WO1999015674A2 - Transgene pflanzen, deren oberirdische teile früher reifen und vollständig absterben - Google Patents

Transgene pflanzen, deren oberirdische teile früher reifen und vollständig absterben Download PDF

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WO1999015674A2
WO1999015674A2 PCT/EP1998/005973 EP9805973W WO9915674A2 WO 1999015674 A2 WO1999015674 A2 WO 1999015674A2 EP 9805973 W EP9805973 W EP 9805973W WO 9915674 A2 WO9915674 A2 WO 9915674A2
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nucleic acid
gdp
plant
acid molecules
plants
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PCT/EP1998/005973
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Jens Kossmann
Ruth Keller
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MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to transgenic plants, the above-ground parts of which ripen earlier and faster than wild-type plants and die completely without this having an effect on the yield of underground plant parts.
  • the plants are characterized by a decrease in the activity of GDP-mannose pyrophosphorylase in the cells.
  • the invention further relates to the use of nucleic acid olecules which encode a GDP-mannose pyrophosphorylase, or of fragments of such molecules for the production of plants with a reduced activity of this enzyme.
  • the present invention also relates to nucleic acid molecules which encode vegetable proteins with the enzymatic activity of a GDP-mannose pyrophosphorylase.
  • the present application thus relates to transgenic plants containing plant cells which are genetically modified, the genetic modification leading to a reduction in the activity of an endogenous GDP-mannose pyrophosphorylase (EC 2.7.7.22) occurring in the plant cell in comparison with corresponding non-genetically modified cells of such plants .
  • an endogenous GDP-mannose pyrophosphorylase EC 2.7.7.22
  • the GDP-mannose pyrophosphorylase is a vegetable protein which is encoded by a nucleic acid molecule selected from the group consisting of:
  • nucleic acid molecules encoding a protein comprising the amino acid sequence encoded by the insertion in the plasmid pGMPase (DSM 11746);
  • nucleic acid molecules gue ⁇ sen the coding region which is contained in the insertion of plasmid pGMPase (DSM 11746);
  • nucleic acid molecules (d) nucleic acid molecules, (d) hy ⁇ brid is with one strand of a nucleic acid molecule of (a), (b), (c) and / or; and (f) Nucleic acid molecules whose sequence deviates from the sequence of a nucleic acid molecule according to (e) due to the degeneration of the genetic code.
  • corresponding wild-type plants means that they are plants which served as starting material for the production of the plants according to the invention, i.e. whose genetic information, apart from the introduced genetic modification, corresponds to that of a plant according to the invention.
  • Ripening means the ripening and death of the aerial parts of the plants. Ripening and dying preferably means the appearance of dark spots on stems first, the appearance of lesions on leaves in the form of small black dots, and the drying of the leaves. The leaf preferably dries progressively from the tip to the stem. In addition, the leaves of the plant, which begin at the bottom of the stem, preferably dry up first, and the drying of the leaves continues progressively, from bottom to top, on the plant, until finally all above-ground parts of the plant have ripened.
  • the fact that the genetically modified plants ripen more quickly means that on the one hand the above-ground parts, in particular the leaves, stems and possibly fruits, start to die earlier than in the corresponding ones Wild-type plants and / or that the entire ripening process proceeds much faster than with corresponding wild-type plants and is completed earlier.
  • the fact that the process starts "earlier” preferably means that the ripening and death of the aerial parts begins at least one week, preferably at least 2 to 3 weeks and particularly preferably about 4 weeks earlier than in the case of corresponding wild-type plants.
  • the fact that the process of ripening takes place “faster” preferably means that the process of ripening and dying off the aerial parts of the plants is generally faster than in the case of corresponding wild-type plants, preferably by at least one week faster and particularly preferably by at least two weeks more quickly.
  • the fact that the process of ripening and dying ends earlier means that the above-ground parts of the plants according to the invention have preferably died off at least 1 to 4 weeks, preferably at least 2 to 4 weeks and particularly preferably at least 3 to 4 weeks earlier than the above-ground parts Parts of corresponding wild-type plants.
  • the fact that the ripening process is completed earlier preferably means that the above-ground parts of the plants according to the invention have already completely died off before the ripening process has started on the above-ground parts of corresponding wild-type plants.
  • the aerial parts of plants according to the invention die about 4 weeks earlier than those of corresponding wild-type plants if the plants are kept under the following conditions: in 16-liter pots with potting soil (prickly soil) / sand mixture 3: 1; Humidity 60%; Temperature 22 ° C during the day / 15 ° C at night; 16 h light / 8 h dark rhythm; Light intensity approx. 150 ⁇ E.
  • plants according to the invention ripen completely means that all above-ground parts of the plant die, in particular that these parts die completely.
  • Such plants according to the invention have the advantage, for example, that they are completely based on the use of herbicides. can be pulled in order to achieve a uniform ripening of the aerial plant parts.
  • late-ripening potato plants it is now possible to change them in such a way that their herb ripens and dies earlier and completely.
  • the herb of the plants according to the invention dies completely. Even with the earlier ripening potato plants used in agriculture, there is the problem that the herb never dies completely and the use of herbicides and herb beaters is therefore always necessary. By cultivating plants where the herb dies completely, the use of these measures could be completely dispensed with.
  • transgenic means that cells of the plants according to the invention contain a foreign DNA sequence in their genome which does not occur in corresponding non-genetically modified cells of corresponding wild-type plants.
  • Foreign DNA sequence means a DNA sequence that either does not naturally occur in the corresponding plant cells, i.e. which is heterologous to the cells, which in the specific spatial arrangement does not occur naturally in the plant cells or which is located at a location in the genome of the plant cell where it does not occur naturally.
  • the foreign DNA sequence is preferably a recombinant molecule which consists of different elements, the combination or specific spatial arrangement of which does not naturally occur in plant cells.
  • the presence, the location and the spatial arrangement of the foreign DNA sequence in the genome of the cells of plants according to the invention can be demonstrated, for example, by Southern blot analysis.
  • the term "genetically modified" means that the plant cell is changed in its genetic information by the introduction of a foreign nucleic acid molecule and that the presence or expression of the foreign nucleic acid molecule leads to a phenotypic change. Phenotypic change preferably means a measurable change in one or more functions of the cells.
  • the genetically modified plant cells of the plants according to the invention show, owing to the presence or expression of the introduced foreign nucleic acid molecule, a reduction in the activity of a GDP-mannose phosphorylase endogenously occurring in the plant.
  • GDP-mannose pyrophosphorylase (EC 2.7.7.22) catalyzes the conversion of GTP and mannose-1-phosphate to GDP-mannose and pyrophosphate.
  • the term “reduction in activity” means a reduction in the expression of endogenous genes which encode a GDP-mannose pyrophosphorylase, a reduction in the amount of GDP-mannose pyrophosphorylase in the cells and / or a reduction in the enzymatic activity of the GDP-mannose pyrophosphorylase in the cells.
  • the reduction in expression can be determined, for example, by measuring the amount of transcripts encoding GDP-mannose pyrophosphorylase, e.g. by Northern blot analysis.
  • a "reduction” preferably means a reduction in the amount of transcripts in comparison to corresponding non-genetically modified cells by at least 10%, preferably by at least 30%, in particular by at least 50%, particularly preferably by at least 70% and in particular by at least 90% .
  • the reduction in the amount of GDP-mannose pyrophosphorylase can be determined, for example, by Western blot analysis.
  • a “reduction” preferably means a reduction in the amount of GDP-mannose pyrophosphorylase protein in comparison to corresponding non-genetically modified cells by at least 10%, preferably by at least 30%, in particular by at least 50%, particularly preferably by at least 70% and in particular by at least 90%.
  • the reduction in the enzymatic activity can be determined, for example, by converting GTP and mannose-1-phosphate to GDP-mannose and pyrophosphate.
  • the activity of GDP-mannose pyrophosphorylase can be determined, for example, as described in Asua et al. (Biochim. Biophys.
  • a "reduction" in the enzymatic activity preferably means a reduction in comparison to corresponding non-genetically modified cells by at least 10%, preferably by at least 30%, in particular by at least 50%, particularly preferably by at least 70% and in particular by at least 90%.
  • the genetic modification by means of a foreign nucleic acid molecule which has been introduced into the cells of the plants according to the invention and whose presence or expression leads to a reduction in GDP-mannose pyrophosphorylase activity can be of various types.
  • the genetic modification can consist in that an endogenously present gene in the plant cell which encodes a GDP-mannose pyrophosphorylase is changed by the introduction of a foreign nucleic acid molecule in such a way that its expression is reduced or completely suppressed.
  • a reduction preferably means a reduction in transcription by at least 10%, preferably by at least 30%, in particular by at least 50%, particularly preferably by at least 70%, in particular at least 90% in comparison to non-genetically modified cells.
  • This can be determined, for example, using Northern blot analysis.
  • This reduction in transcription preferably brings about a corresponding reduction in the activity of GDP-mannose pyrophosphorylase.
  • Such a genetic modification can encode, for example, in an insertion or deletion. the region or promoter region of a GDP-mannose pyrophosphorylase gene.
  • the genetic modification can induce the synthesis of a GDP-mannose pyrophosphorylase that no longer exhibits enzymatic activity. This can e.g. are based on mutations in the coding region of the gene which lead to a loss of the enzymatic activity or to incorrect splicing of the mRNA.
  • a foreign nucleic acid molecule that encodes an inhibitor of GDP-mannose pyrophosphorylase, e.g. an antibody whose binding to the enzyme leads to inhibition of the enzymatic activity.
  • the genetic modification preferably consists in introducing a foreign nucleic acid molecule into the genome of the plant cell, the expression of which leads to the inhibition of the expression of endogenous genes which encode a GDP-mannose pyrophosphorylase, in particular at the transcriptional or translation level.
  • nucleic acid molecules which encode a suitable antisense RNA, a suitable ribozyme or a suitable cosuppression RNA.
  • a corresponding DNA sequence is expressed in an antisense orientation, so that an antisense RNA is synthesized in the cells, which is homologous to transcripts of GDP-mannose pyrophosphorylase genes or to parts of such transcripts.
  • This preferably has a length of at least 30 nucleotides, preferably of at least 50 nucleotides and particularly preferably of at least 100 nucleotides.
  • the expressed antisense RNA should have a high homology to the transcripts which are endogenously expressed in the plant and which encode GDP-mannose pyrophosphorylase.
  • the homology is preferably at least 90 %, preferably at least 95% and particularly preferably at least 99%.
  • RNA that can specifically cleave transcripts of a GDP-mannose pyrophosphorylase gene.
  • the expression of ribozymes for reducing the activity of certain enzymes in cells is also known to the person skilled in the art and is described, for example, in EP-Bl 0 321 201.
  • the expression of ribozymes in plant cells was described, for example, in Feyter et al. (Mol. Gen. Genet. 250 (1996), 329-338).
  • the cosuppression effect is based on the expression of a sense RNA which suppresses the expression of endogenous GDP-mannose pyrophosphorylase RNA. The implementation of these techniques is known to the person skilled in the art.
  • the reduction in the activity of a GDP-mannose phosphorylase in the cells is achieved in that the foreign nucleic acid molecule comprises the following elements:
  • Nucleic acid molecules encoding vegetable GDP-mannose pyrophosphorylase are provided by the present invention.
  • the in Seq ID No. 1 nucleic acid sequence encodes a GDP-mannose pyrophosphorylase from potato. With the aid of this sequence, the person skilled in the art is able to isolate corresponding sequences from other plants or plant species using common molecular biological methods (see below).
  • nucleic acid molecules according to the invention from potato or parts thereof described below are used for the expression of an antisense RNA.
  • all cells or essentially all cells of the plants according to the invention have the genetic modification. In contrast, it is not absolutely necessary for all cells to have a reduction in the activity of GDP-mannose pyrophosphorylase. In a first embodiment it is provided that all or essentially all cells of the plant have a reduced GDP-mannose pyrophosphorylase activity.
  • only cells of parts of plants above ground preferably only cells in the leaves or only cells in the leaves and stems, have a reduced GDP-mannose pyrophosphorylase activity due to the expression of the foreign nucleic acid molecule.
  • the plants according to the invention can in principle be a plant of any plant species, ie both monocotyledonous and dicotyledonous plants. It is preferably an agricultural crop, particularly preferably cotton or potato, and in particular late-ripening potato plants.
  • the present invention also relates to transgenic plant cells which are genetically modified by the introduction of a foreign nucleic acid molecule, the presence or expression of this nucleic acid molecule causing the activity of a GDP-mannose pyrophosphorylase which is endogenously present in the plant cell to be reduced.
  • Such plant cells according to the invention can be used for the regeneration of whole plants.
  • the present invention also relates to a process for the production of transgenic plants, the above-ground parts of which ripen earlier and faster than in the case of corresponding wild-type plants and die completely, whereby
  • a plant cell is genetically modified by the introduction of a foreign nucleic acid molecule and the genetic modification leads to a reduction in the activity of a GDP-mannose pyrophosphorylase which is endogenously present in plant cells;
  • step (c) further plants are produced from the plant according to (b).
  • the plants can be regenerated in accordance with step (b) by methods known to the person skilled in the art.
  • step (c) of the process can e.g. occur through vegetative propagation (for example, through cuttings, tubers or via callus culture and regeneration of whole plants) or through sexual reproduction.
  • Sexual reproduction is preferably controlled, i.e. selected plants with certain characteristics are crossed and propagated.
  • the method is used to produce transgenic potato plants.
  • the introduced foreign nucleic acid molecule enables the synthesis of an antisense RNA which is complementary to transcripts of GDP-mannose pyrophosphorylase genes.
  • the present invention also relates to the plants obtainable by the process according to the invention.
  • the present invention also relates to propagation material of plants according to the invention and of the transgenic plants produced according to the method according to the invention which contains genetically modified cells according to the invention.
  • propagation material includes those components of the plant that are suitable for the production of offspring by vegetative or sexual means. Cuttings, callus cultures, rhizomes or tubers are suitable for vegetative propagation. Other propagation material includes, for example, fruits or seeds.
  • the propagation material is preferably seeds and particularly preferably tubers.
  • the present invention also relates to the use of nucleic acid molecules which encode a GDP-mannose pyrophosphorylase, of their complements or of parts of such molecules for reducing the GDP-mannose pyrophosphorylase activity in plant cells, for producing plant cells with a reduced activity of the GDP-mannose pyrophosphorylase, for the production of plants containing such plant cells and / or for the production of transgenic plants, the above-ground parts of which mature and die faster than in corresponding wild-type plants and which die off completely.
  • the nucleic acid molecules are preferably the nucleic acid molecules according to the invention described below.
  • the present invention further relates to nucleic acid molecules which encode a vegetable protein, the mature form of which has the enzymatic activity of a GDP-mannose pyrophosphorylase, selected from the group consisting of:
  • nucleic acid molecules encoding a protein comprising the amino acid sequence encoded by the insertion in the plasmid pGMPase (DSM 11746);
  • nucleic acid molecules comprising the coding region contained in the insertion of the plasmid pGMPase (DSM 11746);
  • nucleic acid molecules which hybridize with a strand of a nucleic acid molecule according to (a), (b), (c) and / or (d);
  • nucleic acid molecules the sequence due to the Dege ⁇ neration of the genetic code from the sequence of a nucleic acid molecule according to (e) differs.
  • the invention also relates to the complementary strands of the molecules described above.
  • the in Seq ID No. 1 nucleic acid sequence shown is a complete cDNA encoding a GDP-mannose pyrophosphorylase from potato (Solanum tuberosum).
  • a plasmid containing this cDNA was deposited as DSM 11746.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can code a GDP-mannose pyrophosphorylase from any plant organism, preferably one from a higher plant, in particular a monocotyledonous or a dicotyledonous plant.
  • the nucleic acid molecule particularly preferably encodes a protein from an agricultural useful plant, in particular from a cereal plant (for example barley, rye, oats, wheat etc.), or from corn, rice, pea, flax etc.
  • the nucleic acid molecule encodes Protein from potato or cotton.
  • hybridization means hybridization under conventional hybridization conditions, preferably under stringent conditions, as described, for example, in Sambrock et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
  • Nucleic acid molecules that can hybridize with the nucleic acid molecules according to the invention in principle come from any plant that expresses the corresponding proteins.
  • Nucleic acid molecules that hybridize with the molecules according to the invention can be isolated, for example, from genomic or from cDNA libraries.
  • nucleic acid molecules can be identified and isolated using the nucleic acid molecules according to the invention or parts of these molecules or the reverse complements of these molecules, for example by means of hybridization according to standard methods (see for example Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) or by amplification using PCR.
  • nucleic acid molecules can be used as the hybridization sample that exactly or essentially the ones under Seq ID No. 1 indicated nucleotide sequence or parts of this sequence.
  • the fragments used as the hybridization sample can also be synthetic fragments which have been produced with the aid of the common synthetic techniques and whose sequence essentially corresponds to that of a nucleic acid molecule according to the invention.
  • the sequence should be determined and the properties of the proteins encoded by this sequence should be analyzed to determine whether it is a GDP-mannose pyrophosphorylase. Homology comparisons at the level of the nucleic acid or amino acid sequence and the determination of the enzymatic activity are particularly suitable for this.
  • the molecules hybridizing with the nucleic acid molecules according to the invention include in particular fragments, derivatives and allelic variants of the nucleic acid molecules described above, which encode a vegetable protein with the activity of a GDP-mannose pyrophosphorylase.
  • the term derivative in this context means that the sequences of these molecules differ from the sequences of the nucleic acid molecules described above at one or more positions and a high degree of homology to them Have sequences.
  • Homology means a sequence identity over the entire length of at least 60%, in particular an identity of at least 70%, preferably over 80%, particularly preferably over 90% and in particular at least 95%.
  • the deviations from the nucleic acid molecules described above may have arisen, for example, through deletion, addition, substitution, insertion or recombination.
  • nucleic acid molecules in question or the proteins encoded by them are usually variations of these molecules which are modifications which have the same biological function.
  • These can be both naturally occurring variations, for example sequences from other plants, in particular other cereal plants or varieties, or mutations, wherein these mutations can have occurred naturally or have been introduced by targeted mutagenesis.
  • the variations can be synthetically produced sequences.
  • allelic variants can be both naturally occurring variants and also synthetically produced variants or those produced by recombinant DNA techniques.
  • the proteins encoded by the different variants of the nucleic acid molecules according to the invention have certain common characteristics. These can include, for example, biological activity, molecular weight, immunological reactivity, conformation etc., and physical properties such as running behavior in gel electrophoresis, chromatographic behavior, sedimentation coefficients, solubility, spectroscopic properties, stability; pH optimum, temperature optimum etc.
  • Important characteristics of GDP-mannose pyrophosphorylase are (i) its location in the cytosol of plant cells, (ii) its ability to synthesize GDP-mannose using GTP and mannose-1-phosphate as a substrate. This activity can be determined, for example, according to the in Asua et al. (loc. cit.) or in Szumilo et al. (op. cit.) described methods.
  • the molecular weight of the GDP-mannose pyrophosphorylase from potato, derived from the amino acid sequence, is 39,578 daltons.
  • the derived molecular weight of a protein according to the invention is therefore preferably in the range from 35 kDa to 45 kDa, preferably in the range from 38 kDa to 42 kDa and particularly preferably approximately 40 kDa.
  • the calculated isoelectric point of the protein from potato is 7.21.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can be any nucleic acid molecules, in particular DNA or RNA molecules, for example cDNA, genomic DNA, mRNA etc. They can be naturally occurring molecules or molecules produced by genetic engineering or chemical synthesis methods. They can be single-stranded molecules that contain either the coding or the non-coding strand, or double-stranded molecules.
  • the present invention relates to nucleic acid molecules of at least 15, preferably more than 50 and particularly preferably more than 200 nucleotides in length, which hybridize specifically with at least one nucleic acid molecule according to the invention.
  • Hybridizing specifically here means that these molecules hybridize with nucleic acid molecules which encode a protein according to the invention, but not with nucleic acid molecules which encode other proteins.
  • Hybridization preferably means hybridization under stringent conditions (see above).
  • the invention relates to those nucleic acid molecules which hybridize with transcripts of nucleic acid molecules according to the invention. be able to prevent their translation.
  • Such nucleic acid molecules which hybridize specifically with the nucleic acid molecules according to the invention can, for example, be components of antisense constructs or ribozymes or can be used as primers for amplification by means of PCR.
  • the invention further relates to vectors, in particular plasmids, cosmids, viruses, bacteriophages and other vectors which are common in genetic engineering and which contain the nucleic acid molecules according to the invention described above.
  • nucleic acid molecules contained in the vectors are linked in sense orientation to regulatory elements which ensure expression in prokaryotic or eukaryotic cells.
  • expression can mean transcription as well as transcription and translation.
  • nucleic acid molecules according to the invention in prokaryotic cells, for example in Escherichia coli, enables, for example, a more precise characterization of the enzymatic activities of the encoded proteins.
  • mutants can be produced which have a changed ⁇ value or no longer are subject to the regulatory mechanisms normally present in the cell via allosteric regulation or covalent modification.
  • mutants can be produced which have an altered substrate or product specificity.
  • mutants can be produced which have a changed activity-temperature profile. Genetic engineering manipulation in prokaryotic cells can be carried out according to methods known to the person skilled in the art (cf. Sambrook et al., Loc. Cit.).
  • a large number of promoters are available for the expression of a nucleic acid molecule according to the invention in plant cells.
  • any promoter that is functional in the plants selected for the transformation can be used.
  • the promoter can be homologous or heterologous with respect to the plant species used.
  • the 35S promoter of the Cauliflower mosaic virus (Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812) is suitable, which ensures constituent expression in all tissues of a plant and that described in WO / 9401571 Promoter construct.
  • Another example is the promoters of maize polyubiquitin genes (Christensen et al., Loc. Cit.).
  • promoters can also be used which are only activated at a point in time determined by external influences (see for example WO / 9307279). Promoters of heat-shock proteins that allow simple induction can be of particular interest. It is also possible to use the promoters which lead to expression of downstream sequences in a particular tissue of the plant (see, for example, Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2245-2251), for example the ST-LS1- Promoter that is only active in photosynthetically active tissue (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947).
  • promoters which are active in the starch-storing organs of plants to be transformed.
  • these are the corn kernels, while the potatoes are the tubers.
  • the tuber-specific B33 promoter (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) can, for example, be used in the potato to precess the nucleic acid molecules according to the invention.
  • Seed-specific promoters have already been described for various plant species. For example, the USP promoter from Vicia faba, which ensures seed-specific expression in V. faba and other plants (Fiedler et al., Plant Mol. Biol.
  • promoters of the zein genes ensure specific expression in the endosperm of the maize kernel (Pedersen et al., Cell 29 (1982), 1015-1026; Quattrocchio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93 ).
  • prokaryotic organisms e.g. E. coli are sufficiently described in the literature, as are those for expression in yeast, in particular in Saccharomyces cerevisiae.
  • Termination signals for transcription in plant cells are described and can be interchanged as desired.
  • the termination sequence of the octopine synthase gene from Agro acterium tumefaciens can be used.
  • the invention relates to host cells, in particular prokaryotic or eukaryotic cells, which have been transformed with a nucleic acid molecule or a vector described above, and cells which are derived from such host cells and contain the nucleic acid molecules or vectors described.
  • the host cells can be bacterial (eg E. coli) or fungal cells (eg yeast, in particular S. cerevisiae), as well as plant or animal cells.
  • the term "transformed” means that the cells of the invention are genetically modified with a nucleic acid molecule of the invention insofar as they contain at least one nucleic acid molecule of the invention in addition to their natural genome. This can be freely in the cell, if present as a self-replicating molecule, or it can be stably integrated into the genome of the host cell.
  • the present invention further relates to methods for producing a GDP-mannose pyrophosphorylase, in which host cells according to the invention are cultivated under conditions which allow expression of the protein, and the protein from the culture, i.e. is obtained from the cells and / or the culture medium.
  • the invention also relates to proteins which are encoded by the nucleic acid molecules according to the invention or which are obtainable by a method according to the invention.
  • the present invention further relates to antibodies which specifically recognize a protein according to the invention.
  • These can e.g. be monoclonal or polyclonal antibodies. It can also be fragments of antibodies that recognize proteins according to the invention. Methods for producing such antibodies or fragments are known to the person skilled in the art.
  • the host cells according to the invention are transgenic plant cells which, owing to the presence of an introduced nucleic acid molecule according to the invention, express a GDP-mannose pyrophosphorylase according to the invention.
  • nucleic acid molecules according to the invention By providing the nucleic acid molecules according to the invention, it is now possible to use genetic engineering methods to modify plant cells to the extent that they express a new or an additional plant GDP-mannose pyrophosphorylase.
  • transgenic plant cells differ from untransformed cells in that the nucleic acid molecule introduced is either heterologous to the transformed cell, that is to say from a cell with a different genomic background, or in that the introduced one Nucleic acid molecule, if it is homologous to the transformed plant species, is located in the genome at a location where it is not naturally found in non-transformed cells.
  • the nucleic acid molecule introduced can either be under the control of its natural promoter or linked to regulatory elements of foreign genes.
  • the plant cells according to the invention preferably differ from corresponding non-transformed plant cells in that they have an increased amount of protein according to the invention.
  • This can be determined using detection methods known to the person skilled in the art, e.g. Western blot analysis.
  • An increased amount preferably means an increase of at least 5%, preferably at least 10% and particularly preferably at least 20%.
  • the synthesized protein can be localized in any compartment of the plant cell.
  • the coding region may have to be linked to DNA sequences which ensure localization in the respective compartment. Such sequences are known (see, for example, Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al ., Plant J. 1 (1991), 95-106).
  • the invention further relates to transgenic plants which contain the transgenic plant cells described above.
  • the plant which contains plant cells according to the invention can be any plant. It is preferably a monocot or dicot plant, in particular an agricultural crop, for example a starch-storing plant, such as, for example, cereal plants (rye, barley, oats, wheat, etc.), rice, corn, legumes (for example pea), cassava or potato, or an ornamental plant .
  • Cereal plants are understood in particular as monocotyledonous plants belonging to the Poales order, preferably those belonging to the Poaeeae family. Examples of this are the plants belonging to the genera Avena (oat), Triticum
  • Vicia e.g. Vicia faba
  • Cicer e.g. Cicer arietinum
  • Lens e.g. Lens culinaris
  • Phaseolus vulgaris and Phaseolus coccineus e.g. Phaseolus vulgaris and Phaseolus coccineus
  • the invention furthermore relates to propagation material from transgenic plants according to the invention, for example seeds, fruits, cuttings, tubers, rhizomes, calli, cell cultures etc., this propagation material containing transgenic plant cells described above.
  • the present invention further relates to transgenic plant cells in which the activity of the protein according to the invention is reduced due to the inhibition of the transcription or translation of endogenous nucleic acid molecules which code for such a protein.
  • This can be achieved, for example, by expressing a nucleic acid molecule according to the invention or a part thereof in the corresponding plant cells in an antisense orientation and by reducing the amount of protein according to the invention due to an antisense effect.
  • Another possibility for reducing the amount of the protein according to the invention in plant cells is the expression of suitable ribozymes which specifically cleave transcripts of the DNA molecules according to the invention. It is also possible to express molecules which have both an antisense and a ribozyme effect in combination.
  • the amount of protein according to the invention in the plant cells can also be reduced by a cosupression effect. Such methods are known to the person skilled in the art (see above).
  • the reduction in the activity of the protein according to the invention can be determined as described above.
  • the invention further relates to transgenic plants which contain the transgenic plant cells described above.
  • the invention also relates to propagation material of the transgenic plants described above, for example seeds, fruits, cuttings, tubers, rhizomes, calli, cell cultures, etc., which contains the transgenic plant cells described above.
  • a variety of techniques are available for introducing DNA into a plant host cell. These techniques include the transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacteriu tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as a transformation agent, the fusion of protoplasts, the injection, the electroporation of DNA, the introduction of DNA using the biological method and other possibilities.
  • Another object of the present invention is the use of the nucleic acid molecules according to the invention or parts of these molecules or the reverse complements of these molecules for the identification and isolation of homologous molecules which encode proteins with the enzymatic activity of a GDP-mannose pyrophosphorylase.
  • FIG. 1 shows schematically the plasmid pGMPase.
  • the fine line corresponds to the sequence of pBluescript II SK (-).
  • the strong line represents the cDNA encoding the GDP mannose pyrophosphorylase from Solanum tuberosum. Restriction sites of the insertion are given.
  • the cDNA insert is ligated between the EcoRI and Xhol sites of the polylinker of the plasmid.
  • the DNA sequence of the cDNA insertion is under Seq ID No. 1 specified.
  • Figure 2 shows schematically the plasmid p35S-antiGMPase.
  • A Fragment A: CaMV35S promoter of the cauliflower mosaic virus, 540 bp.
  • C fragment C: ocs terminator of the octopine synthase gene from Agrobacterium turne f ciens.
  • FIG. 3 shows a comparison of the amino acid sequences of GDP-mannose pyrophosphorylases from Saccharomyces cerevisiae (bottom line in each case and Solanum tuberosum (top line in each case).
  • FIG. 4 shows a Northern blot analysis of the expression of the GMPase in tubers of GDP-mannose pyrophosphorylase "antisense" plant (lines 6, 28 and 37) in comparison to corresponding non-transformed wild-type plants (WT).
  • FIG. 5 shows a comparison of 3-month-old transgenic GMPase “antisense” plants (right and middle) and a wild type plant of the same age (left).
  • FIG. 6 shows the appearance of dark spots on the stems and leaves of 3-month-old transgenic GMPase “antisense” plants and the progressive drying of the leaves.
  • 6.5 x 10 phage plaques from a cDNA library were prepared from leaves of potato plants (Koßmann et al., Planta 188 (1992), 7- 12) , screened for fragments contained therein that hybridize specifically with the probe used.
  • the probe was derived from an EST (expressed sequence tag) from Arabidopsis thaliana, the sequence of which has homology to a yeast mannose-1-phosphate guanyl transferase (EC 2.7.7.13) (Gen Bank accession number T 21688).
  • phage plaques were transferred to Hybond N nylon membranes (Amersham, UK) and the DNA was denatured by NaOH treatment, the filters were neutralized and the DNA was fixed on the filters by UV treatment.
  • the filters were prehybridized in 0.25 M NaHP0 4 , pH 7.2, 0.25 M NaCl, 7% SDS, 1 mM EDTA, 25% formamide, 10% PEG for 2 hours at 42 ° C.
  • the filters were then in 0.25 M NaHP0 4 , pH 7.2, 0.25 M NaCl, 7% SDS, 1 mM EDTA, 25% formamide, 10% PEG after addition of the corresponding radioactively labeled probe for 10 h at 42 ° C hybridizes.
  • phage clones were further purified using standard procedures. With the help of the in vivo excision measurement methods were obtained from positive phage clones E. coli clones which contain a double-stranded pBluescript plasmid with the respective cDNA insert. After checking the size and restriction pattern of the inserts, a suitable clone, cGMPase, was further analyzed.
  • the plasmid pGMPase (FIG. 1) was isolated from the clone and its cDNA insertion was determined by standard methods using the dideoxy method (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).
  • the insertion is 1524 kb long and represents a complete cDNA.
  • a part of the nucleotide sequence (1478 bp) is under Seq ID No. 1 specified.
  • the deduced amino acid sequence is in Seq ID No. 2 specified. Sequence comparisons showed that this DNA sequence and the deduced amino acid sequence in different areas showed strong homology to the cDNA from Saccharomyces cerevisiae, which encodes a GDP-mannose pyrophosphorylyase, or to the corresponding amino acid sequence (see FIG. 3).
  • Fragment A (540 bp) contains the 35S promoter from the cauliflower mosaic virus.
  • fragment B contains the protein-coding region of a GDP-mannose pyrophosphorylase from Solanum tuberosum. This was isolated from pGMPase as described above and fused in antisense orientation to the 35S promoter in pBinAR.
  • Fragment C (215 bp) contains the polyadenylation signal of the octopine synthase gene from Ag-robacte ium tumefaciens.
  • the size of the plasmid p35S-antiGMPase is approximately 13.5 kb.
  • the plasmid was transferred into potato plants using Agrobacteria.
  • the leaves for callus induction were then placed on MS medium with 1.6% glucose, 5 mg / 1 naphthylacetic acid, 0.2 mg / 1 benzylaminopurine, 250 mg / 1 claforan, 50 mg / 1 kanamyeine and 0.8% Bacto Agar placed. After incubation for one week at 25 ° C. and 3000 lux, the leaves were induction on MS medium with 1.6% glucose, 1.4 mg / 1 zeatin ribose, 20 ⁇ g / 1 naphthylacetic acid, 20 ⁇ g / 1 giberellic acid, 250 mg / 1 Claforan, 50 mg / 1 kanamyein and 0.8% Bacto Agar. Whole plants were regenerated from the transformed cells.
  • the transgenic potato plants obtained were kept in the greenhouse under the following conditions: light period: 16 h at 25,000 lux and 22 ° C. dark period: 8 h at 15 ° C. atmospheric humidity: 60%.
  • transgenic potato plants showed a decrease in the activity of a GDP-mannose pyrophosphorylase and a decrease in the GDP-mannose pyrophosphorylase RNA (see FIG. 4).
  • RNA was isolated from leaf tissue of plants according to standard protocols. 50 ⁇ g of RNA were separated on an agarose gel (1.5% agarose, 1 ⁇ MEN buffer, 16.6% formaldehyde). After electrophoresis, the RNA was capillary blotted with 20 x SSC onto a nylon membrane Hybond N
  • RNA was fixed on the membrane by UV radiation.
  • the membrane was in phosphate hybridization buffer
  • Transgenic plants showed no differences in their appearance compared to untransformed plants both in sterile culture and up to two months after transfer to greenhouses. After two months, dark spots formed on the stem. Lesions in the form of small black dots were visible on the leaves (FIG. 6).
  • the leaves of the plants started to dry up. First the tip of the terminal pinnate of a leaf was stretched until the whole leaf was brown and dried up to the stem. This ripening of the leaves continued, progressing from bottom to top, until finally all parts of the plant above ground had ripened (FIG. 5).
  • Transgenic GDP-mannose antisense plants do not differ in their tuber yield from untransformed potato plants. Tubers from 15-week-old untransformed potato plants weighed an average of 169.7 g per plant. The yields for three independently transformed lines averaged 168.6 g (line 37), 162.5 g
  • microorganism referred to under I has been received by this international depository on (date of first deposit) and an application for conversion of this first deposit into a deposit under the Budapest Treaty has been received on (date of receipt of the application for conversion)

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Abstract

Beschrieben werden transgene Pflanzen, insbesondere Kartoffelpflanzen, deren oberirdische Teile früher und schneller reifen als bei Wildtyp-Pflanzen und vollständig absterben, ohne dass dies den Ertrag unterirdischer Pflanzenteile beeinflusst. Diese Pflanzen sind gekennzeichnet durch eine Verringerung der Aktivität der GDP-Mannose Pyrophosphorylase in den Zellen. Beschrieben werden ferner Verfahren zur Herstellung solcher Pflanzen, sowie Nucleinsäuremoleküle, die pflanzliche GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren.

Description

Transgene Pflanzen, deren oberirdische Teile früher reifen und vollständig absterben
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Pflanzen, deren oberirdische Teile früher und schneller reifen als bei Wildtyp-Pflanzen und vollständig absterben, ohne daß dies den Ertrag unterirdischer Pflanzenteile beeinflußt. Die Pflanzen sind gekennzeichnet durch eine Verringerung der Aktivität der GDP-Mannose Pyrophosphorylase in den Zellen. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung von Nucleinsäure olekü- len, die eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren, oder von Fragmenten solcher Moleküle zur Herstellung von Pflanzen mit einer verringerten Aktivität dieses Enzyms. Ebenso betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die pflanzliche Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren.
In der Produktionstechnik beim Anbau vieler landwirtschaftlicher Kulturen werden durch den Einsatz von Herbiziden gezielt oberirdische vegetative Pflanzenteile abgetötet, um eine gleichmäßige Abreife, d.h. das Reifen und .Absterben, oberirdischer Pflanzenteile zu erreichen. Dies ermöglicht eine leichtere Ernte der wertgebenden Organe oder Pflanzenteile und gewährleistet eine bessere Pflanzenhygiene. So werden insbesondere beim .Anbau von Baumwolle und der Kartoffel die Pflanzen vor der Abreife mit Herbiziden behandelt. Bei der Baumwolle wird dadurch bewirkt, daß die Blätter abfallen und somit die maschinelle Ernte der Fasern er- leichtert wird. Bei der Kartoffel wird das Abtöten des Krautes aus einer Vielzahl von Gründen durchgeführt: Das .Abtöten des Krauts bewirkt eine Verminderung der Kraut - masse und verursacht so ein besseres Abtrocknen der Dämme. Dies bewirkt eine Zunahme der Schalenfestigkeit und vermindert so die bei der Ernte verursachten Beschädigungen der Kartoffelknollen und somit das Auftreten von Lagerfäulen. Weiterhin sind die Verschmutzungen der geernteten Knollen durch die bessere Trocknung geringer. Außerdem erlaubt das Abtöten des Krauts eine höhere Fahrgeschwindigkeit beim Roden und somit eine höhere Flächenleistung. Die Trennung von Knolle und Kraut erfolgt effektiver, wodurch eventuelle Ernteverluste verringert werden. Die phytosanitären Aspekte des Krautabtötens liegen in einer Verminderung der Knolleninfektion mit Phytophthora und einer Vielzahl von Kartoffelviren. Insbesondere beim Anbau bei spätreifenden Wirtschaftsorten wird durch das Krautabtöten eine Ernte erst ermöglicht. Das Abtöten und Entfernen des Kartoffelkrauts mit Herbiziden wird in der Regel unterstützt durch den Einsatz eines Krautschlägers, oder ausschließlich damit durchgeführt. Diese Verfahren sind arbeits- und kostenintensiv und würden sich im Falle eines termingerechten vollständigen Abreifens des Krauts erübrigen.
Im Hinblick auf die zunehmende Bedeutung, die der Verminderung des Einsatzes von Herbiziden in der Landwirtschaft in letzter Zeit beigemessen wird, ist es eine der Aufgaben der biotechnologischen Forschung, sich um eine Anpassung der Pflanzen an die Anforderungen der .Anbautechnik zu bemühen, so daß gegebenenfalls auf den Einsatz von Herbiziden verzichtet werden kann.
Es erscheint daher wünschenswert, Pflanzen zur Verfügung zu stellen, die bei voller Ertragsleistung termingerecht und vollständig abreifen, um so den Einsatz chemischer oder mechanischer Verfahren zum Abtöten des Kartoffelkrauts minimieren zu können oder gegebenenfalls vollständig darauf verzichten zu können. Der vorliegenden .Anmeldung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Pflanzen zur Verfügung zu stellen, deren oberirdische Teile früher und schneller als bei entsprechenden Wildtyp-Pflanzen reifen und vollständig absterben ohne eine Ertragsminderung anderer, insbesondere unterirdischer, Pflanzenteile aufzuweisen.
Diese Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die vorliegende Anmeldung transgene Pflanzen enthaltend Pflanzenzellen, die genetisch modifiziert sind, wobei die genetische Modifikation zur Verringerung der Aktivität einer endogenen in der Pflanzenzelle vorkommenden GDP- Mannose Pyrophosphorylase (EC 2.7.7.22) führt im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Zellen solcher Pflanzen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei die GDP-Mannose Pyrophosphorylase, deren Aktivität reduziert wird, ein pflanzliches Protein, das codiert wird von einem Nucleinsäu- remolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
(a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter Seq ID No. 2 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt;
(b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No. 1 ange¬ gebene codierende Region umfassen;
(c) Nucleinsäuremoleküle, die ein Protein codieren, das die Aminosäuresequenz umfaßt, die von der Insertion in dem Plasmid pGMPase (DSM 11746) codiert wird;
(d) Nucleinsäuremoleküle, die die codierende Region umfas¬ sen, die in der Insertion des Plasmids pGMPase (DSM 11746) enthalten ist;
(e) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem Strang eines Nucleinsäuremoleküls nach (a) , (b) , (c) und/oder (d) hy¬ bridisieren; und (f) Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (e) abweicht.
Für die Definition des Begriffs "Hybridisierung" wird dabei auf weiter unten verwiesen.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß bei Kartoffelpflanzen, bei denen die Expression und somit die Aktivität der GDP-Mannose Pyrophosphorylase aufgrund der Expression einer entsprechenden antisense-RNA verringert ist, die oberirdischen Teile (das Kraut) wesentlich schneller abreifen als bei entsprechenden nicht modifizierten Wildtyp- Pflanzen. Ferner reifen sie in relativ kurzer Zeit vollständig ab. Dadurch wird jedoch der Knollenertrag der Pflanzen nicht wesentlich beeinträchtigt.
Der Begriff "entsprechende Wildtyp-Pflanzen" bedeutet dabei, daß es sich um Pflanzen handelt, die als Ausgangsmaterial für die Herstellung der erfindungsgemäßen Pflanzen dienten, d.h. deren genetische Information abgesehen von der eingeführten genetischen Modifikation der einer erfindungsgemäßen Pflanze entspricht.
Der Begriff "Abreifen" bedeutet dabei das Reifen und Absterben der oberirdischen Teile der Pflanzen. Vorzugsweise bedeutet dabei Reifen und Absterben das Auftreten dunkler Flecken zuerst an Stengeln, das Auftreten von Läsionen an Blättern in Form kleiner schwarzer Punkte, sowie das Vertrocknen der Blätter. Bevorzugt vertrocknet das Blatt dabei von der Spitze her fortschreitend bis zum Stengel. Darüber hinaus vertrocknen vorzugsweise die Blätter der Pflanze zuerst, die unten am Stengel ansetzen, und das Vertrocknen der Blätter setzt sich an der Pflanze fortschreitend, von unten nach oben fort, bis schließlich alle oberirdischen Pflanzenteile abgereift sind.
Daß die genetisch modifizierten Pflanzen schneller abreifen bedeutet dabei, daß zum einen das Absterben der oberirdischen Teile, insbesondere der Blätter, Stengel und gegebenenfalls Früchte früher einsetzt als bei entsprechenden Wildtyp-Pflanzen und/oder daß der gesamte Prozeß des Abrei- fens wesentlich schneller verläuft als bei entsprechenden Wildtyp-Pflanzen und früher abgeschlossen ist. Daß der Prozeß "früher" einsetzt bedeutet dabei vorzugsweise, daß das Reifen und Absterben der oberirdischen Teile mindestens eine Woche, bevorzugt mindestens 2 bis 3 Wochen und besonders bevorzugt ca. 4 Wochen früher einsetzt als bei entsprechenden Wildtyp-P lanzen.
Daß der Prozeß des Abreifens "schneller" erfolgt bedeutet dabei vorzugsweise, daß der Prozeß des Reifens und Abster- bens der oberirdischen Teile der Pflanzen insgesamt schneller verläuft als bei entsprechenden Wildtyp-Pflanzen, bevorzugt um mindestens eine Woche schneller und besonders bevorzugt um mindestens zwei Wochen schneller.
Daß der Prozeß des Reifens und Absterbens früher abgeschlossen ist, bedeutet dabei, daß die oberirdischen Teile der er- findungsgemäßen Pflanzen vorzugsweise mindestens 1 bis 4 Wochen, bevorzugt mindestens 2 bis 4 Wochen und besonders bevorzugt mindestens 3 bis 4 Wochen früher abgestorben sind als die oberirdischen Teile entsprechender Wildtyp-Pflanzen. Daß der Prozeß des Reifens früher abgeschlossen ist, bedeutet ferner vorzugsweise, daß die oberirdischen Teile der erfindungsgemäßen Pflanzen bereits vollständig abgestorben sind, bevor bei den oberirdischen Teilen entsprechender Wildtyp-Pflanzen der Prozeß des Reifens begonnen hat. Insbesondere sterben die oberirdischen Teile erfindungsgemäßer Pflanzen ca. 4 Wochen früher als die von entsprechenden Wildtyp-Pflanzen ab, wenn die Pflanzen unter folgenden Bedingungen gehalten werden: in 16er-Töpfen mit Topferde (Pikiererde) /Sand-Mischung 3:1; Luftfeuchtigkeit 60 % ; Temperatur 22°C tags/15°C nachts; 16 h Licht/ 8 h Dunkel-Rhythmus,; Lichtintensität ca. 150 μE .
Daß die erfindungsgemäßen Pflanzen vollständig abreifen bedeutet, daß alle oberirdischen Teile der Pflanze absterben, insbesondere, daß diese Teile komplett absterben. Derartige erfindungsgemäße Pflanzen haben beispielsweise den Vorteil, daß vollständig auf den Einsatz von Herbiziden ver- ziehtet werden kann, um eine gleichmäßige .Abreife der oberirdischen Pflanzenteile zu erreichen. Im Zusammenhang beispielsweise mit an sich spätreifenden Kartoffelpflanzen besteht nun die Möglichkeit, diese derart zu verändern, daß ihr Kraut früher und vollständig reift und abstirbt. Weiterhin ergibt sich generell ein Vorteil daraus, daß das Kraut der erfindungsgemäßen Pflanzen vollständig abstirbt. Selbst bei den bisher in der Landwirtschaft verwendeten früher reifenden Kartoffelpflanzen besteht das Problem, daß das Kraut nie komplett abstirbt und somit in jedem Fall der Einsatz von Herbiziden und Krautschlägern erforderlich ist. Durch den .Anbau von Pflanzen, bei denen das Kraut vollständig abstirbt, könnte auf den Einsatz dieser Maßnahmen vollkommen verzichtet werden.
Der Begriff "transgen" bedeutet, daß Zellen der erfindungsgemäßen Pflanzen in ihrem Genom eine fremde DNA-Sequenz enthalten, die in entsprechenden nicht -genetisch modifizierten Zellen entsprechender Wildtyp-Pflanzen nicht vorkommt. "Fremde DNA-Sequenz" bedeutet dabei eine DNA-Sequenz, die entweder natürlicherweise gar nicht in den entsprechenden pflanzlichen Zellen nicht vorkommt, d.h. die heterolog zu den Zellen ist, die in der konkreten räumlichen Anordnung so nicht natürlicherweise in den Pflanzenzellen vorkommt oder die an einem Ort im Genom der Pflanzenzelle lokalisiert ist, an dem sie natürlicherweise nicht vorkommt. Bevorzugt ist die fremde DNA-Sequenz ein rekombinantes Molekül, das aus verschiedenen Elementen besteht, dessen Kombination oder spezifische räumliche Anordnung natürlicherweise in pflanzlichen Zellen nicht auftritt.
Das Vorhandensein, die Lokalisation sowie die räumliche Anordnung der fremden DNA-Sequenz im Genom der Zellen erfin- dungsgemäßer Pflanzen läßt sich beispielsweise durch Southern-Blot-Analyse nachweisen. Der Begriff "genetisch modifiziert" bedeutet, daß die Pflanzenzelle durch Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküle in ihrer genetischen Information verändert ist und daß das Vorhandensein oder die Expression des fremden Nucleinsäure- moleküls zu einer phänotypischen Veränderung führt. Phänoty- pische Veränderung bedeutet dabei vorzugsweise eine meßbare Veränderung einer oder mehrerer Funktionen der Zellen. Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen der erfindungsgemäßen Pflanzen zeigen aufgrund des Vorhandenseins oder bei Expression des eingeführten fremden Nucleinsäuremoleküls eine Verringerung der Aktivität einer endogen in der Pflanze vorkommenden GDP-Mannose Phosphorylase . Das Enzym GDP-Mannose Pyrophosphorylase (EC 2.7.7.22) katalysiert die Umwandlung von GTP und Mannose- 1-Phosphat zu GDP-Mannose und Pyrophosphat . Der Begriff "Verringerung der Aktivität" bedeutet dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verringerung der Expression endogener Gene, die eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren, eine Verringerung der Menge an GDP-Mannose Pyrophosphorylase in den Zellen und/oder eine Verringerung der enzymatischen Aktivität der GDP-Mannose Pyrophosphorylase in den Zellen.
Die Verringerung der Expression kann beispielsweise bestimmt werden durch Messung der Menge an GDP-Mannose Pyrophosphorylase codierenden Transkripten, z.B. durch Northern-Blot- .Analyse. Eine "Verringerung" bedeutet dabei vorzugsweise eine Verringerung der Menge an Transkripten im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Zellen um mindestens 10 %, bevorzugt um mindestens 30 %, insbesondere um mindestens 50 %, besonders bevorzugt um mindestens 70 % und insbesondere um mindestens 90 %.
Die Verringerung der Menge an GDP-Mannose Pyrophosphorylase kann beispielsweise bestimmt werden durch Western-Blot-.Ana- lyse . Eine "Verringerung" bedeutet dabei vorzugsweise eine Verringerung der Menge an GDP-Mannose Pyrophosphorylase-Pro- tein im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Zellen um mindestens 10 %, bevorzugt um mindestens 30 %, insbesondere um mindestens 50 %, besonders bevorzugt um mindestens 70 % und insbesondere um mindestens 90 %. Die Verringerung der enzymatischen Aktivität kann beispielsweise bestimmt werden durch die Umwandlung von GTP und Man- nose-1-Phosphat zu GDP-Mannose und Pyrophosphat . Die Aktivität der GDP-Mannose Pyrophosphorylase läßt sich beispielsweise bestimmen wie beschrieben in Asua et al . (Biochim. Biophys . Acta 128 (1966), 582-585) oder in Szumilo et al. (J. Biol. Chem. 268 (1993), 17943-17950). Eine "Verringerung" der enzymatischen Aktivität bedeutet dabei vorzugsweise eine Verringerung im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Zellen um mindestens 10 %, bevorzugt um mindestens 30 %, insbesondere um mindestens 50 %, besonders bevorzugt um mindestens 70 % und insbesondere um mindestens 90 %.
Die genetische Modifikation mittels eines fremden Nuclein- säuremoleküls, das in die Zellen der erfindungsgemäßen Pflanzen eingeführt wurde und dessen Vorhandensein oder Expression zur Verringerung der GDP-Mannose Pyrophosphorylase- Aktivität führt, kann unterschiedlicher Natur sein. Zum einen kann die genetische Modifikation darin bestehen, daß ein endogen in der Pflanzenzelle vorliegendes Gen, das eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase codiert, durch Einführen eines fremden Nucleinsäuremoleküls derart verändert wird, daß seine Expression verringert oder vollständig unterdrückt ist. Eine Verringerung bedeutet dabei vorzugsweise eine Verringerung der Transkription um mindestens 10 %, bevorzugt um mindestens 30 %, insbesondere um mindestens 50 %, besonders bevorzugt um mindestens 70 %, insbesondere mindestens 90 % im Vergleich zu nicht genetisch modifizierten Zellen. Dies kann z.B. über Northern-Blot-.Analyse bestimmt werden. Diese Verringerung der Transkription bewirkt vorzugsweise eine entsprechende Verringerung der Aktivität der GDP-Mannose Pyrophosphorylase. Eine derartige genetische Modifikation kann beispielsweise in einer Insertion oder Deletion im codieren- den Bereich oder in der Promotorregion eines GDP-Mannose Pyrophosphorylase-Gens bestehen.
Ferner kann die genetische Modifikation die Synthese einer GDP-Mannose Pyrophosphorylase hervorrufen, die keine enzy a- tische Aktivität mehr aufweist. Dies kann z.B. auf Mutationen in der codierenden Region des Gens beruhen, die zu einem Verlust der enzymatischen Aktivität führen oder zu einem fehlerhaften Splicing der mRNA.
Verfahren, um genetische Modifikationen in Gene oder deren regulatorische Bereiche einzuführen, die zur Verringerung oder zum Verlust der Expression des Gens führen, sind dem Fachmann bekannt. Dazu gehören z.B. Transposon-Mutagenese oder gene-tagging .
Denkbar ist ferner die Einführung eines fremden Nucleinsäu- remoleküls, das einen Inhibitor der GDP-Mannose Pyrophosphorylase codiert, z.B. einen .Antikörper, dessen Bindung an das Enzym zur Inhibierung der enzymatischen Aktivität führt. Vorzugsweise besteht die genetische Modifikation in der Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls in das Genom der Pflanzenzelle, dessen Expression zur Inhibierung der Expression endogener Gene führt, die eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren, insbesondere auf der Transkriptions- oder auf der Translationsebene.
Bevorzugt sind hierbei Nucleinsäuremoleküle, die eine geeignete antisense-RNA, ein geeignetes Ribozym oder eine geeignete Cosuppressions-RNA codieren.
Bei einem antisense-Effekt wird eine entsprechende DNA-Sequenz in antisense-Orientierung exprimiert, so daß in den Zellen eine antisense-RNA synthetisiert wird, die zu Transkripten von GDP-Mannose Pyrophosphorylase Genen oder zu Teilen solcher Transkripte homolog ist. Diese hat vorzugsweise eine Länge von mindestens 30 Nucleotiden, bevorzugt von mindestens 50 Nucleotiden und besonders bevorzugt von mindestens 100 Nucleotiden. Die exprimierte antisense-RNA sollte eine hohe Homologie zu den endogen in der Pflanze exprimier- ten Transkripten, die GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren, haben. Die Homologie beträgt vorzugsweise mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 95 % und besonders bevorzugt mindestens 99 %. Bei einem Ribozym-Effekt wird eine RNA expri- miert, die spezifisch Transkripte einer GDP-Mannose Pyro- phosphorylase-Gens spalten kann. Die Expression von Ribozy- men zur Verringerung der Aktivität von bestimmten Enzymen in Zellen ist dem Fachmann ebenfalls bekannt und ist beispielsweise beschrieben in EP-Bl 0 321 201. Die Expression von Ri- bozymen in pflanzlichen Zellen wurde z.B. beschrieben in Feyter et al . (Mol. Gen. Genet . 250 (1996), 329-338). Der Cosuppressions-Effekt beruht auf der Expression einer sense- RNA, die die Expression von endogener GDP-Mannose Pyrophosphorylase- RNA unterdrückt. Die Ausführung dieser Techniken sind dem Fachmann bekannt. Das Verfahren der Cosuppression ist beispielsweise beschrieben in Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344), Niebel et al . (Curr. Top. Microbiol. Immunol . 197 (1995), 91-103), Flavell et al . (Curr. Top Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43-46), Palaqui und Vaucheret (Plant Mol. Biol . 29 (1995), 149-159), Vaucheret et al . (Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 311-317), de Borne et al . (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 613-621) und anderen Quellen,
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Verringerung der Aktivität einer GDP-Mannose Phosphorylase in den Zellen dadurch erreicht, daß das fremde Nucleinsäuremolekül folgende Elemente umfaßt :
(a) einen Promotor, der die Transkription in pflanzlichen Zellen ermöglicht; und
(b) eine in antisense-Orientierung mit diesem Promotor verknüpfte DNA-Sequenz, deren Transkripte ganz oder teilweise komplementär sind zu Transkripten eines endogen in Pflanzenzellen vorliegenden Gens, das eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase codiert. Promotoren, die die Expression in pflanzlichen Zellen gewährleisten sind in großem Umfang beschrieben. Für eine kon- stitutive Expression eignet sich z.B. der 35S-Promotor des CaMV (Franck et al . , Cell 21 (1980), 285-292) oder die Promotoren der Polyubiquitingene (Christensen et al . , Plant Mol. Biol. 18 (1992), 675-689). Für eine Expression in photosynthetisch aktivem Gewebe eignet sich z.B. der ST-LS1- Promotor (Stockhaus et al . , EMBO J. 8 (1989), 2245-2251; Stockhaus et al . , Proc . Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987), 7943-7947) .
Nucleinsäuremoleküle, die pflanzliche GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren, werden durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt. Die in Seq ID No . 1 dargestellte Nucleinsäuresequenz codiert eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase aus Kartoffel. Mit Hilfe dieser Sequenz ist es dem Fachmann möglich, mittels gängiger molekularbiologischer Methoden entsprechende Sequenzen aus anderen Pflanzen bzw. Pflanzenspezies zu isolieren (siehe unten) .
In einer bevorzugten Ausführungsform werden für die Expression einer antisense-RNA die weiter unten beschriebenen erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle aus Kartoffel oder Teile davon verwendet.
In der Regel weisen alle Zellen oder im wesentlichen alle Zellen der erfindungsgemäßen Pflanzen die genetische Modifikation auf. Dagegen ist es nicht unbedingt erforderlich, daß alle Zellen eine Verringerung der Aktivität der GDP-Mannose Pyrophosphorylase aufweisen. In einer ersten Ausführungsform ist vorgesehen, daß alle bzw. im wesentlichen alle Zellen der Pflanze eine verringerte GDP-Mannose Pyrophosphorylase- Aktivität aufweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen nur Zellen oberirdischer Pflanzenteile, vorzugsweise nur Zellen in den Blättern oder nur Zellen in den Blättern und Stengeln eine verringerte GDP-Mannose Pyrophosphorylase-Aktivität auf aufgrund der Expression des fremden Nucleinsäuremoleküls . Bei den erfindungsgemäßen Pflanzen kann es sich im Prinzip um eine Pflanze jeder beliebigen Pfianzenspezies handeln, d.h. sowohl um monokotyle als auch um dikotyle Pflanzen. Vorzugsweise handelt es sich um eine landwirtschaftliche Nutzpflanze, besonders bevorzugt um Baumwolle oder Kartoffel und insbesondere um spätreifende Kartoffelpflanzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch transgene Pflanzenzellen, die durch die Einführung eines fremden Nucleinsäure- moleküls genetisch modifiziert sind, wobei das Vorhandensein oder die Expression dieses Nucleinsäuremoleküls die Verringerung der Aktivität einer endogen in der Pflanzenzelle vorkommenden GDP-Mannose Pyrophosphorylase bewirkt.
Hinsichtlich der genetischen Modifikation der Zellen trifft das bereits oben im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Pflanzen Gesagte zu.
Derartige erfindungsgemäße Pflanzenzellen können zur Regeneration ganzer Pflanzen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus auch ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, deren oberirdische Teile früher und schneller reifen als bei entsprechenden Wildtyp-Pflanzen und vollständig absterben, wobei
(a) eine pflanzliche Zelle genetisch modifiziert wird durch die Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls und die genetische Modifikation zur Verringerung der Aktivität einer endogen in pflanzlichen Zellen vorkommenden GDP-Mannose Pyrophosphorylase führt; und
(b) aus der Zelle eine Pflanze regeneriert wird; und gegebenenfalls
(c) aus der Pflanze nach (b) weitere Pflanzen erzeugt werden. Für die laut Schritt (a) in die Pflanzenzelle eingeführte Modifikation gilt dasselbe, was bereits oben im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Pflanzen erläutert wurde. Die Regeneration der Pflanzen gemäß Schritt (b) kann nach dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.
Die Erzeugung weiterer Pflanzen gemäß Schritt (c) des Verfahrens kann z.B. erfolgen durch vegetative Vermehrung (beispielsweise über Stecklinge, Knollen oder über Calluskultur und Regeneration ganzer Pflanzen) oder durch sexuelle Vermehrung. Die sexuelle Vermehrung findet dabei vorzugsweise kontrolliert statt, d.h. es werden ausgewählte Pflanzen mit bestimmten Eigenscha ten miteinander gekreuzt und vermehrt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Erzeugung transgener Kartoffelpflanzen verwendet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ermöglicht das eingeführte fremde Nucleinsäuremolekül die Synthese einer antisense-RNA, die zu Transkripten von GDP-Mannose Pyrophosphorylase-Genen komplementär ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlichen Pflanzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vermehrungsmaterial erfindungsgemäßer Pflanzen sowie der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten transgenen Pflanzen, das erfindungsgemäße genetisch modifizierte Zellen enthält. Der Begriff Vermehrungsmaterial umfaßt dabei jene Bestandteile der Pflanze, die geeignet sind zur Erzeugung von Nachkommen auf vegetativem oder sexuellem Weg. Für die vegetative Vermehrung eignen sich beispielsweise Stecklinge, Calluskul- turen, Rhizome oder Knollen. Anderes Vermehrungsmaterial umfaßt beispielsweise Früchte oder Samen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Vermehrungsmaterial um Samen und besonders bevorzugt um Knollen. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von Nucleinsäuremolekülen, die eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren, von deren Komplementen oder von Teilen solcher Moleküle zur Verringerung der GDP-Mannose Pyrophospho- rylase-Aktivität in pflanzlichen Zellen, zur Erzeugung von Pflanzenzellen mit einer verringerten Aktivität der GDP-Mannose Pyrophosphorylase, zur Erzeugung von Pflanzen, enthaltend solche Pflanzenzellen und/oder zur Erzeugung von trans- genen Pflanzen, deren oberirdische Teile schneller reifen und absterben als bei entsprechenden Wildtyp-Pflanzen und die vollständig absterben. Bei den Nucleinsäuremolekülen handelt es sich vorzugsweise um die im folgenden beschriebenen erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen.
Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren Nucleinsäuremoleküle, die ein pflanzliches Protein codieren, dessen reife Form die enzymatische Aktivität einer GDP-Mannose Pyrophosphorylase aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus :
(a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter Seq ID No . 2 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt ;
(b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No. 1 angegebene codierende Region umfassen;
(c) Nucleinsäuremoleküle, die ein Protein codieren, das die Aminosäuresequenz umfaßt, die von der Insertion in dem Plasmid pGMPase (DSM 11746) codiert wird;
(d) Nucleinsäuremoleküle, die die codierende Region umfassen, die in der Insertion des Plasmids pGMPase (DSM 11746) enthalten ist;
(e) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem Strang eines Nucleinsäuremoleküls nach (a) , (b) , (c) und/oder (d) hybridisieren; und
(f) Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz aufgrund der Dege¬ neration des genetischen Codes von der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (e) abweicht. Die Erfindung betrifft auch die jeweils komplementären Stränge der oben beschriebenen Moleküle .
Die in Seq ID No. 1 dargestellte Nucleinsäuresequenz ist eine vollständige cDNA, die eine GDP-Mannose-Pyrophospho- rylase aus Kartoffel { Solanum tuberosum) codiert. Ein Plas- mid enthaltend diese cDNA wurde hinterlegt als DSM 11746. Mit Hilfe dieser Sequenz bzw. dieses Moleküls ist es dem Fachmann nun möglich, homologe Sequenzen aus anderen Pflanzen und Pflanzenarten zu isolieren. Dies kann beispielsweise mit Hilfe konventioneller Methoden, wie dem Durchmustern von cDNA oder genomischen Banken mit geeigneten Hybridisierungs- proben erfolgen. Auf diese Weise ist es beispielsweise möglich, Nucleinsäuremoleküle zu identifizieren und isolieren, die mit der unter Seq ID No . 1 angegebenen Sequenz hybridisieren und die eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können prinzipiell eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase aus jedem beliebigen pflanzlichen Organismus codieren, vorzugsweise eine aus einer höheren Pflanze, insbesondere einer monokotylen oder einer dikotylen Pflanze. Besonders bevorzugt codiert das Nucleinsäuremolekül ein Protein aus einer landwirtschaftlichen Nutzpflanze, insbesondere aus einer Getreidepflanze (z.B. Gerste, Roggen, Hafer, Weizen etc.), oder aus Mais, Reis, Erbse, Lein usw.. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform codiert das Nucleinsäuremolekül ein Protein aus Kartoffel oder Baumwolle.
Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrock et al . , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben sind. Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, können prinzipiell aus jeder beliebigen Pflanze stammen, die entsprechende Proteine exprimiert . Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Molekülen hybridisieren, können z.B. aus genomischen oder aus cDNA-Bibliotheken isoliert werden. Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nucleinsäuremoleküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, z.B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z.B. Sambrook et al . , 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) oder durch Amplifikation mittels PCR. Als Hybridisierungsprobe können z.B. Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die unter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz oder Teile dieser Sequenz aufweisen. Bei den als Hybridisierungsprobe verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls übereinstimmt. Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, sollte eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz codierten Proteine erfolgen, um festzustellen, ob es sich um eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase handelt. Hierzu eignen sich insbesondere Homologievergleiche auf der Ebene der Nucleinsäure- oder Aminosäure- sequenz sowie die Bestimmung der enzymatischen Aktivität. Die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisierenden Moleküle umfassen insbesondere Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle, die ein pflanzliches Protein codieren mit der Aktivität einer GDP-Mannose Pyrophosphorylase. Der Ausdruck Derivat bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenz - identität über die gesamte Länge von mindestens 60 %, insbesondere eine Identität von mindestens 70 %, vorzugsweise über 80 %, besonders bevorzugt über 90 % und insbesondere von mindestens 95 %. Die Abweichungen zu den oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen können dabei z.B. durch Dele- tion, Addition, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.
Homologie bedeutet ferner, daß funktionelle und/oder strukturelle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nucleinsäuremolekülen oder den durch sie codierten Proteinen, besteht. Bei den Nucleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben beschriebenen Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Moleküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Pflanzen, insbesondere anderen Getreidepflanzen oder -sorten, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA- Techniken erzeugte Varianten.
Die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine weisen bestimmte gemeinsame Charakteristika auf. Dazu können z.B. biologische Aktivität, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konformation etc. gehören, sowie physikalische Eigenschaften wie z.B. das Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromato- graphisches Verhalten, Sedimentationskoeffizienten, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität; pH-Optimum, Temperatur-Optimum etc. Wichtige Charakteristika einer GDP-Mannose Pyrophosphorylase sind (i) ihre Lokalisation im Cytosol pflanzlicher Zellen, (ii) ihre Fähigkeit zur Synthese von GDP-Mannose unter Verwendung von GTP und Mannose-1-Phosphat als Substrat. Diese Aktivität kann beispielsweise bestimmt werden nach den in Asua et al . (a.a.O.) oder in Szumilo et al . (a.a.O.) beschriebenen Methoden.
Das von der Aminosäuresequenz abgeleitete Molekulargewicht der GDP-Mannose Pyrophosphorylase aus Kartoffel beträgt 39.578 Dalton. Das abgeleitete Molekulargewicht eines erfindungsgemäßen Proteins liegt daher vorzugsweise im Bereich von 35 kDa bis 45 kDa, bevorzugt im Bereich von 38 kDa bis 42 kDa und besonders bevorzugt bei ca. 40 kDa. Der errechnete isoelektrische Punkt des Proteins aus Kartoffel liegt bei 7.21.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können beliebige Nucleinsäuremoleküle sein, insbesondere DNA- oder RNA-Mole- küle, beispielsweise cDNA, genomische DNA, mRNA etc. Sie können natürlich vorkommende Moleküle sein, oder durch gentechnische oder chemische Syntheseverfahren hergestellte Moleküle. Sie können einzelsträngige Moleküle sein, die entweder den codierenden oder den nicht codierenden Strang enthalten, oder doppelsträngige Moleküle.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremoleküle von mindestens 15, vorzugsweise mehr als 50 und besonders bevorzugt mehr als 200 Nucleotiden Länge, die spezifisch mit mindestens einem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül hybridisieren. Spezifisch hybridisieren bedeutet hierbei, daß diese Moleküle mit Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, die ein erfindungsgemäßes Protein codieren, jedoch nicht mit Nucleinsäuremolekülen, die andere Proteine codieren. Hybridisieren bedeutet dabei vorzugsweise Hybridisieren unter stringenten Bedingungen (s.o.). Insbesondere betrifft die Erfindung solche Nucleinsäuremoleküle, die mit Transkripten von erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridi- sieren und dadurch deren Translation verhindern können. Solche Nucleinsäuremoleküle, die spezifisch mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, können beispielsweise Bestandteile von antisense-Konstrukten oder Ri- bozymen sein oder können als Primer für die Amplifikation mittels PCR verwendet werden.
Weiterhin betrifft die Erfindung Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vektoren enthaltenen Nucleinsäuremoleküle in sense Orientierung verknüpft mit regulatorischen Elementen, die die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen gewährleisten. Der Begriff "Expression" kann dabei Transkription als auch Transkription und Translation bedeuten.
Die Expression der er indungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in prokaryontischen Zellen, beispielsweise in Escherichia coli , ermöglicht beispielsweise eine genauere Charakterisierung der enzymatischen Aktivitäten der codierten Proteine. Darüber hinaus ist es möglich, mittels gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe z.B. Sambrook et al . , a.a.O.) verschiedenartige Mutationen in die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle einzuführen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biologischen Eigenschaften kommt. Möglich ist die Erzeugung von Deletionsmu- tanten, bei denen durch fortschreitende Deletionen vom 5'- oder vom 3 ' -Ende der codierenden DNA-Sequenz Nucleinsäuremoleküle erzeugt werden, die zur Synthese entsprechend verkürzter Proteine führen. Möglich ist auch die Einführung von Punktmutationen an Positionen, die einen Einfluß beispielsweise auf die Enzymaktivität oder die Regulierung des Enzyms haben. Auf diese Weise können z.B. Mutanten hergestellt werden, die einen veränderten ^-Wert besitzen oder nicht mehr den normalerweise in der Zelle vorliegenden Regulationsmechanismen über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen. Des weiteren können Mutanten hergestellt werden, die eine veränderte Substrat- oder Pro- duktspezifität aufweisen. Weiterhin können Mutanten hergestellt werden, die ein verändertes Aktivitäts-Temperatur- Profil aufweisen. Die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können nach dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen (vgl. Sambrook et al., a.a.O.) .
Für die Expression eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls in pflanzlichen Zellen stehen eine Vielzahl von Promotoren zur Verfügung. Im Prinzip kann jeder in den für die Transformation gewählten Pflanzen funktionale Promotor verwendet werden. Der Promotor kann homolog oder heterolog in bezug auf die verwendete Pflanzenspezies sein. Geeignet ist beispielsweise der 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (Odell et al . , Nature 313 (1985), 810-812), der eine konsti- tutive Expression in allen Geweben einer Pflanze gewährleistet und das in der WO/9401571 beschriebene Promo- torkonstrukt . Ein anderes Beispiel sind die Promotoren der Polyubiquitingene aus Mais (Christensen et al . , a.a.O.) . Es können jedoch auch Promotoren verwendet werden, die nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt aktiviert werden (siehe beispielsweise WO/9307279) . Von besonderem Interesse können hierbei Promotoren von heat-shock- Proteinen sein, die eine einfache Induktion erlauben. Ferner können die Promotoren verwendet werden, die in einem bestimmten Gewebe der Pflanze zu einer Expression nachgeschalteter Sequenzen führen (siehe z. B. Stockhaus et al . , EMBO J. 8 (1989) , 2245-2251) , beispielsweise der ST-LSl-Pro- motor, der lediglich in photosynthetisch aktivem Gewebe aktiv ist (Stockhaus et al . , Proc . Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) , 7943-7947) . Zu erwähnen sind ferner Promotoren, die in den stärkespeichernden Organen von zu transformierenden Pflanzen aktiv sind. Dies sind z.B. bei Mais die Maiskörner, während es bei der Kartoffel die Knollen sind. Zur Überex- pression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in der Kartoffel kann beispielsweise der knollenspezifische B33- Promotor (Rocha-Sosa et al . , EMBO J. 8 (1989), 23-29) verwendet werden. Samenspezifische Promotoren sind bereits für verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden. So z.B. der USP-Promotor aus Vicia faba, der eine samenspezifische Expression in V. faba und anderen Pflanzen gewährleistet (Fiedler et al . , Plant Mol. Biol . 22 (1993), 669-679; Bäumlein et al . , Mol Gen. Genet. 225 (1991), 459-467). In Mais gewährleisten beispielsweise Promotoren der Zein-Gene eine spezifische Expression im Endosperm der Maiskörner (Pedersen et al . , Cell 29 (1982), 1015-1026; Quattrocchio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93).
Regulatorische Sequenzen zur Expression in prokaryontischen Organismen, z.B. E. coli, sind ausreichend in der Literatur beschrieben, ebenso wie solche zur Expression in Hefe, insbesondere in Saccharomyces cerevisiae.
Terminationssignale für die Transkription in pflanzlichen Zellen sind beschrieben und sind beliebig gegeneinander austauschbar. Verwendet werden kann beispielsweise die Termina- tionssequenz des Octopinsynthase-Gens aus Agro acterium tumefaciens.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, insbesondere prokaryontische oder eukaryonti- sche Zellen, die mit einem oben beschriebenen Nucleinsäuremolekül oder einem Vektor transformiert wurden, sowie Zellen, die von derartigen Wirtszellen abstammen und die beschriebenen Nucleinsäuremoleküle oder Vektoren enthalten. Die Wirtszellen können Bakterien- (z.B. E. coli) oder Pilzzellen (z.B. Hefe, insbesondere S . cerevisiae) , sowie pflanzliche oder tierische Zellen sein. Der Begriff "transformiert" bedeutet dabei, daß die erfindungsgemäßen Zellen mit einem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül genetisch modifiziert sind insofern als sie zusätzlich zu ihrem natürlichen Genom mindestens ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül enthalten. Dieses kann in der Zelle frei, gegebenen- falls als selbstreplizierendes Molekül, vorliegen oder es kann stabil in das Genom der Wirtszelle integriert vorliegen.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung einer GDP-Mannose Pyrophosphorylase, bei dem erfindungsgemäße Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert werden, die die Expression des Proteins erlauben, und das Protein aus der Kultur, d.h. aus den Zellen und/oder dem Kulturmedium gewonnen wird.
Die Erfindung betrifft auch Proteine, die durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert werden, oder die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältlich sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Antikörper, die spezifisch ein erfindungsgemäßes Protein erkennen. Diese können z.B. monoclonale oder polyclonale Antikörper sein. Es können auch Fragmente von Antikörpern sein, die erfindungsgemäße Proteine erkennen. Methoden zur Herstellung derartiger Antikörper bzw. Fragmente sind dem Fachmann geläufig.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Wirtszellen transgene pflanzliche Zellen, die aufgrund der Gegenwart eines eingeführten erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls eine erfindungsgemäße GDP-Mannose Pyrophosphorylase exprimieren.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle besteht nun die Möglichkeit, pflanzliche Zellen mittels gentechnischer Methoden dahingehend zu verändern, daß sie eine neue oder eine zusätzliche pflanzliche GDP-Mannose Pyrophosphorylase exprimieren.
Solche transgenen Pflanzenzellen unterscheiden sich von nicht-transformierten Zellen dadurch, daß das eingeführte Nucleinsäuremolekül entweder heterolog zu der transformierten Zelle ist, d.h. aus einer Zelle mit einem anderen genomischen Hintergrund stammt, oder dadurch daß das eingeführte Nucleinsäuremolekül, wenn es homolog zur transformierten Pflanzenspezies ist, im Genom an einem Ort lokalisiert ist, an dem es in nicht-transformierten Zellen natürlicherweise nicht vorkommt. Dabei kann das eingeführte Nucleinsäuremolekül entweder unter der Kontrolle seines natürlichen Promotors stehen oder mit regulatorischen Elementen fremder Gene verknüpft sein.
Ferner unterscheiden sich die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen von entsprechenden nicht-transformierten Pflanzenzellen vorzugsweise dadurch, daß sie eine erhöhte Menge an erfindungsgemäßem Protein aufweisen. Dies läßt sich mit dem Fachmann bekannten Nachweismethoden bestimmen, wie z.B. Western- Blot-Analyse . Eine erhöhte Menge bedeutet dabei vorzugsweise eine Steigerung um mindestens 5 %, bevorzugt um mindestens 10 % und besonders bevorzugt um mindestens 20 %. Es besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das synthetisierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanzlichen Zelle lokalisiert sein kann. Um die Lokalisation in einem bestimmten Kompartiment der Zelle zu erreichen, muß gegebenenfalls die codierende Region mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen Kompartiment gewährleisten. Derartige Sequenzen sind bekannt (Siehe beispielsweise Braun et al . , EMBO J. 11 (1992), 3219- 3227; Wolter et al . , Proc . Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al . , Plant J. 1 (1991), 95-106).
Die Erfindung betrifft ferner transgene Pflanzen, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei der Pflanze, die erfindungsgemäße Pflanzenzellen enthält, kann es sich im Prinzip um jede beliebige Pflanze handeln. Vorzugsweise ist es eine monokotyle oder dikotyle Pflanze, insbesondere eine landwirtschaftliche Nutzpflanze, beispielsweise eine stärkespeichernde Pflanze, wie z.B. Getreidepflanzen (Roggen, Gerste, Hafer, Weizen etc) , Reis, Mais, Leguminosen (z.B. Erbse), Maniok oder Kartoffel, oder eine Zierpflanze. Unter Getreidepflanzen werden insbesondere monokotyle Pflanzen verstanden, die zur Ordnung Poales, bevorzugt solche, die zur Familie der Poaeeae gehören. Beispiele hierfür sind die Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer) , Triticum
(Weizen) , Seeale (Roggen) , Oryza (Reis) , Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) etc. gehören. Besonders bevorzugt ist Hordeum (Gerste). Stärkespeichernde Leguminosen sind z.B. manche Arten der Gattung Pisum
(z.B. Pisum sativum) , Vicia (z.B. Vicia faba) , Cicer (z.B. Cicer arietinum) , Lens (z.B. Lens culinaris) , Phaseolus
(z.B. Phaseolus vulgaris und Phaseolus coccineus) , etc.
Gegenstand der Erfindung ist ferner Vermehrungsmaterial von erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen, beispielsweise Samen, Früchte, Stecklinge, Knollen, Wurzelstöcke, Calli, Zellkulturen etc., wobei dieses Vermehrungsmaterial oben beschriebene transgene Pflanzenzellen enthält.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzenzellen, bei denen die Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins verringert ist aufgrund der Inhibition der Transkription oder Translation von endogenen Nucleinsäuremolekülen, die ein derartiges Protein codieren. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß ein erfindungsge- mäßes Nucleinsäuremolekül oder ein Teil davon in den entsprechenden Pflanzenzellen in antisense-Orientierung expri- miert wird und es aufgrund eines antisense-Effektes zur Verringerung der Menge an erfindungsgemäßem Protein kommt . Eine weitere Möglichkeit zur Verringerung der Menge des erfindungsgemäßen Proteins in pflanzlichen Zellen besteht in der Expression von geeigneten Ribozymen, die spezifisch Transkripte der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle spalten. Möglich ist auch die Expression von Molekülen, die sowohl einen antisense- als auch einen Ribozymeffekt in Kombination ausüben. Alternativ kann die Verringerung der Menge an erfindungsgemäßem Protein in den Pflanzenzellen auch durch einen Cosupressionseffekt erfolgen. Derartige Verfahren sind dem Fachmann bekannt (s.o.) .
Die Verringerung der Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins kann wie oben beschrieben bestimmt werden.
Die Erfindung betrifft ferner transgene Pflanzen, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten.
Die Erfindung betrifft auch Vermehrungsmaterial der vorstehend beschriebenen transgenen Pflanzen, beispielsweise Samen, Früchte, Stecklinge, Knollen, Wurzelstöcke, Calli, Zellkulturen, etc., wobei dieses vorstehend beschriebene transgene Pflanzenzellen enthält.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacteriu tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistisehen Methode sowie weitere Möglichkeiten.
Die Verwendung der Agrobakterien-vermittelten Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al . , Crit . Rev. Plant. Sei., 4, 1-46 und An et al . EMBO J. 4 (1985), 277-287 beschrieben worden. Für die Transformation von Kartoffel, siehe z.B. Rocha Sosa et al .
(EMBO J. 8 (1989) , 29-23) .
Auch die Transformation monokotyler Pflanzen mittels Agrobakterium basierender Vektoren wurde beschrieben (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al . , Plant J. 6 (1994), 271-282, Deng et al . , Science in China 33
(1990), 28-34; Wilmink et al, Plant Cell Reports 11 (1992), 76-80; May et al . , Bio/Technology 13 (1995), 486-492; Conner und Domisse; Int. J. Plant Sei. 153 (1992), 550-555; Ritchie et al . , Transgenic Res . 2 (1993), 252-265). Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistisehen Ansatzes (Wan und Lemaux, Plant Physiol . 104 (1994), 37-48; Vasil et al . , Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et al . , Plant Mol. Biol. 24 (1994), 317-325; Spencer et al . , Theor . Appl . Genet. 79 (1990), 625-631), die Protoplastentransformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Insbesondere die Transformation von Mais wird in der Literatur mehrfach beschrieben (vgl. z.B. WO95/06128, EP 0 513 849; EP 0 465 875, EP 292 435; Fromm et al . , Biotechnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al . , Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel et al . , Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al . , Theoretical Appl. Genet. 80 (1990), 721-726).
Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben, z.B. für Gerste (Wan und Lemaux, s.o.; Ritala et al . , s.o.; Krens et al . , Nature 296 (1982), 72-74) und für Weizen (Nehra et al . , Plant J. 5 (1994), 285- 297) .
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle zur Identifizierung und Isolierung homologer Moleküle, die Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren.
Das im Rahmen der vorliegenden Erfindung hergestellte Plas- mid pGMPase wurde bei der als internationale Hinterlegungsstelle anerkannten Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland entsprechend den Anforderungen des Budapester Vertrages am 15. September 1997 unter der Hinterlegungsnummer DSM 11746 hinterlegt. Figur 1 zeigt schematisch das Plasmid pGMPase. Die fein gezogene Linie entspricht der Sequenz von pBluescript II SK ( - ) . Die starke Linie repräsentiert die cDNA, die die GDP-Mannose Pyrophosphorylase aus Solanum tuberosum codiert. Restriktionsschnittstellen der Insertion sind angegeben. Die cDNA- Insertion ist zwischen die EcoRI- und Xhol-Schnittstellen des Po- lylinkers des Plasmids ligiert. Die DNA-Sequenz der cDNA- Insertion ist unter Seq ID No . 1 angegeben.
Figur 2 zeigt schematisch das Plasmid p35S-antiGMPase .
Aufbau des Plasmids :
A = Fragment A: CaMV35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus, 540 bp .
B = Fragment B: cDNA aus Solanum tuberosum codierend die GDP-Mannose Pyrophosphorylase; Orientierung zum Promotor: antisense.
C = Fragment C: ocs Terminator des Octopin Synthase Gens aus Agrobacterium turne f ciens .
Figur 3 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von GDP-Mannose Pyrophosphorylasen aus Saccharomyces cerevisiae (jeweils untere Zeile und Solanum tuberosum (jeweils obere Zeile) .
Figur 4 zeigt eine Northern Blot-Analyse der Expression der GMPase in Knollen von GDP-Mannose Pyrophosphorylase "antisense" Pflanze (Linien 6, 28 und 37) im Vergleich zu entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzen (WT) .
Figur 5 zeigt einen Vergleich von 3 Monate alten transgenen GMPase "antisense" Pflanzen (rechts und Mitte) und einer gleichalten Wildtyp-Pflanze (links) . Figur 6 zeigt das Auftreten von dunklen Flecken an Stengel und Blättern von 3 Monate alten transgenen GMPase "antisense" Pflanzen sowie das fortschreitende Vertrocknen der Blätter.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung einer cDNA, die eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase aus Solanum tuberosum codiert
Zur Identifizierung einer cDNA, die eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase aus Kartoffel codiert, wurden 6,5 x 10 Pha- genplaques einer cDNA-Bibliothek, hergestellt aus Blättern von Kartoffelpflanzen (Koßmann et al . , Planta 188 (1992), 7- 12), nach darin enthaltenen Fragmenten durchgemustert, die spezifisch mit der verwendeten Sonde hybridisieren. Die Sonde war abgeleitet aus einem EST (expressed sequence tag) aus Arabidopsis thaliana , dessen Sequenz Homologie zu einer Mannose-1-Phosphat Guanyltransferase (EC 2.7.7.13) aus Hefe aufweist (Gen Bank Zugriffsnummer T 21688) .
Phagenplaques wurden dafür auf Nylonmembranen Hybond N (Amersham, UK) übertragen und die DNA durch NaOH-Behandlung denaturiert, die Filter neutralisiert und die DNA durch UV- Behandlung auf den Filtern fixiert . Die Filter wurden in 0,25 M NaHP04, pH 7,2, 0,25 M NaCl, 7% SDS, 1 mM EDTA, 25% Formamid, 10% PEG für 2 Stunden bei 42°C vorhybridisiert. Anschließend wurden die Filter in 0,25 M NaHP04 , pH 7,2, 0,25 M NaCl, 7% SDS, 1 mM EDTA, 25% Formamid, 10% PEG nach Zugabe der entsprechenden radioaktiv markierten Sonde für 10h bei 42°C hybridisiert. Die Filter wurden anschließend 30 min in 1 x SSC, 0,5% SDS und 15 min in 0,5 x SSC, 0,5% SDS jeweils bei 42 °C gewaschen und auf Röntgenfilmen exponiert. Positive Phagenclone wurden unter Anwendung von Standardverfahren weiter gereinigt. Mit Hilfe der in-vivo-excision-Me- thode wurden von positiven Phagenclonen E. coli-Clone gewonnen, die ein doppelsträngiges pBluescript-Plasmid mit der jeweiligen cDNA- Insertion enthalten. Nach Überprüfung der Größe und des Restriktionsmusters der Insertionen wurde ein geeigneter Clon, cGMPase, weiter analysiert.
Aus dem Clon wurde das Plasmid pGMPase (Fig. 1) isoliert und seine cDNA-Insertation durch Standardverfahren mittels der Didesoxymethode (Sanger et al . , Proc . Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977), 5463-5467) bestimmt.
Die Insertion ist 1524 kb lang und stellt eine vollständige cDNA dar. Ein Teil der Nucleotidsequenz (1478 bp) ist unter Seq ID No . 1 angegeben. Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist in Seq ID No . 2 angegeben. Sequenzvergleiche zeigten, daß diese DNA-Sequenz sowie die abgeleitete Aminosäuresequenz in verschiedenen Bereichen starke Homologie zu der cDNA aus Saccharomyces cerevisiae aufwies, die eine GDP-Mannose Pyrophosphorylyase codiert, bzw. zu der entsprechenden Aminosäuresequenz (siehe Figur 3) .
Beispiel 2
Konstruktion des Plasmids p35S-antiGMPase und Einführung des Plasmids in das Genom von Kartoffelpflanzen
Aus dem Plasmid pGMPase wurde mit Hilfe der Restriktionsen- donucleasen Asp718 und BamHI ein ca. 1,5 kb großes DNA-Fragment isoliert, das die codierende Region für die GDP-Mannose Pyrophosphorylase umfaßt, und in den mit Asp718 und BamHI geschnittenen Vektor pBinAR (DSM 9505) ligiert. Durch die Insertion des cDNA-Fragmentes entsteht eine Expressionskassette, die folgendermaßen aus den Fragmenten A, B und C aufgebaut ist (Fig. 2) :
Das Fragment A (540 bp) enthält den 35S Promotor aus dem Blumenkohlmosaikvirus . Das Fragment B enthält neben flankierenden Bereichen die proteincodierende Region einer GDP-Mannose Pyrophosphorylase aus Solanum tuberosum. Diese wurde wie oben beschrieben aus pGMPase isoliert und in antisense-Orientierung an den 35S- Promotor in pBinAR fusioniert.
Fragment C (215 bp) enthält das Polyadenylierungssignal des Octopin Synthase Gens aus Ag-robacte ium tumefaciens . Die Größe des Plasmids p35S-antiGMPase beträgt ca. 13,5 kb . Das Plasmid wurde mit Hilfe von Agrobakterien in Kartoffelpflanzen transferiert.
Dazu wurden 100 kleine mit dem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur { Solanum tuberosum, L.cv. Desiree) in 10 ml MS-Medium (Murashige&Skoog Physiol. Plant. 15 (1962) , 473) mit 2% Sachcarose gelegt, welches 50μl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens -Ober - nachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem Schütteln erfolgte eine weitere Inkubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur Kallusinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glucose, 5 mg/1 Naphthylessigsäure, 0,2 mg/1 Benzylami- nopurin, 250 mg/1 Claforan, 50 mg/1 Kanamyein und 0,8% Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glucose, 1,4 mg/1 Zeatinribose, 20 μg/1 Naphthylessigsäure, 20 μg/1 Giberellinsäure, 250 mg/1 Claforan, 50 mg/1 Kanamyein und 0,8% Bacto Agar gelegt. Aus den transformierten Zellen wurden ganze Pflanzen regeneriert.
Die erhaltenen transgenen Kartoffelpflanzen wurden im Gewächshaus unter folgenden Bedingungen gehalten: Lichtperiode: 16 h bei 25000 Lux und 22°C Dunkelperiode: 8 h bei 15°C Luftfeuchtigkeit: 60 %.
Als Ergebnis der Transformation zeigten transgene Kartoffelpflanzen eine Verringerung der Aktivität einer GDP-Mannose Pyrophosphorylase sowie eine Verminderung der GDP-Mannose Pyrophosphorylase RNA (siehe Figur 4) . Dies wurde mittels Northern Blot Analyse nachgewiesen. Dazu wurde RNA nach Standardprotokollen aus Blattgewebe von Pflanzen isoliert. 50 μg RNA wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt (1,5% Agarose, lx MEN-Puffer, 16,6 % Formaldehyd) . Nach der Elektrophorese wurde die RNA mit 20 x SSC mittels Kapillarblot auf eine Nylonmembran Hybond N
(Amersham, UK) übertragen. Die RNA wurde auf der Membran durch UV-Bestrahlung fixiert. Die Membran wurde in Phosphat -Hybridisierungspuffer
(Sambrook et al . , a.a.O.) für 2h prähybridisiert und anschließend durch Zugabe der radioaktiv markierten Sonde für 10 h hybridisiert.
Transgene Pflanzen zeigten sowohl in der Sterilkultur als auch bis zu zwei Monaten nach Transfer in Gewächshaushaltung in ihrem Erscheinungbild keine Unterschiede gegenüber untransformierten Pflanzen. Nach zwei Monaten bildeten sich am Stengel dunkle Flecken. An den Blättern wurden Läsionen in Form von kleinen schwarzen Punkten sichtbar (Fig. 6) . Außerdem begannen die Blätter der Pflanzen zu vertrocknen. Dabei vertroekente zuerst die Spitze der endständigen Fieder eines Blattes bis das ganze Blatt bis zum Stengel hin braun und vertrocknet war. Dieses Abreifen der Blätter setzte sich, von unten nach oben fortschreitend, fort, bis schließlich alle oberirdischen Pflanzenteile abgereift waren (Fig. 5) .
Transgene GDP-Mannose antisense Pflanzen unterscheiden sich in ihrem Knollenertrag nicht von untransformierten Kartoffelpflanzen. Knollen von 15 Wochen alten untransformierten Kartoffelpflanzen wogen durchschnittlich 169,7 g pro Pflanze. Die Erträge für drei unabhängig transformierte Linien betrugen durchschnittlich 168,6 g (Linie 37), 162,5 g
(Linie 28) beziehungsweise 160,7g (Linie 6). BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATION ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGA. ,.SM£N FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Max-Planck- Institut für molekulare Pflanzen- physiologie
Karl-Liebknecht-Str. 24-25
Haus 20 EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG,
14476 Golm ausgestellt gemäß Regel 7 1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER pGMPase
DSM 11746
II WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TaAXONOMISCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter I bezeichneten Mikroorganismus wurde
(X ) eine wissenschaftliche Beschreibung
( ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht (Zutreffendes ankreuzen)
III EINGANG UND ANNAHME
Diese mtemaüonale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 1997 - 09 - 15 (Datum der Ersthinterlegung)' eingegangen ist
IV EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Ersthinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung)
V INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschnft(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten
Anschrift Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig £/ *m '<io
Datum 1997 - 09 - 18
1 Falls Regel 64 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer intemauonalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist - BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE
ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MUCROORG-ANISMEN
FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERhAHRHN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Max-Planck-Institut für molekulare Pflanzenphysiologie
Karl-Liebknecht-Str. 24-25 Haus 20 LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG 14476 Golm ausgestellt gemäß Regel 10.2 von der unten angegebenen
INTERNAΗONa LEN HINTERLEGUNGSSTELLE
Figure imgf000035_0001
Angabe des Datums der Ersthinteriegung. Wenn eine erneute Hinteriegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinteriegung oder Weiterleitung. in den in Regel 10 Buchstaoe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fallen Angabe der letzten Lebensffchigkeitsprüfung.
Zutreffendes ankreuzen.
Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Transgene Pflanze enthaltend Pflanzenzellen, die genetisch modifiziert sind, wobei die genetische Modifikation zur Verringerung der Aktivität einer endogen in den Pflanzenzellen vorkommenden GDP-Mannose Pyrophosphorylase (EC 2.7.7.22) führt im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Zellen.
2. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, wobei die GDP-Mannose Pyrophosphorylase, deren Aktivität reduziert wird, ein pflanzliches Protein ist, das codiert wird von einem Nucleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
(a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter Seq ID No . 2 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt;
(b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No. 1 angegebene codierende Region umfassen;
(c) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die Aminosäuresequenz umfaßt, die von der Insertion in Plasmid pGMPase (DSM 11746) codiert wird;
(d) Nucleinsäuremoleküle, die die in der Insertion des Plasmids pGMPase (DSM 11746) enthaltene codierende Region umfassen;
(e) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem Strang eines Nucleinsäuremoleküls nach (a) , (b) , (c) und/oder (d) hybridisiert; und
(f) Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (e) abweicht.
3. Transgene Pflanze nach Anspruch 1 oder 2, deren oberirdische Teile im Vergleich zu denen einer entsprechenden nicht genetisch modifizierten Pflanze schneller reifen und absterben.
4. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die genetische Modifikation darin besteht, daß ein fremdes Nucleinsäuremolekül in das Genom der in der Pflanze enthaltenen Zelle eingeführt ist, dessen Expres¬ sion zur Inhibierung der Expression endogener Gene führt, die eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren.
5. Transgene Pflanze nach Anspruch 4 , wobei das fremde Nucleinsäuremolekül ein Molekül codiert ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
(a) antisense-RNAs, die zu Transkripten von GDP-Mannose Pyrophosphorylase -Genen oder zu Teilen solcher Transkripte komplementär ist;
(b) Ribozymen, die spezifisch Transkripte eines GDP-Mannose Pyrophosphorylase -Gens spalten können; und
(c) Cosuppressions-RNAs zu einer mRNA, die eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase codiert .
6. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Aktivität der GDP-Mannose Pyrophosphorylase in Zellen aller Pflanzenteile verringert ist.
7. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Aktivität der GDP-Mannose Pyrophosphorylase in Zellen der oberirdischen Pflanzenteile verringert ist.
8. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Aktivität der GDP-Mannose Pyrophosphorylase um mindestens 10 % verringert ist im Vergleich zu der Aktivität in entsprechenden Wildtyp-Pflanzen.
9. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 8, die eine Kartoffelpflanze ist.
10. Transgene Pflanzenzelle, die durch die Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls genetisch modifiziert ist, wobei das Vorhandensein oder die Expression des Nuclein- säuremoleküls die Verringerung der Aktivität einer endo¬ gen in der Pflanzenzelle vorkommenden GDP-Mannose Pyro¬ phosphorylase bewirkt im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch mdifizierten Wildtyp-Zellen.
11. Vermehrungsmaterial einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 9 enthaltend Pflanzenzellen nach An¬ spruch 10.
12. Vermehrungsmaterial nach .Anspruch 11, das eine Knolle oder ein Same ist.
13. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, deren oberirdische Teile früher und schneller reifen und ab¬ sterben als bei entsprechenden Wildtyp-Pflanzen, wobei
(a) eine pflanzliche Zelle genetisch modifiziert wird durch die Einführung eines fremden Nucleinsäuremole¬ küls, und die genetische Modifikation zur Verringe¬ rung der Aktivität einer endogen in pflanzlichen Zellen vorkommenden GDP-Mannose Pyrophosphorylase führt ; und
(b) aus der Zelle eine Pflanze regeneriert wird; und ge¬ gebenenfalls
(c) aus der Pflanze nach (b) weitere Pflanzen erzeugt werden .
14. Verfahren nach Anspruch 13 , wobei die Pflanze eine Kar¬ toffelpflanze ist.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das einge¬ führte fremde Nucleinsäuremolekül die Synthese einer antisense-RNA zu Transkripten von GDP-Mannose Pyrophos- phorylase-Genen erlaubt.
16. Verwendung von Nucleinsäuremolekülen, die eine GDP-Man¬ nose Pyrophosphorylase codieren, von Fragmenten solcher Moleküle oder von Nucleinsäuremolekülen, die zu solchen Molekülen komplementär sind, zur Verringerung der GDP- Mannose Pyrophosphorylase-Aktivität in pflanzlichen Zellen.
17. Verwendung von Nucleinsäuremolekülen, die eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren, von Fragmenten solcher Moleküle oder von Nucleinsäuremolekülen, die zu solchen Molekülen komplementär sind, zur Erzeugung von Pflanzenzellen mit einer verringerten Aktivität der GDP-Mannose Pyrophosphorylase .
18. Verwendung von Nucleinsäuremolekülen, die eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren, von Fragmenten solcher Moleküle oder von Nucleinsäuremolekülen, die zu solchen Molekülen komplementär sind, zur Erzeugung von Pflanzen enthaltend Pflanzenzellen wie in Anspruch 17 definiert.
19. Verwendung von Nucleinsäuremolekülen, die eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren, von Fragmenten solcher Moleküle oder von Nucleinsäuremolekülen, die zu solchen Molekülen komplementär sind, zur Erzeugung von transgenen Pflanzen, deren oberirdische Teile schneller reifen und absterben als die oberirdischen Teile von entsprechenden Wildtyp-Pflanzen.
20. Nucleinsäuremolekül codierend ein pflanzliches Protein, dessen reife Form die enzymatische Aktivität einer GDP- Mannose Pyrophosphorylase aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
(a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter Seq ID No . 2 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt;
(b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No . 1 angegebene codierende Region umfassen;
(c) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die Aminosäuresequenz umfaßt, die von der Insertion in Plasmid pGMPase (DSM 11746) codiert wird; (d) Nucleinsäuremoleküle, die die in der Insertion des Plasmids pGMPase (DSM 11746) enthaltene codierende Region umfassen;
(e) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem Strang eines Nucleinsäuremoleküls nach (a) , (b) , (c) und/oder (d) hybridisiert; und
(f) Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (e) abweicht.
21. Vektor enthaltend ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 20.
22. Vektor nach Anspruch 21, wobei das Nucleinsäuremolekül in sense-Orientierung mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die die Transkription in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.
23. Wirtszelle, die genetisch modifiziert ist mit einem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 20 oder mit einem Vek¬ tor nach Anspruch 21 oder 22.
24. Verfahren zur Herstellung einer GDP-Mannose Pyrophosphorylase, wobei eine Wirtszelle nach Anspruch 23 unter Bedingungen kultiviert wird, die die Expression des Proteins erlauben, und das Protein aus den kultivierten Zellen und/oder dem Kulturmedium isoliert wird.
25. Protein codiert durch ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 20 oder erhältlich durch ein Verfahren nach Anspruch 23.
26. Antikörper, der spezifisch ein Protein nach Anspruch 25 erkennt .
27. Transgene Pflanzenzelle, die mit einem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 20 genetisch modifiziert ist und die im Vergleich zu einer nicht genetisch modifizierten Pflanzenzelle eine erhöhte Aktivität der GDP-Mannose Pyrophosphorylase aufweist .
28. Transgene Pflanze enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 27.
29. Vermehrungsmaterial einer Pflanze nach Anspruch 28.
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