DD295717B5

DD295717B5 - Enzyme immunoassay and test kit for the detection of human neuron-specific enolase

Info

Publication number: DD295717B5
Application number: DD34400090A
Authority: DD
Inventors: Johann Prof Dr Sc Med Gross; Joerg Dr Med Zinsmeyer; Brigitte Dr Rer Nat Brux
Original assignee: Johann Prof Dr Sc Med Gross; Joerg Dr Med Zinsmeyer; Brigitte Dr Rer Nat Brux
Priority date: 1990-09-13
Filing date: 1990-09-13
Publication date: 1997-02-20

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung bezieht sich auf einen Enzymimmunoassay und ein Testbesteck zum Nachweis niedriger Konzentrationen humaner Neuronen-spezifischer Enolase (NSE) in Patientenproben (Plasma, Serum, Liquor, Fruchtwasser). Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.The invention relates to an enzyme immunoassay and a test kit for detecting low concentrations of human neuron-specific enolase (NSE) in patient samples (plasma, serum, cerebrospinal fluid, amniotic fluid). The field of application of the invention is medical diagnostics.

Characteristic of the known technical solutions

Neuronen-spezifische Enolase, die γ-Untereinheiten enthaltenden Dimeren des Glykolyseenzyms Enolase, ist in hohen Konzentrationen in neuronalen und neuroendokrinen Zellen des zentralen und peripheren Nervensystems lokalisiert (Marangos, P. J., Schmechel, D. E., Parma, A. M., Clark, R. L., Goodwin, F. K.: J. Neurochem. 33 [1979] 319-329). NSE wird darüber hinaus in großen Mengen von den Tumoren der APUD-Zellen (APUDomas) produziert, zu denen Neuroblastome zählen (lshiguro, Y., Kato, K.,Shimizu,A., lto,T.,Nagaya,M.: Clin.Chim.Acta 121 [1982] 173-180), sowie durch das kleinzellige Bronchialkarzinom (Carney, D.M., Marangos, P.J., lhde D.C, Bunn, P.A., Cohen, M.H., Minna J.D., Gazdar A.F.: Lancet 1982,1 583-585). NSE bietet sich als Markerprotein für pathologische Prozesse des ZNS und als Tumormarker an (Marangos, P. J., Schmechel D.E.: Ann. Rev. Neurosci. 10 [1987] 269-295). Die Bestimmung der NSE wird in zunehmenden Maße für die Diagnose, das Monitoring des klinischen Verlaufes sowie der Therapie speziell der Tumore angewendet. Das Einsatzgebiet der NSE zum Nachweis von Schädigungen des ZNS durch Hypoxie oder Ischämie muß noch weiter abgeklärt werden. Einem empfindlichen Parameter zur Anzeige der Schädigung neuronaler Zellen vor allem im Neugeborenenalterwird verstärkt Aufmerksamkeit gewidmet. Die Validität der NSE für diese Fragestellung muß überprüft werden.Neuron-specific enolase, the γ-subunit-containing dimers of the glycolysis enzyme enolase, is localized at high levels in neuronal and neuroendocrine cells of the central and peripheral nervous systems (Marangos, PJ, Schmechel, DE, Parma, AM, Clark, RL, Goodwin, FK : J. Neurochem., 33 [1979] 319-329). NSE is also produced in large quantities by the tumors of the APUD cells (APUDomas), which include neuroblastomas (Ishiguro, Y., Kato, K., Shimizu, A., Ito, T., Nagaya, M .: Clin Chim. Acta 121 [1982] 173-180) as well as by the small cell bronchial carcinoma (Carney, DM, Marangos, PJ, DC, Bunn, PA, Cohen, MH, Minna JD, Gazdar AF: Lancet 1982, 583- 585). NSE is useful as a marker protein for CNS pathological processes and as a tumor marker (Marangos, P.J., Schmechel D.E .: Ann. Rev. Neurosci. 10 [1987] 269-295). The determination of NSE is increasingly being used for the diagnosis, the monitoring of the clinical course and the therapy of the tumors in particular. The field of application of NSE for the detection of damage to the CNS by hypoxia or ischaemia must be further clarified. A sensitive parameter for indicating neuronal cell damage, especially in neonatal age, is receiving increased attention. The validity of the NSE for this question needs to be checked.

Der Nachweis der NSE in verschiedenem Probenmaterial wie Plasma, Serum, Liquor oder Fruchtwasser erfolgte mit Enzymimmunoassays (EIA) unter Verwendung polyklonaler bzw. monoklonaler bzw. monoklonaler Antikörper (Kato, K„ Suzuki, F., Semba, R.: J. Neurochem. 37 [1981] 998-1005. Scarna, H.Delafoss, B., Steinberg, R., Debilly, G., Madbrand, B., Keller A., Pujol, J. F.: Neurochem. Int. 4 [1982] 405-411. Kimura, S., Hayano, T., Kato, K.: Biochim Biophys Acta 799 [1984] 252-259). Zur Anwendung kamen weiterhin Radioimmunassays (RIA), die ebenfalls sowohl polyklonale wie auch monoklonale Antikörper verwendeten (Parma, A. M., Marangos, P. J., Goodwin, F. K.: J. Neurochem. 36 [1981 ] 1093-1096. Royds, J. A., Davies-Jones G. B., Lewtas, N.A.,Timberley, W. R., Taylor C.B.: J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 46 [1983] 1031-1036. Pahlman, S., Esscher, Т., Bergvall, P., Odelstad, L: Tumor Biol. 5 [1984] 127-139. Soler Federspiel, B.S., Cras, P., Gheuens, J., Andries, D., Lowenthal, A.: J. Neurochem. 48 [1987] 22-28).Detection of NSE in various sample material such as plasma, serum, cerebrospinal fluid or amniotic fluid was carried out by enzyme immunoassays (EIA) using polyclonal or monoclonal antibodies (Kato, K. Suzuki, F., Semba, R .: J. Neurochem. 37 [1981] 998-1005, Scarna, H. Delafoss, B., Steinberg, R., Debilly, G., Madbrand, B., Keller A., Pujol, JF: Neurochem., Int. 4 [1982] 405- 411. Kimura, S., Hayano, T., Kato, K .: Biochim Biophys Acta 799 [1984] 252-259). Radioimmunoassays (RIA), which also used both polyclonal and monoclonal antibodies, were also used (Parma, AM, Marangos, PJ, Goodwin, FK: J. Neurochem., 36: 1093-1096, 1981. Royds, JA, Davies-Jones GB, Lewtas, NA, Timberley, WR, Taylor CB: J. Neurol Neurosurgical Psychiatry 46 [1983] 1031-1036, Pahlman, S., Esscher, T., Bergvall, P., Odelstad, L: Tumor Biol. 5 [1984] 127-139 Soler Federspiel, BS, Cras, P., Gheuens, J., Andries, D., Lowenthal, A .: J. Neurochem. 48 [1987] 22-28).

Beide Testsysteme, EIA und RIA, werden auch als kommerzielle Testkits vertrieben. Die Testsysteme unterscheiden sich durch den Einsatz unterschiedlicher Festphasen, die verwendeten Nachweissysteme des Enzymkonjugats sowie die unteren Nachweisgrenzen. Eine Testkombination unter Einsatz von polyklonalen bzw. monoklonalen anti-humanen Antikörpern gegen NSE als Zweiseiten-Bindungstest unter Verwendung von M ikrotestplatten mit einer vergleichbaren analytischen Empfindlichkeit um 2цд/І wird kommerziell noch nicht angeboten. Durch die Erkennung unterschiedlicher Epitope dery-Untereinheit der NSE durch jeden monoklonalen Antikörper ist der spezifische Einsatz zur Bestimmung der Enolase im Plasma bzw. Serum, die verschiedenen zellulären Ursprungs sein kann, zu überprüfen.Both test systems, EIA and RIA, are also sold as commercial test kits. The test systems differ by the use of different solid phases, the used detection systems of the enzyme conjugate and the lower detection limits. A test combination using polyclonal or monoclonal anti-human antibodies against NSE as a two-side binding test using microtest plates with a comparable analytical sensitivity of 2 kd / І is not yet commercially available. By detecting different epitopes of the NSE subunit of each monoclonal antibody, the specific use for the determination of the enolase in the plasma or serum, which may be of different cellular origin, must be checked.

In der Patentschrift DD 293 368 ist ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen das Glykolyseenzym Neuronenspezifische Enolase beschrieben worden. Die Fusion der Milzzellen von Balb/c-Mäusen nach Immunisierung mit Ferritin-gekoppelter NSE - mit Maus-Myelomzellen führt zu dem Hybridom H-FDM N-1D23, aus dem die entsprechenden mAk gewonnen werden.In the patent DD 293 368 a method for the production of monoclonal antibodies against the glycolysis enzyme Neuron Specific Enolase has been described. Fusion of Balb / c mouse spleen cells after immunization with ferritin-coupled NSE - with mouse myeloma cells results in the hybridoma H-FDM N-1D23, from which the corresponding mAbs are recovered.

Object of the invention

Es ist das Ziel der Erfindung, der medizinischen Diagnostik einen Enzymimmunoassay und ein Testbesteck zum Nachweis geringer Konzentrationen von NSE zur Verfügung zu stellen.It is the object of the invention to provide medical diagnostics with an enzyme immunoassay and a test kit for the detection of low concentrations of NSE.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Enzymimmunoassay und ein Testbesteck zum Nachweis geringer Konzentrationen von NSE zu entwickeln. Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe durch den Einsatz des monoklonalen Antikörper FMD-N-1D23 als Antikörper an der Festphase bzw. als Konjugat in Verbindung mit einem polyklonalen Antikörper gelöst. Der erfindungsgemäß verwendete monoklonale Antikörper, der humane NSE erkennt, wird aus der Hybridomzellinie H-FMD-N-1D23 gewonnen, die in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Molekularbiologie (ZIM) der Akademie der Wissenschaften der DDR, Berlin-Buch, unter der Nr. ZIM 0514 hinterlegt worden ist. Überraschenderweise zeigte sich, daß eine deutlich selektive Reaktivität des FMD-N-1 D23 immunhistologisch nachweisbar ist, wobei eine Reaktion nur mit Hirngewebe nachweisbar und Nervenzellen im Gegensatz zu Nervenfasern gut darstellbar sind.The invention has for its object to develop an enzyme immunoassay and a test kit for the detection of low concentrations of NSE. According to the invention, the object was achieved by using the monoclonal antibody FMD-N-1D23 as an antibody on the solid phase or as a conjugate in conjunction with a polyclonal antibody. The monoclonal antibody according to the invention, which recognizes human NSE, is obtained from the hybridoma cell line H-FMD-N-1D23, in the depository of the Central Institute of Molecular Biology (ZIM) of the Academy of Sciences of the GDR, Berlin-Buch, under the No. ZIM 0514 has been deposited. Surprisingly, it was found that a clearly selective reactivity of the FMD-N-1 D23 is immunohistologically detectable, with a reaction detectable only with brain tissue and nerve cells in contrast to nerve fibers are well represented.

Der monoklonale Antikörper FMD-N-1 D23 kann nur entweder als Festphase- oder als Konjugat-Antikörper genutzt werden, so daß ein polyklonaler Antikörper entsprechend im Zweiseiten-Bindungsassay zur Verfügung stehen muß.The monoclonal antibody FMD-N-1 D23 can only be used as either a solid-phase or a conjugate antibody, so that a polyclonal antibody must be available according to the two-site binding assay.

Das Konjugat wird in Enzym-markierter Form, insbesondere Peroxidase(POD)-markiert, eingesetzt.The conjugate is used in enzyme-labeled form, in particular peroxidase (POD) -labeled.

Der genutzte monoklonale anti-humane NSE-Antikörper reagiert mit NSE mit einer Dissoziationskonstanten von 5,1 ± 1,8 x 10"¹⁰mol/l.The monoclonal anti-human NSE antibody used reacts with NSE with a dissociation constant of 5.1 ± 1.8 x ¹⁰ -10 mol / l.

Das erfindungsgemäße Testbesteck zur Durchführung von Enzymimmunoassays besteht aus den mit anti-humanen Antikörpern (monoklonal FMD-N-1 D23 bzw. polyklonal) beschichteten festen Phasen, wie Mikrotiterplatten oder Röhrchen, POD-markiertem Konjugat (polyklonal bzw. monoklonal FMD-N-1 D23), einem Substratgemisch zum Nachweis der Peroxidase, einem Stoppreagens zur Beendigung der Farbreaktion und Inkubationspuffern für Antigen und Konjugat.The test kit according to the invention for carrying out enzyme immunoassays consists of the solid phases coated with anti-human antibodies (monoclonal FMD-N-1 D23 or polyclonal), such as microtiter plates or tubes, POD-labeled conjugate (polyclonal or monoclonal FMD-N-1 D23), a substrate mixture for detecting peroxidase, a stop reagent for terminating the color reaction, and incubation buffers for antigen and conjugate.

Die untere Nachweisgrenze für NSE liegt unter Anwendung des erfindungsgemäßen Enzymimmunoassays bei 0,25 цд/І.The lower detection limit for NSE is 0.25 цd / unter using the enzyme immunoassay according to the invention.

embodiment

1.1 Herstellung und Präparation des monoklonalen Antikörpers1.1 Preparation and Preparation of the Monoclonal Antibody

Die Herstellung des monoklonalen Antikörpers erfolgte nach Immunisierung von Mäusen nach der von Köhler und Milstein (Köhler, G., Milstein, C: Nature 256 [1975] 495-497) beschriebenen Methode. Die Hybridomzellen wurden auf eine Konzentration von 1 χ 10⁶/ml gebracht und in Pristan-vorbehandelte Mäuse intraperitoneal nach bekanntem Verfahren appliziert. Nach ca.The production of the monoclonal antibody was carried out after immunization of mice according to the method described by Köhler and Milstein (Köhler, G., Milstein, C: Nature 256 [1975] 495-497). The hybridoma cells were brought to a concentration of 1 × 10 ⁶ / ml and administered in pristane-pretreated mice intraperitoneally by a known method. After approx.

14 Tagen läßt sich durch Punktion Aszitesflüssigkeit gewinnen.14 days can be obtained by puncture ascitic fluid.

Durch FPLC-Reinigung läßt sich nach Anionenaustausch-Chromatographie aus 1 ml Ascitesflüssigkeit 5,7 mg IgG-Antikörper isolieren.By FPLC purification, 5.7 mg of IgG antibody can be isolated from 1 ml of ascites fluid after anion exchange chromatography.

1.2 Konjugat1.2 Conjugate

Die Markierung des monoklonalen bzw. polyklonalen Konjugats mit Peroxidase (POD) erfolgte nach der von Ishikawa et al. (T. T. Ngo [Eds.] Nonisitopic Immunoassay, Plenum Press, New York and London, 1988, 27) beschriebenen Methode im molaren Verhältnis 1:1 (IgGiPOD).The labeling of the monoclonal or polyclonal conjugate with peroxidase (POD) was carried out according to the method described by Ishikawa et al. (T.T. Ngo [Eds.] Nonisitopic Immunoassay, Plenum Press, New York and London, 1988, 27) in a molar ratio of 1: 1 (IgGiPOD).

1.3 NSE-Antigen1.3 NSE antigen

Die Präparation des Antigens humane NSE erfolgte durch Anionenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie an einem FPLC-System.The preparation of the human NSE antigen was performed by anion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography on an FPLC system.

1.4 Enzymimmunoassay1.4 Enzyme immunoassay

Polystyren-Mikrotestplatten wurden mit 5 mg/l Antikörper in 0,1 mol/l Karbonatpuffer pH 9,5 beschichtet. Die Inkubation erfolgte 2h bei Raumtemperatur und anschließend 14—16h bei 4°C. Nach dem Waschen mit Phosphat-gepufferter Kochsalz-Lösung (PBS), 0,05%Tween 20pH7,4 können die behandelten Platten sofort oder nach Lagerung bei -20⁰C (über mehrere Monate) eingesetzt werden. Als Verdünnungspuffer für Antigenproben, Standard und Konjugat dient PBS mit Zusatz von 5% fetalem Kälberserum. Die Reaktionszeit zur Antigenbindung beträgt 16h bei 4⁰C. Nach fünfmaligem Waschen wird 120min mit POD-markiertem Konjugat inkubiert. Als Substrat für die Farbreaktion wird ABTS ((2,2-Azino-bis(3-äthyl-benzthiazolin-6-sulfonsäure), Ammoniumsalz) in Natrium-Azetat-Puffer pH4,2 eingesetzt. Der Abbruch der Farbreaktion erfolgt durch Zugabe von Natriumazid (0,1 mM). Die Extinktionsmessung wird bichromatisch bei 414 und 492nm durchgeführt. Als untere Nachweisgrenze gilt die Konzentration, die sich vom 3 S-Vertrauensbereich der Leerwertkontrolle unterscheiden läßt.Polystyrene microtest plates were coated with 5 mg / l antibody in 0.1 mol / l carbonate buffer pH 9.5. The incubation took place at room temperature for 2 h and then at 4 ° C. for 14-16 h. After washing with phosphate-buffered saline (PBS), 0.05% Tween 20pH7,4 the treated plates may be employed (over several months) immediately or after storage at -20 ⁰ C. The dilution buffer for antigen samples, standard and conjugate is PBS supplemented with 5% fetal calf serum. The reaction time for antigen binding is 16 hours at 4 ⁰ C. After washing five times is incubated for 120 minutes with HRP-labeled conjugate. The substrate used for the color reaction is ABTS ((2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ammonium salt) in sodium acetate buffer pH 4.2, and the color reaction is stopped by the addition of sodium azide (0.1 mM) The absorbance measurement is carried out bichromatically at 414 and 492 nm The lower detection limit is the concentration that can be distinguished from the 3 S confidence range of the blank control.

Claims

claims:

1. Enzyme immunoassay for the detection of human neuron-specific enolase (NSE) using a monoclonal antibody FMD-N-1D23, characterized in that the monoclonal antibody (mAb) is used in conjunction with a polyclonal antibody.

2. Test kit for detection of human NSE based on solid phases, such as microtiter plates or tubes coated with the mAb FMD-N-1D23, which test kit is a substrate mixture for the detection of peroxidase, a stopper for a peroxidase (POD) reaction and incubation buffer for antigen and conjugate, characterized in that it further consists of solid phases which, besides the mAb, are coated with polyclonal antibodies and consist of a conjugate of monoclonal antibodies in combination with polyclonal POD-labeled antibodies.