WO1999034670A1 - Animaux presentant une mutation genique - Google Patents

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WO1999034670A1
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presenilin
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Masatoshi Takeda
Junji Takeda
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Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a transgenic animal. More specifically, the present invention relates to a presenilin gene-transferred animal into which a mutation of the presenilin gene that causes human Marzheimer's disease is introduced. Background art
  • Alzheimer's disease is a disease with progressive dementia, characterized by the histopathological characteristics of the appearance of a remarkably large number of senile plaques in the brain and the accumulation of neurofibrillary tangles in nerve cells. It is a neurodegenerative disease that is lost. Alzheimer's disease often affects older people, and it is known that the proportion of affected individuals increases with age. At present, it is impossible to cure Alzheimer's disease, and there is an urgent need for methods for treatment and prevention of Alzheimer's disease in preparation for the rapid increase in the elderly population in the future, and for effective prevention and treatment of Alzheimer's disease. Development is eagerly awaited.
  • a ⁇ 42 exists. Most of the amyloid / 3 ⁇ 4 produced by the cells is A
  • Alzheimer's disease has a familial onset with autosomal dominant inheritance.
  • the first gene identified as the causative gene for this familial Alzheimer's disease was a mutant of ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , in which the amino acid residue at position 7117 in 1991 was mutated from valine to isoloisin, This gene is present on chromosome 21 (Goate A. et al .: Nature 349, 704, 1991).
  • APP mutants that cause Alzheimer's disease include those in which the amino acid residue at position 717 has been converted to fenilalanine (Murrel J. et al .: Science 254, 97, 1991). ), In which the amino acid residue at the same position is mutated to glycine (Chartier, Harlin, etc .: Nature 353, 844, 1991), and the two amino acid residues at the 670th and 671st positions In which the group is mutated from lysine-methionine to asparagine-mouth isine (Mullan M. et al .: Nature Genet. 1, Vol. 345, 1992), the amino acid residue at position 692 was mutated from alanine to dalysine (Hendrisk L. et al .: Nature Genet. Vol. 1, p. 218, 1992).
  • Apolipoprotein E was reported in 1993 as a causative or risk factor for familial Alzheimer's disease. That is, among the isomers of apo E in which the gene is present on chromosome 19, apo E4 in which the 112th amino acid residue is arginine and the 158th amino acid residue is arginine It was found that the proportion of carriers possessing Alzheimer's disease was significantly higher than that of healthy subjects (Corder EH. Et al .: Science 261: 921, 1993).
  • Presenilin-11 protein and presenilin-2 protein have seven (or eight) transmembrane primary structures consisting of 467 amino acid residues and 448 amino acid residues, respectively, and exist as membrane proteins. It is speculated that they are. The homology at both amino acid levels is high, 67% in total, and 84% only in the transmembrane region.
  • the function of the presenilin-11 protein it has been pointed out that the functions of these proteins may be similar to those of the nematode sel-12 and SPE-4 proteins due to their high homology.
  • SPE-4 protein is involved in the process of spermatogenesis in nematodes, and has been implicated in the transport and storage of proteins.
  • the first report states that the mutation that causes familial Alzheimer's disease is a substitution of five amino acid residues.:, Reported OS-2 (the amino acid residue at the 2nd and 13th residues isoleucine was mutated to threonine) and OS-3 (the ninth and 6th amino acid residue was mutated to the phenylalanine) (Kamino K. Et al .: Neurosci. Lett. Vol. 208, p. 195, 1996), and many other familial Alzheimer's disease mutants have been found at various locations. 40 types The above substitution of amino acid residues is known (Hardy: TINS, Vol. 20, p. 154, 1997).
  • transgenic animals are useful as a means for analyzing the function of a target gene in a living body.
  • it is technically difficult to control the expression of the introduced gene quantitatively, expressionally, and developmentally.
  • Another problem is that since the gene of the animal itself is normally expressed, both gene products are mixed in the transgenic animal, and the function of the introduced gene cannot be fully analyzed.
  • the introduced gene is overexpressed, the function may not be fulfilled in vivo and may appear in the transgenic animal.
  • drawbacks such as the potential for damage.
  • knockout animals can be used as a means to analyze the function of the gene of interest.
  • Knockout animals are those in which the gene of interest in the animal itself has been artificially destroyed to render it nonfunctional. Detailed analysis of knockout animals can reveal the function of the gene of interest in vivo.
  • the function of the product of the disrupted gene is replaced by another gene product in the knockout animal, even when homogenized, no particular change may appear in the knockout animal itself.
  • the disrupted gene product is essential for the development and growth of animals, homozygous lethality may occur, and detailed analysis of gene function may not be practically possible with a heterozygous grower. There is also a problem. Disclosure of the invention
  • mutant presenilin protein can be expressed in the brain by introducing a gene (mutated presenilin gene) obtained by adding a mutation to the preseurin gene, which is thought to be the causative gene of Alzheimer's disease, by homologous recombination. It is an object of the present invention to provide a genetically modified animal.
  • Another object of the present invention is to evaluate a method for producing the above-described gene-mutated animal, a plasmid useful for the method, and a substance useful for prevention and / or treatment of Alzheimer's disease using the gene-mutated animal. It is to provide a way to do it.
  • amino acid sequence of the presenilin-11 protein preferably in the amino acid sequence of the mouse-derived presenilin-11 protein, the following numbers:
  • the DNA sequence encoding the vicinity of amino acid number 2 in the amino acid sequence of presenilin-1 protein is as follows:
  • N means a base other than T
  • M means T or C
  • the underlined base is the base encoding the amino acid number 21.
  • the DNA sequence encoding the vicinity of amino acid number 21 in the amino acid sequence of presenilin-1 protein is as follows:
  • the DNA sequence encoding the vicinity of amino acid number 21 in the amino acid sequence of presenilin-1 protein is as follows:
  • XYZ means a 3-base codon encoding an amino acid other than isoloicin
  • M means T or C
  • the underlined base encodes the amino acid at position 21-3.
  • the amino acid sequence of the presenilin 2 protein a protein in which the amino acid at position 141 and the amino acid at position Z or the amino acid at position 4336 is replaced with another amino acid is encoded.
  • a gene mutant animal other than a human having a mutant presenilin 2 gene containing a DNA sequence is provided.
  • the amino acid sequence of the presenilin 2 protein contains N141I and / or M Mutant plasmid with 2 39 V mutation
  • a non-human gene mutant animal having a mutant presenilin-2 gene containing a DNA sequence encoding a senirin-2 protein is provided.
  • the above-mentioned gene mutant animals in which overexpression of the amyloid 3 protein is caused by the mutant preseurin-1 gene and Z or the mutant presenilin 12 gene;
  • the above-mentioned gene mutation wherein the expression of the protein causes production of amyloid i3 protein in an amount sufficient to form a progressive neurological disease in the peripheral cerebral cortex of the mammalian brain.
  • Mutated presenilin-1 gene and / or mutated presenilin-12 gene introduced by homologous recombination; mutated presenilin-1
  • the expression level of amy'loid protein in brain tissue caused by one gene is impaired in memory learning tests compared to normal animals.
  • a gene other than human having a DNA comprising a mutant presenilin-1 gene encoding a mutant presenilin-11 protein in which one or more amino acids in the sequence have been substituted with another amino acid, and a nucleotide sequence encoding a marker protein Mutant animals are provided.
  • the DNA sequence encoding the vicinity of the amino acid at position 23 in the amino acid sequence of the preseurin-1 protein has the following sequence: 5′-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3 ′ (where N Refers to A, G, or C, M refers to T or C, and the underlined base is a base encoding the amino acid number 21.)
  • Chromosome containing exon 8 of the mutant presenilin-11 gene encoding the mutant presenilin-1 protein in which amino acid number 2-13 in the amino acid sequence of the presenilin-11 protein is substituted with an amino acid other than isoleucine DNA is also provided.
  • the full length or mutated portion of the cDNA or chromosomal DNA of the mutant presenilin-1 gene encoding the mutant presenilin-1 protein in which amino acid number 211 in the amino acid sequence of the preseurin-11 protein is substituted with an amino acid other than isoleucine A plasmid containing DNA having a Sau3AI site introduced into the nucleotide sequence thereof, wherein the amino acid substitution is a substitution of isoleucine at position 21 to threonine; the following nucleotide sequence: A plasmid containing DNA specified by 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3 '(where M means T or C) is provided.
  • the gene is provided which is a replacement.
  • a method for evaluating a substance useful for treating and / or preventing Alzheimer's disease comprising a step of comparing the above-described gene-mutated animal to which a test compound has been administered and the animal to which the test compound has not been administered.
  • a typical example of this evaluation method is a screening method.
  • Comparison of pathological tests based on neuropathology indicates suppression of hypertrophic dariosis reduction around the cerebral cortex of the brain and reduction of 2-dexoxyglucose uptake around the cerebral cortex of the brain
  • the above-described evaluation method which is a comparison of one or more items selected from the group consisting of inhibition of cerebral cortex and inhibition of 2-dexoxyglucose utilization in the cerebral cortex of the brain; and survival of the animal.
  • the above evaluation method for comparing one or more items selected from the group consisting of a period, a search action, and a movement action is provided.
  • a method for evaluating a therapeutic and / or Z- or prophylactic agent for Alzheimer's disease comprising a step of culturing the above-mentioned primary culture cells or subculture cells in an in-vitro cell in the presence of a test compound; OS-2 type presenilin A method for diagnosing the possibility of developing Alzheimer's disease or Alzheimer's disease, comprising using a partial base sequence of the mutant presenilin-1 gene encoding 1 protein; treatment of Alzheimer's disease selected by each of the above-mentioned evaluation methods And / or a substance useful for prevention; and a therapeutic and / or prophylactic agent for Alzheimer's disease containing the substance as an active ingredient.
  • a hybrid animal produced by crossing the above-described genetically modified animal with an animal having a gene encoding a mutant protein of amyloid precursor protein (APP) and producing a large amount of amyloid i3 protein, and progeny thereof.
  • a hybrid mouse or a progeny thereof produced by or obtained by crossing comprising a mutant presenilin gene and a gene encoding a mutant protein of amyloid precursor protein. Genetically altered animals are provided.
  • the above-described gene-mutated animal wherein the animal having a gene encoding the mutant protein of APP and producing a large amount of amyloid is a PS1 mutant mouse.
  • FIG. 1 is a restriction map of a chromosomal DNA fragment P containing exon 8 of mouse presenilin-11 obtained by cloning from a mouse 'dienomic DNA library.
  • Figure 2 shows the steps of a method for preparing a plasmid pmX-1 having a part of exon 8 of the mouse presenilin-11 gene containing the site where the OS-2 type mutation was introduced by site-directed mutagenesis.
  • FIG. 6 is a diagram showing a process of producing a targeting vector.
  • FIG. 8 shows the tail of a pup obtained by crossing the # 2 mouse (male) with the ⁇ S-type 2 mutant presenilin-1 gene and the F4 (female) of a CAG-cre # 13 mouse.
  • FIG. 2 is a view showing the results of 1% agarose gel electrophoresis of a product obtained by subjecting a chromosomal DNA obtained from a part-cut sample to PCR by the method described in Example 10. 2nd and 4th from right It has been shown that mice of the eye do not have neo expression units on chromosomal DNA.
  • the leftmost lane is a molecular weight marker.
  • mutant presenilin gene used for producing the genetically modified animal of the present invention (in the present specification, the term “mutated presenilin gene” refers to either the mutant presenilin-1 gene or the mutant presenilin-12 gene)
  • the mutant presenilin protein (referred to as “mutant presenilin protein” in the present specification, means one or both of the mutant presenilin-1 protein and the mutant presenilin-2 protein).
  • the gene that encodes This mutant presenilin gene has the property of increasing the production of amyloid; 8 protein.
  • the genetically modified animal of the present invention is a mammal into which the above mutant presenilin gene has been introduced, for example, by homologous recombination.
  • the mutation present in the mutant presenilin protein is preferably caused by substitution of an amino acid residue, and the number of the mutation is not limited, but is preferably one.
  • the full length of mammalian presenilin-11 protein is described, for example, in E. Levy-Lahad, et al., Science, 269, pp. 973-977, 1995.
  • the full length of human and mouse-derived preseurin-1 protein and an example of DNA encoding the protein are shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 of the sequence listing, respectively.
  • the mutation site is No. 79, No. 82, No. 96, No. 115, No. 120, No. 135, No. 139, No. 143 No. 146, No. 163, No. 209, No. 213, No. 231, No. 235, No. 246, No. 250, No. 260, No. 263, No. 264, No. 267, 269, 280, 285, 286, 290, 318, 384, 392, 41
  • the number is preferably one or more selected from No. 0, No. 426, and No. 436.
  • a mutation in which the 213rd amino acid is substituted with another amino acid is a particularly preferred mutation.
  • a mutation in which the 13th isoleucine is substituted with an amino acid other than iso- mouth isine or a mutation in which the 21st isoleucine is substituted with threonine is particularly preferable.
  • the full length presenilin-12 protein from mammals is described in, for example, Science, 269, pp. 973-977, 1995.
  • the mutation site is preferably No. 141 and Z or No. 436, and more preferably N 141 I and Z or M239 V in a mouse-derived sequence.
  • a mutation may be present in either one or both of the presenilin-11 protein and the presenilin protein-12.
  • the genetically modified animal of the present invention is characterized by having the above-mentioned mutant preseurin-1 gene and Z or mutant presenilin-2 gene on its chromosome DNA.
  • the genetically modified animal of the present invention may be any mammal, and the type thereof is not particularly limited. For example, rodents can be suitably used. Particularly preferred is a mouse.
  • the gene-mutated animal of the present invention is obtained by preparing a plasmid using DNA having a sequence of about 10 kbp containing the mutant presenilin gene, Can be produced by introducing homologous assembly in cells by introducing the gene into embryonic stem cells.
  • the DNA may contain a marker portion, a sequence for inserting the marker, and the like.
  • one base can be substituted to insert a site cleavable by Sau3AI, and the PCR product can be cleaved with Sau3AI and confirmed by electrophoresis or the like.
  • the gene-mutated animal of the present invention has a characteristic that as a result of the gene mutation,] 3 amyloid protein is produced in a larger amount than a normal animal.
  • the amount of increase of the amyloid 13 protein achieved by the gene-mutated animal of the present invention is not particularly limited. It is preferable that such a difference is recognized.
  • the DNA, plasmid, cultured cells, and mammalian cell embryos provided by the present invention are also characterized by having the above-mentioned mutant presenilin-1 gene and / or mutant preseurin-2 gene.
  • these genes or DN A substituted with one or more, preferably one to twenty, more preferably one to several bases in A is also included in the scope of the present invention.
  • DNA or plasmid of the present invention examples include, for example,
  • DNA consisting of a mutant presenilin-1 gene encoding a mutant presenilin-1 protein in which isoleucine 213 of preseurin-1 has been replaced with threonine, and a plasmid containing the DNA;
  • Isoleucine at position 213 of the amino acid sequence of preseurin-1 protein is threonine DNA containing exon 8 of the mutant presellinillin-1 gene encoding the mutant presellinillin-1 protein substituted with the protein, and a neomycin expression unit sandwiched between loxPs, or a plasmid containing the DNA
  • Examples of the embryo or cell provided by the present invention include the above-described plasmid, for example, an embryo or cell into which a plasmid having the nucleotide sequence of PRL-104 or PRL-105 has been inserted. Further, by homologous recombination using the above-described plasmid, a cell into which a gene encoding a mutated preseurin-1 protein containing a mutation in the amino acid sequence No. 21-3 of the presedulin-1 protein is introduced according to the present invention. Preferred cells.
  • the type of embryo or cell is not particularly limited as long as it is derived from a mammal, but an embryo or cell derived from a rodent, preferably a mouse can be used.
  • a presenilin gene mutant animal of the present invention can be prepared according to the following steps.
  • a mouse is used as a mammal and a human mutant presenilin-1 gene is used as a human mutant presenilin gene, but the gene mutant animals of the present invention are limited to those produced using these. It will not be done.
  • This method is an example of the method for producing the genetically modified animal of the present invention, and the method for producing the genetically modified animal of the present invention is not limited to the following method.
  • a DNA fragment containing a site to be mutated in exon 8 of the presenilin-1 gene of a mutant animal to be prepared is obtained from a mouse 'dienomic DNA library.
  • Mouse '' Ginonom As the DNA library, in addition to the mouse genomic DNA of 129 strains described in the examples, a mouse dienomic DNA library of any strain may be used. When a mouse is used as an animal into which a mutation is to be introduced, exon 8 of the mouse 'presenilin-11 gene is used, but an appropriate portion must be selected for other types of animals.
  • a targeting vector containing chromosomal DNA containing exon 8 of the presenilin-1 gene is prepared.
  • Neo targeting units are introduced into the targeting vector as a selectable marker, and G418 (antibiotic) is added to the medium to kill cells whose vector has not been introduced into the chromosome.
  • G418 antibiotic
  • ES cells are cultured in the presence of G418, and emerging colonies are collected. The obtained colony is divided into two parts, one is cultured and preserved by subculture or freezing, and the other is used for homologous recombination to obtain the desired exon of the mouse preseurin-1 gene.
  • Examine ES cells into which 8 mutations have been introduced.
  • the stored portion of the ES cell colony into which the desired mutation has been introduced is removed and used in the following steps.
  • an 8-cell embryo is taken out from a pregnant mouse, and about 20 ES cells that have been stored and collected as described above are dusted, and then introduced into the uterus of a pseudopregnant female mouse.
  • Select chimeric mice from the pups born.
  • a mouse containing the desired mutation can be obtained.
  • This mouse is heterozygous for the mutated presenilin-1 gene and another The preseurin-1 gene in the chromosome is the wild type without mutation.
  • mouse chromosomal DNA containing a portion corresponding to exon 8 of mouse presenilin-1 gene of chromosomal DNA, or a base A method of preparing a large amount of a plasmid containing cDNA of the presenilin-1 gene derived from other mammals such as mouse and human whose sequence is known can be employed.
  • the desired DNA fragment can also be obtained by cleaving the plasmid with a restriction enzyme and collecting a necessary portion as a DNA fragment using means such as agarose gel electrophoresis.
  • a method for labeling the DNA fragment besides the random priming method described in the examples, a method of performing PCR in the presence of 32 P-dNTP can be used.
  • labeling may be performed by a PCR method or a random priming method by using a previously labeled oligodoxynucleotide as a primer.
  • a chemiluminescence method using piotin-avidin (fc0), fc0 resin, alkaline phosphatase, etc. can be used.
  • an RNA fragment labeled using T3 or T7 RNA polymerase can be used as a probe.
  • various methods for producing a probe are known, but any method may be employed to obtain a target probe.
  • a plasmid derived from a phage such as M13 or a plasmid replicated using ung E. coli is used.
  • the oligodeoxynucleotide synthesized to introduce the mutation at the site where the desired mutation is to be introduced (only the base at the mutation introduction site is complementary)
  • a heterologous double-stranded DNA plasmid is prepared with DNA polymerase, and Escherichia coli (ung + ) is transformed with this plasmid to obtain a plasmid having the desired mutation. Can be obtained.
  • two oligonucleotides that are modified so that the bases are changed to introduce the desired mutation and that can anneal complementarily to each other, and have restriction enzyme sites at both ends.
  • a method of synthesizing a xynucleotide and binding it to a plasmid to be mutated using DNA ligase can also be used to obtain a plasmid having the desired mutation.
  • the targeting vector contains, as essential elements, a mutated mouse chromosomal DNA fragment, a DNA fragment encoding a selectable marker, a promoter for controlling transcription thereof, and a selectable marker expression unit containing a terminator.
  • the mouse chromosome DNA fragment into which the mutation has been introduced is necessary for homologous recombination to occur in ES cells, and the mouse chromosome DNA fragments before and after the mutation-introduced site are required. That is, the targeting vector has a DNA fragment that differs from the original mouse chromosome DNA only in the mutated base.
  • the length of the fragment is preferably about 10 kbp, but in general, a slight increase or decrease in length is allowed. However, if it is too short, the frequency of homologous recombination in ES cells may decrease.
  • ES cell line 129 mouse-derived strains are commonly used.As ES cells of this line, in addition to R1 described in the Examples, ES cells such as D3, CCE, Jl, and AB1 are used. You may. ES cells derived from a mouse other than the 129 strain, such as a mouse of the C57BL / 6 strain, can also be used.
  • a method for introducing a targeting vector into ES cells the electroporation method described in Examples is generally used, but it is used for introducing a plasmid into a cultured cell line, such as a calcium phosphate coprecipitation method or a ribosome method. Any method may be adopted as long as it is possible.
  • ES cells after the introduction of the targeting vector are cultured in the presence of a selection marker, ES cells that survive and form colonies may have undergone homologous recombination.
  • PCR is used as a method for examining cells that have undergone homologous recombination from the ES cells that have formed these colonies, but DNA fragments, RNA fragments, and synthetic oligodeoxynucleotides that can be used as probes are used. It is also possible to use xynucleotides or antibodies.
  • ES cells After the ES cells are mixed into the fertilized egg at the early stage of development, the development is continued and a mouse whose sperm or ovum is derived from the ES cell can be obtained.
  • ES cells that have undergone homologous recombination can be mixed into fertilized eggs at the early stage of development, or fertilized eggs at the blastula stage can be removed from pregnant mice and injected with injection pipets. After injecting 10 to 20 ES cells and transplanting them into the uterus of a pseudopregnant female mouse, the development can be continued to obtain offspring.
  • the mouse used to obtain the desired mutagenized mouse by breeding the obtained chimeric mouse be a mouse of a different color from the mouse of the strain that is the source of the ES cells .
  • a female chimera mouse is crossed with a female of another strain, a mouse that has the desired mutation in a mucous mouth is obtained if an aguchi-colored offspring is obtained.
  • Mice harboring the OS-2 type of presenilin 1 gene have a neo expression unit flanked by loxP sequences, and thus are crossed with an ere gene-introduced transgenic mouse. You can get the mouse with the removed.
  • mice transfected with a gene encoding a mutant of APP that causes familial Alzheimer's disease mice producing amyloid deposits in the brain have been reported (Games D. et al.). : Nature 373, 523, 1995. Hsiao K., etc .: Science 274, 99, 1996. St.urchler-Pierrat C., etc .: Pro to Natl. Acad. Sc. USA. 94. 24, 13287, 1997).
  • These transgenic mice are thought to have amyloid deposits due to increased production of Ai3 in the brain.
  • a transgenic animal (whether homologous or heterologous with respect to the transgene) into which a gene encoding an APP mutant is introduced and which causes amyloid deposition in the brain, and the PS1 of the present invention.
  • Genetically altered animals Homozygous for the mutant gene And hybrids can be used to produce hybrid animals. Mice are preferred as animals. In mating, the animal on either side may be os.
  • a part of the tail of the obtained pup is collected and chromosome DNA is extracted.
  • the two oligodeoxynucleotides with base sequences designed to sandwich the mutation site of the gene encoding the APP mutant and the mutation site of the mutant PS1 gene Perform PCR using two oligodeoxynucleotides having the designed nucleotide sequence as primers.
  • PCR can be carried out according to the method described in Example 8 of Examples.
  • the nucleotide sequence of the oligonucleotide used for the primer of the PCR may be any nucleotide as long as it can detect a gene encoding an APP mutant or a mutant PS1 gene. Based on the results of PCR, by selecting an animal having the gene encoding the APP mutant and having the mutant PS1 gene of the present invention, obtaining an animal having both genes heterozygously Can be.
  • an appropriate gene must be selected from among the animals having both of these genes in the mouth.
  • An individual having homozygous both genes may be selected from pups obtained by selecting and mating a female.
  • a part of the tail of the offspring is collected, chromosomal DNA is extracted, the extracted chromosomal DNA is cut with a restriction enzyme, and then agarose gel is used. Alternatively, perform electrophoresis using an acrylamide gel. After blotting the DNA on a membrane filter, the APP mutant was cloned. Southern blotting may be performed using an oligodeoxynucleotide having a base sequence capable of specifically binding to the gene to be detected as a probe, and the resulting band density may be measured.
  • the cells of the present invention When the cells of the present invention are used, they can be separated from the animal of the present invention and used as primary culture cells, and the primary culture cells can be immortalized with a virus or the like and then subcultured to obtain a number of cells. By removing a part of the cultured cells every day and culturing them again with a new tissue culture solution, the cells can be stably used as subcultured cells.
  • the cells of the present invention include not only primary cells such as nerve cells isolated from a genetically modified animal, but also subcultured cells obtained by subculturing primary cells. It is. When a nerve cell is used as the cell of the present invention, the amyloid i3 protein is expressed in a large amount as a result of the cell expressing the mutant presenilin-11 protein.
  • amyloid i3 protein is involved, for example, by comparing the cell survival period and the number of viable cells after a certain period of time. A substance that prevents or delays nerve cell death can be screened and its usefulness can be evaluated.
  • the presenilin-11 gene may be abbreviated as PS-1.
  • PR-8-L 5'-GGTCCATTCGGGGAGGTACTTG A-3 '(23mer)
  • DNA extracted from 129 SVJ mouse dienomic library (Stratagene).
  • PCR was performed to obtain the obtained amplified DNA fragment of about 130 bp.
  • This fragment was labeled by the random prime labeling method in the presence of : i2P-dCTP and used as a probe to screen a 129 SVJ mouse genetic library.
  • the nucleotide sequence of the obtained positive phage clone was examined, and it was confirmed that the clone had a chromosomal DNA containing exon 8 of the desired mouse PS-11 gene.
  • a restriction map was prepared (FIG. 1).
  • Example 2 Construction of plasmid for mutagenesis:
  • PRL-105 5 '-GGGCCTTTCCAGTGG G TGGCG * ATCATCCCGACCACA- 3'
  • pmX-1 was digested with Xba I and Pst I, and then 1% agarose gel electrophoresis was performed to recover mX-1.
  • MX-1 was ligated to the above Pst I fragment with T4 DNA ligase to transform Escherichia coli.
  • the transformed E. coli colonies were examined, and a colony having a plasmid in which the X-1 portion of the plasmid pSB-0 was replaced with mX-1 was selected, and the recovered plasmid was designated as pmSB-0 (Fig. 3).
  • 1% agarose gel electrophoresis was carried out to recover a DNA fragment containing about 7 kbp of exon 8.
  • PBluescript II KS + previously digested with BamHI and SalI was ligated to this fragment using T4 DNA ligase, and E. coli was transformed to obtain plasmid pSB-1.
  • 1% agarose gel electrophoresis was performed.
  • the approximately 2.2 kbp DNA fragment XN and pSB-1 containing the recovered exon 8 were digested with XbaI and PstI, and then subjected to 1% agarose gel electrophoresis.
  • the recovered 2.3 kbp DNA fragment PX without exon 8 was ligated with T4 DNA ligase. This was previously cut with XbaI, blunt-ended with T4 DNA polymerase in the presence of four dNTPs, religated with T4 DNA ligase, and further cut with SmaI and PstI.
  • Plasmid pBluescript II KS + was ligated with T4 DNA ligase to transform E. coli. The transformed E.
  • Example 5 Basic backbone of the targeting vector Production of An oligodeoxynucleotide having the following nucleotide sequence was synthesized from the plasmid pmSB-0 'to introduce an EagI site at the XbaI site.
  • This oligodoxynucleotide can be annealed via a nucleotide sequence having complementarity to the CGGCCG portion, and when inserted into a site cut with XbaI, the result is as follows.
  • this oligodeoxynucleotide is added and ligated with T4 DNA ligase to transform Escherichia coli.
  • the EagI site is inserted into the XbaI site of the plasmid pmSB-0'.
  • PmSB-0 'eag was obtained.
  • 1% agarose gel electrophoresis was carried out, and an approximately 5.3 kbp DNA fragment SN containing exon 8 was recovered.
  • pSB-1 was digested with BamHI and NcoI
  • 1% agarose gel electrophoresis was performed to recover a DNA fragment NB of about 2 kbp without exon 8.
  • SN and NB were ligated with T4DNA ligase and treated with BamHI and SalI to obtain a DNA fragment in which both DNA fragments were bound at the NcoI site.
  • the DNA fragment was previously cut with Not I, blunt-ended with Mung Bean nuclease treatment, religated with T4 DNA ligase to destroy the Not I site and the overlapping Eag I site.
  • Plasmid pBluescript II KS10 digested with BamHI and SalI was ligated with T4DNA ligase, and E. coli was transformed to obtain plasmid pA (FIG. 5).
  • Example 6 Creating a targeting vector
  • Plasmid pPNT (Victor and J. et al .: Cell 65, 1153, 1991) was digested with XhoI and BamHI, blunt-ended using T4 DNA polymerase, and subjected to 1% agarose gel electrophoresis. . A DNA fragment of about 1.7 kbp containing the collected neo-expression unit was digested with BamHI in advance, and then blunt-ended with T4 DNA polymerase. Plasmid pBS246 (manufactured by Gibco BRL) was digested with T4 DNA. Escherichia coli was transformed by ligation using ligase to obtain plasmid pBS246neo.
  • plasmid pSB-2 obtained by subcloning a DNA fragment of about 6.5 kbp obtained by cleaving P strain with Sal I and BamH I into pBluescript II KS + was cut with Hind III and BamH I, followed by % Agarose gel electrophoresis was performed to recover a DNA fragment D of about 4 kbp.
  • the DNA fragments C and D were ligated using T4 DNA ligase, and then cut with HindIII and SalI to obtain a DNA fragment in which DNA fragments C and D were bound at the BamHI site.
  • This DNA fragment was ligated with pBluescript II S + previously cut with HindIII and SalI using T4DNA ligase, and Escherichia coli was transformed to obtain a targeting vector—pOS—2neoloxP (FIG. 7). .
  • Example 7 Introduction of targeting vector into ES cells
  • ES medium DMEM medium
  • electroporation solution 20 mM HEPES, H7.05, 137 mM NaCl, 5 mM KC1, 0.7 mM NaCl
  • Example 7 colonies of ES cells generated by culturing for one week after the addition of G418 were collected. Each colony was bisected and one continued to culture. The other was washed with PBS to select clones that had undergone homologous recombination, treated with Proteinase K, and then the chromosomal DNA was recovered and clones were selected by PCR.
  • the nucleotide sequences of the synthetic primers used in PCR are as follows.
  • Prsnl-2 5'-CCCAACTCTATTTCTACCCTCGTTCATCTG-3 '
  • PCR conditions were as follows: 30 cycles at 93 ° C, 1 minute at 60 ° C, and 3 minutes at 68 ° C for 35 cycles, and PCR products were subjected to 1% agarose gel electrophoresis. Clones that produced a band at the position indicated were considered positive. The clones judged positive here were subjected to PCR using oligodeoxynucleotides PRL-101 and PRL-102, and after cutting the PCR product with Sau3AI, 2 ° / ° C. Agarose gel electrophoresis was performed, and it was confirmed that the mutation had been introduced because the band was divided into two, and ES cells in which homologous recombination had correctly occurred were selected.
  • nucleotide sequences of PRL-101 and PRL-102 are as follows.
  • PRL-101 5'-TGCTGGAGGAAAATGTGTTATTTAAGAGCA-3 '
  • PRL-102 5'-TACTGAAATCACAGCCAAGATGAGCCATGC-3 'Example 9: Obtaining knock-in mouse:
  • ES cells After culturing ES cells for which homologous recombination was confirmed to have occurred for 4 days, the cells were dispersed by trypsin treatment. Eight-cell embryos were removed from females of the same strain obtained by crossing males of the mouse BDF1 strain, the zona pellucida was removed, and the above ES cells were separated and adhered (20 ES cells Z 8-cell embryos 1 Pieces ). This was transferred to the uterus of a female mouse subjected to pseudopregnancy treatment, and the development of the fetus was continued to obtain a chimera mouse.
  • mice The male of this chimeric mouse was bred to a C57BL / 6 female, and the offspring were selected to have the color of Aguchi and the chromosome DNA was extracted from a sample in which a part of the tail was cut off. After performing PCR using PRL-101 and PRL-102, cut the PCR product with Sau3AI, perform 2% agarose gel electrophoresis, and check for the presence of the cut band. I confirmed that. One of the confirmed mice was selected as # 2.
  • Knock-in mouse # 2 obtained in Example 9 has a heterologous neo-expression unit sandwiched between the targeting vectors derived from the targeting vector.
  • This mouse # 2 male, about 4 months old
  • was transfected with CAG-crettl3 K. Sakai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 217: 318, 1997) F4 female (2 months old: introduced ere The gene was heterozygous.
  • PCR was performed using oligodeoxynucleotides PRL-100, PRL-102 and PGK-1 under the conditions described in Example 8 to remove neo-expressed units.
  • an OS-2 type knock-in mouse without neo expression unit was obtained (FIG.
  • PRL-100 5 '-GGT CCA TCC CAG CTT CAC ACA GAC AAG TCT-3'
  • PRL-102 5 '-TAC TGA AAT CAC AGC CAA GAT GAG CCA TGC- 3'
  • the genetically modified animal of the present invention Since the genetically modified animal of the present invention has the mutant presellinillin 1 gene, it produces a higher amount of amyloid 3 compared to normal animals (animals without the mutation), and early death or loss of cerebral hippocampal neurons. Alzheimer's symptoms occur. Therefore, by using the genetically modified animal of the present invention, it is possible to prevent Alzheimer's disease and screen for a substance useful for Z or treatment, and to evaluate the usefulness.

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Description

明 細 書 遺伝子変異動物 技術分野
本発明は、 遺伝子導入動物に関するものである。 より詳しくは、 ヒ ト ·ァルツ ハイマー病を惹起するプレセ二リン遺伝子の変異を導入したプレセ二リン遺伝子 導入動物に関する。 背景技術
アルツハイマー病は進行性の痴呆症状を呈する疾患であり、 脳内での著しく多 数の老人斑の出現と神経原線維変化の神経細胞内蓄積を病理組織学的特徴とし、 緩徐に神経細胞が障害され脱落する神経変性疾患である。 アルツハイマー病は老 齢者に発症することが多く、 加齢とともに罹患者の比率が増大することが知られ ている。 現在のところアルツハイマー病の根治は不可能であり、 将来的な老齢者 人口の急増に備えてアルツハイマー病に対する治療や予防のための方法、 並びに アルツハイマー病に対して有効な予防 ·治療剤の早急な開発が切望されている。 老人斑は種々の成分を含む神経細胞外の沈着物であり、 アミロイ ド ;3タンパク ( A i3 ) と呼ばれる 3 9〜4 2個のアミノ酸残基からなるぺプチドを主成分とし ている。 アミ ロイ ド /3はアミ ロイ ド前駆体タンパク （amyloid precursor protein ： A P P ) より /^セクレタ一-ビと γセクレタ一-ビと仮称されているプロ テアーゼで切断されて生じる。 老人斑では、 アミロイ ド が シート構造をとつ た堅固な構造物として沈着している。 老人斑はび漫性老人斑と呼ばれる "しみ" 状の沈着から始まるが、 この段階では神経変性は生じておらず、 更にび漫性老人 斑が堅固な沈着物となるとともに、 神経変性や神経細胞の脱落が生じることによ つて痴呆などのアルツハイマー病の症状が現れるものと考えられている。 アミ口 ィ ド としては主に 4 0ァミノ酸残基よりなる Α 4 0と 4 2ァミノ酸残基より なる A β 4 2が存在する。 細胞が生成するアミロイ ド/¾の大部分は A |3 4◦であ り、 A j3 4 2は僅かに存在しているにすぎないが、 A β 4 2の方が凝集性が高く、 Α β 4 0と比較して老人斑形成に果たす役割は大きいと考えられている （玉岡： 内科 77卷、 843 頁、 1996年）。
アルツハイマー病には常染色体優性の遺伝を示す家族性の発症が認められる。 この家族性アルツハイマー病の原因遺伝子として最初に見つけられたものは、 1 9 9 1年第 7 1 7番目のアミノ酸残基がバリンからィソロイシンに変異している Α Ρ Ρの突然変異体であり、 この遺伝子は 2 1番染色体上に存在する （Goate A. 等： Nature 349卷、 704 頁、 1991年）。
この他、 アルツハイマー病の原因となる A P Pの突然変異体として、 同じく第 7 1 7番目のアミノ酸残基がフエ二ルァラニンに変換したもの （Murrel l J.等： Science 254巻、 97頁、 1991年）、 同じ位置のアミノ酸残基がグリシンへ変異し たもの （Chart ier, Harl in等： Nature 353 卷、 844 頁、 1991年）、 第 6 7 0番 目と第 6 7 1番目の 2アミノ酸残基がリジン ·メチォニンからァスパラギン · 口 イシンに変異したもの （Mul lan M. 等 ： Nature Genet . 1卷、 345 頁、 1992 年）、 第 6 9 2番目のアミノ酸残基がァラニンからダリシンに変異したもの (Hendrisk L.等： Nature Genet . 1卷、 218 頁、 1992 年） 等が見い出されて いる。
家族性アルツハイマー病の原因因子あるいは危険因子としてアポリポタンパク E (apo E ) が 1993 年に報告された。 すなわち、 1 9番染色体上に遺伝子が存 在する apo Eのァイソマーのうち第 1 1 2番目のアミノ酸残基がアルギニンで あり、 第 1 5 8番目のアミノ酸残基がアルギニンである a p o E 4を保有する者 の比率がアルツハイマー病患者では健常人と比較して有意に高いことが見つけら れた （Corder E. H. . 等： Science 261 巻、 921 頁、 1993年）。
その後、 1995 年にアルツハイマー病の新たな原因遺伝子として、 1 4番染色 体上に存在する 「プレセリニン- 1」 （PS- 1； 当初は S 182と呼ばれていた） の遺伝 子 （Sherrington R.等： Nature 375卷、 754 頁、 1995年） の突然変異体および 1番染色体上に存在する「プレセニリン一 2」 （PS- 2 ;当初は E5- 1あるいは STM-2 と呼ばれていた） の遺伝子 （Rogaev E. I.等 ： Nature 376 卷、 775 頁、 1995 年） の突然変異体が見いだされた （本明細書において、 それぞれの遺伝子を 「プ レセニリン一 1遺伝子」 及び 「プレセニリン一 2遺伝子」 と呼ぶ。 また、 それら の遺伝子産物をそれぞれ「プレセニリンー 1蛋白」及び 「プレセニリンー 2蛋白」、 又は 「PS - 1」 及び 「PS - 2」 と呼ぶ。）。
プレセ二リン一 1蛋白及びプレセ二リンー 2蛋白はそれぞれ 467 ァミノ酸残 基および 448 アミノ酸残基よりなる 7回 （又は 8回） 膜貫通型の 1次構造を有 しており、 膜タンパクとして存在していると推測されている。 両者のアミノ酸レ ベルでのホモロジ一は高く、 全体で 6 7 %、 膜貫通部のみでは 8 4 %である。 プ レセニリン一 1蛋白の機能に関しては、 線虫の sel-12タンパクや SPE-4 タンパ クとの高い相同性から、 これらのタンパクと機能が類似している可能性が指摘さ れている。 SPE-4 タンパクは線虫の精子形成過程に関与するタンパクであり、 タ ンパクの輸送 .貯蔵に関与しているとされている。
従って、 プレセニリンー 1蛋白は A P Pのような膜タンパクのプロセシング、 軸策輸送、 膜小胞の膜との融合過程などに関与する可能性が考えられている。 ま た、 se卜 12は線虫の発生過程を制御している lin- 12の突然変異による発生異常 を救済する遺伝子として発見された。 lin-12 は細胞間情報伝達に関与している と考えられており、 プレセニリンー 1蛋白も細胞間情報伝達のどこかに関与して いる可能性も示唆されている。
プレセ二リン一 1蛋白について、 最初の報告では、 家族性アルツハイマー病の 原因となる突然変異は 5ケ所のアミノ酸残基の置換であることが記載されている,:, この報告以降、 本発明者等の報告した O S— 2 (第 2 1 3番目のアミノ酸残基ィ ソロイシンがスレオニンに変異） および OS- 3 (第 9 6番目のアミノ酸残基バリ ンがフエ二ルァラニンに変異） （Kamino K. 等： Neurosci . Lett. 208 卷、 195 頁、 1996 年） を初めとして、 多くの家族性アルツハイマー病の家系から様々な 個所での突然変異体が見つけられているおり、 現在では 3 0ケ所以上で 4 0種類 以上のアミノ酸残基の置換が知られている （Hardy ： TINS 20 卷、 154 頁、 1997 年)。
現在ではプレセニリンー 1蛋白の突然変異は家族性アルツハイマー病の 7 0〜 8 0 %を占めると考えられている。 PS - 2 については 2ケ所の突然変異が報告さ れている。 以上述べたように、 PS-1および PS-2の突然変異体が家族性アルッハ イマ一病と深く関連していることが遺伝学的解析から証明されている。
一方、 最近、 プレセ二リン一 1蛋白及びプレセ二リン一 2蛋白の突然変異体が どのような機作でアルツハイマー病の発症の原因となっているかに関する研究も 進められている。 これらの突然変異体を持つアルツハイマー病患者の血清中や皮 膚の腺維芽芽細胞の培養液 （Scheuner D. 等： Nature Med. 2 卷、 864 頁、 1996 年）、 プレセ二リン一 1蛋白及びプレセエリンー 2蛋白の突然変異体で形質転換 した培養細胞株の培溶液中 （Xia W . 等： J. Biol. Chem. 272 卷、 7977 頁、 1997 年。 Borchelt DR等： Neuron 17卷、 1005頁、 1996年。 CitronM.等： Nature Med. 3卷、 67頁、 1997年）、 及びプレセ二リン一 1蛋白の突然変異体を持つ家族性ァ ルツハイマー病患者の脳組織 （Lemere C. A. 等： Nature Med. 2卷、 1146頁、 1996 年） において、 A ]3 4 0は正常型のプレセ二リン一 1蛋白及びプレセ二リン一 2 蛋白に比べて殆ど変化が見られないが、 Α β 4 2は正常型のプレセニリン一 1蛋 白及びプレセユリンー 2蛋白と比較して大きく増加していることが報告されてい る。
すなわち、 家族性アルツハイマー病をもたらすプレセニリンー 1蛋白及びプレ セニリンー 2蛋白の突然変異は、 老人斑の形成に大きな役割を果たすと考えられ ている Α (ί 4 2を増加させることにより、 アルツハイマー病を発症させる可能性 が示されている。 プレセ二リン一 1蛋白の突然変異体をコードする遺伝子を導入 したトランスジエニックマウスも作製されている （Duff K. 等： Nature 383卷、 710頁、 1996年。 Borche lt DR. 等： Neuron 17卷、 1005頁、 1996年。 Ci tron M. 等： Nature Med. 3 卷、 67頁、 1997年）。 これらのトランスジエニックマウスに おいてマウス脳内の 4 2が特異的に増加していることが報告されている。 こ の結果は、 家族性アルツハイマー病をもたらすプレセニリンー 1蛋白及びプレセ 二リン 2蛋白の突然変異体は、 老人斑の形成に大きな役割を果たすと考えられ ている 4 2を増加させることにより、 アルツハイマー病を発症させる可能性 を強く支持するものである。 しかしながら、 これらのトランスジエニックマウス の報告ではトランスジエニックマウスの脳の組織学的検討に関する記載はされて いない。 これはトランスジエニックマウスで顕著な脳の組織学的変化が観察され ていないことを推察させる。
一般的に、 トランスジヱニック動物は、 対象とする遺伝子の生体内での機能を 解析する手段としては有用である。しかしながら、導入した遺伝子の発現を量的 · 発現組織的 ·発生上の発現時期的に制御することは技法的に困難である。 また、 動物自体が持っている遺伝子が正常に発現しているために、 トランスジェニック 動物の体内では両方の遺伝子産物が混在した状態にあり、 導入した遺伝子の機能 解析が十分できないという問題もある。 さらに、 導入した遺伝子が特に過剰に発 現される場合、 本来生体内で果たしていな 、機能がトランスジエニック動物で現 れてしまう場合があり、 その結果、 作製した遺伝子変異動物の解析に混乱をもた らすおそれがある等の難点もある。
トランスジエニック動物とは別に、 対象とする遺伝子の機能を解析する手段と してノックアウト動物を利用することができる。 ノックアウト動物は、 動物自体 が持っている対象の遺伝子を人工的に破壊して機能できない状態にしたものであ る。 ノックアウト動物を詳細に解析することにより、 対象としている遺伝子の生 体内での機能を明らかにすることができる。 しかしながら、 破壊した遺伝子の産 物の機能をノックァゥ 卜動物体内の別の遺伝子産物が代替するため、 ホモ化して もノックアウト動物自体に特段の変化が現れてこないことがある。 また、 破壊し た遺伝子の産物が動物の発生上 ·成育上必須であるためにホモでは致死となって しまい、 成長可能なヘテロでは遺伝子の機能の詳細な解析が事実上不可能な場合 があるという問題点も有している。 発明の開示
本発明の課題は、 アルツハイマー病の病態モデル動物の作製にあたり、 前記の ような欠点を有するトランスジュニック動物ではなく、 ヒ 卜におけるァルツハイ マー病患者の病態により近いモデル動物を提供することにある。より具体的には、 アルツハイマー病の原因遺伝子と考えられるプレセユリン遺伝子に変異を加えた 遺伝子 （変異プレセ二リン遺伝子） を相同組換え法で導入することにより、 変異 プレセニリン蛋白を脳内で発現可能な遺伝子変異動物を提供することが本発明の 課題である。 また、 本発明の別の課題は、 上記の遺伝子変異動物の作製方法、 該 作製方法に有用なプラスミ ド、 及び該遺伝子変異動物を用いてアルツハイマー病 の予防及び/又は治療に有用な物質を評価する方法を提供することにある。
本発明者らは、 プレセ二リン一 1蛋白の役割を解明するため、 及びプレセ二 リンー 1遺伝子の突然変異がどのような機作でアルツハイマー病を引き起こすの か解析するため、 マウス自体が持っているプレセニリン— 1遺伝子を上記 OS— 2型の変異をもつプレセニリンー 1遺伝子と入れ換えたノックインマウスを作製 した。 その結果、 この遺伝子変異動物ではトランスジエニックマウス及びノック ァゥトマウスの持つ欠点を回避することができ、 変異プレセユリンー 1遺伝子を もつ家族性アルツハイマー病の病因 ·病態解明に有用であることを見出した。 本 発明者らはさらに研究を続け、 下記に述べる本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、 変異プレセ二リン遺伝子を有するヒ ト以外の遺伝子変異動 物を提供するものであり、 より好ましくは、 プレセ二リン一 1蛋白のアミノ酸配 列中の 1つのァミノ酸が他のァミノ酸に置換した変異プレセ二リン一 1蛋白をコ 一ドする DN A配列を含む変異プレセニリンー 1遺伝子を有する遺伝子変異動物 を提供するものである。
また、 プレセ二リン一 1蛋白のアミノ酸配列、 好ましくはマウス由来のプレセ 二リン一 1蛋白のァミノ酸配列において、 次の番号：
第 79番、 第 82番、 第 96番、 第 1 1 5番、 第 1 20番、 第 1 35番、 第 1 3 9番、 第 143番、 第 146番、 第 1 63番、 第 209番、 第 213番、 第 23 1番、 第 235番、 第 246番、 第 250番、 第 260番、 第 263番、 第 26 4番、 第 267番、 第 269番、 第 280番、 第 285番、 第 286番、 第 29 0番、 第 31 8番、 384番、 第 392番、 第 41 0番、 第 426番、 及び第 4 36番からなる群から選ばれる 1又は 2以上の箇所のァミノ酸が他のァミノ酸に 置換したァミノ酸配列を有する変異プレセニリンー 1蛋白をコードする DNA配 列を含むプレセ二リン一 1変異遺伝子を有するヒ ト以外の遺伝子変異動物； 及び、 プレセ二リン一 1蛋白のアミノ酸配列、 好ましくはマウス由来のプレセ 二リン一 1蛋白のァミノ酸配列において、
A79V、 V82 L、 V96 F、 Y1 1 5H、 Y 1 1 5 C、 E 1 20K、 E 1 2 0 D、 N 1 35 D、 M 1 39 V、 Ml 39 T、 Ml 39 I、 I 143 F、 1 14 3 T、 M146 L、 M146V、 H1 63Y、 H 1 63 R、 G209V、 1 21 3 T、 A231 T、 A23 1 V、 L 235 P、 A 246 E L 250 S、 A 26 0V、 C 263 R、 P 264 L、 P 267 S、 R269G、 R269G、 R 26 9H、 E 280A、 E 280G、 A285V、 L 286V、 S 290C、 E 31 8G、 G384A、 L 392V、 C41 0Y、 A426 P、 及び P 436 S、 (各アルファべッ トは一文字表記法によるアミノ酸を意味しており、 数字はプレ セニリン一 1蛋白の N末端からのァミノ酸番号を示し、 数字左側に示す野生型の アミノ酸が右側のアミノ酸に置換されていることを示す。 以下、 本明細書におい て、 変異プレセ二リン一 1蛋白及び変異プレセニリンー 2蛋白について同様に表 示する。）
からなる群から選ばれる 1又は 2以上の変異を有する変異プレセニリンー 1蛋白 をコードする DN A配列を含む変異プレセユリンー 1遺伝子を有するヒ 卜以外の 遺伝子変異動物が提供される。
さらに、 プレセニリンー 1蛋白の第 21 3番のィソロイシンがィソロイシン以 外のァミノ酸に置換した変異プレセニリンー 1蛋白をコードする DNA配列を含 む変異プレセ二リン一 1遺伝子を有するヒ ト以外の遺伝子変異動物；及び、 プレ セニリンー 1蛋白の第 21 3番のイソロイシンがスレオニンに置換した変異プレ セニリン 1蛋白をコードする D N A塩基配列を含む変異プレセユリン— 1遺伝 子を有するヒ ト以外の遺伝子変異動物が提供される。
これらの発明の好ましい態様に従い、
プレセニリンー 1蛋白のアミノ酸配列中の第 2 1 3番のアミノ酸の近辺をコード する D N A配列が、 次の配列：
5' - TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC- 3'
(ただし、 Nは T以外の塩基を意味し、 Mは T又は Cを意味し、 下線を付した塩 基が第 2 1 3番のァミノ酸をコードする塩基である。） に変異した変異プレセ二 リン 1遺伝子を有する上記遺伝子変異動物；
プレセニリンー 1蛋白のァミノ酸配列中の第 2 1 3番のァミノ酸の近辺をコード する D N A配列が、 次の配列
5' -TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC- 3'
(ただし、 Nは Cを意味し、 Mは T又は Cを意味し、 下線を付した塩基が第 2 1 3番のアミノ酸をコードする塩基である。） に変異した変異プレセユリンー 1遺 伝子を有する上記遺伝子変異動物；
プレセニリンー 1蛋白のァミノ酸配列中の第 2 1 3番のァミノ酸の近辺をコード する D N A配列が、 次の配列
5' -TGTGGTCGGGATGATMGCC XYZ CACTGGAAAGGCCC- 3'
(ただし、 X Y Zはィソロイシン以外のァミノ酸をコードする 3塩基のコ ドンを 意味し、 Mは T又は Cを意味し、 下線を付した塩基が第 2 1 3番のアミノ酸をコ ―ドする塩基である。） に変異した変異プレセ二リンー 1遺伝子を有する上記遺 伝子変異動物が提供される。
別の観点からは、 本発明により、 プレセ二リン 2蛋白のアミノ酸配列におい て、 第 1 4 1番及び Z又は 4 3 6番のァミノ酸が他のァミノ酸に置換した蛋白を コ一ドする D N A配列を含む変異プレセニリン 2遺伝子を有するヒ 卜以外の遺 伝子変異動物が提供され、 その好ましい態様として、 プレセ二リ ン 2蛋白のァ ミノ酸配列において、 N 1 4 1 I及び/又は M 2 3 9 Vの変異を有する変異プレ セニリンー 2蛋白をコードする D N A配列を含む変異プレセニリンー 2遺伝子を 有するヒ ト以外の遺伝子変異動物が提供される。
これらの遺伝子変異動物の好ましい態様として、 アミロイ ド 3蛋白の過剰発現 が変異プレセユリンー 1遺伝子及び Z又は変異プレセ二リン一 2遺伝子に起因す る上記の遺伝子変異動物；変異プレセ二リン蛋白を発現することができ、 かつ該 蛋白の発現が、 哺乳類動物の脳の大脳皮質周辺部において進行性の神経疾患を形 成させるのに十分な量のアミロイ ド i3蛋白を生産させるものである上記遺伝子変 異動物；哺乳類動物の齧歯類、 好ましくはマウスである上記遺伝子変異動物；変 異プレセニリンー 1遺伝子及び/又は変異プレセニリン一 2遺伝子が相同組換え により導入された上記遺伝子変異動物；変異プレセ二リン一 1遺伝子により引き 起こされた脳組織でのアミ'ロイ ド蛋白の発現量が、 正常動物と比較して記憶学習 試験において障害された行動を引き起こし、 かつ当該動物の脳の海馬の大脳皮質 周辺部において異常な神経病理を誘発するのに十分であることを特徴とする、 上 記遺伝子変異動物；並びに、 プレセユリンー 1蛋白のアミノ酸配列中の 1又は 2 以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換した変異プレセ二リン一 1蛋白をコードす る変異プレセニリンー 1遺伝子とマーカー蛋白をコードする塩基配列とを含む D N Aを有するヒ ト以外の遺伝子変異動物が提供される。
さらに別の観点からは、 プレセユリンー 1蛋白のァミノ酸配列中の第 2 1 3番 のァミノ酸の近辺をコードする D N A配列が、次の配列：5' -TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3' (ただし、 Nは A、 G、 又は Cを意味し、 Mは T又は C を意味し、 下線を付した塩基は第 2 1 3番のアミノ酸をコードする塩基である。） である変異プレセニリンー 1遺伝子を含むプラスミ ド；及び
プレセニリンー 1蛋白のァミノ酸配列中の第 2 1 3番のァミノ酸がィソロイシン 以外のァミノ酸に置換した変異プレセユリンー 1蛋白をコードする変異プレセ二 リンー 1遺伝子であって、 第 2 1 3番のァミノ酸の付近をコードする D N A配列 力；、 次の配列： 5' -TGTGGTCGGGATGATMGCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3' (ただし、 Mは T又は Cを意味し、 X Y Zはィソロイシン以外をコードする 3塩基のコ ドンを意 味し、 下線を付した塩基は第 2 1 3番のアミノ酸をコードする塩基である。） で ある遺伝子を含むプラスミ ドが提供される。 プレセ二リン一 1蛋白のアミノ酸配 列中の第 2 1 3番のァミノ酸がイソロイシン以外のァミノ酸に置換した変異プレ セニリンー 1蛋白をコードする変異プレセ二リン一 1遺伝子のェキソン 8を含む 染色体 D N Aも提供される。
また、 プレセユリン一 1蛋白のアミノ酸配列中の第 2 1 3番のアミノ酸がィソ ロイシン以外のアミノ酸に置換した変異プレセニリンー 1蛋白をコードする変異 プレセニリンー 1遺伝子の c D N A又は染色体 D N Aの全長又は変異部分を含む 塩基配列に対して Sau3AI 部位が導入された D N Aを含むプラスミ ドが提供され、 ァミノ酸の置換が 2 1 3番のイソロイシンからスレオニンへの置換である上記プ ラスミ ド；下記の塩基配列： 5' -TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3' (こ こで Mは T又は Cを意味する。） で特定される D N Aを含むプラスミ ドが提供さ れる。
これらに加えて、 マウス .プレセユリンー 1蛋白のァミノ酸配列の第 2 1 3番 のイソロイシンがィソロイシン以外のアミノ酸に置換したマウス変異プレセニリ ンー 1蛋白をコードする遺伝子；アミノ酸の置換がィソロイシンからスレオニン への置換である上記遺伝子が提供される。 また、 （1) マウス .プレセ二リン一 1 蛋白のアミノ酸配列の第 2 1 3番のィソロイシンがィソロイシン以外のアミノ酸 に置換したマウス変異プレセ二リン一 1蛋白をコードする遺伝子、 及び (2) ΙοχΡ ではさまれたネオマイシン発現ュニッ トを含むプラスミ ド；アミノ酸の置換がィ ソロイシンからスレオニンへの置換である上記プラスミ ドも提供さォ Iる （IoxP については、すでに特表平 4 一 5 0 1 5 0 1号公報の第 4頁に開示されている）。 さらに別の観点から、 下記の塩基配列：
5' -TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3' (ここで Mは T又は Cを意味す る。） で特定される D N Aを含むプラスミ ドが導入されたことを特徴とする胚； 上記の各プラスミ ドを用いた相同組換えにより得られた胚；及び、 哺乳類動物の 齧歯類由来、 好ましくはマウス由来の上記胚が提供される。 また、 上記の遺伝子 変異動物の細胞を単離し、 組織培養により培養することにより得られる初代培養 細胞又は継代培養細胞；並びに、 変異プレセユリンー 1蛋白を発現することがで き、 かつ該蛋白の発現が脳の大脳皮質周辺部において進行性の神経疾患を形成さ せるのに十分な量のアミロイ ド 蛋白を生産させることができる変異プレセユリ ンー 1遺伝子を相同組換法により動物の胚に導入する工程を含む、 ヒ ト以外の遺 伝子変異動物の作製方法；及び第 2 1 3番のイソロイシンがイソロイシン以外の アミノ酸に変異した変異プレセ二リン一 1変異蛋白を発現することができる上記 方法が提供される。
また、 被検化合物を投与した上記遺伝子変異動物と無投与の該動物との比較を 行う工程を含む、 アルツハイマー病の治療及び/又は予防に有用な物質の評価方 法が提供される。 この評価方法の代表例としてスクリーニング方法を挙げること ができる。 この発明の好ましい態様によれば、 記憶学習試験により比較を行う上 記評価方法；病理試験により比較を行う上記評価方法；大脳皮質周辺部での神経 病理に基づく病理試験により比較を行う上記評価方法；神経病理に基づく病理試 験による比較が、 当該脳の大脳皮質周辺部での肥大したダリオ一シスの減少の抑 制、当該脳の大脳皮質周辺部での 2—デォキシグルコース取り込みの減少の抑制、 及び当該脳の大脳皮質での 2—デォキシグルコース利用の减少の抑制からなる群 から選択される 1又は 2以上の項目の比較である上記評価方法；並びに、 当該動 物の生存期間、 探索行動、 及び移動行動からなる群から選ばれる 1又は 2以上の 項目について比較を行う上記評価方法が提供される。
さらに、 上記初代培養細胞又は継代培養細胞を被検化合物の存在下でイン - ビ 卜口細胞培養する工程を含む、 アルツハイマー病の治療及び Z又は予防剤の評価 方法； O S— 2型変異プレセニリンー 1蛋白をコードする変異プレセニリン一 1 遺伝子の部分塩基配列を用いることを特徴とする、 アルツハイマー病又はアルッ ハイマー病の発症可能性の診断方法；上記の各評価方法により選択されたァルツ ハイマー病の治療及び/又は予防に有用な物質；並びに、 上記物質を有効成分と して含むアルツハイマー病の治療及び/又は予防剤が提供される。 また、 上記の遺伝子変異動物と、 アミロイ ド前駆体タンパク （A P P ) の変異 蛋白質をコードする遺伝子を有しアミロイ ド i3タンパクの産生量の多い動物とを 掛け合わせることにより作製したハイプリッド動物およびその子孫であって、 好 ましくは、 掛け合わせにより作製した、 又は掛け合わせにより生まれたハイプリ ッドマウスおよびその子孫であって、 変異プレセ二リン遺伝子とアミロイ ド前駆 体タンパクの変異蛋白質をコードする遺伝子を有する遺伝子変異動物が提供され る。 この発明の好ましい態様では、 A P Pの変異蛋白質をコードする遺伝子を有 しアミロイ ド の産生量の多い動物が、 P S 1変異マウスである上記遺伝子変異 動物が提供される。 図面の簡単な説明
第 1図は、 マウス 'ジエノミック D N Aライブラリーよりクローユングして得 たマウスプレセニリン一 1のェキソン 8を含む染色体 D N A断片 Pひの制限酵素 地図である。
第 2図は、 部位特異的変異導入法によ O S— 2型変異が導入された部位を含 むマウスプレセニリン一 1遺伝子のェキソン 8の一部を持つプラスミ ド pmX- 1の 作製方法の工程を示した図である。
第 3図は、 ターゲッティングベクターの作製の工程を示した図である。
第 4図は、 ターゲッティングベクターの作製の工程を示した図である。
第 5図は、 ターゲッティングベクターの作製の工程を示した図である。
第 6図は、 ターゲッティングベクタ一の作製の工程を示した図である。
第 7図は、 ターゲッティングベクターの作製の工程と、 ターゲティングベクタ 一 p〇 S - 2 neoloxPの構造を示した図である。
第 8図は、 〇S— 2型変異プレセ二リン— 1遺伝子をもつ # 2マウス （雄） と CAG-cre # 13 マウスの F 4 (雌） を交配して得られた仔の尾の一部を切断した 試料から得られた染色体 D N Aを、 例 1 0に記載した方法で P C Rを行った産物 の 1 %ァガロースゲル電気泳動の結果を示した図である。 右側から 2番目と 4番 目のマウスは染色体 DNA上に neo 発現ュニットをもっていないことが示され ている。 図中、 最左端のレーンは分子量マーカーである。 [A] は、 染色体 DN A上の neo を欠損していることをバンドであり、 [B] は染色体 DN Aが野生型 であることを示すバンドであり、 [C] は染色体 DN A上の neo 存在しているこ とを示すバンドである。
発明を実施するための最良の形態
本発明の遺伝子変異動物の作製に用いられる変異プレセ二リン遺伝子 （本明細 書において 「変異プレセ二リン遺伝子」 という場合には、 変異プレセ二リン— 1 遺伝子及び変異プレセ二リン一 2遺伝子のいずれか片方又は両者を意味する）は、 変異プレセ二リン蛋白 （本明細書において 「変異プレセ二リン蛋白」 という場合 には、変異プレセニリンー 1蛋白及び変異プレセニリンー 2蛋白のいずれか片方、 又は両者を意味する） をコードする遺伝子である。 この変異プレセ二リン遺伝子 はアミロイ ド; 8蛋白の生産量を増加させる性質を有している。 本発明の遺伝子変 異動物は、 上記の変異プレセ二リン遺伝子が、 例えば相同組換え法により導入さ れた哺乳類動物である。 変異プレセ二リン蛋白に存在する変異は、 好ましくはァ ミノ酸残基の置換により生じたものであり、 その変異の個数は制限されないが、 好ましくは 1個である。
哺乳類動物由来のプレセ二リ ン一 1蛋白の全長は、 例えば E. Levy-Lahad, etal. , Science, 269, pp.973-977, 1995 に記載されている。 ヒ ト及びマウス由 来のプレセユリンー 1蛋白の全長及び該蛋白をコ一ドする DNA の一例をそれ ぞれ配列表の配列番号 1〜4に示した。 例えばマウス由来のプレセユリンー 1蛋 白においては、 変異部位は、 第 79番、 第 82番、 第 96番、 第 1 1 5番、 第 1 20番、 第 1 35番、 第 1 39番、 第 143番、 第 146番、 第 1 63番、 第 2 09番、 第 213番、 第 231番、 第 235番、 第 246番、 第 250番、 第 2 60番、 第 263番、 第 264番、 第 267番、 第 269番、 第 280番、 第 2 85番、 第 286番、 第 290番、 第 3 1 8番、 384番、 第 392番、 第 41 0番、 第 426番、 及び第 436番から選ばれる 1又は 2個所以上であることが 好ましい。
より好ましい変異は、 プレセ二リ ン一 1蛋白のアミノ酸配列、 より好ましくは マウス由来のプレセ二リン一 1蛋白のアミノ酸配列において、 A79V、 V 82 L、 V96 F、 Y1 1 5H、 Y1 1 5 C、 E 1 20K：、 E 1 20D、 N 1 35D、 Ml 39 V、 Ml 39 T、 Ml 39 I、 I 143 F、 I 143T、 M146 L、 M146V、 H 1 63Y、 H 1 63 R、 G209V、 I 21 3T、 A23 1 T、 A231 V、 L 235 P、 A246 E、 L 250 S、 A260V、 C 263 R、 P 264 L、 P 267 S、 R 269 G、 R 269 G、 R 269H、 E 280A、 E 280G、 A285V、 L 286V、 S 290 C、 E 31 8G、 G384A、 L 392V、 C410Y、 A426 P、 及び P 436 Sからなる群から選ばれる 1又は 2以上の変異である。 これらの変異のうち、 第 21 3番のアミノ酸が他の アミノ酸へ置換する変異 （本明細書において 「OS— 2型変異」 という場合があ る。） は特に好ましい変異であり、 例えば、 第 2 1 3番のイソロイシンがイソ口 イシン以外のアミノ酸に置換した変異、 又は第 2 1 3番のィソロイシンがスレオ ニンに置換した変異が特に好適である。
哺乳類動物由来のプレセ二リ ン一 2蛋白の全長は、 例えば Science, 269, pp.973-977, 1995 に記載されている。 変異部位としては、 第 141番及び Z又 は 436番が好ましく、 マウス由来の配列においては N 141 I及び Z又は M2 39 Vがより好ましい。 プレセ二リン一 1蛋白及びプレセ二リン蛋白一 2のいず れか片方、 又は両者に変異が存在していてもよい。
本発明の遺伝子変異動物は、 その染色体 DN A上に上記の変異プレセユリンー 1遺伝子及び Z又は変異プレセニリンー 2遺伝子を有することを特徴としている。 本発明の遺伝子変異動物は哺乳類動物であればよく、 その種類は特に限定されな いが、 例えば、 ゲッ歯類動物を好適に用いることができる。 特に好ましいのはマ ウスである。 本発明の遺伝子変異動物は、 変異プレセ二リン遺伝子を含む約 1 0 k b p程度の配列を有する DNAを用いてプラスミ ドを作製し、 そのプラスミ ド を胚性幹細胞に導入することにより、 細胞内で相同組えを起こさせることにより 作製することができる。
本発明の遺伝子変異動物は、 上記の変異プレセニリンー 1遺伝子及び/又は変 異プレセニリン一 2遺伝子が相同組換えにより導入された結果、 アミノ酸変異が ほとんどの場合 1個所で起こるという特徴がある。 いわゆるトランスジエニック 動物の場合には、 変異部分の D N A 配列がランダムに染色体 D N A 上に挿入さ れ、 多くの場合、 繰り返し配列の数十コピーが複数箇所に挿入されている。 本発 明の遺伝子変異動物ではこのような問題が回避されており、 アルツハイマー病の 病態を遺伝子レベルで正確に解析することが可能である。 もっとも、 本発明の遺 伝子変異動物においてマーカー等を含む D N Aを導入した場合は、 そのマーカー 部分及びマーカーを挿入するための配列などを含む場合もある。 例えば、 Sau3AI で切断可能な部位を挿入するために 1塩基を置換することができ、 P C R産物を Sau3AIで切断して電気泳動等で確認することができる。
本発明の遺伝子変異動物は、 その遺伝子変異の結果、 正常動物に比べて ]3アミ ロイ ド蛋白をより多量に生産するという特徴を有している。 本発明の遺伝子変異 動物により達成されるアミロイ ド 13蛋白の増加量は特に限定されないが、例えば、 記憶障害、 病理所見、 各種の神経障害の程度を評価した場合に正常動物との間で 実質的な差異が認められる程度であることが好ましい。
本発明により提供される D N A、 プラスミ ド、 培養細胞、 及び哺乳類動物細胞 の胚も同様に上記の変異プレセニリンー 1遺伝子及び/又は変異プレセユリンー 2遺伝子を有することにより特徴づけられる。 例えば、 変異プレセ二リン一 1蛋 白、 好ましくは O S— 2型変異プレセリニンー 1蛋白をコードする変異プレセ二 リンー 1遺伝子の c D N A若しくは染色体 D N Aの全長又は変異部分を含む D N A配列；上記 c D N A若しくは染色体 D N Aの全長又は変異部分を含む D N A配 列に Sau3AI 部位を導入した D N Aを含むプラスミ ド； O S— 2型変異プレセリ ニン一 1蛋白をコ一ドする変異プレセユリン一 1遺伝子のェキソン 8を含む染色 体 D N Aはいずれも本発明の範囲に包含される。 また、 これらの遺伝子又は D N Aにおいて 1又は 2個以上、 好ましくは 1個ないし 20 個、 より好ましくは 1個 ないし数個の塩基が置換したものも本発明の範囲に包含される。
本発明の DNA又はプラスミ ドの例としては、 例えば、
1)プレセユリンー 1の第 21 3番のィソロイシンがスレオニンに置換した変異プ レセユリンー 1蛋白をコードする変異プレセニリンー 1遺伝子からなる DNA， 及び該 DNAを含むプラスミ ド；
2)変異プレセニリンー 1蛋白のアミノ酸配列中の第 21 3番付近のアミノ酸をコ ードする DNA 塩基配列が、 次の配列：
5' - TGTGGTCGGGATGAT M GCCA N CCACTGGAAAGGCCC - 3'
(ただし、 Nは T以外の塩基を意味し、 Mは T又は Cを意味する。） である変異 プレセニリンー 1遺伝子からなる DNA、 又は該 DNAを含むプラスミ ド；
3) OS— 2型変異変異プレセ二リン一 1蛋白のアミノ酸配列中の第 2 1 3番付近 のアミノ酸をコードする DNA 塩基配列が、 次の配列：
5' -TGTGGTCGGGATGAT M GCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3'
(ただし、 Mは T又は Cを意味し、 XYZはイソロイシン以外をコードする 3塩 基のコ ドンを意味する。） である変異プレセニリンー 1遺伝子からなる DNA、 又は該 DNAを含むプラスミ ド；
4) Sau3AI 制限部位が導入された前記 1)〜4)のいずれかに記載の D N A、 又は該 DN Aを含むプラスミ ド；
5)プレセニリンー 1蛋白のァミノ酸配列中の第 2 1 3番のィソロイシンがスレオ ニンに置換された変異プレセ二リンー 1蛋白をコードする変異プレセリニン一 1 の遺伝子の c DN A若しくは染色体 DN Aの全長又は変異部分を含んだ配列に Sau3AI制限部位が導入された DNA、 又は該 D N Aを含むプラスミ ド；
6) 0 S— 2型変異マウスプレセニリンー 1蛋白をコードする変異マウスプレセ二 リン一 1遺伝子のェキソン 8と、 ΙοχΡ ではさまれたネオマイシン （neomycin) 発現ュニッ 卜とを含む DNA、 又は該 DNAを含むプラスミ ド；並びに
7)プレセユリンー 1蛋白のァミノ酸配列の第 21 3番のィソロイシンがスレオニ ンに置換した変異プレセリニリン 1蛋白をコードする変異プレセリニリンー 1 遺伝子のェキソン 8と、 loxP ではさまれたネオマイシン （neomycin) 発現ュニ ッ 卜とを含む D N A、 又は該 D N Aを含むプラスミ ド
などを挙げることができるが、 本発明の範囲はこれらの具体例に限定されること はない。
本発明により提供される胚又は細胞としては、 上記のプラスミ ド、 例えば PRL -104 又は PRL- 105 の塩基配列を有するプラスミ ドを挿入した胚又は細胞を挙げ ることができる。 また、 前記のプラスミ ドを用いた相同組換えにより、 プレセ二 リンー 1蛋白のアミノ酸配列の第 2 1 3番に変異を含む変異プレセユリンー 1蛋 白をコードする遺伝子を導入した細胞は、 本発明の好ましい細胞である。 胚又は 細胞は哺乳類動物由来であればその種類は特に限定されないが、 ゲッ歯類動物由 来、 好ましくはマウス由来の胚又は細胞を用いることができる。
[遺伝子変異動物の作製]
ヒ ト変異プレセ二リンをコードする D N Aを入手した後に、 本発明のプレセニリ ン遺伝子変異動物を以下に述べる工程に従って作製することができる。 以下、 哺 乳類動物としてマウスを用い、 ヒ ト変異プレセニリン遺伝子としてヒ ト ·変異プ レセニリンー 1遺伝子を用いる例について説明するが、 本発明の遺伝子変異動物 はこれらを用いて作製されるものに限定されることはない。 また、 この方法は本 発明の遺伝子変異動物の作製方法の一例であり、 本発明の遺伝子変異動物の作製 方法は以下の方法に限定されることはない。 ここに記載された一般的な方法及び 実施例に記載された具体的な方法を参照することにより、 また必要に応じてこれ らの方法に適宜の修飾ないし改変を加えることにより、 当業者は本発明の遺伝子 変異動物を容易に作製することができる。
まず、 P C R 法で用いるプローブを作製するために、 マウス 'ジエノミク D N Aライブラリーから、 作製しょうとする変異動物のプレセニリンー 1遺伝子の ェキソン 8中の変異させる部位を含む D N A 断片を得る。 マウス ' ジヱノミッ ク D N Aライブラリ一としては、 実施例で述べる 129 系統のマウスジエノミツ ク D N Aのほか、 いかなる系統のマウスのジエノミック D N Aライブラリーを用 いてもよい。 変異を導入しょうとする動物としてマウスを用いる場合には、 マウ ス 'プレセ二リン一 1遺伝子のェキソン 8を用いるが、 他の種類の動物において は適宜の部分を選択する必要がある。
つぎに、 上記工程で作製した D N A 断片をランダムプライミングでラベル化 (32 P ) した後、 ラベル化したプロ一ブを用いてジエノッミクライブラリーをス クリーニングし、 プレセ二リン一 1遺伝子のェキソン 8を含む染色体 D N A 断 片をクローニングする。 さらに、 クローユングしたプレセ-リン一 1遺伝子のェ キソン 8中の変異させる部分をサブクローニングした後に変異を導入する。
変異を導入したマウス .プレセニリンー 1遺伝子のェキソン 8を含む染色体 D N Aを含むターゲッティングベクターを作製する。 ターゲッティングベクターに は、 選択マーカーとして neo 発現ュニッ トを導入しておき、 G418 (抗生物質） を培地に添加することにより、 ベクターが染色体に導入されなかった細胞を死滅 させるようにしておく。 このターゲッティングベクターをエレク トロポレーショ ン法ゃ遺伝子を細胞内に導入する他の方法によって E S細胞に導入した後、 G418 存在下で E S細胞を培養し、 出現してくるコロニーを採取する。 得られたコロニ 一を二つに分け、 一つは培養 .継代あるいは凍結により保存しておき、 他の一つ を使用して相同組換えにより目的とするマウス ·プレセユリンー 1遺伝子のェキ ソン 8の変異が導入された E S細胞を調べる。 目的とする変異が導入された E S 細胞のコロニーの保存してある分を取り出して以下の工程に用いる。
別途、 妊娠マウスから 8細胞期胚を取り出し、 上記の保存してあつた約 2 0個 位の E S細胞をまぶした後、 偽妊娠させたメスマウスの子宮に導入する。 生まれ てきた仔の中から毛色がキメラのマウスを選択する。 キメラマウスを C57BL/6系 統と交配させ、 生まれてきた仔の中から毛色がァグチのものを選択することによ り、 目的とする変異の入ったマウスを取得することができる。 なお、 このマウス は変異の入ったプレセニリンー 1遺伝子に関してはへテロであり、 もう 1本の染 色体にあるプレセユリンー 1遺伝子は変異のない野生型である。
マウス ·プレセ二リン一 1遺伝子のェキソン 8を含む染色体 DN Aをマウス · ジエノミック DN Aライブラリーからクローニングするためのプローブを作製す るための出発材料としては、 実施例に具体的に述べる方法のほか、 塩基配列が明 らかにされているマウスゃヒ ト等の他の哺乳類動物由来のプレセニリンー 1遺伝 子の c DNAを用いてもよい。 プローブとなる DNA断片を得る方法としては、 実施例に述べる P CR法による増幅法のほか、 染色体 DNAのマウス ·プレセ二 リンー 1遺伝子のェキソン 8に対応する部分を含むマウス染色体 DNA、 又は塩 基配列が明らかにされているマウスゃヒ ト等の他の哺乳類動物由来のプレセニリ ンー 1遺伝子の c DNAを含むプラスミ ドを大量に調製する方法などを採用する ことができる。 また、 このプラスミ ドを制限酵素で切断した後、 ァガロースゲル 電気泳動等の手段を用いて DNA断片として必要な部分を分取することによって も目的の DN A断片を得ることができる。
DN A断片をラベル化する方法としては、 実施例に述べるランダムプライミン グ法のほか、 32P- dNTP存在下に PCRを行う方法などを用いることができる。 ま た、 予めラベルしたオリゴデォキシヌクレオチドをプライマーとして使用するこ とにより、 P CR法あるいはランダムプライミング法でラベル化してもよい。 ラ ベル化には、 実施例に示すラジオアイソ トープのほか、 ピオチン一アビジン (Biotin— Avidin) fc0レヽ ¾ァノレ力リフ才スフ： 7タ―ゼ (alkal inephosphatase) 等を用いる化学発光法も利用できる。 また、 T3又は T7 RNAポリメラーゼを用 いてラベルした RNA断片をプローブとして使用できる。 この他、 プローブを作 製する方法は種々知られておりが、 いかなる方法を採用して目的とするプローブ を取得してもよい。
目的とする変異を DN Aに導入する方法としては、 実施例に具体的に示した方 法のほか、 M13 等のファージ由来のプラスミ ド又は ung 大腸菌を用いて複製し たプラスミ ドを用いて、 目的の変異を導入したい部分に変異を導入するために合 成したオリゴデォキシヌクレオチドを相補的に （変異導入部位の塩基のみは相補 的ではない） 結合させ、 これをプライマーとして D N Aポリメラーゼでヘテロな 二本鎖 D N Aプラスミ ドを作製し、 このプラスミ ドで大腸菌（ung+) を形質転換 することにより目的の変異を持ったプラスミ ドを取得することができる。 また、 目的とする変異を導入するために塩基を変更してあり、 かつ互いに相補的にァニ ールすることができ、 両端に制限酵素部位が生じるように設計された二本のオリ ゴデォキシヌクレオチドを合成し、 変異を導入すべきプラスミ ドに D N Aリガ一 ゼを用いて結合させる方法 （カセッ ト法）を採用して、 目的の変異を持ったブラ スミ ドを取得することもできる。 これらの方法を目的に応じて適宜修飾ないし改 良することにより、 一層効率的に目的を達成できる場合がある。 これらの他、 変 異を導入する方法は当業界で利用可能な種々の変異導入法が知られており、 いず れの方法によっても目的を達成できる。
ターゲッティングベクターは、 変異を導入したマウス染色体 D N A断片、 選択 マーカーをコ一ドする D N A断片、 これの転写を制御するためのプロモーター、 及びターミネータ一を含む選択マーカー発現ュニットを必須要素として含んでい ることが好ましい。 変異を導入したマウス染色体 D N A断片は、 E S細胞内で相 同組換えを起こすために必要な部分であり、 変異を導入した箇所を挟んで前後の マウス染色体 D N A断片が必要である。すなわち、ターゲッティングベクターは、 変異させた塩基のみが本来のマウス染色体 D N Aとは異なる D N A断片を持って いる。 その断片の長さは 1 0 kbp 程度が好ましいが、 一般的には多少の長さの 増減は許容される。 もっとも、 あまりに短い場合には、 E S細胞内での相同組換 えの頻度が低下する場合がある。
選択マーカーとしては、 ネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝 子等のポジティブ選択マーカー、 単純へルぺスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝 子、 ジフテリア毒素 Aフラグメント等のネガティブ選択マーカーなどが知られて おり、 培養細胞株の選択マーカーとして使用されている選択マーカーは E S細胞 において何れも使用することができる。 ネガティブ選択マーカーを使用する場合 は、 ターゲッティングベクターのマウス染色体 D N A断片の外に挿入することが 必要であり、 ポジティブ選択マーカーを使用する場合は、 その発現ユニッ トをタ ーゲッティングベクターのマウス染色体 D N A断片の中のィントロン中に挿入す ることが必要である。 ポジティブ選択マーカーをェキソン中に挿入すると、 挿入 された遺伝子は機能を失うのが通常であり、 最終目的である変異の影響を調べる ために作製するマウスを得ることができない場合がある。
E S細胞株としては 129 系統のマウス由来の株が多く使用されているが、 こ の系統の E S細胞としては、 実施例で述べる R1 のほか、 D3、 CCE 、 Jl、 AB1 な どの E S細胞を用いてもよい。 また、 例えば C57BL/6 系統のマウス等、 129 系 統以外のマウス由来の E S細胞も使用できる。 E S細胞にターゲッティングべク ターを導入する方法としては、 実施例で述べるエレク トロポレーション法が一般 的であるが、 リン酸カルシウム共沈法やリボソーム法など、 培養細胞株へのプラ スミ ド導入に利用可能な方法であれば何れの方法を採用してもよい。 ターゲッテ ィングベクター導入後の E S細胞を選択マーカー存在下で培養すると、 生き残つ てコロニーを形成する E S細胞は相同組換えを起こしている可能性がある。 これ らのコロニーを形成した E S細胞の中から相同組換えを起こしている細胞を調べ る方法として一般的には P C R法が用いられるが、 プローブとして使用できる D N A断片、 R N A断片、 合成オリゴデォキシヌクレオチド、 又は抗体などを使用 することも可能である。
E S細胞を発生初期の受精卵に混入させた後、 発生を継続させ、 精子あるいは 卵子が E S細胞由来のマウスを得ることができる。 相同組換えを起こした E S細 胞を発生初期の受精卵に混入させる方法としては、 実施例に述べる方法のほか、 胞胚期の受精卵を妊娠マウスより取り出し、 これに注入用ピぺッ 卜で 10〜20 個 の E S細胞を注入した後、 偽妊娠させたメスマウスの子宮に移植することにより 発生を継続させて仔を得る方法などを採用することができる。
E S細胞を混入させる際に使用する発生初期の受精卵はいずれの系統のマウス から採取したものでもよいが、 混入させた E S細胞が生まれた仔に取り込まれて いるかどうか分かりやすいように、 E S細胞の元になつている系統のマウスとは 毛色の異なる系統のマウスの受精卵を使用するのが好ましい。 例えば、 実施例に おいて使用した E S細胞はァグチ色 （agouti 色、 淡褐色） の 129 系統であり、 受精卵が由来するマウス （C57BL/6 系統） は黒色の系統である。 これらを用いて 生まれてきた仔の中からキメラの毛色をしている仔を選択することにより、 E S 細胞由来の細胞を持っている仔を容易に選択することが可能である。 この場合、 ァグチ色の割合の多レ、仔ほど生殖細胞が E S細胞由来となっている可能性が高レ、。 なお、 偽妊娠させるマウスはどの系統のマウスでもよい。
得られたキメラマウスを交配させて目的とする変異導入マウスを取得するため に使用するマウスも、 E S細胞の元になつている系統のマウスとは毛色の異なる 系統のマウスを使用するのが好ましい。 通常、 キメラマウスのォスと他系統のメ スを交配させ、 ァグチ色の仔を得ればそれが目的とする変異をへテ口の状態で持 つているマウスである。 O S— 2型変異のプレセ二リン 1遺伝子を持つマウス は、 lox P配列で挟まれた neo 発現ュニッ トを有しているため、 ere 遺伝子導 入トランスジエニックマウスとの交配により neo 発現ュニッ トが取り除かれた マウスを得ることができる。
本明細書の従来の技術で述べたように、 プレセニリンー 1蛋白及びプレセニリ ンー 2蛋白の突然変異は、 A 3 42 の増加により老人斑の形成を促進し、 ァルツ ハイマ一病を発症させると考えられる。 一方、 家族性アルツハイマー病の原因で ある A P Pの突然変異体をコ一ドする遺伝子を導入したトランスジエニックマウ スにおいて、 脳内にアミロイ ド沈着を生じるマウスが報告されている （Games D. 等： Nature 373卷、 523頁、 1995年。 Hsiao K. 等： Sc ience 274卷、 99頁、 1996年。 St.urchler - Pierrat C.等： Proに Nat l. Acad. Sc i. U. S. A. . 94卷、 24 号、 13287頁、 1997年）。 これらのトランスジエニックマウスでは、 脳内での A i3の産生量が増加しているためにアミロイ ド沈着が生じていると考えられている。
A P Pの突然変異体をコードする遺伝子が導入され、 脳内にアミロイ ド沈着を 生じるトランスジエニック動物（導入遺伝子に関してホモであってもヘテロであ つてもよレ、）と、 本発明の PS 1遺伝子変異動物（変異遺伝子に関してホモであつ てもへテロであってもよレ、）とを交配することにより、 ハイブリッ ド動物を作製 することができる。 動物としてはマウスが好ましい。 交配に際して、 どちらの側 の動物がォスであってもよい。
得られる仔の尾の一部を採取し、 染色体 D N Aを抽出する。 抽出した染色体 D N Aを基質として、 A P Pの突然変異体をコードする遺伝子の突然変異部位を挟 むように設計した塩基配列を持つ二本のオリゴデォキシヌクレオチドおよび変異 PS 1遺伝子の変異部位を挟むように設計した塩基配列を持つ二本のオリゴデォキ シヌクレオチドをプライマーとした P C Rを行う。
P C R産物のァガロースゲル電気泳動を行い、 バンドの有無、 バンドのゲル上 での易動度、 変異部位を含む塩基配列を持つオリゴデォキシヌクレオチドを用い たハイプリダ一ゼーションによる変異を含むバンドの確認等により、 抽出した染 色体 D N Aに、 A P Pの突然変異体をコードする遺伝子および本発明の変異 PS1 遺伝子が含まれているかどうかを調べることができる。 P C Rは実施例の例 8に 記載した方法に準じて行うことができる。 P C Rのプライマーに使用するオリゴ ヌクレオチドの塩基配列は、 A P Pの突然変異体をコ一ドする遺伝子あるいは変 異 PS 1遺伝子を検出できるものであればいかなるものでもよい。 P C Rの結果 に基づいて、 A P Pの突然変異体をコードする遺伝子を有し、 かつ、 本発明の変 異 PS1遺伝子を持つ動物を選抜することにより、 両遺伝子をそれぞれヘテロで持 つ動物を得ることができる。
A P Pの突然変異体をコードする遺伝子および本発明の変異プレセニリン— 1 遺伝子の両遺伝子をホモで持つ動物を得るためには、 この両遺伝子をそれぞれへ テ口で持つ動物のうち、 適当なォスおよびメスを選んで交配することにより得ら れる仔の中から、 両遺伝子をホモで持つ個体を選択すればよい。 A P Pの突然変 異体をコードする遺伝子をホモで持つことを確認するためには、 仔の尾の一部を 採取し、染色体 D N Aを抽出し、抽出した染色体 D N Aを制限酵素で切断した後、 ァガロースゲル又はアクリルアミ ドゲルを用いて電気泳動を行なう。 その後、 メ ンブランフィルターに D N Aをブロッティングした後、 A P Pの突然変異体をコ 一ドする遺伝子と特異的に結合できる塩基配列を持つオリゴデォキシヌクレオチ ドをプローブとしてサザンプロッティングを行い、 得られるバンドの濃さを測定 すればよい。
この方法に準じて本発明の変異プレセニリンー 1遺伝子をホモで持つことを確 認することができる。 サザンブロッティングにプローブとして用いるオリゴデォ キシヌクレオチドは、 放射性同位元素、 蛍光色素等サザンブロッテイングに通常 使用される手段により標識して用いることが可能である。 このようにして、 A P Pの突然変異体をコードする遺伝子および本発明の変異プレセ二リン— 1遺伝子 の両遺伝子を持つマウスを作製することができる。 このような方法で作製したハ イブリツドマウスは、 脳内のアミロイ ド j3タンパクの生産がより多く、 また、 ァ ミロイ ドの沈着が促進されているという特徴がある。
本発明の遺伝子変異動物、 変異プレセ二リン遺伝子を導入した細胞、 変異プレ セニリン遺伝子を含むプラスミ ド等を用いて、 アルツハイマー病の予防及び 又 は治療に有用な物質をスクリーニングし、 その有用性を評価することができる。 健常な哺乳類動物ではアミロイ ド |3の蓄積は極めて徐々に生じるが、 本発明の遺 伝子変異動物は、 アミロイ ド ;3の産生が多いという特徴を有している。 従って、 本発明の遺伝子変異動物に種々の被検物質を投与し、 非投与群の動物又は対照物 質投与動物と比較することにより、 ァルツハイマー病の予防及び/又は治療に有 用な物質を評価することができる。 評価の代表例として被検物質のスクリーニン グを挙げることができ、 試験項目としては、 症状、 病理所見、 薬理試験等を採用 する二とができる。
また、 本発明の細胞を用いる場合には、 本発明の動物から分離して初代培養細 胞として用いることができるほか、 その初代培養細胞をウィルス等で不死化した 後、 継代培養して数日毎に当該培養細胞の一部を取り出して再び新しい組織培養 液で培養することにより、当該細胞を安定して継代培養細胞とすることができる。 なお、 本発明の細胞には、 遺伝子変異動物から分離した神経細胞などの初代細胞 のほか、 初代細胞を継代培養していわゆるライン化された継代培養細胞も包含さ れる。 本発明の細胞として神経細胞を用いる場合には、 細胞が変異プレセ二リン 一 1蛋白を発現する結果としてアミロイ ド i3蛋白が多量に発現される。 このよう な神経細胞のィンビトロの培養系に被検物質を添加した後、 例えば細胞の生存期 間や一定期間経過後の生細胞数などを比較することにより、 アミロイ ド i3蛋白の 蓄積が関与する神経細胞死を予防又は遅延させる物質をスクリーユングし、 その 有用性を評価することができる。 実施例
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲はこれ らの例に限定されることはない。 実施例中、 プレセ二リン一 1遺伝子を P S— 1 と略する場合がある。
例 1 ：マウス .プレセ二リン一 1 (PS1) 遺伝子のェキソン 8を含む染色体 DN Aのクローニング
マウス P S 1遺伝子のェキソン 8を含む染色体 DN A断片取得用のプローブ作 製のため、 まず下記の 2 本のオリゴデォキシヌクレオチドを合成した。
PR-8-L : 5'- GGTCCATTCGGGGAGGTACTTG A- 3' (23mer) この 2本のオリゴデォキシヌクレオチドをプライマーとして、 129 S V Jマ ウスジエノミックライブラリー （Stratagene 社製） より抽出した DNAを用い て PC Rを行い、 得られた約 130bp の増幅された DNA断片を得た。 この断片 を :i 2P— d C TP存在下、 ランダムプライムラベル法によりラベルしたものを プローブと し、 1 29 SV Jマウスジヱノ ミックライブラリーをスクリーニング した。 得られた陽性ファージクローンの塩基配列を調べ、 目的とするマウス P S 一 1遺伝子のェキソン 8を含む染色体 DN Aを持ったクローンであること確認し た。 このクローユングした染色体 DN Aを P αとし、 その制限酵素地図を作製し た （図 1)。 例 2 ：突然変異導入用プラスミ ドの作製：
P aを持つクローン化したファージょり D N Aを抽出し、 Sal Iで切断後、 1. 0% ァガロースゲル電気泳動を行い、 ρ αを回収した。 Ρ αを Pst Iおよび Xba Iで 切断後、 1 %ァガロースゲル電気泳動を行い、 マウス P S 1の第 2 1 3番目のァ ミノ酸であるィソロイシンをコードしている塩基を含む約 6 0 O bp の D N A断 片を回収し、 これを X- 1とした。 X- 1を予め Pst Iおよび Xba lで切断したプ ラスミ ド pBluescript I I KS + (Stratagene 社製） と T 4リガーゼを用いて結 合させ、 大腸菌を形質転換してプラスミ ド pX- 1を得た。 例 3 ： O S - 2型突然変異の導入：
プラスミ ド pX- 1 に下記の 2本のオリゴデォキシヌクレオチド PRL - 104 および PRL-105 を用いて、 O S— 2型突然変異および制限酵素 Sau3AI 部位を新たに導 入した。 なお、 PRL- 104 および PRL-105 は何れも 36mer で、 互いに相補性とな つている。
PRL-104 ： 5' - TGTGGTCGGGA TGATC* GCCA C CCACTGGAAAGGCCC - 3'
PRL-105 ： 5' - GGGCCTTTCCAGTGG G TGGCG* ATCATCCCGACCACA- 3'
(下線を付した塩基は〇S— 2型変異導入のため本来の塩基を変異させてある ：
PRL-104 では本来は T、 PRL-105 では本来は Aである。 また、 アステリスクを付 した塩基は Sau3AI 部位導入のため本来の塩基を変異させてある ： PRい 104 では 本来は T 、 105 では本来は Aである）。
変異の導入は QUICK CHANGE S ITE- DIRECTED MUTAGENES ISKIT (St ragene社製） を使用し、 同社のプロ 卜コールに従って実施した。 塩基配列を調べて変異が正し く導入されていることを確認し、 この変異を持った X- 1 を mX-1とし、 mX - 1を持 つプラスミ ドを p mX-1 とした （図 2 ) 例 4 ： O S— 2型変異を持った染色体 D N Aの作製
例 1で得たマウス PS- 1のェキソン 8を含む P αを Nco Iで切断後、 4種類の d NT P s存在下、 T 4 DNAポリメラーゼで平滑末端とした。 ついで、 Asp718I で切断後、 1 %ァガロースゲル電気泳動を行い、 ェキソン 8を含む約 5kbp の D NA断片を回収した。 この DNA断片を、 予め Sma I および Asp718 Iで切断し たプラスミ ド pBluescript II KS+と T 4 D N Aリガーゼで結合し、 大腸菌を形 質転換してプラスミ ド pSB-0を得た。 pSB- 0を Xba Iで完全に切断した後、 Pst I で部分消化を行った。 一方、 pmX-1 を Xba I および Pst I で切断した後、 1% ァガロースゲル電気泳動を行い mX-1 を回収した。 上記の Pst I 断片に mX-1 を T4DNAリガーゼで結合させ、 大腸菌を形質転換した。 形質転換した大腸菌の コロニーを調べ、 プラスミ ド pSB-0 の X-1 部分が mX- 1 と置換されているプラス ミ ドを持つコロニーを選択し、 回収したプラスミ ドを pmSB - 0とした （図 3)。 また、 P αを BamH Iおよび Sal Iで切断後、 1 %ァガロースゲル電気泳動を 行い、 約 7kbp のェキソン 8を含む DNA断片を回収した。 予め Bam H I およ び Sal I で切断した pBluescript II KS+をこの断片に T 4 D N Aリガーゼで 結合させ、 大腸菌を形質転換してプラスミ ド pSB-1を得た。 pmSB-0を Nco I で 切断後、 4種の dNTP s存在下 T4DNA ポリメラーゼで平滑末端化し、 更に Xbal で切断後、 1 %ァガロースゲル電気泳動を行った。 回収したェキソン 8を 含む約 2. 2kbp の DNA断片 XNと pSB- 1 を Xba I および Pst I で切断後、 1 %ァガロースゲル電気泳動を行った。 回収したェキソン 8を含まない約 2. 3 kbpの DN A断片 P Xを T 4 DNAリガーゼで結合させた。 これを、予め Xba Iで 切断してから 4種の dNTP s存在下に T 4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し た後、 T 4 DNAリガ一ゼで再結合させ、 さらに Sma I および Pst I で切断し たプラスミ ド pBluescript II KS+と T 4 D N Aリガーゼを用いて結合させ、 大 腸菌を形質転換した。 形質転換した大腸菌のコロニーを調べ、 DN A断片 NXと XPが Xba I 部位で結合した DNA断片を 1個だけ含むプラスミ ド pmSB- 0' を 得た （図 4) 例 5 ： ターゲッティングベクターの基本骨格の作製 プラスミ ド pmSB- 0' を Xba I 部位に Eag I部位を導入するため次の塩基配列 を持つオリゴデォキシヌクレオチドを合成した。
5' -CTAGACGGCCGT-3' (12 mer)
このオリゴデォキシヌクレオチドは CGGCCG 部分の相補性を持つ塩基配列を介 してァニールすることができ、 Xba I で切断した部位に挿入すると以下のように なる。
5 ' 一 TCTAGACGGCCGTCTAGA— 3 '
3 ' 一 AGATCTGCCGGCAGATCT— 5 '
Xb a I Ea g I Xb a I
プラスミ ド pmSB- 0' を Xba I で切断後、 このオリゴデォキシヌクレオチドを 加え T4DNAリガーゼで結合させ、大腸菌を形質転換し、プラスミ ド pmSB - 0' の Xba I 部位に Eag I 部位が挿入されたプラスミ ド pmSB- 0' eag を得た。 この pmSB 0' eagを Nco I および Sal I で切断後、 1 %ァガロースゲル電気泳動を行 レ、、 ェキソン 8を含む約 5 .3 kbp の DNA断片 S Nを回収した。 また、 pSB- 1 を BamHI および Nco I で切断後、 1 %ァガロースゲル電気泳動を行い、 ェキソ ン 8を含まない約 2kbp の DNA断片 NBを回収した。 SNおよび NBを T4D NAリガーゼで結合させ、 BamH I および Sal I で処理することにより、 両 DN A断片が Nco I部位で結合した DN A断片を得た。 この DN A断片を、予め、 Not I で切断後マングビーンヌクレアーゼ処理により平滑末端化し、 T 4 DNAリガ —ゼで再結合させることにより Not I 部位およびそれに重なっている Eag I 部 位を壊し、 さらに BamH Iおよび Sal Iで切断したプラスミ ド pBluescript II KS 十と T4DN Aリガーゼを用いて結合させ、大腸菌を形質転換してプラスミ ド pA を得た （図 5)。 例 6 ： ターゲッティングベクタ一の作製
プラスミ ド pPNT (Victor し J.等： Cell65卷、 1153頁、 1991年） を Xho I お よび BamH Iで切断後、 T 4 D N Aポリメラーゼを用いて平滑末端化し、 1 %ァ ガロースゲル電気泳動を行った。 回収した neo 発現ュニッ トを含む約 1.7kbpの DNA断片を、 予め Bam HIで切断後、 T 4 D N Aポリメラーゼを用いて平滑末 端化したプラスミ ド pBS246 (ギブコ BRL社製） に対して T 4 D N Aリガーゼ を用いて結合させ、 大腸菌を形質転換してプラスミ ド pBS246neo を得た。 この プラスミ ドを Not I で切断後、 1 %ァガロースゲル電気泳動を行い、 ΙοχΡ配列 に挟まれた neo 発現ュニットを持つ約 2 kbp の DNA断片を回収した。 この D NA 断片を、予め Eaglで切断した pAと T 4 D N Aリガーゼを用いて結合させ、 大腸菌を形質転換した。 形質転換した大腸菌のコロニーを調べ、 neo 遺伝子の方 向が PS-1遺伝子と同方向になっているプラスミ ド pBを得た （図 6)。
プラスミ ド pBを BamH Iおよび Sal Iで切断後、 1 %ァガロースゲル電気泳動 を行い、 OS— 2型変異を持ち、 かつ ΙοχΡ配列に挟まれた neo 発現ュニットを 持つ DN A断片 Cを回収した。 また、 Pひを Sal I および BamH I で切断して 得た約 6.5 kbpの DNA断片を pBluescript II KS +へサブクローニングして得 たプラスミ ド pSB- 2 を、 Hind IIIおよび BamH Iで切断後、 1%ァガロースゲ ル電気泳動を行い、 約 4kbp の DNA断片 Dを回収した。 DNA断片 Cおよび D を T 4 DN Aリガーゼを用いて結合した後、 Hind III および Sal I で切断し、 DNA断片 Cと Dが Bam H I 部位で結合した D N A断片を得た。 この DNA断 片を、 予め Hin d III および Sal I で切断した pBluescript II S +と T4D NAリガーゼを用いて結合させ、 大腸菌を形質転換し、 ターゲッティングベクタ 一 pO S— 2neoloxPを得た （図 7)。 例 7 ： E S細胞へのターゲッティングベクターの導入
以下の実施例で記載する細胞の培養は、 全て 37°Cの 5 % CO インキュベータ 一中で行った。 1 5%FB Sおよび 10:i units/ml のし I F (ESGR0 社製） を添加 した D M E M培地 （以下、 E S用培地と略す） で維持している E S細胞 R 1に対 して、 エレク ト口ポレーシヨン （electroporation) 法によりターゲッティング ベクターの導入を行った。 エレク トロポレーシヨンを実施する前日に新鮮な E S 用培地と交換した R 1細胞を集め、エレク トロポレーション用溶液（20 mM HEPES, H 7. 05, 137 mM NaCl, 5 mM KC1, 0. 7 mM Na2HP04, 6mM dextrose) で洗浄した。 107個の R l細胞を、 Not Iで線状化した 25 // gのターゲッティングベクター p O S - 2 neoloxP と 0. 8 ml のエレク トロボレ一シヨ ン用溶液を用レ、、 エレク ト 口ポレーシヨン用キュべッ ト中で混合した。 1〜 2分後、 Bio- Rad GenePulser (バ ィォラッド社製） を使用してパルスを与えた （パルス条件： 240V, 500 μ F)。 遠心分離により E S細胞を回収し、 30 mlの E S用培地に懸濁した。 予め 8 mlの E S用培地中にフィーダ一細胞を播いてある 10 ml デイシュ 1枚当たりこの E S細胞懸濁液 2 ml を加え、 1 2〜1 8時間後に力価 150 /i g/ml の G 4 1 8を 添加して、 1週間培養した。 なお、 フィーダ一細胞としては、 本発明者が HS 1 ノックアウトマウス （I. Taniuchi 等； EMBO J. 14卷、 3664頁、 1995年） の雄 と野性型の ICR 系統の雌を交配し、 1 2〜1 3日胚から分離して樹立した線維 芽細胞を使用した。 例 8 ：相同組換えを起こした E S細胞の取得
例 7において、 G418 の添加後 1週間培養して生じてきた E S細胞のコロニー を採取した。 各コロニーを二分し、 一つは培養を継続した。 もう一つは相同組換 えを起こしているクローンを選択するため P B Sで洗浄し、 Proteinase K 処理 を行った後、 染色体 D N A を回収して P C R によりクローンを選択した。 P C Rにおいて用いた合成プライマーの塩基配列は次の通りである。
Prsnl-2 ： 5' -CCCAACTCTATTTCTACCCTCGTTCATCTG-3'
(構築したターゲッティングベクタ一の外側に有る塩基配列）
PKG-1 ： 5' -TAGTGAGACGTGCTACTTCCATTTGTCACG-3'
(neo 発現ュニッ 卜中の塩基配列） P C R の実験条件は、 93°Cで 30秒、 60°Cで 1分、 68°Cで 3分を 1サイクルと して 3 5サイクル行い、 P C R 産物の 1 %ァガロースゲル電気泳動を行い、 予 想される位置にバンドを生じたクローンを陽性と判断した。 ここで陽性と判断さ れたクローンはオリゴデォキシヌクレオチド PRL- 101 および PRL- 102 を用いた P C Rを行い、 P C R 産物を Sau3AIで切断した後、 2°/。ァガロースゲル電気泳動 を行い、 バンドが二分されていることから変異が導入されていることを確認して 正しく相同組換えを起こした E S細胞を選択した。
PRL-101 および PRL- 102 の塩基配列は次の通りである。
PRL-101 ： 5' -TGCTGGAGGAAAATGTGTTATTTAAGAGCA-3'
PRL-102 ： 5' -TACTGAAATCACAGCCAAGATGAGCCATGC-3' 例 9 ： ノックインマウスの取得：
相同組換えを起こしていることが確認された E S細胞の培養を 4日間継続した 後、 細胞をトリプシン処理によりバラバラに分散した。 マウス BDF1 系統の雄を 掛け合わせた同系統の雌より 8細胞期胚を取り出し、 透明帯を外した後、 バラバ ラにした上記 E S細胞を接着させた （2 0 E S細胞 Z 8細胞期胚 1個 ）。 これを 偽妊娠処理した雌マウスの子宮に移し、 胎児の発生を継続させることによりキメ ラマウスを得た。 このキメラマウスの雄を C57BL/6 の雌と交配し、 生まれた仔 のうちァグチ色のものを選び、 その尾の一部を切断した試料から染色体 D N Aを 抽出した。 PRL-101 および PRL-102 を用いて P C Rを行った後、 Sau3AIで P C R 産物を切断し、 2%ァガロースゲル電気泳動を行い、 切断されたバンドの存在 を調べることにより O S— 2型変異を持っていることを確認した。 確認されたマ ウスのうち雄を一匹選び # 2とした。 例 1 0
例 9で得られたノ ックインマウス # 2はターゲッティングべクタ一由来の ΙοχΡ で挟まれた neo 発現ュニッ トをヘテロの状態で有している。 このマウス # 2 (雄性、約 4ヶ月齢）を CAG- crettl3 (K. Sakai等； Biochem. Biophys. Res. Commun. 217 : 318, 1997) トランスジエニックマウスの F 4の雌 （ 2ヶ月齢：導入した ere 遺伝子はへテロの状態となっている。） と交配し、 例 8で述べた条件でオリゴデ ォキシヌクロチド PRL-100, PRL- 102及び PGK-1 を用いて P C R を行い、 neo発 現ュニットが除かれたマウスを選択することにより、 neo 発現ュニットを持たな い O S— 2型変異のノックインマウスを取得した （図 8 )。 本マウスは O S— 2 型変異に関してへテロであり、 また、 一つの ΙοχΡ を保持している。 なお、 P C R に使用した PRL-100、 PRL-102及び PGK-1の塩基配列は以下のとおりである。 PRL-100 : 5' -GGT CCA TCC CAG CTT CAC ACA GAC AAG TCT - 3'
PRL-102 : 5' -TAC TGA AAT CAC AGC CAA GAT GAG CCA TGC- 3'
PKG-1 : 5' -TAG TGA GAC GTG CTA CTT CCA TTT GTC ACG - 3' 産業上の利用可能性
本発明の遺伝子変異動物は、 変異プレセリニリン 1遺伝子を有するために、 正常動物 （その変異を持たない動物） に比較してアミロイ ド ]3の生産量が多く、 大脳海馬神経細胞死や脱落が早期に起こりアルツハイマー症状を呈する。従って、 本発明の遺伝子変異動物を用いて、 アルツハイマー病の予防及び Z又は治療に有 用な物質のスクリ一二ングなどを行うことができ、 有用性の評価を行うことがで きる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 変異プレセ二リン遺伝子を有するヒ ト以外の遺伝子変異動物。
2. プレセ二リン一 1蛋白のアミノ酸配列中の 1つのァミノ酸が他のァミノ酸に 置換した変異プレセ二リン一 1蛋白をコードする DN A配列を含む変異プレセ二 リンー 1遺伝子を有する請求の範囲第 1項記載の遺伝子変異動物。
3. プレセ二リン一 1蛋白のアミノ酸配列において、 次の番号：
第 79番、 第 82番、 第 96番、 第 1 1 5番、 第 1 20番、 第 1 35番、 第 1 3 9番、 第 143番、 第 146番、 第 1 63番、 第 209番、 第 213番、 第 23 1番、 第 235番、 第 246番、 第 250番、 第 260番、 第 263番、 第 26 4番、 第 26 7番、 第 269番、 第 280番、 第 285番、 第 286番、 第 29 0番、 第 3 1 8番、 384番、 第 392番、 第 410番、 第 426番、 及び第 4 36番からなる群から選ばれる 1又は 2以上の箇所のアミノ酸が他のアミノ酸に 置換したァミノ酸配列を有する変異プレセニリンー 1蛋白をコードする DNA配 列を含むプレセニリンー 1変異遺伝子を有するヒ ト以外の遺伝子変異動物。
4. プレセニリン一 1蛋白のァミノ酸配列において、
A 79V、 V82し、 V96 F、 Y1 1 5H、 Y 1 1 5 C、 E 1 20K、 E 1 2 0 D、 N 1 35 D、 Ml 39 V、 Ml 39 T、 Ml 39 I、 I 143 F、 1 14 3 T、 M146 L、 M146V、 H 163Y、 H1 63 R、 G 209 V 1 21 3 T、 A23 1 T、 A231 V、 L 235 P A246 E、 L 250 S、 A 26 0V、 C 263 R、 P 264 L、 P 26 7 S、 R269 G、 R269G、 R 26 9H、 E 280A、 E 280G、 A285V、 L 286 V、 S 290 C、 E 31 8 G、 G384A、 L 392V、 C410Y、 A426 P、 及び？ 436 S、 (各アルファべットは一文字表記法によるアミノ酸を意味しており、 数字はプレ セニリン一 1蛋白の N末端からのァミノ酸番号を示し、 数字左側に示す野生型の ァミノ酸が右側のアミノ酸に置換されていることを示す。）
からなる群から選ばれる 1又は 2以上の変異を有する変異プレセユリンー 1蛋白 をコードする D N A配列を含む変異プレセユリンー 1遺伝子を有するヒ 卜以外の 遺伝子変異動物。
5 . プレセ二リン一 1の第 2 1 3番のィソロイシンがィソロイシン以外のァミノ 酸に置換した変異プレセ二リン一 1蛋白をコードする D N A配列を含む変異プレ セニリン一 1遺伝子を有するヒ ト以外の遺伝子変異動物。
6 . プレセ二リン一 1の第 2 1 3番のイソロイシンがスレオニンに置換した変異 プレセニリン一 1蛋白をコードする D N A塩基配列を含む変異プレセユリンー 1 遺伝子を有するヒ ト以外の遺伝子変異動物。
7 . プレセニリン一 1蛋白のアミノ酸配列中の第 2 1 3番のァミノ酸の近辺をコ ードする D N A配列が、 次の配列：
5' - TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3'
(ただし、 Nは丁以外の塩基を意味し、 Mは T又は Cを意味し、 下線を付した塩 基が第 2 1 3番のアミノ酸をコードする塩基である。） に変異した変異プレセ二 リンー 1遺伝子を有する請求の範囲第 1項ないし第 6項のいずれか 1項に記載の ヒ ト以外の遺伝子変異動物。
8 . プレセニリンー 1蛋白のァミノ酸配列中の第 2 1 3番のァミノ酸の近辺をコ 一ドする D N A配列が、 次の配列
5' -TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3'
(ただし、 Nは Cを意味し、 Mは T又は Cを意味し、 下線を付した塩基が第 2 1 3番のアミノ酸をコードする塩基である。） に変異した変異プレセニリンー 1遺 伝子を有する請求の範囲第 1項ないし第 6項のいずれか 1項に記載のヒ 卜以外の 遺伝子変異動物。
9 . プレセユリンー 1蛋白のァミノ酸配列中の第 2 1 3番のァミノ酸の近辺をコ ードする D N A配列が、 次の配列
5' -TGTGGTCGGGATGATMGCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3'
(ただし、 X Y Zはィソロイシン以外のァミノ酸をコードする 3塩基のコ ドンを 意味し、 Mは T又は Cを意味し、 下線を付した塩基が第 2 1 3番のアミノ酸をコ 一ドする塩基である。） に変異した変異プレセニリンー 1遺伝子を有する請求の 範囲第 1項ないし第 6項のレ、ずれか 1項に記載のヒ ト以外の遺伝子変異動物。
1 0 . プレセ二リン一 2蛋白のアミノ酸配列において、 第 1 4 1番及び Z又は 4 3 6番のァミノ酸が他のァミノ酸に置換した蛋白をコードする D N A配列を含む 変異プレセ二リン一 2遺伝子を有するヒ ト以外の遺伝子変異動物。
1 1 . プレセ二リン— 2蛋白のアミノ酸配列において、 N 1 4 1 I及び/又は M 2 3 9 V (各アルファベッ トは一文字表記法によるアミノ酸を意味しており、 数 字はプレセ二リン一 2蛋白の N末端からのアミノ酸番号を示し、 数字左側に示す 野生型のァミノ酸が右側のァミノ酸に置換されていることを示す。） の変異を有 する変異プレセニリン一 2蛋白をコードする D N A配列を含む変異プレセニリン 一 2遺伝子を有する請求の範囲第 10項に記載のヒ 卜以外の遺伝子変異動物。
1 2 . アミロイ ド i3蛋白の過剰発現が変異プレセ二リン一 1遺伝子及び Z又は変 異プレセニリンー 2遺伝子に起因するものである、請求の範囲第 1項ないし第 11 項のいずれか 1項に記載の遺伝子変異動物。
1 3 . 変異プレセ二リン蛋白を発現することができ、 かつ該蛋白の発現が、 哺乳 類動物の脳の大脳皮質周辺部にぉレ、て進行性の神経疾患を形成させるのに十分な 量のアミロイ ド j3蛋白を生産させるものである、 請求の範囲第 1項ないし第 12 項のいずれか 1項に記載のヒ ト以外の遺伝子変異動物。
1 4 .遺伝子変異動物が哺乳類動物の齧歯類である請求の範囲第 1項ないし第 13 項のいずれか 1項に記載のヒ 卜以外の遺伝子変異動物。
1 5 . 遺伝子変異動物がマウスである請求の範囲第 1項ないし第 14 項のいずれ か 1項に記載のヒ ト以外の遺伝子変異動物。
1 6 . 変異プレセ二リン一 1遺伝子及び/又は変異プレセ二リン一 2遺伝子が相 同組換えにより導入された請求の範囲第 1項ないし第 15 項のいずれか 1項に記 載のヒ ト以外の遺伝子変異動物。
1 7 . 変異プレセ二リン一 1遺伝子により引き起こされた脳組織でのアミロイ ド 蛋白の発現量が、 正常動物と比較して記憶学習試験において障害された行動を引 き起こし、 かつ当該動物の脳の海馬の大脳皮質周辺部において異常な神経病理を 誘発するのに十分であることを特徴とする、 請求の範囲第 1項ないし第 16 項の いずれか 1項に記載のヒ ト以外の遺伝子変異動物。
1 8 . プレセユリンー 1蛋白のアミノ酸配列中の 1又は 2以上のアミノ酸が他の ァミノ酸に置換した変異プレセ二リン一 1蛋白をコードする変異プレセニリンー 1遺伝子とマーカー蛋白をコ一ドする塩基配列とを含む D N A配列を有するヒ ト 以外の遺伝子変異動物。
1 9 . プレセニリンー 1蛋白のアミノ酸配列中の第 2 1 3番のァミノ酸の近辺を コードする D N A配列が、 次の配列：
5' - TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC- 3'
(ただし、 Nは A、 G、 又は Cを意味し、 Mは T又は Cを意味し、 下線を付した 塩基が第 2 1 3番のァミノ酸をコードする塩基である。） である変異プレセニリ ンー 1遺伝子の D N A配列又はその部分配列を含むプラスミ ド。
2 0 . プレセニリンー 1蛋白のアミノ酸配列中の第 2 1 3番のアミノ酸がィソロ イシン以外のァミノ酸に置換した変異プレセニリンー 1蛋白をコードする変異プ レセニリン— 1遺伝子であって、 第 2 1 3番のアミノ酸の付近をコードする D N A配列が、 次の配列：
5' -TGTGGTCGGGATGATMGCC XYZ CACTGGAAAGGCCC- 3'
(ただし、 Mは T又は Cを意味し、 X Y Zはイソロイシン以外をコードする 3塩 基のコドンを意味し、 下線を付した塩基が第 2 1 3番のアミノ酸をコードする塩 基である。） である遺伝子の D N A配列又はその部分配列を含むプラスミ ド。
2 1 . プレセ二リンー 1蛋白のァミノ酸配列中の第 2 1 3番のァミノ酸がィソ口 イシン以外のアミノ酸に置換した変異プレセ二リン一 1蛋白をコードする変異プ レセユリンー 1遺伝子のェキソン 8を含む染色体 D N A。
2 2 . プレセユリンー 1蛋白のアミノ酸配列中の第 2 1 3番のァミノ酸がィソロ イシン以外のァミノ酸に置換した変異プレセニリンー 1蛋白をコードする変異プ レセユリンー 1遺伝子の c D N A又は染色体 D N Aの全長又は変異部分を含む塩 基配列に対して Sau3AI 部位が導入された D N Aを含むプラスミ ド。
2 3 . アミノ酸の置換が 2 1 3番のィソロイシンからスレオニンへの置換である 請求の範囲第 22項に記載のプラスミ ド。
2 4 . 下記の塩基配列：
5' - TGTGGTCGGGATGAMCGCCACCCACTGGAMGGCCC-3'
(ここで Mは T又は Cを意味する。）
で特定される D N Aを含むプラスミ ド。
2 5 . マウス ·プレセ二リン一 1蛋白のアミノ酸配列の第 2 1 3番のイソ口イシ ンがイソロイシン以外のアミノ酸に置換したマウス変異プレセリュリン—丄蛋白 をコードする D N A配列を含む遺伝子。
2 6 . アミノ酸の置換がィソロイシンからスレオニンへの置換である請求の範囲 第 25項に記載の遺伝子。
2 7 . (1) マウス 'プレセ二リン一 1蛋白のアミノ酸配列の第 2 1 3番のイソ口 イシンがイソロイシン以外のァミノ酸に置換したマウス変異プレセリュリン一 1 蛋白をコードする遺伝子、 及び（2) ΙοχΡ ではさまれたネオマイシン発現ュニッ トを含むプラスミ ド。
2 8 . アミノ酸の置換がィソロイシンからスレオニンへの置換である請求の範囲 第 27項に記載のプラスミ ド。
2 9 . 下記の塩基配列：
5 ' -TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3'
(ここで Mは T又は Cを意味する。 )
で特定される D N Aを含むプラスミ ドが導入されたことを特徴とする胚。
3 0 . 請求の範囲第 20項、 第 22項、 第 23項、 第 24項、 第 27項、 又は第 28項 に記載のプラスミ ドを用いた相同組換えにより得られた胚。
3 1 . 胚が哺乳類動物の齧歯類由来の胚である請求の範囲第 29項又は第 30項に 記載の胚。
3 2 . マウス由来の胚性幹細胞である請求の範囲第 29項ないし第 31項のいずれ か 1項に記載の胚。
3 3 . 請求の範囲第 1項ないし第 18 項のいずれか 1項に記載の遺伝子変異動物 の細胞を単離し、 組織培養により培養することにより得られる初代培養細胞又は 継代培養細胞。
3 4 . 変異プレセ二リ ン一 1蛋白を発現することができ、 かつ該蛋白の発現が脳 の海馬又は大脳皮質周辺部において進行性の神経疾患を形成させるのに十分な量 のアミロイ ド j3蛋白を生産させることができる変異プレセ二リン一 1遺伝子を相 同組換法により動物の胚に導入する工程を含む、 ヒ ト以外の遺伝子変異動物の作 製方法。
3 5 . 請求の範囲第 34 項に記載の遺伝子変異動物の作製方法において、 第 2 1 3番のィソロイシンがイソロイシン以外のァミノ酸に変異した変異プレセニリン 一 1変異蛋白を発現する方法。
3 6 . 被検物質を投与した請求の範囲第 1項ないし第 18 項のいずれか 1項に記 載の遺伝子変異動物と無投与又は対照物質を投与した該動物との比較を行う工程 を含む、 アルツハイマー病の治療及び/又は予防に有用な物質の評価方法。
3 7 . 記憶学習試験により比較を行う請求の範囲第 36項に記載の評価方法。
3 8 . 病理試験により比較を行う請求の範囲第 36項に記載の評価方法。
3 9 . 大脳皮質周辺部での神経病理に基づく病理試験により比較を行う請求の範 囲第 36項に記載の評価方法。
4 0 . 神経病理に基づく病理試験による比較が、 当該脳の大脳皮質周辺部での肥 大したダリオ一シスの減少の抑制、 当該脳の大脳皮質周辺部での 2—デォキシグ ルコース取り込みの減少の抑制、 及び当該脳の大脳皮質での 2—デォキシグルコ ース利用の減少の抑制からなる群から選択される 1又は 2以上の項目の比較であ る、 請求の範囲第 38項又は第 39項に記載の評価方法。
4 1 . 当該動物の生存期間、 探索行動、 及び移動行動からなる群から選ばれる 1 又は 2以上の項目について比較を行う請求の範囲第 36項に記載の評価方法。
4 2 . 請求の範囲第 33 項に記載の初代培養細胞又は継代培養細胞を被検化合物 の存在下でィン · ビトロ細胞培養する工程を含む、 アルツハイマー病の治療及び
Z又は予防剤の評価方法。
4 3 . O S 一 2型変異プレセ二リン一 1蛋白をコ一ドする変異プレセユリン一 1 遺伝子の部分塩基配列を用いることを特徴とする、 アルツハイマー病又はアルッ ハイマー病の発症可能性の診断方法。
4 4 . 請求の範囲第 36項ないし第 42項のいずれか 1項に記載の評価方法により 選択されたアルツハイマー病の治療及び Z又は予防に有用な物質。
4 5 . 請求の範囲第 44 項に記載の物質を有効成分として含むアルツハイマー病 の治療剤及び Z又は予防剤。
4 6 . 請求の範囲第 1項ないし第 18項に記載の遺伝子変異動物と、 アミロイ ド 前駆体タンパクの変異蛋白をコードする遺伝子を有しァミロイ ド J3タンパクの 生産量の多い動物とを掛け合わせることにより作製したハイプリッ ド動物およ びその子孫であって変異プレセニリン遺伝子とアミロイ ド前駆体タンパクの変 異蛋白をコードする遺伝子を有する遺伝子変異動物。
4 7 . 動物がマウスである請求の範囲第 46項に記載の遺伝子変異動物。
4 8 . アミロイ ド前駆体タンパクの変異蛋白をコードする遺伝子を有しァミ口 ィ ド βタンパクの生産量の多いマウスが、 P S 1変異したマウスである請求の 範囲第 47項に記載の遺伝子変異動物。
4 9 . 請求の範囲第 7項ないし 1 8項のいずれか 1項に記載の遺伝子変異動物 と、 アミロイ ド前駆体タンパクの変異蛋白をコードする遺伝子を有しァミロイ ド タンパクの生産量の多いマウスとを掛け合わせることにより作製したハイ ブリ ッ ドマウスおよびその子孫であって変異プレセユリン遺伝子とアミロイ ド 前駆体タンパクの変異蛋白をコードする遺伝子を有する遺伝子変異マウス。
5 0 . 請求の範囲第 7項ないし 1 8項のいずれか 1項に記載の遺伝子変異動物 と、 アミロイ ド前駆体タンパクの変異蛋白をコードする遺伝子を有しアミロイ ド 1¾タンパクの生産量の多いマウスとを掛け合わせることにより生まれたハイ ブリッ ドマウスおよびその子孫であって変異プレセユリン遺伝子とアミロイ ド 前駆体タンパクの変異蛋白をコードする遺伝子を有する遺伝子変異マウス。
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