CN114630579A - 胎儿/新生儿同种免疫性血小板减少症的鼠模型 - Google Patents

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Abstract

描述了包含GPIIIa中T30A、S32P、Q33L、N39D和M470Q突变的转基因小鼠，以及制备所述转基因小鼠的方法和使用所述转基因小鼠筛选测试化合物的方法。

Description

胎儿/新生儿同种免疫性血小板减少症的鼠模型
相关申请的交叉引用
不适用。
参考通过EFS网站提交的序列表
名为“160180_00134_ST25.txt”的大小为29.0kb的序列表的ASCII文本文件的内容创建于2019年11月4日，并通过EFS网站以电子方式提交，该申请以引用方式整体并入本文。
背景技术
血小板特异性抗原的同种抗体导致三种临床上重大的出血性病症：输血后紫癜(PTP)、血小板输注无效(RPT)和胎儿/新生儿同种免疫性血小板减少症(FNAIT-在文献中不同地称为NATP或NAIT–综述请参阅参考文献1)。PTP是一种罕见的综合征，指多产妇在接受输血后，不仅莫明其妙地清除了输注的血小板，还清除了自己的血小板，从而导致严重的血小板减少症、瘀斑和瘀点。RPT见于多次输注血小板的患者，并且仍然是一个临床挑战，导致出血并发症和住院时间延长。RPT可分为免疫原因和非免疫原因。免疫原因包括因先前妊娠、输血和/或移植暴露而导致的HLA和/或血小板特异性抗原的同种免疫。基于对急性髓性白血病(AML)或造血祖细胞移植患者的研究，非免疫原因包括发热、败血症、脾肿大、弥散性血管内凝血(DIC)、出血、静脉闭塞性疾病(VOD)、移植物抗宿主病(GVHD)和药物治疗54。与PTP或RPT不同，FNAIT是一种相当常见的病症，导致约1/1000至1/2000活产婴儿出现严重的胎儿和/或新生儿血小板减少症2，3。虽然许多婴儿完全康复，但FNAIT是胎儿和新生儿严重血小板减少症的主要原因，其中近一半经历了严重到需要输注“抗原阴性”血小板的出血4。然而，FNAIT最具破坏性的后果是早在妊娠20-24周出现颅内出血和宫内死亡2，5，6。尽管治疗取得了进展，但FNAIT仍然是足月婴儿颅内出血的主要原因4，7-10，通常导致终身残疾。
在过去60年中，许多实验室进行的工作已经鉴定出30多种不同的可遗传的人血小 板特异性同种抗原(HPA)系统(HPA 1-30)，这些系统位于五种不同的糖蛋白上，目前被国际输血学会(ISBT)血小板命名委员会和ISTH认可11。其中，HPA-1a(也称为PlA1)表位是最常引发PTP和FNAIT的表位，是约80％的可检测到同种抗体的病例的原因12，因此被广泛研究。然而，本领域需要用于研究HPA-1a/1b表位的改进模型以及用于PTP和FNAIT的改进的诊断、预防和治疗方法。
发明内容
下面总结了本发明的一些主要方面。在本公开的具体实施方式、实施例、附图和权利要求部分中描述了另外的方面。本公开的每个部分中的描述意图与其他部分一起阅读。此外，在本公开的每个部分中描述的各种实施方案可以各种不同的方式组合，并且实施方案的任一及所有此类组合意图落入本发明的范围内。
在第一方面，本文提供了转基因小鼠，其基因组包含编码与SEQ ID NO:25具有至少95％同一性的变体血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)的核酸，其中该变体GPIIIa包含SEQ IDNO:25中的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q。在一些实施方案中，小鼠表达包含SEQ IDNO:26中所示序列的变体GPIIIa。在一些实施方案中，变体GPIIIa还包含相对于SEQ ID NO:25的突变V22M。在一些实施方案中，变体GPIIIa可以与抗HPA-1a抗体结合。
在第二方面，本文提供了一种鉴定能够与变体血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)特异性结合的分子的体外方法，该方法包括：将候选分子与来自本文所述转基因小鼠的血小板接触；并且确定该候选分子是否与血小板结合；其中如果该候选分子与来自转基因小鼠的血小板结合但不与来自野生型小鼠的血小板结合，则该候选分子能够与变体GPIIIa特异性结合。在一些实施方案中，候选分子选自由抗体、Fv、F(ab)、F(ab′)、F(ab′)2以及前述任一种的单链形式组成的组。
在第三方面，本文提供了一种鉴定能够防止雌性小鼠抗HPA-1a同种免疫应答的分子的体内方法，该方法包括：给试验小鼠施用候选分子，其中该试验小鼠怀有野生型血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)复合包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa杂合的幼崽，并且其中该试验小鼠抗HPA-1a抗体呈阴性；并且测量该试验小鼠的抗HPA-1a抗体滴度；其中如果通过单抗原珠测定法在产后两周检测不到该试验小鼠的抗HPA-1a抗体滴度，则该候选分子能够防止抗HPA-1a同种免疫应答。在一些实施方案中，在产后六周检测不到试验小鼠中的抗HPA-1a抗体滴度。在一些实施方案中，候选分子选自由抗体、Fv、F(ab)、F(ab′)、F(ab′)2以及前述任一种的单链形式组成的组。
在第四方面，本文提供了一种鉴定能够抑制抗HPA-1a同种抗体与胎儿或新生儿血小板结合的分子的体内方法，该方法包括：给试验小鼠施用候选分子，其中该试验小鼠怀有野生型血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)复合包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa杂合的幼崽，并且其中该试验小鼠在妊娠前用(i)来自如本文所述的转基因小鼠的血小板或(ii)包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa免疫；并且测量胎儿或新生儿血小板计数；其中如果该试验小鼠幼崽的胎儿或新生儿血小板计数高于对照小鼠幼崽的胎儿或新生儿血小板计数，则该候选分子能够抑制抗HPA-1a同种抗体与胎儿或新生儿血小板结合。在一些实施方案中，与对照小鼠的幼崽相比，试验小鼠的幼崽出血减少或被阻止。在一些实施方案中，候选分子选自由抗体、Fv、F(ab)、F(ab′)、F(ab′)2以及前述任一种的单链形式组成的组。
在第五方面，本文提供了一种鉴定能够抑制抗HPA-1a同种抗体通过妊娠小鼠胎盘的分子的体内方法，该方法包括：给试验小鼠施用候选分子，其中该试验小鼠怀有野生型血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)复合包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa杂合的幼崽，并且其中该试验小鼠在妊娠前用(i)来自如本文所述的转基因小鼠的血小板或(ii)包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa免疫；并且测量胎儿或新生儿抗HPA-1a抗体滴度；其中如果试验小鼠幼崽的胎儿或新生儿抗体滴度低于对照小鼠幼崽的胎儿或新生儿抗体滴度，则所述候选分子能够抑制抗HPA-1a同种抗体通过妊娠小鼠的胎盘。在一些实施方案中，与对照小鼠的幼崽相比，试验小鼠的幼崽出血减少或被阻止。在一些实施方案中，候选分子选自由抗体、Fv、F(ab)、F(ab′)、F(ab′)2以及前述任一种的单链形式组成的组。
在第六方面，本文提供了变体血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)，其包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列。
在第七方面，本文提供了一种鉴定能够与抗HPA-1a抗体竞争与如本文所述变体GPIIIa结合的分子的体外方法，该方法包括：将该变体GPIIIa与该抗HPA-1a抗体接触以形成GPIIIa-抗体复合物，其中该变体GPIIIa固定在底物上，并且其中该抗HPA-1a抗体包含标记；将该GPIIIa-抗体复合物与溶液中的候选分子接触；并且通过检测底物上或溶液中的标记量来确定该候选分子是否与抗HPA-1a抗体竞争与变体GPIIIa的结合；其中如果与该GPIIIa-抗体复合物与该候选分子接触之前在底物上检测到的标记量相比，在该GPIIIa-抗体复合物与该候选分子接触之后在底物上检测到的标记量减少，则该候选分子能够与该抗HPA-1a抗体竞争与该变体GPIIIa结合；或者其中如果与该GPIIIa-抗体复合物与该候选分子接触之前溶液中标记量相比，在该GPIIIa-抗体复合物与该候选分子接触之后溶液中标记量增加，则该候选分子能够与该抗HPA-1a抗体竞争与变体GPIIIa结合。在一些实施方案中，抗HPA-1a抗体是单克隆抗体26.4。在一些实施方案中，标记选自由荧光团、放射性同位素、化学发光探针和生物发光探针组成的组。在一些实施方案中，底物选自由珠、树脂、颗粒、膜和凝胶组成的组。在一些实施方案中，候选分子选自由抗体、Fv、F(ab)、F(ab′)、F(ab′)2以及前述任一种的单链形式组成的组。
在第八方面，本文提供了一种制备本文所述转基因小鼠的方法，该方法包括：向受精的鼠卵母细胞的细胞质中注射i)Cas9核酸酶或编码Cas9核酸酶的核苷酸；ii)靶向鼠ITGB3外显子3的gRNA；iii)靶向鼠ITGB3外显子10的gRNA；iv)编码GPIIIa中相对于SEQ IDNO:25的T30A、S32P、Q33L和N39D突变的单链同源定向修复(HDR)模板寡核苷酸；和ii)编码GPIIIa中相对于SEQ ID NO:25的M470Q突变的单链HDR模板寡核苷酸；将由经注射的卵母细胞产生的双细胞阶段胚胎植入假孕雌性小鼠的输卵管中；以及筛选由假孕雌性小鼠生下的小鼠中存在GPIIIa中相对于SEQ ID NO:25的T30A、S32P、Q33L、N39D和M470Q突变的小鼠。在一些实施方案中，靶向ITGB3外显子10的gRNA包含SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，编码M470Q突变的单链HDR模板寡核苷酸另外编码诊断限制性位点。在一些实施方案中，编码M470Q突变的该单链HDR模板寡核苷酸另外编码ITGB3外显子10的一个或多个沉默突变，以沉默Cas9对ITGB3在外显子10处的重复消化。在一些实施方案中，编码M470Q突变的单链HDR模板寡核苷酸包含SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，靶向ITGB3外显子3的gRNA包含SEQ IDNO:1。在一些实施方案中，编码T30A、S32P、Q33L和N39D突变的单链HDR模板寡核苷酸另外编码诊断限制性位点。在一些实施方案中，编码T30A、S32P、Q33L和N39D突变的该单链HDR模板寡核苷酸另外编码ITGB3外显子3的一个或多个沉默突变，以使Cas9对ITGB3在外显子3处的重复消化沉默。在一些实施方案中，编码T30A、S32P、Q33L和N39D突变的单链HDR模板寡核苷酸包含SEQ ID NO:4。
在第九方面，本文提供了转基因小鼠，其基因组包含编码与SEQ ID NO:27具有至少95％同一性的变体血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)的核酸，其中该变体GPIIIa包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q。在一些实施方案中，小鼠表达包含SEQID NO:27中所示序列的变体GPIIIa。在一些实施方案中，变体GPIIIa可以与抗HPA-1a抗体结合。
在第十方面，本文提供了怀有野生型血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)复合包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa杂合的幼崽的小鼠。在一些实施方案中，小鼠抗HPA-1a抗体呈阳性。在一些实施方案中，该小鼠在妊娠前用(i)来自如本文所述转基因小鼠的血小板或(ii)包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa进行免疫。
附图说明
图1A-1B显示了人GPIIIa PSI和EGF1结构域的三维结构。注意PSI结构域位于GPIIIa的杂合结构域和EGF1结构域之间，并且控制HPA-1a(PlA1)表位表达的多态性氨基酸33与线性距离但构象接近的EGF1结构域正对着。丙氨酸到Cys435的突变(通过与Cys13的二硫键将EGF1结构域连接到PSI结构域)先前已显示导致一些但不是全部母体抗HPA-1a同种抗体结合的丧失，导致EGF1中的非多态性氨基酸构成这些所谓的II型抗体的部分表位的推测。
图2A-2F显示了CRISPR介导的APLD人源化转基因小鼠的产生。图2A：GPIIIa PSI结构域的三维结构，显示了在鼠蛋白质中突变以使22-40氨基酸环人源化的残基的位置。图2B：ITGB3基因座的示意图，显示了gRNA结合位点(红色柱)、前间隔序列相邻基序(PAM)序列(品红色柱)和Cas9切割位点(红色箭头指向)的位置。设计了一个200bp的APLD同源定向修复(HDR)模板，以引入四个所需的氨基酸取代(用红色标记的突变核苷酸)和诊断性BamH1限制性位点(用蓝色标记的沉默突变核苷酸)，其侧翼是80个核苷酸同源臂。HDR模板还引入了编码沉默突变的核苷酸(绿色),以防止Cas9的再切割。图2C：小图B中显示的被设计用于将Cas9核酸酶靶向ITGB3基因的20bp gRNA被克隆到CRISPR运载体px459的BbsI位点，其也编码Cas9和嘌呤霉素抗性基因。向C57BL/6N受精卵的原核显微注射px459质粒连同HDR模板以产生人源化APLD小鼠。图2D：设计的PCR策略以报告HDR模板在鼠ITGB3基因靶位点周围717bp区域内的掺入。引入的BamH1用蓝色方框标记。图2E：两个代表性幼崽的基因分型：来自幼崽尾部的基因组DNA被PCR扩增并用BamH1消化以鉴定正确靶向的APLD等位基因。用BamH1切割幼崽#1的PCR产物证明了成功掺入HDR寡核苷酸。箭头表示预期的BamH1消化产物。图2F：从幼崽#1的基因组DNA中PCR扩增基因组编辑位点周围的ITGB3基因座，并进行DNA序列分析，证实人序列精确纯合整合到鼠ITGB3的两个等位基因中。
图3A-3B显示了APLD人源化鼠PSI结构域支持一些但不是全部人抗HPA-1a同种抗血清的结合。图3A：HPA-1a选择性鼠mAb SZ21与人和小鼠血小板的结合的流式细胞术分析。注意SZ21与人HPA-1a-阳性的人血小板结合，但不与HPA-1b-阳性的人血小板结合，证明了其同种选择性，并与APLD结合，但不与野生型鼠血小板结合。PSI结构域特异性mAb PSIB1,用作GPIIb-IIIa表达的阳性对照，如图所示，其结合所有PSI结构域，而不考虑物种或HPA同种异型。图3B：抗HPA-1a母体同种抗血清与GPIIb-IIIa的人和鼠形式结合的抗原捕获ELISA分析。将五种不同的人FNAIT同种抗血清与所示表型的人或鼠血小板一起孵育。然后将血小板/抗体复合物用洗涤剂裂解，并添加至已经用抗小鼠CD41包被的微量滴定孔中以从小鼠血小板捕获免疫复合物，或用mAb AP2包被的微量滴定孔中以从人血小板捕获免疫复合物的微量滴定孔中。注意，人同种抗血清2、3和4与人GPIIb-IIIa和APLD鼠GPIIb-IIIa反应相似，而同种抗血清1和5不与鼠APLD GPIIb-IIIa反应，这表明在这些多克隆血清中存在的HPA-1a特异性同种抗体的优势具有更复杂的表位要求。如预期的那样，FNAIT同种抗血清均不与野生型鼠GPIIb-IIIa反应。
图4A-4B显示了用于与II型抗HPA-1a抗体结合的结构要求。图4A：HPA-1a特异性单克隆抗体与人和小鼠血小板反应性的流式细胞术分析。来自指定物种并具有指定表型的血小板与mAb SZ21、26.4和B2G1反应。注意，II型mAb 26.4要求鼠GPIIIa在EGF1结构域的残基470处从Met人源化为Gln，其在空间上接近PSI结构域，如图4B所示。另一种II型HPA-1a特异性mAb B2G1仍然不与APLDQ血小板反应，这突出了对控制HPA-1a表位形成的Leu33Pro多态性的多克隆体液应答中可能存在的结合特异性的复杂性。
图5A-5C显示I-EGF1中的多个氨基酸能有助于II型抗HPA-1a抗体的结合。图5A：人与鼠PSI和I-EGF1结构域序列的比较，差异用红色突出显示。尤其注意PSI结构域的APLD序列以及EGF1中Q470M、H446P、G463D和P464Q的差异。图5B：与β3PSI和I-EGF1结构域结合的抗体B2G1可变区的结构模型。抗体显示为所示的带有CDR环的棕褐色表面，而抗原-抗体界面上整合素β3残基的侧链显示为棒和点。注意，界面相互作用残基不仅包括多态性氨基酸33，还包括PSI结构域中的P32和I-EGF1的H446和Q470。还注意到G463和P464不在界面附近。图5C上图：将使用表达人GPIIb和已突变以表达所示人源化氨基酸取代的鼠GPIIIa异型体的质粒瞬时转染的HEK293细胞与所示抗体一起孵育，并进行流式细胞术分析。PSI结构域特异性mAb PSIB1用作转染效率的对照。注意mAb 26.4的结合需要Q470，而B2G1需要Q470和H446，如图5B中对接模型所预测的。图5C下图：使用所示抗体对用表达人GPIIb和已突变以表达所示小鼠氨基酸的人GPIIIa异型体的质粒转染的HEK293细胞进行流式细胞术分析。注意Q470→M突变导致26.4和B2G1两者结合的丧失，而H446→P氨基酸取代仅影响B2G1。
图6A-6D显示了CRISPR介导的APLDQ人源化转基因小鼠的产生。图6A：GPIIIa PSI结构域的三维结构，显示在APLD鼠GPIIIa蛋白的EGF1结构域中突变为Q的残基M470的位置。图6B：ITGB3基因座的示意图，显示了gRNA结合位点(红色柱)、前间隔序列相邻基序(PAM)序列(品红色柱)和Cas9切割位点(红色箭头指向)的位置。设计了一个167bp的同源定向修复(HDR)模板来引入M到Q的氨基酸取代(用红色标记的突变核苷酸),其侧翼是82个和77个核苷酸同源臂。HDR模板也引入了沉默突变(用绿色表示的核苷酸)以防止被Cas9再切割。图6C：向APLD C57BL/6N受精卵的细胞质显微注射Cas-9蛋白、gRNA连同HDR模板以产生人源化APLDQ小鼠。图6D：从幼崽的基因组DNA中PCR扩增基因组编辑位点周围的ITGB3基因座，并进行DNA序列分析，证实HDR序列精确杂合整合到鼠ITGB3的一个等位基因中。
图7显示了抗HPA-1a母体同种抗血清与GPIIb-IIIa的人和鼠形式结合的抗原捕获ELISA分析。将16种不同的人FNAIT同种抗血清或PTP同种抗血清与所示表型的人或鼠血小板一起孵育。然后将血小板/抗体复合物用洗涤剂裂解，并添加至已经用抗小鼠CD41包被的微量滴定孔中以从小鼠血小板捕获免疫复合物，或用mAb AP2包被的微量滴定孔中以从人血小板捕获免疫复合物的微量滴定孔中。注意，人FNAIT同种抗血清2、3、4、7、11、12、13和PTP同种抗血清2和3与人GPIIb-IIIa和APLD鼠GPIIb-IIIa的反应相似，而人FNAIT同种抗血清1、5、9、10与鼠APLD GPIIb-IIIa的反应较差，这表明这些多克隆血清中存在的HPA-1a特异性同种抗体的优势具有更复杂的表位要求。如预期的那样，FNAIT同种抗血清均不与野生型鼠GPIIb-IIIa反应。
图8显示了II型而不是I型抗HPA-1a同种抗体抑制PAC-1与人αIIbβ3结合。用野生型人αIIbβ3加EGFP转染HEK293FT细胞。将细胞与I型mAb SZ21、II型mAb B2G1和26.4或来自先前表征的I型PTP抗血清(PTP-1)或先前表征的II型FNAIT抗血清(FNAIT-5和FNAIT-9)的纯化IgG级分预孵育。预孵育后，将纤维蛋白原配体模拟mAb PAC-1添加至含有0.2mM Ca+2和2mM Mn+2的缓冲液中。通过流式细胞术分析EGFP阳性细胞与PAC-1的结合。PAC-1结合被标准化为总β3表面表达，并表示为缓冲液对照的百分比。数据为平均值±标准差(n≥2)。注意，单克隆和多克隆II型抗体均在不同程度上抑制PAC-1结合，而I型抗体基本上没有效果。
图9显示与APLD+/+雄性交配的预免疫的野生型雌性生下严重血小板减少的幼崽。交配对照#1是与APLD C57BL/6雄性杂交的WT非免疫Balb/c雌性。交配对照#2是与WTC57BL/6雄性杂交的免疫Balb/c雌性。
图10A-10D显示，尽管雌性动物仅被同种免疫一次，但胎儿/新生儿血小板减少症在至少五次随后的妊娠中持续存在。母体抗APLDβ3整合素抗体导致幼崽血小板减少症和出血。
图11显示，类似于图9中显示的APLD模型，与APLDQ雄性交配的预免疫的野生型雌性生下严重血小板减少的幼崽。交配对照#1是与APLD C57BL/6雄性杂交的WT非免疫Balb/c雌性。交配对照#2是与WT C57BL/6雄性杂交的免疫Balb/c雌性。
图12A-12D显示了在图11中概述的交配中，在多达4次妊娠中，幼崽的血小板减少症和出血持续存在。母体抗APLDβ3整合素抗体导致幼崽血小板减少症和出血。
图13显示4μg/ml mAb 26.4在体外有效抑制鼠多克隆抗APLDQ抗体与鼠APLDQ血小板的结合。在2μg/ml和16μg/ml之间测试的所有浓度都有效地抑制了结合。
图14显示了IVIG和mAb 26.4治疗方案。在交配后第10天和第17天IV引入1g/kg的人IVIG治疗提高了APLDQ同种免疫雌性所生幼崽的血小板计数。同样，在交配后第10天和第17天引入的PG-LALA形式的mAb 26.4(30μg/只小鼠)的治疗提高了APLDQ同种免疫雌性所生幼崽的血小板计数。
图15显示了IVIG和PG-LALA 26.4都有效地提高了APLDQ同种免疫的雌性小鼠幼崽的血小板计数。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其并入程度就如每个单独的出版物、专利和专利申请被具体地和单独地指出以引用方式并入一样。
具体实施方式
FNAIT和PTP是由血小板特异性抗原的同种抗体引起的出血性病症。HPA-1a(也称为PlA1)表位是最常引发PTP和FNAIT的人血小板同种抗原，是约80％的可检测到同种抗体的病例的原因。HPA-1a/-1b同种抗原系统由血小板膜糖蛋白(GP)IIIa中的Leu33Pro多态性(＝αIIbβ3血小板纤维蛋白原受体的β3整合素亚单位)控制13，14，Pro33(＝HPA-1b)纯合个体也携带主要组织相容性复合物(MHC)的HLA-DRB3*0101等位基因，最容易对GPIIIa的Leu33(HPA-1a)形式产生同种免疫应答15-17。多态性氨基酸33位于称为丛状蛋白、臂板蛋白(semaphorin)、整合素(PSI)结构域的重二硫键结样结构内，该结构本身位于GPIIIa 18的杂合和整合素蛋白表皮生长因子1(EGF，I-EGF1)结构域之间(参见图1A-1B)。有趣的是，虽然一些被分类为I型抗体的母体抗HPA-1a同种抗体通常与GPIIIa的突变形式(其中连接PSI和EGF1结构域的二硫键已被破坏)结合，但其他抗体(II型)则丧失反应性19，这表明(1)对HPA-1a的同种免疫应答是异质性的，以及(2)对于至少一些母体抗HPA-1a抗体，可能需要线性距离的EGF结构域内的序列以在GPIIIa上形成高亲和力抗体结合位点(如图1A-1B所示)。
基于对在多态性氨基酸33周围分子区域的GPIIIa的三维结构数据的分析，本文描述了表达鼠GPIIIa异型体的转基因小鼠，所述异型体在PSI和EGF1结构域内含有选择的人源化残基。还描述了一系列单克隆和多克隆HPA-1a特异性抗体与含有选择的人源化残基的GPIIIa异型体的结合。这种结合显示了对这种临床上重要的人血小板同种抗原系统的多克隆同种免疫应答的复杂异质性。这种同种免疫应答的高分辨率作图可能改善FNAIT的诊断，并且应该促进预防性和治疗性抗HPA-1a药物的合理设计、选择和/或筛选。
目前，还不存在能够准确反映来自抗HPA-1a抗血清的广泛的单克隆和多克隆抗体与GPIIIa的结合(如在人类FNAIT中所见的)的FNAIT的动物模型。此外，不存在适用于设计、选择和筛选预防和治疗试剂的FNAIT动物模型。这是由于与人GPIIIa相比，鼠GPIIIa的序列和结构差异，导致结合的单克隆和多克隆抗体改变。
本文提供了包含GPIIIa人源化突变的转基因小鼠。由于GPIIIa的突变，小鼠表达了与来自抗HPA-1a抗血清的单克隆和多克隆抗体结合的变体GPIIIa。本文还提供了来源于转基因小鼠的细胞和组织。野生型小鼠GPIIIa序列作为SEQ ID NO:25包括在本文中。转基因小鼠GPIIIa序列包含GPIIIa(SEQ ID NO:25)中的至少T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q突变，导致变体GPIIIa能够与抗HPA-1a抗体结合，并且在一些实施方案中，变体GPIIIa能够与单克隆和多克隆抗HPA-1a抗体结合。在一些实施方案中，变体GPIIIa序列包含至少一个M470Q突变和SEQ ID NO:25的氨基酸残基22-40的突变，其中氨基酸残基22-40被序列MCAWCSDEALPLGSPRCD(SEQ ID NO:28)取代，该序列对应于PSI结构域中的环区域并与人GPIIIa的EGF1和EGF2结构域相邻。在一个实施方案中，变体GPIIIa能够结合单克隆抗体26.4。在一些实施方案中，转基因小鼠表达包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的变体GPIIIa。在一些实施方案中，转基因小鼠表达包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的变体GPIIIa。
鼠GPIIIa(SEQ ID NO:25)
ESNICTTRGVNSCQQCLAVSPVCAWCSDETLSQGSPRCNLKENLLKDNCAPESIEFPVSEAQILEARPLSSKGSGSSAQITQVSPQRIALRLRPDDSKIFSLQVRQVEDYPVDIYYLMDLSFSMKDDLSSIQTLGTKLASQMRKLTSNLRIGFGAFVDKPVSPYMYISPPQAIKNPCYNMKNACLPMFGYKHVLTLTDQVSRFNEEVKKQSVSRNRDAPEGGFDAIMQATVCDEKIGWRNDASHLLVFTTDAKTHIALDGRLAGIVLPNDGHCHIGTDNHYSASTTMDYPSLGLMTEKLSQKNINLIFAVTENVVSLYQNYSELIPGTTVGVLSDDSSNVLQLIVDAYGKIRSKVELEVRDLPEELSLSFNATCLNNEVIPGLKSCVGLKIGDTVSFSIEAKVRGCPQEKEQSFTIKPVGFKDSLTVQVTFDCDCACQAFAQPSSPRCNNGNGTFECGVCRCDQGWLGSMCECSEEDYRPSQQEECSPKEGQPICSQRGECLCGQCVCHSSDFGKITGKYCECDDFSCVRYKGEMCSGHGQCNCGDCVCDSDWTGYYCNCTTRTDTCMSTNGLLCSGRGNCECGSCVCVQPGSYGDTCEKCPTCPDACSFKKECVECKKFNRGTLHEENTCSRYCRDDIEQVKELTDTGKNAVNCTYKNEDDCVVRFQYYEDTSGRAVLYVVEEPECPKGPDILVVLLSVMGAILLIGLATLLIWKLLITIHDRKEFAKFEEERARAKWDTANNPLYKEATSTFTNITYRGT
人源化鼠GPIIIa变体1(SEQ ID NO:26)
Figure BDA0003628453010000131
Figure BDA0003628453010000141
人源化鼠GPIIIa变体2(SEQ ID NO:27)
Figure BDA0003628453010000142
如本文所用，术语“变体”是指与参考序列相比具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的多肽。例如，SEQ ID NO:26是SEQ ID NO:25的变体。变体GPIIIa可具有与SEQID NO:25例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列，并且包含相对于SEQ ID NO:25的T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q突变。在一些实施方案中，变体GPIIIa包含相对于SEQ ID NO:25的T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q突变以及相对于SEQ ID NO:25的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、多达15、多达20、多达25或多达30个另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是保守取代。
如本文所用，术语“保守取代”是指一个或多个氨基酸被另一生物学上类似的残基替换。示例包括具有类似特征的氨基酸残基的取代，例如小氨基酸、酸性氨基酸、极性氨基酸、碱性氨基酸、疏水性氨基酸和芳香族氨基酸。有关肽和蛋白质中表型沉默取代的进一步信息，参见例如Bowie等人，Science 247:1306-1310(1990)。在下表中，氨基酸的保守取代根据物理化学性质分组；I：中性和/或亲水性，II：酸和酰胺，III：碱性，IV：疏水性，V：芳香族的大体积氨基酸。
表I
I II III IV V
A N H M F
S D R L Y
T E K I W
P Q V
G C
在下表中，氨基酸的保守取代根据物理化学性质分组；VI：中性或疏水性，VII：酸性，VIII：碱性，IX：极性，X：芳香族。
表II
VI VII VIII IX X
A D H M F
L E R S Y
I K T W
V N H
P Q
G C
鉴别不影响蛋白质功能的保守核苷酸和氨基酸取代的方法是本领域众所周知的(参见例如Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人，Protein Eng.12(10):879-884(1999)；以及Burks等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:412-417(1997))。
在两个或更多个核酸或多肽的上下文中，术语“同一”或“同一性”百分比是指当进行比较和比对(如果需要，引入空位)以获得最大对应性时，相同或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列不考虑任何保守氨基酸取代作为序列同一性的部分。同一性百分比可使用序列比较软件或算法或通过视觉检查来测量。本领域已知可用于获得氨基酸或核苷酸序列比对的各种算法和软件。
序列比对算法的一个此类非限制性示例在Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，87:2264-2268(1990)中描述，如Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，90:5873-5877(1993)中进行修饰并且结合到NBLAST和XBLAST程序(Altschul等人，Nucleic Acids Res.，25:3389-3402(1991))中。在某些实施方案中，可如Altschul等人，Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)中所述使用空位BLAST。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等人，Methods inEnzymology，266:460-480(1996))、ALIGN、ALIGN-2(Genentech，South San Francisco，California)或Megalign(DNASTAR)是可用于序列比对的附加公开软件程序。在某些实施方案中，两个核苷酸序列之间的同一性百分比使用GCG软件包中的GAP程序来确定(例如，使用NWSgapdna.CMP矩阵，空位权重为40、50、60、70或90，长度权重为1、2、3、4、5或6)。在某些另选的实施方案中，GCG软件包中的GAP程序结合Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))的算法，可用于确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比(例如，使用BLOSUM62矩阵或PAM250矩阵，且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5)。另选地，在某些实施方案中，使用Myers和Miller(CABIOS 4:11-17(1989))的算法确定核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比。例如，可使用ALIGN程序(2.0版)并使用带有残基表(空位长度罚分为12和空位罚分为4)的PAM120来确定同一性百分比。本领域技术人员可通过特定的比对软件来确定用于最大比对的合适参数。在某些实施方案中，使用比对软件的默认参数。用于计算同一性的其他资源包括在以下文献中描述的方法：Computational MolecularBiology(Lesk编辑，1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith编辑，1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part 1(Griffin和Griffin编辑，1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(G.von Heinje，1987)；SequenceAnalysis Primer(Gribskov等人编辑，1991)；以及Carillo等人，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。
如本文所用，“转基因动物”是指非人动物，例如哺乳动物，通常是啮齿类动物，例如大鼠或小鼠，其中该动物的一种或多种(优选全部)细胞包含如本文所述的转基因。转基因动物的其他实例包括非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、山羊、鸡、两栖动物等。如本文所用，“转基因”是指整合到转基因动物发育的细胞基因组中并且因此保留在成熟动物的基因组中的外源DNA，从而指导编码的基因产物在转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中表达。基因敲除动物包括在转基因动物的定义中。
通过胚胎处理和多能干细胞或卵母细胞的电穿孔或显微注射产生转基因动物，特别是如小鼠的动物的方法是本领域已知的，并描述于例如美国专利第4,736,866号和第4,870,009号、美国专利第4,873,191号、美国序列第10/006,611号，Hofker和van Deursen编辑的“Transgenic Mouse Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)”(Humana Press,Totowa,N.J.,2002)；和Nagy等人编辑的“Manipulating the MouseEmbryo”(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2002)中，其全部内容以引用方式并入本文。
一般而言，通过将如本文所述制备的运载体注射到受精小鼠卵母细胞的原核或细胞质中来制备如本文所述的转基因小鼠，并将其用于使用标准转基因技术产生在所有细胞中在GPIIIa中具有相对于SEQ ID NO:25的GPIIIa中的T30A、S32P、Q33L、N39D和M470Q突变的转基因小鼠，所述标准转基因技术例如在“Transgenic Mouse Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),”Hofker和van Deursen编辑(Humana Press,Totowa,N.J.,2002)；美国专利第4,736,866号和第4,870,009号、美国专利第4,873,191号和第6,791,006号、以及在Hogan,“Manipulating the Mouse Embryo,”Nagy等人编辑(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2002)中描述。
基因突变的方法是本领域已知的。参见例如Takeda等人的美国专利第7,022,893号和Giros等人的美国专利第6,218,595号，以及W.Velander等人的美国专利第6,344,596号(American Grey Cross)；T.T.Sun的美国专利第6,339,183号(New York University)；D.Cooper和E.Koren的美国专利第6,331,658号；H.Lubon等人的美国专利第6,255,554号(American National Grey Cross；Virginia Polytechnic Institute)；P.Prieto等人的美国专利第6,204,431号(Abbott Laboratories)；L.Diamond等人的美国专利第6,166,288号(Nextran Inc.,Princeton,N.J.)；J.M.Hyttinin等人的美国专利第5,959,171号(Pharming BV)；H.Lubon等人的美国专利第5,880,327号(American Grey Cross)；G.Brem的美国专利第5,639,457号；I.Garner等人的美国专利第5,639,940号(PharmaceuticalProteins Ltd.；Zymogenetics Inc)；W.Drohan等人的美国专利第5,589,604号(AmericanGrey Cross)；Townes等人的美国专利第5,602,306号(UAB Research Foundation)；Leder和Stewart的美国专利第4,736,866号(Harvard)；以及Meade和Lonberg的美国专利第4,873,316号(Biogen)。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复(HDR)产生如本文所述的转基因小鼠。例如参见Wang等人(“One-step generation of mice carrying mutationsin multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome editing”,Cell,2013,153(4):910-918)。为了使GPIIIa突变并产生转基因小鼠，向受精的鼠卵母细胞的原核或细胞质中注射编码i)Cas9核酸酶和ii)靶向感兴趣的区域并位于前间隔序列相邻基序(PAM)位点之前的向导RNA(gRNA)的运载体和单链寡脱氧核苷酸(ssODN)同源定向修复模板。在一些实施方案中，将分离的gRNA、ssODN HDR模板和Cas9核酸酶注射到受精的鼠卵母细胞的原核或细胞质中。在一些实施方案中，运载体包含报道基因或选择性标志物。
在一些实施方案中，gRNA靶向鼠ITGB3外显子3，ssODN HDR模板编码GPIIIa T30A、S32P、Q33L和N39D突变。在一些实施方案中，靶向鼠ITGB3外显子3的gRNA具有序列5'-TTCTCCTTCAGGTTACATCG-3’(SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，编码GPIIIa T30A、S32P、Q33L和N39D突变的ssODN HDR模板具有序列5'-GCCAGGGGGAGGTGACTTACCAGGCAGGAGGCACAGCCGCCCTAGCTCTGATGTTGACCTTTCCCTCGGGCTCTTCTCTTCATAGGCCTTGCCTCTGGGATCCCCACGCTGTGACCTGAAGGAGAACCTGCTGAAGGACAATTGTGCTCCAGAGTCTATTGAGTTCCCAGTCAGTGAGGCCCAGATCCTGGAGGCTAGGC-3’(SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，ssODN HDR模板编码引入诊断限制性位点的沉默突变。在一些实施方案中，ssODN HDR模板编码目的靶基因的沉默突变，以沉默Cas9对所得突变基因的重复消化。
鼠ITGB3基因序列可从NCBI基因ID:16416和GenBank NC_000077.6获得。图2B和图6B中概述了对应于ITGB3中A30、P32、L33、D39和Q470突变的基因组核苷酸突变。
在一些实施方案中，gRNA靶向ITGB3外显子10，ssODN HDR模板编码GPIIIa M470Q突变。在一些实施方案中，靶向鼠ITGB3外显子10的gRNA具有序列5'-CTCCTCAGAGCACTCACACA-3'(SEQ ID NO:7)。在一些实施方案中，编码GPIIIa M470Q突变的ssODN HDR模板具有序列5'-AGCCTTCCAGCCCACGCTGCAACAATGGGAACGGGACTTTTGAGTGTGGGGTGTGCCGCTGTGACCAGGGCTGGCTGGGGTCCCAATGCGAGTGCTCTGAGGAGGATTACCGACCCTCTCAGCAGGAAGAGTGCAGCCCCAAGGAGGGCCAGCCCATCTGCAGCCA-3'(SEQ ID NO:8)。在一些实施方案中，ssODNHDR模板编码引入诊断限制性位点的沉默突变。在一些实施方案中，ssODN HDR模板编码目的靶基因的沉默突变，以沉默Cas9对所得突变基因的重复消化。
基于GPIIIa中T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q突变的存在，可以鉴定转基因建群动物。突变的存在可以例如通过GPIIIa基因目的区域的PCR扩增或测序直接检测。然后可以用转基因建群动物与携带转基因的另外的动物交配。此外，在GPIIIa中携带T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q突变的转基因动物可以进一步与携带其他转基因的其他转基因动物交配。
本文所述的转基因动物以及来源于转基因动物的细胞和组织可用于鉴定和研究能够与变体GPIIIa(例如单克隆或多克隆抗HPA-1a抗体或其片段)结合的因子。在一些实施方案中，本文所述的转基因动物可用于表征在RPT、PTP或FNAIT的治疗或预防中有用的测试因子，例如，通过监测血小板计数、血小板浓度、出血或测试因子的药代动力学。
筛选方法
本发明提供了体外和体内筛选方法。一个实施方案是鉴定能够与变体糖蛋白IIIa(GPIIIa)特异性结合的分子的体外方法。在该实施方案的一个方面，将候选分子与来自转基因小鼠的血小板接触，该转基因小鼠的基因组包含编码变体GPIIIa的核酸，其中变体GPIIIa包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q。如果候选分子与来自转基因小鼠的血小板结合，但不与来自野生型小鼠或不包含变体GPIIIa的小鼠的血小板结合，则可以认为候选分子与变体GPIIIa特异性结合。
血小板结合可通过已知方法定性或定量测量，包括流式细胞术、免疫组织化学、放射免疫测定、ELISA、荧光共振能量转移(FRET)、生物层干涉法和表面等离子体共振。
另一种体外方法可以鉴定能够与抗HPA-1a抗体竞争与本发明的变体GPIIIa结合的分子。在一个实施方案中，该方法包括(a)将该变体GPIIIa与该抗HPA-1a抗体接触以形成GPIIIa-抗体复合物，其中该变体GPIIIa固定在底物上，并且其中该抗HPA-1a抗体包含标记；(b)将该GPIIIa-抗体复合物与溶液中的候选分子接触；并且(c)通过检测底物上或溶液中的标记量来确定该候选分子是否与该抗HPA-1a抗体竞争与该变体GPIIIa的结合。候选分子通过结合变体GPIIIa并阻止抗体的结合而与抗体竞争。该测定中的阳性结果表明候选分子与GPIIIa的结合位点与抗体结合的GPIIIa上的表位重叠或包含该表位。在一个特定的实施方案中，变体GPIIIa包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列。
“标记”是可检测的化合物，其可直接或间接缀合至分子，以便产生标记的分子。标记可以是自身可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者可以是间接检测的，例如通过催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变(例如酶标记)或通过其他间接检测手段(例如生物素化)。在一个实施方案中，标记选自由荧光团、放射性同位素、化学发光探针和生物发光探针组成的组。
候选分子对抗HPA-1a抗体结合的阻止(即竞争)可以通过检测标记的存在与否来确定。例如，如果该方法通过色谱法进行，洗脱液中存在标记表明候选分子竞争结合变体GPIIIa；不存在标记表明抗体保留/结合在固定的GPIIIa上(即没有竞争或竞争有限)。另选地，可以分析其上固定有抗体的底物是否存在标记，其中存在标记表明候选分子的竞争有限或没有竞争，不存在标记表明候选分子已经结合GPIIIa并阻止了抗体的结合(即竞争)。I
在某些实施方案中，HPA-1a抗体是选自由PSIB1、SZ21和26.4组成的组的单克隆抗体。在一个具体的实施方案中，抗HPA-1a抗体是26.4。
变体GPIIIa可固定在本领域已知的任何多孔或无多孔底物上。固定底物的非限制性实例包括珠、树脂、颗粒、膜和凝胶。底物可以由多种材料组成，包括琼脂糖、海藻酸盐、玻璃和磁性材料。可以使用任何已知的方法实现固定，例如吸附、亲和标签结合或共价键合。
在本发明提供的体内方法中，有一种鉴定能够防止雌性小鼠抗HPA-1a同种免疫应答的分子的方法。在一个实施方案中，该方法包括给试验小鼠施用候选分子，其中该试验小鼠怀有野生型血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)复合包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa杂合的幼崽，并且其中该试验小鼠抗HPA-1a抗体呈阴性；并且测量该试验小鼠的抗HPA-1a抗体滴度。如果在分娩时，在产后一周、两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周、九周和/或十周检测不到试验小鼠中的抗HPA-1a抗体滴度，则候选分子能够防止抗HPA-1a同种免疫应答。
本发明还提供了一种鉴定能够抑制抗HPA-1a同种抗体通过妊娠小鼠胎盘的分子的体内方法。在一个实施方案中，该方法包括给试验小鼠施用候选分子，其中该试验小鼠怀有野生型血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)复合包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa杂合的幼崽，并且其中该试验小鼠在妊娠前用(i)来自如本文所述的转基因小鼠的血小板或(ii)包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa免疫，并且测量胎儿或新生儿抗HPA-1a抗体滴度。如果该试验小鼠幼崽的胎儿或新生儿抗体滴度低于对照小鼠幼崽的胎儿或新生儿抗体滴度，则该候选分子能够抑制抗HPA-1a同种抗体通过妊娠小鼠的胎盘。
还提供了鉴定能够抑制抗HPA-1a同种抗体与胎儿或新生儿血小板结合的分子的体内方法。在一个实施方案中，该方法包括给试验小鼠施用候选分子，其中该试验小鼠怀有野生型血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)复合包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa杂合的幼崽，并且其中所述试验小鼠在妊娠前用(i)来自如本文所述的转基因小鼠的血小板或(ii)包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa免疫；并且测量胎儿或新生儿血小板计数。如果该试验小鼠幼崽的胎儿或新生儿血小板计数高于对照小鼠幼崽的胎儿或新生儿血小板计数，则该候选分子能够抑制抗HPA-1a同种抗体与胎儿或新生儿血小板结合。
如本文所用，“对照小鼠”是指包括与所比较的试验小鼠相同的条件并以与所比较的试验小鼠相同的方式和相同的时间范围进行评估的小鼠，只是对照小鼠没有用候选分子进行处理。例如，当试验小鼠在妊娠前用来自本发明转基因小鼠的血小板或用本发明的GPIIIa变体进行免疫时，对照小鼠在相同条件下进行预免疫。同样，在本发明的方法中，其中试验小鼠怀有野生型GPIIIa复合包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa杂合的幼崽，对照小鼠也怀有杂合的幼崽。在试验小鼠和对照小鼠之间测量某些参数和/或比较结果的情况下，在相同的条件下，使用相同的技术/测定法进行测量或评估。为了获得杂合幼崽的妊娠，使野生型雌性小鼠与本发明的转基因雄性小鼠交配。
根据本发明的方法可以筛选多种候选分子。如本文所用，“候选分子”可以是任何化学化合物。候选化合物的实例包括大分子如肽、多肽、蛋白质复合体、糖蛋白、抗体、寡核苷酸和核酸，以及小分子如氨基酸、核苷酸、有机化合物、无机化合物和有机金属化合物。候选分子可以是天然存在的、合成的，或者可以包括天然和合成成分。
在本发明的方法中使用或筛选的抗体可以包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、双特异性抗体、多特异性抗体及其抗原结合片段。抗原结合片段包括Fv、F(ab)、F(ab’)和F(ab’)2。还包括每种前述抗体和抗原结合片段的单链形式。
在一些实施方案中，候选分子可以是文库的成员，例如无机或有机化学库、肽库、寡核苷酸库、抗体库或混合分子库。在一些实施方案中，该方法包括筛选小分子，例如天然产物或组合化学库的成员。
在候选分子是文库(例如包含抗体或其抗原结合片段的文库)的一部分的情况下，本发明的变体GPIIIa可用于表位分箱测定。表位分箱是一种竞争性免疫测定法，可用于表征和分选针对靶抗原(例如包含SEQ ID NO:26中所示氨基酸序列的蛋白质)的单克隆抗体的文库。以成对的方式针对文库中的所有其他抗体测试针对相似靶标的抗体，以确定抗体是否相互阻断与抗原表位的结合。针对文库中的所有其他抗体，创建每种抗体的竞争性阻断模式。密切相关的表位分箱图谱表明抗体具有相同或密切相关的表位并被“拣选”在一起的抗体。(参见例如，Brooks B.D.,Curr.Drug Discovery Technol.11:109-112(2014)；Estep P.等人,MAbs 5:270-278(2013))。表位分箱在本领域也称为表位定位或表位表征。
候选分子可以通过本领域已知的方法施用，例如，通过口服、肠胃外、吸入或局部途径中的任一种。肠胃外施用包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠和阴道施用。口服剂型包括例如固体、液体和悬浮液配制品。口服管饲法是口服施用的优选形式。鼻气雾剂或吸入剂型可以制备成例如盐水溶液，使用苯甲醇或其它合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂和/或其它常规增溶剂或分散剂。候选分子可以在包含缓冲液(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、任选地表面活性剂(例如聚山梨醇酯)、任选地稳定剂(例如人白蛋白)等的组合物中施用。载体或稀释剂的形式和特征可以由与其组合的活性成分的量、施用途径和其他众所周知的变量来决定。根据候选分子的结构和性质，本领域技术人员可以容易地确定适当的途径和剂型。候选分子的剂量可以由技术人员根据经验确定。
根据本发明的方法，可以在妊娠前、妊娠期间和产后的时间点一次或多次施用候选分子。例如，可以在交配前1至14天之间、交配后1至24天之间和/或产后1至28天之间一次或多次施用候选分子。在一个实施方案中，在交配后第10天和第17天施用候选分子。普通技术人员可以根据经验确定给药方案，这取决于候选分子及其被筛选的特定作用。
在本发明的一些方法中，在妊娠前用变体GPIIIa免疫雌性小鼠，以诱导抗HPA-1a抗体的产生。在一些实施方案中，免疫接种包括施用来自表达变体GPIIIa的转基因小鼠的血小板，该变体GPIIIa包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q。在一些实施方案中，免疫接种包括施用变体GPIIIa(例如包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q)。通过已知的方法施用，优选通过注射施用。例如，可以在交配前1至14天之间、小鼠妊娠期期间或幼崽出生后进行一次或多次免疫接种。在一些实施方案中，在交配前1至14天之间进行一次或多次预免疫接种。
在本发明的某些方法中，测量母体、胎儿和/或新生儿抗HPA-1a抗体滴度。可以在来自成年小鼠、新生儿小鼠或胎儿小鼠的样品中测量抗体滴度。抗体滴度可通过已知方法测量，包括化学发光微粒免疫测定(CMIA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分选(FACS)、侧向层析法、酶联免疫吸附测定(ELISA)等。例如，可以通过将包含标记的适当抗原(例如HPA-1a)包被到表面(例如珠、微孔板或微粒)上，使抗原与待分析的样品反应，然后测量标记的强度来测量抗体滴度。也可以使用间接免疫测定。在一个实施方案中，使用单抗原珠测定法测量抗体滴度。在一个实施方案中，抗体滴度表示为平均荧光强度(MFI)值。
根据筛选测定，可以在一个或多个时间点评估抗体滴度。例如，可以在雌性小鼠交配前1至14天之间、交配后1至24天之间和/或产后1至28天之间测量抗体滴度。例如，可以在分娩后即刻，在分娩后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时，和/或在分娩后1、2、3、4、5和/或6天，和/或在分娩后1、2、3和/或4天测量新生儿幼崽的抗体滴度。例如，可以在妊娠第10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和/或22天测量胎儿的抗体滴度。在一些实施方案中，在向母体施用候选分子后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、24、30、36、42和/或48小时，和/或第1、2、3、4、5和/或6天，和/或第1、2、3或4周，测量成年、新生儿或胎儿小鼠的抗体滴度。
在本发明的一些方法中，测量从解剖的胎儿或从新生儿收集的血液中的胎儿或新生儿血小板计数。血小板计数可以使用血细胞计数器手动计算，或者可以使用例如光学光散射/荧光分析、流式细胞术或阻抗分析通过自动化方法测量。根据筛选测定，可以在一个或多个时间点确定血小板计数。例如，可以在分娩后即刻，在分娩后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时，和/或在分娩后1、2、3、4、5和/或6天，和/或在分娩后1、2、3和/或4天测量新生儿幼崽的血小板计数。例如，可以在妊娠第10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和/或22天测量胎儿的血小板计数。在一些实施方案中，在向母体施用候选分子后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、24、30、36、42和/或48小时，和/或第1、2、3、4、5和/或6天，和/或第1、2、3或4周，测量胎儿或新生儿幼崽的血小板计数。
在本发明的一些方面，评估胎儿或新生儿幼崽出血。本文所用的“出血”意指胎儿或新生儿幼崽的体腔、四肢或颅骨中的血液积聚。在一个实施方案中，出血是颅内出血。出血可以在解剖的胎儿或新生儿中目测评估。
本领域技术人员可以确定评估方案，例如抗体滴度、血小板计数、出血等的测量，可以根据经验确定，这取决于候选分子及其被筛选的特定作用。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明适用领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文定义和使用的所有定义应该理解为控制字典定义、以引用方式并入的文献中的定义和/或所定义术语的普通含义。
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用的方式并入每一个所引用的主题，在某些情况下，该主题可涵盖整个文件的整个内容。另外，本文引用或提及的任何产品的任何制造商的说明或目录均以引用方式并入。以引用方式并入本文的文件或其中的任何教导都可用于本发明的实践中。以引用方式并入本文的文件不被承认是现有技术。
说明书和权利要求中使用的不定冠词“一个/种(a/an)”，除非明确表示相反的意思，否则应该理解为意指“至少一个/种”。
本文在说明书和权利要求中使用的短语“和/或”应该被理解为意指如此结合的元素的“任一个或两个”，即元素在一些情况下连带地存在而在其他情况下分离地存在。用“和/或”列出的多个元素应以相同的方式解释，即“一个或多个”这样结合的元素。除了由“和/或”从句具体指明的元素之外，还可以任选地存在其他元素，无论与具体指明的那些元素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当与诸如“包含”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用在一个实施方案中可以仅指A(任选地包含除B以外的元素)；在另一个实施方案中可以仅指B(任选地包含除A以外的元素)；在又另一个实施例中，可以指A和B两者(任选地包括其他元素)等。
如本文说明书和权利要求书中所使用的，“或”应该理解为具有与上文定义的“和/或”相同的含义。例如，当在列表中分隔项目时，“或”或“和/或”应被理解为包含性的，即包含至少一个，还包括一个以上的数个或一系列元素，以及任选地另外的未列出的项目。只有明确表示相反的术语(例如“仅一个”或“恰好一个”)或者当在权利要求中使用时，“由……组成”将指包括数个或一系列元素中的恰好一个元素。一般而言，本文所用的术语“或”仅应被理解为在排它性术语如“任一”、“之一”、“仅一个”或“恰好一个”之前表示排它性的替代物(即“一个或另一个，但不是两个”)。当在权利要求中使用时，“基本上由……组成”应具有在专利法领域中使用的普通含义。
每当用措辞“包含”来描述实施方案时，包括以术语“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似实施方案。
如本文所用，有关数字的术语“大约”或“约”通常包括该数字在任一方向上(大于或小于)的5％范围内的数，除非另有说明或从上下文中明显看出(除非这样的数超过可能值的100％)。
数值范围包括限定该范围的数字，并且本文提供的任何单个值可用作包括本文提供的其他单个值的范围的端点。例如，一组值(诸如1、2、3、8、9和10)也是1-10、1-8、3-9等数字范围的公开。同样，所公开的范围是该范围所涵盖的每个单个值的公开。例如，5-10的所述范围也是5、6、7、8、9和10的公开。
已经根据一个或多个优选实施方案描述了本发明，并且应当理解，除了那些明确陈述的之外，许多等效物、替代物、变化和修改都是可能的，并且在本发明的范围内。
实施例
实施例1
本文描述的实施方案证明了使用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复的FNAIT的鼠模型的产生。具体地，该实施方案证明了在GPIIIa中包含相对于SEQ ID NO:25的T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q突变的转基因小鼠的产生。
材料和方法
抗体-本研究中使用了对人GPIIIa的Leu33等位基因异型体具有特异性的三种抗体：鼠单克隆抗体(mAb)SZ21 20、人mAb 26.4 21(来源于HPA-1a同种免疫妇女的永生化B细胞，该妇女的婴儿患有FNAIT)、以及B2G1 22(人源化IgG，来源于通过噬菌体展示从HPA-1a同种免疫妇女分离的scFv片段)。人类母体抗HPA-1a抗血清由Drs.Richard Aster、DanBougie和Brian Curtis(Blood Research Institute,BloodCenter of Wisconsin,Milwaukee,WI)提供。鼠mAb PSIB1，结合人和小鼠β3整合素PSI结构域两者，且其结合不受Leu33Pro多态性的影响23，由Heyu Ni博士(University of Toronto)友情提供。识别GPIIb-IIIa上的复合物依赖性表位，但不干扰HPA-1a抗体结合24的mAb AP2由Robert Montgomery博士(Blood Research Institute,BloodCenter of Wisconsin)提供。
使用CRISPR设计工具(crispr.mit.edu)设计表达鼠GPIIIa的APLD人源化形式-gRNA的小鼠的一步产生，以最小化脱靶效应，并选择在5′-NGG前间隔序列相邻基序(PAM)之前。为了产生共表达Cas9的运载体和靶向ITGB3外显子3的sgRNA(TTCTCCTTCAGGTTACATCG,SEQ ID NO:1)，将一对寡核苷酸(5’-CACCGTTCTCCTTCAGGTTACATCG-3’(SEQ ID NO:2)和5’-AAACCGATGTAACCTGAAGGAGAAC-3’(SEQ ID NO:3))退火并克隆到Cas9表达质粒px459(Addgene，Cambridge，MA)的BbsI位点。长度为200个核苷酸具有序列5'-GCCAGGGGGAGGTGACTTACCAGGCAGGAGGCACAGCCGCCCTAGCTCTG-ATGTTGACCTTTCCCTCGGGCTCTTCTCTTCATAGGCCTTGCCTCTGGGATCCCCACGCTGTGACCTGAAGGAGAACCTGCTGAAGGACAATTGTGCTCCAGAGTCTATTGAGTTCCCAGTCAGTGAGGCCCAGATCCTGGAGGCTAGGC-3'(SEQ ID NO:4)的单链寡脱氧核苷酸(ssODN)由Integrated DNA Technologies(IDT,Coralville,IA)合成。该寡核苷酸对应于鼠β3基因的反义链，并含有5个核苷酸取代，导致在鼠β3整合素亚单位的PSI结构域中引入4个人氨基酸取代。ssODN还含有四个沉默突变，其中两个将诊断性BamH1限制性位点引入质粒，两个突变序列以避免Cas9对人源化鼠β3基因的重复消化。
C57BL/6N雌性小鼠超数排卵并与C57BL/6N雄性小鼠交配，并从输卵管收集受精卵。将px459质粒(10ng/μl)和ssODN(5ng/μl)注射到受精卵母细胞的原核中。将注射的受精卵在含有氨基酸的单钾优化培养基(KSOM)中于37℃在5％CO2和95％湿润空气中培养过夜。然后将双细胞阶段胚胎转移到假孕雌性小鼠的输卵管中。将从幼崽尾部分离的基因组DNA通过PCR和随后的序列分析进行基因分型。使用GPIIIa fw1:5′-AACCATGGAAGGACCATGAC-3′(SEQ ID NO:5)和GPIIIa rev1:5′-CACCCCAGTCCTATCCTG-TG-3′(SEQ ID NO:6)扩增靶基因座周围的区域。使用Herculase II融合聚合酶(Agilent,Waldbronn,Germany)进行PCR反应。使用QiaQuick旋转柱纯化PCR产物，用BamHI(New England Biolabs Inc.,Ipswich,MA)消化，在2％琼脂糖凝胶上分析，并测序以证实DNA双链断裂已被准确修复。
表达鼠GPIIIa的APLDQ人源化形式的小鼠的一步产生-将CRISPR/Cas9显微注射混合物(包括gRNA(CTCCTCAGAGCACTCACACA,(SEQ ID NO:7))、ssODN5'-AGCCTTCCAGCCCACGCTGCAACAATGGGAACGGGACTTTTGAGTGTGGGGTGTGCCGCTGTGACCAGGGCTGGCTGGGGTCCCAATGCGAGTGCTCTGAGGAGGATTACCGACCCTCTCAGCAGGAAGAGTGCAGCCCCAAGGAGGGCCAGCCCATCTGCAGCCA-3'(SEQ ID NO:8)和Cas-9蛋白)注射到受精的APLD GPIIIa卵母细胞的细胞质中(图6A-6D)。通过PCR和随后的测序分析筛选显微注射出生的小鼠是否存在所需的点突变。使用GPIIIafw2:5’-GAGAAGGAGCAGTCTTTCACTATCAAGCC-3’(SEQ ID NO:9)和GPIIIa rev2:5’-GCAGGAGAAGTCATCGCACTCAC-3’(SEQ ID NO:10)扩增靶基因座周围的区域。
将氨基酸取代引入鼠和人GPIIIa质粒-编码鼠GPIIIa的cDNA表达运载体pCMV3-鼠ITGB3购自Creative Biogene(Shirley，NY)。使用Quick-Change定点突变形成试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)将核苷酸取代引入该质粒，以转变为T30→A、S32→P、Q33→L和N39→D，产生编码鼠GPIIIa(含有完全人源化的PSI结构域，称为APLD鼠GPIIIa)的质粒。以此作为模板，在鼠EGF1结构域内编码M470和P446的密码子中引入另外的突变，使它们分别人源化为Q470和H446，得到的构建体称为APLDQ、APLDH和APLDQH。相反，将G463P464→DQ、H446→P和Q470→M突变引入人ITGB3表达运载体pcDNA3-人ITGB3，以产生编码人GPIIIa的质粒，该质粒在人EGF1结构域内具有D463Q464、P446或M470。用于引入这些突变的引物列于表1。所有的构建体和突变都通过核苷酸测序进行证实。
表1：用于定点诱变的寡核苷酸引物
Figure BDA0003628453010000311
Figure BDA0003628453010000321
改变的序列用粗体表示。
野生型和突变型αllbβ3异型体的表达-用编码人αIIb的质粒连同编码野生型或突变型鼠或人GPIIIa的质粒转染HEK 293FT细胞。在转染前一天，使HEK 293FT细胞生长在含有10％FBS但不含抗生素的DMEM 6孔板中生长，以在转染时获得80％-90％的融合。用在250μL Opti-MEM I减血清培养基中的1μg每种质粒和5μLLipofectamine 2000(Invitrogen)转染细胞。转染后，使细胞在37℃下再生长48小时，以允许蛋白质表达。
流式细胞术-在转染后48小时，使用FACSCanto II或Accuri C6流式细胞仪(BDBiosciences)进行与瞬时转染的HEK293细胞结合的抗体的流式细胞术分析。将未转染的细胞用作阴性对照。适当时，使用FITC标记的山羊(Fab′)2抗人IgG、FITC标记的山羊(Fab′)2抗小鼠IgG检测抗体结合。使用FlowJo软件(Tree Star Inc.，Ashland，OR)分析数据。
通过抗HPA-1a同种抗体抑制PAC-1与人αIIbβ3的结合-用野生型人αIIbβ3加EGFP转染HEK293FT细胞。将细胞与mAb SZ21、B2G1或26.4(以2.5μg/ml)，或者与来自正常对照、PTP或FNAIT样品的纯化总IgG(以1:50的稀释度)在室温下预孵育30分钟，然后在添加含有0.2mM Ca+2和2mM Mn+2的2.5μg/ml PAC-1后再孵育30分钟。将细胞分别用鼠mAb AP3染色，以检测总β3表面表达，从而使结合和竞争数据标准化。在用Alexa Fluor 647缀合的山羊抗小鼠IgM(对于PAC-1)或Alexa Fluor 647缀合的山羊抗小鼠IgG(对于AP3)染色后，通过流式细胞术分析EGFP阳性细胞。PAC-1结合的平均荧光强度(MFI)被标准化为β3表达，并表示为缺乏抗HPA-1a同种抗体时对照的百分比。
改良的抗原捕获酶联免疫吸附测定-将8×107个经洗涤的人或鼠血小板与人FNAIT同种抗血清(以1:5稀释)在室温下孵育1小时，洗涤，然后在200μl含有蛋白酶抑制剂混合物(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)冰冷的裂解缓冲液[20mM Tris(pH7.4)、150mM NaCl、1％Triton X-100、1mM乙二胺四乙酸、10mM N-乙基马来酰亚胺]中裂解。将裂解物添加至已用抗小鼠CD41(eBioscience，San Diego，CA)包被的微量滴定孔中以从小鼠血小板捕获免疫复合物，或用mAb AP2包被的微量滴定孔中以从人血小板捕获免疫复合物。使用碱性磷酸酶缀合的抗人IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)检测结合的免疫复合物。
分子模拟和对接-使用Rosetta Antibody Protocol产生B2G1 Fab可变区的模型25-29。使用ClusPro蛋白质-蛋白质对接服务器将来自αIIbβ3 30(PDB代码:3FCS)的晶体结构的PSI和I-EGF1结构域的结构对接到抗体B2G1的CDR环区域中31-35。残基A30、P32和L33被定义为整合素β3的对接位点。使用“Antibody mode”自动掩蔽非互补性决定区域36。
统计学分析-数据显示为平均值±SEM。使用不成对的双尾学生t检验进行统计学比较。在P<0.05时，差异被认为具有统计学意义。
结果
在鼠血小板GPIIIa的PSI结构域中重建HPA-1a表位-如图1A-1B和图2A所示，多态氨基酸Leu33位于从GPIIIa的PSI结构域延伸的长柔性环的末端。先前的研究将一系列氨基酸取代掺入由鼠GPIIIa N-末端残基1-66组成的小构建体中，证明了需要人源化T30A、S32P、Q33L和N39D(如图2A所示)来重建I型HPA-1a选择性mAb SZ21和至少若干种人多克隆抗HPA-1a同种抗血清的结合37。基于这些数据，设计了CRISPR策略(图2B)，以将修复模板引入鼠ITGB3基因座的外显子3中，该外显子编码这四个氨基酸取代。从显微注射了编码图2B显示的gRNA、Cas9核酸内切酶和APLD HDR模板的质粒构建体(图2C)的60个受精卵中，一个雌性后代给出了适当确认的基因型(图2D-2F)，并被命名为APLD小鼠。
需要GPIIIa的EGF1结构域内的特定氨基酸来支持II型HPA-1a抗体的结合-先前的研究显示，对HPA-1a的免疫应答是多克隆的和异质的，需要一些含有亚群的同种抗血清，除了多态性氨基酸33之外，还需要线性距离远的EGF1结构域的待表征区域内的不连续序列19，38。如图3A所示，原型I型HPA-1a特异性mAb SZ21易与APLD结合，但不与野生型鼠GPIIIa(muGPIIIa)结合，证实了其表位在鼠PSI结构域内的重建。为了进一步了解可能存在于更复杂的多克隆人类母体抗HPA-1a同种抗血清中的抗体群体的结合所必需的结构要求，我们检测了五种不同的人FNAIT同种抗血清与固定在微量滴定孔中的muGPIIIa、APLD muGPIIIa或人GPIIIa结合的能力。如图3B所示，五种代表性同种抗血清中的三种与APLD muGPIIIa反应，而另外两种不反应，这与这些同种抗血清含有大量所谓的II型抗HPA-1a同种抗体(需要人源化PSI结构域外的残基来结合)19的概念相一致。另外的人抗HPA-1a同种抗血清的反应性和特异性如图7所示。
为了确定II型抗HPA-1a抗体结合的结构要求，我们检测了原型II型抗体mAb 26.4与鼠APLD血小板的结合。如图4A所示，类似于图3B中的人同种抗血清1和5，mAb 26.4不能与表达APLD GPIIIa的鼠血小板结合。仔细检查PSI和EGF1结构域之间的界面(图4B),发现从人GPIIIa的EGF1结构域延伸出来的环使氨基酸Q470与多态性残基Leu33非常接近。该残基是鼠GPIIIa中的甲硫氨酸(Ser469在两个物种中都是保守的)。为了确定Q470是否形成被II型抗HPA-1a抗体识别的表位的一部分，从我们的APLD小鼠开始，通过引入将改变鼠EGF1结构域中M470→Q的HDR(见方法)，我们进一步改进了鼠GPIIIa的序列。mAb 26.4现在易与来自第二代HPA-1a人源化转基因小鼠的血小板结合，我们将其命名为APLDQ小鼠(图4A)。相反，mAbSZ21的结合没有被EGF1结构域的另外的人源化所增强，这与其被归类为表位完全包含在PSI结构域内的I型抗体相一致。出乎意料的是，来自APLDQ小鼠的血小板与通过噬菌体展示从HPA-1a同种免疫的女性中分离的HPA-1a特异性mAb(称为B2G1)完全不反应22，这证明了多克隆母体抗HPA-1a同种抗血清中可能存在的抗体亚群特异性中的另外的未预期的复杂性。
图5A强调了GPIIIa的鼠相对于人PSI和EGF1结构域之间的氨基酸差异。如图所示，除了在空间上接近多态性残基33的Q470M差异之外，两个物种之间的EGF1中还存在六个另外的氨基酸差异。B2G1与GPIIIa的EGF1和PSI结构域的分子对接分析(图5B)揭示，在这七个氨基酸中，预测仅H446和Q470连同L33一起位于抗体/抗原界面。因此，鼠GPIIIa的APLDQ异型体的表达带有另外的Pro446→His氨基酸取代支持B2G1结合。相反，用脯氨酸残基取代人H446导致B2G1结合的完全丧失，而如果Q470被甲硫氨酸残基取代，B2G1和mAb 26.4都丧失了与人GPIIIa的反应性。相反，没有HPA-1a特异性抗体受到G463D和P464Q突变的影响(图5C)，与它们不存在于抗体/抗原界面一致(图5B)。综上所述，这些数据证明了可变数量的空间接近的非多态性氨基酸形成多个表位，每个表位以多态性残基33为中心，它们共同包含由抗HPA-1a抗血清中存在的多克隆抗体亚群识别的靶识别位点。
讨论
旨在表征HPA-1a表位的分子性质的早期研究发现，GPIIIa的胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶蛋白水解片段(大小从17kDa39到66kDa40)可以结合HPA-1a特异性同种抗体。Beer和Coller后来的研究41发现，66kDa多肽由GPIIIa的17kDa氨基末端片段(现在已知含有PSI结构域)与含有残基348-654(现在已知含有EGF1结构域)的更大的50kDa片段二硫键键合而组成。在发现HPA-1a表位的形成由GPIIIa氨基末端的Leu33Pro氨基酸取代控制13，14后，合成了围绕该多态性残基的小合成肽，但其不能结合HPA-1a同种抗体42，可能是由于线性肽不能折叠和采用合适的三级构象，这是因为GPIIIa的前55个氨基酸中有7个半胱氨酸残基形成复杂的二硫键键合结样结构。有趣的是，原核生物λgt22噬菌体菌斑中产生的由GPIIIa的前66个氨基酸(即完整的PSI结构域)组成的稍大的重组蛋白能够与来自PTP患者的四种不同的抗HPA-1a血清反应43，从而将HPA-1a表位定位于多态性氨基酸33周围的GPIIIa的氨基末端7kDa。
20世纪90年代中期发表的两项研究表明，由HPA-1a抗体子集识别的HPA-1表位可能更复杂。Valentin等人使用定点突变来破坏GPIIIa的PSI结构域与EGF1结构域之间连接的二硫键，并发现尽管一些抗HPA-1a同种抗体继续很好地结合，但近三分之一的抗体丧失了与突变蛋白的部分或全部反应性19。基于这些发现，作者提出HPA-1a抗体可以根据其对PSI和EGF1结构域中存在的非连续线性序列的依赖性分为I型或II型。Stafford及其同事44的成果支持了这一概念，他们发现121例母体抗HPA-1a同种抗体中约20％仅在GPIIIa的重组片段同时含有PSI和EGF1结构域时才与该片段反应。Honda及其同事38检测到II型抗体的存在，该抗体仅在Xenopus蛋白含有人氨基酸26-38以及氨基酸287-490时，才与由含有各种片段的人GPIIIa序列的Xenopus GPIIIa分子组成的嵌合蛋白反应。
从抗体的角度看表位：发现单独的HPA-1a抗体滴度并不总是与临床结果的严重程度相关45，46，并且另外将HPA-1a特异性同种抗体分为I型和II型，令人失望地是它们既没有提供诊断优势也没有提供预后优势44。然而，最近，Santoso和他的同事报告，当抗HPA-1a同种抗体的特定群体与内皮细胞上存在的整合素亚单位αv(而不是αIIb)复合时，其优先结合GPIIIa，并且此类抗体与FNAIT中颅内出血的发展密切相关47。这些发现有若干重要的含义。首先，这些发现强烈建议识别和区分所有母体多克隆抗HPA-1a抗血清中始终存在的抗HPA-1a抗体的不同群体，这可能是预测FNAIT病例中血小板减少症和出血风险的关键。其次，这些发现证明了多态性氨基酸残基33周围的局部构象的影响对确定同种抗体结合的核心靶识别位点及其随后的效应子结果具有深远的影响。我们发现两种不同的II型单克隆抗HPA-1a抗体的结合可以通过它们对GPIIIa的EGF1结构域内的不同氨基酸的需求而彼此区分(图5A-5C)，这进一步支持了抗体/表位识别不仅仅涉及多态性氨基酸，并且可能在包含几乎任何同种免疫应答的抗体亚群之间变化的观点。使用表达鼠GPIIIa(含有特异性鼠→人氨基酸取代)的细胞绘制针对HPA-1a的多克隆免疫应答图，连同HPA-1a特异性单克隆抗体数量的增加，可以实现同种抗体亚群的高分辨率分析，从而提供预测性诊断益处。有趣的是，初步研究(图8)表明，I型和II型同种抗体群体对血小板与其配体相互作用的能力有明显影响。尽管I型抗体的作用极小，但II型抗体可显著阻断纤维蛋白原模拟物PAC-1与GPIIb-IIIa复合物的结合，这可能是通过抑制整合素激活过程中GPIIIa的延伸实现的48。这方面的另外的研究是广泛计划的临床研究的主题。
给定多克隆血清中的单个抗体群体具有不同的表面形态要求，这解释了为什么它们能够诱导不同的病理生理学效应。在组织相容性测试领域，越来越多的证据表明，除了细胞表面抗原的基因型匹配之外，受体抗体/表位库的表型确定，包括分子表面聚集在一起的不连续位置残基提供的这些表位，可能是移植成功的重要预测因素49。基于结构的匹配已被证实为改善难治性血小板减少症患者血小板输注支持的策略50，51。因此，将需要精确的基于医学的诊断方案，所述研究方案不仅考虑多态性差异，还考虑同种抗体亚群的接触面积，以便对免疫应答的多克隆性质提供更精确的剖析，从而更准确地预测血小板减少症、出血和颅内出血的风险。
由GPIIIa中临床上重要的Leu33Pro多态性产生的应答的多克隆性质是复杂的，并且仍然是对预防和治疗都有意义的令人着迷的研究领域。考虑到HPA-1特异性抗体的多克隆性质，以及任何母体抗血清含有来自不同角度的多态性氨基酸33且由于涉及另外的残基而与不同的形态分布和不同的亲和力结合的抗体的可能性，我们怀疑可能需要HPA-1特异性mAb的混合物，而不是任何单一的mAb，来阻断多克隆母体抗体的结合，并防止从循环中清除胎儿血小板。鉴定EGF1中的两个残基(H446和Q470)对于II型抗HPA-1a同种抗体的结合是必要的和充分的，这并不排除EGF1内部或外部的残基可能需要支持仍待表征的II型同种抗体的结合的可能性。例如，据报道，PSI结构域内的D39和杂合物/PSI界面上的R93均影响人抗HPA-1a抗体的结合37，52，而其他抗体对整合素的弯曲构象具有特异性，可能是由于它们需要PSI和EGF1结构域两者，如本研究中所述。53我们的原子能级剖析证明了HPA-1a同种免疫个体的同种抗血清内存在越来越广泛的抗体亚群，这突出了开发具有窄表位特异性的单一试剂用以抑制同种抗体介导血小板破坏的挑战。在妊娠期间或分娩后不久引入母体循环中的人源化抗HPA-1a特异性mAb的预防性递送，可用于清除已经通过母体的新生儿血小板，从而首先预防或减轻同种免疫应答的发展。
实施例2
腹膜内注射抗HPA-1a mAb在APLDQ小鼠中诱导了严重的血小板减少症，但在野生型小鼠中不会。此外，当将来自APLDQ小鼠的血小板引入野生型小鼠时，其引发强烈的多克隆免疫应答，该应答对这些人源化残基产生的表位具有特异性，并且重要的是仅限于这些表位，这证明了鼠GPIIIa的APLDQ人源化形式在小鼠中具有免疫原性。用APLDQ血小板预免疫并与APLDQ雄性小鼠交配的野生型雌性小鼠产下严重血小板减少的幼崽，其中许多表现出伴随的出血表型(图11和图12A-12D)。然而，mAb 26.4有效抑制鼠多克隆抗APLDQ抗体与鼠APLDQ血小板的结合(图13)。
IVIG(静脉内注射免疫球蛋白)是一种高纯度的球蛋白制剂，从每批1000至15,000名健康献血者的混合血浆中获得。IVIG在多个水平上靶向细胞免疫隔室，包括先天和适应性免疫细胞。IVIG主要通过激活和抑制FcγRs与树突细胞、巨噬细胞和粒细胞相互作用。1988年报道了第一例母体输注IVIG用于治疗FNAIT(Bussel JB等人，New Engl JMed.1988；319(21):1374-8)，此后IVIG迅速成为FNAIT的标准产前治疗策略。最近的系统性综述表明，无论是否添加皮质类固醇，每周施用IVIG都是FNAIT的一线产前管理，并且有助于减少或减轻FNAIT对婴儿的影响以及降低血小板减少症的严重程度(Dian Winkelhorst等人BLOOD.2017；129(11):1538-1547)。
在交配后第10天和第17天向妊娠的雌性小鼠静脉内施用免疫球蛋白G(IVIG)或mAb 26.4降低了母体和胎儿循环中的抗APLDQ同种抗体的浓度，并且重要的是使幼崽的血小板计数正常化(图14和图15)。总之，这些数据建立了一个新型的FNAIT鼠模型，概括了FNAIT的许多临床重要特征。
参考文献
1.Newman PJ，McFarland JG，Aster RH.The AlloimmuneThrombocytopenias.In：Loscalzo J，Schafer AI，eds.Thrombosis and Hemorrhage：Lippincott Williams and Wilkins；2003：441-456.
2.Williamson LM，Hackett G，Rennie J，et al.The natural history offetomaternal alloimmunization to the platelet-specific antigen HPA-1a(PlA1，Zwa)as determined by antenatal screening.Blood.1998；92(7)：2280-2287.
3.Kjeldsen-Kragh J，Killie MK，Tomter G，et al.A screening andintervention program aimed to reduce mortality and serious morbidityassociated with severe neonatal alloimmune thrombocytopenia.Blood.2007；110(3)：833-839.
4.Bussel J.Diagnosis and management of the fetus and neonate withalloimmune thrombocytopenia.J Thromb Haemost.2009；7Suppl 1：253-257.
5.Giovangrandi Y，Daffos F，Kaplan C，Forestier F，Mac AJ，Moirot M.Veryearly intracranial haemorrhage in alloimmune fetalthrombocytopenia.Lancet.1990；336(8710)：310.
6.Mueller-Eckhardt C，Kiefel V，Grubert A，et al.348 cases of suspectedneonatal alloimmune thrombocytopenia.Lancet.1989；1：363-366.
7.Bonacossa IA，Jocelyn LJ.Alloimmune thrombocytopenia of the newborn：neurodevelopmental sequelae.Am J Perinatol.1996；13(4)：211-215.
8.Dreyfus M，Kaplan C，Verdy E，Schlegel N，Durand-Zaleski I，TcherniaG.Frequency of immune thrombocytopenia in newborns：a prospective study.ImmuneThrombocytopenia Working Group.Blood.1997；89(12)：4402-4406.
9.Spencer JA，Burrows RF.Feto-maternal alloimmune thrombocytopenia：aliterature review and statistical analysis.Aust N Z J Obstet Gynaecol.2001；41(1)：45-55.
10.Turner ML，Bessos H，Fagge T，et al.Prospective epidemiologic studyof the outcome and cost-effectiveness of antenatal screening to detectneonatal alloimmune thrombocytopenia due to anti-HPA-1a.Transfusion.2005；45(12)：1945-1956.
11.Curtis BR，McFarland JG.Human platelet antigens-2013.Vox Sang.2014；106(2)：93-102.
12.Davoren A，Curtis BR，Aster RH，McFarland JG.Human platelet antigen-specific alloantibodies implicated in 1162 cases of neonatal alloimmune thrombocytopenia.Transfusion.2004；44(8)：1220-1225.
13.Newman PJ，Derbes RS，Aster RH.The human platelet alloantigens，PlA1and PlA2，are associated with a leucine33/proline33 amino acid polymorphism inmembrane glycoprotein IIIa，and are distinguishable by DNAtyping.JClinInvest.1989；83：1778-1781.
14.Goldberger A，Kolodziej M，Poncz M，Bennett JS，Newman PJ.Effect ofsingle amino acid substitutions on the formation of the PlA and Bakalloantigenic epitopes.Blood.1991；78：681-687.
15.Valentin N，Vergracht A，Bignon JD，et al.HLA-DRw52a is involved inalloimmunization against PlA1 antigen.HumImmunol.1990；27：73-79.
16.Maslanka K，Yassai M，Gorski J.Molecular identification of T cellsthat respond in a primary bulk culture to a peptide derived from a plateletglycoprotein implicated in neonatal alloimmune thrombocytopenia.JClinInvest.1996；98：1802-1808.
17.Ahlen MT，Husebekk A，Killie MK，Skogen B，Stuge TB.T-cell responsesassociated with neonatal alloimmune thrombocytopenia：isolation of HPA-1a-specific，HLA-DRB3*0101-restricted CD4+ T cells.Blood.2009；113(16)：3838-3844.
18.Xiao T，Takagi J，Coller BS，Wang JH，Springer TA.Structural basis forallostery in integrins and binding to fibrinogen-mimetictherapeutics.Nature.2004；432(7013)：59-67.
19.Valentin N，Visentin GP，Newman PJ.Involvement of the cysteine-richdomain of glycoprotein IIIa in the expression of the human plateletalloantigen，PlA1：evidence for heterogeneity in the humoralresponse.Blood.1995；85(11)：3028-3033.
20.Weiss EJ，Goldschmidt-Clermont PJ，Grigoryev D，Jin Y，Kickler TS，BrayPF.A monoclonal antibody(SZ21)specific for platelet GPIIIa distingui shesPlA1 from PlA2.Tissue Antigens.1995；46(5)：374-381.
21.Eksteen M，Tiller H，Averina M，et al.Characterization of a humanplatelet antigen-1a-specific monoclonal antibody derived from a B cell from awoman alloimmunized in pregnancy.J Immunol.2015；194(12)：5751-5760.
22.Griffin HM，Ouwehand WH.A human monoclonal antibody specific forthe leucine-33(PlA1，HPA-1a)form of platelet glycoprotein IIIa from a V genephage display library.Blood.1995；86(12)：4430-4436.
23.Zhu G，Zhang Q，Reddy EC，et al.The integrin PSI domain has anendogenous thiol isomerase function and is a novel target for antiplatelettherapy.Blood.2017；129(13)：1840-1854.
24.Pidard D，Montgomery，RR，Bennett JS，Kunicki TJ.Interaction of AP-2，amonoclonal antibody specific for the human platelet glycoprotein IIb-IIIacomplex，with intact platelets.JBiolChem.1983；258：12582-12586.
25.Sivasubramanian A，Sircar A，Chaudhury S，Gray JJ.Toward high-resolution homology modeling of antibody Fv regions and application toantibody-antigen docking.Proteins.2009；74(2)：497-514.
26.Marze NA，Lyskov S，Gray JJ.Improved prediction of antibody VL-VHorientation.Protein Eng Des Sel.2016；29(10)：409-418.
27.Weitzner BD，Gray JJ.Accurate Structure Prediction of CDR H3 LoopsEnabled by a Novel Structure-Based C-Terminal Constraint.J Immunol.2017；198(1)：505-515.
28.Weitzner BD，Jeliazkov JR，Lyskov S，et al.Modeling and docking ofantibody structures with Rosetta.Nat Protoc.2017；12(2)：401-416.
29.Lyskov S，Chou FC，Conchuir SO，et al.Serverification of molecularmodeling applications：the Rosetta Online Server that Includes Everyone(ROSIE).PLoS One.2013；8(5)：e63906.
30.Zhu J，Luo BH，Xiao T，Zhang C，Nishida N，Springer TA.Structure of acomplete integrin ectodomain in a physiologic resting state and activationand deactivation by applied forces.Mol Cell.2008；32(6)：849-861.
31.Comeau SR，Gatchell DW，Vajda S，Camacho CJ.ClusPro：an automateddocking and discrimination method for the prediction of proteincomplexes.Bioinformatics.2004；20(1)：45-50.
32.Comeau SR，Gatchell DW，Vajda S，Camacho CJ.ClusPro：a fully automatedalgorithm for protein-protein docking.Nucleic Acids Res.2004；32(Web Serverissue)：W96-99.
33.Kozakov D，Brenke R，Comeau SR，Vajda S.PIPER：an FFT-based proteindocking program with pairwise potentials.Proteins.2006；65(2)：392-406.
34.Kozakov D，Beglov D，Bohnuud T，et al.How good is automated proteindocking？Proteins.2013；81(12)：2159-2166.
35.Kozakov D，Hall DR，Xia B，et al.The ClusPro web server for protein-protein docking.Nat Protoc.2017；12(2)：255-278.
36.Brenke R，Hall DR，Chuang GY，et al.Application of asymmetricstatistical potentials to antibody-protein docking.Bioinformatics.2012；28(20)：2608-2614.
37.Barron-Casella EA，Nebbia G，Rogers OC，King KE，Kickler TS，CasellaJF.Construction of a human platelet alloantigen-1a epitope(s)within murineglycoprotein IIIa：identification of residues critical to the conformation ofthe antibody binding site(s).Blood.1999；93(9)：2959-2967.
38.Honda S，Honda Y，Bauer B，Ruan C，Kunicki TJ.The impact of three-dimensional structure on the expression of PlA alloantigens on human integrinbeta 3.Blood.1995；86(1)：234-242.
39.Newman PJ，Martin LS，Knipp MA，Kahn RA.Studies on the nature of thehuman platelet alloantigen，PlA1：localization to a 17,000-daltonpolypeptide.MolImmunol.1985；22：719-729.
40.Kornecki E，Chung SY，Holt JC，Cierniewski CS，Tuszynski GP，Niewiarowski S.Identification of PlA1 alloantigen domain on a 66 kDa proteinderived from glycoprotein IIIa of human platelets.BiochimBiophysActa.1985；818(3)：285-290.
41.Beer J，Coller BS.Evidence that platelet glycoprotein IIIa has alarge disulfide-bonded loop that is susceptible to proteolyticcleavage.JBiolChem.1989；264：17564-17573.
42.Flug F，Espinola R，Liu LX，et al.A 13-mer peptide straddling theleucine33/proline33 polymorphism in glycoprotein IIIa does not define thePlA1 epitope.Blood.1991；77：1964-1969.
43.Bowditch RD，Tani PH，Halloran CE，Frelinger AL，III，McMillan R，Ginsberg MH.Localization of a PlA1 epitope to the amino terminal 66 residuesof platelet glycoprotein IIIa.Blood.1992；79：559-562.
44.Stafford P，Ghevaert C，Campbell K，et al.Immunologic and structuralanalysis of eight novel domain-deletion beta3 integrin peptides designed fordetection of HPA-1 antibodies.J Thromb Haemost.2008；6(2)：366-375.
45.Ghevaert C，Campbell K，Stafford P，et al.HPA-1a antibody potency andbioactivity do not predict severity of fetomatemal alloimmune thrombocytopenia.Transfusion.2007；47(7)：1296-1305.
46.Killie MK，Husebekk A，Kaplan C，Taaning E，Skogen B.Maternal humanplatelet antigen-1a antibody level correlates with the platelet count in thenewborns：a retrospective study.Transfusion.2007；47(1)：55-58.
47.Santoso S，Wihadmadyatami H，Bakchoul T，et al.Antiendothelialalphavbeta3 Antibodies Are a Major Cause of Intracranial Bleeding in Fetal/Neonatal Alloimmune Thrombocytopenia.Arterioscler Thromb Vasc Biol.2016；36(8)：1517-1524.
48.Zhou D，Thinn AMM，Zhao Y，Wang Z，Zhu J.Structure of an extendedbeta3integrin.Blood.2018；132(9)：962-972.
49.Duquesnoy RJ.The eplet load concept in clinicaltransplantation.Pediatr Transplant.2016；20(7)：884-885.
50.Duquesnoy RJ.Structural epitope matching for HLA-alloimmunizedthrombocytopenic patients：a new strategy to provide more effective platelettransfusion support？Transfusion.2008；48(2)：221-227.
51.Brooks EG，MacPherson BR，Fung MK.Validation of HLAMatchmakeralgorithm in identifying acceptable HLA mismatches for thrombocytopenicpatients refractory to platelet transfusions.Transfusion.2008；48(10)：2159-2166.
52.Watkins NA，Schaffner-Reckinger E，Allen DL，et al.HPA-1a phenotype-genotype discrepancy reveals a naturally occurring Arg93Gln substitution inthe platelet beta 3 integrin that disrupts the HPA-1a epitope.Blood.2002；99(5)：1833-1839.
53.Thinn AMM，Wang Z，Zhou D，Zhao Y，Curtis BR，Zhu J.Autonomousconformational regulation of beta3 integrin and the conformation-dependentproperty of HPA-1a alloantibodies.Proc Natl Acad Sci U S A.2018.
54.Hod E1，Schwartz J.，Platelet transfusion refractoriness.Br JHaematol.2008 Jul；142(3)：348-60.Epub 2008 May 28.
序列表
<110> 弗尔斯蒂血液研究所基金会股份有限公司(VERSITI BLOOD RESEARCHINSTITUTE FOUNDATION, INC.）
P·J·纽曼(Newman, Peter J.）
H·支(Zhi, Huiying)
<120> 胎儿/新生儿同种免疫性血小板减少症的鼠模型
<130> 160180.00134
<160> 48
<170> PatentIn Version 3.5
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<223> 合成的
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<211> 45
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 45
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成的
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<210> 21
<211> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 22
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<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 23
gtggggtatg ccgttgtgac cagggctggc tgggatccca g 41
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
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Glu Ala Arg Pro Leu Ser Ser Lys Gly Ser Gly Ser Ser Ala Gln Ile
65 70 75 80
Thr Gln Val Ser Pro Gln Arg Ile Ala Leu Arg Leu Arg Pro Asp Asp
85 90 95
Ser Lys Ile Phe Ser Leu Gln Val Arg Gln Val Glu Asp Tyr Pro Val
100 105 110
Asp Ile Tyr Tyr Leu Met Asp Leu Ser Phe Ser Met Lys Asp Asp Leu
115 120 125
Ser Ser Ile Gln Thr Leu Gly Thr Lys Leu Ala Ser Gln Met Arg Lys
130 135 140
Leu Thr Ser Asn Leu Arg Ile Gly Phe Gly Ala Phe Val Asp Lys Pro
145 150 155 160
Val Ser Pro Tyr Met Tyr Ile Ser Pro Pro Gln Ala Ile Lys Asn Pro
165 170 175
Cys Tyr Asn Met Lys Asn Ala Cys Leu Pro Met Phe Gly Tyr Lys His
180 185 190
Val Leu Thr Leu Thr Asp Gln Val Ser Arg Phe Asn Glu Glu Val Lys
195 200 205
Lys Gln Ser Val Ser Arg Asn Arg Asp Ala Pro Glu Gly Gly Phe Asp
210 215 220
Ala Ile Met Gln Ala Thr Val Cys Asp Glu Lys Ile Gly Trp Arg Asn
225 230 235 240
Asp Ala Ser His Leu Leu Val Phe Thr Thr Asp Ala Lys Thr His Ile
245 250 255
Ala Leu Asp Gly Arg Leu Ala Gly Ile Val Leu Pro Asn Asp Gly His
260 265 270
Cys His Ile Gly Thr Asp Asn His Tyr Ser Ala Ser Thr Thr Met Asp
275 280 285
Tyr Pro Ser Leu Gly Leu Met Thr Glu Lys Leu Ser Gln Lys Asn Ile
290 295 300
Asn Leu Ile Phe Ala Val Thr Glu Asn Val Val Ser Leu Tyr Gln Asn
305 310 315 320
Tyr Ser Glu Leu Ile Pro Gly Thr Thr Val Gly Val Leu Ser Asp Asp
325 330 335
Ser Ser Asn Val Leu Gln Leu Ile Val Asp Ala Tyr Gly Lys Ile Arg
340 345 350
Ser Lys Val Glu Leu Glu Val Arg Asp Leu Pro Glu Glu Leu Ser Leu
355 360 365
Ser Phe Asn Ala Thr Cys Leu Asn Asn Glu Val Ile Pro Gly Leu Lys
370 375 380
Ser Cys Val Gly Leu Lys Ile Gly Asp Thr Val Ser Phe Ser Ile Glu
385 390 395 400
Ala Lys Val Arg Gly Cys Pro Gln Glu Lys Glu Gln Ser Phe Thr Ile
405 410 415
Lys Pro Val Gly Phe Lys Asp Ser Leu Thr Val Gln Val Thr Phe Asp
420 425 430
Cys Asp Cys Ala Cys Gln Ala Phe Ala Gln Pro Ser Ser Pro Arg Cys
435 440 445
Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Glu Cys Gly Val Cys Arg Cys Asp Gln
450 455 460
Gly Trp Leu Gly Ser Met Cys Glu Cys Ser Glu Glu Asp Tyr Arg Pro
465 470 475 480
Ser Gln Gln Glu Glu Cys Ser Pro Lys Glu Gly Gln Pro Ile Cys Ser
485 490 495
Gln Arg Gly Glu Cys Leu Cys Gly Gln Cys Val Cys His Ser Ser Asp
500 505 510
Phe Gly Lys Ile Thr Gly Lys Tyr Cys Glu Cys Asp Asp Phe Ser Cys
515 520 525
Val Arg Tyr Lys Gly Glu Met Cys Ser Gly His Gly Gln Cys Asn Cys
530 535 540
Gly Asp Cys Val Cys Asp Ser Asp Trp Thr Gly Tyr Tyr Cys Asn Cys
545 550 555 560
Thr Thr Arg Thr Asp Thr Cys Met Ser Thr Asn Gly Leu Leu Cys Ser
565 570 575
Gly Arg Gly Asn Cys Glu Cys Gly Ser Cys Val Cys Val Gln Pro Gly
580 585 590
Ser Tyr Gly Asp Thr Cys Glu Lys Cys Pro Thr Cys Pro Asp Ala Cys
595 600 605
Ser Phe Lys Lys Glu Cys Val Glu Cys Lys Lys Phe Asn Arg Gly Thr
610 615 620
Leu His Glu Glu Asn Thr Cys Ser Arg Tyr Cys Arg Asp Asp Ile Glu
625 630 635 640
Gln Val Lys Glu Leu Thr Asp Thr Gly Lys Asn Ala Val Asn Cys Thr
645 650 655
Tyr Lys Asn Glu Asp Asp Cys Val Val Arg Phe Gln Tyr Tyr Glu Asp
660 665 670
Thr Ser Gly Arg Ala Val Leu Tyr Val Val Glu Glu Pro Glu Cys Pro
675 680 685
Lys Gly Pro Asp Ile Leu Val Val Leu Leu Ser Val Met Gly Ala Ile
690 695 700
Leu Leu Ile Gly Leu Ala Thr Leu Leu Ile Trp Lys Leu Leu Ile Thr
705 710 715 720
Ile His Asp Arg Lys Glu Phe Ala Lys Phe Glu Glu Glu Arg Ala Arg
725 730 735
Ala Lys Trp Asp Thr Ala Asn Asn Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Thr Ser
740 745 750
Thr Phe Thr Asn Ile Thr Tyr Arg Gly Thr
755 760
<210> 26
<211> 762
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 26
Glu Ser Asn Ile Cys Thr Thr Arg Gly Val Asn Ser Cys Gln Gln Cys
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Pro Val Cys Ala Trp Cys Ser Asp Glu Ala Leu Pro
20 25 30
Leu Gly Ser Pro Arg Cys Asp Leu Lys Glu Asn Leu Leu Lys Asp Asn
35 40 45
Cys Ala Pro Glu Ser Ile Glu Phe Pro Val Ser Glu Ala Gln Ile Leu
50 55 60
Glu Ala Arg Pro Leu Ser Ser Lys Gly Ser Gly Ser Ser Ala Gln Ile
65 70 75 80
Thr Gln Val Ser Pro Gln Arg Ile Ala Leu Arg Leu Arg Pro Asp Asp
85 90 95
Ser Lys Ile Phe Ser Leu Gln Val Arg Gln Val Glu Asp Tyr Pro Val
100 105 110
Asp Ile Tyr Tyr Leu Met Asp Leu Ser Phe Ser Met Lys Asp Asp Leu
115 120 125
Ser Ser Ile Gln Thr Leu Gly Thr Lys Leu Ala Ser Gln Met Arg Lys
130 135 140
Leu Thr Ser Asn Leu Arg Ile Gly Phe Gly Ala Phe Val Asp Lys Pro
145 150 155 160
Val Ser Pro Tyr Met Tyr Ile Ser Pro Pro Gln Ala Ile Lys Asn Pro
165 170 175
Cys Tyr Asn Met Lys Asn Ala Cys Leu Pro Met Phe Gly Tyr Lys His
180 185 190
Val Leu Thr Leu Thr Asp Gln Val Ser Arg Phe Asn Glu Glu Val Lys
195 200 205
Lys Gln Ser Val Ser Arg Asn Arg Asp Ala Pro Glu Gly Gly Phe Asp
210 215 220
Ala Ile Met Gln Ala Thr Val Cys Asp Glu Lys Ile Gly Trp Arg Asn
225 230 235 240
Asp Ala Ser His Leu Leu Val Phe Thr Thr Asp Ala Lys Thr His Ile
245 250 255
Ala Leu Asp Gly Arg Leu Ala Gly Ile Val Leu Pro Asn Asp Gly His
260 265 270
Cys His Ile Gly Thr Asp Asn His Tyr Ser Ala Ser Thr Thr Met Asp
275 280 285
Tyr Pro Ser Leu Gly Leu Met Thr Glu Lys Leu Ser Gln Lys Asn Ile
290 295 300
Asn Leu Ile Phe Ala Val Thr Glu Asn Val Val Ser Leu Tyr Gln Asn
305 310 315 320
Tyr Ser Glu Leu Ile Pro Gly Thr Thr Val Gly Val Leu Ser Asp Asp
325 330 335
Ser Ser Asn Val Leu Gln Leu Ile Val Asp Ala Tyr Gly Lys Ile Arg
340 345 350
Ser Lys Val Glu Leu Glu Val Arg Asp Leu Pro Glu Glu Leu Ser Leu
355 360 365
Ser Phe Asn Ala Thr Cys Leu Asn Asn Glu Val Ile Pro Gly Leu Lys
370 375 380
Ser Cys Val Gly Leu Lys Ile Gly Asp Thr Val Ser Phe Ser Ile Glu
385 390 395 400
Ala Lys Val Arg Gly Cys Pro Gln Glu Lys Glu Gln Ser Phe Thr Ile
405 410 415
Lys Pro Val Gly Phe Lys Asp Ser Leu Thr Val Gln Val Thr Phe Asp
420 425 430
Cys Asp Cys Ala Cys Gln Ala Phe Ala Gln Pro Ser Ser Pro Arg Cys
435 440 445
Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Glu Cys Gly Val Cys Arg Cys Asp Gln
450 455 460
Gly Trp Leu Gly Ser Gln Cys Glu Cys Ser Glu Glu Asp Tyr Arg Pro
465 470 475 480
Ser Gln Gln Glu Glu Cys Ser Pro Lys Glu Gly Gln Pro Ile Cys Ser
485 490 495
Gln Arg Gly Glu Cys Leu Cys Gly Gln Cys Val Cys His Ser Ser Asp
500 505 510
Phe Gly Lys Ile Thr Gly Lys Tyr Cys Glu Cys Asp Asp Phe Ser Cys
515 520 525
Val Arg Tyr Lys Gly Glu Met Cys Ser Gly His Gly Gln Cys Asn Cys
530 535 540
Gly Asp Cys Val Cys Asp Ser Asp Trp Thr Gly Tyr Tyr Cys Asn Cys
545 550 555 560
Thr Thr Arg Thr Asp Thr Cys Met Ser Thr Asn Gly Leu Leu Cys Ser
565 570 575
Gly Arg Gly Asn Cys Glu Cys Gly Ser Cys Val Cys Val Gln Pro Gly
580 585 590
Ser Tyr Gly Asp Thr Cys Glu Lys Cys Pro Thr Cys Pro Asp Ala Cys
595 600 605
Ser Phe Lys Lys Glu Cys Val Glu Cys Lys Lys Phe Asn Arg Gly Thr
610 615 620
Leu His Glu Glu Asn Thr Cys Ser Arg Tyr Cys Arg Asp Asp Ile Glu
625 630 635 640
Gln Val Lys Glu Leu Thr Asp Thr Gly Lys Asn Ala Val Asn Cys Thr
645 650 655
Tyr Lys Asn Glu Asp Asp Cys Val Val Arg Phe Gln Tyr Tyr Glu Asp
660 665 670
Thr Ser Gly Arg Ala Val Leu Tyr Val Val Glu Glu Pro Glu Cys Pro
675 680 685
Lys Gly Pro Asp Ile Leu Val Val Leu Leu Ser Val Met Gly Ala Ile
690 695 700
Leu Leu Ile Gly Leu Ala Thr Leu Leu Ile Trp Lys Leu Leu Ile Thr
705 710 715 720
Ile His Asp Arg Lys Glu Phe Ala Lys Phe Glu Glu Glu Arg Ala Arg
725 730 735
Ala Lys Trp Asp Thr Ala Asn Asn Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Thr Ser
740 745 750
Thr Phe Thr Asn Ile Thr Tyr Arg Gly Thr
755 760
<210> 27
<211> 762
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 27
Glu Ser Asn Ile Cys Thr Thr Arg Gly Val Asn Ser Cys Gln Gln Cys
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Pro Met Cys Ala Trp Cys Ser Asp Glu Ala Leu Pro
20 25 30
Leu Gly Ser Pro Arg Cys Asp Leu Lys Glu Asn Leu Leu Lys Asp Asn
35 40 45
Cys Ala Pro Glu Ser Ile Glu Phe Pro Val Ser Glu Ala Gln Ile Leu
50 55 60
Glu Ala Arg Pro Leu Ser Ser Lys Gly Ser Gly Ser Ser Ala Gln Ile
65 70 75 80
Thr Gln Val Ser Pro Gln Arg Ile Ala Leu Arg Leu Arg Pro Asp Asp
85 90 95
Ser Lys Ile Phe Ser Leu Gln Val Arg Gln Val Glu Asp Tyr Pro Val
100 105 110
Asp Ile Tyr Tyr Leu Met Asp Leu Ser Phe Ser Met Lys Asp Asp Leu
115 120 125
Ser Ser Ile Gln Thr Leu Gly Thr Lys Leu Ala Ser Gln Met Arg Lys
130 135 140
Leu Thr Ser Asn Leu Arg Ile Gly Phe Gly Ala Phe Val Asp Lys Pro
145 150 155 160
Val Ser Pro Tyr Met Tyr Ile Ser Pro Pro Gln Ala Ile Lys Asn Pro
165 170 175
Cys Tyr Asn Met Lys Asn Ala Cys Leu Pro Met Phe Gly Tyr Lys His
180 185 190
Val Leu Thr Leu Thr Asp Gln Val Ser Arg Phe Asn Glu Glu Val Lys
195 200 205
Lys Gln Ser Val Ser Arg Asn Arg Asp Ala Pro Glu Gly Gly Phe Asp
210 215 220
Ala Ile Met Gln Ala Thr Val Cys Asp Glu Lys Ile Gly Trp Arg Asn
225 230 235 240
Asp Ala Ser His Leu Leu Val Phe Thr Thr Asp Ala Lys Thr His Ile
245 250 255
Ala Leu Asp Gly Arg Leu Ala Gly Ile Val Leu Pro Asn Asp Gly His
260 265 270
Cys His Ile Gly Thr Asp Asn His Tyr Ser Ala Ser Thr Thr Met Asp
275 280 285
Tyr Pro Ser Leu Gly Leu Met Thr Glu Lys Leu Ser Gln Lys Asn Ile
290 295 300
Asn Leu Ile Phe Ala Val Thr Glu Asn Val Val Ser Leu Tyr Gln Asn
305 310 315 320
Tyr Ser Glu Leu Ile Pro Gly Thr Thr Val Gly Val Leu Ser Asp Asp
325 330 335
Ser Ser Asn Val Leu Gln Leu Ile Val Asp Ala Tyr Gly Lys Ile Arg
340 345 350
Ser Lys Val Glu Leu Glu Val Arg Asp Leu Pro Glu Glu Leu Ser Leu
355 360 365
Ser Phe Asn Ala Thr Cys Leu Asn Asn Glu Val Ile Pro Gly Leu Lys
370 375 380
Ser Cys Val Gly Leu Lys Ile Gly Asp Thr Val Ser Phe Ser Ile Glu
385 390 395 400
Ala Lys Val Arg Gly Cys Pro Gln Glu Lys Glu Gln Ser Phe Thr Ile
405 410 415
Lys Pro Val Gly Phe Lys Asp Ser Leu Thr Val Gln Val Thr Phe Asp
420 425 430
Cys Asp Cys Ala Cys Gln Ala Phe Ala Gln Pro Ser Ser Pro Arg Cys
435 440 445
Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Glu Cys Gly Val Cys Arg Cys Asp Gln
450 455 460
Gly Trp Leu Gly Ser Gln Cys Glu Cys Ser Glu Glu Asp Tyr Arg Pro
465 470 475 480
Ser Gln Gln Glu Glu Cys Ser Pro Lys Glu Gly Gln Pro Ile Cys Ser
485 490 495
Gln Arg Gly Glu Cys Leu Cys Gly Gln Cys Val Cys His Ser Ser Asp
500 505 510
Phe Gly Lys Ile Thr Gly Lys Tyr Cys Glu Cys Asp Asp Phe Ser Cys
515 520 525
Val Arg Tyr Lys Gly Glu Met Cys Ser Gly His Gly Gln Cys Asn Cys
530 535 540
Gly Asp Cys Val Cys Asp Ser Asp Trp Thr Gly Tyr Tyr Cys Asn Cys
545 550 555 560
Thr Thr Arg Thr Asp Thr Cys Met Ser Thr Asn Gly Leu Leu Cys Ser
565 570 575
Gly Arg Gly Asn Cys Glu Cys Gly Ser Cys Val Cys Val Gln Pro Gly
580 585 590
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595 600 605
Ser Phe Lys Lys Glu Cys Val Glu Cys Lys Lys Phe Asn Arg Gly Thr
610 615 620
Leu His Glu Glu Asn Thr Cys Ser Arg Tyr Cys Arg Asp Asp Ile Glu
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Tyr Lys Asn Glu Asp Asp Cys Val Val Arg Phe Gln Tyr Tyr Glu Asp
660 665 670
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675 680 685
Lys Gly Pro Asp Ile Leu Val Val Leu Leu Ser Val Met Gly Ala Ile
690 695 700
Leu Leu Ile Gly Leu Ala Thr Leu Leu Ile Trp Lys Leu Leu Ile Thr
705 710 715 720
Ile His Asp Arg Lys Glu Phe Ala Lys Phe Glu Glu Glu Arg Ala Arg
725 730 735
Ala Lys Trp Asp Thr Ala Asn Asn Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Thr Ser
740 745 750
Thr Phe Thr Asn Ile Thr Tyr Arg Gly Thr
755 760
<210> 28
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 28
Met Cys Ala Trp Cys Ser Asp Glu Ala Leu Pro Leu Gly Ser Pro Arg
1 5 10 15
Cys Asp
<210> 29
<211> 62
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 29
ctcttctctt catagacttt gtctcagggc tcaccccgat gtaacctgaa ggagaacctg 60
ct 62
<210> 30
<211> 62
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 30
agcaggttct ccttcaggtt acatcggggt gagccctgag acaaagtcta tgaagagaag 60
ag 62
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 31
Thr Leu Ala Gln Gly Ser Pro Arg Cys Asn
1 5 10
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 32
Ala Leu Pro Leu Gly Ser Pro Arg Cys Asp
1 5 10
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 33
aggcgttgcc tctgggatcc ccacgatgtg acc 33
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 34
agactttgtc tcagggctca ccccgatgta acc 33
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 35
aggcgttgcc tctgggatcc ccacgctgtg acc 33
<210> 36
<211> 57
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 36
Gly Pro Asn Ile Cys Thr Thr Arg Gly Val Ser Ser Cys Gln Gln Cys
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Pro Met Cys Ala Trp Cys Ser Asp Glu Ala Leu Pro
20 25 30
Leu Gly Ser Pro Arg Cys Asp Leu Lys Glu Asn Leu Leu Lys Asp Asn
35 40 45
Cys Ala Pro Glu Ser Ile Glu Phe Pro
50 55
<210> 37
<211> 57
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 37
Glu Ser Asn Ile Cys Thr Thr Arg Gly Val Asn Ser Cys Gln Gln Cys
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Pro Val Cys Ala Trp Cys Ser Asp Glu Thr Leu Ser
20 25 30
Gln Gly Ser Pro Arg Cys Asn Leu Lys Glu Asn Leu Leu Lys Asp Asn
35 40 45
Cys Ala Pro Glu Ser Ile Glu Phe Pro
50 55
<210> 38
<211> 40
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
Cys Asp Cys Ala Cys Gln Ala Gln Ala Glu Pro Asn Ser His Arg Cys
1 5 10 15
Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Glu Cys Gly Val Cys Arg Cys Gly Pro
20 25 30
Gly Trp Leu Gly Ser Gln Cys Glu
35 40
<210> 39
<211> 40
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 39
Cys Asp Cys Ala Cys Gln Ala Phe Ala Gln Pro Ser Ser Pro Arg Cys
1 5 10 15
Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Glu Cys Gly Val Cys Arg Cys Asp Gln
20 25 30
Gly Trp Leu Gly Ser Met Cys Glu
35 40
<210> 40
<211> 50
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 40
ccagggctgg ctggggtcca tgtgtgagtg ctctgaggag gattaccgac 50
<210> 41
<211> 50
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 41
gtcggtaatc ctcctcagag cactcacaca tggaccccag ccagccctgg 50
<210> 42
<211> 4
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 42
Ser Met Cys Glu
1
<210> 43
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 43
Ser Gln Cys Glu
1
<210> 44
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 44
tcccaatgcg ag 12
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 45
Trp Leu Gly Ser Met Cys Glu Cys Ser Glu
1 5 10
<210> 46
<211> 33
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 46
gctggctggg gtccatgtgt gagtgctctg agg 33
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 47
Trp Leu Gly Ser Gln Cys Glu Cys Ser Glu
1 5 10
<210> 48
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 48
gctggctggg gtcccaatgc gagtgctctg agg 33

Claims (36)

1.一种转基因小鼠，其基因组包含编码与SEQ ID NO:25具有至少95％同一性的变体血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)的核酸，其中所述变体GPIIIa包含SEQ ID NO:25中的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q。
2.如权利要求1所述的转基因小鼠，其中所述小鼠表达包含SEQ ID NO:26中所示序列的变体GPIIIa。
3.如权利要求1所述的转基因小鼠，其中所述变体GPIIIa进一步包含相对于SEQ IDNO:25的突变V22M。
4.如前述权利要求中任一项所述的转基因小鼠，其中所述变体GPIIIa能够与抗HPA-1a抗体结合。
5.一种鉴定能够与变体血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)特异性结合的分子的体外方法，所述方法包括：
a)将候选分子与来自如前述权利要求中任一项所述的转基因小鼠的血小板接触；并且
b)确定所述候选分子是否与所述血小板结合；
其中如果所述候选分子与来自所述转基因小鼠的血小板结合但不与来自野生型小鼠的血小板结合，则所述候选分子能够与所述变体GPIIIa特异性结合。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述候选分子选自由抗体、Fv、F(ab)、F(ab′)、F(ab′)2以及前述任一种的单链形式组成的组。
7.一种鉴定能够防止雌性小鼠中抗HPA-1a同种免疫应答的分子的体内方法，所述方法包括：
a)给试验小鼠施用候选分子，其中所述试验小鼠怀有野生型血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)复合包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa杂合的幼崽，并且其中所述试验小鼠抗HPA-1a抗体呈阴性；并且
b)测量所述试验小鼠的抗HPA-1a抗体滴度；
其中如果通过单抗原珠测定法在产后两周检测不到所述试验小鼠的抗HPA-1a抗体滴度，则所述候选分子能够防止抗HPA-1a同种免疫应答。
8.如权利要求7所述的方法，其中在产后六周检测不到所述试验小鼠中的所述抗HPA-1a抗体滴度。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述候选分子选自由抗体、Fv、F(ab)、F(ab′)、F(ab′)2以及前述任一种的单链形式组成的组。
10.一种鉴定能够抑制抗HPA-1a同种抗体与胎儿或新生儿血小板结合的分子的体内方法，所述方法包括：
a)给试验小鼠施用候选分子，其中所述试验小鼠怀有野生型血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)复合包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa杂合的幼崽，并且其中所述试验小鼠在妊娠前用(i)来自如权利要求1所述的转基因小鼠的血小板或(ii)包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa进行免疫；并且
b)测量胎儿或新生儿血小板计数；
其中如果所述试验小鼠幼崽的胎儿或新生儿血小板计数高于对照小鼠幼崽的胎儿或新生儿血小板计数，则所述候选分子能够抑制抗HPA-1a同种抗体与胎儿或新生儿血小板结合。
11.如权利要求10所述的方法，其中与对照小鼠的幼崽相比，所述试验小鼠幼崽的出血减少或被阻止。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述候选分子选自由抗体、Fv、F(ab)、F(ab′)、F(ab′)2以及前述任一种的单链形式组成的组。
13.一种鉴定能够抑制抗HPA-1a同种抗体通过妊娠小鼠胎盘的分子的体内方法，所述方法包括：
a)给试验小鼠施用候选分子，其中所述试验小鼠怀有野生型血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)复合包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa杂合的幼崽，并且其中所述试验小鼠在妊娠前用(i)来自如权利要求1所述的转基因小鼠的血小板或(ii)包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa进行免疫；并且
b)测量胎儿或新生儿抗HPA-1a抗体滴度；
其中如果所述试验小鼠幼崽的胎儿或新生儿抗体滴度低于对照小鼠幼崽的胎儿或新生儿抗体滴度，则所述候选分子能够抑制抗HPA-1a同种抗体通过所述妊娠小鼠的胎盘。
14.如权利要求13所述的方法，其中与对照小鼠的幼崽相比，所述试验小鼠的幼崽的出血减少或被阻止。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述候选分子选自由抗体、Fv、F(ab)、F(ab′)、F(ab′)2以及前述任一种的单链形式组成的组。
16.一种变体血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)，其包含SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列。
17.一种鉴定能够与抗HPA-1a抗体竞争与如权利要求16所述的变体GPIIIa结合的分子的体外方法，所述方法包括：
a)将所述变体GPIIIa与所述抗HPA-1a抗体接触以形成GPIIIa-抗体复合物，其中所述变体GPIIIa固定在底物上，并且其中所述抗HPA-1a抗体包含标记；
b)将所述GPIIIa-抗体复合物与溶液中的候选分子接触；并且
c)通过检测底物上或溶液中的标记量来确定所述候选分子是否与所述抗HPA-1a抗体竞争与所述变体GPIIIa的结合；
其中如果与所述GPIIIa-抗体复合物与所述候选分子接触之前在所述底物上检测到的标记量相比，在所述GPIIIa-抗体复合物与所述候选分子接触之后在所述底物上检测到的标记量减少，则所述候选分子能够与所述抗HPA-1a抗体竞争与所述变体GPIIIa的结合；
或者其中如果与所述GPIIIa-抗体复合物与所述候选分子接触之前所述溶液中标记量相比，在所述GPIIIa-抗体复合物与所述候选分子接触之后所述溶液中标记量增加，则所述候选分子能够与所述抗HPA-1a抗体竞争与所述变体GPIIIa结合。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述抗HPA-1a抗体是单克隆抗体26.4。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中所述标记选自由荧光团、放射性同位素、化学发光探针和生物发光探针组成的组。
20.如权利要求17、18或19所述的方法，其中所述底物选自由珠、树脂、颗粒、膜和凝胶组成的组。
21.如权利要求17-20中任一项所述的方法，其中所述候选分子选自由抗体、Fv、F(ab)、F(ab′)、F(ab′)2以及前述任一种的单链形式组成的组。
22.一种制备如权利要求1-4中任一项所述的转基因小鼠的方法，所述方法包括：
a)向受精的鼠卵母细胞的细胞质中注射i)Cas9核酸酶或编码Cas9核酸酶的核苷酸；ii)靶向鼠ITGB3外显子3的gRNA；iii)靶向鼠ITGB3外显子10的gRNA；iv)编码GPIIIa中相对于SEQ ID NO:25的T30A、S32P、Q33L和N39D突变的单链同源定向修复(HDR)模板寡核苷酸；和ii)编码GPIIIa中相对于SEQ ID NO:25的M470Q突变的单链HDR模板寡核苷酸；
b)将由所述经注射的卵母细胞产生的双细胞阶段胚胎植入假孕雌性小鼠的输卵管中；并且
c)筛选由假孕雌性小鼠生下的小鼠中GPIIIa中存在相对于SEQ ID NO:25的T30A、S32P、Q33L、N39D和M470Q突变的小鼠。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述靶向ITGB3外显子10的gRNA包含SEQ ID NO:7。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中所述编码M470Q突变的单链HDR模板寡核苷酸另外编码诊断限制性位点。
25.如权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述编码M470Q突变的单链HDR模板寡核苷酸另外编码ITGB3外显子10的一个或多个沉默突变，以使Cas9对ITGB3在外显子10处的重复消化沉默。
26.如权利要求22-25中任一项所述的方法，其中所述编码M470Q突变的单链HDR模板寡核苷酸包含SEQ ID NO:8。
27.如权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述靶向ITGB3外显子3的gRNA包含SEQ ID NO:1。
28.如权利要求22-27中任一项所述的方法，其中所述编码T30A、S32P、Q33L和N39D突变的单链HDR模板寡核苷酸另外编码诊断限制性位点。
29.如权利要求22-28中任一项所述的方法，其中所述编码T30A、S32P、Q33L和N39D突变的单链HDR模板寡核苷酸另外编码ITGB3外显子3的一个或多个沉默突变，以使Cas9对ITGB3在外显子3处的重复消化沉默。
30.如权利要求22-29中任一项所述的方法，其中所述编码T30A、S32P、Q33L和N39D突变的单链HDR模板寡核苷酸包含SEQ ID NO:4。
31.一种转基因小鼠，其基因组包含编码与SEQ ID NO:27具有至少95％同一性的变体血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)的核酸，其中所述变体GPIIIa包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q。
32.如权利要求31所述的转基因小鼠，其中所述小鼠表达包含SEQ ID NO:27中所示序列的变体GPIIIa。
33.如权利要求31或32所述的转基因小鼠，其中所述变体GPIIIa能够与抗HPA-1a抗体结合。
34.一种怀有野生型血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)复合包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa杂合的幼崽的小鼠。
35.如权利要求34所述的小鼠，其中所述小鼠抗HPA-1a抗体呈阳性。
36.如权利要求35所述的小鼠，其中所述小鼠在妊娠前用(i)来自如权利要求1所述的转基因小鼠的血小板或(ii)包含相对于SEQ ID NO:25的突变T30A、S32P、Q33L、N29D和M470Q的变体GPIIIa进行免疫。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2022381210A1 (en) * 2021-11-08 2024-05-02 Rallybio Ipa, Llc ASSAYS FOR QUANTIFICATION OF ANTI-HPA-1a ANTIBODIES

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2211993A1 (en) * 1995-01-31 1996-08-08 The Rockefeller University Identification of dec, (dentritic and epithelial cells, 205 kda), a receptor with c-type lectin domains, nucleic acids encoding dec, and uses thereof
US6066778A (en) * 1996-11-06 2000-05-23 The Regents Of The University Of Michigan Transgenic mice expressing APC resistant factor V
CN108794631A (zh) * 2018-06-12 2018-11-13 广州血液中心 一种鼠源性抗鼠cd36单克隆抗体的制备方法
CN109803530A (zh) * 2016-07-29 2019-05-24 瑞泽恩制药公司 包含引起c-截短的原纤维蛋白-1表达的突变的小鼠
CN110384074A (zh) * 2019-07-15 2019-10-29 广州医科大学 一种Kir7.1基因失活的小鼠模型及其构建方法

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US661108A (en) 1899-12-04 1900-11-06 Albert Schmitz Manufacture of compound tubes.
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4870009A (en) 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
US4736866B1 (en) 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
AU6505690A (en) 1989-09-26 1991-04-28 Richard R Behringer Erythroid-specific gene expression system
DE4000939A1 (de) 1990-01-15 1991-07-18 Brem Gottfried Prof Dr Dr Verfahren zur antikoerpergewinnung
AU1228592A (en) 1991-01-11 1992-08-17 American Red Cross Expression of active human protein c in mammary tissue of transgenic animals
US6331658B1 (en) 1993-04-20 2001-12-18 Integris Baptist Medical Center, Inc. Genetically engineered mammals for use as organ donors
US5639940A (en) 1994-03-03 1997-06-17 Pharmaceutical Proteins Ltd. Production of fibrinogen in transgenic animals
US6204431B1 (en) 1994-03-09 2001-03-20 Abbott Laboratories Transgenic non-human mammals expressing heterologous glycosyltransferase DNA sequences produce oligosaccharides and glycoproteins in their milk
US5959171A (en) 1994-08-17 1999-09-28 Pharming B.V. Method for the production of biologically active polypeptides in a mammal's
US5880327A (en) 1994-09-21 1999-03-09 American National Red Cross Transgenic mammals expressing human coagulation factor VIII
US6339183B1 (en) 1995-06-05 2002-01-15 New York University Transgenic mammals expressing heterologous DNA in urothelium and isolation of biologically active molecules from urine
US6166288A (en) 1995-09-27 2000-12-26 Nextran Inc. Method of producing transgenic animals for xenotransplantation expressing both an enzyme masking or reducing the level of the gal epitope and a complement inhibitor
AU7385596A (en) 1995-10-02 1997-04-28 Duke University Dopamine transporter knockout mice
EP0971724B1 (en) 1997-02-14 2010-01-20 American Red Cross Expression of active human factor ix in mammary tissue of transgenic animals
CN1292638A (zh) 1998-01-08 2001-04-25 第一制药株式会社 基因突变动物
AU4951300A (en) 1999-05-31 2000-12-18 Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc. Lkb1 gene knockout animals

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2211993A1 (en) * 1995-01-31 1996-08-08 The Rockefeller University Identification of dec, (dentritic and epithelial cells, 205 kda), a receptor with c-type lectin domains, nucleic acids encoding dec, and uses thereof
US6066778A (en) * 1996-11-06 2000-05-23 The Regents Of The University Of Michigan Transgenic mice expressing APC resistant factor V
CN109803530A (zh) * 2016-07-29 2019-05-24 瑞泽恩制药公司 包含引起c-截短的原纤维蛋白-1表达的突变的小鼠
CN108794631A (zh) * 2018-06-12 2018-11-13 广州血液中心 一种鼠源性抗鼠cd36单克隆抗体的制备方法
CN110384074A (zh) * 2019-07-15 2019-10-29 广州医科大学 一种Kir7.1基因失活的小鼠模型及其构建方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DARKO ZDRAVIC等: "Fetal and neonatal alloimmune thrombocytopenia", SEMINARS IN FETAL & NEONATAL MEDICINE, vol. 21, no. 1, pages 19 - 27, XP029408944, DOI: 10.1016/j.siny.2015.12.004 *
HUIYING ZHI等: "High-resolution mapping of the polyclonal immune response to the human platelet alloantigen HPA-1a(PlA1)", BLOOD ADVANCES, vol. 2, no. 21, pages 3001 - 3011, XP055702326, DOI: 10.1182/bloodadvances.2018023341 *

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