DD295717B5 - Enzymimmunoassay und Testbesteck zum Nachweis humaner Neuronen-spezifischer Enolase - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf einen Enzymimmunoassay und ein Testbesteck zum Nachweis niedriger Konzentrationen humaner Neuronen-spezifischer Enolase (NSE) in Patientenproben (Plasma, Serum, Liquor, Fruchtwasser). Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Neuronen-spezifische Enolase, die γ-Untereinheiten enthaltenden Dimeren des Glykolyseenzyms Enolase, ist in hohen Konzentrationen in neuronalen und neuroendokrinen Zellen des zentralen und peripheren Nervensystems lokalisiert (Marangos, P. J., Schmechel, D. E., Parma, A. M., Clark, R. L., Goodwin, F. K.: J. Neurochem. 33 [1979] 319-329). NSE wird darüber hinaus in großen Mengen von den Tumoren der APUD-Zellen (APUDomas) produziert, zu denen Neuroblastome zählen (lshiguro, Y., Kato, K.,Shimizu,A., lto,T.,Nagaya,M.: Clin.Chim.Acta 121 [1982] 173-180), sowie durch das kleinzellige Bronchialkarzinom (Carney, D.M., Marangos, P.J., lhde D.C, Bunn, P.A., Cohen, M.H., Minna J.D., Gazdar A.F.: Lancet 1982,1 583-585). NSE bietet sich als Markerprotein für pathologische Prozesse des ZNS und als Tumormarker an (Marangos, P. J., Schmechel D.E.: Ann. Rev. Neurosci. 10 [1987] 269-295). Die Bestimmung der NSE wird in zunehmenden Maße für die Diagnose, das Monitoring des klinischen Verlaufes sowie der Therapie speziell der Tumore angewendet. Das Einsatzgebiet der NSE zum Nachweis von Schädigungen des ZNS durch Hypoxie oder Ischämie muß noch weiter abgeklärt werden. Einem empfindlichen Parameter zur Anzeige der Schädigung neuronaler Zellen vor allem im Neugeborenenalterwird verstärkt Aufmerksamkeit gewidmet. Die Validität der NSE für diese Fragestellung muß überprüft werden.

Der Nachweis der NSE in verschiedenem Probenmaterial wie Plasma, Serum, Liquor oder Fruchtwasser erfolgte mit Enzymimmunoassays (EIA) unter Verwendung polyklonaler bzw. monoklonaler bzw. monoklonaler Antikörper (Kato, K„ Suzuki, F., Semba, R.: J. Neurochem. 37 [1981] 998-1005. Scarna, H.Delafoss, B., Steinberg, R., Debilly, G., Madbrand, B., Keller A., Pujol, J. F.: Neurochem. Int. 4 [1982] 405-411. Kimura, S., Hayano, T., Kato, K.: Biochim Biophys Acta 799 [1984] 252-259). Zur Anwendung kamen weiterhin Radioimmunassays (RIA), die ebenfalls sowohl polyklonale wie auch monoklonale Antikörper verwendeten (Parma, A. M., Marangos, P. J., Goodwin, F. K.: J. Neurochem. 36 [1981 ] 1093-1096. Royds, J. A., Davies-Jones G. B., Lewtas, N.A.,Timberley, W. R., Taylor C.B.: J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 46 [1983] 1031-1036. Pahlman, S., Esscher, Т., Bergvall, P., Odelstad, L: Tumor Biol. 5 [1984] 127-139. Soler Federspiel, B.S., Cras, P., Gheuens, J., Andries, D., Lowenthal, A.: J. Neurochem. 48 [1987] 22-28).

Beide Testsysteme, EIA und RIA, werden auch als kommerzielle Testkits vertrieben. Die Testsysteme unterscheiden sich durch den Einsatz unterschiedlicher Festphasen, die verwendeten Nachweissysteme des Enzymkonjugats sowie die unteren Nachweisgrenzen. Eine Testkombination unter Einsatz von polyklonalen bzw. monoklonalen anti-humanen Antikörpern gegen NSE als Zweiseiten-Bindungstest unter Verwendung von M ikrotestplatten mit einer vergleichbaren analytischen Empfindlichkeit um 2цд/І wird kommerziell noch nicht angeboten. Durch die Erkennung unterschiedlicher Epitope dery-Untereinheit der NSE durch jeden monoklonalen Antikörper ist der spezifische Einsatz zur Bestimmung der Enolase im Plasma bzw. Serum, die verschiedenen zellulären Ursprungs sein kann, zu überprüfen.

In der Patentschrift DD 293 368 ist ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen das Glykolyseenzym Neuronenspezifische Enolase beschrieben worden. Die Fusion der Milzzellen von Balb/c-Mäusen nach Immunisierung mit Ferritin-gekoppelter NSE - mit Maus-Myelomzellen führt zu dem Hybridom H-FDM N-1D23, aus dem die entsprechenden mAk gewonnen werden.

Ziel der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, der medizinischen Diagnostik einen Enzymimmunoassay und ein Testbesteck zum Nachweis geringer Konzentrationen von NSE zur Verfügung zu stellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Enzymimmunoassay und ein Testbesteck zum Nachweis geringer Konzentrationen von NSE zu entwickeln. Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe durch den Einsatz des monoklonalen Antikörper FMD-N-1D23 als Antikörper an der Festphase bzw. als Konjugat in Verbindung mit einem polyklonalen Antikörper gelöst. Der erfindungsgemäß verwendete monoklonale Antikörper, der humane NSE erkennt, wird aus der Hybridomzellinie H-FMD-N-1D23 gewonnen, die in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Molekularbiologie (ZIM) der Akademie der Wissenschaften der DDR, Berlin-Buch, unter der Nr. ZIM 0514 hinterlegt worden ist. Überraschenderweise zeigte sich, daß eine deutlich selektive Reaktivität des FMD-N-1 D23 immunhistologisch nachweisbar ist, wobei eine Reaktion nur mit Hirngewebe nachweisbar und Nervenzellen im Gegensatz zu Nervenfasern gut darstellbar sind.

Der monoklonale Antikörper FMD-N-1 D23 kann nur entweder als Festphase- oder als Konjugat-Antikörper genutzt werden, so daß ein polyklonaler Antikörper entsprechend im Zweiseiten-Bindungsassay zur Verfügung stehen muß.

Das Konjugat wird in Enzym-markierter Form, insbesondere Peroxidase(POD)-markiert, eingesetzt.

Der genutzte monoklonale anti-humane NSE-Antikörper reagiert mit NSE mit einer Dissoziationskonstanten von 5,1 ± 1,8 x 10"¹⁰mol/l.

Das erfindungsgemäße Testbesteck zur Durchführung von Enzymimmunoassays besteht aus den mit anti-humanen Antikörpern (monoklonal FMD-N-1 D23 bzw. polyklonal) beschichteten festen Phasen, wie Mikrotiterplatten oder Röhrchen, POD-markiertem Konjugat (polyklonal bzw. monoklonal FMD-N-1 D23), einem Substratgemisch zum Nachweis der Peroxidase, einem Stoppreagens zur Beendigung der Farbreaktion und Inkubationspuffern für Antigen und Konjugat.

Die untere Nachweisgrenze für NSE liegt unter Anwendung des erfindungsgemäßen Enzymimmunoassays bei 0,25 цд/І.

Ausführungsbeispiel

1.1 Herstellung und Präparation des monoklonalen Antikörpers

Die Herstellung des monoklonalen Antikörpers erfolgte nach Immunisierung von Mäusen nach der von Köhler und Milstein (Köhler, G., Milstein, C: Nature 256 [1975] 495-497) beschriebenen Methode. Die Hybridomzellen wurden auf eine Konzentration von 1 χ 10⁶/ml gebracht und in Pristan-vorbehandelte Mäuse intraperitoneal nach bekanntem Verfahren appliziert. Nach ca.

14 Tagen läßt sich durch Punktion Aszitesflüssigkeit gewinnen.

Durch FPLC-Reinigung läßt sich nach Anionenaustausch-Chromatographie aus 1 ml Ascitesflüssigkeit 5,7 mg IgG-Antikörper isolieren.

1.2 Konjugat

Die Markierung des monoklonalen bzw. polyklonalen Konjugats mit Peroxidase (POD) erfolgte nach der von Ishikawa et al. (T. T. Ngo [Eds.] Nonisitopic Immunoassay, Plenum Press, New York and London, 1988, 27) beschriebenen Methode im molaren Verhältnis 1:1 (IgGiPOD).

1.3 NSE-Antigen

Die Präparation des Antigens humane NSE erfolgte durch Anionenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie an einem FPLC-System.

1.4 Enzymimmunoassay

Polystyren-Mikrotestplatten wurden mit 5 mg/l Antikörper in 0,1 mol/l Karbonatpuffer pH 9,5 beschichtet. Die Inkubation erfolgte 2h bei Raumtemperatur und anschließend 14—16h bei 4°C. Nach dem Waschen mit Phosphat-gepufferter Kochsalz-Lösung (PBS), 0,05%Tween 20pH7,4 können die behandelten Platten sofort oder nach Lagerung bei -20⁰C (über mehrere Monate) eingesetzt werden. Als Verdünnungspuffer für Antigenproben, Standard und Konjugat dient PBS mit Zusatz von 5% fetalem Kälberserum. Die Reaktionszeit zur Antigenbindung beträgt 16h bei 4⁰C. Nach fünfmaligem Waschen wird 120min mit POD-markiertem Konjugat inkubiert. Als Substrat für die Farbreaktion wird ABTS ((2,2-Azino-bis(3-äthyl-benzthiazolin-6-sulfonsäure), Ammoniumsalz) in Natrium-Azetat-Puffer pH4,2 eingesetzt. Der Abbruch der Farbreaktion erfolgt durch Zugabe von Natriumazid (0,1 mM). Die Extinktionsmessung wird bichromatisch bei 414 und 492nm durchgeführt. Als untere Nachweisgrenze gilt die Konzentration, die sich vom 3 S-Vertrauensbereich der Leerwertkontrolle unterscheiden läßt.

Claims (2)

1. Patentansprüche:

   1. Enzymimmunoassay zum Nachweis humaner Neuronen-spezifischer Enolase (NSE) mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers FMD-N-1D23, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonal Antikörper (mAk) in Verbindung mit einem polyklonalen Antikörper eingesetzt wird.
2. 2. Testbesteck zum Nachweis humaner NSE auf der Grundlage fester Phasen, wie Mikrotiterplatten oder Röhrchen, die mit dem mAk FMD-N-1D23 beschichtet sind, wobei das Testbesteck ein Substratgemisch zum Nachweis von Peroxidase, ein Stoppreagens für eine Peroxidase(POD)-Reaktion sowie Inkubationspuffer für Antigen und konjugat enthält, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner aus festen Phasen, die - neben dem mAk - mit polyklonalen Antikörpern beschichtet sind und aus einem Konjugat monoklonaler in Verbindung mit polyklonalen POD-markierten Antikörpern, besteht.