ES2246566T3 - Aplicacion de proteinas hsp70. - Google Patents
Aplicacion de proteinas hsp70.Info
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Abstract
Utilización de una proteína Hsp70 que no está complejada con péptidos de células tumorales, de un fragmento C-terminal o un derivado del mismo o una proteína con una homología de secuencia aminoacídica de >70% con la región de los aminoácidos 384-641 de la proteína Hsp70 para la producción de una preparación farmacéutica, un producto médico o un adyuvante médico para el tratamiento de tumores, enfermedades cancerosas o enfermedades infecciosas mediante la activación de células NK.
Description
Aplicación de proteínas Hsp70.
La invención hace referencia a la utilización de
la proteína Hsp70, la cual no forma complejos con los péptidos
tumorales o fragmentos de lo mismo para la activación de células NK,
productos farmacéuticos, productos o adyuvantes de uso clínico que
contienen fragmentos o derivados de dicha proteína Hsp70, o células
NK activadas para el tratamiento de tumores, enfermedades cancerosas
o enfermedades infecciosas. La invención también hace referencia a
un procedimiento para la activación de células NK, así como para la
utilización clínica del producto obtenido mediante el procedimiento
de la invención.
Las chaperonas son necesarias en diversos
procesos fundamentales de la célula. En particular, se sabe que
contrarrestan el estrés celular. La clase de chaperonas mejor
analizada es el grupo de proteínas de choque térmico (HSP, del
inglés heat-shock proteins) con un peso
molecular de 70 KDa (Multhoff y col., Cell Stress & Chaperones 1
(3) (1996), 167). Estas proteínas están altamente conservadas
evolutivamente. Se unen a polipéptidos no renaturalizados o
incorrectamente renaturalizados en la célula, los estabilizan y de
este modo inhiben su agregación o la posibilitan para que se
produzca su translocación a la membrana. La Hsp70 está localizada en
el núcleo, en el citosol y en la superficie celular de ciertas
células tumorales. Además de su labor intracelular como chaperonas,
los miembros de la familia Hsp70 parece que desempeñan un papel en
la estimulación del sistema inmune, p.ej., procesos inflamatorios
ante la presencia de patógenos, y como respuesta inmune celular
anti-tumoral in vivo e in vitro. Según
ello, se presentan en los antecedentes de la materia un amplio
abanico de utilizaciones terapéuticas de las proteínas de choque
térmico. En la patente internacional WO 97/10000, se describe la
utilización de complejos consistentes en una proteína de choque
térmico y un antígeno exógeno (péptido) unido a esta proteína de
forma no covalente para la prevención y tratamiento de tumores y
enfermedades infecciosas. Los antígenos presentes con las proteínas
de choque térmico en el complejo derivan de las células tumorales.
Éstos tienen las mismas características, es decir inducen una
respuesta inmune, Multhoff y col., Biol. Chem. 379 (1998),
295-300 asignan una función a HSPs, incluyendo la
Hsp70, en el reconocimiento por células efectoras no restringidas a
MHC, incluyendo las células NK. En particular, se enfatiza que las
células NK reconocen moléculas Hsp70 presentes en la superficie de
células tumorales y a continuación lisan dichas células. Otra
aproximación de la terapia para las enfermedades cancerosas ha sido
introducida por Tamura y colaboradores (Tamura y col., Science 278
(1997), 117-123). Estos autores fueron capaces de
demostrar que los ratones portadores de tumores podían ser tratados
con éxito con preparaciones de proteínas de choque térmico derivadas
de tumores autólogos. Las preparaciones de tumores
no-autólogos de tejido normal, no condujeron a la
regresión de los tumores (Blachere y col., J. Exp. Med. 186 (1997),
1315-1322). En el estudio de Tamura y col., las HSPs
forman complejos con diversos péptidos no identificados con mucho
detalle. Para resumir, se puede decir que el estado de la técnica
demuestra una actividad inmunológica de moléculas HSP si forman
complejos con péptidos y/o están presentes en la superficie de
células como las células tumorales. Por ello, aunque el potencial de
proteínas de choque térmico básicamente se ha dirigido a la lucha
contra diversas enfermedades, una utilización terapéutica
satisfactoria depende de la preparación de ciertos complejos o de
preparaciones celulares, así como de la cantidad de material de
inicio (material tumoral). Es difícil de imaginar una utilización
universal o independiente del paciente de estos complejos o
preparaciones celulares.
En consecuencia, el problema subyacente de la
presente invención fue proporcionar nuevos medios y procedimientos
para utilizar el potencial inmunológico de las proteínas de choque
térmico que no presentaban las desventajas anteriormente mencionadas
del estado de la técnica.
Este problema se ha solventado proporcionando las
realizaciones descritas en las reivindicaciones.
Por ello, la invención hace referencia a la
utilización de una proteína Hsp70, que no forma complejos con los
péptidos tumorales, un fragmento carboxi-terminal
(C-terminal) o un derivado de lo mismo o una
proteína con una homología de secuencia \geq70% con la región
C-terminal de la proteína Hsp70 para la producción
de una preparación farmacéutica, un producto o un adyuvante de uso
clínico para el tratamiento de tumores, enfermedades cancerosas o
infecciosas mediante la activación de células NK.
De acuerdo con la invención, las preparaciones
farmacéuticas se definen como sustancias y preparaciones de
sustancias que, cuando se utilizan en el cuerpo humano, se utilizan
con propósitos curativos, calmantes, preventivos o de reconocimiento
de enfermedades, achaques, defectos físicos o malestares
patológicos.
De acuerdo con la invención, los productos de uso
clínico son sustancias que se utilizan solas o en combinación unas
con otras o preparaciones de sustancias u otros contenidos que, de
acuerdo con el fabricante, se aplican a humanos dadas sus funciones
con fines de detección, prevención, control, tratamiento o para
calmar las enfermedades y cuyo efecto principal en el cuerpo humano
no se logra mediante preparaciones farmacológica o inmunológicamente
efectivas ni por un metabolismo cuya efectividad pueda estar
soportada por dichas preparaciones.
De acuerdo con la presente invención, los
adyuvantes de uso clínico son aquellas sustancias que se utilizan
para la producción (como ingredientes activos) de preparaciones
farmacéuticas.
Además, la invención hace referencia a la
utilización de un proteína Hsp70, un fragmento
C-terminal o un derivado de lo mismo, o una proteína
con una homología de secuencia aminoacídica con la región
C-terminal (aminoácidos 384-641) de
la proteína Hsp70 de \geq70% para la activación ex vivo o
in vitro de células NK.
De acuerdo con la invención, el término
"proteína Hsp70" hace referencia a proteínas de
choque-térmico eucariotas, cuya expresión puede
inducirse por calor pero también por otros reactivos, como p.ej.,
análogos de aminoácidos, metales pesados, ionóforos o citotoxinas,
en donde el factor del incremento en la expresión mediante la
inducción es de al menos 5, comparado con la expresión constitutiva.
La Figura 5 muestra la composición de una proteína Hsp70 que
comprende un dominio de ATPasa N-terminal y un
dominio de unión al sustrato C-terminal de la
proteína. La secuencia aminoacídica se ha publicado por Milner y
col., Immunogenetics 32 (4) (1990), 242-251.
De acuerdo con la invención, el término
"fragmento carboxi-terminal
(C-terminal)" de la proteína Hsp70 comprende
(poli)péptidos que presentan una secuencia aminoacídica
comprendida entre los aminoácidos 384-641 de la
Hsp70 humana. La presente invención también comprende fragmentos de
la secuencia aminoacídica 384-641 del extremo
C-terminal. En otras realizaciones, el término
comprende (poli)péptidos derivados de la región de otra
proteína que también está comprendida en el término de "proteína
Hsp70" utilizado de acuerdo con la presente invención, siendo
esta región homóloga con la región del extremo
C-terminal de la proteína humana Hsp70. Los
fragmentos de la proteína Hsp70 utilizados de acuerdo con la
invención son también capaces de activar las células NK. La
activación puede fácilmente verificarse por la persona experta en la
materia según las indicaciones de la invención. Así, el experto en
la materia será también capaz de producir fragmentos del fragmento
anteriormente mencionado 384-641 mediante técnicas
recombinantes (los procedimientos estándares se describen en
Sambrook y col., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2
edición, 1989, CSH Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) y analizar sus
propiedades de activación deseadas.
El término "derivado" comprende tanto los
derivados de la proteínas Hsp70 como los derivados del
fragmento
C-terminal, siempre que los derivados presenten las funciones de la invención. Preferentemente, dichos derivados presentan la misma estructura tridimensional que la Hsp70 o su fragmento C-terminal y pueden producirse, por ejemplo, mediante péptidomiméticos (al-Obeidi y col., MOl. Biotechbnol. 9 (1998), 205-233; Wiley y col., Med. Res. Rev. 13 (1993), 327-384; Bohm, J. Comput. Aided Mol. Des. 10 (1996), 265-272; Hruby y col., Biopolymers 43 (1997),
219-266).
C-terminal, siempre que los derivados presenten las funciones de la invención. Preferentemente, dichos derivados presentan la misma estructura tridimensional que la Hsp70 o su fragmento C-terminal y pueden producirse, por ejemplo, mediante péptidomiméticos (al-Obeidi y col., MOl. Biotechbnol. 9 (1998), 205-233; Wiley y col., Med. Res. Rev. 13 (1993), 327-384; Bohm, J. Comput. Aided Mol. Des. 10 (1996), 265-272; Hruby y col., Biopolymers 43 (1997),
219-266).
El término "célula NK" ("células
supresoras" del inglés natural killer)comprende los
linfocitos grandes y granulares que expresan CD45 en la superficie y
presentan una actividad supresora sin estimulación previa. Se
caracterizan porque expresan CD16 y/o pueden ser estimulados por la
interleucina-2 y/o no expresan CD3 y/o no tienen los
receptores de células T \alpha/\beta- o \gamma/\delta.
Las células NK que muestran su eficacia en el
procedimiento de la invención se caracterizan preferentemente por
las propiedades siguientes:
- se adhieren transitoriamente al plástico tras
la adición de IL-2 en cantidades de 10 a 10.000
unidades, p.ej., de 100 UI, en donde IL-2 puede
obtenerse de la firma Chiron;
- la adherencia tiene lugar 3-18
horas después de la adición de IL-2 en los PBL
recién aislados (linfocitos de sangre periférica sin monocitos);
- las células NK presentan una expresión de
CD16dim (valor promedio del pico de fluorescencia);
- las células NK expresan CD56 y DC57 como
marcadores NK típicos;
- las células NK expresan CD94 (receptor de
lectina de tipo C de célula supresora);
- las células NK secretan
IFN-gamma después de la activación con Hsp70 y
citocinas;
- las células NK pueden estimularse mediante
adición de Hsp70 (proteína purificada) (crecimiento y actividad
citotóxica);
- no son dependientes del tipo MHC de los
pacientes.
De acuerdo con la presente invención, también se
pueden utilizar otras poblaciones de células NK. En este caso, sin
embargo, es un pre-requisito que puedan activarse
por la Hsp70 utilizada de acuerdo con la invención o por los
fragmentos o derivados anteriormente mencionados. De acuerdo con la
invención, se pueden utilizar células NK aisladas. Además es posible
utilizar mezclas de células como las células sanguíneas
mononucleares (PBMC) incluyendo las células NK.
De acuerdo con la invención, el término
"homología de secuencia aminoacídica con la región
C-terminal de la proteína Hsp70 \geq70%"
significa que al menos un 70% de los aminoácidos son idénticos
cuando se alinean ambas secuencias, siendo una de las secuencias
aminoacídicas alineadas la región C-terminal de
Hsp70. También se incluyen las secuencias aminoacídicas con una
identidad del 70% que además difieran de la secuencia de referencia
C-terminal de Hsp70 por huecos en la alineación.
Estos huecos pueden tener lugar en una molécula homóloga utilizada
de acuerdo con la invención o en la molécula de referencia. Las
alineaciones, generalmente mediante comparación por ordenador, son
conocidas en el estado de la materia, así como los programas que
facilitan dicho alineamiento. Además, es preferible que las
proteínas o los fragmentos presenten una homología de secuencia
aminoacídica con la región carboxi-terminal, es
decir, en la región de los aminoácidos 384-641, de
la proteína Hsp70 de \geq80% y preferentemente \geq90%.
Se ha de considerar de lo más sorprendente el
hallazgo de que las proteínas de choque térmico, los fragmentos
C-terminal de las mismas o sus derivados induzcan
actividades inmunológicas por medio de la activación de células NK,
incluso si no forman complejos con péptidos o si no se hallan en la
superficie de las células como las células tumorales. En junio de
1998 (véase, Srivastava y col., Immunity 8 (1998),
657-665, citado como una opinión de expertos), por
ejemplo, todavía se asumía que las proteínas de choque térmico no
presentaban efectos inmunogénicos como la inducción de CTL (Blachere
y col., J. Exp. Med. 186 (1997), 1315-1322) y no
podían inducir una inmunidad protectora contra ciertos tipos de
cáncer (Udono y Srivastava, J. Immunol. 152 (1994),
5398-5403). Con la presente invención, es posible
inducir la activación in vivo e in vitro de células NK
de forma independiente de las condiciones del paciente, pudiéndose
utilizar dicha activación satisfactoriamente, por ejemplo, contra
enfermedades tumorales. Además, la utilización de proteínas de
choque-térmico aisladas permite una mejor
estandarización de los procesos de activación. La presente invención
posibilita la producción de cantidades ilimitadas de HSP, mientras
que en el caso de una preparación específica para un paciente de
complejos peptídicos HSP la cantidad de HSP está limitada por el
tamaño del tumor.
Además de los hallazgos anteriormente mencionados
es sorprendente que la utilización de los fragmentos
C-terminales de la proteína Hsp70 también conduzca al resultado de la invención. En particular, fue inesperado que la región C-terminal presente aparentemente la misma estructura tridimensional que es reconocida por las células NK y que conduce a su activación. La posibilidad de utilizar los fragmentos de la región C-terminal de Hsp70 en la activación de células NK también presenta la ventaja de que la producción recombinante produce a un aumento del rendimiento en comparación con la expresión recombinante de la proteína entera.
C-terminales de la proteína Hsp70 también conduzca al resultado de la invención. En particular, fue inesperado que la región C-terminal presente aparentemente la misma estructura tridimensional que es reconocida por las células NK y que conduce a su activación. La posibilidad de utilizar los fragmentos de la región C-terminal de Hsp70 en la activación de células NK también presenta la ventaja de que la producción recombinante produce a un aumento del rendimiento en comparación con la expresión recombinante de la proteína entera.
La producción de derivados de Hsp70 o de
fragmentos de su extremo C-terminal, p.ej., por
péptidomiméticos, es por ejemplo de utilidad si se ha de evitar una
rápida degradación de estos (poli)péptidos en el cuerpo. Ello
puede ser importante, p.ej., en la administración oral de
preparaciones farmacéuticas.
Preferentemente, la activación comprende la
inducción de una respuesta inmune mediada por células NK. En la
presente invención es preferible que la respuesta inmune mediada por
células NK comprenda una estimulación de la proliferación de células
NK y/o un aumento de la actividad citolítica de las células NK.
Cantidades efectivas (farmacéuticamente) de Hsp70 o de fragmentos o
sus derivados se utilizan en todas las realizaciones anteriormente
mencionadas para que se induzca la activación, de preferencia la
respuesta inmune. Dicha respuesta inmune está dirigida
principalmente, pero no exclusivamente, contra las células que
expresan Hsp70 o sus fragmentos en la superficie celular. Ello
incluye tanto las células animales como las humanas. Dichas células,
animales o humanas, que expresan Hsp70 en la superficie celular
incluyen, por ejemplo, las células tumorales y las células de
pacientes con enfermedades infecciosas. De acuerdo con la presente
invención, la actividad citolítica de las células NK estimuladas por
Hsp70 se incrementa significativamente con el fin de posibilitar la
eliminación inmunológica de aquellas células que expresan Hsp70 en
su superficie.
En una realización preferida de la utilización de
acuerdo con la invención, se incrementa la actividad citolítica
contra las células tumorales y/o las células de pacientes con
enfermedades infecciosas.
En otra realización preferida de la utilización
de acuerdo con la invención, se incrementa la actividad citolítica
contra las células de leucemia, células de linfoma, células
tumorales y células de metástasis de tumores sólidos y de células de
pacientes con enfermedades infecciosas micóticas o bacterianas. Un
ejemplo del tratamiento de enfermedades virales es el tratamiento de
infecciones por VIH, y un ejemplo de infecciones bacterianas es el
tratamiento de enfermedades causadas por micobacterias. Los tumores
sólidos cuyas células metastásicas pueden tratarse por el
procedimiento inmunológico de la invención incluyen, por ejemplo,
los carcinomas, los sarcomas, los melanomas, las leucemias y los
linfomas. Ejemplos de carcinomas son los carcinomas de colon y de
pulmón.
Mediante la utilización de una proteína Hsp70,
porciones de la misma o proteínas con una homología de secuencia
\geq70% de acuerdo con la invención, pueden lisarse células
infectadas por virus, bacterias y/o hongos o células que se hayan
convertido en tumorales. Las células que contienen porciones
antigénicas de estos organismos extraños o de células tumorales
también pueden lisarse por las células NK activadas por la
utilización de la proteína Hsp70 de acuerdo con la invención.
La invención hace referencia además a un
procedimiento para la activación ex viv o in vitro de
células NK, en donde se mezcla una suspensión fisiológica de células
que contienen células NK con una proteína Hsp70, un fragmento
C-terminal o un derivado de lo mismo o una proteína
con una homología de secuencia aminoacídica con la región
C-terminal (aminoácidos 384-641) de
la proteína Hsp70 de \geq70% y se incuba para lograr la activación
de células NK.
La incubación tiene lugar a temperatura ambiente,
preferentemente, sin embargo, a temperatura fisiológica (37ºC) en un
agitador (agitación suave).
En una realización preferida del procedimiento de
acuerdo con la invención, la activación comprende una estimulación
de la proliferación de células NK y/o un aumento de su
citotoxicidad. Respecto a las células diana preferidas para la
actividad citotóxica, se hace referencia a las explicaciones
anteriores.
En una realización preferida del procedimiento de
la presente invención, se utilizan células sanguíneas mononucleares
(PBMC) o una fracción de lo mismo que contiene células NK como una
suspensión fisiológica de células NK.
Utilizando procedimientos adecuados, se pueden
obtener células NK de los pacientes a tratar o de un donante sano.
Preferentemente, se pueden utilizar las bandas densas de células
mononucleares obtenidas por procedimientos de aislamiento y
separación celulares por densidad (concentrados de linfocitos) que
contengan células NK.
Las bandas densas de células mononucleares
(concentrado de linfocitos) se obtienen por punción de las venas de
los pacientes y p.ej., se añade heparina para prevenir la
coagulación de las células. Las bandas densas a las cuales se ha
añadido heparina se recogen en un receptáculo estéril (generalmente
bolsas de plástico pequeñas) y luego se centrifugan obteniéndose la
acumulación de células sanguíneas (=PBMC, células mononucleares de
sangre periférica, p.ej., linfocitos, eritrocitos, granulocitos y
otras). El concentrado de linfocitos permanece estéril en el
recipiente (bolsa de plástico). En el caso de probados sanos, una
banda densa de células consiste en células rojas y blancas de la
sangre (linfocitos, eritrocitos y demás). En el caso de un paciente
con un tumor, la banda densa de células no consiste únicamente en
células sanguíneas, sino que también contiene células tumorales (en
el caso de leucemia, p.ej., células de leucemia=blastos; en el caso
de tumores sólidos, p.ej., células mestatásicas).
Las bandas densas de células que contienen
células de sangre periférica mononucleares se utilizan como una
suspensión fisiológica de células, preferentemente con adición de
heparina. La heparina previene la agregación de las células.
En otra realización preferida en particular del
procedimiento de la invención, la suspensión celular contiene además
células humanas y animales que expresan Hsp70 en la superficie
celular. La estimulación de células NK por la proteína Hsp70, sin
embargo, puede tener lugar sin que estén presentes las células diana
(células tumorales, células infectadas) que expresan Hsp70 en la
superficie celular.
En otra realización preferida del procedimiento,
las células tumorales y las células de pacientes con enfermedades
infecciosas se utilizan igual que las células humanas o
animales.
En otra realización preferida del procedimiento,
las células de leucemia, linfomas, células metastásicas de tumores
sólidos y células de pacientes con enfermedades infecciosas víricas,
micóticas o bacterianas se utilizan igual que las células humanas o
animales.
En otra realización preferida del procedimiento,
la suspensión celular fisiológica que contiene las células y las
proteínas se incuba durante al menos 3 horas.
En esta realización, con el fin de aumentar el
efecto citolítico de las células supresoras, las células diana de
estas células supresoras se incuban preferentemente junto con las
células supresoras y la Hsp70 en suspensión, preferentemente durante
el periodo anteriormente mencionado. Las incubaciones a largo plazo,
sin embargo, son también posibles durante al menos 4 días. Por ello,
en otra realización preferida del procedimiento de acuerdo con la
invención, la incubación se lleva a cabo durante 4 días. En otra
realización preferida de la utilización de acuerdo con la invención
o del procedimiento de acuerdo con la invención, se utiliza además
una citocina. La citocina y las células NK y/o las proteínas de
choque térmico, sus fragmentos o derivados pueden utilizarse juntos
o por separado en una misma dosis.
En una realización preferida de la utilización o
del procedimiento, se utiliza una interleucina como citocina. De
acuerdo con la invención, se puede utilizar también una combinación
con la proteína Hsp70 para aumentar la activación de las células NK,
p.ej., la respuesta inmune mediada por las células NK o la
estimulación de la proliferación de las células NK.
En otra realización preferida de la utilización o
del procedimiento de acuerdo con la invención, se utilizan como
interleucina la IL-2, IL-12 y/o la
IL-15.
La invención hace posible la reintroducción al
paciente con no sólo células NK activadas ex vivo, sino
también la utilización in vivo de células NK tratadas de
acuerdo con la invención debido a que no utilizan sustancias
tóxicas, p.ej., en combinación con un tratamiento hipertérmico. Esta
realización de la invención presenta una ventaja adicional, es
decir, que las células diana, p.ej., células tumorales que eran
resistentes a procedimientos terapéuticos conocidos, pueden ahora
ser eliminadas inmunológicamente por el efecto citolítico de células
NK. Así, la invención hace referencia a un procedimiento para la
activación in vivo del sistema inmune, en donde una cantidad
efectiva farmacéuticamente de células NK activadas de acuerdo con el
procedimiento mencionado anteriormente se administra a un paciente,
opcionalmente al mismo tiempo que o antes de una cantidad efectiva
farmacéuticamente de una proteína Hsp70, un fragmento
C-terminal o un derivado de lo mismo o una proteína
con una homología de secuencia aminoacídica con la región
C-terminal (aminoácidos 384-641) de
la proteína Hsp70 \geq70%.
Si las sustancias se administran conjuntamente,
pueden ponerse juntas en un recipiente o por separado en diversos
recipientes, mientras que en el caso de un proceso en diversas
etapas se mantienen por separado.
Si las células NK se administran antes que la
proteína Hsp70, el período de tiempo correspondiente antes de la
administración de la proteína Hsp70 debería ser de al menos
3-24 h.
Un ejemplo de tratamiento de acuerdo con la
invención es el siguiente:
Células de la banda densa de células (concentrado
de linfocitos) consistentes en células mononucleares de sangre
periférica, o de médula ósea y de células tumorales de pacientes,
por ejemplo de pacientes con leucemia, se someten a un tratamiento
por calor en un recipiente sellado y estéril, por ejemplo un
recipiente de plástico, con la proteína Hspo70,
Hsp70-relacionada y/o fragmentos efectivos o
derivados de lo mismo en un baño de agua y temperatura controlada.
Tanto las células tumorales como las NK estimuladas por el
tratamiento presente están en el recipiente. Después de finalizar el
proceso de la invención, la solución de cultivo que contiene las
células NK activadas y las células tumorales lisadas se reintroducen
en el paciente.
De acuerdo con la invención, las células NK están
presentes opcionalmente con otras células mononucleares de sangre
periférica, por ejemplo con los eritrocitos, granulocitos y las
células T. En consecuencia, las células NK solas no se utilizan
preferentemente, sino una mezcla de células mononucleares de sangre
periférica que se obtiene mediante aislamiento de las células en
gradientes de densidad. Estas acumulaciones contienen además células
tumorales de pacientes con tumores que se eliminan inmunológicamente
por el procedimiento de la invención.
Además, la invención hace referencia a la
utilización de una cantidad farmacéuticamente efectiva de una
proteína Hsp70, un fragmento C-terminal de lo mismo
o un derivado de ésta o una proteína con una homología de secuencia
aminoacídica con la región C-terminal (aminoácidos
384-641) de la proteína Hsp70 de \geq70% para la
producción de una preparación farmacéutica para la activación in
vivo de células NK.
Además, la invención hace referencia a la
utilización de una cantidad farmacéuticamente efectiva de células NK
activadas de acuerdo con el procedimiento anteriormente mencionado
de la invención y/o una proteína Hsp70, un fragmento
c-terminal o un derivado de lo mismo o una proteína
con una homología de secuencia aminoacídica con la región
C-terminal (aminoácidso 384-641) de
la proteína Hsp70 de \geq70% para la producción de una preparación
farmacéutica para el tratamiento de tumores, enfermedades cancerosas
y/o enfermedades infecciosas.
En una realización preferida del procedimiento de
la invención, el tumor es un tumor sólido o una metástasis. La
estrategia de tratamiento se dirige en particular a la eliminación
de metástasis de células individuales que puedan eliminarse
inmunológicamente por el procedimiento de la invención. Un aumento
de la activación específica de células NK por Hsp70 puede lograrse
por adición de interleucina-2 a una dosis baja, por
ejemplo de 100 UI. La interleucina-2 puede, por
ejemplo, introducirse en el recipiente estéril, p.ej., un recipiente
de plástico, junto con la Hsp70.
En otra realización preferida de la invención, la
enfermedad cancerosa es una leucemia o un linfoma.
En otra realización preferida de la invención, la
enfermedad infecciosa tiene un origen viral, micótico o
bacteriano.
La invención además hace referencia a una
preparación farmacéutica, un adyuvante de uso clínico, o un producto
de uso clínico que contiene un fragmento C-terminal
de la proteína Hsp70, o un derivado de lo mismo o una proteína con
una homología de secuencia aminoacídica con la región
C-terminal (aminoácidos 384-641) de
la proteína Hsp70 de \geq70% y/o las células NK activadas de
acuerdo con el procedimiento de la invención en una cantidad
terapéuticamente efectiva, así como opcionalmente un vehículo y/o
sustancias adyuvantes comunes. Además, opcionalmente se añade a la
preparación farmacéutica una citocina tal como se definió
anteriormente.
En una realización preferida de la preparación
farmacéutica, adyuvante o producto de uso clínico, la proteína se
halla a una concentración de al menos 1 \mug/ml, preferentemente
de hasta 1000 \mug/ml, preferentemente 1 x 10^{6} a
5 x 10^{6} células NK, en donde es preferible una cantidad de 10 \mug a 600 \mug/ml.
5 x 10^{6} células NK, en donde es preferible una cantidad de 10 \mug a 600 \mug/ml.
Ejemplos de vehículos tolerables
farmacéuticamente aceptables son conocidos por los expertos en la
materia y comprenden, por ejemplo, las soluciones de tampón fosfato
salino, el agua, las emulsiones como las emulsiones de aceite/agua,
las soluciones estériles y demás. Las composiciones farmacéuticas
(preparaciones farmacéuticas) que contienen dichos vehículos pueden
prepararse de acuerdo con procedimientos comunes. Las composiciones
farmacéuticas pueden administrarse al individuo determinado en una
dosis adecuada. Las vías de administración son, por ejemplo, la
intravenosa, la subcutánea, la intramuscular, la tópica o la
intradérmica. La dosificación depende de muchos factores, p.ej., de
la altura, peso, sexo y edad del paciente, así como del tipo de
composición administrada, el tipo de administración y demás. En
general, la dosificación administrada por mes es de 10 a 1000
\mug. Junto con la inyección intravenosa de sustancias de la
invención, la dosificación es generalmente de 10 a 1000 \mug. Las
composiciones se pueden administrar local o sistémicamente. Por lo
general, la administración se realiza parenteralmente. Por ello, las
células NK tratadas con Hsp70 de acuerdo con la invención se
inyectan preferentemente por vía intravenosa. También puede llevarse
a cabo directamente en el tumor la inyección de una cantidad
efectiva de células NK. Otros tipos de aplicaciones conocidas
también son, desde luego, posibles.
La proteína Hsp70 por ella misma puede, por
ejemplo, aplicarse junto con citocinas. Un ejemplo de aplicación es
la inyección de la proteína Hsp70, p.ej., con citocinas en una vía
intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraperitoneal o incluso
en la planta del pié.
En otra realización preferida de la utilización
del procedimiento o de la preparación farmacéutica o del producto o
adyuvante de aplicación clínica de la invención, la proteína Hsp70
es una proteína humana. La proteína de la invención es, por ejemplo,
de origen humano (tras el aislamiento de extractos celulares) o
presenta la secuencia aminoacídica de la proteína Hsp70 (p.ej.,
después de la producción recombinante). Sin embargo, también pueden
utilizarse las proteínas Hsp70 animales.
La proteína Hsp70 o los fragmentos utilizados de
acuerdo con la invención pueden producirse de forma recombinante,
aislarse de extractos celulares, o generarse mediante síntesis
química.
Preferentemente, la proteína Hsp70 o un fragmento
de ésta o derivado es una proteína recombinante. Dichas proteínas
recombinantes pueden producirse mediante técnicas estándares.
Dichas técnicas estándares son conocidas por el
experto en la materia (Sambrook y col., ibid. y Ausubel, "Current
Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and
Wiley Intersciences, N.Y. (1989)). Para la producción recombinante
de las proteínas, se utilizan moléculas de ácido nucleico que
codifican la proteína Hsp70 o sus fragmentos de acuerdo con la
invención. Estas moléculas pueden ser diversos ácidos nucleicos, en
particular DNA o RNA, por ejemplo el cDNA, el DNA genómico, el mRNA
y demás. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden producirse de
forma natural y/o por procedimientos de síntesis genética o química.
Para la producción de proteínas recombinantes, el experto en la
materia utiliza vectores, en particular plásmidos, cósmidos, virus,
bacteriófagos y otros vectores corrientes en la ingeniería genética
(Sambrook y col., ibid.). Las moléculas de ácido nucleico
contenidas en los vectores pueden unirse a elementos reguladores que
garantizan la expresión en las células procariotas o eucariotas. En
dicho contexto, el término "expresión" puede significar tanto
la transcripción como la transcripción y traducción. Los elementos
reguladores comprenden, en particular, los promotores. Para la
expresión de una molécula de ácido nucleico en células procariotas,
existe un amplio margen de promotores disponibles, p.ej., el
promotor lac- o el trp de E. coli, el promotor PR- o PL del
fago lambda, lacI, lacZ, T3, T7, gpt, y demás. Los promotores
eucariotas son, por ejemplo, el promotor inmediato temprano de CMV,
el promotor de HSV, el promotor de la timidinquinasa, el promotor de
SV40, los LTRs de los retrovirus y el promotor de la
metalotionina-I de ratón. Se han descrito diversos
vectores de expresión para la expresión en células procariotas o
eucariotas, p.ej., para eucariotas, pKK223-3
(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) o GEM1 (Promega Biotec,
Madison, WI, USA), pSV2CAT, pOG44 y para procariotas, pQE70, pQE60,
pBluescript SK y demás. Además de promotores, estos vectores pueden
también contener elementos para aumentar la transcripción, como los
denominados intensificadores de la transcripción. Ejemplos son el
intensificador de SV40, el intensificador del polioma, el
intensificador del promotor temprano de citomegalovirus y el
intensificador del adenovirus. Las proteínas recombinantes pueden,
en consecuencia, expresarse en diversas células huéspedes
procariotas o eucariotas, por ejemplo, cuando se utilizan los
vectores descritos anteriormente. Ejemplos de dichas células
huéspedes son las células bacterianas (como E. coli,
streptomices, bacillus, Salmonella
typhimurium), las células de hongos (como levaduras, en
particular Saccharomyces cerevisiae), las células de insecto
(como drosophila o las células SF9), las células de animales
(como las células CHO o COS), o también, las células de plantas y
otras. Dichas células huéspedes pueden cultivarse en condiciones que
permiten la expresión de la proteína recombinante, la cual puede
recuperarse a partir de las células y/o del medio de cultivo. Los
procedimientos para la expresión de la proteína foránea en diversos
tipos de células huéspedes, así como de la recuperación de la
proteína producida son conocidos por los expertos en la materia.
En otra realización sobre la utilización o el
procedimiento o la preparación farmacéutica o del producto o
adyuvante de utilización clínica de la invención, la proteína Hsp70
comprende el fragmento C-terminal, los aminoácidos
384-561 de la Hsp70 humana o la región
correspondiente de otra Hsp70 que presenta los efectos de la
invención, o comprende el fragmento C-terminal, los
aminoácidos 454-460 de la Hsp70 humana. De acuerdo
con la invención, se demostró que fragmentos con esta secuencia
mínima de 7 aminoácidos (NLLGRFE) fueron inhibidos por anticuerpos,
y que la activación de NK se evitó o se interrumpió. Los
experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con Multhoff y col., J.
Immunol. 158 81997), 4341-4350. Se utilizó el
anticuerpo RPN 1197 de Amersham. Los 7 aminoácidos se flanquearon
por secuencias de Hsp70 naturales o por otros aminoácidos. Es
preferible que los 7 aminoácidos permanezcan en su contexto natural.
Si se utilizan otros aminoácidos, es preferible mantener el contexto
tridimensional natural de los 7 aminoácidos. En estos 7 aminoácidos,
pueden producirse cambios aminoacídicos siempre y cuando se mantenga
una homología de al menos el 70%. Estos cambios, sin embargo, no
comprenden un cambio de arginina en la posición 458 por lisina. Esta
sustitución aminoacídica conduce a un cambio de conformación. Según
ello, los cambios en la región de los 7 aminoácidos que conducen a
un cambio de conformación están incluidos en la invención sólo si
presentan las propiedades de activación deseadas.
La invención hace referencia además a la
utilización de células NK tratadas de acuerdo con un procedimiento
de una o más de las realizaciones anteriormente mencionadas para la
terapia de enfermedades tumorales y/o enfermedades infecciosas.
En una realización preferida de la utilización de
la invención, la terapia se lleva a cabo mediante reintroducción de
las células NK tratadas.
Los procedimientos in vivo mencionados
anteriormente también pueden utilizarse como procedimientos de
tratamiento de las indicaciones descritas.
Las Figuras muestran:
Figura
1
Comparación por separado de la actividad
proliferativa de las células NK (A) y T (B) estimuladas con una
concentración de 10 \mug/ml cada una de medio con
IL-2 (100 UI/ml) o con otras proteínas recombinantes
de Hsp70 (rHsp70, rHsp70-Cterm (aminoácidos
384-561), rHsp70homC, DnaK, Hsc70 y rHsp70
desnaturalizada por calor) resuspendidas en medio
IL-2 (100 IU/ml). Las características fenotípicas de
las células NK son las siguientes:
CD3: <5%; CD16/CD56:46-87%;
CD94:60-70%; p58.1 y p58.2:<5% y células T:
CD3:85-92%; CD16/CD56:5-10%;
CD94:<29%; p58.1 y p58.2: no analizadas; p70: no analizada,
determinaciones realizadas por citometría de flujo. La proliferación
de las células se determinó al cabo de 48 horas y después de la
incubación con timidina-H^{3}
(1 \muCi/ml) a 37ºC durante 18 horas. El porcentaje relativo la absorción de timidina-H^{3} en las células NK (A) y T (B) se comparó con los efectos de IL-2 sola (100%). Los valores mostrados son el promedio de cuatro a siete experimentos independientes + desviación estándar.
(1 \muCi/ml) a 37ºC durante 18 horas. El porcentaje relativo la absorción de timidina-H^{3} en las células NK (A) y T (B) se comparó con los efectos de IL-2 sola (100%). Los valores mostrados son el promedio de cuatro a siete experimentos independientes + desviación estándar.
Figura
2
Comparación de la actividad citotóxica de células
NK altamente purificadas (CD3:<2%;
CD16/CD56:75-80%; CD94:65-87%;
p558.1 y p58.2: 20-30%; p70:<10%), las cuales o
bien no fueron tratadas (líneas continuas, símbolos vacíos) o se
pre-incubaron después de una
pre-incubación de células NK con proteína rHsp70
(cada una a 5 \mug/ml durante 4 días; líneas continuas, símbolos
rellenos) en comparación con las células diana tumorales marcadas
con Cr^{15} CX+ en (A) y CX- en (B), que difieren en su capacidad
de expresión de Hsp70 en su membrana plasmática. Los resultados se
indican en porcentajes de lisis específica a diversas proporciones E
: T de 0,2 : 1 a 2 : 1. Cada punto representa el valor promedio de
al menos tres experimentos independientes \pm desviaciones
estándares. El porcentaje de liberación espontánea para cada línea
de células tumorales fue siempre inferior al 15%.
Figura
3
Crecimiento tumoral de células CX+ que expresan
Hsp70 en ratones inmunodeficientes. Después de la inyección i.p. de
las células NK, se inhibió completamente el crecimiento del tumor
(con inyección i.p. de células tumorales). El tamaño del tumor se
proporcionó en cm^{2}.
Crecimiento tumoral después de la inyección i.p.
de células CX+ y NK el día 21.
Figura
4
Crecimiento tumoral de células CX+ que expresan
Hsp70 en ratones inmunodeficientes. Después de la inyección i.v. de
células NK, se inhibió completamente el tumor. El crecimiento
tumoral se cuantificó en gramos.
Crecimiento tumoral después de la inyección o.t.
de células CX+ e inyección i.v. de células NK el día 35. Las células
NK inhibieron el crecimiento tumoral de las células CX+ que
expresaban la Hsp70 al cabo de 3 o 5 semanas después de la inyección
(véase la Figura 3). Tanto la aplicación intraperitoneal como
intravenosa de células NK produjo resultados similares.
Figura
5
Proteína Hsp70 intacta en donde se muestra la
región C-terminal.
Figura
6
Representación de la influencia de Hsp70 y/o las
citocinas sobre la respuesta inmune mediada por células NK. La
adición de citocinas también conduce a la estimulación de células
T.
Los ejemplos ilustran la invención.
La proliferación de células NK y T estimuladas
con proteínas Hsp70, rHsp70, DnaK, Hsc70, rHsp70-C
term y rHsp70homC (aminoácidos 384-561) se determinó
en un ensayo de absorción estándar con
timidina-H^{3} (ver más adelante para las
condiciones del ensayo). En primer lugar, se separaron los
linfocitos de sangre periférica de donantes humanos voluntarios en
subpoblaciones de células T CD3+ no-adherentes y
células NK CD3-(CD16+/CD56+) adherentes transitoriamente
(12-24 h) en un procedimiento con múltiples etapas y
posterior incubación de 12h en un medio con IL-2
(véase 3). Las células se cultivaron por separado en
rIL-2 (100 UI, Chiron, Frankfurt, Alemania) con
medio RPMI 1640 (Life Technologies, Eggstein, Alemania) durante
3-4 días. La proliferación se cuantificó como la
absorción de H^{3}.
Los experimentos de hibridación con un panel de
anticuerpos se llevaron a cabo utilizando Hsp70 recombinante humana
(sHsp70, SPP-755, StressGen Biotechnologies,
Victoria, Canada) y DnaK (homólogo de Hsp70 obtenido de E.
coli, SPP-630, StressGen). Las proteínas se
diluyeron en PBS a una concentración de 1 \mug/ml, se alicuotaron
y se congelaron a -80ºC. Se incubaron frascos de cultivo
T-25 con la proteína rHsp o DnaK (10 \mug/ml), se
diluyó en 3 ml de tampón carbonato frío, pH 9,5 durante 12 horas.
Después de bloquear los sitios de unión inespecíficos con PBS/5%
SFB, una mezcla de células T y NK se resuspendió a una proporción de
1 : 2 y 2 : 1 y se incubó en los frascos de cultivo durante 1 hora a
temperatura ambiente. Las células no-adherentes se
obtuvieron de la fracción del sobrenadante después de la incubación.
Las células adherentes se obtuvieron mediante etapas de lavado
secuencial con solución de PBS/10% SFB fría. Se realizó una etapa de
lavado ligero para eliminar las células ligeramente adherentes,
mientras que las células altamente adherentes se obtuvieron mediante
etapas adicionales de lavados astringentes. Las poblaciones
celulares obtenidas en cada etapa se contaron por separado y se
caracterizaron mediante citometría de flujo y se fenotiparon.
La citometría de flujo se llevó a cabo en un
equipo FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania) tal como se
describió en (4). El porcentaje de células de tinción positiva se
definió como la diferencia entre el número de células vivas (yoduro
de propidio negativas) menos el número de células que se tiñeron con
los anticuerpos controles correspondientes al isotipo. Los
anticuerpos siguientes se utilizaron para la caracterización
fenotípica de las células efectoras.
El anticuerpo control correspondiente al isotipo
(Dianova, Hamburgo, Alemania; Becton Dickinson, Heidelberg,
Alemania), CD16 (Dianova, Hamburgo, Alemania), CD3 (Dianova,
Hamburgo, Alemania).
La capacidad de las células T o NK para
proliferar en respuesta a diversas proteínas Hsp70 se determinó con
un ensayo de absorción estándar con
timidina-H^{3}. Las células viables (5 x 10^{4}
células/100 \mul) se pusieron en una placa de microtitulación de
96 pocillos con un fondo plano (Geiner, Nürtingen, Alemania), y se
utilizó un medio RPMI 1640 suplementado con 100 UI de
IL-2 y diversas proteínas Hsp70 recombinantes
(rHsp70, DnaK, Hsc70, la forma constitutiva de Hsp70, purificada de
cerebro bovino, SPP-750; StressGen;
rHsp70-Cterm. Se utilizó el dominio de unión
peptídica C-terminal de Hsp70 recombinante
(aminoácidos 384-561), rHsp70homC, el dominio de
unión peptídica C-terminal recombinante de Hsp70hom
(Hsp70hom es un miembro específico de testículos de la familia de
Hsp70 que presenta una elevada homología (94%) con Hsp70,
aminoácidos 384-561). Probando diversas
concentraciones de proteínas Hsp70 (1-200 \mug/ml)
se halló que una concentración final de 100 \mug/ml era la ideal
para la estimulación. Como un control interno, se determinó en
paralelo una actividad proliferante frente a IL2 (100 UI). Después
de un período de incubación de 24 horas o de 48 horas, las células
se marcaron con timidina-H^{3} (1 \muCi/pocillo)
y la absorción total se determinó después de 18h de incubación a
37ºC en un contador de centelleo líquido (Beckmann Instruments,
Munich, Alemania). Además, como control interno, se determinó la
capacidad de proliferación de linfocitos T procedentes del mismo
donante. Utilizando diversas proteínas/fragmentos de Hsp70 en
concentraciones de 1-200 \mug/ml, el examen de
dosis escaladas mostró que se podía lograr una estimulación máxima
de la capacidad de proliferación con 100 \mug/ml de proteína
Hsp70. La actividad de proliferación de células Nk y T aisladas se
analizó después de la estimulación in vitro con rHsp70, DnaK,
Hsc70, rHsp70-C term o rHsp70-C
(aminoácidos 384-562). Como puede verse en la Figura
1A, la proliferación de células NK se estimuló significativamente
por rHsp70. También es posible la estimulación por la región
carboxi-terminal de Hsp y rHsp70homC que, en el
dominio C-terminal con los aminoácidos
384-561, es un 94% idéntica a Hsp70. En cambio, DnaK
y Hsc70 no estimularon la proliferación de célula NK. La rHsp70
desnaturalizada por calor pierde completamente sus propiedades
estimulantes de la proliferación de células NK.
Además, fue posible mostrar que la proliferación
de linfocitos T CD3-positivos podría estimularse por
DnaK, mientras que rHsp70, Hsc70 y rHsp70homC y rHsp70
desnaturalizadas por calor no mostraron ningún efecto sobre la
capacidad de proliferación de células T (Figura 1B).
Por ello, para resumir, una proliferación de
células NK podría ser inducida por la proteína Hsp70 humana
recombinante por la región C-terminal de Hsp70
(384-561) y rHsp70homC, una proteína homóloga a
Hsp70, mientras que una proliferación de células T podría
estimularse selectivamente por la Hsp70 bacteriana (E. coli
DnaK).
Un análisis funcional de células NK utilizando
células tumorales que expresan Hsp70 (CX+) y no expresan Hsp70 (CX-)
mostró que la expresión de Hsp70 en la membrana plasmática se
correlacionaba con un aumento de sensibilidad por la lisis mediada
por células NK. Esta lisis de células tumorales mediada por células
NK puede bloquearse mediante pre-incubación de las
líneas de células tumorales con anticuerpos monoclonales dirigidos
contra la región carboxi-terminal (aminoácidos
504-617) de Hsp70 y con el anticuerpo RPN1197 (1,
4). A continuación, se analizó la influencia de la proteína Hsp70
recombinante (rHsp70) sobre la actividad citolítica de las células
NK sobre las células tumorales autólogas que expresan (CX+) y no
expresan (CX-) Hsp70. Los resultados de los ensayos de citotoxicidad
utilizando células altamente purificadas y
pre-incubadas con la proteína Hsp70 a una
concentración de 5 \mug/ml durante 4 días se resumen en las
Figuras 2A y B. El esquema experimental fue el siguiente: para la
estimulación de la actividad citotóxica de las células NK se
incubaron con 10 \mug/ml de rHsp70. La estimulación se repitió al
cabo de 4 días.
Las sublíneas autólogas CX+ y CX- de carcinoma de
colon humano que diferían en su expresión de Hsp70 en la membrana
plasmática (Multhoff y col., J. Immunol. 158 (1997), 4341), se
cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB (Life
Technologies), L-glutamina 6 mM y antibióticos (100
UI/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina; Life
Technologies). Las células tumorales con crecimiento exponencial se
utilizaron como células diana y como células efectoras se utilizaron
las células CD3 NK purificadas después de la selección de células
utilizando un instrumento FACStar^{plus} (Becton Dickinson,
Heidelberg, Alemania). La citotoxicidad mediada por las células NK
se determinó mediante un ensayo con el radioisótopo Cr^{51} de 4
horas (Mulhoff y col., J. Immunol. 158 (1997), 4341). El porcentaje
de la lisis específica se calculó de la manera siguiente:
[(liberación experimental - liberación espontánea)/(liberación
máxima - liberación espontánea)] x 100. La liberación espontánea de
Cr^{51} fue inferior al 15% en todos los experimentos.
Sorprendentemente, fue posible demostrar que
tanto la proliferación y la actividad citolítica de las células NK
contra las células tumorales que expresan Hsp70 (CX+) se estimulaba
cuando las células NK se incubaron con proteína rHsp70 durante al
menos 4 días. Por el contrario, las células NK del mismo donante,
que no se trataron con rHsp70, perdieron su actividad al cabo de 10
días. La actividad lítica de las células NK no estimuladas con
rHsp70 fue inferior en comparación con las células NK tratadas y
estimuladas con rHsp70 y no se pudo observar una diferencia
significativa en la lisis de las células tumorales que expresaban y
no expresaban Hsp70.
El examen presente muestra que la región
carboxi-terminal de Hsp70 (aminoácidos
384-641) es responsable de la estimulación de la
función citolítica y proliferativa de las células NK. De acuerdo con
la invención, fue posible demostrar que particularmente la región
carboxi-terminal de la proteína Hsp70 es eficaz como
señal estimuladora para que las células NK ataquen específicamente
las células tumorales que expresan la proteína Hsp70 in
vitro.
Para examinar la importancia in vivo de
las células NK en comparación con las células tumorales que expresan
Hsp70 se realizaron ensayos con ratones inmunodeficientes
SCID/beige. En primer lugar, se inyectaron diversas cantidades de
células tumorales (CX+ o CX-) en los ratones SCID/beige. Una
cantidad de 2,5 x 10^{6} de células fue la cantidad óptima de
células tumorales para inducir el crecimiento tumoral en un período
de 3 a 5 semanas. Se eligió una inyección i.p. (intraperitoneal) u
o.t. (ortótopica, es decir en la propia pared del intestino) de
células de carcinoma de colon CX+ y CX-. Las células NK se aplicaron
después de la estimulación bien i.p. o i.v. (intravenosamente). Tal
como se muestra en la Figura 3, se alcanzó un crecimiento tumoral en
todos los animales tanto después de la inyección i.p o después de la
inyección o.t. Al contrario que la inyección i.p., además del
crecimiento de un tumor primario después de una inyección o.t., se
puede observar metástasis de células CX+, en particular en el bazo y
el pulmón (3 de 3 ratones después de una inyección o.t.).
La inyección de células NK humanas (i.p., pero
también i.v.) incluso 4 días después de la inyección de células
tumorales, conduce a una inhibición total del crecimiento tumoral.
Es interesante resaltar que no solamente puede inhibirse el
crecimiento de tumores primarios (en la región i.p. o en los
intestinos) por las células NK, sino también la metástasis
tumoral.
Estos hallazgos demuestran claramente que una
reconstitución inmune de ratones SCID/beige con células NK humanas
activadas conduce a la lisis de células tumorales no solamente in
vitro sino también in vivo (en el animal). Es interesante
remarcar que también es posible suprimir la metástasis por las
células NK humanas.
Claims (29)
1. Utilización de una proteína Hsp70 que no está
complejada con péptidos de células tumorales, de un fragmento
C-terminal o un derivado del mismo o una proteína
con una homología de secuencia aminoacídica de \geq70% con la
región de los aminoácidos 384-641 de la proteína
Hsp70 para la producción de una preparación farmacéutica, un
producto médico o un adyuvante médico para el tratamiento de
tumores, enfermedades cancerosas o enfermedades infecciosas mediante
la activación de células NK.
2. Utilización de una proteína Hsp70 que no está
complejada con péptidos de células tumorales, de un fragmento
C-terminal o de un derivado del mismo o una proteína
con una homología de secuencia aminoacídica de \geq70% con la
región de los aminoácidos 384-641 de la proteína
Hsp70 para la activación in vitro o ex vivo de células
NK.
3. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en donde la activación comprende la inducción de una respuesta
inmune mediada por células NK.
4. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la activación incluye una
estimulación de la proliferación de células NK y/o un aumento de la
actividad citolítica de las células NK.
5. Utilización de acuerdo con la reivindicación
4, en donde se aumenta la actividad citolítica de las células
tumorales o de las células infectadas de pacientes con enfermedades
infecciosas.
6. Utilización de acuerdo con la reivindicación
5, en donde se aumenta la actividad citolítica contra las células
leucémicas, células de linfoma, células tumorales, células
metastatizantes de tumores sólidos o células de pacientes infectados
con virus, bacterias y/o hongos.
7. Procedimiento para la activación ex
vivo o in vitro de células NK, en donde una suspensión
celular fisiológica que contenía células NK se mezcla e incuba con
una proteína, fragmento o derivado tal como se define en la
reivindicación 1, para lograr una activación de células NK.
8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
7, en donde la activación comprende una estimulación de la
proliferación de células NK y/o un aumento de su citotoxicidad.
9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
7 u 8, en donde las células mononucleares de sangre periférica o una
fracción que contiene células NK se utiliza como una suspensión de
células fisiológicas que contiene células NK.
10. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 9, en donde la suspensión celular contiene
además células humanas o animales que expresan Hsp70 en la
superficie celular.
11. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10, en donde las células tumorales o las células
infectadas de pacientes con enfermedades infecciosas se utilizan
como células humanas o animales.
12. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11, en donde las células de leucemia, linfoma,
tumorales, metastásicas de tumores sólidos o células de pacientes
infectados con virus, bacterias y/o hongos se utilizan como células
humanas o animales.
13. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 12, en donde la suspensión fisiológica de
células que contiene células y proteínas se incuba durante al menos
3 horas.
14. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 13, en donde la incubación se lleva a cabo durante 4
días.
15. Utilización de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 6 o el procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 7 a 14, en donde se utiliza además una
citocina.
16. Utilización o procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 15, en donde una se utiliza una citocina como
interleucina.
17. Utilización o procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16, en donde se utilizan la IL-2,
IL-12 o IL-15 como
interleucinas.
18. Utilización de una cantidad farmacéuticamente
efectiva de células NK activadas de acuerdo con el procedimiento de
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17 para la producción de una
preparación farmacéutica para la activación in vivo del
sistema inmune, en donde dicha preparación farmacéutica se
administra opcionalmente al mismo tiempo que o antes de una cantidad
farmacéuticamente efectiva de una proteína, fragmento o derivado tal
como se define en la reivindicación 1.
19. Utilización de una cantidad farmacéuticamente
efectiva de células NK activadas de acuerdo con el procedimiento de
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17 y opcionalmente una
proteína, fragmento o derivado tal como se define en la
reivindicación 1 para la producción de una preparación farmacéutica
para el tratamiento de tumores, enfermedades cancerosas,
enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunes.
20. Utilización de acuerdo con la reivindicación
19, en donde el tumor es un tumor sólido o una metástasis.
21. Utilización de acuerdo con la reivindicación
19, en donde la enfermedad cancerosa es una leucemia o un
linfoma.
22. Utilización de acuerdo con la reivindicación
19, en donde la enfermedad infecciosa tiene un origen vírico,
micológico o bacteriano.
23. Preparación farmacéutica, producto o
adyuvante medicinal que contiene un fragmento
C-terminal de una proteína Hsp70 tal como se define
en la reivindicación 1 o un derivado del mismo o una proteína con
una homología de secuencia aminoacídica de \geq70% con la región
de los aminoácidos 384 a 641 de la proteína Hsp70 y/o células NK
activadas de acuerdo con el procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 17 en una cantidad terapéuticamente efectiva
así como opcionalmente sustancias vehículo y/o adyuvantes
comunes.
24. Preparación farmacéutica, producto o
adyuvante medicinal de acuerdo con la reivindicación 23, en donde la
proteína está presente a una concentración de al menos 1 \mug/ml,
preferentemente de hasta 1000 \mug/ml.
25. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 o 15 a 22 o el procedimiento de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17, o una preparación
farmacéutica, producto medicinal o adyuvante medicinal de acuerdo
con la reivindicación 23 ó 24, en donde la proteína Hsp70 es una
proteína humana.
26. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, 15 a 22 ó 25 o el procedimiento de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17 ó 25 o la preparación
farmacéutica, producto o adyuvante medicinal de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en donde la proteína
Hsp70 o su fragmento o derivado es una proteína recombinante.
27. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, 15 a 22, 25 ó 26, o el procedimiento de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17, 25 ó 26 o la
preparación farmacéutica, producto o adyuvante medicinal de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en donde el
fragmento C-terminal de la proteína Hsp70 comprende
los aminoácidos 348 a 561 de la Hsp70 humana o la región
correspondiente de otra Hsp70 que comprenda los efectos de la
presente invención.
28. Utilización de las células NK tratadas con un
procedimiento de acuerdo con una o más de las reivindicaciones
anteriores para la producción de una preparación farmacéutica para
la terapia de enfermedades tumorales y/o enfermedades
infecciosas.
29. Utilización de acuerdo con la reivindicación
28, en donde la terapia se lleva a cabo mediante reinfustión de las
células NK tratadas.
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