VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON ZENTRALNERVOSEM GEWEBE IN ERZEUGNISSEN
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis von spezifischein Risikoπiaterial , vorzugsweise von zentralnervösem Gewebe wie insbesonders Gehirnzυsätzen sowie Zusätzen von zentralem Nervengewebe in Erzeugnissen wie Lebensmitteln und pharmazeutischen Präparaten und ein Testkit. zur Durchführung des Verfahrens .
Es ist bekannt, daß von mit Scrapie erkrankten Schafen und Ziegen stammendem Gewebe Rinderwahnsirin (Bovine spongi- forrne Enzephalopathie , BSE) bei Rindern erzeugt werden kann. H erbei hat es sich gezeigt, daß der Erreger offen¬ bar auch durch den Verzehr von infiziertem Fleisch bzw. Fle chprodukten auch auf den Menschen übertragen werden kann und dort zu einer neuen Variante der Jakob-Creutzfeldt-Erkrankung (nvCJD) führen kann. Da weiterhin gefunden wurde, daß sich die für die Auslösung der Erkrankung verantwortlichen infektiösen Proteine (Prieme) besonders in den Nerven und im Gehirn ansammeln, stellen Gewebe aus diesen Organen auch unter Berücksichtigung von noch nicht entdeckten Erregern und Agenzien ein hohes Infektionsri¬ siko dar. Daher werden derartige von Rindern, Schafen und Ziegen stammende Organe, die üblicherweise eine hohe Prionen-konzentration enthalten, als "spez f z rtes Risikomaterial" (SRM) bezeichnet.
Rechtsvorschriften wie die Entscheidung der Kommission 97/534/EG (Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften Nr. L 1997, 216:95-98) sehen vor, daß derartiges spezielles, bei der Schlachtung anfallendes Risikomaterial getrennt, gesammelt, eingefärbt und auch getrennt von übrigen Schlachtabfällen beseitigt werden muß. Hierzu gehören auch Augen, Mandeln oder die Milz derartiger Tiere.
Da bei der Verarbeitung von Lebensmitteln, insbesondere von Fleischerzeugnissen wie Würsten, das Zusetzen von Hirngewebe auch technische Wirkungen wie bessere Emul- gierbarkeit (Brühwurstbrät) und erhöhte Stabilität (Beefburger) bietet, ist es zum Schütze des Verbrauchers notwendig, die Einhaltung des zuvor genannten Verwertungsverbotes im Rahmen der LebensmittelÜberwachung zu kontrollieren. Dabei wurden bislang von den zu untersuchenden Lebensmitteln, wie z.B. Fleischerzeugnissen histologische Präparate hergestellt, welche anschließend von besonders geschulten Fachleuten lichtmikroskopisch untersucht wurden. Mit diesem Verfahren können neben den zu erwartenden Bestandte len der Muskulatur und Bindege¬ webe auch nicht erwünschte Gewebe identifiziert werden, wie Niere, Pansen oder auch Haut.
Es hat sich jedoch gezeigt, daß der Zusatz von Hirngewebe mittels lichtmi roskop scher Roυtined agnostik , d. h. durch Anfertigen von lOμm Kryoschnitten und Färbung mit Picroindigocaπnin/Karπia aun nicht erfaßt werden. Dies gilt auch für Ultradünnschnitte mit herkömmlicher Färbetechnik (Hämatoxylin/Eosin) sowie für Spezialfärbungen (Silberim- prägnierung, Neurofibrillen, Markscheiben, Nissl-Färbung) . Auch ZNS-charakteristische Bestandteile wie Hirnhaut oder Zellstrυkturen wie Astrozyten sind mittels den oben genannten Verfahren nicht ent f z erb r.
Es besteht daher Bedarf an einem schnellen Testverfahren, mit dem die Verwendung derartiger unerlaubter spezifizierter Risikomaterialien auch noch in geringen Mengen nachgewiesen werden kann.
Es ist bereits ein Verfahren zum Nachweis von unerwünschten Zutaten in Fleischerzeugnissen bekannt und zwar im besonderen in Hinblick auf die bovine spongiforrne Enzephalophathie (BSE) [Fleischw rtscha t 77 (9), 836-840 (1997), E. Lücker und M. Bülte] . Dabei wird mit einem enzymatlsch-photometrischen Verfahren der Cholesteringe- halt bestimmt, wodurch sich bereits ein Zusatz von 2% Gehirngewebe in Brühwürsten nachweisen läßt. Dieses Verfahren hat zwar den Vorteil, daß es sich auf einfache Weise mit geringen instru entelle Zeit- und Kostenaufwand durchführen läßt. Es weist jedoch den Nachteil auf, daß es nicht möglich ist, festzustellen, ob ein erhöhter Chole- steringehalt durch verbotene Hirnzusätze oder durch Zusätze wie Eigelb, Leber oder pflanzliche 3-ß-Hydroxy- sterine hervorgerufen wird. Daher kann er in der Praxis nur zum Auffinden von Verdachtsproben dienen.
Das glycolytische Enzym Enolase, eine 2-Phospho-D-gly- cerat-Hydrolase (Gras P., Martin J.J., Gheuens, J., V" -enolase and glial fibrillary acidic protein in nervous system tumors. An immunohistochemical study using specific monoclonal antibodies, Acta Neuropathol . 1988, 75:377-84 und Cras P., Soler Federsppiel, S. Gheuens J., Martin. J.-J., Lo enthal A. , Demonstration of neuron-specific enolase in nonneuronal tumors using a specific monoclonal antibody, Ann. Neurol . 1986, 20:106-7) ist als Marker für neuronale und ni chtneurona] e Tumore bekannt.
Die Erfindung hat daher zum Ziel, den weiterhin bestehen¬ den Bedarf an einem spez fischen, leicht durchzuführenden
Verfahren zu befriedigen, mit de spezifiziertes Risikomaterial, insbesondere Gehirn- und Nervengewebe noch bei einem geringen Gehalt zweifelsfrei nachgewiesen werden kann, und zwar auch dann, wenn das Erzeugnis bei der Zubereitung erhitzt wurde. Ein derartiges Testverfahren soll preiswert, schnell durchführbar und automatisierbar sein, damit es als Routineverfahren generell einsetzbar ist.
Dieses Ziel wird nun mittels dem erfindungsgemäßen Verfahren nach Anspruch 1 erreicht.
Es wurde nämlich gefunden, daß sich der Zusatz von Gehirnmasse bzw. zentralem Nervengewebe durch den Gehalt an v", '-Enolase (EC 4.2.1.11, neuronenspezifi sehe Enolase) nachweisen läßt, wobei der Gehalt direkt proportional zur zugesetzten Gehirnmasse bzw. Nervenmasse ist. Dies ist umso überraschender, weil umfangreiche Untersuchungen der Erfinder gezeigt haben, daß in erhitzten Fleischerzeugnissen wie Brüh- und Kochwürsten mit definierten Hirnzusätzen bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese und beim Isoelektrischen Fokussieren (PAGIF) keine spezifischen Banden erhalten werden, die sich vom gleichen Produkt ohne Hirnzusatz unterscheiden, da sowohl die Struktur als auch die elektrochemischen bzw. proteinchemischen Eigenschaften der ZNS-spezifischen Proteine bei der Erhitzung während der Wurstherstellung (mindestens 80°C über etwa 60 Minuten) nachhaltig beeinträchtigt werden. Dies gilt auch für den Nachweis von derartigen charakteristischen Proteinen mittels immunolo¬ gischer Methoden.
Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß sich trotz der oben beschriebenen Proteindenaturierung ein spezifischer Nachweis von Hirngewebe bzw. zentralem Nervengewebe in Erzeugnissen bzw. Präparaten durchführen läßt. Somit ist es erfindungsgemäß möglich, derartige unzulässige Zusätze auch noch in erhitzten Fleischerzeugnissen nachzuweisen. Vorzugsweise wird der Nachweis mittels Jf , ^-Enolase-spezifischen Antikörpern durchgeführt, überraschenderweise wurde
festgestellt, daß sich der Nachweis auch mittels polykloπa] er. ^",^" -Enolase-Antikörpern spezifisch durchführen läßt.
Erfindυngsge äß wurde auch gefunden, daß sich die Empfindlichkeit des Nachweises von "", <>f -Enolase beträchtlich steigern läßt, wenn die zu untersuchende Probe vorher einer Fettextraktion unterzogen wird. Auf diese Weise ist es möglich, noch 0,25% Zusatz an Rinderhirn in Fleischerzeugnissen selektiv nachzuweisen.
Die erfindungsgemäße Fettextraktion wird mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels durchgeführt. Vorzugsweise werden n cht-protonische apolare Lösungsmittel wie Petroleum-Benzin, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff oder Ether verwendet. Auch die Extraktion mittels Gasen im überkri¬ tischen Zustand, wie beispielsweise CO2 ist möglich. Optimale Bedingungen werden bei der isothermischen Extraktion im Rückfluß (Soxhlet) erreicht. Die Reduktion des Fettgehaltes sollte bezogen auf den Fettgehalt, der Probe mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, im besonderen mindestens 30% bzw. bezogen auf die Probenmasse mindestens 2%, zweckmäßigerweise mindestens 5% und vorzugsweise mindestens 8% und im besonderen mindestens 15% betragen. In der Praxis hat es sich gezeigt, daß je nach Probe eine Extraktion im Bereich von 15-60% zweckmäßig ist.. Vorzugsweise wird die Fettextraktion an der nativen Probe durchgeführt. Extraktion mit anderen Mitteln wie SDS oder Tensiden wie Temed oder Nonidet sind zwar möglich, jedoch werden die zuvor genannten Lösungsmittel bevorzugt. Gleiches trifft auf die Proteinanreicherung mittels umgekehrter Filtration (Zentrisart. , Sartori us) zu.
Erfindungsgemäß ist es auch möglich, mittels geeigneten Antikörpern gegen Spezies-spezifische ^J ^f -Enolase Hirn-
und Nervenzusätze von unterschiedlichen Tierarten zu bestimmen. Dabei werden die , Y" -Enolasen von verschiedenen Tierarten nach einer einfachen und reproduzierbaren Reinigung aus Gehirngewebe und aus Rous-Sarko a- transformierten Zellen von verschiedenen Tierarten gewonnen (Eigenbrodt, E., P. Fister, H. Rübsamen, R. R. Fries, Influence of transfor ation by Rous sarcome virus on the amount , phosphorylation and enzy e kinetic properties of enolase, The EMBO Journal, Vol. 2:1565-1570, 1983). Nach der Isolierung und Reinigung des so erhaltenen Enzyms kann dieses nach bekannten Verfahren zur Herstellung von poly- und monoklonalen Antikörpern verwendet, werden.
Die Erfindung betrifft auch einen Testkit zur Durchführung des Verfahrens. In einer bevorzugten Aυsführungsform wird dabei ein an Ϋ , -Enolase bindender Antikörper, vorzugsweise ein spezifischer Antikörper mittels bekannten Verfahren an eine Festphase immobilisiert. Die zu untersuchende Probe wird dann mit dem vorzugsweise gelösten Enzym in Kontakt gebracht und in einem geeigneten Puffersystem m ttels der Antikörper an die Festphase gebunden. Nach Waschen des so erhaltenen immobilisierten Antikörper-Enol se-Komplexes wird dann ein weiterer, mit einem Marker versehener sekundärer Antikörper zugesetzt, der an ein anderes Epitop der ^", ^"-Enolase bindet und die Menge des Markers bestimmt. Die Menge an gebundenem Marker ist. direkt proportional der Menge der Enolase in der Probe. Zweckmäßigerweise enthält der Testkit Referenzmaterial mit untersch dl chen Hirn- und/oder Nervenzusätzen zur Sicherung der Analysenqualität.
Erf ndungsgemäß ist. es auch möglich, die Analytenkonzen- tration mittels Biosensoren zu bestimmen, wie z. B. a perometr ehe Sensoren, potent o etrische , ionenselek¬ tive potentiometrische oder photometrische Sensoren oder
auch solche mittels Halbleiterelektroden wie Feldeffekttransistoren (FET) , che osensitive Feldeffekttransistoren (CHEMFET) , suspended-gate-Feldeffekttransistoren (SGFET) oder ionensensitiven Feldeffekttransistoren. Derartige Biosensoren sind zusammenfassend in E. A. H. Hall und G. Hummel in "Biosensoren", Springer Verlag Heidelberg, Deutschland, 1995 beschrieben. Weitere Entwicklungen von ionensensitiven Feldeffekttransistoren (ISFET) oder optischen Detektoren sind unter anderem von F. Aberl und H. Wolf in "Aktuelle Trends in der I munsensori , Labor 2000, S. 70-96, (1993)" beschrieben. Ebenfalls geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren für die Durchführung mittels piezoelektrischen Schwingquarzen und Oberflächen- wellenel e enten , welche als Mikrowaagen verwendet werden können. Dabei wird der primäre Antikörper (der sog. Catcher) auf einem piezoelektrischen Substrat, immobilisiert und nach Bindung mit der zu analysierenden % , -Enolase gemessen. Derartige Sensoren sind bei¬ spielsweise von A. Leidl et al . in "Proceedings of the second international Symposium on miniaturized total analyses system μTAS", Basel 1996, beschrieben. Quarzkri- stallmikrowaagen , wie sie von C. Köslinger et. al-, Fresenius J. Anal. Chem. (1994), 349., 349-354 beschrieben sind, haben sich als besonders geeignet erwiesen.
Beispiel 1:
Es wurden Brühwürste mit definierten Zusätzen an Rinderhirn hergestellt, w e dies bei Lücker und Bülte [(1997) Fleischwirtschaft 77, Seite 136-840 (1997)] beschrieben ist. Bei diesen Brühwurststandards betrug der Anteil an Hirn 0%, 1%, 2%, 3,8%, 7,4%, 13,8% und 33,3% (BWS-a bis g). Bei einem zusätzlichen Standard wurde anstelle des Hirns 16% Eigelb zugesetzt (BWS-Ei) . Die Proben wurden
unter Kühlung mit. Tris-Harnstoff-Puffer im Potter extrahiert (Extraktionspuffer: TRIS-Harnstoff-Puffer aus 20 mM Tris (Hydroxymethyl ) -Am inomethan, 8 M Harnstoff, pH 7 , 6 und 15 Minuten bei 2500 UpM zentrifugiert und zweifach filtriert. Das Filtrat wurde im Verhältnis 50:1 mit Probenpuffer (TRIS-SDS-Mercaptoethanol-Harnstoff , Probenpuffer zu gleichen Teilen aus Sa melgelpuffer , 10%igem Gew. /Vol. 2-Mercaptoethanol, 10%igem Gew. /Vol. SDS und 8 M Harnstoff; Sammelgelpuffer : 0,5 Tris (Hydroxymethyl) - Amminomethan, 1% Ge . /Vol . SDS) verdünnt. Diese Probenextrakte können bei -18°C über mehrere Monate hindurch ohne Qual tätsverluste gelagert werden.
Die Proteinkonzentration der Extrakte wurde mit einem Proteintest von Bio-Rad (Richmond, USA) bestimmt. Die Proteine wurden mittels einer SDS-Gel-Elektrophorese mit 10%igen Acrylamidgelen nach Laem li [Nature, 227, 680-685 (1970)] aufgetrennt. Dabei wurde bei jeder Probe 10-100 μg Protein aufgetragen. Nach der Auftrennung wurde mit Coomassie-Blau angefärbt, wobei als Marker der Molekular¬ masse-Kalibrierungskit LMW von Pharmacia (Uppsala, Schweden) verwendet wurde.
Die aufgetrennten extrahierten Proteine wurden dann im E ektroblotverfahren (CTI, Idstein/Taunυs) auf Nitrocellulose-Me branen (Optitran BA-S85, Schleicher und Schuell) bzw. auf PVDF-Membranen (Immobilon-P . , Millipore, Bedford/USA) übertragen und mittels primärer pol - bzw. monoklonaler Antikörper in Verbindung mit sekundären Antikörpern markiert, die mit Peroxidase konjugiert waren
(direkt bzw. biotinyli ert.) . Als Substrat für die Farbre¬ aktion wurde 3,3' -Dia inobenzidin-tetrahydrochloridhydrat
(DAB, Aldrich, Milwaukee, USA) verwendet.
Als Antikörper wurden sowohl poly- als auch monoklonale Antikörper verwendet. Polyklonale Antikörper, die gegen ^, ^-Enolase gerichtet sind, z. B. Rabbit N 535 ^-Enolase, werden von Geπosys hergestellt und durch IC Chemikalien GmbH, Ismaning/DE vertrieben. Ihre Kreuzreaktivität mit α-Enolase wird als <10% angegeben. Monoklonale Antikörper, die gegen die humane $t £ -Enolase gerichtet sind, werden von DAKO, Hamburg/DE vertrieben.
Weitere erfindungsgemäß zu verwendende monoklonale Antikörper sind aus Zellinien erhältlich, die dem Mäusezell- klon BBS/NC/VI-H14 entstammen. Diese monoklonalen Antikörper zeigen keine Kreuzreaktivität mit humaner α- oder ß-Enolase. Soler Federsppiel, B.S., P. Cras, J. Gheueus , D. Andries, A. Lowenthal , Human V,^ -Enolase: Two-site im unoradio etric assay with a Single monoclonal antibody, Journal of Neurochemi stry 1987, £8: 22-28.
Beispiel 2:
Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei die Wurstproben jedoch manuell mit einem Messer fein zerkleinert wurden. Von diesem gehackten Material wurden 10g auf einen Faltenfilter (Schleicher und Schυell, Nr. 597%) eingewogen und der Filter mit dem Probenmaterial in eine Extraktionshülse aus Filterpapier (Schleicher und Schuell , Nr. 603) einge¬ bracht, mit Watte verschlossen und in einen Extraktions¬ apparat nach Soxhlet. Dabei wurde das 1,5-fache des Extraktionsaufsatzes an Petroleum-Benzin in den Extrakti- onskolbeπ gegeben und acht Stunden unter Rückfluß extra¬ hiert. Nach Rückdestülierung des Lösungsmittels wurden die Extraktionshülsen entnommen und bei Raumtemperatur (etwa 1 Stunde) getrocknet. Im Durchschnitt wurde ca. 36% des Fettgehaltes der Probe extrahiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle angegeben.
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Tabellarische Auflistung der Ergebnisse (semiquantitativ: aus Beispiel 1 (ohne Fettextraktion) und Beispiel 2 (mit Fett xtrakt n)
Probe Hirn-Zusatz (%) Sonst. Zusatz (%) Extraktion Response
Brühwurst 0 Ohne -
1 Fettextraktion +
2 ++
3,8 +++
7,4 ++++
13,8 +++++
33,3 ++++++
0 Eigelb, 16% -
0 Mit -
0,25 Fettextraktion +
0,5 ++
1 +++
2 ++++
Kochwurst 0 Leber, 16% Ohne -
1 bzw. Fettextraktion -
2 Leber, 32% -
4 -
8 -
16 -
32 -
0,25 Mit +
0,5 Fettextraktion -
1 +
Bande nicht erkennbar
Bande (mit bloßem Auge) gerade erkennbar
+-f Bande erkennbar + ++ Bande gut erkennbar ++++ Bande deutlich ausgeprägt +++++ Bande sehr stark ausgeprägt ++++++ Bande extrem ausgeprägt, in die Nachbar-Banden ausfließend * * -λ