WO1999049881A2 - Verwendung von hsp70 protein - Google Patents

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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/07—Heat shock proteins

Definitions

  • the invention relates to the use of Hsp70 protein or fragments thereof for activating NK cells, medicaments, medical devices or medical auxiliaries which contain an Hsp70 protein or fragments thereof or activated NK cells, methods for activating NK cells, and medical uses of the products obtained by the method according to the invention.
  • Chaperones are necessary for a number of fundamental processes in the cell. In particular, it is known that they counteract cell stress.
  • the best studied class of chaperones is the group of heat shock proteins (HSP) with a molecular weight of 70 kDa (Multhoff et al., Cell Stress & Chaperones 1 (3) (1996), 167). These proteins are highly conserved evolutionarily. They bind intracellularly to unfolded or incorrectly folded polypeptides, stabilize them and thus inhibit their aggregation or enable transmembrane translocation. Hsp70 is localized both in the cell nucleus, in the cytosol and on the cell surface of certain tumor cells.
  • WO 97/10000 describes the use of complexes consisting of a heat shock protein and an exogenous antigen molecule (peptide) which is not covalently bound to this protein for the prevention and treatment of tumor and infectious diseases.
  • the antigens present in the complex with heat shock proteins originate from tumor cells. They have the common property of inducing an immune response.
  • HSPs including Hsp70
  • NK cells recognize Hsp70 molecules presented on the surface of tumor cells and then lyse the tumor cells.
  • Tamura and colleagues Tamura et al., Science 278 (1997), 117-123). They were able to demonstrate that tumor-bearing mice can be successfully treated with heat shock protein preparations if they originate from autologous tumors. In contrast, preparations from non-autologous tumors or from normal tissue do not lead to regression of the tumors (Blachere et al., J. Exp. Med.
  • HSPs are in the study by Tamura et al. complexed with a large number of unidentified peptides.
  • the prior art demonstrates an immunological activity of HSP molecules when they are either complexed with peptides and / or are presented on the surface of cells such as tumor cells.
  • successful therapeutic use generally depends on the preparation of certain complexes or cell preparations and on the amount of the starting material (tumor material). A universal, patient-independent use of these complexes or cell preparations is difficult to imagine.
  • the object of the present invention was accordingly to provide new means and ways of using the immunological potential of heat shock proteins which are not burdened by the disadvantages known from the prior art mentioned above.
  • the invention relates to the use of an Hsp70 protein, a carboxy-terminal (C-termmal) fragment thereof or a derivative thereof or a protein with an amino acid sequence homology to the C-termal region of the Hsp70 protein of> 70% for the production of a medicament, Medical product or medical auxiliary for the activation of NK cells.
  • medicaments are defined as substances and preparations made of substances which are intended to heal, alleviate, prevent or recognize diseases, conditions, body damage or pathological complaints by use on or in the human body.
  • medical products are all substances and preparations made of substances or other objects used individually or in conjunction with one another, which are intended to be used by the manufacturer for use by humans by means of their functions for the purpose of detecting, preventing, monitoring, treating or alleviating diseases and their intended main effect is not achieved in or on the human body by either pharmacologically or immunologically active agents or by metabolism, but the mode of action of which can be supported by such agents.
  • medical auxiliaries are substances which are used for the production (as active ingredients) of medicaments.
  • the invention further relates to the use of an Hsp70 protein, a C-terminal fragment thereof or a derivative thereof or a protein with an amino acid sequence homology to the C-terminal region (amino acids 384-641) of the Hsp70 protein of> 70% for ex vivo or m vitro activation of NK cells.
  • Hsp70 protein encompasses eukaryotic heat shock proteins whose expression can be reduced by heat, but also by a large number of other reagents such as, for example, amino acid analogs, heavy metals, ionophores or cell toxins, the ratio of the increase in expression by induction being proportional for constitutive expression is at least 5.
  • FIG. 5 shows the structure of an Hsp70 protein consisting of an N-terminal ATPace domain and a C-terminal substrate binding domain of the protein.
  • the complete ammosaur sequence is published m M lner, et al. , Immunogenetics 32 (4) (1990), 242-251.
  • the term “carboxy-termmale [s] (C-termmale [s]) fragment” of the Hsp70 protein encompasses (poly) peptides which have an amino acid sequence from the range of amino acids 384-641 of human Hsp70.
  • the present invention also includes fragments of the C-termmal fragment 384-641.
  • this term encompasses (poly) peptides that come from the range of another protein that is encompassed by the term “Hsp70 protein” used according to the invention which is homologous to the C-termal region of the human Hsp70 protein.
  • the fragments of the Hsp70 protem used according to the invention also have the ability to activate NK cells.
  • Activation can easily be checked by a person skilled in the art on the basis of the teaching of the invention.
  • the person skilled in the art is also readily able to produce fragments from the above-mentioned fragment 384-641 by genetic engineering (general procedures for this are described in Sambrook et al., "Molecular Clon g, A Laboratory Manual", 2nd edition 1989, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY) and to test the desired activation properties.
  • derivatives encompasses both derivatives of the Hsp70 protein and derivatives of the C-termmal fragment, provided that these Derivatives that have functions according to the invention.
  • Such derivatives preferably have the same three-dimensional structure as Hsp-70 or its C-terminal fragments and can be produced, for example, by peptidomimetics (al-Obeidi et al., Mol. Biotechnol. 9 (1998), 205-223; Wiley et al ., Med. Res. Rev. 13 (1993), 327-384; Böhm, J. Comput. Aided Mol. Des. 10 (1996), 265-272; Hruby et al., Biopolymers 43 (1997), 219- 266).
  • NK cells (“natural killer cells”) encompasses large, granular lymphocytes that expand CD45 on the surface and have killer activity without prior stimulation. They are particularly characterized in that they expand CD16 and / or can be stimulated by Interleukm-2 and / or core CD3 expand and / or have no ⁇ / ⁇ or ⁇ / ⁇ T cell receptors.
  • IL-2 transiently plastic-adherent after the addition of IL-2 in quantities of 10 to 10,000 units, for example 100 IU, where IL-2 can be obtained from Chiron; the adherence takes place 3-18 hours after addition of the IL-2 to freshly isolated PBL (monocyte-depleted, pe ⁇ phere blood phytes); the NK cells have CD16d ⁇ m expression (mean value of the fluorescence weak); the NK cells express CD56 and CD57 as typical NK markers; the NK cells express CD94 (C-type lectm killer cell receptor); the NK cells secrete IFNgamma after activation with Hsp70 and cytokms; the NK cells can be stimulated by adding Hsp70 (purified protein) (growth and cytotoxic activ did) ; it is not dependent on the patient's MHC type.
  • NK cell populations can also be used.
  • the prerequisite is that they can be activated by the Hsp70 used according to the invention or by the fragments or derivatives mentioned.
  • isolated NK cells can be used.
  • cell mixtures such as pe ⁇ phere mononuclear blood cells (PBMC) which contain NK cells.
  • amino acid sequence homology to the C-termmal region of the Hsp70 protein of> 70% means that at least 70% of the amino acids are identical when two ammosaurus sequences are aligned, one of the opposed ammosaurus sequences is that of the C-term region of Hsp70. Also included are sequences in which 70% of the amino acids are identical, but which additionally differ from the C-terminal Hsp70 reference sequence when compared by gaps. These gaps can occur either in the homologous molecule used according to the invention or in the reference molecule. Alignments, usually by computer comparison, are known in the prior art, as are the programs with which such alignments can be carried out. It is also preferred that the proteins or fragments have an ammosaur sequence homology to the carboxy-terminal region, that is to say in the region of amino acids 384-641, of the Hsp70 protein of j> 80% and preferably> 90%.
  • Activation preferably involves induction of an immune response mediated by NK cells.
  • the immune response mediated by NK cells comprises stimulating the proliferation of the NK cells and / or increasing the cytolytic activity of the NK cells.
  • Hsp70 or fragments or derivatives thereof are used in all the above-mentioned embodiments in a (pharmaceutically) effective amount, so that the desired activation, preferably the immune response, is induced.
  • the immune response is primarily, but not exclusively, directed against those cells which express Hsp70 or fragments thereof on the cell surface. This includes both human and animal cells.
  • These Hsp70 cells or human cells that are expanding on the cell surface include, for example, tumor cells and cells from patients with infectious diseases.
  • the cytolytic activity of the NK cells stimulated by Hsp70 according to the invention is significantly increased, so that an immunological elimination of these Hsp70 cells which express on the cell surface is made possible.
  • the cytolytic activity towards tumor cells and / or cells from patients with infectious diseases is increased.
  • the cytolytic activity towards leukemia cells, lymphoma cells, tumor cells and metastatic cells of solid tumors and cells from patients with viral, mycotic or bacterial infectious diseases is increased.
  • An example of the treatment of viral diseases is the treatment of HIV infections
  • an example of a bacterial infection is the treatment of diseases caused by mycobacteria.
  • Soli ⁇ en tumors whose metastatic cells can be treated by the immunological method according to the invention include, for example, carcinomas, sarcomas, melanomas or leukemias and lymphomas. Examples of carcinomas are colon carcinomas and lung carcinomas.
  • Hsp70 protein By using an Hsp70 protein according to the invention, parts of this protein or> 70% sequence-homologous proteins, cells can be lysed that are infected by viruses, bacteria and / or fungi or cells that are tumorigenically altered. Cells that contain antigenic parts of these foreign organisms or parts of tumor cells can also be lysed by using the Hsp70 protein according to the invention with the aid of the activated NK cells.
  • the invention further relates to a method for ex vivo or in vitro activation of NK cells, wherein a physiological cell suspension containing NK cells with an Hsp70 protein, a C-terminal fragment thereof or a derivative thereof or a protein with an amino acid sequence homology for C-terminal region (amino acids 384-641) of the Hsp70 protein from j ⁇ . 70% mixed and incubated to activate NK cells.
  • Incubation can take place at room temperature, but preferably at a physiological temperature (37 ° C) on a shaker (gentle shaking).
  • the activation comprises stimulating the proliferation of the NK cells and / or increasing their cytotoxicity.
  • the preferred target cells for the cytotoxic activity reference is made to the above illustrations.
  • peripheral, mononuclear blood cells or a fraction thereof containing NK cells are used as the physiological cell suspension containing NK cells.
  • the NK cells can be removed from the patient to be treated or from a healthy donor by suitable methods Blood collection can be obtained. Buffy coats (lymphocyte concentrates) containing NK cells should preferably be used.
  • Buffy coats (lymphocyte concentrates) are removed from the patient via the vein and e.g. mixed with heparin to prevent cell clumping.
  • the lymphocyte concentrate remains sterile in the vessel (plastic bag).
  • a buffy coat consists of white and red blood cells (lymphocytes, erythrocytes, etc.).
  • the buffy coats which contain peripheral, mononuclear blood cells, are used in the form of a physiological cell suspension, preferably mixed with heparin.
  • the heparin prevents cell aggregation.
  • the cell suspension further contains human or animal cells expressing Hsp70 on the cell surface.
  • Nsp cells can also be stimulated by Hsp70 protein if there are no target cells (tumor cells, infected cells) expressing Hsp70 on the cell surface.
  • tumor cells are used as human or animal cells.
  • leukemia cells are used as human or animal cells.
  • lymphoma cells are used as human or animal cells.
  • metastatic cells of solid tumors and cells from patients with viral, mycotic or bacterial infectious diseases are used as human or animal cells.
  • the physiological cell suspension containing the cells and proteins is incubated for at least 3 hours.
  • the target cells of the natural killer cells are preferably incubated together with the natural killer cells and the Hsp70 in suspension, preferably for the period mentioned.
  • long-term incubations for at least 4 days are also possible. Accordingly, in another particularly preferred embodiment of the method according to the invention, the incubation is carried out for 4 days.
  • a cytokine is additionally used.
  • the cytokine can be used separately with the NK cells and / or the heat shock proteins, fragments or derivatives thereof or together in one dose.
  • an interleukin is used as the cytokine.
  • a combination of interleukins can also be used according to the invention together with the Hsp70 protein in order to further intensify the activation of the NK cells, e.g. the immune response mediated by NK cells or the stimulation of the proliferation of the NK cells.
  • Interleukin IL-2 Interleukin IL-2, IL-12 and / or IL-15 used.
  • the invention opens up the possibility of not only reinfusing NK cells activated ex vivo in the patient, but also of using NK cells treated according to the invention, for example also in combination with hyper-thermal treatment, in vivo because of the avoidance of toxic substances.
  • This embodiment of the invention has the further, invaluable and surprising advantage that target cells, for example tumor cells, which resisted the known therapeutic methods can now also be immunologically killed by the cytolytic action of NK cells.
  • the invention thus further relates to a method for in vivo activation of the immune system, in which a patient is administered a pharmaceutically effective amount of NK cells activated according to the method described above, optionally in combination with or before a pharmaceutically effective amount of an Hsp70 protein , a C-terminal fragment thereof or a derivative thereof or a protein with an amino acid sequence homology to the C-terminal region (amino acids 384-641) of the Hsp70 protein of j ⁇ . 70% administered.
  • the active ingredients can be formulated separately in one or more containers, whereas in the case of processing which is separate in terms of time, they are formulated separately.
  • the corresponding time period before the administration of the Hsp70 protein should be at least 3-24 hours.
  • Buffy-coat cells consisting of peripheral, mononuclear blood cells or bone marrow cells and tumor cells from tumor patients, for example leukemia patients, are in a container, for example a plastic Container that is sterile sealed, heat treated with the Hsp70, Hsp70-related protein and / or effective fragments or derivatives thereof, in a temperature controlled water bath. Both the tumor cells and the NK cells, which are stimulated by the present treatment, are located in the container. After completion of the method according to the invention, the activated NK cells and the culture solution containing the lysed tumor cells are re-infused into the patient.
  • the NK cells are optionally present together with other peripheral, mononuclear blood cells, for example together with erythrocytes and granulocytes and T cells.
  • the NK cells are therefore preferably not used alone, but rather a mixture of the peripheral, mononuclear blood cells is obtained by isolating buffy-coat cells. In tumor patients, these accumulations continue to contain tumor cells that are immunologically eliminated by the method according to the invention.
  • the invention relates to a method for in vivo activation of NK cells, wherein a patient receives a pharmaceutically effective amount of an Hsp70 protein, a C-terminal fragment thereof or a derivative thereof or a protein with an amino acid sequence homology to the C-terminal region (Amino acids 384-641) of the Hsp70 prototype of . ⁇ . 70% administered.
  • the invention relates to a method for treating tumors, cancer and / or infectious diseases, wherein a patient receives a pharmaceutically effective amount of NK cells activated by the method according to the invention described above and / or an Hsp70 proteme, a C-termmal fragment thereof or a derivative thereof or a protein with an amino acid sequence homology to the C-terminal region (amino acids 384-641) of the Hsp70 protein of . ⁇ . 70% administered.
  • the tumor is a solid tumor or a metastasis.
  • the treatment strategy aims in particular at eliminating single cell metastases which can be eliminated immunologically by the method according to the invention.
  • Enhanced activation of Hsp70-specific NK cells can be achieved by adding interleukin-2 in a low dose, for example 100 IU.
  • the interleukin-2 can, for example, be introduced together with the Hsp70 into the sterile container, for example a plastic container.
  • the cancer is leukemia or a Ly ⁇ nphom.
  • the infectious disease is of viral, mycotic or bacterial origin.
  • the invention further relates to a medicament, a medical adjuvant or a medical device which contains an Hsp70 protein, a C-terminal fragment thereof or a derivative thereof or a protein with an amino acid sequence homology to the C-terminal region (amino acids 384-641) of the Hsp70 -Proteins of ⁇ .
  • a medicament a medical adjuvant or a medical device which contains an Hsp70 protein, a C-terminal fragment thereof or a derivative thereof or a protein with an amino acid sequence homology to the C-terminal region (amino acids 384-641) of the Hsp70 -Proteins of ⁇ .
  • a cytokine as defined above may also be added to the drug.
  • the protein is in a concentration of at least 1 ⁇ g / ml, preferably up to 1000 ⁇ g / ml, preferably 1 ⁇ 10 s to 5 ⁇ 10 8 NK cells, an amount of 10 ug to 600 ug / ml is preferred.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers are familiar to the person skilled in the art and include, for example, phosphate-buffered salt solutions, water, emulsions, such as, for. B. oil / water emulsions, sterile solutions, etc.
  • the pharmaceutical compositions (pharmaceuticals) containing such carriers can be formulated by conventional methods.
  • the pharmaceutical compositions can be administered to the subject concerned in a suitable dose. Types of administration are, for example, intravenously, intraperitoneally, subcutaneously, intramuscularly, topically or intradermally. The dosage depends on many factors, e.g. B. on the size, gender, weight, age of the patient, as well as the type of compound specifically administered, the type of administration, etc.
  • the monthly dose is 10 to 1000 ⁇ g.
  • dosages of 10 to 1000 ⁇ g are common.
  • the compositions can be administered locally or systemically. In general, administration will be parenteral.
  • the NK cells treated with Hsp70 protein according to the invention are preferably injected intravenously. It can also be injected directly into the tumor, injecting an effective amount of the NK cells.
  • other forms of application known per se are also possible.
  • the Hsp70 protein itself can be administered together with cytokines, for example.
  • An example of an application is the injection of the Hsp70 protein, e.g. together with cytokines intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intraperitoneally or in the sole of the foot.
  • the Hsp70 protein is a human protein.
  • the protein according to the invention is of human origin (when isolated from cell extracts) or has the amino acid sequence of human Hsp70 protein (e.g. after recombinant production).
  • animal Hsp70 proteins can also be used.
  • the Hsp70 protein used according to the invention or the fragments can either be produced recombinantly, isolated from cell extracts or produced by chemical synthesis.
  • the Hsp70 protein or its fragment or derivative is a recombinant protein.
  • Such recombinant proteins can be produced by standard methods.
  • Nucleic acid molecules which encode the Hsp70 protein according to the invention or fragments thereof are used for the recombinant production of the proteins. These can be different nucleic acid molecules, in particular DNA or RNA molecules, for example cDNA, genomic DNA, mRNA etc. These nucleic acid molecules can be naturally occurring molecules and / or molecules produced by genetic or chemical synthesis methods.
  • nucleic acid molecules contained in the vectors can be linked to regulatory elements which ensure expression in prokaryotic or eukaryotic cells.
  • expression can mean transcription as well as transcription and translation.
  • Regulatory elements include promoters in particular. A number of promoters are available for the expression of a nucleic acid molecule in prokaryotic cells, e.g. B. the E.
  • coli lac or trp promoter the P R or P L promoter of the lambda phage, lad, lacZ, T3, T7, gpt, etc. are eukaryotic promoters for example the CMV immediate early promoter, the HSV promoter, the thymidine kinase promoter, the SV40 promoter, LTRs of retroviruses and the mouse metallothionin I promoter.
  • a variety of expression vectors for expression in prokaryotic or eukaryotic cells have already been described, e.g. B.
  • these vectors can also Contain elements to further increase transcription, such as. B. so-called transcription enhancers. Examples of these are the SV40 Enhander, the Polyoma Enhancer, the Cytomegalovirus early promoter Enhancer and Adenovirus Enhancer.
  • the recombinant proteins can therefore be expressed in various prokaryotic or eukaryotic host cells, for example using the vectors described above.
  • host cells are bacterial cells (such as, for example, BE coli, Streptomyces, Bacillus, Salmonella typhimurium), fungal cells (such as, for example, yeast cells, in particular Saccharomyces cerevisiae), insect cells (such as, for example, Drosophila or SF9 cells), animal cells Cells (such as CHO or COS cells) or also plant cells, etc.
  • Such host cells are cultivated under conditions which allow expression of the recombinant protein which can subsequently be obtained from the cells and / or from the culture medium. Methods for the expression of foreign protein in different types of host cells and for the production of the protein produced are familiar to the person skilled in the art.
  • the Hsp70 protein comprises the C-terminal fragment amino acids 384 to 561 of human Hsp70 or the corresponding region from another Hsp70 which is the inventive one
  • the C-terminal fragment has effects or comprises amino acids 454 to 460 of human Hsp70.
  • NLLGRFE fragments which have this minimal sequence of 7 amino acids
  • the 7 amino acids can be flanked by naturally flanking Hsp70 sequences or by other amino acids. It is preferred that the 7 amino acids remain in their natural context. If other flanking amino acids are used, the three-dimensional context in which the 7 amino acids mentioned are naturally present is preferred. Further amino acid exchanges can take place within the 7 amino acids provided the homology is maintained at least 70%. However, these exchanges do not involve replacement of arginine at position 458 by lysine. This exchange leads to a change in conformation. Accordingly, exchanges which lead to a change in conformation in the region of the 7 amino acids are only included in the invention if they have the desired activation properties.
  • the invention further relates to the use of the NK cells treated by a method according to one or more of the preceding embodiments for the therapy of tumor diseases and / or infectious diseases.
  • the therapy is carried out by reinfusing the treated NK cells.
  • FTGUR, 1 Comparison of the proliferating activity of separate NK (A) and T (B) cells, either with IL-2 (100 IU / ml) medium or with other recombinant Hsp70 proteins (rHsp70, rHsp70-C term . (amino acids 384-561), rHsp70homC, DnaK, Hsc70 and heat-denatured rHsp70), which were suspended in IL-2 medium (100 IU / ml), each with a concentration of 10 ⁇ g / ml, were stimulated.
  • the phenotypic characterization of the NK cells is as follows:
  • CD3 ⁇ 5%; CD16 / CD56: 46-87%; CD94: 60-70%; p58.1 and p58.2: ⁇ 5% and T cells: CD3: 85-92%; CD16 / CD56: 5-10%; CD94: ⁇ 29%; p58.1 and p58.2: not tested; p70: not tested, determined by flow cytometry.
  • the proliferation of the cells was determined after 48 hours and after incubation with 3 H-thymidine (1 ⁇ Ci / ml) at 37 ° C. for 18 hours.
  • the relative percentage of 3 H-thymidine uptake in NK (A) and T (B) cells was compared to the effects of IL-2 alone (100%). The values show the mean values of four to seven independent experiments ⁇ standard deviation.
  • FTGU 2 Comparison of the cytotoxic activity of highly purified NK cells (CD3: ⁇ 2%; CD16 / CD56: 75-80%; CD94: 65-87%; p58.1 and p58.2: 20-30%; p70: ⁇ 10%), which either remained untreated (solid lines, empty symbols) or were pre-incubated after preincubation of the NK cells with rHsp70 (A) protein (5 ⁇ g / ml each for 4 days; solid lines, filled symbols) , versus 51 Cr-labeled tumor target cells CX + (A) and CX- (B), which differ in their ability to express Hsp70 on their plasma membrane.
  • the results are as a percentage of the specific lysis at different E : T ratios expressed from 0.2: 1 to 2: 1. Each point represents the mean of at least three independent experiments ⁇ standard deviation. The percentage of spontaneous release for each tumor target cell line was always below 15%.
  • FTGUR 3 tumor growth of CX + cells bearing Hsp70 in immune deficient mice. After ip injection of NK cells, tumor growth is completely inhibited (with i.p. injection of the tumor cells). The tumor size was given in cm 2 .
  • FTGUR 4 tumor growth of Hsp70-bearing CX + cells in immune-efficient mice. After i. v. Injection of NK cells completely inhibits tumor growth. The tumor growth was measured in grams. Tumor growth after o. t. Injection of CX + and IV injection of NK cells on day 35. The NK cells prevent tumor growth of Hsp70-bearing CX + cells after 3 and 5 weeks after injection and (see FIG. 3). Both intraperitoneal and intravenous administration of the NK cells lead to comparable results.
  • FTGUR 6 Representation of the influence of Hsp70 and / or cytokines on the immune response mediated by NK cells. The cytokine addition also stimulates T cells.
  • Example 1 Increased proliferation of NK cells after administration of Hsp70
  • NK and T cells The proliferation of purified NK and T cells, which with the Hsp70 proteins rHsp70, DnaK, Hsc70, rHsp70-C term. and rHsp70homC (amino acids 384-561) had been stimulated was determined in a 3 H-thymidine uptake standard test (test conditions see later).
  • peripheral blood lymphocytes from voluntary human donors were initially transformed into non-adherent CD3 + T cells and transient (12-24 hours) adherent CD3- (CD16 + / CD56 +) NK cell subpopulations in a multi-step procedure and subsequent 12-hour incubation in one Medium containing IL-2 (see FIG. 3) separately.
  • the cells were cultured separately in rIL-2 (100 IU, Chiron, Frankfurt, Germany) containing an RPMI 1640 (Life Technologies, Eggenstein, Germany) medium for 3-4 days. Proliferation was measured as H-3 uptake.
  • Hsp70 human recombinant Hsp70 (rHsp70, SPP-755, StressGen Biotechnologies, Victoria, Canada) and DnaK (Hsp70 homolog obtained from E. coli, SPP-630, StressGen).
  • the proteins were diluted in PBS to a stock concentration of 1 ⁇ g / ml and frozen in aliquots at -80 ° C.
  • T-25 culture bottles were incubated with rHsp70 or DnaK protein (10 ⁇ g / ml), diluted in 3 ml ice-cold carbonate buffer, pH 9.5, for 12 hours.
  • the flow cytometry was carried out as described in (4) on a FACScan instrument (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany).
  • the percentage of positively stained cells was defined as the difference between the number of specifically stained, vital (propidium iodide negative) cells minus the number of cells which were stained with the control antibody corresponding to the isotype.
  • the following antibodies were used for phenotypic labeling of the effector cells: the isotype-corresponding control antibody (Dianova, Hamburg, Germany; Becton Dickinson, Heidelberg, Germany), CD16 (Dianova, Hamburg, Germany), CD3 (Dianova, Hamburg, Germany).
  • T or NK cells proliferate against different Hsp70 proteins was determined in a standard 3 H thyroid uptake test.
  • Viable cells (5 x 10 4 cells / 100 ⁇ l) were sown in a 96-well-containing microtiter plate with a flat bottom (Greiner, Nuertingen, Germany), using a supplemented RPMI 1640 medium with 100 IU IL-2 and various recombinant Hsp70 proteins (rHsp70, DnaK, Hsc70, the constitutive form of Hsp70, purified from bovine brain, SPP-750; StressGen; rHsp70-C term., They rec.
  • Hsp70 amino acids 384 - 561, rHsp70homC, the recombinant C-terminal peptide binding domain of Hsp70hom (Hsp70hom is a Testis specific member of the Hsp70 family, which has a strong homology (94%) to Hsp70), amino acids 384-561) was used.
  • Hsp70hom is a Testis specific member of the Hsp70 family, which has a strong homology (94%) to Hsp70), amino acids 384-561
  • the cells were labeled with 3 H-thymidine (1 ⁇ Ci / well), and the total uptake was determined after 18 hours of incubation at 37 ° C. in a liquid scintillation counter (Beckmann Instruments, Kunststoff, Germany) .
  • the proliferation capacity of T lymphocytes from the same donor was also determined.
  • Dose escalation studies using various Hsp70 proteins / fragments in concentrations of 1-200 ⁇ g / ml showed that maximum stimulation of the proliferation capacity was achievable with 100 ⁇ g / ml Hsp70 protein.
  • NK cell proliferation was significantly stimulated by rHsp70. Stimulation by the carboxy-terminal region of Hsp and by rHsp70homC, which is 94% identical to Hsp70 in the C-terminal domain with amino acids 384-561, is also possible. In contrast, DnaK and Hsc70 did not stimulate NK cell proliferation. Heat denatured rHsp70 completely lost the stimulatory properties for the proliferation of NK cells.
  • NK cells proliferation of NK cells by recombinant human Hsp70 protein could thus be induced by the C-terminal region of Hsp70 (384-561) and rHsp70homC, a protein homologous to Hsp70, while proliferation of the T cells was selective by bacterial Hsp70 (E. coli DnaK) was stimulable.
  • Example 2 Increasing the cytolytic activity of NK cells after administration of Hsp70
  • NK cells using Hsp70-expressing (CX +) and Hsp70 -non-expressing (CX-) tumor cells showed that the plasma membrane expression of Hsp70 correlated with an increased sensitivity to the lysis mediated by NK cells.
  • This NK cell-mediated lysis of tumor cells can be blocked by preincubating the tumor cell lines with monoclonal antibodies which are directed against the carboxy-terminal region (amino acids 504-617) of Hsp70 and with the antibody RPN1197 (1, 4).
  • Hsp70 recombinant Hsp70 protein
  • CX + Hsp70-expressing
  • CX- Hsp70-non-expressing
  • FIGS. 2A and B The experimental arrangement was as follows: To stimulate the cytotoxic activity, NK cells were incubated with 10 ⁇ g / ml rHsp70. The stimulation was repeated every 4 days.
  • the human, autologous colon carcinoma subcell lines CX + and CX- which differ in their Hsp70 expression on the plasma membrane (Multhoff et al., J. Immunol. 158 (1997), 4341), were supplemented with in RPMI 1640 medium 10% FCS (Life Technologies), 6 mM L-glutamine and antibiotics (100 IU / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin; Life Technologies) were cultivated. Exponentially growing tumor cells were used as target cells, and purified CD3-NK cells were used as effector cells after cell sorting using a FACStar plU ⁇ instrument (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany).
  • Cytotoxicity mediated by NK cells was assessed using a 4 hour 51 Cr-Ra- dioisotope tests (Multhoff et al., J. Immunol. 158 (1997), 4341). The percentage of specific lysis was calculated as follows: [(experimental release - spontaneous release) / (maximum release - spontaneous release)] x 100. The spontaneous release of Cr-51 was below 15% in all experiments.
  • NK cells were incubated with rHsp70 protein for at least 4 days, both the proliferation and the cytolytic activity of NK cells against Hsp70-expressing tumor cells (CX +) were stimulated.
  • CX + Hsp70-expressing tumor cells
  • NK cells from the same donor that were not treated with rHsp70 lost this reactivity after 10 days (data not shown).
  • the lytic activity of NK cells not stimulated with rHsp70 was lower compared to NK cells treated and stimulated with rHsp70, and no significant difference in the lysis of Hsp70-expressing and non-expressing tumor cells could then be determined.
  • Hsp70 amino acids 384 - 641
  • the carboxy-terminal part of Hsp70 protein acts as a stimulating signal for NK cells which specifically attack tumor cells expressing Hsp70 in vitro.
  • NK cells For the investigation of the in vivo relevance of NK cells compared to Hsp70-expressing tumor cells, investigations on immunodeficient SCID / beige mice were carried out. First different amounts of tumor cells (CX + or CX- cells) were injected into SCID / beige mice. An amount of 2.5 million Cells proved to be the optimal amount of tumor cells to induce tumor growth within a period of 3 to 5 weeks. An ip (intraperitoneal) or ot (orthotopic, ie here in the intestinal wall) injection of colon carcinoma cells CX + or CX- into the intestinal wall was chosen as the injection method. After stimulation, the NK cells were applied either ip or iv (intravenously). As shown in FIG.
  • tumor growth could be achieved in both animals both after ip and after ot injection.
  • ot injection in addition to the growth of a primary tumor, metastasis of the CX + cells was also observed, especially in the spleen and lungs (3 out of 3 mice after ot injection).
  • NK cells not only inhibited the growth of primary tumors (in the i.p. space or on the intestine), but also the metastasis of the tumors.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Hsp70-Protein oder Fragmenten davon zur Aktivierung von NK-Zellen, Arzneimitteln, Medizinprodukten oder medizinischen Hilfsstoffen, die ein Hsp70-Protein oder Fragmente davon oder aktivierte NK-Zellen enthalten, Verfahren zur Aktivierung von NK-Zellen, sowie medizinische Verwendungen der durch das erfindungsgemässe Verfahren erhaltenen Produkte.

Description

Verwendung von Hsp70 Protein
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Hsp70 -Protein oder Fragmenten davon zur Aktivierung von NK-Zellen, Arzneimittel, Medizinprodukte oder medizinische Hilfsstoffe, die ein Hsp70- Protein oder Fragmente davon oder aktivierte NK-Zellen enthalten, Verfahren zur Aktivierung von NK-Zellen, sowie medizinische Verwendungen der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Produkte.
Chaperone sind für eine Anzahl fundamentaler Prozesse in der Zelle notwendig. Insbesondere ist bekannt, daß sie dem Zellstreß entgegenwirken. Die am besten untersuchte Klasse von Chaperonen ist die Gruppe der Hitzeschock-Proteine (HSP) mit einem Molekulargewicht von 70 kDa (Multhoff et al . , Cell Stress & Chaperones 1 (3) (1996) , 167) . Diese Proteine sind evolutionär hochkonserviert. Sie binden intrazellulär an nicht gefaltete oder nicht korrekt gefaltete Polypeptide, stabilisieren sie und inhibieren auf diese Weise deren Aggregation oder ermöglichen eine Transmembran-Translokation. Hsp70 ist sowohl im Zellkern, im Zytosol und an der Zelloberfläche bestimmter Tumorzellen lokalisiert. Neben ihrer intrazellulären Aufgabe als Chaperone scheinen die Mitglieder der HSP70 -Familie an der Stimulierung des Immunsystems beteiligt zu sein, z. B. entzündlicher Prozesse unter Beteiligung von Pathogenen und an der zellulären anti -Tumorimmunantwort in vivo und in vitro. Entsprechend sind im Stand der Technik therapeutische Verwendungsmöglichkeiten von Hitzeschockproteinen dargestellt worden. So wird in der WO 97/10000 der Einsatz von Komplexen, die aus einem Hitzeschockprotein und einem an dieses Protein nicht-kovalent gebundenem, exogenem Antigenmolekül (Peptid) bestehen, zur Prävention und Behandlung von Tumor- und Infektionserkrankungen beschrieben. Die mit Hitzeschockproteinen im Komplex vorliegenden Antigene stammen aus Tumorzellen. Sie weisen die gemeinsame Eigenschaft auf, eine Immunantwort zu induzieren. Multhoff et al . , Biol . Chem. 379 (1998) , 295-300 ordnen HSPs, darunter Hsp70 eine Rolle in der Erkennung durch nicht -MHC-restringierte Effektorzellen, darunter NK-Zellen, zu. Insbesondere wird herausgestellt, daß NK-Zellen auf der Oberfläche von Tumorzellen präsentierte Hsp70 -Moleküle erkennen und die Tumorzellen sodann lysieren. Ein weiterer Ansatz zur Therapie von Krebserkrankungen wurde von Tamura und Kollegen (Tamura et al . , Science 278 (1997), 117-123) vorgestellt. Sie konnten belegen, daß Tumor-tragende Mäuse dann erfolgreich mit Hitzeschockproteinpräparationen behandelt werden können, wenn diese aus autologen Tumoren stammen. Präparationen aus nicht-autologen Tumoren oder aus Normalgewebe hingegen führen nicht zur Regression der Tumore (Blachere et al . , J. Exp . Med. 186 (1997) 1315-1322). Die HSPs sind in der Studie von Tamura et al . mit einer Vielzahl nicht näher identifizierter Peptide komplexiert . Zusammenfassend kann festgehalten werden, daß der Stand der Technik eine immunologische Aktivität von HSP-Molekülen belegt, wenn diese entweder mit Peptiden komplexiert sind und/oder auf der Oberfläche von Zellen wie Tumorzellen präsentiert werden. Obwohl somit das Potential von Hitzeschockproteinen bei der Bekämpfung unterschiedlicher Erkrankungen in erster Näherung erkannt ist, hängt der erfolgreiche therapeutische Einsatz in der Regel jedoch von der Präparation bestimmter Komplexe oder Zellaufbereitungen sowie von der Menge des Ausgangsmaterials (Tumormaterials) ab. Ein universeller, patientenunabhängiger Einsatz dieser Komplexe oder Zellaufbereitungen ist nur schwer vorstellbar.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war demzufolge, neue Mittel und Wege für die Nutzung des immunologischen Potentials von Hitzeschockproteinen bereitzustellen, die unbelastet von den vorstehend genannten aus dem Stand der Technik bekannten Nachteilen sind.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen dargestellten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die Erfindung die Verwendung eines Hsp70- Protems, eines carboxy-terminalen (C-termmalen) Fragmentes davon oder eines Derivats davon oder eines Proteins mit einer Aminosäuresequenzhomologie zum C-termmalen Bereich des Hsp70- Protems von > 70% zur Herstellung eines Arzneimittels, Medizinproduktes oder medizinischen Hilfsstoffes zur Aktivierung von NK-Zellen.
Arzneimittel sind erfindungsgemäß als Stoffe und Zubereitungen aus Stoffen definiert, die dazu bestimmt sind, durch Anwendung am oder im menschlichen Korper Krankheiten, Leiden, Körperschäden oder krankhafte Beschwerden zu heilen, zu lindern, zu verhüten oder zu erkennen.
Medizinprodukte sind erfindungsgemäß alle einzeln oder miteinander verbunden verwendeten Stoffe und Zubereitungen aus Stoffen oder andere Gegenstände, die vom Hersteller zur Anwendung für Menschen mittels ihrer Funktionen zum Zwecke der Erkennung, Verhütung, Überwachung, Behandlung oder Linderung von Krankheiten zu dienen bestimmt sind und deren bestimmungsgemäße Hauptwirkung im oder am menschlichen Körper weder durch pharmakologisch oder immunologisch wirkende Mittel noch durch Metabolismus erreicht wird, deren Wirkungsweise aber durch solche Mittel unterstützt werden kann.
Medizinische Hilfsstoffe sind erfmdungsgemäß solche Stoffe, die zur Produktion (als aktive Ingredienzien) von Arzneimitteln eingesetzt werden.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung eines Hsp70- Protems, eines C-termmalen Fragmentes davon oder eines Derivats davon oder eines Proteins mit einer Aminosäuresequenzhomologie zum C-termmalen Bereich (Aminosäuren 384-641) des Hsp70-Proteins von > 70% zur ex vivo oder m vitro Aktivierung von NK-Zellen. Der Begriff "Hsp70 -Protein" erfaßt erfindungsgemäß eukaryontische Hitzeschockproteine, deren Expression durch Hitze, aber auch durch eine Vielzahl anderer Reagenzien wie z.B. Aminosäure-Analoga, Schwermetalle, Ionophore oder Zellgifte mduzierbar ist, wobei der Faktor der Steigerung der Expression durch die Induktion im Verhältnis zur konstitutiven Expression mindestens 5 beträgt. Die beiliegende Figur 5 zeigt den Aufbau eines Hsp70-Proteins bestehend aus einer N- termmalen ATPace Domäne und einer C-termmalen Substrat- Bmdungsdomane des Proteins. Die vollständige Ammosauresequenz ist veröffentlicht m M lner, et al . , Immunogenetics 32 (4) (1990) , 242-251.
Der Begriff "carboxy-termmale [s] (C-termmale [s] ) Fragment" des Hsp70-Protems umfaßt erfindungsgemäß (Poly) peptide, die eine Am osauresequenz aus dem Bereich der Aminosäuren 384-641 des menschlichen Hsp70 aufweisen. Umfaßt von der vorliegenden Erfindung sind auch Fragmente des C-termmalen Fragmentes 384- 641. In anderen Ausführungsformen sind mit diesem Begriff (Poly) peptide erfaßt, die aus dem Bereich eines anderen, von dem erfindungsgemäß verwendeten Begriff "Hsp70-Protein" erfaßten Proteins stammen, der zu dem genannten C-termmalen Bereich des menschlichem Hsp70-Protems homolog ist. Die erfindungsgemäß verwendeten Fragmente des Hsp70-Protems weisen ebenfalls die Fähigkeit auf, NK-Zellen zu aktivieren. Die Aktivierung kann vom Fachmann ohne weiteres anhand der Lehre der Erfindung überprüft werden. Insofern ist der Fachmann auch ohne weiteres m der Lage, Fragmente aus dem vorstehend genannten Fragment 384-641 gentechnologisch herzustellen (allgemeine Verfahren hierzu sind beschrieben m Sambrook et al . , "Molecular Clon g, A Laboratory Manual", 2. Auflage 1989, CSH Press, Cold Spring Harbor, N. Y.) und auf die gewünschten Aktivierungseigenschaften hm zu testen.
Der Begriff "Derivat" umfaßt sowohl Derivate des Hsp70-Protems als auch Derivate des C-termmalen Fragmentes, sofern diese Derivate die erf dungsgemaßen Funktionen aufweisen. Derartige Derivate weisen vorzugsweise dieselbe dreidimensionale Struktur wie Hsp-70 bzw. dessen C-termmale Fragmente auf und können beispielsweise durch Peptidomimetics hergestellt werden (al- Obeidi et al . , Mol. Biotechnol . 9 (1998), 205-223; Wiley et al . , Med. Res . Rev. 13 (1993), 327-384; Böhm, J. Comput . Aided Mol. Des. 10 (1996), 265-272; Hruby et al . , Biopolymers 43 (1997) , 219-266) .
Der Begriff "NK-Zellen" ("Natürliche Killerzellen" , engl . : "natural killer cells") umfaßt große, granuläre Lymphozyten, die CD45 auf der Oberfläche expπmieren und ohne vorherige Stimulation Killeraktivität aufweisen. Sie sind insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß sie CD16 expπmieren und/oder durch Interleukm-2 stimulierbar sind und/oder kern CD3 expπmieren und/oder keine α/ß- oder γ/δ- T-Zell-Rezeptoren besitzen.
Die NK-Zellen, die im erfmdungsgemaßen Verfahren ihre Wirksamkeit entfalten, sind weiterhin bevorzugt durch die nachfolgenden Eigenschaften gekennzeichnet :
sie sind transient plastik-adhärent nach Zugabe von IL-2 m Mengen von 10 bis 10.000 Einheiten, z.B. von 100 l.E, wobei IL-2 von der Firma Chiron bezogen werden kann; die Adh renz erfolgt 3-18 Stunden nach Zugabe des IL-2 auf frisch isolierte PBL (monozytendepletierte, peπphere Blutly phozyten) ; die NK-Zellen weisen eine CD16dιm Expression auf (Mittelwert der Fluorszenz schwach) ; die NK-Zellen exprimieren CD56 und CD57 als typische NK- Marker ; die NK-Zellen exprimieren CD94 (C-Typ Lectm Killer-Zell- Rezeptor) ; die NK-Zellen sezernieren nach Aktivierung mit Hsp70 und Zytokmen IFNgamma; die NK-Zellen sind durch Zugabe von Hsp70 (gereinigtes Protein) stimulierbar (Wachstum und zytotoxische Aktivi- tat) ; sie s nd nicht vom MHC-Typ des Patienten abhängig.
Erfindungsgemäß können auch andere NK-Zellpopulationen eingesetzt werden. Voraussetzung ist jedoch, daß sie durch das erfindungsgemäß eingesetzte Hsp70 oder durch die genannten Fragmente oder Derivate aktivierbar sind. Erfindungsgemäß können isolierte NK-Zellen eingesetzt werden. Es ist aber auch möglich, Zellgemische wie peπphere mononucleäre Blutzellen (PBMC) einzusetzen, in denen NK-Zellen enthalten sind.
Der Begriff "Aminosäuresequenzhomologie zum C-termmalen Bereich des Hsp70-Protems von > 70%" bedeutet im Sinne dieser Erfindung, daß mindestens 70% der Aminosäuren bei einer Gegenüberstellung ("alignment") von zwei Ammosauresequenzen identisch sind, wobei die eine der gegenübergestellten Ammosauresequenzen die des C-termmalen Bereichs von Hsp70 ist. Umfaßt sind auch solche Sequenzen, bei denen 70% der Aminosäuren identisch sind, die sich aber zusätzlich von der C- termmalen Hsp70 -Referenzsequenz bei der Gegenüberstellung durch Lücken ("gaps") unterscheiden. Diese Lücken können entweder im erfindungsgemäß eingesetzten homologen Molekül oder im Referenzmolekül auftreten. Alignments, üblicherweise durch Computervergleich, sind im Stand der Technik bekannt, desgleichen die Programme, mit denen derartige Alignments durchgeführt werden können. Es ist außerdem bevorzugt, daß die Proteine bzw. Fragmente eine Ammosauresequenzhomologie zum carboxy-termmalen Bereich, also im Bereich der Aminosäuren 384 - 641, des Hsp70 -Proteins von j> 80% und bevorzugt > 90%, aufweisen.
Der Befund, daß Hitzeschockproteine, C-termmale Fragmente davon oder davon abgeleitete Derivate über die Aktivierung von NK-Zellen immunologische Aktivitäten induzieren, selbst wenn sie nicht mit Peptiden komplexiert sind oder auf der Oberfläche von Zellen wie Tumorzellen präsentiert werden, muß als höchst überraschend angesehen werden. Beispielsweise ging man noch im Juni 1998 (vgl. Srivastava et al . , Immunity 8 (1998), 657-665, hier gutachtlich zitiert) davon aus, daß isolierte Hitzeschockproteine keine immunogenen Wirkungen wie CTL- Induktion aufweisen (Blachere et al . , J. Exp . Med. 186 (1997), 1315-1322) und keine protektive Immunität gegenüber irgendeiner Krebsart induzieren können (Udono und Srivstava, J. Immunol . 152 (1994) , 5398-5403) . Mit der vorliegenden Erfindung wird hingegen möglich, patientenunabhängig eine in vitro oder in vivo Aktivierung von NK-Zellen herbeizuführen, die nach der Aktivierung erfolgreich gegen verschiedene Krankheiten, beispielsweise Tumorerkrankungen eingesetzt werden können. Die Verwendung von isoliertem Hitzeschockprotein erlaubt darüber hinaus eine bessere Standardisierung von Aktivierungsvorgängen. Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, HSP in unbegrenzter Menge herzustellen, wohingegen bei der patientenspezifischen Aufbereitung der HSP-Peptid Komplexe die Menge an HSP über die Menge des Tumors limitiert ist.
Überraschend ist über die vorgenannten Befunde hinaus, daß auch der Einsatz von C-terminalen Fragmenten des Hsp70-Proteins zum erfindungsgemäßen Ergebnis führt. Unerwartet ist vor allem, daß der C-Terminus offensichtlich dieselbe dreidimensionale Struktur aufweist, die von NK-Zellen erkannt wird und zu deren Aktivierung führt. Die Möglichkeit des Einsatzes von C- terminalen Hsp70-Fragmenten in der Aktivierung von NK-Zellen birgt unter anderem den Vorteil, daß die rekombinante Herstellung zu besseren Ausbeuten im Vergleich zur rekombinanten Darstellung des gesamten Proteins führen sollte.
Die Herstellung von Derivaten von Hsp70 oder dessen C- terminalen Fragmenten, beispielsweise durch Peptidomimetics , ist beispielsweise dann sinnvoll, wenn der rasche Abbau dieser (Poly) peptide im Körper vermieden werden soll. Dies kann z. B. bei der oralen Gabe von Arzneimitteln eine Rolle spielen.
Vorzugsweise umfaßt die Aktivierung die Induktion einer durch NK-Zellen vermittelten Immunantwort. Dabei ist besonders bevorzugt, daß die durch NK-Zellen vermittelte Immunantwort eine Stimulation der Proliferation der NK-Zellen und/oder die Steigerung der zytolytischen Aktivität der NK-Zellen umfaßt. Der Einsatz von Hsp70 bzw. von Fragmenten oder Derivaten davon erfolgt allen vorgenannten Ausführungsformen einer (pharmazeutisch) wirksamen Menge, so daß die gewünschte Aktivierung, vorzugsweise die Immunantwort, induziert wird. Die Immunantwort richtet sich vornehmlich, aber nicht ausschließlich gegen solche Zellen, die Hsp70 oder Fragmente davon auf der Zelloberfläche exprimieren. Hierzu gehören sowohl menschliche als auch tierische Zellen. Zu diesen Hsp70 auf der Zelloberfläche expπmierenden menschlichen oder tierischen Zellen gehören beispielsweise Tumorzellen und Zellen von Patienten mit Infektionskrankheiten. Die zytolytische Aktivität der durch Hsp70 erfmdungsgemäß stimulierten NK-Zellen ist signifikant erhöht, so daß eine immunologische Elimination dieser Hsp70 auf der Zelloberfläche expπmierenden Zellen ermöglicht wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung ist die zytolytische Aktivität gegenüber Tumorzellen und/oder Zellen von Patienten mit Infektionserkrankungen gesteigert .
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung ist die zytolytische Aktivität gegenüber Leukämiezellen, Lymphomzellen, Tumorzellen und meta- stasierenden Zellen solider Tumore und Zellen von Patienten mit viralen, mykotischen oder bakteriellen Infektlonserkrankungen gesteigert. Ein Beispiel für die Behandlung viraler Erkrankungen ist die Behandlung von HIV-Infektionen, ein Beispiel für eine bakterielle Infektion ist die Behandlung von durch My- kobakteπen hervorgerufenen Erkrankungen. Zu den soliαen Tumoren, deren Metastasenzellen durch das erfindungsgemäße immunologische Verfahren behandelbar sind, gehören beispielsweise Karzinome, Sarkome, Melanome oder Leukämien und Lymphome . Beispiele für Karzinome sind Kolonkarzinome und Lungenkarzinome. Durch die erfindungsgemäße Verwendung eines Hsp70 -Proteins , Teilen dieses Proteins oder > 70% sequenzhomologer Proteine können Zellen lysiert werden, die durch Viren, Bakterien und/- oder Pilze infiziert sind oder Zellen, die tumorigen verändert sind. Auch Zellen, die antigene Teile dieser Fremdorganismen oder Teile von Tumorzellen enthalten, können durch die erfindungsgemäße Anwendung des Hsp70-Proteins mit Hilfe der aktivierten NK-Zellen lysiert werden.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur ex vivo oder in vitro Aktivierung von NK-Zellen, wobei man eine NK-Zellen enthaltende physiologische Zellsuspension mit einem Hsp70- Protein, einem C-terminalen Fragment davon oder einem Derivat davon oder einem Protein mit einer Aminosäuresequenzhomologie zum C-terminalen Bereich (Aminosäuren 384-641) des Hsp70- Proteins von j≥. 70% vermischt und inkubiert, um eine Aktivierung der NK-Zellen zu bewirken.
Die Inkubation kann bei Raumtemperatur, bevorzugt aber bei physiologischer Temperatur (37°C) auf einem Schüttler (sanftes Schütteln) erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt die Aktivierung eine Stimulation der Proli- feration der NK-Zellen und/oder eine Steigerung ihrer Zytotoxizität . Hinsichtlich der bevorzugten Zielzellen für die zytotoxische Aktivität wird auf die vorstehenden Darstellungen verwiesen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden als NK-Zellen enthaltende physiologische Zellsuspension periphere, mononukleäre Blutzellen (PBMC) oder eine NK-Zellen enthaltende Fraktion hiervon eingesetzt .
Die NK-Zellen können durch geeignete Verfahren aus den zu behandelnden Patienten oder aus einem gesunden Spender durch Blutabnahme gewonnen werden. Bevorzugt sollen Buffy-Coats (Lymphozytenkonzentrate) , die NK-Zellen enthalten, verwendet werden.
Buffy-Coats (Lymphozytenkonzentrate) werden über die Vene aus dem Patienten entnommen und z.B. mit Heparin versetzt, um eine Verklumpung der Zellen zu verhindern. Die mit Heparin versetzten Buffy-Coats werden in einem sterilem Gefäß (zumeist Plastiksäckchen) gesammelt und anschließend zentrifugiert , so daß es zu einer Anreicherung von Blutzellen ( = PBMC, periphere, mononukleäre Blutzellen, z.B. Lym-phozyten, Erythrozyten, Granulozyten usw.) kommt. Das Lymphozy- tenkonzentrat bleibt steril im Gefäß (Plastikbeutel) . Im Falle von gesunden Probanden besteht ein Buffy-Coat aus weißen und roten Blutzellen (Lymphozyten, Erythrozyten usw.). Im Falle eines Tumorpatienten besteht der Buffy-Coat nicht nur aus Blutzellen, sondern kann auch Tumorzellen enthalten (bei Leukämien, z.B. leukämische Zellen = Blasten; bei soliden Tumoren, z.B. metastastasierte Zellen) .
Die Buffy-Coats, die periphere, mononukleäre Blutzellen enthalten, werden in Form einer physiologischen Zellsuspension, bevorzugt versetzt mit Heparin, eingesetzt. Das Heparin verhindert eine Aggregation der Zellen.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält die Zellsuspension weiterhin Hsp70 auf der Zelloberfläche exprimierende menschliche oder tierische Zellen. Eine Stimulation der NK- Zellen durch Hsp70-Protein kann allerdings auch erfolgen, wenn keine Hsp70 auf der Zelloberfläche exprimierende Zielzellen (Tumorzellen, infizierte Zellen) vorhanden sind.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden als menschliche oder tierische Zellen Tumorzellen, Zellen von Patienten mit Infektionserkrankungen eingesetzt . In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden als menschliche oder tierische Zellen Leukämiezellen, Lymphomzellen, metastasierende Zellen solider Tumore und Zellen von Patienten mit viralen, mykotischen oder bakteriellen Infektionserkrankungen eingesetzt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die die Zellen und Proteine enthaltende physiologische Zellsuspension mindestens 3 Stunden inkubiert.
Um die zytolytische Wirkung der Natürlichen Killerzellen zu steigern, werden in dieser Ausführungsform vorzugsweise die Zielzellen der Natürlichen Killerzellen zusammen mit den Natürlichen Killerzellen und dem Hsp70 miteinander in Suspension vorzugsweise für den genannten Zeitraum inkubiert. Allerdings sind auch Langzeitinkubationen für mindestens 4 Tage möglich. Dementsprechend wird in einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Inkubation 4 Tage lang vorgenommen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung oder des erfindungemäßen Verfahrens wird zusätzlich ein Zytokin eingesetzt. Das Zytokin kann dabei getrennt mit den NK-Zellen und/oder den Hitzeschockproteinen, Fragmenten oder Derivaten davon oder zusammen in einer Dosis eingesetzt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Verwendung oder des Verfahrens wird als Zytokin ein Interleukin eingesetzt. Auch eine Kombination von Interleukinen kann erfindungsgemäß zusammen mit dem Hsp70-Protein eingesetzt werden, um die Aktivierung der NK-Zellen weiter zu verstärken, z.B. die durch NK-Zellen vermittelte Immunantwort oder die Stimulation der Proliferation der NK-Zellen.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Verwendung oder des Verfahrens der Erfindung wird als Interleukin IL-2, IL-12 und/oder IL-15 eingesetzt.
Durch die Erfindung eröffnet sich die Möglichkeit, nicht nur ex vivo aktivierte NK-Zellen in den Patienten zu reinfundieren, sondern aufgrund der Vermeidung toxischer Stoffe erfindungemäß behandelte NK-Zellen, z.B auch in Kombination mit einer Hyper- thermiebehandlung, auch in vivo einzusetzen. Diese Ausführungsform der Erfindung hat den weiteren, unschätzbaren und überraschenden Vorteil, daß auch Zielzellen, z.B. Tumorzellen, die den bekannten Therapieverfahren widerstanden, nunmehr durch zytolytische Wirkung von NK-Zellen immunologisch abgetötet werden können. Die Erfindung betrifft somit ferner ein Verfahren zur in vivo-Aktivierung des Immunsystems, wobei man einem Patienten eine pharmazeutisch wirksame Menge von nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren aktivierten NK-Zellen verabreicht, gegebenenfalls in Kombination mit oder zeitlich vor einer pharmazeutisch wirksamen Menge eines Hsp70 -Proteins, eines C-terminalen Fragmentes davon oder eines Derivats davon oder eines Proteins mit einer Aminosäuresequenzhomologie zum C- terminalen Bereich (Aminosäuren 384-641) des Hsp70-Proteins von j≥. 70% verabreicht.
Im Falle, daß die Wirkstoffe zusammen verabreicht werden, können die Wirkstoffe in einem Container oder mehreren Containern getrennt formuliert sein, während sie im Falle einer zeitlich getrennten Verarbeitung getrennt formuliert sind.
Sofern die NK-Zellen vor dem Hsp70 -Proteinen verabreicht werden, sollte der entsprechende Zeitraum vor der Gabe des Hsp70 -Proteins mindestens 3-24 Stunden betragen.
Ein Beispiel für eine erfindungsgemäße Behandlung ist wie folgt:
Buffy-coat-Zellen (Lymphoztenkonzentrate) , bestehend aus peri- pheren, mononukleären Blutzellen oder Knochenmarkszellen und Tumorzellen aus Tumorpatienten, beispielsweise Leukämiepatienten, werden in einem Behälter, beispielsweise einem Kunststoff- behälter, der steril verschlossen ist, einer Behandlung mit dem Hsp70, Hsp70 -verwandten Protein und/oder wirksamen Fragmenten oder Derivaten hiervon, m einem temperaturkontrollierten Wasserbad einer Hitzebehandlung unterzogen. Im Behälter befinden sich sowohl die Tumorzellen als auch die NK-Zellen, die über die vorliegende Behandlung stimuliert werden. Nach Abschluß des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die aktivierte NK-Zellen und die lysierten Tumorzellen enthaltende Kulturlosung den Patienten remfundiert .
Er mdungsgemäß liegen die NK-Zellen gegebenenfalls zusammen mit anderen peripheren, mononukleären Blutzellen, beispielsweise zusammen mit Erythrozyten und Granulozyten und T-Zellen, vor. Bevorzugt werden somit die NK-Zellen nicht alleine verwendet, sondern durch Isolierung von Buffy-Coat- Zellen eine Mischung der peripheren, mononukleären Blutzellen gewonnen. Bei Tumorpatienten enthalten diese Anreicherungen weiterhin Tumorzellen, die durch das erf dungsgemäße Verfahren immunologisch eliminiert werden.
Desweiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur m vivo- Aktivierung von NK-Zellen, wobei man einem Patienten eine pharmazeutisch wirksame Menge eines Hsp70 -Proteins , eines C- termmalen Fragmentes davon oder eines Derivats davon oder eines Proteins mit einer Aminosäuresequenzhomologie zum C- termmalen Bereich (Aminosäuren 384-641) des Hsp70-Protems von .≥. 70% verabreicht.
Weiterhin betrifft die Erfindung e n Verfahren zur Benandlung von Tumoren, Krebserkrankungen und/oder Infektionskrankheiten, wobei man einem Patienten eine pharmazeutisch wirksame Menge von nach dem vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahren aktivierten NK-Zellen und/oder eines Hsp70-Protems, eines C-termmalen Fragmentes davon oder eines Derivats davon oder eines Proteins mit einer Aminosäuresequenzhomologie zum C- termmalen Bereich (Aminosäuren 384-641) des Hsp70-Prote s von .≥. 70% verabreicht. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist der Tumor ein solider Tumor oder eine Metastase. Die Behandlungsstrategie zielt insbesondere auf die Elimination von Einzelzell -Metastasen ab, die durch das erfindungsgemäße Verfahren immunologisch eliminiert werden können. Eine verstärkte Aktivierung Hsp70-spezifischer NK-Zellen kann durch eine Zugabe von Interleukin-2 in einer niedrigen Dosis, beispielsweise 100 I.U., erreicht werden. Das Interleukin-2 kann beispielsweise zusammen mit dem Hsp70 in den sterilen Behälter, beispielsweise einen KunstStoffbehälter , eingeführt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Krebserkrankung Leukämie oder ein Lyτnphom.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Infektionskrankheit viralen, mykotischen oder bakteriellen Ursprungs .
Die Erfindung betrifft ferner ein Arzneimittel, einen medizinischen Hilfsstoff, oder ein Medizinprodukt, das ein Hsp70-Protein, ein C-terminales Fragment davon oder ein Derivat davon oder ein Protein mit einer Aminosäuresequenzhomologie zum C-terminalen Bereich (Aminosäuren 384-641) des Hsp70-Proteins von ≥. 70% und/oder von nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aktivierten NK-Zellen in einer therapeutisch wirksamen Menge sowie gegebenenfalls übliche Träger- und/oder Hilfsstoffe enthält. Dem Arzneimittel ist gegebenenfalls ferner ein wie oben definiertes Zytokin zugesetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Arzneimittels, medizinischen Hilfsstoffs oder Medizinproduktes liegt das Protein in einer Konzentration von mindestens 1 μg/ml, bevorzugt bis zu 1000 μg/ml, vorzugsweise 1 x 10s bis 5 x 108 NK- Zellen, wobei eine Menge von 10 μg bis 600 μg/ml bevorzugt ist.
Beispiele für geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger sind dem Fachmann geläufig und umfassen beispielsweise phosphatgepufferte Salzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie z. B. Öl/Wasser-Emulsionen, sterile Lösungen, etc. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen (Arzneimittel) , die derartige Träger enthalten, können nach gängigen Verfahren formuliert werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem betroffenen Individuum in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Arten der Verabreichung sind beispielsweise intravenös, intraperitoneal , subcutan, intramusculär, topisch oder intradermal. Die Dosierung hängt dabei von vielen Faktoren ab, z. B. von der Größe, dem Geschlecht, dem Gewicht, dem Alter des Patienten, sowie der Art der speziell verabreichten Verbindung, der Art der Administration etc. Im allgemeinen liegt die monatlich verabreichte Dosis bei 10 bis 1000 μg . Im Zusammenhang mit der intravenösen Injektion von erfindungsgemäßen Substanzen sind Dosierungen von 10 bis 1000 μg gängig. Die Zusammensetzungen können lokal oder systemisch verabreicht werden. Im allgemeinen wird die Verabreichung parenteral erfolgen. So werden die erfindungsgemäß mit Hsp70- Protein behandelten NK-Zellen bevorzugt intravenös injiziert. Es kann auch eine Injektion direkt in den Tumor erfolgen, wobei eine wirksame Menge der NK-Zellen injiziert wird. Selbstverständlich sind auch andere, an sich bekannte Applikationsformen möglich.
Das Hsp70-Protein selbst kann beispielsweise zusammen mit Zytokinen appliziert werden. Ein Beispiel für eine Applikation ist die Injektion des Hsp70-Proteins, z.B. zusammen mit Zytokinen intravenös, intramuskulös, subkutan, intraperitonial oder auch in die Fußsohle.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Verwendung oder des Verfahrens oder des Arzneimittels, des Medizinprodukts oder des medizinischen Hilfsmittels der Erfindung ist das Hsp70-Protein ein humanes Protein. Beispielsweise ist das erfindungsgemäße Protein humanen Ursprungs (bei der Isolierung aus Zellextrakten) bzw. weist die Aminosäuresequenz des menschlichen Hsp70-Proteins auf (z. B. nach rekombinanter Herstellung) . Es können aber auch tierische Hsp70-Proteine eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäß eingesetzte Hsp70 -Protein oder die Fragmente können sowohl rekombinant hergestellt werden, aus Zellextrakten isoliert werden oder über chemische Synthese hergestellt werden.
Bevorzugt ist, daß das Hsp70 -Protein oder dessen Fragment oder Derivat ein rekombinantes Protein ist. Derartige rekombinante Proteine können nach Standardverfahren hergestellt werden.
Diese Standardverfahren sind dem Fachmann bekannt (Sambrook et al . , loc. cit. und Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology" , Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)). Zur rekombinanten Herstellung der Proteine werden Nucleinsäuremolekule eingesetzt, die das erfindungsgemäße Hsp70 -Protein oder Fragmente hiervon codieren. Diese können verschiedene Nucleinsäuremolekule sein, insbesondere DNA oder RNA Moleküle, beispielsweise cDNA, genomische DNA, mRNA etc. Diese Nucleinsäuremolekule können natürlich vorkommenden Moleküle sein und/oder durch genetische oder chemische Syntheseverfahren hergestellte Moleküle. Um rekombinante Proteine herzustellen, verwendet der Fachmann Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bakteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren (Sambrook et al . , loc . cit . ) . Die in den Vektoren enthaltenen Nucleinsäuremolekule können verknüpft sein mit regulatorischen Elementen, die die Expression in prokaryontisehen oder eukaryontisehen Zellen gewährleistet. Hierbei kann der Begriff "Expression" Transkription als auch Transkription und Translation bedeuten. Regulatorische Elemente umfassen dabei insbesondere Promotoren. Für die Expression eines Nucleinsäuremoleküls in prokaryontischen Zellen stehen eine Reihe von Promotoren zur Verfügung, z. B. der E. coli lac- oder trp-Promotor, der PR- oder PL-Promotor des Lambda-Phagen, lad, lacZ, T3 , T7, gpt, etc. Eukaryontisehe Promotoren sind beispielsweise der CMV immediate early-Promotor, der HSV- Promotor, der Thymidinkinase-Promotor, der SV40 -Promotor, LTRs von Retroviren und der Maus Metallothionin I -Promotor. Es ist bereits eine Vielzahl von Expressionvektoren für die Expression in prokaryontischen oder eukaryontisehen Zellen beschrieben, z. B. für Eukaryonten pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) oder GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI , USA), pSV2CAT, pOG44 und für Prokaryonten pQE70, pQE60, pBluescript SK, etc. Neben Promotoren können diese Vektoren auch Elemente zur weiteren Steigerung der Transkription enthalten, wie z. B. sogenannte Transkriptions-Enhancer . Beispiele dafür sind der SV40-Enhander, der Polyoma-Enhancer, der Cytomegalovirus early promoter-Enhancer und Adenovirus-Enhancer. Die rekombinanten Proteine können daher in verschiedenen prokaryontischen oder eukaryontisehen Wirtszellen, beispielsweise unter Einsatz der oben beschriebenen Vektoren, exprimiert werden. Beispiele für solche Wirtszellen sind bakterielle Zellen (wie z. B. E. coli, Streptomyces, Bacillus, Salmonella typhimurium) , Pilzzellen (wie beispielsweise Hefezellen, insbesondere Saccharomyces cerevisiae) , Insektenzellen (wie. z. B. Drosophila- oder SF9- Zellen) , tierische Zellen (wie z. B. CHO oder COS-Zellen) oder auch Pflanzenzellen, etc. Solche Wirtszellen werden unter Bedingungen kultiviert, die die Expression des rekombinanten Proteins erlauben, welches anschließend aus den Zellen und/oder aus dem Kulturmedium gewonnen werden kann. Verfahren zur Expression von Fremdprotein in verschiedenen Arten von Wirtszellen sowie zur Gewinnung des produzierten Proteins sind dem Fachmann geläufig.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Verwendung oder des Verfahrens oder des Arzneimittels, Medizinprodukts oder medizinischen Hilfsstoffs der Erfindung umfaßt das Hsp70- Protein das C-terminale Fragment die Aminosäuren 384 bis 561 von menschlichem Hsp70 oder den entsprechenden Bereich aus einem anderem Hsp70, das die erfindungsgemäßen Wirkungen aufweist oder umfaßt das C-terminale Fragment die Aminosäuren 454 bis 460 von menschlichem Hsp70. Erfindungsgemäß konnte überraschenderweise gezeigt werden, daß Fragmente, welche diese minimale Sequenz von 7 Aminosäuren (NLLGRFE) haben, durch Antikörper gehemmt werden, wodurch NK-Aktivierung unterbunden bzw. getrennt wurde. Die Experimente wurden entsprechend Multhoff et al., J. Immunol . 158 (1997), 4341-4350 durchgeführt. Es wurde der von Amersham erhältliche Antikörper RPN 1197 eingesetzt. Die 7 Aminosäuren können dabei von natürlicherweise flankierenden Hsp70-Sequenzen oder durch andere Aminosäuren flankiert sein. Bevorzugt ist, daß die 7 Aminosäuren in ihrem natürlichen Kontext verbleiben. Sofern andere flankierende Aminosäuren eingesetzt werden, wird bevorzugt der dreidimensionale Kontext, in dem die genannten 7 Aminosäuren natürlicherweise stehen beibehalten. Innerhalb der 7 Aminosäuren können weitere Aminosäureaustausche erfolgen, sofern die Homologie von mindestens 70% beibehalten wird. Allerdings umfassen diese Austausche nicht einen Austausch von Arginin in Position 458 durch Lysin. Dieser Austausch führt zu einer Konformationsänderung. Entsprechend sind Austausche, die in den Bereich der 7 Aminosäuren zu einer Konformationsänderung führen nur dann von der Erfindung umfaßt, wenn sie die gewünschten Aktivierungseigenschaften aufweisen.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der nach einem Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ausführungsformen behandelten NK-Zellen zur Therapie von Tumorerkrankungen, und/oder Infektionserkrankungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung erfolgt die Therapie durch Reinfundierung der behandelten NK-Zellen.
Die vorstehend beschriebenen in vivo Verfahren können auch als Behandlungsverfahren zur Behandlung der beschriebenen Indikatoren eingesetzt werden. Die Figuren zeigen:
FTGUR, 1 : Vergleich der proliferierenden Aktivität getrennter NK- (A) - und T(B) -Zellen, die entweder mit IL-2 (100 IU/ml) -Medium oder mit anderen rekombinanten Hsp70- Proteinen (rHsp70, rHsp70-Cterm. (Aminosäuren 384- 561) , rHsp70homC, DnaK, Hsc70 und hitzedenaturiertem rHsp70) , die in IL-2-Medium (100 IU/ml) suspendiert sind, je mit einer Konzentration von 10 μg/ml, stimuliert wurden. Die phänotypische Charakterisierung der NK-Zellen ist wie folgt:
CD3 : < 5%; CD16/CD56 : 46-87%; CD94 : 60-70%; p58.1 und p58.2 : < 5% und T-Zellen: CD3 : 85-92%; CD16/CD56 : 5-10%; CD94 : < 29%; p58.1 und p58.2: nicht getestet; p70: nicht getestet, durchflußzytome- trisch bestimmt. Die Proliferation der Zellen wurde nach 48 Stunden und nach Inkubation mit 3H-Thymidin (1 μCi/ml) bei 37°C für 18 Stunden bestimmt. Der relative Prozentsatz der 3H-Thymidin-Aufnahme in NK- (A) und T(B) -Zellen wurde mit den Wirkungen von IL-2 allein (100%) verglichen. Die Werte zeigen die Mittelwerte von vier bis sieben unabhängigen Experimenten ± Standardabweichung .
FTGU 2 : Vergleich der zytotoxischen Aktivität hochgereinigter NK-Zellen (CD3 : < 2%; CD16/CD56 : 75-80%; CD94 : 65- 87%; p58.1 und p58.2 : 20-30%; p70 : < 10%), die entweder unbehandelt blieben (durchgezogene Linien, leere Symbole) oder nach einer Vorinkubation der NK- Zellen mit rHsp70 (A) -Protein (je 5 μg/ml für 4 Tage; durchgezogene Linien, ausgefüllte Symbole) vorinku- biert wurden, gegenüber 51Cr-markierten Tumortargetzellen CX+ (A) und CX- (B) , die sich aufgrund ihrer Fähigkeit, Hsp70 auf ihrer Plasmamembran zu exprimieren, unterscheiden. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der spezifischen Lyse bei verschiedenen E : T-Verhältnissen von 0,2 : 1 bis 2 : 1 ausgedrückt. Jeder Punkt stellt den Mittelwert zumindest dreier unabhängiger Experimente ± Standardabweichung dar. Der Prozentsatz an spontaner Freisetzung für jede Tumortargetzellinie war immer unter 15%.
FTGUR 3 : Tumorwachstum von Hsp70 tragenden CX+ Zellen in im- mundefizienten M usen. Nach i. p. -Injektion von NK- Zellen wird das Tumorwachstum vollständig inhibiert (bei i .p. -Injektion der Tumorzellen). Die Tumorgröße wurde in cm2 angegeben .
Tumorwachstum nach i .p . -Injektion von CX+ und NK-Zellen am Tag 21.
FTGUR 4 : Tumorwachstum von Hsp70 tragenden CX+ Zellen in im- mundeffizienten Mäusen. Nach i. v. -Injektion von NK- Zellen wird das Tumorwachstum vollständig inhibiert. Das Tumorwachstum wurde in Gramm gemessen. Tumorwachstum nach o . t . -Injektion von CX+ und i.v.- Injektion von NK-Zellen am Tag 35. Die NK-Zellen verhindern das Tumorwachstum von Hsp70 -tragenden CX+ Zellen nach 3 bzw. 5 Wochen nach Injektion und (vgl. Figur 3) . Sowohl eine intraperitoniale als auch eine intravenöse Applikation der NK-Zellen führt zu vergleichbaren Ergebnissen.
FTGUR 5 : Intaktes Hsp70-Protein mit Darstellung des C-terminalen Bereichs
FTGUR 6 : Darstellung des Einflusses von Hsp70 und/oder Zytokinen auf die durch NK-Zellen vermittelte Immunantwort. Die Zytokinzugabe bewirkt auch eine Stimulation von T-Zellen.
Jedes der hierin zitierten Dokumente (einschließlich Angaben des Herstellers, Bedienungsanleitungen, etc.) wird hiermit durch Bezugnahme in die Beschreibung inkorporiert .
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1: Gesteigerte Proliferation von NK-Zellen nach Gabe von Hsp70
Die Proliferation gereinigter NK- und T-Zellen, die mit den Hsp70-Proteinen rHsp70, DnaK, Hsc70, rHsp70-C term. und rHsp70homC (Aminosäuren 384-561) stimuliert worden waren, wurde in einem 3H-Thymidin-Aufnahme-Standardtest bestimmt (Testbedingungen vgl . später) . Dazu wurden zunächst periphere Blutlymphozyten aus freiwilligen, menschlichen Spendern in nicht-adhärente CD3+ T-Zell und transient (12-24 Stunden) adhärente CD3- (CD16+/CD56+) NK-Zell-Subpopulationen in einem Mehrschrittverfahren und nachfolgender 12 -stündiger Inkubation in einem IL-2 -enthaltendem Medium (vgl. 3) getrennt. Die Zellen wurden getrennt in rIL-2 (100 IU, Chiron, Frankfurt, Deutschland) , enthaltend ein RPMI 1640 (Life Technologies, Eggenstein, Deutschland) -Medium für 3-4 Tage lang kultiviert. Die Proliferation wurde als H-3 Aufnahme gemessen.
Panning-Experimente wurden unter Verwendung von humanem, rekombinanten Hsp70 (rHsp70, SPP-755, StressGen Biotechnologies, Victoria, Canada) und DnaK (Hsp70-Homolog, erhalten aus E. coli, SPP-630, StressGen) durchgeführt. Die Proteine wurden in PBS zu einer Stammkonzentration von 1 μg/ml verdünnt und in Aliquots bei -80°C tiefgefroren. T-25-Kultur- flaschen wurden mit rHsp70 bzw. DnaK-Protein (10 μg/ml) , verdünnt in 3 ml eiskaltem Carbonatpuffer, pH 9,5 12 Stunden lang inkubiert. Nach Abblockung nicht-spezifischer Bindungsstellen mit PBS/5% FKS wurde eine Mischung aus T- und NK-Zellen suspendiert in PBS/l% FKS in einem Verhältnis von 1 : 2 und 2 : 1 in den Kulturflaschen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nicht-adhärente Zellen wurden aus der Überstandsfraktion nach Inkubation erhalten. Adhärente Zellen wurden durch sequentielle Waschschritte unter Verwendung von eiskalter PBS/10% FKS-Lösung erhalten. Um leicht-adhärente Zellen zu entfernen, wurde ein einzelner, milder Waschschritt verwendet, während stark-adhärente Zellen durch zusätzliche, stringente Waschschritte erhalten wurden. Die bei jedem Schritt erhaltenen Zellpopulationen wurden getrennt gezählt und durchflußzytometrisch, phänotypisch charakterisiert.
Die Durchflußzytometrie wurde wie in (4) beschrieben auf einem FACScan-Instrument (Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) durchgeführt. Der Prozentsatz an positiv-gefärbten Zellen wurde definiert als Differenz zwischen der Zahl spezifisch-gefärbter, vitaler (propidiumiodid-negativer) Zellen minus der Anzahl an Zellen, die mit dem Isotyp entsprechenden Kontrollantikörpern gefärbt waren. Die nachfolgenden Antikörper wurden zur phänotypisehen Kennzeichnung der Effektorzellen verwendet : Dem Isotyp-entsprechender Kontrollantikörper (Dianova, Hamburg, Deutschland; Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) , CD16 (Dianova, Hamburg, Deutschland) , CD3 (Dianova, Hamburg, Deutschland) .
Die Proliferationsfähigkeit von T- oder NK-Zellen gegen unterschiedliche Hsp70 -Proteine wurde in einem 3H-Thyτnidin-Aufnahme- Standardtest bestimmt. Lebensfähige Zellen (5 x 104 Zellen/100 μl) wurden in eine 96 Vertiefungen-enthaltende Mikrotiterplatte mit einem flachen Boden (Greiner, Nürtingen, Deutschland) eingesät, wobei ein supplementiertes RPMI 1640-Medium mit 100 IU IL-2 und verschiedenen, rekombinanten Hsp70 -Proteinen (rHsp70, DnaK, Hsc70, die konstitutive Form von Hsp70, gereinigt aus Rinderhirn, SPP-750; StressGen; rHsp70-C term. , sie rek. C-terminale Peptidbindungsdomäne von Hsp70 (Aminosäuren 384 - 561) , rHsp70homC, die rekombinante C-terminale Peptidbindungsdomäne von Hsp70hom (Hsp70hom ist ein Testis spezifisches Mitglied der Hsp70 Familie, das eine starke Homologie (94%) zu Hsp70 aufweist) , Aminosäuren 384-561) eingesetzt wurde. Durch Test verschiedener Konzentrationen der Hsp70 -Proteine (1 - 200 μg/ml) konnte herausgefunden werden, daß eine Endkonzentration von 100 μg/ml zur Stimulation optimal war. Als weitere interne Kontrolle wurde die proliferierende Aktivität gegen IL-2 (100 IU) parallel bestimmt. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden oder 48 Stunden wurden die Zellen mit 3H-Thymidin (1 μCi/Vertiefung) markiert, und die Gesamtaufnahme wurde nach 18-stündiger Inkubation bei 37°C in einem Flüssigszintillationszählgerät (Beckmann Instruments, München, Deutschland) bestimmt. Als interne Kontrolle wurde weiterhin die Proliferationskapazität von aus dem gleichen Spender stammenden T-Lymphozyten bestimmt. Dosiseskalierungsuntersuchungen unter Verwendung verschiedener Hsp70 -Proteine/Fragmente in Konzentrationen von 1-200 μg/ml zeigten, daß eine maximale Stimulierung der Proliferationskapazität mit 100 μg/ml Hsp70-Protein erreichbar war. Die Prolife- rationsaktivität isolierter NK- und T-Zellen wurde nach in vitro-Stimulation mit rHsp70, DnaK, Hsc70, rHsp70-C term. bzw. rHsp70homC (Aminosäuren 384-562) getestet. Wie in der Figur 1A gezeigt, wurde die NK-Zellproliferation durch rHsp70 signifikant stimuliert. Die Stimulation durch den carboxy- terminalen Bereich von Hsp und durch rHsp70homC, das in der C- terminalen Domäne mit den Aminosäuren 384-561 zu 94% mit Hsp70 identisch ist, ist ebenfalls möglich. Im Gegensatz dazu stimulierten DnaK und Hsc70 die Proliferation von NK-Zellen nicht. Hitzedenaturiertes rHsp70 verlor die stimulatorischen Eigenschaften für die Proliferation von NK-Zellen vollständig.
Weiterhin konnte gezeigt werden, daß die Proliferation von CD3 - positiven T-Lymphyten durch DnaK stimulierbar war, während rHsp70, Hsc70 und rHsp70homC und hitzedenaturiertes rHsp70 keine Wirkung auf die Proliferationsfähigkeit von T-Zellen zeigten (Figur 1B) .
Zusammenfassend konnte somit eine Proliferation von NK-Zellen durch rekombinantes humanes Hsp70 -Protein durch den C- terminalen Bereich von Hsp70 (384 - 561) und rHsp70homC, einem zum Hsp70 homologen Protein, induziert werden, während eine Proliferation der T-Zellen selektiv durch bakterielles Hsp70 (E. coli DnaK) stimulierbar war. Beispiel 2: Steigerung der zytolytischen Aktivität von NK- Zellen nach Gabe von Hsp70
Eine funktioneile Analyse der NK-Zellen unter Verwendung von Hsp70-exprimierenden (CX+) und Hsp70 -nicht -exprimierenden (CX-) -Tumorzellen zeigte, daß die Plasmamembranexpression von Hsp70 mit einer erhöhten Sensitivität für die durch NK-Zellen vermittelte Lysis korrelierte. Diese durch NK-Zellen vermittelte Lysis von Tumorzellen kann durch Vorinkubation der Tumorzellinien mit monoklonalen Antikörpern, die gegen den carboxy-terminalen Bereich (Aminosäuren 504-617) von Hsp70 gerichtet sind und mit dem Antikörper RPN1197 (1, 4) , blockiert werden. Nachfolgend wurde der Einfluß von rekombinantem Hsp70- Protein (rHsp70) auf die zytolytische Aktivität von NK-Zellen für die autologen, Hsp70 -exprimierenden (CX+) - und Hsp70-nicht- exprimierenden (CX-) -Tumorzellen analysiert. Die Ergebnisse der Zytotoxizitätstests unter Verwendung hochgereinigter NK-Zellen, die mit Hsp70-Protein in einer Konzentration von 5 μg/ml für 4 Tage vorinkubiert worden waren, sind in der Figur 2A und B zusammengefaßt . Die Versuchsansordnung war dabei wie folgt : Zur Stimulation der zytotoxischen Aktiviatät wurden NK-Zellen mit 10 μg/ml rHsp70 inkubiert. Die Stimulation wurde in 4-tägigem Abstand wiederholt.
Die humanen, autologen Kolonkarzinom-Subzellinien CX+ und CX-, die sich in ihrer Hsp70-Expression auf der Plasmamembran unterscheiden (Multhoff et al., J. Immunol . 158 (1997), 4341), wurden in RPMI 1640 -Medium, supplementiert mit 10% FKS (Life Technologies) , 6 mM L-Glutamin und Antibiotika (100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin; Life Technologies) kultiviert. Exponentiell wachsende Tumorzellen wurden als Targetzellen verwendet, und gereinigte CD3- NK-Zellen wurden, nach Zellsortierung unter Verwendung von eines FACStarplUΞ- Instruments (Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) , als Effektorzellen eingesetzt. Die durch NK-Zellen vermittelte Zy- totoxizität wurde unter Verwendung eines 4-stündigen 51Cr-Ra- dioisotopentests (Multhoff et al . , J. Immunol . 158 (1997), 4341) bestimmt. Der Prozentsatz der spezifischen Lyse wurde wie folgt berechnet: [(experimentelle Freisetzung - spontane Freisetzung) / (maximale Freisetzung - spontane Freisetzung)] x 100. Die spontane Freisetzung von Cr-51 betrug in allen Versuchen unter 15%.
Überraschenderweise konnte gezeigt werden, daß bei einer Inkubation der NK-Zellen mit rHsp70 -Protein für mindestens 4 Tage sowohl die Proliferation als auch die zytolytische Aktivität von NK-Zellen gegenüber Hsp70 -exprimierenden Tumorzellen (CX+) stimuliert wurde. Im Gegensatz dazu verloren NK-Zellen aus dem gleichen Spender, die nicht mit rHsp70 behandelt wurden, diese Reaktivität nach 10 Tagen (Daten nicht gezeigt) . Die lytische Aktivität von nicht mit rHsp70 stimulierten NK-Zellen war im Vergleich zu mit rHsp70 behandelten und stimulierten NK-Zellen geringer, und es konnte dann kein signifikanter Unterschied in der Lyse Hsp70-exprimierender und nicht-exprimierender Tumorzellen festgestellt werden.
Die vorliegenden Untersuchungen zeigen, daß der carboxy-termi- nale Teil von Hsp70 (Aminosäuren 384 - 641) , für die Stimulierung der zytolytischen und proliferativen Funktion von NK-Zellen verantwortlich ist. Erfindungsgemäß konnte somit gezeigt werden, daß insbesondere der carboxy-terminale Teil des Hsp70 -Proteins als stimulierendes Signal für NK-Zellen wirkt, die spezifisch Hsp70-exprimierende Tumorzellen in vitro angreifen.
Beispiel 3: Anti-tumorale Wirkung mit Hsp70 stimulierter NK- Zellen
Für die Untersuchung der in vivo Relevanz von NK-Zellen gegenüber Hsp70 -exprimierenden Tumorzellen wurden Untersuchungen an immundefizienten SCID/beige Mäusen durchgeführt. Dabei wurden zunächst unterschiedliche Mengen an Tumorzellen (CX+ oder CX- Zellen) in SCID/beige Mäuse injiziert. Eine Menge von 2,5 Mio Zellen erwies sich als optimale Tumorzeilmenge zur Induktion von Tumorwachstum innerhalb eines Zeitraums von 3 bis 5 Wochen. Als Injektionsmethode wurde eine i.p. (intraperitoneale) oder o.t. (orthotope, d. h. hier in die Darmwand) Injektion von Kolonkarzinomzellen CX+ oder CX- in die Darmwand gewählt. Die NK-Zellen wurden nach Stimulation entweder i.p. oder i.v. (intravenös) appliziert. Wie in Figur 3 dargestellt, konnte in allen Tieren ein Tumorwachstum sowohl nach i.p. als auch nach o.t. Injektion erzielt werden. Im Gegensatz zur i.p. Injektion konnte nach o.t. Injektion neben dem Wachstum eines Primärtumors auch eine Metastasierung der CX+ Zellen vor allem in Milz und Lunge beobachtet werden (3 von 3 Mäusen nach o.t. Injektion) .
Eine Injektion von humanen NK-Zellen (i.p., aber auch i.v.) selbst vier Tage nach der Injektion von Tumorzellen führt zu einer vollständigen Inhibition des Tumorwachstums. Interessanterweise konnte durch NK-Zellen nicht nur das Wachstum von Primärtumoren (im i.p. Raum oder am Darm) inhibiert werden, sondern auch die Metastasierung der Tumore .
Diese Befunde machen deutlich, daß eine Immunrekonstitution von SCID/beige Mäusen mit voraktivierten, humanen NK-Zellen nicht nur in vitro, sondern auch in vivo (im Tier) zu einer Lyse von Tumorzellen führt. Interessanterweise kann auch die Metastasierung durch humane NK-Zellen unterdrückt werden.

Claims

Ansprüche
1. Verwendung eines Hsp70 -Proteins, eines C-terminalen Fragmentes davon oder eines Derivats davon oder eines Proteins mit einer Aminosäuresequenzhomologie zum C- terminalen Bereich (Aminosäuren 384-641) des Hsp70- Proteins von ≥ 70% zur Herstellung eines Arzneimittels, Medizinproduktsrodukts, oder medizinischen Hilfsstoffs zur Aktivierung von NK-Zellen.
2. Verwendung eines Hsp70-Proteins, eines C-terminalen Fragmentes davon oder eines Derivats davon oder eines Proteins mit einer Aminosäuresequenzhomologie zum C- terminalen Bereich (Aminosäuren 384-641) des Hsp70- Proteins von ≥ 70% zur in vitro oder ex vivo Aktivierung von NK-Zellen.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Aktivierung die Induktion einer durch NK-Zellen vermittelten Immunantwort umfaßt .
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Aktivierung eine Stimulation der Proliferation von NK- Zellen und/oder eine Steigerung der zytolytischen Aktivität von NK-Zellen einschließt.
5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die zytolytische Aktivität gegenüber Tumorzellen, Zellen von Patienten mit Infektionserkrankungen gesteigert ist.
6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die zytolytische Aktivität gegenüber Leukämiezellen, Lymphomzellen, Tumorzellen, metastasierenden Zellen solider Tumore und Zellen von Patienten mit viralen, mykotischen und/oder bakteriellen Infektionserkrankungen gesteigert ist.
. Verfahren zur ex vivo oder in vitro Aktivierung von NK- Zellen, wobei man eine NK-Zellen enthaltende physiologische Zellsuspension mit einem Hsp70-Protein, einem C-terminalen Fragment davon oder einem Derivat davon oder einem Protein mit einer Aminosäuresequenzhomologie zum C-terminalen Bereich (Aminosäuren 384-641) des Hsp70- Proteins von ._> 70% vermischt und inkubiert, um eine Aktivierung der NK-Zellen zu bewirken.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Aktivierung eine Stimulation der Proliferation der NK-Zellen und/oder eine Steigerung ihrer Zytotoxizität umfaßt.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei als NK-Zellen enthaltende physiologische Zellsuspension periphere, mononukleäre Blutzellen oder eine NK-Zellen enthaltende Fraktion hiervon eingesetzt werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die Zellsuspension weiterhin Hsp70 auf der Zelloberfläche exprimierende menschliche oder tierische Zellen enthält.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei als menschliche oder tierische Zellen Tumorzellen, Zellen von Patienten mit Infektionserkrankungen eingesetzt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei als menschliche oder tierische Zellen Leukämiezellen, Lymphomzellen, Tumorzellen, metastasierende Zellen solider Tumore und Zellen von Patienten mit viralen, mykotischen und/oder bakteriellen Infektionserkrankungen eingesetzt werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, wobei die die Zellen und Proteine enthaltende physiologische Zellsuspension mindestens 3 Stunden inkubiert wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Inkubation 4 Tage lang vorgenommen wird.
15. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 14, wobei zusätzlich ein Zytokin eingesetzt wird.
16. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 15, wobei als Zytokin ein Interleukin eingesetzt wird.
17. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 16, wobei als Interleukin IL-2, IL-12 und/oder IL-15 eingesetzt wird.
18. Verfahren zur in vivo-Aktivierung des Immunsystems, wobei man einem Patienten eine pharmazeutisch wirksame Menge von nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 17 aktivierten NK-Zellen verabreicht, gegebenenfalls in Kombination mit oder zeitlich vor einer pharmazeutisch wirksamen Menge eines Hsp70 -Proteins, eines C-terminalen Fragmentes davon oder eines Derivats davon oder eines Proteins mit einer Aminosäuresequenzhomologie zum C- terminalen Bereich (Aminosäuren 384-641) des Hsp70- Proteins von .≥. 70% verabreicht.
19. Verfahren zur in vivo-Aktivierung von NK-Zellen, wobei man einem Patienten eine pharmazeutisch wirksame Menge eines Hsp70 -Proteins, eines C-terminalen Fragmentes davon oder eines Derivats davon oder eines Proteins mit einer Aminosäuresequenzhomologie zum C-terminalen Bereich
(Aminosäuren 384-641) des Hsp70-Proteins von _> 70% verabreicht .
20. Verfahren zur Behandlung von Tumoren, Krebserkrankungen, Infektionskrankheiten oder Autoimmunerkrankungen, wobei man einem Patienten eine pharmazeutisch wirksame Menge von nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 17 aktivierten NK-Zellen und/oder eines Hsp70-Proteins, eines C-terminalen Fragmentes davon oder eines Derivats davon oder eines Proteins mit einer Aminosäuresequenzhomologie zum C-terminalen Bereich (Aminosäuren 384-641) des Hsp70- Proteins von ≥ 70% verabreicht.
21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Tumor ein solider Tumor oder eine Metastase ist.
22. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Krebserkrankung Leukämie oder ein Lymphom ist.
23. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Infektionskrankheit viralen, mykologischen oder bakteriellen Ursprungs ist.
24. Arzneimittel, Medizinprodukt oder medizinischer Hilfsstoff das/der ein Hsp70 -Protein, ein C-terminales Fragment davon oder ein Derivat davon oder ein Protein mit einer Aminosäuresequenzhomologie zum C-terminalen Bereich
(Aminosäuren 384-641) des Hsp70 -Proteins von _ 70% und/oder von nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 17 aktivierten NK-Zellen in einer therapeutisch wirksamen Menge sowie gegebenenfalls übliche Trägerund/oder Hilfsstoffe enthält.
25. Arzneimittel, Medizinprodukt oder medizinischer Hilfsstoff nach Anspruch 24, wobei das Protein in einer Konzentration von mindestens 10 μg/ml, bevorzugt bis zu 1000 μg/ml, vorliegt .
26. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 23 oder Arzneimittel, Medizinprodukt oder medizinischer Hilfsstoff nach Anspruch 24 oder 25, wobei das Hsp70-Protein ein humanes Protein ist .
27. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 26 oder Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 23 oder 26 oder Arzneimittel, Medizinprodukt oder medizinischer Hilfsstoff nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei das Hsp70- Protein oder dessen Fragment oder Derivat ein rekombinantes Protein ist .
28. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, 26 oder 27 oder Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 23, 26 oder 27 oder Arzneimittel, Medizinprodukt oder medizinischer Hilfsstoff nach einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei das Hsp70-Protein das C-terminale Fragment die Aminosäuren 384 bis 561 von menschlichem Hsp70 oder den entsprechenden Bereich aus einem anderem Hsp70 umfaßt, das die erfindungsgemäßen Wirkungen umfaßt.
29. Verwendung der nach einem Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche behandelten NK-Zellen zur Therapie von Tumorerkrankungen, und/oder Infektionserkrankungen .
30. Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Therapie durch Reinfundierung der behandelten NK-Zellen erfolgt.
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