WO1999040923A1

WO1999040923A1 - Agent prophylactique et therapeutique contre la steatose hepatique

Info

Publication number: WO1999040923A1
Application number: PCT/JP1999/000652
Authority: WO
Inventors: Kazuhiko Tsutsumi; Yasuhide Inoue
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.
Priority date: 1998-02-17
Filing date: 1999-02-16
Publication date: 1999-08-19
Also published as: EP1062951A1; AU2440699A; US6274571B1; EP1062951A4; TW570799B

Description

明細書脂肪肝予防，治療剤及び治療方法技術分野

本発明は脂肪肝予防，治療剤及び治療方法に関する。

背景技術

脂肪肝とは、肝臓内に脂質、主に中性脂肪（トリグリセリド、 T G) が過剰に蓄積した状態、即ち肝細胞のほぼ半数以上に脂肪空胞が認められる状態をいう。その原因としては、肥満、糖尿病、アルコール摂取、酸素不足、内分泌性障害、外来性毒物乃至薬品、内因性毒物等の種々のものが報告されている。特に、最近肥満の増加と共に、脂肪肝を伴う患者が増加している。該脂肪肝は、やがて肝炎、肝硬変等の重篤な肝障害に移行し、死に至る場合も少なくないので、早期の治療が必要である。しかしながら、現在、有効な治療薬はなく、食事療法が一般的であり、満足な予防及び治療効果を奏し得る医薬品の開発が望まれている。

本発明者らは従来より、医薬品有効成分化合物につき、鋭意研究を重ねてきた力その過程で先に一連のカルボン酸アミド誘導体が、抗炎症剤、カルシウム拮抗作用剤として有用であることを見出し、該誘導体に係る発明を完成し、特許出願した（特開昭 6 1— 1 5 1 1 9 9号公報及び E P特許公開第 2 7 3 4 4 4号公報参照）。

また、本発明者らは、上記カルボン酸アミド誘導体に関連する他のカルボン酸アミド誘導体が、優れた脂質低下作用を有し、また副作用等の毒性面でもより優れており、高脂質血症治療剤として、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高リン脂質血症、高遊離脂肪酸血症等の各種疾患（高脂質血症）の治療及び予防に有用であることを見出し、該知見に基づく発明を特許出願した（特許第 2 5 8 4 3 3 6号参照）。

更に、本発明者は、上記高脂質血症に有効なカルボン酸アミド誘導体が、これとは別個に、尿蛋白排泄抑制作用を有し、腎炎治療剤として有効であることも見出し、該知見に基づく発明を特許出願した（特願平 9一 9 3 0 0 2号）。発明の開示

本発明の目的は、上記特許出願に係る化合物の低毒性等の優れた性質を利用して、該化合物の新たな医薬用途、特に脂肪肝に対する予防，治療剤及び治療方法を開発する点にある。

本発明者は、上記目的より引続き研究を重ねた結果、高脂血症及び腎炎に対して有効な上記化合物が、之等各医薬用途とは関連せず、しかも之等医薬用途に適した薬理作用からは予想外の、肝臓中の中性脂肪（トリグリセリド、 T G) 及び総コレステロールの低下作用を有し、脂肪肝の予防及び治療に有効であるという新しい知見を得た。本発明はこの知見に基づいて完成されたものである。

課題を解決するための手段

(式中 Rは低級アルキル基を、 Xはハロゲン原子を示す。）

で表わされるカルボン酸アミド誘導体を有効成分とする脂肪肝予防，治療剤及び治療方法に係わる。

本発明脂肪肝予防，治療剤及び治療方法において有効成分とする上記一般式 ( 1 )で表わされる化合物は、前述した通り、本発明者らにより、既に血中中性脂肪（トリグリセリド、 T G) 及びコレステロール低下作用を有し、高脂血症治療に有効であることが知られている（特開平 3 _ 6 8 5 9 2号公報）。しかしながら、この作用と脂肪肝予防及び治療のための肝臓における中性脂肪蓄積抑制乃至肝臓コレステロール低下作用とは、むしろ相反する作用であることが知られている。

事実、血中中性脂肪及びコレステロール低下作用を有し、高脂血症治療剤として用いられている、例えばクロフイブラートは、副作用として肝への中性脂肪蓄積をもたらし、肝肥大を引き起こすことが知られているのである（例えば特開平 8 - 1 1 9 8 6 0号公報参照）。本発明は、かかる従来の知見に反して驚くべきことに、上記一般式（1 )で表わされる化合物が、血中中性脂肪及びコレステロール低下作用を有するにもかかわらず、該作用と共に、肝臓脂肪の蓄積抑制乃至肝臓中コレステロール低下作用を奏し、所望の脂肪肝予防及ぴ治療効果を奏し得ることを見出し完成されたものである。

図面の簡単な説明

図 1及び図 2は、薬理試験例 4に従う、各群ラットの摘出肝臓を写真撮影した生物の形態を示す図面代用写真である。図 1は白黒写真であり、図 2はカラー写真である。

発明を実施するための最良の形態

本発明有効成分化合物を示す一般式（1 )において、 Rで示される低級アルキル基としては、例えばメチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、 tーブチル、ペンチル、へキシル基等の炭素数 1〜6の直鎖状及び分枝鎖状アルキル基を挙げることができる。また Xで示されるハロゲン原子には、弗素原子、塩素原子、臭素原子及び沃素原子が包含される。

殊に優れた脂肪肝予防及び治療効果を奏し得る上記有効成分化合物としては、下記一般式（1 a ) 及び（1 b ) で表わされるカルボン酸アミド誘導体、即ちフェニル環上の置換基としての C N基が同置換基としてのアミノ基に対してオルト位又はパラ位に存在し、且つ Xで示されるハロゲン原子がパラ位又はオルト位に存在する誘導体が例示できる。

一般式（1 a ) ：

(式中 R及び Xは上記に同じ。）

一般式（l b ) ： ( 1 b

(式中 R及び Xは上記に同じ。）

上記一般式（l a ) で表わされる有効成分化合物中でも、 4ージエトキシホスフイノィルメチルー N— ( 4—ブロモ一 2—シァノフエニル）ベンズアミドは、最も優れた脂肪肝予防及び治療効果を奏し得るものとして例示できる。

上記一般式（1 ) で表わされる誘導体、殊に一般式（l a ) 及び一般式（1 b ) で表わされる誘導体は、優れた脂肪肝予防及び治療効果を奏するに加えて、溶血作用等の副作用を殆んど伴わない安全性の優れたものである特徴を有しており、この面から上記予防及び治療剤として極めて有用である。更に、上記誘導体は、肝に対する副作用、例えば脂肪の蓄積や浮腫等による肝肥大を伴わない特徴をも有しており、この点でも脂肪肝予防及び治療剤として特に有効である。

本発明において有効成分とするカルボン酸アミド誘導体は、種々の方法により製造できる。その例としては、例えば特許第 2 5 8 4 3 3 6号の記載を引用することができる。より詳しくは、上記一般式（1 ) の化合物に対応するカルボン酸塩化物誘導体と、同化合物に対応するハロゲン原子及びシァノ基をフユ二ル環上置換基として有するァミン類とを、芳香族乃至脂肪族炭化水素やハロゲン化炭化水素等の適当な溶媒中、脱酸剤、例えばトリェチルァミン等の第 3級ァミンの存在下に、室温〜溶媒の還流温度下に、 0 . 5〜1 0時間程度反応させる方法を例示することができる。

上記有効成分化合物は、通常一般的な医薬製剤の形態に調製され本発明予防及び治療剤とされる。該医薬製剤は、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤乃至賦形剤を用いて調整される。この医薬製剤としては各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）等が挙げられる。

錠剤の形態に成形するに際しては、担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリゥム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケィ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリゥム、ポリビエルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロ一ス又はそのカルシウム塩、微結晶セルロース、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壌剤、白糖、ステアリン、カカオバタ一、水素添加油等の崩壊抑制剤、第 4級アンモニゥム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケィ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホゥ酸末、ポリエチレングリコ一ル等の滑沢剤等を使用できる。さらに錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フイルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。

丸剤の形態に成形するに際しては、担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。坐剤の形態に成形するに際しては、担体として例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を使用できる。

カプセル剤は常法に従い通常本発明化合物を上記で例示した各種の担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調整される。

注射剤として調整される場合、液剤、乳剤及び懸濁剤は殺菌され、かっ血液と等張であるのが好ましく、これらの形態に成形するに際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用できる。なお、この場合等張性の溶液を調整するに充分な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。

更に本発明医薬製剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させることもできる。

本発明医薬製剤中に含有されるべき有効成分化合物の量は、特に限定されず広範囲から適宜選択される。通常医薬製剤中に 1 70重量％とするのがよい。本発明医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、その製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、？し剤、顆粒剤及びカプセル剤は経口投与される。注射剤は単独で又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。坐剤は直腸内投与される。本発明医薬製剤の投与量は、用法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等により適宜選択され、通常有効成分化合物の量が 1 日成人体重 1 k g当り約 450mg 4. 5 g程度とするのがよく、該製剤は 1 日に 1 4回に分けて投与することができる。

実施例

以下、本発明を更に詳しく説明するため本発明有効成分化合物の製造例を挙げ、次いで薬理試験例を挙げる。更に、本発明脂肪肝予防及び治療剤の製剤例を挙げる。

製造例 1

2—ァミノ _ 5—ブロモベンゾニトリル 3. 94 g (20ミリモル）、トリエチルァミン 2. 22 g (22ミリモル）及び 4ージメチルァミノピリジン 0. 4 9 g (4ミリモル）とを、乾燥ジクロロメタン 40m 1に溶解させ、これに氷冷撹拌下に、 4一ジェトキシホスフイノィルメチルベンゾィルクロリド 5 · 81 g (20ミリモル）の乾燥ジクロロメタン 4 Om 1溶液をゆっくり滴下した。室温で 10時間撹拌した後、反応混合物中に水 50m lを加え、クロ口ホルムで抽出し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロ口ホルム：酢酸ェチル == 1 ： 2で溶出）で精製し、ベンゼン一 n—へキサンより再結晶して、無色結晶の 4—ジエトキシホスフイノィルメチルー N— (4—ブロモ一 2—シァノフエニル）ベンズアミド 2. 9 4 gを得た。融点： 165 1 66 C (ベンゼン— n キサンより再結晶）薬理試験例 1 脂肪肝抑制及び改善効果試験

9ヶ月齢の雄性ラット（SDラット、体重約 700 g) を 3群に分け、その一群（9匹、正常群）は、固形飼料（オリエンタル酵母工業株式会社製、 CRF— 1) で 3ヶ月間飼育した。

他の 2群（各群 6匹、本発明群及び対照群）は、 26. 7%のサフラワー油を含有する同固形飼料（オリエンタル酵母工業株式会社製、 CRF- 1) で 3ヶ月間飼育した。

本発明群は、上記固形飼料による飼育と同時に、 4ージエトキシホスフイノィノレメチノレー N— (4—ブロモ一 2—シァノフエニル）ベンズアミドを 50mgZ k gノ日の割合で経口投与（ 5。/₀ァラビアゴム懸濁液として投与）した。

実験終了後、各群ラットを解剖し、肝臓を摘出し、肝臓中のトリグリセリド量及びコレステロール濃度を測定した。尚、上記測定は、肝臓の脂質をクロ口ホルム：メタノ一ル = 2 ： 1の混合液で抽出した後、市販の酵素法のキットを用いて行なった。

結果を下記表 1に示す。尚、表中※印は、スチュデンッテストによる対照群に対する有意差（P<0. 01) を示す。

上記表 1より、高脂肪食でラットを飼育すると、対照群として示すように、肝臓中のトリグリセリド濃度及びコレステロール濃度が増加し、脂肪肝となるのに対して、本発明有効成分化合物の投与によれば、本発明群として示す通り、上記トリグリセリド濃度及びコレステロール濃度の増加は顕著に抑制されることが明らかである。このことから、上記有効成分化合物は、脂肪肝の発症抑制効果乃至脂肪肝の改善効果を奏し得ることが明らかである。

薬理試験例 2 脂肪肝改善効果試験フルクト一ス含有飼料（フルクトース 7 0 %、カゼイン 1 5 %、コーン油 7 <½、ミネラル混合物 5 %、ビタミン混合物 1 %及びセルロース 2 %) で 9週齢の雄性ウィスターラットを 3日間飼育して脂肪肝を誘発させた。

上記脂肪肝誘発ラットに、 4—ジエトキシホスフイノィルメチル一 N— （4一プロモ一 2—シァノフエニル）ベンズアミドを 5 O m g / k gの割合で 1 日 1回、 4曰間経口投与（ 5 %ァラビアゴム懸濁液として投与）した（本発明群）。

最終投与の 4時間後に、ェ一テル麻酔下にラットより肝臓を摘出し、肝臓中の中性脂肪（トリグリセリド）及びコレステロールを薬理試験例 1と同様にして測定した。

結果を下記表 2に示す。表には、本発明有効成分化合物の投与を行なわなかつた脂肪肝誘発ラットをコントロール群とし、また正常ラットを正常群として、それぞれの中性脂肪及びコレステロール測定結果を併記する。尚、表中※印及び※ ※印は、それぞれスチュデンッテストによるコントロール群に対する有意差（p < 0 . 0 5及び pく 0 . 0 1 ) を示す。

表 2

上記表 2より、本発明有効成分化合物の投与（本発明群）によれば、脂肪肝誘発ラットにおけるトリグリセリド及びコレステロールの顕著な低下の認められることが明らかである。このことから、上記有効成分化合物は、脂肪肝の治療、改善効果を奏し得ることが判る。

薬理試験例 3 脂肪肝改善効果試験

本発明の種々の有効成分化合物の脂肪肝改善効果を調べるために、下記の化合物 1〜4を用いて、薬理試験例 2と同様にして薬理試験を行った _c

化合物 1 ：

化合物 2

化合物 3

化合物 4

結果を下記表 3に示す。表には、本発明有効成分化合物の投与を行なわなかつた脂肪肝誘発ラットをコントロール群とし、また正常ラットを正常群として、それぞれの中性脂肪及びコレステロール測定結果を併記する。尚、表 3における化合物 1 ( 4ージエトキシホスフエノィルメチル一 N— ( 4—ブロモ一 2—シァノフエニル）ベンズアミド）は、薬理試験例 2の表 2における本発明群に投与した化合物に相当する。表 3

上記表 3より、化合物 1だけでなく化合物 2〜4を投与した試験群（本発明群）においても、脂肪肝誘発ラットにおけるトリグリセリド及びコレステロールの顕著な低下が認められた。このことから、本発明の種々の有効成分化合物は、脂肪肝の治療、改善効果を奏し得ることが判る。

薬理試験例 4 脂肪肝改善効果試験

7週齢の雄性ウィスター系ラットにストレプトゾトシン（シグマ社製）を 85 mgZk gの割合で尾静脈より投与して糖尿病を惹起させた。

上記糖尿病発症ラットを、コレステロール 0. 25%を含有する固形飼料（ォリエンタ /レ酵母工業社製、 CRF-1) にて 8ヶ月間飼育した（対照群）。

また本発明群は、上記固形餅料による飼育と同時に、 4—ジエトキシホスフィノィメチ /レー N— (4—ブロモー 2—シァノフェニ^^) ベンズアミドを、 1日 1回、 8ヶ月間、 30、 100又は 30 OmgZk g/日の割合で経口投与した c 8ヶ月の実験期間経過後、各群ラットより肝臓を摘出し、その状態を観察すると共に、写真撮影を行なった。結果は、図 1及び図 2に示す通りである。図 1及び図 2は、各群ラットの摘出肝臓を写真撮影した生物の形態を示す図面代用写真である。図 1は白黒写真であり、図 2はカラ一写真である。

図中、「Normal」は正常ラット（普通食による飼育）の肝臓である。

「Control」は対照群ラットの肝臓である。また、「30mg/k g」、「10 OmgZk g」及び「300mg/k g」は、それぞれ本発明有効成分化合物を 30mgZk g、 1 0 Omg/k g及び 30 Omg/k gとなる割合で経口投与したラット（本発明群）の肝臓である。

図 1及び図 2より、本発明群ラットの肝臓は、濃度依存的に若干脂肪の蓄積による淡色化は認められるものの、いずれも正常ラットの肝臓とほぼ同様の色調を有していることが判る。これに対して、対照群ラットの肝臓は、脂肪の蓄積による白化が著しく、正常ラットの肝臓とは明らかに異なる色調を呈することが判る。このことから、上記有効成分化合物は、脂肪肝の予防及び治療剤として有効であることが判った。

また、本発明群ラットの肝臓では、肝肥大は認められなかった。

薬理試験例 5 溶血試験

7週齢の雄性 d dYマウスを 1群 6匹（試験群）に群分けして以下の試験を行なった。本発明有効成分化合物（製造例 1で得たもの）を 0. 5%カルボキシメチルセルロース（CMC) に懸濁させて、経口ゾンテを用いて強制的に 600 mgZ5m 1 Zk gで 10日間経口投与した。

尚、コントロール群として、 0. 5。/₀ CMCのみを投与した群を設けた。

上記最終投与後、 20時間絶食させた後、供試動物を解剖し、採血及び臓器摘出を行ない、血液の赤血球数を測定し、また脾臓の重量測定を行なった。

その結果、上記有効成分化合物を経口投与した試験群の赤血球数比（コント口 —ル群の赤血球数を 1とする相対比）は 0. 96であり、脾臓重量比（同様にコントロール群の同値を 1とする相対値）は、 1. 1 3であり、両値ともコント口ール群と比べて有意差が認められず、このことから本発明有効成分化合物は、溶血の副作用を示さないものであることが明らかとなった。

製剤例 1 錠剤の調製製造例 1で調製した化合物を、 1錠当リ 25 Omg含有する錠剤（1 000 錠）を、次の処方により調製した。

製造例 1で調製した化合物 250 g

乳糖（日本薬局方品） 33. 3 g コーンスターチ（日本薬局方品） 1 6. 4 g カルボキシメチルセルロースカルシウム（日本薬局方品） 1 2. 8 g メチルセルロース（日本薬局方品） 6. 0 g ステアリン酸マグネシウム（ョ本薬局方品） 1. 5 g 全量 320. 0 g

上記処方に従い、有効成分化合物、乳糖、コーンスターチ及びカルボキシメチルセルロ一スカルシウムを充分に混合し、メチルセルロース水溶液を用いて顆粒ィ匕し、 24メッシュの篩に通し、ステアリン酸マグネシウムと混合して錠剤にプレスした。

製剤例 2 カプセル剤の調製

本発明有効成分化合物として 4ージエトキシホスフイノィルメチルー N— (2 —クロ口一4—シァノフエニル）ベンズアミドを、 1カプセル当リ 25 Omg含有する硬質ゼラチンカプセル（1000個）を、次の処方により調製した。 4—ジェトキシホスフィノィ /レメチノレー N— ( 2—クロ口一 4一シァノフエ- レ）ベンズァミド 250 g 結晶セルロース（日本薬局方品） 30 g

コーンスターチ（日本薬局方品） 1 7 g

タルク（日本薬局方品） 2 g

ステアリン酸マグネシウム（日本薬局方品） l g

全量 300 g

上記処方に従い各成分を細かく粉末にし、均一な混合物となるように充分混和した後、所望の寸法を有する経口投与用ゼラチンカプセルに充填して、目的の力プセルを得た。

製剤例 3 顆粒剤の調製

有効成分として 4—ジェトキシホスフイノィルメチル一 N— (2—ブロモ一4 —シァノフエ二ル）ベンズアミドを、 1 g当り 50 Omg含有する顆粒剤（1 0 0 Og) を、次の処方により調製した。

4—ジェトキシホスフィノィルメチル一 N— (2—ブロモ一4—シァノフエ二ル）ベンズァミド 500 g コーンスターチ（日本薬局方品） 250 g 乳糖（日本薬局方品） 100 g 結晶セルロース（日本薬局方品） 100 g カルボキシメチルセルロースカルシウム（日本薬局方品） 40 g ヒドロキシプロピルセルロース（日本薬局方品） 10 g 全量 1000 g

上記処方に従い有効成分化合物、コーンスターチ、乳糖、結晶セルロース及びカルボキシメチルセル口一スカルシウムを混合した後、混合物にヒドロキシプロピルセルロース水溶液を加えて混練し、押出し造粒機で造粒し、 50°Cで 2時間乾燥して、目的顆粒剤を得た。