WO1999018114A1 - Nouveaux conjugues fluorescents de nucleosides ou de nucleotides, leur procede de preparation et leurs utilisations - Google Patents

Nouveaux conjugues fluorescents de nucleosides ou de nucleotides, leur procede de preparation et leurs utilisations Download PDF

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WO1999018114A1
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triphosphate
cryptate
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rare earth
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PCT/FR1998/002111
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Hervé Bazin
Gérard Mathis
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Cis Bio International
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/40—Rare earth chelates

Definitions

  • the invention relates to new fluorescent conjugates of nucleosides or nudeotides, which can be used in particular for detecting, localizing and / or isolating nucleic acids or molecules of biological or clinical interest with a nucleoside structure or capable of interacting with nucleic acids.
  • RNA ribonucleic acid
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • A Adenosine
  • An enzymatic DNA synthesis reaction employs an RNA or DNA template, an oligonucleotide primer of sequence complementary to a segment of the template, an appropriate enzyme and four deoxynucleotides dATP, dCTP, dGTP and dTTP (or dUTP).
  • Various enzymes are known, such as E.
  • RNA polymerase T7 DNA polymerase, the Klenow fragment of DNA polymerase, Taq DNA polymerase, a reverse transcriptase, to which we can add the nucleotidyl transferase terminal which has the particularity of not requiring of matrix.
  • the synthesis of RNA is carried out in a similar manner except that the primers and templates required are different and that ribonucleotides (ATP, CTP, GTP and UTP) are used in the presence of RNA polymerases.
  • Nudeotides or polynucleotides can be radioactively labeled
  • nudeotides are incorporated in vitro into polynucleotides by the action of DNA or RNA polymerases (EP 0 063 879) and allow colorimetric detection of nucleic acids by a “dot-blot” reaction (Leary JJ, Brigati DJ and Ward DD; 1983; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4045-49).
  • Bio-15-dGTP has also been described (Gilliam I.C. and Tener G. M.; 1989; Nucleoside &Nucleotide; 8, 1453-62). Fluorescent derivatives such as fluorescein or rhodamine can be incorporated into a nucleic acid via a labeled nucleoside triphosphate (dATP, dUTP, dCTP) (WO 93 19206).
  • nucleoside triphosphate labeled using different tracers allows simultaneous visualization of different sequences during hybridization (RIED T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89, 1388-1392).
  • fluorescein-labeled deoxynucleotides such as FI-dUTP or FI-dCTP is also carried out by only partially replacing the natural nucleotide with the labeled compound, dCTP / FldCTP ⁇ 2: 1 (WO93 / 19206).
  • This same patent describes that by a choice of the enzyme and experimental conditions, it is possible to substitute the whole of a nucleotide by a labeled nucleotide.
  • Data from the literature show that the efficiency of incorporation of a triphosphate conjugate is modified by the coupling of a molecule such as biotin and to a lesser extent by the presence of the arm allowing coupling.
  • Molecules conjugated to nucleoside triphosphates are molecules of relatively small size ( ⁇ 800Da), either neutral or negatively charged and of essentially planar shape and consequently, their bulk is reduced but sufficient to disturb the enzymatic incorporation of the nucleoside triphosphate.
  • nucleosides or nudeotides comprising:
  • a native or chemically modified ribo- or deoxyribo-nucleoside or nucleotide or conjugate to one or more marker molecules including at least one carbon atom of the ring or one exocyclic nitrogen atom of the purine or pyrimidine ring or one carbon atom of the pentofuranose ring is likely to be involved in a bond with a fluorescent marker, and
  • said conjugates comprise:
  • Said conjugates can be used in all the applications of labeled nucleosides or nudeotides without presenting major drawbacks of use and in particular have a high capacity to be incorporated into single stranded or double stranded DNA.
  • These properties are all the more surprising since the rare earth cryptâtes are molecules of high molecular mass (greater than 1400 Da), having a three-dimensional structure which has more steric bulk than a globally planar molecule, and having a character ionic resulting from the presence of the complexed ion which gives them a positive charge.
  • the positive charges of a rare earth cryptate would strongly interact with the negative charges of the triphosphate group and modify its reactivity as well as the fluorescence qualities of the cryptate.
  • the activity of enzymes such as the polymerases being sensitive to the presence and to the concentration of certain ions or complexing agents in the reaction medium, it could be expected that the conjugates according to the invention would cause a strong reduction in the incorporation of the triphosphate nudeotides, and therefore a low yield, especially during a synthesis of polynucleotides.
  • the results obtained using the conjugates according to the invention show that not only the rare earth cryptates have no unfavorable influence in applications which involve enzymatic reactions, but retain their intrinsic fluorescent properties.
  • the conjugates according to the invention have new fluorescence characteristics and, in particular, that the emission lifetime of the complexed rare earth ion is significantly increased.
  • Said conjugates can therefore be used as fluorescent markers in all the uses in which quantitative or qualitative detection is carried out by measuring direct or indirect fluorescence.
  • the invention relates to fluorescent conjugates of nudeotides comprising a ribonucleotide chosen from AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, CMP, CDP, CTP, UMP, UDP, UTP, TMP, TDP, TTP , 2Me AMP, 2Me ADP, 2Me ATP, 1Me GMP, 1Me GDP, 1Me GTP, 5Me CMP, 5Me CDP, 5Me CTP, 5MeO CMP 5MeO CDP, 5MeO CTP, 7-concesaza-ATP, 7-déaza-GTP ou, le where appropriate, a deoxyribo-nucleotide chosen from the deoxy- or dideoxy-ribonucleotides corresponding to these ribo-nucleotides, and in particular
  • nudeotides which can be used for the purposes of the invention also include chemically modified nudeotides on the triphosphate part, in particular the ⁇ -thiotriphosphates derivatives.
  • the invention relates to fluorescent conjugates of nucleosides in which the ribo- or deoxyribo-nucleoside is chosen from A, G,
  • the fluorescent marker consists of a rare earth cryptate preferably chosen from terbium, europium, samarium cryptates or dysprosium.
  • said rare earth cryptate consists of at least one rare earth salt complexed with a macropolycyclic compound of formula
  • Z is an atom having 3 or 4 valences
  • R is nothing or represents hydrogen, the hydroxy group, an amino group or a hydrocarbon radical
  • the bivalent radicals @, (D and ⁇ , are independently one of l other hydrocarbon chains which optionally contain one or more heteroatoms and are optionally interrupted by a heteromacrocycle, at least one of the radicals (A), (g) and ⁇ further comprising at least one molecular unit or essentially consisting of a molecular motif, said molecular motif having a triplet energy greater than that of the emissive level of the complexed rare earth ion.
  • the molecular unit is chosen from phenanthroline, anthracene, benzene, naphthalene, bi- and ter-phenyl, azobenzene, azopyridine, pyridine, bipyridines, bisquinolines and the compounds of the following formulas:
  • Xi and X 2 which may be identical or different denote oxygen, nitrogen or sulfur,
  • the fluorescent marker is a rare earth cryptate consisting of the terbium or europium ion complexed by one of the macrocyclic compounds below:
  • a particularly advantageous marker is the europium cryptate Eu tris bipyridine.
  • macropolycyclic cryptate compounds complexing rare earth ions in which the molecular motif is chosen from bipyrazines, bipyrimidines and nitrogen heterocycies comprising N-oxide groups.
  • Macropolycyclic compounds with bipyrazine units are described in F. Bodar-Houillon et al., New J. Chem., 1996, 20, 1041-1045.
  • Macropolycyclic compounds with bipyrimidine units are described in J. M. Lehn et al., Helv. Chim. Acta, 1992, 75, 1221.
  • Macropolycyclic compounds comprising nitrogenous heterocycies comprising N-oxide groups are described in J.M. Lehn et al., Helv. Chim. Acta, 1991, 74, 572.
  • the rare earth cryptate used as fluorescent marker can also consist of at least one rare earth salt complexed with a macropolycyclic compound corresponding to one of the formulas II or III below:
  • - Y is a group or a spacer arm which is constituted by a bivalent organic radical, chosen from linear or branched C 1 to C 20 alkylene groups optionally containing one or more double bonds and / or optionally containing one or more heteroatoms such as oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus or one or more carbamoyl or carboxamido group (s); among C 5 -C 6 cycloalkylene groups or among C 6 -C arylene groups, said alkylene, cycloalkylene or arylene groups being optionally substituted by alkyl, aryl or sulfonate groups;
  • - Z is a functional group capable of binding covalently with a biological substance
  • - R is a methyl group or represents the group -Y-Z;
  • R - R ' is hydrogen or a group -COOR "in which R" is alkyl to C 10 and preferably represents methyl, ethyl or tert-butyl or R' is a -CO-NH-YZ group .
  • said fluorescent label can be linked to the ribo- or deoxyribonucleoside or nucleotide either directly or via an arm spacing.
  • direct bond is meant the binding of the fluorescent label to a functional group previously introduced or generated on one or more atoms of the base or of the pentofuranose unit of the ribo- or deoxyribonucleoside or nucleotide.
  • the term “functional group” denotes any function carried by the nudeosidic or nudeotidic part or introduced onto this part by any method known by a person skilled in the art and capable of binding by covalent bond, directly or after activation with a function. present on the cryptate or on the spacer arm carried by the cryptate.
  • Such functional groups are in particular the NH 2, COOH, CHO, OH or SH functions as well as the functions capable of giving covalent bonds by substitution (halides, sulfonates, epoxide) or by addition (double bonds of maleimide type). These functions are generally carried by a hydrocarbon chain itself connected to the nudeoside or nudeotide part.
  • This spacer arm is for example constituted by a bivalent organic radical, chosen from linear or branched alkylene groups of CrC 20 , optionally containing one or more double bonds or triple bonds and / or optionally containing one or more heteroatoms, such as l oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus or one or more carbamoyl or carboxamido group (s); C 5 -C 8 cycloalkylene groups and C 6 -C ⁇ 4 arylene groups, said alkylene, cycloalkylene or arylene groups being optionally substituted by alkyl, aryl or sulfonate groups.
  • a bivalent organic radical chosen from linear or branched alkylene groups of CrC 20 , optionally containing one or more double bonds or triple bonds and / or optionally containing one or more heteroatoms, such as l oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus or one or more carbamoyl or carboxamido group (s); C 5 -C 8 cycloalkylene groups
  • the conjugate according to the invention comprises a deoxyribonucleotide which is deoxyuridine, a fluorescent label which is the europium cryptate Eu trisbipyridine and a spacer arm which is a 3-aminoallyl group.
  • the invention also relates, according to a further aspect, to a process for the preparation of the conjugates described above.
  • Said preparation process is characterized in that a native or chemically modified ribo- or deoxyribonucleoside or nucleotide or conjugate is reacted with one or more marker molecules, including at least one ring carbon atom or one atom exocyclic nitrogen from the purine or pyrimidine cycle, or a carbon atom of the pentofuranose unit is likely to be involved in a bond with a fluorescent marker with at least one fluorescent marker linked to said atom (s) (s) consisting of a rare earth cryptate, and isolating the conjugate thus obtained.
  • marker molecules including at least one ring carbon atom or one atom exocyclic nitrogen from the purine or pyrimidine cycle, or a carbon atom of the pentofuranose unit is likely to be involved in a bond with a fluorescent marker with at least one fluorescent marker linked to said atom (s) (s) consisting of a rare earth cryptate, and isolating the conjugate thus obtained.
  • ribo- or deoxyribonucleosides or nudeotides as well as the fluorescent markers which can be used in this preparation process are as described above.
  • conjugates according to the invention which comprise a ribo- or a deoxyribonudeotide are particularly suitable for all the applications which require a qualitative or quantitative measurement during the synthesis or the use of polynucleotides.
  • the invention also relates to the polynucleotides comprising at least one fluorescent conjugate of ribo- or deoxyribonuucleotide as described above as a constitutive nucleotide.
  • the polynucleotides obtained by incorporating conjugates according to the invention can comprise a number of conjugates greater than 1, and therefore a number of fluorescent markers greater than 1.
  • conjugates according to the invention it is thus possible to carry out the polymarking of polynucleotides by the enzymatic route.
  • This technique makes it possible to obtain labeled polynucleotides more easily and while ensuring better reproducibility than using the conventional techniques of fluorescent labeling by chemical means. In particular, it avoids the separation steps necessary to remove from the medium the polynucleotides and / or unreacted functionalized fluorescent markers.
  • the conjugates according to the invention which comprise a ribo- or a deoxyribonudeotide can be used for the detection and / or the localization of compounds containing at least one nucleic acid sequence.
  • these uses there may be mentioned without limitation: - the detection and / or localization of specific DNA sequences, for example with a view to establishing chromosome mapping or the detection of a mutation; - the synthesis of probes usable in biomedical research or for establishment of a clinical diagnosis.
  • They can also be used in a method for measuring the enzymatic activity of an enzyme involved in a nucleic acid synthesis reaction, for example a DNA or RNA polymerase activity, reverse transcriptase, transferase or ligase, in which the fluorescence emitted directly or indirectly by said conjugate is measured, said fluorescence emission being correlated with the rate of incorporation of said conjugate into the synthesized nucleic acid polynucleotide.
  • an enzyme involved in a nucleic acid synthesis reaction for example a DNA or RNA polymerase activity, reverse transcriptase, transferase or ligase
  • the conjugates according to the invention can also be used to measure the enzymatic activity of an enzyme having as substrate a nucleic acid, for example a phosphodiesterase, DNAse or Rnase activity, the fluorescence emitted directly or indirectly by said conjugate being correlated either with said activity, or to the inhibition of said activity.
  • an enzyme having as substrate a nucleic acid for example a phosphodiesterase, DNAse or Rnase activity
  • nucleic acids can also be used to measure an enzymatic activity modifying the structure of a nucleic acid such as a heiicase or integrase activity or an activity modifying the topology of a nucleic acid such as a topoisomerase activity.
  • conjugates according to the invention can also be used as markers, for example for the preparation of a compound comprising a nucleic acid in which said conjugate is incorporated for detection.
  • the fluorescence emitted by the conjugates according to the invention can be either "direct”: the light signal is emitted by the conjugate after excitation at a given wavelength, or "indirede”: the emission of the light signal is induced by a transfer of non-radiative energy between the conjugate after excitation known as “donor compound” and another fluorescent molecule known as “acceptor compound”.
  • the fluorescent acceptor compound has an absorption spectrum which at least partially covers the emission spectrum of the donor and has a high molar absorbance in this overlap zone , and an emission spectrum in a wavelength range where the donor has a weak intrinsic emission;
  • the acceptor and the donor are located close to each other, the orientation of their transition dipoles being approximately parallel.
  • EXAMPLE 1 Synthesis of deoxyuridine labeled with europium cryptate trisbipyridine (conjugate K-11-dUTP).
  • the number 11 indicates the total number of atoms of the spacer arm and of the functional group which links the cryptate structure to the nucleotide (here, the bond is made at position 5 of the pyrimidine).
  • the nucleoside triphosphate used is 5- [N- (6-aminocaproyl) -3- aminoallyl] -2'-deoxyuridine-5'-triphosphate] (AH-dUTP) prepared by reaction of the N-hydroxysuccinimide trifluoroacetamido-caproate ( M.
  • the europium cryptate [(bis-bpy) - (bpy-diacid)] thus obtained (4 mg) is dissolved in 0.5 ml of anhydrous acetonitrile and 1 mg of N-hydroxysuccinimide is added, then a solution of 1.9 mg of dicyclohexylcarbodiimide dissolved in 0.5 ml of acetonitrile. After 16 h of reaction, the precipitate of dicydohexyluree is filtered and the N-hydroxysuccinimide cryptate solution is used directly for coupling.
  • fraction 1 The compound of Rt ⁇ 16.4 min is collected, then this fraction, called fraction 1, is concentrated under vacuum (speed-vac) to a volume of 350 ⁇ l and contains 8 UA304 nm. Estimating a £ 304 ⁇ 35,000, it is estimated that the K-dUTP concentration is around 0.72 M.
  • fraction 2 150 ⁇ l of a solution of K-dUTP called fraction 2 containing 1.95 UA304 nm.
  • EXAMPLE 2 Purification of the K-11-dUTP Conjugate by Ion Exchange A C10 / 20 column (Pharmacia Biotech., Uppsala, S) filled with DEAE Sepharose® Fast Flow (Pharmacia) balanced in TEAB buffer is used 10 mM containing 10% methanol. A K-11-dUTP solution also containing unconjugated functionalized europium trisbipyridine cryptate is deposited and the column is eluted (8 ml / min) with 40 ml of buffer A (10 mM TEAB containing 10% methanol).
  • the elution is continued (8 ml / min) with a linear gradient from 10 mM TEAB 10% methanol (100 ml) to 200 mM TEAB 10% methanol (100 ml) and fractions of 5 ml are collected. It is observed that the fluorescence (620 nm) is concentrated in the tubes 43 to 44 which indicates that the K-11-dUTP is eluted at a concentration s 0J6 mM TEAB. The fractions containing K-11-dUTP are combined and concentrated.
  • the template DNA is obtained by PCR amplification (from the English “Polymerase Chain Reaction”) of a fragment of the k-ras gene (exon I) limited by the following primers:
  • PCR medium 25 ⁇ l BUAM (CIS bio international) 10X 8 ⁇ l Antisens-bio primer 8 ⁇ l Sens primer 10 ⁇ l taq polymerase (1, 25U / ml) 10 ⁇ l dNTP (four natural dNTP 5mM each)
  • PCR medium 100 ⁇ l human placenta DNA (Sigma) 0.01 ⁇ g / ⁇ l 89 ⁇ l milli-Q water.
  • the PCR medium is divided into 5 microtubes (5 ⁇ 50 ⁇ l), the tubes are placed in a thermocycler and subjected to 31 cycles of PCR according to the protocol of example 5.
  • the double stranded DNA resulting from the PCR (equivalent to 25 pmol of biotin primer) is incubated in the presence of 300 ⁇ g of Dynabeads-streptavidin M-280 (Dynal, N).
  • SS DNA single-stranded DNA
  • HCl neutralized HCl
  • the copy reaction was also carried out in the presence of DNA polymerase I, Klenow fragment (37 ° C., 45 min) and gives substantially the same results.
  • Example 3 The single-stranded DNA described in Example 3 is used.
  • the tubes are heated for 2 min to 90 ° C (denaturation) and then incubated at 70 ° C in a thermocycler. Samples (9 ⁇ l) are taken at 0, 5, 10, 15 and
  • the samples are diluted at a rate of 8 ⁇ l in 200 ⁇ l of buffer L
  • 620 nm and at 665 nm on a Discovery device (Microplate HTRF - PACKARD analyzer).
  • a region of exon 1 of the k-ras gene limited by the primers S and AS described in example 3 is amplified.
  • a mixture of the 4 natural dephynucleotide triphosphates is used respectively: 5 mM dATP, 5 mM dCTP, 5 mM dGTP and 3.5 mM dTTP.
  • the PCR media are prepared according to the following table, using human placenta DNA (Sigma) at 0.01 ⁇ g / ⁇ l.
  • the PCR reaction is carried out using the following protocol: 1. 5 min / 95 ° C 2.1 1 min / 94 ° C (denaturation) 2.2 1 min / 60 ° C (circularization)
  • the principle of the measurement consists in hybridizing the biotinylated CP probe on the amplified DNA fragment, then putting the hybrid in the presence of the conjugate ⁇
  • the acceptor emits fluorescence at 665 nm with a long lifespan, which makes it possible to differentiate this signal from the fluorescence inherent in the acceptor which has a short lifespan.
  • K1-, K1 +, K2- and K2 + media from the PCR reactions are used.
  • 2 ⁇ l of each PCR medium are deposited to which 10 ⁇ l of CP probe (0.03 UA260 / ml) and 13 ⁇ l of BUAM buffer (2X) are added, the sealed tubes are brought to 10 ° C. at 94 ° C. then 20 min at 50 ° C using a thermal cycler.
  • 5 ⁇ l of hybridization medium are diluted in 200 ⁇ l of buffer L and 40 ⁇ l of this dilution are pipetted into the "Test" wells of a microtiter plate and 40 ⁇ l into the "white” wells (96 well flat bottom microplate HTRF, Packard).
  • the results show that the K-11-dUTP conjugate is incorporated during a PCR reaction.
  • the presence of the cryptate molecules linked to the amplified DNA can be demonstrated by the hybridization of a specific probe of this amplified DNA and revealed by a non-radiative energy transfer between the cryptate and a linked acceptor. with the hybridized probe.
  • EXAMPLE 6 Synthesis of deoxyuridine labeled with europium cryptate trisbipyridine (K-4-dUTP).
  • the number 4 indicates the total number of atoms of the arm which connects the structure cryptate to the nucleotide (here the bonding is done at position 5 of pyrimidine).
  • the nucleoside triphosphate used is 5- (3-aminoallyl) -2'-deoxyuridine-
  • AA-dUTP 5'-triphosphate
  • TEAB triethylammonium hydrogen carbonate
  • 300 ⁇ l of a solution of cryptate [TBP- (Eu3 +)] activated at 4 mg / ml in acetonitrile, ie 0.85 ⁇ mol, are added (about 3 equivalents).
  • the activated cryptate [TBP- (Eu3 +)] is prepared extemporaneously as described in example 1, method A.
  • Fraction 1 The Rt s compound is collected 16.3 min; this fraction, called Fraction 1, is concentrated under vacuum (speed-vac) to a volume of 200 ⁇ i and then injected onto the same column eluted with a 25 mM triethylammonium acetate buffer pH7 containing 5% acetonitrile. The fraction corresponding to the single peak of the chromatogram is collected (16 min ⁇ Rt ⁇ 19 min) and concentrated under vacuum (speed-vac) to obtain 260 ⁇ l of a solution of K-4-dUTP called Fraction 2 containing 6.0 UA303. By estimating an 8393 ⁇ 35,000, the concentration of K-4-dUTP is estimated at approximately 0.65 mM.
  • the compound is analyzed by mass spectrometry (electrospray negative mode):
  • EXAMPLE 7 Synthesis of uridine labeled with europium cryptate trisbipyridine (K-11-UTP).
  • the number 11 indicates the total number of atoms of the spacer arm which connects the cryptate structure to the nucleotide (here the binding takes place at position 5 of the pyrimidine).
  • the nucleoside triphosphate used is 6-aminocaproyl- [5- (3-aminoallyl) - Uridine-5'-triphosphate] (AH-UTP) prepared as indicated in Example 1.
  • the compound is purified on DEAE-Sepharose ® (Pharmacia) in a linear gradient of triethylammonium hydrogen carbonate (25mM to 300mM).
  • fraction 1 is injected on the same column eluted with a 25 mM triethylammonium acetate buffer pH7 containing 5% acetonitrile.
  • the fraction c - responding to the single peak of the chromatogram is collected (Rt ⁇ 16.5 min) and concentrated under vacuum (speed-vac) to obtain 202 ⁇ l of a K-11-UTP solution called fraction 2 containing 7, 5 UA304 nm.
  • the compound is analyzed by mass spectrometry (electrospray negative mode):
  • the compound is analyzed by FPLC (mono-Q column, Pharmacia).
  • Buffer A 20mM sodium acetate pH 5.2 containing 10% acetonitrile. Buffer
  • the cryptate of Europium [(bis-bpy) (bpy-di (amidoethyleneamine)] described in example 4 of application EP 0 321 353 (hereinafter referred to as KNH 2 ) is used as the reference cryptate.
  • a mother solution of KNH 2 in water is prepared and its concentration is determined by measuring the optical density at 306 nm using an 8306 ⁇ 30,000.
  • the mother solution (6.7 x 10 ⁇ M) is diluted 1 / 100 èm ⁇ in 0JM Tris-HCl buffer pH 9; 100 ⁇ l of this intermediate dilution are then diluted in 600 ⁇ l of the same buffer.
  • a stock solution of K-11-dUTP, K-4-dUTP and K-11-UTP prepared respectively according to examples 1, method A; 6 and 7) in water, the concentration of which is estimated at 3 x 10 "5 M by measuring the optical density at 304 nm (8304 ⁇ 35000).
  • Each stock solution is diluted to 50 ⁇ l in 1 ml of Tris-HCI 0JM buffer pH 7.4 or in Tris-HCI 0JM pH 9 buffer .
  • the values of the emission lifetime of the Europium are measured using a time-resolved spectrofluorimeter of the LS50 (Perkin-Elmer) type and 5 mm x 5 mm Helma cells.
  • EXAMPLE 9 Incorporation of K-11-dUTP during the elongation of an oligonucleotide by the Terminale Nucleotidyl Transferor (Demonstration by transfer of non-radiant energy and measurement of fluorescence in time resolved): A microtube is prepared in which takes place the elongation reaction using: - 25 ⁇ l of 0.2M Tris-acetate buffer pH 7.2
  • composition A2C3G7T3 biotinylated in 5 ′ a solution of an oligonucleotide (composition A2C3G7T3 biotinylated in 5 ′).
  • TnT Terminal Deoxynucleotidyl Transferor
  • a "blank” is produced from a reaction mixture described above in which the enzyme has not been added but replaced by 1 ⁇ l of water, 2 ⁇ l of this mixture are taken and it is subjected to the treatments and dilutions described above. 50 ⁇ l of this diluted sample are pipetted into the wells called "white” to which 50 ⁇ l of SA-XL555 conjugate and 150 ⁇ l of buffer L are added.
  • the fluorescence is read at 620 nm and at 665 nm on a DISCOVERY device (Microplate HTRF-analyzer PACKARD).
  • EXAMPLE 10 Photophysical Properties of an Oligonucleotide in Which Cryptate Molecules Are Incorporated An incorporation reaction of K-11-dUTP is carried out with TnT according to Example 9 by multiplying all the quantities by 3. It is verified that the incorporation of K-11-dUTP follows the same kinetics by carrying out the measurement of DF as a function of time. After 80 minutes of reaction, it is stopped with 12 ⁇ l of 400 mM EDTA solution. 105 ⁇ l of reaction mixture are taken and placed on an NAP5 column (Pharmacia) balanced in 10 mM phosphate buffer pH 7.4.
  • fraction 1 exclusion volume
  • SA-XLggs conjugate CIS bio international
  • fractions 2, 3 have a low DF value compared to that of F1 and a high raw fluorescence at 620 nm: they therefore contain the excess of K- 11-dUTP not incorporated.
  • the lifetime of the emission is measured at 620 nm for the labeled oligonucleotide contained in fraction 1 (10 mM phosphate buffer pH 7.4) using a KRYPTOR time-resolved fluorometer (CIS bio international) with an excitation at 337 nm.
  • EXAMPLE 11 Synthesis of adenosine labeled with Europium trisbipyridine cryptate (K-9-ATP conjugate).
  • the number 9 indicates the total number of atoms of the spacer arm which links the cryptate structure to the nucleotide (here the bonding takes place at position 8 of the purine).
  • the nucleoside triphosphate used is [8- (6-aminohexyl) -Adenosine-5'-triphosphate] (AH-ATP, Sigma).
  • a solution of OJ ⁇ mol AH-ATP in 100 ⁇ l of 0.1 M triethylammonium hydrogen carbonate (TEAB) pH 8 is used and 100 ⁇ l of an activated solution of cryptate [TBP- (Eu3 +)] (4 mg / ml in acetonitrile).
  • the activated cryptate [TBP- (Eu3 +)] (NHS / DCC in acetonitrile) is prepared extemporaneously as described in example 1, method A.
  • the UV spectrum in water has a maximum at 245 nm, a maximum at
  • the transcript obtained has a length of 1035 bases.
  • the transcription medium additionally contains ribonucleotides at a final concentration of 0.5 mM, 0.2% of K-11-UTP and 30% of bio-14-CTP which will be incorporated statistically along the chain.
  • K-11-UTP fraction 2 is used, described in Example 7, which is diluted in water so as to obtain a concentration of 20 ⁇ M.
  • the bio-14-CTP solution is prepared by diluting in water a 10 mM commercial solution of Biotin-14-CTP (Gibco-BRL / Life Technologies).
  • the transcription medium is prepared in microtubes for PCR (0.5 ml) according to the table below:
  • reaction mixture is placed at 37 ° C in a thermocycler. After determined reaction times (60 min, 90 min and 120 min), 2 ⁇ l of reaction mixture are taken which are diluted as previously with 38 ⁇ l of 50 mM EDTA pH 8. These solutions are then diluted by taking 19 ⁇ l which are diluted with 114 ⁇ l of buffer L.
  • SA-XL665 (CIS bio international) are added at a concentration of 6.25.10 " M in buffer L. Then 100 ⁇ l of buffer L are added.
  • EXAMPLE 13 Incorporation of a K-11-dUTP Conjugate During an In Vitro Transcription Reaction (Demonstrated by Transfer of Non-Radiative Energy and Measurement of Fluorescence in Time Solved After Hybridization of a Probe-Acceptor ): The transcription reaction of a double stranded DNA into RNA is carried out using a transcription kit (Gibco BRL). Double stranded DNA containing the promoter
  • T7 is itself obtained by a PCR carried out with a pair of primers, one of the primers of which contains the promoter sequence of the T7 RNA polymerase (EC 2.7.7.6).
  • RNA polymerase transcription is described on p. 5.58 and 5.59 of "Molecular Cloning, A Laboratory Manual” 2 nd edition, J. Sambrook, EF Fritsch and T. Maniatis CSH Press 1989.
  • Another RNA polymerase can also be used such as SP6 or T3
  • RNA polymerase in this case, the sequence of the PCR primer concerned will be modified to incorporate the specific promoter of the RNA polymerase considered.
  • a second PCR is carried out (secondary PCR) using as target DNA (DNA) 2 ⁇ l of a 1/100 ⁇ dilution of the product of the primary PCR.
  • the primer k-ras EX1 Antisens is replaced by the following primer named T7-AS of sequence
  • the primer k-ras EX1 Sens has the following sequence: 5 'd (CTG.CTG.AAA.ATG.ACT.GAA.TAT) 3-.
  • RNA sequence sequence homologous to the antisense strand of the transcribed DNA fragment
  • underlined part corresponds to the sequence which is recognized by the biotinylated probe:
  • the RAS12N probe used is biotinylated at 5 ′ and has the following sequence:
  • the transcription medium contains, in addition to the natural ribonucleotides at a final concentration of 0.5 mM, 2% of K-11-UTP which will be incorporated statistically along the RNA chain.
  • K-11-UTP fraction 2 is used, described in Example 7, which is diluted in water so as to obtain a concentration of 100 ⁇ M.
  • Transcription medium is prepared in PCR microtubes
  • reaction mixture is placed in a thermocycler at 40 ° C for 120 min, then the reaction is stopped with 4 ⁇ l of 0.2 M EDTA pH 8.
  • reaction medium 2 ⁇ l of the reaction medium are taken from a PCR microtube and diluted with 10 ⁇ l of RAS12N probe (0.03 UA260 / ml in H 2 ⁇ ). Then 13 ⁇ l of hybridization buffer is added (100 mM phosphate buffer). pH 7.4 / BSA 0J%
  • hybridization medium diluted HTP 0S 5.5 .mu.l of the hybridization medium above are diluted in buffer L (qs 200 .mu.l) to give the hybridization medium diluted HTP 0S.
  • a blank is made by transcribing according to the above protocol but by replacing the positive PCR DNA with an equivalent volume of PCR medium originating from a negative PCR reaction which does not contain the target DNA.
  • the negative transcription medium (2 ⁇ l) is stopped, then hybridization is carried out as described above and diluted in buffer L. This gives the diluted hybridization medium HT ne g.
  • cryptate into the RNA chain is demonstrated by the hybridization of a probe complementary to the RNA sequence, this probe being labeled with a SA-XL665 conjugate (CIS bio international) via of the streptavidin-biotin pair.
  • a fluorescence measurement is carried out at 620 nm and at 665 nm on a DISCOVERY device (Packard).

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Abstract

L'invention concerne de nouveaux conjugués fluorescents de nucléosides ou de nucléotides, utilisables notamment pour détecter, localiser et/ou isoler des acides nucléiques ou des molécules d'intérêt biologique ou clinique à structure nucléosidique ou susceptibles d'intéragir avec des acides nucléiques. L'invention concerne également les polynucléotides comprenant au moins un conjugué fluorescent de nucléotide.

Description

Nouveaux conjugués fluorescents de nucléosides ou de nudéotides, leur procédé de préparation et leurs utilisations.
L'invention concerne de nouveaux conjugués fluorescents de nucléosides ou de nudéotides, utilisables notamment pour détecter, localiser et/ou isoler des acides nucléiques ou des molécules d'intérêt biologique ou clinique à structure nucléosidique ou susceptibles d'intéragir avec des acides nucléiques.
Dans la suite de la description, les abréviations suivantes seront utilisées : ARN : acide ribonucléique ADN : acide désoxyribonucléique A : Adénosine
C : Cytidine G : Guanosine T : Thymidine U : Uridine I : Inosine suffixe MP : monophosphate suffixe DP : diphosphate suffixe TP : triphosphate préfixe d : désoxy. Une réaction de synthèse enzymatique d'ADN emploie une matrice d'ARN ou d'ADN, une amorce oligonucléotidique de séquence complémentaire à un segment de la matrice, une enzyme appropriée et quatre désoxynucléotides dATP, dCTP, dGTP et dTTP (ou dUTP). Diverses enzymes sont connues, comme E. Coli DNA polymerase, T7 DNA polymerase, le fragment de Klenow de la DNA polymerase, la Taq DNA polymerase, une transcriptase inverse, auxquelles on peut ajouter la terminal nucléotidyl transférase qui présente la particularité de ne pas nécessiter de matrice. La synthèse d'ARN se fait de façon similaire sinon que les amorces et matrices requises sont différentes et que des ribonucléotides (ATP, CTP, GTP et UTP) sont utilisés en présence de RNA polymérases. Les nudéotides ou polynucléotides peuvent être marqués radioactivement
(3H, 32P, 1 C, 35S ou 125l).
L'utilisation de molécules marquées présente les inconvénients classiquement associés avec les isotopes radioactifs qui sont les risques liés à la radioactivité ainsi qu'un stockage et une disponibilité limités due à la décroissance radioactive et aux phénomènes de radiolyse. Le marquage chimique au niveau des nudéotides ou des polynucléotides, permettant d'éviter ces inconvénients, a été décrit dans la littérature. Notamment, on a décrit le marquage par de la biotine de nudéotides dérivés du dUTP ou de l'UTP (Langer P.R., Waldrop A.A., Ward D.C., 1981 ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6633-37). Ce sont des dérivés dans lesquels la biotine est liée à la position C-5 du noyau pyrimidine par un bras alkylamine. Ces nudéotides marqués sont incorporés in vitro dans des polynucléotides par l'action de polymérases à ADN ou à ARN (EP 0 063 879) et permettent une détection colorimétrique d'acides nucléiques par une réaction de « dot-blot » (Leary J.J., Brigati D.J. and Ward D.D. ; 1983 ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4045-49).
D'autres analogues de nudéotides marqués à la biotine basés sur des dérivés de la N-4-aminoalkyi-désoxy-cytidine et de la N-6-aminoalkyl- désoxyadénosine sont décrits dans le brevet US 4,828,979 et dans Gebegehu G.G. ét al. Nucleic. Acids. Res ; 1987, 15, 4513-4534. Des dérivés de dUTP, de dATP substitué par de la biotine en position C-8, ainsi que la possibilité de substitution en C-7 d'une 7-déazapurine sont également décrits (EP 0 063 879).
Le dérivé Bio-15-dGTP a également été décrit (Gilliam I.C. and Tener G. M. ; 1989 ; Nucleoside & Nucleotide ; 8, 1453-62). Des dérivés fluorescents tels que la fluoresceine ou la rhodamine peuvent être incorporés dans un acide nucléique par l'intermédiaire d'un nucleoside triphosphate (dATP, dUTP, dCTP) marqué (WO 93 19206). Une discussion sur la position des substitutions sur les purines et pyrimidines ainsi que sur la nature des bras espaceurs utilisables pour le marquage des didésoxynucléotides avec des dérivés de la fluoresceine, bien que dédiée aux terminateurs de chaîne pour le sequençage, donne une vue d'ensemble de la chimie des nudéotides marqués (Confalone P.T., 1990, J. Heterocyclic Chem., 27, 31-46).
L'utilisation conjointe de nucléosides triphosphate marqués à l'aide de traceurs différents (Biotine-11-dUTP, dig-11-dUTP et FITC-11dUTP) permet une visualisation simultanée de séquences différentes lors d'une hybridation (RIED T. ét al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89, 1388-1392).
L'incorporation de désoxynucléotides marqués à la fluoresceine tels que FI-dUTP ou FI-dCTP est également effectuée en ne substituant que partiellement le nucleotide naturel par le composé marqué, dCTP / FldCTP ≈ 2:1 (WO93/19206). Ce même brevet décrit que par un choix de l'enzyme et des conditions expérimentales, il est possible de substituer la totalité d'un nucleotide par un nucleotide marqué. Les données de la littérature montrent que l'efficacité d'incorporation d'un conjugué de triphosphate est modifiée par le couplage d'une molécule comme la biotine et dans une moindre mesure par la présence du bras permettant le couplage.
Par exemple, dans une réaction de « nick-translation » en présence d'une polymerase à ADN, les taux d'incorporation de divers analogues de triphosphates ont été comparés au nucleoside naturel pris comme référence (100 % d'incorporation) pour un même temps de réaction (90 min) (Gebeyehu G. et al.
Nucleic Acids Res., 1987, 15, 4525).
Les molécules conjuguées à des triphosphates de nucléosides (Goodchild, J. Bioconjugate chem., 1990, p171 ; Kricka J. Non isotopic Blotting, and Sequencing 1995 Académie Press p47 ; Zhu Z. et al. Nucleic Acids Res., 1994, 3418-3422) sont des molécules de taille relativement petites (<800Da), soit neutres soit chargées négativement et de forme essentiellement plane et par conséquent, leur encombrement est réduit mais suffisant pour perturber l'incorporation enzymatique du nucleoside triphosphate.
On a maintenant trouvé de nouveaux conjugués de nucléosides ou de nudéotides comprenant :
- un ribo- ou désoxyribo-nucléoside ou nucleotide natif ou chimiquement modifié ou conjugué à une ou plusieurs molécules marqueur(s), dont au moins un atome de carbone du cycle ou un atome d'azote exocyclique du cycle purique ou pyrimidique ou encore un atome de carbone du cycle pentofuranose est susceptible d'être impliqué dans une liaison avec un marqueur fluorescent, et
- au moins un marqueur fluorescent lié au(x)dit(s) atome(s) constitué par un cryptate de terre rare. Dans un aspect préféré, lesdits conjugués comprennent :
- un ribo- ou désoxyribo-nucléoside ou nucleotide natif ou chimiquement modifié ou conjugué à une ou plusieurs molécules marqueur(s), dont au moins un atome de carbone du cycle ou d'azote exocyclique du cycle purique ou pyrimidique est susceptible d'être impliqué dans une liaison avec un marqueur fluorescent, et - au moins un marqueur fluorescent lié au(x)dit(s) atome(s) constitué par un cryptate de terre rare.
Lesdits conjugués peuvent être utilisés dans toutes les applications des nucléosides ou nudéotides marqués sans présenter d'inconvénients majeurs d'utilisation et présentent notamment une capacité élevée à être incorporés dans de l'ADN simple brin ou double brin. Ces propriétés sont d'autant plus surprenantes que les cryptâtes de terre rare sont des molécules de masse moléculaire élevée (supérieure à 1400 Da), possédant une structure tridimensionnelle qui présente plus d'encombrement stérique qu'une molécule globalement plane, et ayant un caractère ionique provenant de la présence de l'ion complexé qui leur confère une charge positive.
Du fait de ces caractéristiques structurales, on pouvait s'attendre à ce que les charges positives d'un cryptate de terre rare interagissent fortement avec les charges négatives du groupe triphosphate et modifient sa réactivité ainsi que les qualités de fluorescence du cryptate. Egalement, l'activité des enzymes telles que les polymérases étant sensibles à la présence et à la concentration de certains ions ou agents complexants dans le milieu réactionnel, on pouvait s'attendre à ce que les conjugués selon l'invention entraînent une forte diminution de l'incorporation des nudéotides triphosphates, et donc un faible rendement, notamment lors d'une synthèse de polynucléotides.
De manière surprenante, les résultats obtenus en utilisant les conjugués selon l'invention montrent que, non seulement les cryptâtes de terre rare n'ont pas d'influence défavorable dans les applications qui font intervenir des réactions enzymatiques, mais conservent leurs propriétés fluorescentes intrinsèques. De manière avantageuse, on a également trouvé que les conjugués selon l'invention présentaient de nouvelles caractéristiques de fluorescence et, en particulier, que la durée de vie d'émission de l'ion de terre rare complexé était significativement augmentée.
Lesdits conjugués peuvent donc être utilisés à titre de marqueurs fluorescents dans toutes les utilisations dans lesquelles on effectue une détection quantitative ou qualitative par mesure de la fluorescence directe ou indirecte.
Dans un aspect préféré, l'invention concerne des conjugués fluorescents de nudéotides comprenant un ribo-nucléotide choisi parmi AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, CMP, CDP, CTP, UMP, UDP, UTP, TMP, TDP, TTP, 2Me AMP, 2Me ADP, 2Me ATP, 1Me GMP, 1Me GDP, 1Me GTP, 5Me CMP, 5Me CDP, 5Me CTP, 5MeO CMP 5MeO CDP, 5MeO CTP, 7-déaza-ATP, 7-déaza-GTP ou, le cas échéant, un désoxyribo-nucléotide choisi parmi les désoxy- ou didésoxy- ribonucléotides correspondants à ces ribo-nucléotides, et en particulier
- les dérivés de la 2'-désoxy-uridine-5'-triphosphate ou de l'uridine-5'- triphosphate fonctionnalisés en position 5 de la base (principalement squelette aminoallyle ou aminopropyne), - les dérivés de la 2'-désoxy-cytidine-5'-triphosphate ou de la cytidine-5'- triphosphate fonctionnalisés en position 4 ou 5 de la base (principalement squelette aminoallyle ou aminopropyne pour la position 5),
- les dérivés de la 2'-désoxy-adénosine-5'-triphosphate ou de l'adénosine- 5'-triphosphate fonctionnalisés en position 6 ou 8 de la base,
- les dérivés de la 2'-désoxy-guanosine-5'-triphosphate ou de la guanosine-5'-triphosphate fonctionnalisés en position 6 ou 8 de la base,
- les dérivés de la 2'-désoxy-7-déaza-adénosine-5'-triphosphate ou de la 7-déaza-adénosine-5'-triphosphate fonctionnalisés en position 7 de la base, et - les dérivés de la 2'-désoxy-7-déaza-guanosine-5'-triphosphate ou de la
7-déaza-guanosine-5'-triphosphate fonctionnalisés en position 7 de la base.
Les nudéotides utilisables aux fins de l'invention comprennent également des nudéotides modifiées chimiquement sur la partie triphosphate, en particulier les dérivés α-thiotriphosphates. Selon un autre aspect, l'invention concerne des conjugués fluorescents de nucléosides dans lesquels le ribo- ou désoxyribo-nucléoside est choisi parmi A, G,
C, U, T, les désoxy- ou didésoxynucléosides correspondants, et leurs analogues chimiquement modifiés, et en particulier la 3'-azido-3'-désoxythymidine et ses dérivés ; et les analogues 2', 3'-didéoxy de A, T, C, G, U, I. Le marqueur fluorescent est constitué par un cryptate de terre rare choisi de préférence parmi les cryptâtes de terbium, d'europium, de samarium ou de dysprosium.
Dans la suite de la description, la notion de « cryptate »ainsi que la nomenclature des macrocycles et polycycles utilisables sont telles que définies par J.M. Lehn dans Struct. Bonding (Berlin), 16, 1 , 1973 et dans Ace. Chem. Res. 11 ,
49 (1978).
Selon un aspect préféré, ledit cryptate de terre rare est constitué d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique de formule
Figure imgf000007_0001
dans laquelle Z est un atome ayant 3 ou 4 valences, R est rien ou représente l'hydrogène, le groupe hydroxy, un groupe amino ou un radical hydrocarboné, les radicaux bivalents @ , (D et © , sont indépendamment l'un de l'autre des chaînes hydrocarbonées qui contiennent éventuellement un ou plusieurs heteroatomes et sont éventuellement interrompues par un hétéromacrocycle, au moins l'un des radicaux (A) , (g) et © comportant de plus au moins un motif moléculaire ou étant essentiellement constitué par un motif moléculaire, ledit motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé.
De préférence, il s'agit d'un cryptate de formule (I) ci-dessus dans laquelle le motif moléculaire est choisi parmi la phénanthroline, l'anthracène, le benzène, le naphtalène, les bi- et ter-phényle, l'azobenzène, l'azopyridine, la pyridine, les bipyridines, les bisquinoléines et les composés de formules ci-après :
- C2H4 - Xi - CβH - X2 - C2H -
- C2H - Xi - CH2 - CβH , - CH2 - X2 - C2H -
Xi et X2 pouvant être identiques ou différents désignent l'oxygène, l'azote ou le soufre,
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000008_0002
Figure imgf000008_0003
Figure imgf000008_0004
X étant l'oxygène ou l'hydrogène. Dans un aspect avantageux, le marqueur fluorescent est un cryptate de terre rare constitué de l'ion terbium ou europium complexé par l'un des composés macrocycliques ci-après :
(22)phénanthroline ; (22)phénanthroline amide ; (22)anthracène ; (22)anthracène amide ; (22)bi-isoquinoléine ; (22)biphényl-bis-pyridine ;
(22)bipyridine ; (22)bi-pyridine amide ; les macropolycycles tris-bipyridine, tris- phénanthroiine, phénanthroline-bis-bipyridine, bi-isoquinoléine-bis-bipyridine, bis- bipyridine diphénylbipyridine.
Un marqueur particulièrement avantageux est le cryptate d'europium Eu tris bipyridine.
De tels composés sont par exemple décrits dans le brevet EP 180 492.
On peut également utiliser des composés macropolycycliques cryptâtes complexant des ions de terre rare dans lesquels le motif moléculaire est choisi parmi les bipyrazines, les bipyrimidines et les hétérocycies azotés comportant des groupes N-oxydes.
Des composés macropolycycliques à unités bipyrazines sont décrits dans F. Bodar-Houillon ét al., New J. Chem., 1996, 20, 1041-1045.
Des composés macropolycycliques à unités bipyrimidines sont décrits dans J. M. Lehn ét al., Helv. Chim. Acta, 1992, 75, 1221. Des composés macropolycycliques comprenant des hétérocycies azotés comportant des groupes N-oxydes sont décrits dans J.M. Lehn et al., Helv. Chim. Acta, 1991 , 74, 572.
Le cryptate de terre rare utilisé comme marqueur fluorescent peut également être constitué d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique répondant à l'une des formules II ou III ci-après :
Figure imgf000010_0001
dans lesquels :
- le cycle de formule
Figure imgf000010_0002
est l'un des cycles suivants
e [N2OJ ou cycle (22) e [Na-O-J ou cycle (21)
Figure imgf000010_0003
2) macrocycle bis-pyridine
Figure imgf000011_0001
- Y est un groupe ou un bras d'espacement qui est constitué par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en Ci à C20 contenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et/ou contenant éventuellement un ou plusieurs heteroatomes tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido ; parmi les groupes cycloalkylène en C5 à Ce ou parmi les groupes arylène en C6 à C , lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle, aryie ou sulfonate ;
- Z est un groupe fonctionnel susceptible de se lier de façon covalente avec une substance biologique ;
- R est un groupe méthyle ou représente le groupe -Y-Z ;
- R' est l'hydrogène ou un groupe -COOR" dans lequel R" est un groupe alkyle en Ci à C10 et représente de préférence le groupe méthyle, éthyie ou tertiobutyle ou bien R' est un groupe -CO-NH-Y-Z.
De tels composés sont décrits par exemple dans le brevet EP 321 353. Au sein des conjugués selon l'invention, ledit marqueur fluorescent peut être lié au ribo- ou désoxyribo-nucléoside ou nucleotide soit directement, soit par l'intermédiaire d'un bras d'espacement.
Par « liaison directe », on entend la liaison du marqueur fluorescent sur un groupe fonctionnel préalablement introduit ou généré sur un ou plusieurs atomes de la base ou de l'unité pentofuranose du ribo- ou désoxyribo-nucléoside ou nucleotide.
Dans la présente description, on désigne par groupe fonctionnel toute fonction portée par la partie nudeosidique ou nudeotidique ou introduite sur cette partie par toute méthode connue par l'homme du métier et capable de se lier par liaison covalente, directement ou après activation avec une fonction présente sur le cryptate ou sur le bras espaceur porté par le cryptate. De tels groupes fonctionnels sont notamment les fonctions NH2, COOH, CHO, OH ou SH ainsi que les fonctions capables de donner des liaisons covalentes par substitution (halogénures, sulfonates, époxyde) ou par addition (double liaisons type maléïmide). Ces fonctions sont généralement portées par une chaîne hydrocarbonée elle-même reliée à la partie nudeosidique ou nudeotidique.
Des méthodes d'introduction de ces groupes fonctionnels sont notamment décrites dans C. Kessler, Nonisotopic probing, Blotting and Sequencing, 2nd édition, LJ. Kricka (1995), Ed. Académie press Ltd., Londres, p. 66-72.
Ce bras d'espacement est par exemple constitué par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en CrC20, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons ou triples liaisons et/ou contenant éventuellement un ou plusieurs heteroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido ; les groupes cycloalkylène en C5-C8 et les groupes arylène en C6-Cι4, lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle, aryle ou sulfonate.
En particulier, il peut être choisi parmi les groupes :
Figure imgf000012_0001
et
Figure imgf000012_0002
Dans un aspect préféré, le conjugué selon l'invention comprend un désoxyribonucléotide qui est la désoxyuridine, un marqueur fluorescent qui est le cryptate d'europium Eu trisbipyridine et un bras d'espacement qui est un groupe 3- aminoallyle. L'invention concerne également, selon un aspect ulltérieur, un procédé de préparation des conjugués décrits plus hauts.
Ledit procédé de préparation est caractérisé en ce qu'on fait réagir un ribo- ou désoxyribo-nucléoside ou nucleotide natif ou chimiquement modifié ou conjugué à une ou plusieurs molécules marqueur(s), dont au moins un atome de carbone du cycle ou un atome d'azote exocyclique du cycle purique ou pyrimidique, ou encore un atome de carbone de l'unité pentofuranose est susceptible d'être impliqué dans une liaison avec un marqueur fluorescent avec au moins un marqueur fluorescent lié au(x)dit(s) atome(s) constitué par un cryptate de terre rare, et qu'on isole le conjugué ainsi obtenu.
Les ribo- ou désoxyribo-nucléosides ou nudéotides ainsi que les marqueurs fluorescents utilisables dans ce procédé de préparation sont tels que décrits plus haut.
Les conjugués selon l'invention qui comprennent un ribo- ou un désoxyribonudéotide sont particulièrement adaptés pour toutes les applications qui nécessitent une mesure qualitative ou quantitative lors de la synthèse ou de l'utilisation de polynucléotides.
Selon un de ses aspects, l'invention concerne également les polynucléotides comprenant au moins un conjugué fluorescent de ribo- ou de désoxyribo-nuciéotide tel que décrit plus haut en tant que nucleotide constitutif.
Avantageusement, les polynucléotides obtenus par incorporation de conjugués selon l'invention peuvent comprendre un nombre de conjugués supérieur à 1 , et donc un nombre de marqueurs fluorescents supérieur à 1.
En utilisant les conjugués selon l'invention, il est ainsi possible de réaliser le polymarquage de polynucléotides par voie enzymatique. Cette technique permet d'obtenir des polynucléotides marqués plus facilement et en assurant une meilleure reproductibilité qu'en utilisant les techniques classiques de marquage fluorescent par voie chimique. En particulier, elle évite les étapes de séparation nécessaires pour éliminer du milieu les polynucléotides et/ou les marqueurs fluorescents fonctionnalisés n'ayant pas réagi.
On notera que si l'on utilise des cryptâtes bi-fonctionnalisés, la conjugaison ne se fait que sur un bras, ce qui permet toujours l'incorporation du conjugué dans le cadre d'une synthèse de polynucléotides.
Les conjugués selon l'invention qui comprennent un ribo- ou un désoxyribonudéotide peuvent être utilisés pour la détection et/ou la localisation de composés contenant au moins une séquence d'acide nucléique. Parmi ces utilisations, on peut citer de manière non limitative : - la détection et/ou la localisation de séquences spécifiques d'ADN, par exemple en vue de l'établissement de la cartographie de chromosomes ou la détection d'une mutation ; - la synthèse de sondes utilisables en recherche biomédicale ou pour établissement d'un diagnostic clinique.
On peut également les utiliser dans un procédé de mesure de l'activité enzymatique d'une enzyme impliquée dans une réaction de synthèse d'acide nucléique, par exemple une activité polymerase à ADN ou à ARN, transcriptase inverse, transférase ou ligase, dans laquelle on mesure la fluorescence émise directement ou indirectement par ledit conjugué, ladite émission de fluorescence étant corrélée au taux d'incorporation dudit conjugué dans le polynucléotide d'acide nucléique synthétisé.
Les conjugués selon l'invention peuvent également être utilisés pour mesurer l'activité enzymatique d'une enzyme ayant pour substrat un acide nucléique, par exemple une activité phosphodiestérase, DNAse ou Rnase, la fluorescence émise directement ou indirectement par ledit conjugué étant corrélée soit à ladite activité, soit à l'inhibition de ladite activité.
On peut également les utiliser pour mesurer une activité enzymatique modifiant la structure d'un acide nucléique telle qu'une activité héiicase ou integrase ou une activité modifiant la topologie d'un acide nucléique telle qu'une activité topoisomérase.
Les conjugués selon l'invention peuvent également être utilisés à titre de marqueurs, par exemple pour la préparation d'un composé comprenant un acide nucléique dans lequel est incorporé ledit conjugué en vue d'une détection.
La fluorescence émise par les conjugués selon l'invention peut être soit « directe » : le signal lumineux est émis par le conjugué après excitation à une longueur d'onde donnée, soit « indirede » : l'émission du signal lumineux est induite par un transfert d'énergie non radiatif entre le conjugué après excitation dit « composé donneur » et une autre molécule fluorescente dite « composé accepteur ». Dans ce cas particulier, les conditions suivantes sont remplies : - d'une part, le composé fluorescent accepteur possède un spectre d'absorption qui recouvre au moins partiellement le spectre d'émission du donneur et présente une absorbance molaire élevée dans cette zone de recouvrement, et un spectre d'émission dans une gamme de longueur d'ondes où le donneur présente une émission intrinsèque faible ; - d'autre part, l'accepteur et le donneur se situent à proximité l'un de l'autre, l'orientation de leurs dipoles de transition étant approximativement parallèles.
Le principe de la technique de transfert d'énergie non radiatif est décrit notamment dans G. Mathis et al., Clin. Chem., 1993, 39, 1953-1959. L'invention est illustrée par les exemples ci-après, dans lesquels certaines concentrations sont données en unité d'absorption (UA) à une longueur d'onde donnée (exprimée en nm) par unité de volume (exprimée en ml) et exprimées par le même chiffre que la densité optique de la solution concernée.
EXEMPLE 1 : Synthèse de la désoxyuridine marqué au cryptate d'europium trisbipyridine (conjugué K-11-dUTP). Dans ce conjugué, le chiffre 11 indique le nombre total d'atomes du bras espaceur et du groupement fonctionnel qui relie la structure cryptate au nucleotide (ici, la liaison se fait en position 5 de la pyrimidine). Le nucléoside-triphosphate utilisé est le 5-[N-(6-aminocaproyl)-3- aminoallyl]-2'-désoxyuridine-5'-triphosphate] (AH-dUTP) préparé par réaction du trifluoroacétamido-caproate de N-hydroxysuccinimide (M. S Urdea et al., Nucleic acids Res., 1988,.4937) sur le 5-(3-aminoallyl)-2'-désoxyuridine-5'-triphosphate préparé suivant un procédé de la littérature (Langer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981), 78, 6633-6637), suivi d'une déprotection ammoniacale (NH4OH aqueuse 3 %, 45 min à 60°C). Le composé est purifié sur DEAE-Sepharose ® (Pharmacia) dans un gradient linéaire d'hydrogénocarbonate de triéthylammonium (0,1 M à 0,3 M).
1) Méthode A On dilue 68 μl d'une solution d'AH-dUTP à 6 μmole/ml (soit 0,4 μmole) à
250 μl d'hydrogénocarbonate de triéthylammonium (TEAB) 0J M pH 7,8 et on ajoute 320 μl d'une solution de cryptate de N-hydroxysuccinimide (4 mg/ml dans l'acétonitrile) préparée comme suit. Le cryptate d'Europium [(bis-bpy)-(bpy-diester)] décrit dans l'exemple 4, section A, de la demande EP 0 321 353 est hydrolyse par NaOH et le cryptate diacide obtenu est purifié sur colonne RP-18 HPLC (gradient d'acétonitrile dans de l'acide trifluoroacétique à 1% dans l'eau). Le cryptate d'Europium [(bis-bpy)-(bpy-diacide)] ainsi obtenu (4mg) est dissout dans 0,5 ml d'acétonitrile anhydre et on ajoute 1mg de N-hydroxysuccinimide, puis une solution de 1 ,9 mg de dicyclohexylcarbodiimide dissout dans 0,5 ml d'acétonitrile. Après 16 h de réaction, le précipité de dicydohexyluree est filtré et la solution de cryptate de N-hydroxysuccinimide est utilisée directement pour le couplage. Après 45 min sous agitation, on ajoute 15 μl de TEAB 1M pH 8,5 puis on injecte le mélange sur une colonne Superdex 30 ® HR 10/30 (Pharmacia) en éluant par du TEAB 0,05M pH 7 contenant 10 % d'acétonitrile (débit 1 ml/min).
On collecte le composé de Rt ≡16,4 mn, puis cette fraction dénommée fraction 1 est concentrée sous vide (speed-vac) jusqu'à un volume de 350 μl et contient 8 UA304 nm. En estimant un £304 ≡ 35000, on estime que la concentration en K-dUTP est d'environ 0,72 M.
Une aiiquote (90 μl) de cette fraction 1 est injectée sur la même colonne éluée par un tampon triéthylammonium acétate 25 mM pH 7 contenant 5 % d'acétonitrile. La fraction correspondant au seul pic du chromatogramme est collectée (16 min < Rt < 19 min) et concentrée sous vide (speed-vac). On obtient
150 μl d'une solution de K-dUTP dénommée fraction 2 contenant 1 ,95 UA304 nm.
Le composé est analysé en spectrométrie de masse (électrospray mode positif) : (M-2H)+ = 1431
(M-2H+CH3COOH)+ = 1491.
Le spectre UV dans l'eau présente un maximum à 241 nm caractéristique de la partie nudeosidique de la molécule (λmax = 289 nm, ε = 7100, λmax = 240 nm ε = 10700) et un maximum à 304 nm proche du λmax de 305 nm (ε = 30000) caractéristique du cryptate d'Europium. On observe un rapport
A304/A241 ≡ 0,83 compatible avec la structure proposée.
2) Méthode B
On dissout 0,08 μmol d'une solution d'AH-dUTP dans 80 μl de tampon borate 0J M pH 8,6 et on ajoute 90 μl d'une solution de cryptate de N-hydroxysuccinimide (4 mg/ml) préparée comme décrit d-dessus dans la méthode A.
Après 60 min à 20°C, on ajoute 5 pi de TEAB 1M pH 8,5 et 45 μl d'H2O. On injecte la totalité du mélange réactionnel sur une colonne Superdex peptide HR 10/30 (Pharmacia) en éluant par du TEAB 0.05M pH 7 contenant 10 % d'acétonitrile (débit 1 ml/min). On collecte le pic Rt = 16J min qui présente un maximum à 304 nm et un rapport A304/A241 ≡ 0,79. On obtient environ 0,03 μmol de composé K-11-dUTP.
La formule du conjugué K-11-dUTP est donnée en figure 2.
EXEMPLE 2 : Purification du conjugué K-11-dUTP par échange d'ion On utilise une colonne C10/20 (Pharmacia Biotech., Uppsala, S) remplie de DEAE Sépharose ® Fast Flow (Pharmacia) équilibrée dans un tampon TEAB 10 mM contenant 10 % de méthanol. On dépose une solution de K-11-dUTP contenant également du cryptate d'europium trisbipyridine fonctionnalisé non conjugué et on élue la colonne (8 ml/min) par 40 ml de tampon A (TEAB 10 mM contenant 10 % de méthanol). On collecte des fractions de 4 ml et on mesure la fluorescence des fractions éluées ( λexcitation = 337 nm, λémission = 620 nm). Le cryptate non conjugué est élue dans les fractions 4 et 5, c'est-à-dire peu après le volume mort de la colonne.
On continue l'élution (8 ml/min) par un gradient linéaire de 10 mM TEAB 10 % méthanol (100 ml) à 200 mM TEAB 10 % méthanol (100 ml) et on collecte des fractions de 5 ml. On observe que la fluorescence (620 nm) est concentrée dans les tubes 43 à 44 ce qui indique que le K-11-dUTP est élue à une concentration s 0J6 mM TEAB. Les fractions contenant le K-11-dUTP sont réunies et concentrées.
EXEMPLE 3 : Incorporation du conjugué K-11-dUTP au cours de la copie d'un
ADN simple brin par une polymerase (analyse par PAGE et autoradiographie)
L'ADN matrice est obtenu par amplification PCR (de l'anglais « Polymerase Chain Reaction ») d'un fragment du gène k-ras (exon I) limité par les amorces suivantes :
Amorce k-ras EX1 Sens S 5' d(GGC CTG CTG AAA ATG ACT GAA TAT) 3* Solution stock à 3 UA26rj ml soit environ 1 ,2. 10'5M
Amorce k-ras EX1 Antisens AS 5' d(TGT TGG ATC ATA TTC GTC CAC AAA ATG) 3-
Solution stock à 3 UA26o/ml soit environ 1 ,2. 10"5M. L'amorce AS utilisée ici pour la PCR ci-dessous est biotinylée en son extrémité 5'. Un ADN double-brin biotinylé est synthétisé par PCR en suivant le protocole suivant :
Milieu PCR 25 μl BUAM (CIS bio international) 10X 8 μl amorce Antisens-bio 8 μl amorce Sens 10 μl taq polymerase (1 ,25U/ml) 10 μl dNTP (quatre dNTP naturels 5mM chaque)
100 μl ADN placenta humain (Sigma) 0,01 μg/μl 89 μl eau milli-Q. Le milieu PCR est réparti en 5 microtubes (5 x 50 μl), les tubes sont placés dans un thermocycleur et soumis à 31 cycles de PCR suivant le protocole de l'exemple 5. L'ADN double brin issu de la PCR (équivalent à 25 pmoles d'amorce biotine) est incubé en présence de 300 μg de Dynabeads-streptavidine M-280 (Dynal, N).
Après lavage, l'ADN simple brin (SS ADN) est élue par de la soude 0J N puis le surnageant est décanté et neutralisé (HCI dilué), puis concentré jusqu'à un volume résiduel de 60 μl.
Pour la suite de la manipulation, on utilise une amorce AS (non biotinylée)
32 telle que définie ci-dessus marquée au P décrit dans j. Sambrook et al. Molecular cloning a laboratory manuel, 1989.
On prépare des milieux pour la réaction de copie en utilisant : - K-11-dUTP fraction 1 ( Rt = 16,4 min) obtenue dans l'exemple 1 , diluée à
0,25 mM
- dTTP 0,25 mM
- Mélange de 3 désoxynucléotides triphosphates (dATP, dCTP et dGTP) à raison de 0,625 mM chacun - Taq ADN polymerase 1 ,25 U/μl
- Tampon Taq (BUAM) 10X (Cis bio international)
- Amorce AS (3 UA260/ ml) et amorce AS marquée au 32P (0,06 UA26o ml). Parallèlement, on fait une réaction témoin dans laquelle le K-11-dUTP est remplacé par 0,6 μl de dTTP (0,25 mM) de façon à ce que la concentration en dTTP dans le milieu soit la même que pour les trois autres triphosphates.
Volume (μl)
BUAM 10 X 1
Taq DNA polymerase 0,2
Amorce S 32P 2
Amorce S 0,35
3 Triphosphate 0,5
K-11-dUTP 0,6 dTTP 0,6
SS ADN 5 On vérifie par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) que la réaction en présence de conjugué K-11-dUTP produit une bande correspondant à une copie de l'ADN sur toute sa longueur et présentant une mobilité proche de la bande obtenue pour la réaction témoin ou seuls les quatre nudéotides naturels sont introduits. D'autre part, dans les deux cas, le profil d'électrophorèse ne montre pas d'arrêts de lecture.
La même manipulation a été effectuée en utilisant des rapports dTTP/K-11-dUTP variables, entre autre en utilisant 0,3 μl de K-11-dUTP et 0,9 μl de dTTP (dTTP/K-11-dUTP = 3).
La réaction de copie a également été effectuée en présence de DNA polymerase I, fragment de Klenow (37°C, 45 min) et donne sensiblement les mêmes résultats.
Ces résultats montrent que le conjugué dUTP-cryptate d'europium trisbipyridine est bien incorporé par une polymerase (taq polymerase ou fragment de Klenow) au cours de la copie de l'ADN simple brin.
EXEMPLE 4 : Incorporation du conjugué K-11-dUTP au cours de la copie d'un ADN simple brin par une polymerase (mise en évidence par transfert d'énergie non radiatif et mesure de fluorescence en temps résolu)
On utilise l'ADN simple brin décrit dans l'exemple 3. On prépare un microtube dans lequel se dérouie la réaction de copie (50 μl), contenant : - K-11-dUTP : 0,25 mM fraction 1 (Rt = 16,4 min) obtenu dans l'exemple 1
- dTTP : 0,25 mM
- Mélange de 3 désoxynucléotides triphosphates : dATP, dCTP, dGTP à raison de 0,625 mM chacun
- Amorce AS biotinylée (voir exemple 3) : 3 UA26θ ml - Taq DNA polymerase : 1 ,25 U/μl
- Tampon Taq : BUAM 10X Volume (μl)
BUAM 10 X 5
Taq polymerase 1
Amorce biotinylée 1 ,75
Mix 3 dNTP 2,5
K-11-dUTP 3 dTTP 3
SS ADN 30 eau milli-Q 3,75
Les tubes sont chauffés 2 min à 90°C (dénaturation) puis incubés à 70°C dans un thermocycleur. Des prélèvements (9 μl) sont effectués à 0, 5, 10, 15 et
20 min. Les aliquotes sont placées dans des tubes contenant 2 μl de solution
EDTA 0,5 M pH 8. On obtient l'équivalent de 12,5 pmoles d'amorces biotinylées par 50 μl de réaction, soit 2,5 pmoles pour 10 μl. D'autre part, on a 150 pmoles de K-11-dUTP pour 10 μl.
Les prélèvements sont dilués à raison de 8 μl dans 200 μl de tampon L
(phosphate 0,1 M pH 7, NaCI 0,15 M, KF 0,4 M et 0,1 % BSA) puis dilués au 1/10 dans le même tampon.
-14
On pipette 20 μl (équivalent à 2J0 mole de biotine) de prélèvements
(dilués comme décrit ci-dessus) dans les puits « essais » d'une microplaque
(96-wells flat bottom black low fluorescence microplaque HTRF-96 PACKARD). On ajoute 30 μl de conjugué SA-Xl_665 (conjugué de streptavidine et d'allophycoeyanine chimiquement modifiée, CIS bio international) dilué dans le
8 13 tampon L (concentration finale 2J0" M) dans chaque puits « essais » (6,5.10" mole de SA soit 30 équivalent par rapport à la biotine), puis 250 μl de tampon L.
On pipette 20 μl de prélèvement dilués dans les puits « blancs » auxquels on ajoute 280 μl de tampon L. Après incubation (15 mn à 37°C) on lit immédiatement la fluorescence à
620 nm et à 665 nm sur un appareil Discovery (Microplate HTRF - analyser PACKARD).
On calcule les rapports des intensités de fluorescence Re = E665/E620 pour chaque essai et Ro = B665/B620 pour chaque blanc, puis on calcule la valeur
DF = (Re-Ro)/Ro exprimée en pourcentage, les résultats sont reportés dans le tableau 1 ci-dessous. Dans le tableau, comme dans la suite des exemples, les mesures de fluorescence à 620 nm ou à 665 nm sont exprimées en unités arbitraires de fluorescence qui dépendent de l'appareil utilisé pour la mesure.
Tableau 1
Figure imgf000021_0001
En portant la valeur DF en fonction du temps de réaction, on obtient le profil typique d'une cinétique d'incorporation de nucleotide au cours d'une copie enzymatique (Figure 1).
EXEMPLE 5 : Incorporation du conjugué K-11-dUTP au cours d'une réaction de PCR (mise en évidence par transfert d'énergie non radiatif et mesure de fluorescence en temps résolu)
1/ PCR :
On amplifie une région de l'exon 1 du gène k-ras limité par les amorces S et AS décrites dans l'exemple 3.
On génère ainsi un produit d'amplification d'une longueur de 117 bp et de séquence (brin sens)
5' d(GGC CTG CTG AAA 1ATG ACT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT 0GGA GCT GGT GGC GTA GGC AAG AGT GCC TTG 20ACG ATA CAG CTA ATT CAG AAT CAT TTT GTG 30 GAC GAA TAT GAT CCA ACA)3-
On choisit une sonde (56 % G + C) dans la partie centrale de la séquence amplifiée (soulignée ci-dessus) une biotine est introduite en son extrémité 5' à l'aide d'un bras N-4-aminohexyl-dC (A. Roget et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17, 7643-7651) : Sonde CP : biotine-dC .GCC TTG ACG ATA CAG C
Solution stock à 0,3 UA260-/™I soit environ 1 ,7.10 M. On utilise 48 μl de la fraction K-11-dUTP (13 UA304/ml) repurifiée dans un tampon TEAAc (voir exemple 1 , méthode A) que l'on dilue par 32 μl d'eau milli-Q soit une concentration finale de K-11-dUTP d'environ 0,2 mM.
On utilise un mélange des 4 désoxynucléotides triphosphates naturels respectivement : dATP 5 mM, dCTP 5 mM, dGTP 5 mM et dTTP 3,5 mM.
On prépare le mélange stock PCR suivant :
- 25 μi Tampon BUAM (CIS bio international) 10X - 10 μl dNTP
- 8 μl d'amorce S
- 8 μl d'amorce AS
- 10 μl de taq ADN polymerase (soit 12,5 U)
- 9 μl eau milli-Q.
Dans des microtubes pour PCR, on prépare les milieux PCR selon le tableau suivant, en utilisant de l'ADN de placenta humain (Sigma) à 0,01 μg/μl.
Figure imgf000022_0001
On effectue la réaction PCR en utilisant le protocole suivant : 1. 5 min / 95°C 2.1 1 min / 94°C (dénaturation) 2.2 1 min / 60°C (circularisation)
2.3 1 min / 70°C (élongation) (31 cycles)
3J 8 min / 70°C (élongation finale) On contrôle les réactions par électrophorèse sur gel d'agarose. Seuls des tubes contenant de l'ADN (T+, K1+ et K2+) présentent une bande de longueur attendue (par comparaison avec la bande 124 bp du marqueur VIII Boehringer). 2) Mesure du transfert d'énergie en temps résolu :
Le principe de la mesure consiste à hybrider la sonde CP biotinylée sur le fragment d'ADN amplifié, puis de mettre l'hybride en présence du conjuguéμ
SA-XL665 (défini dans l'exemple 4). L'incorporation de bases marquées au cryptate d'europium (donneur) se traduit par un transfert d'énergie non radiatif sur
XL665 (accepteur) lorsque le donneur est excité vers 337 nm.
Dans ce cas, l'accepteur émet de la fluorescence à 665 nm avec une durée de vie longue, ce qui permet de différencier ce signal de la fluorescence propre de l'accepteur qui présente une durée de vie courte. On mesure en temps résolu à la fluorescence à 620 nm et à 665 nm en présence de l'accepteur ("essai" E620 et E665) et en l'absence de l'accepteur ("blanc" B620 et B665), puis on calcule le rapport Re = E665 / E620 et Ro = B665 / B620. Ensuite on calcule la valeur DF = (Re-Ro) / Ro exprimée en pourcentage une augmentation de valeur DF montre la présence d'un transfert d'énergie et donc l'incorporation du cryptate dans l'ADN amplifié.
On utilise les milieux K1-, K1+, K2- et K2+ provenant des réactions PCR. Dans des microtubes, on dépose 2 μl de chaque milieu PCR auxquels on ajoute 10 μl de sonde CP (0,03 UA260 / ml) et 13 μl de tampon BUAM (2X), on porte les tubes scellés 10 mn à 94°C puis 20 mn à 50°C à l'aide d'un thermocycleur. On dilue 5 μl de milieu d'hybridation dans 200 μl de tampon L et on pipette 40 μl de cette dilution dans les puits "Essais" d'une plaque de microtitration et 40 μl dans les puits "blanc" (96 well flat bottom microplate HTRF, Packard).
On ajoute 40 μl de SA-XL665 à 3.10^/1 (CIS bio international) aux puits "Essais" et 200 μl de tampon L. On ajoute 240 μi de tampon L aux puits "Blanc". On incube 15 mn à 37°C et on effectue immédiatement la mesure de fluorescence sur un appareil Discovery (Packard).
Les résultats sont rapportés dans le tableau 2 ci-après.
Tableau 2
Figure imgf000023_0001
Les résultats montrent que le conjugué K-11-dUTP est incorporé au cours d'une réaction de PCR. De plus, la présence des molécules de cryptate liées à l'ADN amplifié peut être mise en évidence par l'hybridation d'une sonde spécifique de cet ADN amplifié et révélée par un transfert d'énergie non radiatif entre le cryptate et un accepteur lié à la sonde hybridée.
EXEMPLE 6: Synthèse de la désoxyuridine marquée au cryptate d'europium trisbipyridine (K-4-dUTP). Dans ce composé, le chiffre 4 indique le nombre total d'atomes du bras qui relie la structure cryptate au nucleotide (ici la liaison se fait en position 5 de la pyrimidine).
Le nucléoside-triphosphate utilisé est le 5-(3-aminoallyl)-2'-désoxyuridine-
5'-triphosphate (AA-dUTP) préparé suivant un procédé de la littérature (Langer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. (1981), 78 , 6633-6637). Le composé est purifié sur DEAE-Sepharose ® (Pharmacia) dans un gradient d'hydrogénocarbonate de triéthylammonium (10mM à 300mM).
On dilue 60 μl d'une solution d'AA-dUTP à 5,4 μmole/ ml (soit 0,3 μmole) à
240 μl d'hydrogénocarbonate de triéthylammonium (TEAB) 0J M pH 7,8 et on ajoute 300 μl d'une solution de cryptate [TBP-(Eu3+)] activé à 4 mg/ml dans l'acétonitrile, soit 0,85 μmol (environ 3 équivalents). Le cryptate [TBP-(Eu3+)] activé est préparé extemporanément comme décrit dans l'exemple 1 , méthode A.
Après 35 min sous agitation on ajoute 15 μl de TEAB 1M pH 8,5, on concentre de moitié puis on injecte le mélange sur une colonne Superdex 30 ® HR 10/30 (Pharmacia) en éluant par du TEAB 25mM pH9 contenant 10% d'acétonitrile (débit 1ml/mln).
On collecte le composé de Rt s 16,3 mn ; cette fraction dénommée Fraction 1 est concentrée sous vide (speed-vac) jusqu'à un volume de 200 μi puis injectée sur la même colonne éluée par un tampon triéthylammonium acétate 25mM pH7 contenant 5% d'acétonitrile. La fraction correspondant au seul pic du chromatograme est collectée (16 min <Rt< 19 min) et concentrée sous vide (speed-vac) on obtient 260μl d'une solution de K-4-dUTP dénommée Fraction 2 contenant 6,0 UA303. En estimant un 8393 ≡ 35 000, on estime la concentration en K-4-dUTP à environ 0,65 mM.
Le composé est analysé en spectrométrie de masse (électrospray mode négatif):
(M-4H)*- = 1315.5 (C50H48EUNHO-17P3 Calculé: 1319 ) Le spectre UV dans l'eau présente un maximum à 243 nm caractéristique du nucleoside (λmax = 289 nm ε = 7100 , λmax = 240 nm ε = 10700 ) et un maximum à 303 nm proche du λmax de 305 nm (ε = 27000) caractéristique du cryptate d'Europium. On observe un rapport A303 A240 ≡ 0,82 compatible avec la structure proposée).
La formule du conjugué K-4-dUTP est donné en figure 2.
EXEMPLE 7: Synthèse de l'uridine marquée au cryptate d'europium trisbipyridine (K-11-UTP). Dans ce composé, le chiffre 11 indique le nombre total d'atomes du bras espaceur qui relie la structure cryptate au nucleotide (ici la liaison se fait en position 5 de la pyrimidine).
Le nucléoside-triphosphate utilisé est le 6-aminocaproyl-[5-(3-aminoallyl)- Uridine-5'-triphosphate] (AH-UTP) préparé comme indiqué dans l'exemple 1. Le composé est purifié sur DEAE-Sepharose ® (Pharmacia) dans un gradient linéaire d'hydrogénocarbonate de triéthylammonium (25mM à 300mM).
On utilise 400 μl d'une solution d'AH-dUTP à 1 ,1 μmole/ ml (soit
0,44μmole) dans de l'hydrogénocarbonate de triéthylammonium (TEAB) 0,1 M pH 7,8 et on ajoute 360 μl d'une solution de de cryptate [TBP-(Eu3+)] activé (3mg/ml dans l'acétonitrile). Le cryptate [TBP-(Eu3+)] activé est préparé extemporanément comme décrit dans l'exemple 1 , méthode A.
Après 45 min sous agitation on ajoute 40μl de TEAB 1M pH 8,5 puis on injecte le mélange sur une colonne Superdex peptide 30 ® HR 10/30 (Pharmacia) en éluant par du TEAB 50 mM pH 7 contenant 10% d'acétonitrile (débit 1ml/mn). On collecte le composé de Rt ≈ 15,4 mn, cette fraction dénommée
Fraction 1 est concentrée sous vide (speed-vac) j'usqu'à un volume de 200 μl qui contient = 10 UA304 nm. En estimant un 8304 ≡ 35 000, on estime la concentration en K-11-UTP à environ 0,3 mM.
Cette fraction 1 est injectée sur la même colonne éluée par un tampon triéthylammonium acétate 25mM pH7 contenant 5% d'acétonitrile. La fraction c- -espondant au seul pic du chromatograme est collectée (Rt ≡ 16,5 min) et concentrée sous vide (speed-vac) on obtient 202 μl d'une solution de K-11-UTP dénommée fraction 2 contenant 7,5 UA304 nm.
Le composé est analysé en spectrométrie de masse (électrospray mode négatif):
(M-4H)" = 1444.3
Figure imgf000025_0001
; Calculé: 1448.0). Le spectre UV dans l'eau présente un maximum à 241 nm caractéristique du nucleoside (λmax = 289 nm ε = 7 100 , λmax = 240 nm ε = 10700) et un maximum à 303 nm proche du λmax de 305 nm (ε = 27 000) caractéristique du cryptate d'Europium. On observe un rapport A304/A241 ≡ 0,80 compatible avec la structure proposée).
Le composé est analysé par FPLC (colonne mono-Q, Pharmacia).
Tampon A: Acétate de sodium 20mM pH 5,2 contenant 10% d'acétonitrile. Tampon
B: Acétate de sodium 20mM pH 5,0 et LiCI 1M contenant 10% d'acétonitrile.
Gradient linéaire de 0 à 30 % B en 25mn. Débit 1ml/mn. Le K-11-UTP présente un Rt = 10,7 min.
La formule du conjugué K-11-UTP est donnée en Figure 3.
EXEMPLE 8 : Mesures comparées des durées de vie des conjugués dUTP-et UTP- cryptate d'europium trisbipyridine et du cryptate seul
On utilise comme cryptate de référence le cryptate d'Europium [(bis- bpy)(bpy-di(amidoéthylèneamine)] décrit dans l'exemple 4 de la demande EP 0 321 353 (ci-après dénommé KNH2).
On prépare une solution mère de KNH2 dans l'eau et on détermine sa concentration par mesure de la densité optique à 306 nm en prenant un 8306 ≡ 30000. La solution mère (6,7 x 10 ^ M) est diluée au 1/100èmβ dans du tampon Tris-HCI 0JM pH 9; 100 μl de cette dilution intermédiaire sont ensuite dilués dans 600 μl du même tampon. Parallèlement, une solution mère de K-11-dUTP, K-4-dUTP et K-11-UTP (préparés respectivement selon les exemples 1 , méthode A ; 6 et 7) dans l'eau , dont la concentration est estimée à 3 x 10 "5 M par mesure de la densité optique à 304 nm (8304 ≈ 35000). Chaque solution mère est diluée à 50μl dans 1 ml de tampon Tris-HCI 0JM pH 7,4 ou dans du tampon Tris-HCI 0JM pH 9.
On mesure les valeurs de la durée de vie d'émission de l'Europium (τ en ms) en utilisant un spectrofluorimetre en temps résolu de type LS50 (Perkin-Elmer) et des cuves Helma 5 mm x 5 mm.
Les résultats sont rapportés dans le tableau 3 ci-dessous : Tableau 3
Figure imgf000027_0001
Ces résultats montrent que le couplage du nucleotide sur la molécule de cryptate entraîne une augmentation de la durée de vie de l'Europium et de nouvelles caractéristiques de fluorescence pour le conjugué cryptate- nucleotide par rapport au cryptate de référence.
EXEMPLE 9 : Incorporation de K-11-dUTP au cours de l'élongation d'un oligonucléotide par la Terminale Nucléotidyl Transférase (Mise en évidence par transfert d'énergie non radiatif et mesure de fluorescence en temps résolu) : On prépare un microtube dans lequel se déroule la réaction d'élongation en utilisant : - 25 μl de tampon Tris-acétate 0,2M pH 7,2
- 4 μl d'une solution aqueuse de chlorure de cobalt 25 mM
- 5 μl d'une solution d'un oligonucléotide (composition A2C3G7T3 biotinylé en 5'). 2,4μM dans H2O
- 2μl de K-11-dUTP (fraction 2, préparé selon l'exemple 7) à une concentration de 0,04 mM
- 8 μl de dTTP: 0,04 mM
- 5 μl d'eau
- 1 μl de Terminal Deoxynucleotidyl Transférase (TnT, EC 2.7.7.31) (Sigma , 35 U/μl). On prélève 2 μl de mélange réactionnel qu'on ajoute à 4 μl d'EDTA 60 mM
(pour obtenir un témoin à to = 0 min) et on incube le reste à 37°C pour faire une étude cinétique. Après 5, 10, 20, 40, 60 et 80 min de réaction à 37°C, on prélève pour chaque temps 2 μl de mélange réactionnel qu'on ajoute à 4 μl d'EDTA 60 mM pour arrêter la réaction. On obtient ainsi les fractions ts, t-io etc. Ces fractions to, ts, t-io sont diluées par 250 μl de tampon L (phosphate OJM pH 7, NaCI 0J5M,
Figure imgf000028_0001
On pipette 50 μl (équivalent à 2,3.10"'' 2 mole de biotine) de prélèvements dilués comme décrit ci-dessus dans les puits "essais" (dénommés Eo, E5, E-io etc.) d'une microplaque (96-wells flat bottom black low fluorescence microplaque HTRF- 96 PACKARD). On ajoute 50 μl de conjugué SA-XLges (CIS bio international) dilué dans le tampon L (1 ,5.10"^ M), dans chaque puit "essais", puis 150 μl de tampon L.
On réalise un "blanc" à partir d'un mélange réactionnel décrit ci-dessus dans lequel l'enzyme n'a pas été ajoutée mais remplacé par 1 μl d'eau, on prélève 2μl de ce mélange et on lui fait subir les traitements et dilutions décrits ci-dessus. On pipette 50μl de ce prélèvement dilué dans les puits dénommés "blancs" auxquels on ajoute 50 μl de conjugué SA-XL555 et 150 μl de tampon L.
Après incubation (15 min à 37°C), on lit la fluorescence à 620 nm et à 665 nm sur un appareil DISCOVERY (Microplate HTRF-analyser PACKARD).
On calcule les rapports des intensités de fluorescence Re=E665/E620 pour chaque essai et Ro=B665/B620 pour chaque blanc, puis on calcule la valeur DF = (Re-Ro)/Ro exprimée en pourcentage, les résultats sont reportés dans le tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4
Figure imgf000028_0003
Le blanc présente un rapport
Figure imgf000028_0002
0,064 . Pour to on observe un rapport E665 / Eβ20 = 0,063, le transfert étant de DF = 100x (Re-Ro)/Ro = 100 (0,063-0,064) / 0,064 soit un transfert pratiquement nul. En calculant ainsi le DF pour chaque temps, on observe que le transfert d'énergie exprimé par la valeur DF augmente au cours du temps, ce qui montre que le K-11-dUTP est incorporé dans la chaîne oiigonucléotidique par la terminal nucleotidyl transférase.
EXEMPLE 10: Propriétés photophysiques d'un oligonucléotide dans lequel sont incorporés des molécules de cryptate : On effectue une réaction d'incorporation de K-11-dUTP par la TnT suivant l'exemple 9 en multipliant toutes les quantités par 3. On vérifie que l'incorporation de K-11-dUTP suit la même cinétique en réalisant la mesure de DF en fonction du temps. Après 80mn de réaction, on l'arrête par 12 μl de solution d'EDTA 400 mM. On prélève 105 μl de mélange réactionnel et on le dépose sur une colonne NAP5 (Pharmacia) équilibrée dans du tampon phosphate 10 mM pH 7,4.
L'oligonucléotide est élue par 600 μl de tampon. Cette fraction appelée « fraction 1 » (volume d'exclusion) est analysée comme suit : dans les puits d'une microplaque on dépose 50 μl de fraction 1 auquel on ajoute 200 μl de tampon L ce qui constitue le « blanc cryptate ». Dans les puits suivants on dépose 50 μl de fraction 1 et 50 μl de conjugué SA-XLggs (CIS bio international) (1 ,5. 10"8 dans du tampon L) et 150 μl de tampon L ce qui constitue le puit « essai ». On mesure la fluorescence à 620 nm et à 665 nm sur un appareil DISCOVERY (Microplate HTRF-analyser PACKARD.
Figure imgf000029_0001
On calcule DF = 100 x (Re-R0) / Ro = 100 (1 ,14-0,0347) / 0,0347 = 3180%, cette fraction contient donc l'oligonucléotide marqué au cryρtatei
On observe que les fractions obtenues en continuant l'élution (fractions 2, 3 ...) présentent une valeur de DF faible par rapport à celle de F1 et une fluorescence brute élevée à 620 nm : elles contiennent donc l'excès de K-11-dUTP non incorporé.
En comparant la fluorescence obtenue dans la fraction F1 (qui correspond aux molécules de cryptate incorporées dans la chaîne oligonucléotidique) avec la fluorescence de solutions étalon contenant du cryptate à une concentration connue, on peut estimer que la fraction F1 contient environ 5J0"'' '' mol de cryptate, étant donné que la quantité d'oligonucléotide estimée dans la fraction F1est de 2J0"'' '' / 2.10"'* '* = 2,5 de nucleotide marqué au cryptate par chaîne oligonucléotidique. II faut noter que l'incorporation de K-dUTP et de dTTP se fait de façon simultanée et de façon statistique. Sur l'extrémité 3' de chaque chaîne oligonucléotidique sont donc incorporés un nombre variable de nudéotides T et en moyenne, au moins 2 nudéotides K-dU.
La durée de vie τ est calculée à partir de la pente à la droite obtenue en traçant Log E520 = f(t).
On mesure la durée de vie de l'émission à 620nm pour l'oligonucléotide marqué contenu dans la fraction 1 (tampon phosphate 10 mM pH 7,4) en utilisant un fluorimètre en temps résolu KRYPTOR (CIS bio international) avec une excitation à 337 nm. On obtient une durée de vie τ = 866 μs. Cette durée de vie est supérieure à la durée de vie du conjugué K-11-dUTP (τ = 681 μs) mesuré simultanément dans les mêmes conditions.
On observe donc une augmentation de la durée de vie du cryptate incorporé dans une chaine oligonucléotidique.
EXEMPLE 11: Synthèse de l'adénosine marquée au cryptate d'Europium trisbipyridine (conjugué K-9-ATP). Dans ce composé, le chiffre 9 indique le nombre total d'atomes du bras espaceur qui relie la structure cryptate au nucleotide (ici la liaison se fait en position 8 de la purine). Le nucléoside-triphosphate utilisé est le [8-(6-aminohexyl)-Adenosine-5'- triphosphate] (AH-ATP, Sigma). On utilise une solution de OJ μmol AH-ATP dans 100 μl d'hydrogénocarbonate de triéthylammonium (TEAB) 0,1 M pH 8 et on ajoute 100 μl d'une solution de cryptate [TBP-(Eu3+)] activé (4 mg/ml dans l'acétonitrile). Le cryptate [TBP-(Eu3+)] activé (NHS /DCC dans l'acétonitrile) est préparé extemporanément comme décrit dans l'exemple 1 , méthode A.
Après 35 min sous agitation on ajoute 5 μl de TEAB 1M, on concentre de moitié puis on injecte le mélange sur une colonne Superdex 30 ® HR 10/30 (Pharmacia) en éluant par du TEAB 50 mM pH 8 contenant 10% d'acétonitrile (débit 1 ml/min). On collecte le composé de Rt ≈ 16,7 min, cette fraction dénommée
Fraction 1 est concentrée sous vide (speed-vac) jusqu'à un volume de 200 μl puis est injectée sur la même colonne éluée par un tampon triéthylammonium acétate 25mM pH7 contenant 5% d'acétonitrile. La fraction correspondant au seul pic du chromatogramme est collectée (Rt = 17,2 min) et concentrée sous vide (speed-vac). Le spectre UV dans l'eau présente un maximum à 245 nm, un maximum à
283 nm proche de la λmax caractéristique du nucleoside (λmax= 279, ε = 21 000) et un maximum à 303 nm proche de la λmax de 305 nm (ε =27 000) caractéristique du cryptate d'Europium. On observe un rapport A305/A28O = 1 compatible avec la strucure proposée.
La formule du conjugué K-9-ATP est donnée en Figure 3.
EXEMPLE 12 : Incorporation d'un conjugué UTP-cryptate d'europium trisbipyridine (K-11-UTP) au cours d'une réaction de transcription in-vitro (mise en évidence par transfert d'énergie non radiatif et mesure de fluorescence en temps résolu)
On utilise l'incorporation simultanée de K-11-UTP et de Bio-14-CTP (conjugué CTP-Biotine) sur une même molécule d'ARN par transcription in-vitro.
1/ Transcription La réaction de transcription d'un ADN double brin renfermant un promoteur (ADN plasmidique pSTP18 et pSTP19 contenant le promoteur T7 et linéarisé par Eco R1 ) en ARN est faite à l'aide d'un kit de transcription SP6/T7
(Boehringer-Mannheim). Le transcrit obtenu possède une longueur de 1035 bases.
Le milieu de transcription contient en plus des ribonucleotides à une concentration finale de 0,5mM, 0,2% de K-11-UTP et 30% de bio-14-CTP qui seront incorporés statistiquement au long de la chaîne.
On utilise le K-11-UTP fraction 2 décrit dans l'exemple 7 qui est dilué dans l'eau de façon à obtenir une concentration de 20 μM.
La solution de bio-14-CTP est préparée par dilution dans l'eau d'une solution commerciale 10 mM de Biotine-14-CTP (Gibco-BRL/Life Technologies).
Le milieu de transcription est préparé dans des microtubes pour PCR (0,5ml) suivant le tableau ci-dessous :
Figure imgf000032_0001
Après ajout de l'enzyme, on prélève 2 μl de milieu réactionnel qui sont immédiatement dilués par 38 μl d'une solution EDTA 50 mM pH 8, cette solution est ensuite diluée en prélevant 19 μl qui sont dilués par 114 μl de tampon L. Cette solution servira à constituer un témoin de bruit de fond à to= 0 min.
Le mélange réactionnel est placé à 37°C dans un thermocycleur. Après des temps de réaction déterminés (60 min, 90 min et 120 min), on prélève 2 μl de mélange réactionnel qui sont dilués comme précédemment par 38 μl d'EDTA 50 mM pH 8. Ces solutions sont ensuite diluées en prélevant 19 μl qui sont dilués par 114 μl de tampon L.
On dépose 50 μl de chaque solution diluée correspondant aux temps 0 min, 60 min, 90 min et 120 min dans les puits d'une microplaque noire (96 well flat bottom microplate HTRF, Packard).
On ajoute 50μl d'une solution de SA-XL665 (CIS bio international) à une concentration de 6,25.10" M dans du tampon L. On ajoute ensuite 100 μl de tampon L.
2/ Mesure du transfert d'énergie en temps résolu
Après incubation (15 min à température ambiante) on effectue une mesure de fluorescence à 620 nm et à 665 nm sur un appareil DISCOVERY (Packard). Pour chaque temps de réaction considéré, on évalue le transfert d'énergie en calculant le rapport Re = F665/F620. Le rapport Ro = F665/F620 pour le temps to permet d'évaluer le niveau du bruit de fond, la même mesure faite sur une dilution de 2 μl d'un mélange réactionnel de transcription dans lequel l'enzyme a été remplacé par un volume équivalent d'eau donne le même niveau de bruit de fond.
Le transfert d'énergie est calculé par la formule DF = (Re-Ro)/Ro pour chaque temps. Les résultats sont reportés dans le tableau 5 ci-dessous.
Tableau 5
Figure imgf000033_0001
On observe que la valeur DF augmente, traduisant une augmentation du transfert d'énergie provenant de l'incorporation du K-11-UTP et du bio-CTP dans l'ARN transcrit. La réaction de transcription décrite ci-dessus est contrôlée par électrophorèse sur gel d'agarose (3%),
On observe une bande de taille élevée montrant l'intégrité du fragment d'ARN produit, cette bande est caractérisée par une migration identique à la bande produite à partir d'une transcription faite à partir des rNTP naturels seuls. La courbe des valeurs de DF en fonction du temps de réaction donnée en figure 4 montre le profil typique d'une cinétique d'incorporation de nucleotide au cours d'une transcription enzymatique. Ces résultats montrent que le conjugué K-11-UTP est incorporé efficacement par une RNA polymerase.
EXEMPLE 13 : Incorporation d'un conjugué K-11-dUTP au cours d'une réaction de transcription in-vitro (mise en évidence par transfert d'énergie non radiatif et mesure de fluorescence en temps résolu après hybridation d'une sonde-accepteur) : La réaction de transcription d'un ADN double brin en ARN est faite à l'aide d'un kit de transcription (Gibco BRL). L'ADN double brin renfermant le promoteur
T7 est lui-même obtenu par une PCR réalisée avec un couple d'amorces dont une des amorces contient la séquence du promoteur de la T7 RNA polymerase (EC 2.7.7.6).
Le transcrit obtenu possède une longueur théorique de 115 bases. Le principe général de la transcription par une RNA polymerase est décrit p. 5.58 et 5.59 de « Molecular Cloning, A Laboratory Manual » 2nd édition, J. Sambrook, E.F. Fritsch et T. Maniatis CSH Press 1989. On peut également utiliser une autre RNA polymerase tel que SP6 ou T3
RNA polymerase : dans ce cas, la séquence de l'amorce PCR concernée sera modifiée pour incorporer le promoteur spécifique de la RNA polymerase considérée.
L'incorporation d'un promoteur est décrit dans le § 13.5 et § 23.2 dans « PCR : Clinical Diagnostics and Research » A ; Rolfs et al. Spinger-Veriag (1992) ainsi que dans D.Y. Kwoth et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1989), 86, 1173-1177.
1/ Obtention de l'ADN double brin renfermant le promoteur de la RNA polymerase : On utilise un protocole analogue à celui décrit dans l'exemple 5, mais en utilisant uniquement des désoxynudéotides afin de générer un produit PCR primaire de 117 bp.
On effectue une deuxième PCR (PCR secondaire) en utilisant comme ADN cible (DNA) 2 μl d'une dilution au 1/100èmβ du produit de la PCR primaire. Pour cette PCR secondaire, on remplace l'amorce k-ras EX1 Antisens par l'amorce suivante nommée T7-AS de séquence
5' d(TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG TGG ATC ATA TTC GTC CAC AAA ATG) 3-. La partie de cette séquence écrite en italique correspond à la séquence du promoteur de la T7 RNA polymerase.
L'amorce k-ras EX1 Sens possède la séquence suivante : 5' d(CTG.CTG.AAA.ATG.ACT.GAA.TAT) 3-.
A l'issu de cette PCR secondaire, on obtient un ADN double brin d'une longueur théorique de 132 pb et de séquence suivante (brin sens) :
5' d(CTG.CTG.AAA.ATG.ACT.GAA.TAT.AAA.CTT.GTG.GTA.GTT.GGA.GCT. GGT.GGC.GTA.GGC.AAG.AGT.GCC.TTG.ACG.ATA.CAG.CTA.ATT.CAG.AAT.CAT. TTT.GTG.GAC.GAA.TAT.GAT.CCA.CCC. CTA. TAG. TGA. GTC.GTA. TTA)3: La partie en italique représente la séquence T7 (brin sens) et la partie soulignée représente la séquence correspondant à la sonde lors de l'étape d'hybridation.
La transcription va produire la séquence ARN suivante (séquence homologue au brin antisens du fragment d'ADN transcrit) dans laquelle la partie soulignée correspond à la séquence qui est reconnue par la sonde biotinylée :
5' pppG.UGG.AUC.AUA.UUC.GUC.CAC.AAA.AUG.AUU.CUG.AAU.UAG. CUG.UAU.CGU.CAA.GGOACU.CUU.GCC.UAC.GCC.ACC.AGC.UCC.AAC.UAC.CA C. G.UUU.AUA.UUC.AGU.CAU.UUU.CAG.CAG.GCC 3-.
La sonde RAS12N utilisée est biotinylée en 5' et possède la séquence suivante :
Biotine-5' d(GTT.GGA.GCT.GGT.GGC.GTA.GG) 3-
2/ Transcription : Le milieu de transcription contient, en plus des ribonucléotides naturels à une concentration finale de 0,5 mM, 2 % de K-11-UTP qui sera incorporé statistiquement au long de la chaine d'ARN.
On utilise le K-11-UTP fraction 2 décrit dans l'exemple 7 qui est dilué dans l'eau de façon à obtenir une concentration de 100 μM. Le milieu de transcription est préparé dans des microtubes pour PCR
(0,5 ml) suivant le tableau ci-dessous :
Figure imgf000035_0001
Le mélange réactionnel est placé dans un thermocycleur à 40°C pendant 120 min, puis on arrête la réaction par 4 μl d'EDTA 0,2 M pH 8.
Dans un microtube pour PCR, on prélève 2 μl du milieu réactionnel et on le dilue par 10 μl de sonde RAS12N (0,03 UA260/ml dans H2θ) Puis on ajoute 13 μl de tampon d'hybridation (tampon phosphate 100 mM pH 7,4 / BSA 0J %
NaCI 1M). On porte 10 min à 70°C puis on hybride 20 min à 45°C dans un thermocycleur.
5,5 μl du milieu d'hybridation ci-dessus sont dilués dans du tampon L (qsp 200 μl) pour donner le milieu d'hybridation dilué HTp0S. On constitue un blanc en effectuant une transcription selon le protocole ci- dessus mais en remplaçant l'ADN de PCR positive par un volume équivalent de milieu PCR provenant d'une réaction de PCR négative qui ne contient pas l'ADN cible.
Le milieu de transcription négative (2 μl) est arrêté, puis on effectue une hybridation comme décrit ci-dessus et on dilue dans du tampon L. On obtient ainsi le milieu d'hybridation dilué HTneg.
3/ Mesure du transfert d'énergie en temps résolu
L'incorporation du cryptate dans la chaîne d'ARN est mise en évidence par l'hybridation d'une sonde complémentaire à la séquence d'ARN, cette sonde étant marquée avec un conjugué SA-XL665 (CIS bio international) par l'intermédiaire du couple streptavidine-biotine.
Dans les puits d'une microplaque noire (96 well flat bottom microplate
HTRF, Packard), on dépose 50 μl de milieu HTp0S et 50 μl de conjugué SA-XL665 (CIS bio international) dilué à 1 ,5.10'^M dans du tampon L puis on ajoute 100 μl de tampon L. Ces puits vont permettre la mesure du transfert d'énergie par le calcul de Re = E665/E620 détaillé dans l'exemple 5.
Dans les puits voisins, on dépose 50 μl de milieu HTneg , on ajoute 50 μl de conjugué SA-XL665 et 100 μl de tampon L comme décrit ci-dessus. Ces puits constituent une référence pour évaluer le bruit de fond par le calcul de Ro.
On effectue une mesure de fluorescence à 620 nm et à 665 nm sur un appareil DISCOVERY (Packard).
Le transfert d'énergie est calculé par la formule suivante DF = (Re-Ro)/Ro pour chaque temps, les résultats sont reportés dans le tableau 6 ci-dessous. Tableau 6
Figure imgf000037_0001
On observe un transfert de 178 % dans le cas où la transcription est faite résence de l'ADN cible.

Claims

REVENDICATIONS
1. Conjugué fluorescent de nucleoside ou de nucleotide, caractérisé en ce qu'il comprend : - un ribo- ou désoxyribo-nucléoside ou nucleotide natif ou chimiquement modifié ou conjugué à une ou plusieurs molécules marqueur(s), dont au moins un atome de carbone du cycle ou un atome d'azote exocyclique du cycle purique ou pyrimidique, ou encore un atome de carbone de l'unité pentofuranose est susceptible d'être impliqué dans une liaison avec un marqueur fluorescent, et - au moins un marqueur fluorescent lié au(x)dit(s) atome(s) constitué par un cryptate de terre rare.
2. Conjugué fluorescent de nucleoside ou de nucleotide, caractérisé en ce qu'il comprend :
- un ribo- ou désoxyribo-nucléoside ou nucleotide natif ou chimiquement modifié ou conjugué à une ou plusieurs molécules marqueur(s), dont au moins un atome de carbone du cycle ou d'azote exocyclique du cycle purique ou pyrimidique est susceptible d'être impliqué dans une liaison avec un marqueur fluorescent, et
- au moins un marqueur fluorescent lié au(x)dit(s) atome(s) constitué par un cryptate de terre rare.
3. Conjugué selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un conjugué fluorescent de nucleotide comprenant un ribo-nucléotide choisi parmi AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, CMP, CDP, CTP, UMP, UDP, UTP, TMP, TDP, TTP, 2Me AMP, 2Me ADP, 2Me ATP, 1Me GMP, 1Me GDP, 1Me GTP, 5Me CMP, 5Me CDP, 5Me CTP, 5MeO CMP, 5MeO CDP, 5MeO CTP, 7-déaza-ATP, 7- déaza-GTP ou un désoxyribo-nucléotide choisi parmi les désoxy- ou didésoxy- ribonucléotides correspondant à ceux-ci.
4. Conjugué selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ribo- ou désoxyribo-nucléotide est choisi parmi :
- les dérivés de la 2'-désoxy-uridine-5'-triphosphate ou de l'uridine-5'- triphosphate fonctionnalisés en position 5 de la base,
- les dérivés de la 2'-désoxy-cytidine-5'-triphosphate ou de la cytidine-5'- triphosphate fonctionnalisés en position 4 ou 5 de la base,
- les dérivés de la 2'-désoxy-adénosine-5'-triphosphate ou de l'adénosine- 5'-triphosphate fonctionnalisés en position 6 ou 8 de la base, - les dérivés de la 2'-désoxy-guanosine-5'-triphosphate ou de la guanosine-5'-triphosphate fonctionnalisés en position 6 ou 8 de la base, - les dérivés de la 2'-désoxy-7-déaza-adénosine-5'-triphosphate ou de la 7-déaza-adénosine-5'-triphosphate fonctionnalisés en position 7 de la base, et
- les dérivés de la 2'-désoxy-7-déaza-guanosine-5'-triphosphate ou de la 7-déaza-guanosine-5'-triphosphate fonctionnalisés en position 7 de la base.
5. Conjugué selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il s'agit d'un conjugué fluorescent de nucleoside dans lequel le ribo- ou désoxyribo-nucléoside est choisi parmi A, G, C, U, T, les désoxy- ou didésoxynucléosides correspondants, leurs analogues chimiquement modifiés.
6. Conjugué selon la revendication 5, caractérisé en ce que le désoxyribonucléoside est choisi parmi la 3'-azido-3'-désoxythymidine et ses dérivés ; et les analogues 2', 3'-didésoxy de A, T, C, G, U, I.
7. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le marqueur fluorescent est lié à un groupe fonctionnel introduit ou généré sur la base ou sur l'unité pentofuranose du ribo- ou désoxyribo- nucleoside ou nucleotide, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un bras espaceur.
8. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le marqueur fluorescent est un cryptate de terbium, d'europium, de samarium ou de dysprosium.
9. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le marqueur fluorescent est un cryptate de terre rare constitué d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropoiycyclique de formule
Figure imgf000039_0001
dans laquelle Z est un atome ayant 3 ou 4 valences, R est rien ou représente l'hydrogène, le groupe hydroxy, un groupe amino ou un radical hydrocarboné, les radicaux bivalents ® , ( ) et © , sont indépendamment l'un de l'autre des chaînes hydrocarbonées qui contiennent éventuellement un ou plusieurs heteroatomes et sont éventuellement interrompues par un hétéromacrocycle, au moins l'un des radicaux (§) , (§) et (c) comportant de plus au moins un motif moléculaire ou étant essentiellement constitué par un motif moléculaire, ledit motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé.
10. Conjugué selon la revendication 9, caractérisé en ce que le marqueur fluorescent est un cryptate de terre rare de formule (I) dans laquelle le motif moléculaire est choisi parmi la phenanthroline, l'anthracène, le benzène, le naphtalène, les bi- et ter-phényle, l'azobenzène, l'azopyridine, la pyridine, les bipyridines, les bisquinoléines et les composés de formules ci-après :
- C2H - Xi - CβH - X2 - C2H -
- C2H - Xi - CH2 - CβH - CH2 - X2 - C2H -
Xi et X2 pouvant être identiques ou différents désignent l'oxygène, l'azote ou le soufre,
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000040_0002
Figure imgf000040_0003
Figure imgf000040_0004
X étant l'oxygène ou l'hydrogène.
11. Conjugué selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que le marqueur fluorescent est un cryptate de terre rare constitué de l'ion terbium ou europium complexé par l'un des composés macrocycliques ci-après :
(22)phénanthroline ; (22)phénanthroline amide ; (22)anthracène ;
(22)anthracène amide ; (22)bi-isoquinoléine ; (22)biphényl-bis-pyridine ;
(22)bipyridine ; (22)bi-pyridine amide ; les macropolycycles tris-bipyridine, tris- phenanthroline, phénanthroline-bis-bipyridine, bi-isoquinoléine-bis-bipyridine, bis- bipyridine diphénylbipyridine.
12. Conjugué selon la revendication 11 , caractérisé en ce que le marqueur fluorescent est le cryptate d'europium Eu trisbipyridine.
13. Conjugué selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le marqueur fluorescent est un cryptate de terre rare constitué d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycydique comprenant un motif moléculaire choisi parmi les bipyrazines, les bipyrimidines et les hétérocycies azotés comportant des groupements N-oxydes.
14. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le marqueur fluorescent est un cryptate de terre rare constitué d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycydique répondant à l'une des formules II ou III ci-après :
Figure imgf000041_0001
dans lesquels : - le cycle de formule
Figure imgf000042_0001
st l'un des cycles suivants
1 ) e [Na-OJ ou cycle (22) e [N2O-j] ou cycle (21)
Figure imgf000042_0002
2) macrocycle bis-pyridine
Figure imgf000042_0003
- Y est un groupe ou un bras d'espacement qui est constitué par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en Ci à
C2o contenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et/ou éventuellement contenant par un ou plusieurs heteroatomes tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido ; parmi les groupes cycloalkylène en C5 à Ce ou parmi les groupes arylène en C6 à d4, lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle, aryle ou sulfonate ;
- Z est un groupe fonctionnel susceptible de se lier de façon covalente avec une substance biologique ;
- R est un groupe méthyle ou représente le groupe -Y-Z ; - R' est l'hydrogène ou un groupe -COOR" dans lequel R" est un groupe alkyle en Ci à C10 et représente de préférence le groupe méthyle, éthyle ou tertiobutyle ou bien R' est un groupe -CO-NH-Y-Z.
15. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le marqueur fluorescent est lié au ribo- ou au désoxyribo- nucléoside ou nucleotide par l'intermédiaire d'un bras d'espacement constitué par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en Cι-C2o, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons ou triples liaisons et/ou contenant éventuellement un ou plusieurs heteroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido ; les groupes cycloalkylène en Cβ-Cβ et les groupes arylène en C6-Cι4, lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle, aryle ou sulfonate.
16. Conjugué selon la revendication 15, caractérisé en ce que le bras d'espacement est choisi parmi les groupes :
Figure imgf000043_0001
et
Figure imgf000043_0002
17. Conjugué selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que le désoxyribonudéotide est la désoxyuridine, le marqueur fluorescent est le cryptate d'europium Eu trisbipyridine et le bras d'espacement est un groupe 3-aminoallyle.
18. Procédé de préparation des conjugués selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce qu'on fait réagir un ribo- ou désoxyribo- nucleoside ou nucleotide natif ou chimiquement modifié ou conjugué à une ou plusieurs molécules marqueur(s), dont au moins un atome de carbone du cycle ou un atome d'azote exocyclique du cycle purique ou pyrimidique ou encore un atome de carbone de l'unité pentafuronose est susceptible d'être impliqué dans une liaison avec un marqueur fluorescent avec au moins un marqueur fluorescent lié au(x)dit(s) atome(s) constitué par un cryptate de terre rare.
19. Utilisation d'un conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 à titre de marqueurs.
20. Utilisation d'un conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 6 à 16 en tant que nucleotide constitutif dans une réaction de synthèse d'acide nucléique.
21. Utilisation d'un conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 7 à 16 pour la détection et/ou la localisation de composés contenant au moins une séquence d'acide nucléique.
22. Utilisation selon la revendication 20 dans un procédé de mesure de l'activité enzymatique d'une enzyme impliquée dans une réaction de synthèse d'acide nucléique, caractérisée en ce que l'on mesure la fluorescence émise directement ou indirectement par ledit conjugué, ladite émission de fluorescence étant corrélée au taux d'incorporation dudit conjugué dans le polynudeotide d'acide nucléique synthétisé.
23. Utilisation selon la revendication 22, caractérisée en ce que l'activité enzymatique est une activité polymerase à ADN ou à ARN, transcriptase inverse, transférase ou ligase.
24. Utilisation selon la revendication 20 dans un procédé de mesure de l'activité enzymatique ayant pour substrat un acide nucléique.
25. Polynudeotide comprenant au moins un conjugué selon l'une des revendications 1 à 3 et 6 à 16.
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001096877A2 (fr) * 2000-06-15 2001-12-20 Cis Bio International Nouveaux cryptates de metal des terres rares peu sensibles a l'extinction de fluorescence
US6811979B2 (en) * 2000-10-11 2004-11-02 Applera Corporation Fluorescent nucleobase conjugates having anionic linkers
US6878552B1 (en) * 1999-04-08 2005-04-12 Cis Bio International French Joint Stock Company Homogeneous detection and/or determination method for a chemical or physico-chemical interaction
US6952259B2 (en) 2000-06-02 2005-10-04 Cis Bio International Method of detecting the presence of a liquid in a mix
WO2007074213A1 (fr) * 2005-12-28 2007-07-05 Wallac Oy Reactifs de marquage d’oligonucleotides macrocycliques et conjugues derives de ces reactifs

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2791141B1 (fr) * 1999-03-15 2001-06-01 Cis Bio Int Procede de reduction de l'extinction de fluorescence due au milieu de mesure
DE102005020384A1 (de) * 2005-05-02 2006-11-09 Therainvention Gmbh Spektroskopisches Verfahren zum Nachweis von Analyten
WO2008082440A2 (fr) * 2006-08-25 2008-07-10 Emory University Analogues de nucléoside fluorescents
JP4621926B2 (ja) * 2008-07-24 2011-02-02 国立大学法人九州大学 酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸、核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブの製造方法および標的核酸の検出方法
JP5146785B2 (ja) * 2008-07-24 2013-02-20 国立大学法人九州大学 酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸誘導体
JP5704481B2 (ja) * 2010-01-22 2015-04-22 国立大学法人九州大学 核酸検出用キット
JP5509440B2 (ja) 2012-06-22 2014-06-04 国立大学法人九州大学 タンパク質−核酸複合体の製造方法および標的物の検出方法
CN105602549A (zh) * 2015-12-24 2016-05-25 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 具有高荧光寿命的荧光指示剂
CN108864095A (zh) * 2018-07-27 2018-11-23 中国科学院长春应用化学研究所 一种穴状螯合剂及其制备方法
KR102589836B1 (ko) * 2021-05-26 2023-10-17 전북대학교산학협력단 핵산 형광 표지용 조성물 및 이를 이용한 핵산의 형광 표지 방법

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0180492A1 (fr) * 1984-09-26 1986-05-07 Cis Bio International Complexes macropolycycliques de terres rares-et application à titre de marqueurs fluorescents
EP0321353A1 (fr) * 1987-12-18 1989-06-21 Cis Bio International Cryptates de terres rares, procédés d'obtention, intermédiaires de synthèse et application à titre de marqueurs fluorescents
WO1992001225A1 (fr) * 1990-07-13 1992-01-23 Cis Bio International Procede d'amplification du signal d'emission d'un compose luminescent
WO1992013264A1 (fr) * 1991-01-28 1992-08-06 Cis Bio International Procede de mesure de la luminescence emise dans un dosage par luminescence
WO1992014841A1 (fr) * 1991-02-14 1992-09-03 Baxter Diagnostics Inc. Nouveaux oligonucleotides conjugues a des chelates de lanthanide

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5220012A (en) 1984-09-26 1993-06-15 Compagnie Oris Industrie Sa Macropolycyclic rare earth complexes and application as fluorescent tracers
US5162508A (en) 1987-12-18 1992-11-10 Compagnie Oris Industrie Rare earth cryptates, processes for their preparation, synthesis intermediates and application as fluorescent tracers

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0180492A1 (fr) * 1984-09-26 1986-05-07 Cis Bio International Complexes macropolycycliques de terres rares-et application à titre de marqueurs fluorescents
EP0321353A1 (fr) * 1987-12-18 1989-06-21 Cis Bio International Cryptates de terres rares, procédés d'obtention, intermédiaires de synthèse et application à titre de marqueurs fluorescents
WO1992001225A1 (fr) * 1990-07-13 1992-01-23 Cis Bio International Procede d'amplification du signal d'emission d'un compose luminescent
WO1992013264A1 (fr) * 1991-01-28 1992-08-06 Cis Bio International Procede de mesure de la luminescence emise dans un dosage par luminescence
WO1992014841A1 (fr) * 1991-02-14 1992-09-03 Baxter Diagnostics Inc. Nouveaux oligonucleotides conjugues a des chelates de lanthanide

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6878552B1 (en) * 1999-04-08 2005-04-12 Cis Bio International French Joint Stock Company Homogeneous detection and/or determination method for a chemical or physico-chemical interaction
US6952259B2 (en) 2000-06-02 2005-10-04 Cis Bio International Method of detecting the presence of a liquid in a mix
WO2001096877A2 (fr) * 2000-06-15 2001-12-20 Cis Bio International Nouveaux cryptates de metal des terres rares peu sensibles a l'extinction de fluorescence
FR2810406A1 (fr) * 2000-06-15 2001-12-21 Cis Bio Int Nouveaux cryptates de terre rare peu sensibles a l'extinction de fluorescence
WO2001096877A3 (fr) * 2000-06-15 2002-04-11 Cis Bio Int Nouveaux cryptates de metal des terres rares peu sensibles a l'extinction de fluorescence
JP2004509075A (ja) * 2000-06-15 2004-03-25 シ　ビオ　アンテルナショナル 蛍光消光にあまり敏感でない新規な希土類金属クリプテート
US7087384B2 (en) 2000-06-15 2006-08-08 Cis Bio International Rare earth metal cryptates which are not very sensitive to the fluorescence quenching
US6811979B2 (en) * 2000-10-11 2004-11-02 Applera Corporation Fluorescent nucleobase conjugates having anionic linkers
AU2002213125B2 (en) * 2000-10-11 2007-11-22 Applied Biosystems, Llc. Fluorescent nucleobase conjugates having anionic linkers
US7429651B2 (en) 2000-10-11 2008-09-30 Applera Corporation Fluorescent nucleobase conjugates having anionic linkers
US7687236B2 (en) 2000-10-11 2010-03-30 Applied Biosystems, Llc Fluorescent nucleobase conjugates having anionic linkers
WO2007074213A1 (fr) * 2005-12-28 2007-07-05 Wallac Oy Reactifs de marquage d’oligonucleotides macrocycliques et conjugues derives de ces reactifs

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