WO1999013911A1

WO1999013911A1 - Agent nootrope

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Publication number: WO1999013911A1
Application number: PCT/JP1998/004136
Authority: WO
Inventors: Tomoyuki Nishizaki; Mitsunobu Yoshii; Shigeo Watabe
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 1997-09-12
Filing date: 1998-09-14
Publication date: 1999-03-25
Also published as: BR9815370A; IL134661A0; ID24282A; JPH1180027A; KR20010030582A; CN1270528A; EP1022029A1; NO20001196L; AU9003598A; NO20001196D0; CA2301782A1

Description

明細書向知性薬技術分野

本発明は向知性薬に関し、さらに詳細には脳の神経伝達系に長時間作用し、痴呆症等の治療に有用な医薬に関する。背景技術

従来、神経系のニコチン性アセチルコリン（nAChと略す。）受容体は、主としてシナプス前部に限局して神経伝達物質遊離の制御に関与しており（K. F. F u n k等、 B i ome d. B i o c h em. Ac t a 1 1 , 1 3 0 1 , 1 9 84 ： G. Sp i gn o l i等、 Ph a rma c o l . B i o c h em. B e h a v . 2 7， 4 9 1 , 1 9 8 7 : M. Ma r c h i等、 E u r. J. Pha rma c o l . 1 85， 247, 1 990. ： S. Wa t ab e等、 J. Pha rma c o l. 238, 303， 1 993 ) 、認知機能と直結する海馬の神経伝達を促進することを示す多くの知見がある（5. M. S a t 0 h e t a 1. , Ne u r o s c i. L e t t. 68， 2 1 6, 1 986) 。

しかし、痴呆症に対して臨床上有効な薬剤は現在殆ど見いだされておらず、また、近年、数種の向知性薬が開発されているが、それらのメカニズムの詳細は不明である。

本発明の目的は、海馬神経伝達を長期間促進する薬剤に基づく、水頭症による痴呆症、アルツハイマ-病の痴呆症等、各種の痴呆症の治療のために、脳神経伝達を長期間改善する薬剤を見いだすことにより、これら痴呆症に対する有用な治療薬を提供することである。発明の開示

ある種の向知性薬（脳機能改善薬）が脳内における、ドーパミン作働系、コリン作働系、グルタミン酸作働系および GAB A作働系など、種々の神経伝達を改善し得ることは、これまでの多数の研究により示されいる。

また、ある種の向知性薬はテ夕ヌス刺激（電気刺激）により神経伝達が活性化するという、学習 '記憶のモデルにもなつている長期増強（LTP) を促進することが知られているが（M. S a t o h等， N e u r o s c i . L e t t . 6 8， 2 1 6, 1 9 8 6 ) 、実地医療の現場においては電気刺激（テタヌス刺激）を併用することは、現実的ではなく痴呆症の改善に臨床上役立つとは思えない。そこで、本発明者らは電気刺激（テタヌス刺激）なしで、神経伝達を長期間活性化するような物質を探索し、そのような物質の用途を見出すベく種々検討した結果、

( 1 ) プロティンカイネース Cの活性化経路を長期間活性化させる物質；

(2) プロティンカイネース Cの長期活性化とニコチン性ァセチルコリン受容体の長期活性化の相互作用をもたらす物質；

(3) プロテインカイネース Cの活性化経路を長期間活性化させ、プロテイン力イネース Cとの相互作用によりシナプス前ニコチン性ァセチルコリン受容体を長期間活性化し、グルタミン酸の分泌を長期間増大させることにより、海馬神経伝達を長期間改善させる物質；あるいは（4) 電気刺激を必要としない L TP様作用を誘発する物質を初めて見出し、これらの物質が種々の原因による痴呆症に対する医薬、すなわち向知性薬として有用であることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、プロテイン力イネ一ス Cの活性化経路を長期間活性化させる物質を有効成分とする向知性薬を提供するものである。

また、本発明は、プロテインカイネース Cの長期活性化とニコチン性ァセチ儿コリン受容体の長期活性化の相互作用をもたらす物質を有効成分とする向知性薬を提供するものである。また、本発明は、プロテインカイネース Cの活性化経路を長期間活性化させ、プロティンカイネース Cとの相互作用によりシナプス前ニコチン性ァセチルコリン受容体を長期間活性化し、グルタミン酸の分泌を長期間増大させることにより、海馬神経伝達を長期間改善させる物質を有効成分とする向知性薬を提供するものでめる。

また本発明は、電気刺激を必要としない L T P様作用を誘発する物質を有効成分とする向知性薬を提供するものである。

また、本発明は、次の一般式（ 1 ) ：

[式中、 Rは水素原子または水酸基を示し、

R ¹ は水素原子またはメチル基を示し、

R ² はピリジル基または 1〜3個の同一又は異なる置換基で置換された置換フェニル基を示す。ここでフヱニル基上の置換基は、

ノヽロゲン原子、

トリフルォロメチル基、

ニトロ基、

ァセチル基、

1〜4個の炭素原子を有する直鎖又は分技鎖のアルキル基、

1〜 4個の炭素原子を有する直鎖又は分技鎖のアルコキシル基、

1〜 7個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキルメルカプト基、一般式一 S— ( C H ₂) „- C H ( R ³) ( R ⁴) [式中の nは 1又は 2を示し、 R ³ は水素原子又はメチル基を示し、 R ⁴ は水酸基又は一般式一 N (R⁸) (R⁹) (式中の R⁸ は水素原子又はメチル基を示し、 R⁹ はメチル基、ベンジル基、又は置換ベンジル基を示し、あるいは R ⁸ 及び R⁹ が一緒になつて式中の窒素原子と共に置換ピロリジン環を示す。）で表されるアミノ基を示す。 ]

で表される置換アルキルメルカプト基、

次の一般式：一 S0₂R⁵ (式中の R⁵ は、ァミノ基又は 1〜 3個の炭素原子を有するアルキル基を示す。）で表されるスルフォニル基、及び

次の一般式： — CO〇（CH₂) ₂— N (R⁶) (R⁷) (式中の R ⁶及び R ⁷ はそれぞれ独立に水素原子、メチル基、又はェチル基を示す。）で表される置換アミノエトキシカルボニル基からなる群から選ばれる基である。 ]

で表される 2—ォキソ一 1一ピロリジニルアルキルカルボン酸ァミド又はその製薬上許容できる酸付加塩を有効成分とする、脳の神経伝達物質の長期改善剤；プロティンカイネース Cの活性化経路の長期活性化剤；

プロティンカイネース Cの活性化経路の長期活性化剤；

電気刺激を必要としない L TP様作用の誘発剤；及び分泌グルタミン酸の長期増加剤を提供するものである。

また、プロティンカイネース Cの活性化経路を長期間活性化させる物質の向知性薬製造のための使用を提供するもである。

また、本発明は、プロテイン力イネ一ス Cの長期活性化とニコチン性ァセチルコリン受容体の長期活性化の相互作用をもたらす物質の向知性薬製造のための使用を提供するものである。

また、本発明は、プロテインカイネース Cの活性化経路を長期間活性化させ、プロティンカイネ一ス Cとの相互作用によりシナプス前ニコチン性ァセチ儿コリン受容体を長期間活性化し、グル夕ミン酸の分泌を長期間増大させることにより- 海馬神経伝達を長期間改善させる物質の向知性薬製造のための使用を提供するものである。また、本発明は前記一般式（ 1 ) の化合物の、脳神経伝達物質の長期増強を製造のための使用；プロテインカイネース Cの活性化経路の長期活性剤；

電気刺激を必要としない L T P様作用を誘発剤製造のための使用；分泌グル夕ミン酸の長期増加剤製造のための使用を提供するものである。

また、本発明は、プロテイン力イネ一ス Cの活性化経路を長期間活性化させる物質を患者に投与することを特徴とする向知性のための処置方法を提供するものでめ。

また、本発明は、プロテイン力イネ一ス Cの長期活性化とニコチン性ァセチルコリン受容体の長期活性化の相互作用をもたらす物質患者に投与することを特徴とする向知性のための処置方法を提供するものである。

また、本発明は、プロテイン力イネ一ス Cの活性化経路を長期間活性化させ、プロテインカイネースじとの相互作用によりシナプス前ニコチン性ァセチルコリン受容体を長期間活性化し、グルタミン酸の分泌を長期間増大させることにより、海馬神経伝達を長期間改善させる物質を患者に投与することを特徴とする向知性のための処置方法を提供するものである。

また、本発明は、電気刺激を必要としない L T P様作用を誘発する物質を患者に投与することを特徴とする向知性のための処置方法を提供するものである。さらに、本発明は、一般式（ 1 ) の化合物を患者に投与することを特徴とする、脳神経伝達物質の長期改善；プロティンカイネ—ス Cの活性化経路の長期活性化；電気刺激を必要としない L T P様作用の誘発；分泌グルタミン酸の長期増加のための処置方法を提供するものである。図面の簡単な説明

図 1は、非 NM D A受容体電流に及ぼすネフィラセタムの効果を示す。

A M P A受容体である G 1 u R 1 , 2 , 3受容体を卵母細胞に発現させた。力ィニン酸（ 1 0 0 // M) により誘発された細胞膜電流をネフィラセ夕厶（ 1 // M) 投与前後で記録した（_n:= 5) 。保持電位は一 3 OmVに設定した。

図 2は、力ルシゥ厶依存性クロライド電流と正常型 n A C h受容体を通過するカルシウム流入に及ぼすネフィラセタムの効果を示す。

(A) アト口ピンを含まない力エル用リンゲル液中で、 AC h受容体を発現していない卵母細胞に対してァセチルコリン（ 1 0 0〃M) を投与した。保持電位は一 3 0 mVに設定した。

(B) 正常型 AC h受容体を発現している卵母細胞にカルシウムグリーンを負荷した。カルシウムを含まない細胞外液（e x t C a ²⁺ (-) ) と通常の細胞外液中でアセチルコリン（ 1 0 0 M) を投与した際の、細胞内カルシウム

( [C a^{2 +} ] i) と誘発電流（ I A) を記録した。カルシウム上昇は、螢光強度の増分（D I ) を基線強度（ I ) で除し、更にカルシウム含まない溶液（ 2) で得た電流振幅（ A) で除して正規化したものである。（ 1 ) はカルシウムを含む溶液から得た電流である。図では各値は 7個の卵母細胞より得られた平均値であり、誤差線は標準偏差（SD) を示す。

図 3は、ネフィラセタムにより誘発された 4 β 2及びひ 7受容体電流の増強作用を示す。

卵母細胞におけるひ 4 β 2又はひ 7受容体の発現を記録するために 2電極電位固定法を用いた。 AC h ( 1 0 0〃M) をひ— B uTX ( 5 0 nM) 又は MCA ( 3 M) の存在又は不存在下 1個の卵母細胞に投与した。保持電位はひ 4 β 2 又は α 7 nAC h受容体に対し各々一 3 0又は— 6 OmVとした。図中、下方へのトレース（屈曲）は、内部への電流に相当する。発明を実施するための最良の形態

本発明における神経伝達の長期増強をもたらす物質を探索するために、次のような手段を用いた。

( 1 ) まず、標準手法によって動物、例えば、ラットの脳から調製した海馬切片を用いて、チャンバ一内で適切量の酸素及び炭酸ガスを飽和させた人工髄液中で連続的に灌流させ、シエーファー側枝/交連線維に対して電気刺激を行い、

C A 1領域の錐体細胞層より樹状突起のフィールド興奮性シナプス後電位を記録する方法を用いる。海馬領域の神経伝達を、このシナプス後電位を測定することにより、海馬神経伝達の増強をもたらす物質の評価をするという手法である。

(2) また、別の手法としてインビトロ転写技術を用いて行うことができる、即ち、アフリカッメガエル卵母細胞へ、脳の n AC h受容体として既に知られている受容体 mRNAを入手して、それを同細胞内へ注入し、これらの受容体を発現した細胞を用いることができる。例えば、 n AC h受容体として、ラットひ 4 /32mRNAおよびひ 7mRNA、及び P K Cの抑制機能を有するぺプチド N P 1 5 2及び活性化していない P K Cを抑制するペプチド N P 1 5 3の mRNA等を、また、 AMP A受容体として G 1 u R 1 , 2， 3受容体 mRNAを用い、それぞれの mRNAを卵母細胞内に注入後、受容体又はべプチドを発現させ、この発現細胞を用いて各々の受容体電流を測定するという手法である。

(3) また、神経伝達物質である、分泌されたグルタミン酸を定量することにより、神経伝達の経路を検証する手法である。

(4) 本発明における評価の手法としては、プロテイン力イネ一ス Cの阻害剤として GF 1 0 9 2 0 3 Xを、プロティンカイネース Aの阻害剤として H 8 9を、 a 7受容体の阻害剤としてひ—ブンガ口トキシンを、ひ 4 /S 2受容体阻害剤としてメカミラミン（MCAM) を、 NMDA型グル夕ミン酸受容体阻害剤として D— 2—ァミノ一 5—ホスホバレリン酸（AP V) を、非 NMDA型グル夕ミン酸選択的阻害剤として 6， 7—ジニトロキノザリン— 2， 3—ジオン（DNQX) を用いることができる。

上記のような手法を用いて、本発明に係る物質が、脳神経の伝達を長期間に渡つて改善する薬剤となる物質であることの確認を行った。次にその結果を示す。 [ 1 ] 本発明の化合物によるシナプス後電位の増強：

一般に、神経伝達の長期改善剤であることは、シナプス後電位の測定により、確認することができる。本発明に係る物質が、シナプス後電位の増強をもたらしたことは、以下のような事実から確認することができた。即ち、モルモット海馬スライスを用いて、人工髄液中で、海馬維体細胞層の C A 1領域から樹状突起のシナプス後電位を記録すると、本発明の化合物の 0. 0 1 zM 濃度から

1 0 / M濃度で処理すると用量依存的にシナプス後電位を増強した（表し表 2) 。また、本発明の化合物の低濃度（0. 1 //Μ 以下）では短期的な抑制が起こり、高濃度（ 1 zM 以上）では L TPに似た長期的な増強の結果を得、また、その効果は用量依存性の二相性を示した（表 1 8) 。

また、脳ニコチン性アセチルコリン（以下、 nAC hと略す。）受容体として既に知られているひ 7受容体及びひ 4 2受容体を発現させた了フリカツメガェル卵母細胞を用いた実験では、本発明に係る物質の処理によるその AC h誘発電流の増強は、ひ 4 2受容体では 0. 0 0 1 以上の濃度で（最大値は 0. 1 M) 、 7受容体では 0. 0 1 /M以上の濃度（最大値は 1 M) で見られた

(表 7，表 8) 。

[2] プロテイン力イネ—ス C (以下 PKCと略す。）の活性化の確認： PKCとは、 1 9 7 7年に西塚等により発見されたカルシウム及びリン脂質 (ホスファチジルセリン； PS) の存在下で活性化されるセリン ·スレオニン酸化酵素である。種々の外界シグナルによって細胞膜のイノシトールリン脂質の代謝回転が亢進すると、 DS (ジ了シルグリセロール）とイノシトール三リン酸という 2種類のセカンドメッセンジャーが生産される。イノシトール三リン酸は細胞内のカルシウムストァからカルシウムを遊離させ、細胞内カルシウム濃度を上昇させ、一方、 DGはカルシウムとリン脂質の存在下で PKCを活性化する。つまり、カルシウムと PKCによるリン酸化反応が協力的に働いて、種々の細胞機能を調節している（斉藤尚亮，代謝、 2 8 ： 1 8 9— 2 2 2) 。本発明に係る物質が、上記によりシナプス後電位の増大を示したが、このシナブス後電位の増大が P K Cの活性化に起因するものであることは、 P K Cの阻害剤 GF 1 0 9 2 0 3 Xを用いた海馬スライスを用いた実験、及び、アフリカッメガエル卵母細胞膜上に n AC h受容体を発現させた細胞における n AC h受容体電流の測定における実験から証明できる。

本発明の物質によるシナプス後電位の増強は P K Cの選択的阻害剤の投与により顕著に阻害されるが、プロテインカイネース A (以下、 PKAと略す。）の選択的阻害剤によっては阻害されないことから、本発明に係る化合物によるシナプス後電位の増強は PKCと関連することが明らかとなった。

また、ァフリカツメガエル卵母細胞膜上に発現させた n AC h受容体である a 7受容体又はひ 4 β 2受容体を用いた実験で、 AC h誘発電流は PKC阻害剤で抑制され、更に、各々の受容体に P K C抑制ペプチド（ N P 1 5 2 ； a PKC l ： P e u n o v a, N. 等、 Na t u r e 3 6 4, 4 5 0 - 4 5 3, 1 9 9 3 ) を同時発現させたとき、各々の受容体において、本発明に係る物質の処理による AC h誘発電流を増強は抑制され、不活性型 P K C抑制べプチド (NP 1 5 3 ； i pKPC) を同時発現させたとき、 AC h誘発電流の増強の抑制が認められる（表 1 0) 。

これらのことは、本発明に係る物質の処理による A C h誘発電流の長期増強が PKCの活性の変動によって制禦されることを示唆している。

[3] n AC h受容体の活性化の確認：

本発明に係る物質は、また、前述の手法を用いて検討したところ、 nAC h受容体を活性化するものであることが、以下のように明らかになった。

本発明に係る物質（ 1 /M) を海馬 C A 1領域の神経細胞に処理すると、海馬 C A 1領域から誘発されたシナプス後電位の増強が、ひ一ブンガ口トキシン（選択的ひ 7受容体阻害剤）により又メカミラミン（ひ 4 2受容体阻害剤）により抑制されることは、本発明に係る物質が n AC h受容体の活性化させたことを示す（表 3, 表 4) 。

脳内の nACh受容体として現在判明しているひ 7受容体、及び、《 4 ^ 2受容体を用いて検討したところ、本発明に係る物質はこれらの 2種の受容体を有する細胞で AC h誘発電流を増強を示した（表 8) 。

以上のことは、本発明に係る物質によるシナプス後電位の持続的な促進が神経系 n AC h受容体を介して起こることを示唆している。

更に、ひおよび 5サブュニット上の PKC燐酸化部位を欠いた変異型 AC h受容体（m aAPKC/S e r 333 m <5APKC/S e r 377 ) (V. M. Ge h l e等、 Mo l . B r a i n Re s. 5, 1 83, 1 9 9 1 ) を発現させた細胞では、本発明に係る物質（ 1 M) は電流の増強を起こさなかった（表 1 7) 。このことは、本発明に係る物質は、 Ca²⁺依存性 PKCの活性化と受容体の PKC燐酸化により、 AC h制禦チャンネル電流を増強することを示している。

このように、本発明に係る物質による脳神経伝達の長期促進（シナプス後電位増強）は、 PKCの長期活性化と、 nACh受容体の長期活性化による相互作用に基づいていることを示す。

[ 4 ] 分泌グル夕ミン酸の増加：

海馬スライスを用いた実験では、電気刺激による脱分極で興奮性伝達物質であるグルタミン酸が分泌する条件下で、本発明に係る物質（ 1 / M) の処理により、グル夕ミン酸の分泌を有意に増加させ、また、その増加がひ—ブンガ口トキシンやメカミラミンの存在により抑制された（表 1 1 ) 。このことは本発明に係る物質が nACh受容体を活性化させグル夕ミン酸分泌増加を引き起こし、シナプス後電位を長期増強することを示唆している。

[5] AMP AZカイニン酸受容体電流に対する効果：

シナプス後電位の主体は、ひーァミノ— 3—ハイドロキシ— 5一メチルー 4一イソキサゾ口プロピオン酸（AMPA、と略す。） Zカイニン酸受容体電流である。

本発明に係る物質の処理による海馬神経伝達の促進は、 AMP A/カイニン酸型受容体（非 NMDA型受容体）の選択的阻害剤（DNQX) で抑制され、 NMD A型受容体の選択的阻害剤（APV ; 6, 7—ジホスホべレリン酸）により抑制されないことは、本発明に係る物質による「シナプス後電位の増強」は/ カイニン酸受容体電流を経由していることを示唆している。しかし、非 NMDA 型受容体である AMPAZカイニン酸受容体（G 1 uR 1, 2， 3) を発現させたアフリカッメガエル卵母細胞を用いた検討では（図 1) 、本発明に係る物質は AMP AZカイニン酸受容体電流を増強しないことから、この「シナプス後電位の増強」は、シナプス後膜に発現する AMP A/カイニン酸受容体の調節に起因して生ずるものではないことを示唆している。

[6] A C hによりゲート制御されるチャンネル電流に対する作用：アフリカッメガエル卵母細胞膜発現系における A C h誘発電流は、 A C hによりゲート（開閉機構）が制禦されるチャンネル電流と、二次的に活性化される力ルシゥ厶依存性のク口ライド電流の 2者から成ることが知られている（R. Mi l e d i等， J. Phy s i o l . 357, 1 73， 1 984 ) 力く、本発明者らによる検討では、本発明に係る物質は、内因性のムスカリン性 AC h受容体の刺激によるカルシウム依存性クロライド電流や（図 2) 、 n AC h受容体チヤンネルのカルシウム透過性に影響を与えないことより（図 2 ；表 1 5) 、本発明に係る物質は AChによりゲ一ト制禦されるチャンネル電流を変えるが、カルシゥム感受性クロライド（C 1一）電流には影響を与えないことを示した。

[7] 作用の 2相性：

海馬スライス切片を用いたシナプス後電位の測定において、本発明に係る物質の低濃度（0. 1 /M以下）処理により、一過性にシナプス後電位の弱い抑制がみられた（表 1 3) 。

また、本発明に係る物質は、 i n v i vo (経口投与）においても、脳での興奮性シナプス後電位（P S) に対する長期かつ著明な増強作用を示した (表 24) 。

以下、本発明についてより詳細に説明する。

本発明は、 PKCの活性化経路を長期間活性化させる物質を有効成分とする向知性薬に関するものである。

本発明者らは、 P K Cを長期間活性化薬剤は向知性薬となりうることを見いだした。すなわち、 P K C；、特に、シナプス前ニコチン性アセチルコリン ( n A C h ) 受容体と連関している P K Cを長期活性化させることにより、 n AC h受容体を燐酸化により長期間活性化させ、細胞内伝達系を介して、グル夕ミン酸の分泌を促進させ、分泌されたグルタミン酸は、 AMP A/カイネート型グルタミン酸受容体及び NMDA型グルタミン酸受容体を活性化させ、これらの受容体が、カルシウムイオン（Ca²⁺) 及びナトリウムイオン（Na+) を細胞内に流入させることにより神経伝達が促進するを見いだした。

シナプス後電位は本発明に係る物質の存在により増強されるシナプス後電位は、選択的 P K C阻害剤の存在下ではその増強が認められなかつたことからもこのことが示唆される（表 5) 。

また、本発明は、 PKCの活性化経路を長期間活性化させ、シナプス前 nACh受容体を長期間活性化させることにより、海馬神経伝達を長期間改善させることを特徴とする向知性薬に関するものである。

本発明に係る物質による神経伝達の増強に n AC h受容体が関与していることは、シナプス後電位に対して —ブンガ口トキシン（ひ一 BuTX) による後電位の抑制により（表 3) 示され、また、 PKC活性化経路の長期活性化と nACh受容体の長期活性化の相互作用により、海馬神経伝達が長期間改善することが示された。このことより、本発明に係る物質は、 PKCの活性化経路の長期活性化と n A C h受容体の長期活性化の相互作用により海馬神経伝達を改善する、向知性薬であるということができる。また、本発明は、 PKCの活性化経路を長期間活性化させ、シナプス前ニコチン性ァセチルコリン（nACh) 受容体を長期間活性化し、グルタミン酸の分泌を長期間増大させることにより、海馬神経伝達を長期間改善させる物質を有効成分とする向知性薬に関するものである。

本発明に係る物質による神経伝達の増強に n AC h受容体が関与していることは、シナプス後電位に対してひ —ブンガロトキシン（ひ — BuTX) によるシナブス後電位を強く抑制したこと等（表 3) より示唆され、また、 PKCの長期間活性化と nACh受容体の長期間活性化の相互作用により、グルタミン酸の分泌の長期間の促進をもたらすことも明らかにされた（表 1 1 ) 。このことより、本発明は、上記の経路により、最終的に海馬神経伝達を長期間改善させる物質を有効成分とする向知性薬に関するものであるということができる。

本発明は、電気刺激を必要としない L T P様作用を誘発する物質を有効成分とする向知性薬に関するものである。

ここで、 LTPとは、 l ong t e rm p o t e n t i a t i onの略であり（以下、 LTPと略す。）、脳神経の伝達が長期間活性化される状態をいい、より具体的には、高頻度の電気刺激（テタヌス刺激）をシナプス前線維に加えた後に、単一刺激を加えると、テ夕ヌス刺激以前よりも大きなシナプス後電位が長時間（0. 5〜1 0時間）にわたつて観察される現象をいい、テタヌス刺激が長期にわたりシナプス伝達の効率を促進することをいう（新—脳のレセピター、小川紀雄著、世界通信社、 296— 299 ) 。

また、ここで LTP様作用とは、本発明に係る向知性薬により誘発される L TPに似たシナプス後電位が長時間にわたって観察される現象をいい、この場合、本発明の向知性薬単独で誘発することができ、テタヌス刺激を与えることを必要としない点において顕著な相違がある。また、その後に誘導されるシナプス後電位の長期間にわたる活性化は同様に起こすのであるが、シナプス後電位が誘発されるまでの生化学的な過程については、同一であるか否かは不明である。すなわち、 L T P作用と L T P様作用が、同一の反応であるか否かは明らかではないが、本発明に係る物質は L T P作用と類似したシナプス後電位の長期間の増強を、テタヌス刺激なし（本発明に係る物質の単独処理）で起こす点に特徴がある従って、 L T P作用は、記憶や学習等の中枢神経系の可塑性形成過程のモデルである神経伝達の長期増強と考えられており、てんかん、虚血性脳障害、ァルツハイマー病等のさまざまな神経精神疾患の発症に関与するとされていることから、 L T P様作用も同様のことが想定される。従って、本発明に係る L T P様作用を誘発する物質は、これらの神柽、精神疾患の治療薬 ·予防薬となる可能性がある _c また、上記の本発明に係る向知性薬は、慢性硬膜下血症による痴呆症に対する治療薬、水頭症による痴呆症に対する治療薬として有用である。

慢性硬膜下血症による痴呆症や、正常圧水頭症による痴呆症においても、脳の神経伝達が損なわれているか、或は、機能低下が起こっていると考えられるため、本発明の向知性薬は、神経伝達を長期間にわたり改善することが期待できることから、かかる疾病の予防薬又は治療薬として十分に期待できる。

上記の本発明向知性薬の有効成分としては、次の一般式（ 1 ) ：

[式中、 Rは水素原子または水酸基を示し、

R ¹ は水素原子またはメチル基を示し、

R ² はピリジル基または 1〜3個の同一又は異なる置換基で置換された置換フェニル基を示す。フニル基上の置換基としては、

ハロゲン原子、

トリフルォロメチル基、

ニトロ基、 1〜 4個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキル基、

1〜 7個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキルメルカプト基、一般式— S_ (CH₂) _n— CH (R³) (R⁴) [式中の nは 1又は 2を示し、 R ³ は水素原子又はメチル基を示し、 R ⁴ は水酸基又は一般式 -N (R⁸) (R⁹) (式中の R⁸ は水素原子又はメチル基を示し、 R⁹ はメチル基、ベンジル基、又は置換ベンジル基を示し、あるいは R⁸ 及び R⁹ がー緒になって式中の窒素原子と共に置換ピロリジン環を示す。）

で表されるァミノ基を示す。 ]

で表される置換アルキルメルカプト基、

次の一般式： — C 00 (CH₂) ₂— N (R⁶) (R⁷) (式中の R^s及び R⁷ はそれぞれ独立に水素原子、メチル基、又はェチル基を示す。）で表される置換ァミノエトキシカルボニル基からなる群から選定する]

で表される 2—才キソ— 1一ピロリジニルアルキルカルボン酸ァミド及びその製薬上許容できる酸付加塩が挙げられる。

フエニル基の置換基の具体例としては、塩素原子、又はフッ素原子等のハロゲン原子；メチル基、ェチル基、 n—プロピル基、 s e c—ブチル基、又は n—ブチル基、などのアルキル基；メトキシ基又はイソプロポキシ基などのアルコキシル基、メチルメルカプト基、 n—プロピルメルカプト基、イソプロピルメルカプト基、 s e c—ブチルメルカプト基、又は n—へプチルメルカプト基などのアルキルメルカプト基； 2—ヒドロキシプロピルメルカプト基、 2— （N, N—ジメチルァミノ） —プロピルメルカプト基、又は 2— (N—メチル—N—ベンジルァミノ）ーェチルメルカプト基等の置換アルキルメルカプト基；一般式：一 S— (CH₂) _n— CH (R³) — N (R⁸) (R⁹) において式中 R⁹ で表される置換べンジル基がメトキシ基で置換されたべンジル基である、例えば、 2— N —メチル一 N— （ 3, 4—ジメトキシベンジル）一ァミノ）一ェチルメルカプト基などの N—メチル— N—ベンジルァミノアルキルメルカプト基；一般式： -S - (CH₂) _n-CH (R³) — N (R⁸) (R⁹) において式中 R^s 及び R⁹ が示す置換ピロリジン環が 2—ォキソ基で置換されたものである、例えば、 2— ( 2一ォキソ一 1 ―ピロリジニル）ーェチルメルカプト基などの 1 一ピロリジニルアルキルメルカプト基；及び 2— (N, N—ジェチルァミノ） —エトキシカルボニル基等を挙げることができる。 R² で表されるピリジル基、又は 4一ピリジル基のいずれを用いてもよい。

本発明の医薬の有効成分として好適な化合物の例として，

1. 2—ォキソ— 1 —ピロリジニル酢酸 2， 6—ジメチルァニリド； 2. 4—ヒドロキシ一 2—ォキソ一 1 —ピロリジニル酢酸 2， 6—ジェチルァニリド；

3. 4—ヒドロキシー 2—ォキツー 1 —ピロリジニル酢酸 2， 6—ジメチ儿ァニリド；

4. 2— [2—ォキソ一ピロリジニル] プロピオン酸 N— 3 _ピリジニルァミド、；

5. 2—ォキソ一 1 —ピロリジニル酢酸 4一イソプロピルメルカプトァニリ K；

6. 2 - [ 2—ォキソ一 1 —ピロリジニル] — 1 —プロピオン酸— 4— ( 2— プチルメルカプト） —ァニリド；

7. 2— [ 2—ォキソ一 1 —ピロリジニル] —プロピオン酸一 4—イソプロピルァニリド；

8. 2— [2—ォキソ一 1 一ピロリジニル] 一プロピオン酸— 2， 4一ジメチル了ニリド； 9. 2— [2—ォキソ一 1 —ピロリジニル] —プロピオン酸一 2， 4， 6—メトキシー 5 —メチルァニリド；

1 0. 2— [ 2—ォキソ一 1 一ピロリジニル] —プロピオン酸— 2—メトキシ一 5 一メチルァニリド；

1 1. 2— [ 2—ォキツー 1 —ピロリジニル] —プロピオン酸ー 2, 6—ジクロロァニリド；

1 2. 2—ピロリドンァセ夕ミド；

1 3. 1 —ァニソィル一 2—ピロリジノン；及び

1 4. 4 ーヒドロキシー 2—ォキソー 1 一ピロリジンァセ夕ミド；

などを挙げることができる。上記化合物のほか、特公平 3 — 4 6 4 6 6号公報の第 1 0 1 9頁の表 3に開示された化合物も代表的化合物である。

上記の化合物のうち特に好適な化合物は、 2—ォキソ— 1 —ピロリジニル酢酸 — 2， 6 —ジメチルァニリド [N— ( 2， 6 —ジメチルフエニル）一 2— ( 2— ォキソ一 1 —ピロリジニル）一ァセタミド、一般名ネフィラセタム] ； 2—ピロリドン一ァセタミド； 1 —ァニフィル一 2—ピロリジノン；及び 4 —ヒドロキン — 2—ォキソ一 1 —ピロリジンァセ夕ミドである。

上記の化合物はいずれも公知であり、特開昭 5 6 - 2 9 6 0号公報、特開昭 6 1 - 2 8 0 4 7 0号公報、特開平 4 - 1 6 0 4 9 6号公報等に記載されている方法に従って容易に製造可能である。なお、特公平 3— 4 6 4 6 6号公報に開示された上記ピロリジニルァセトアミド誘導体については、脳機能改善作用（特公昭 6 2 - 5 4 0 4号）、アルツハイマー型痴呆改善作用（特開平 5 - 1 6 3 1 4 4号公報）、脳血管性痴呆改善作用（特開平 5 - 1 6 3 1 4 5号公報）、及び E Lマウスでの抗ケィレン作用（中本ら、第 1 7回日本神経学会大会、 1 9 9 3年、 1 2月 7日〜 9日、名古屋巿）プログラム抄録集第 8 4頁、演題番号 P 1 A 2 0 ) 、ミトコンドリァ膜安定化作用（特願平 8 - 2 6 0 6 4 9号）などの生物学的作用が知られているが、この化合物の LTP様作用（テ夕ヌス刺激なしでの作用）は、知られていない。

上記一般式（ 1 ) で表される化合物は、前記の〔 1〕〜〔7〕の作用を有するので、脳神経伝達物質の長期改善剤；グルタミン酸分泌の長期増加；水頭症、慢性硬膜下血症等に起因する痴呆症の治療薬；電気刺激を必要としない L TP様作用の誘発剤；及びプロテインカイネース Cの長期増強剤として有用である。

このうち、ネフイラセ夕厶は、上記の用途に対して特に有用である。

すなわち、ネフイラセタムは P K C活性化経路の長期活性化剤として特に有用である。すなわち、前シナプス nACh受容体は、 PKCにより長期燐酸化を受けて長期間活性化され、細胞内伝達系により、グルタミン酸の長期遊離増大へと導き、 AMP A/カイネート型グルタミン酸受容体、及び、 NMDA型グルタミン酸受容体を介して、海馬 C A 1領域の神経伝達を促進することにより、痴呆症の治療薬となる。

ネフイラセタムは、電気刺激を必要としない L T P様作用の誘発剤として有用である。

また、ネフイラセタムは、 PKCの活性化経路の長期間活性化と、シナプス前 nACh受容体の長期活性化の相互作用による、分泌グル夕ミン酸の長期間増加剤としても有用である。

すなわち、ネフイラセ夕厶は、後述する実施例で示すように、 PKCを長期間活性化し（表 5 ；表 7) 、シナプス前 nACh受容体を長期間活性化し（表 5 ；表 8 ;表 9 ;表 1 7) 、メッセンジャーであるグルタミン酸の分泌を長期間増大させる（表 1 1 ) 化合物である。

ネフイラセタムは、プロテイン力イネ—ス Cの活性化経路の長期活性化と、シナプス前ニコチン性アセチルコリン（nACh) 受容体の長期活性化の相互作用による、脳神経伝達の長期改善剤として有用である。

ネフイラセ夕厶は、後述する実施例で示すように、 PKCを長期間活性化し (表 5, 表 7) し、シナプス前 nACh受容体を長期間活性化し（表 5 ；表 8 ；表 9 ；表 1 7 ) 、メッセンジャーであるグル夕ミン酸の分泌を長期間増大させ (表 1 1 ) 、神経伝達を改善することを示した。従って、ネフイラセタ厶は、月 K の神経伝達を長期間にわたり改善する作用を有する薬剤である。

ネフィラセ夕厶を投与した動物においても、前記の効果が認められたことから (表 2 4 ) 、本発明に係る化合物の作用のヒ卜での有用性が示唆される。

また、この神経伝達の長期改善は、 L T P作用に類似することから、 L T P様の作用であると想定される。

ネフイラセタムは、 P K Cの活性化経路を長期間活性化させることによる、電気刺激を必要としない L T P様作用の誘発に基づく、脳の慢性硬膜下血症による痴呆症に対する治療薬として有用である。

ネフイラセタムは、 P K Cの活性化経路を長期間活性化させることによる、電気刺激を必要としない L T P様作用の誘発に基づく、水頭症による痴呆症に対する治療薬として有用である。

水頭症においては、特に、正常圧水頭症に対する痴呆症に対する治療薬として有用である。

ネフイラセ夕厶は、 P K C活性化経路の長期活性化と、シナプス前 n A C h受容体を長期活性化の相互作用により、グルタミン酸分泌を長期間増大させ、海馬神経伝達を長期間改善させることを特徴とする向知性薬としても有用である。この場合の向知性薬とは、各種の痴呆症に対する治療薬、アルツハイマー病薬、脳代謝機能の促進又は改善を必要としている患者の治療薬をいう。

ネフイラセ夕厶は、グル夕ミン酸分泌を長期間増加剤として有用である。

ネフイラセタ厶は、神経伝達経路のメッセンジャーであるグル夕ミン酸の分泌を長期間にわたり増加させることが明らかにされた。従って、ネフイラセタ厶は、分泌グル夕ミン酸の長期間に渡る増加剤であるということができる。

この分泌グル夕ミン酸の増加により、海馬神経伝達を長期間改善させることができ、脳における神経伝達が低下した症状を有する患者、脳における神経伝達が一部欠損した患者、海馬における神経伝達の長期間の改善を必要とする患者にとつて、有用な治療薬，予防薬となりうる。

本発明の医薬の有効成分は、遊離形態の化合物又は生理学的に許容される塩の形態の化合物のいずれを用いてもよい。また、その任意の水和物若しくは溶媒和物を用いることもできる。生理学的に許容される塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の鉱酸塩或は M酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クェン酸塩、シユウ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、 p—トルエンスルホン酸塩、 1 0—カンファースルホン酸塩等の有機酸塩などの酸付加塩を挙げることができる。

本発明の医薬の有効成分として用いる化合物が 1又は 2以上の不斉炭素の立体配置は特に限定されず、任意の光学活性体、光学異性体の任意の混合物、又はラセミ体のいずれを用いてもよい。また、 2個以上の不斉炭素に基づくジァステレォ異性体の任意の混合物を用いてもよい。

本医薬の投与形態は特に制限されず、経口的 ·非経口的に投与することができる。本発明の医薬としては、有効成分である化合物、例えば、上記式（ I ) の化合物をそのまま用いてもよいが、有効成分の化合物と薬理学的及び製剤学的に許容しうる製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態で提供されることが好ましい。薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば、賦形剤。崩壊剤、ないし、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コ-ティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、 p H調製剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。経口投与に適する製剤の例としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、又はシロプ剤等を挙げることができる。非経口投与に適する製剤としては、例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、又は貼付剤等を挙げることができる。なお、本発明の医薬には、 1種又は 2種以上の有効成分を配合することが可能である。本発明の医薬の投与量は特に限定されず、治療又は予防の目的、疾患の種類、患者の年齢や症状、投与経路などの種々の条件に応じて適宜の投与量を選択することが可能である。一般的には、経口投与の場合に成人一日当たり約 1 9mg〜 1， 0 0 Omg程度、好ましくは、約 6 0〜9 0 Omg程度である。なお、本発明に特に好適に用いられる 2—ォキソ— 1 一ピロリジニル酢酸 2, 6一ジメチルァニリド [一般名：ネフイラセタム] の急性毒性は 2, 0 0 5 mg/k g (雄性マウス、経口）であり、安全性が高いことが証明されている（特開平 5 — 1 6 3 1 4 4号公報）。実施例

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。

実施例 1

1. [シナプス後電位の測定] (表 1 )

標準手法によってラットの脳から海馬切片（4 0 0 m) を調製した。得られた切片を記録チャンバ一に移し、 9 5 %酸素及び 5 %炭酸ガスで飽和した 3 4での人工脳脊髄液（mM単位で、 1 2 5mM塩化ナトリウム、 5mM塩化力リゥ厶、 1. 2 4 mM燐酸二水素カリウム、 1. 3mM塩化マグネシウム、 2mM塩化力ルシゥム、 2 6 mM炭酸水素ナトリウム、 1 OmMグルコース）を連続的に灌流させた。シ一ファー側枝 Z交連線維に対して電気刺激（ 0. 2 Hz) を行い、 CA 1領域の錐体細胞層により樹状突起のフィ -ルド興奮性シナプス後電位を記録した（表 1 ) 。この結果、 1 Mのネフイラセ夕厶処理でシナプス後電位の上昇がみられた。

標準手法によってラットの脳から海馬切片（ 4 0 0 urn) を調製した。得られた切片を記録チャンバ一に移し、所定量の酸素及び炭酸ガスで飽和させた人工脳脊髄液で連続的に灌流させた。ネフイラセタムの 0. 0 1 Mから 1 0 / Mの濃度で処理すると、海馬 C A 1領域から誘発されたシナプス後電位を用量依存的に促進させた（表 2) 。最大の促進は 1 //M処理後 6 0分に見られ、約 1 5 0 % であった（表 1，表 2) 。この効果は、神経系の α 7 n AC h受容体の選択的拮抗剤であるひ一ブンガ口トキシン（ひ— B uTX) で抑制された（表 3) 。また、この効果は神経系 n AC h受容体の非選択的拮抗剤であるメカミラミンで抑制されたが、抑制の程度はひ一ブンガ口トキシンの場合よりも少なかった（表 4) 。従って、ネフイラセ夕厶によるシナプス後電位の持続的な促進が神経系 n A C h 受容体を介して起こることが示唆された。

ネフイラセタ厶は、 PKCの選択的阻害剤GF 1 0 9 2 0 3 Xの存在下では全くシナプス後電位を増強しなかった（表 5 ) 。これに対して、 c AMP依存型 PKAの選択的阻害剤 H 8 9にはこのような効果はなかった（表 5) 。この結果より、ネフイラセ夕厶によるシナプス後電位の長期増強が P K Cの活性化によつて制禦されることが示された。

ラット海馬スライスのシナプス後電位に及ぼすネフイラセ夕ムの影響（経時変化）時間シナプス後電位（％ of the original amplitude)

(分）平均値土 SD処理 (分）平均値土 SD処理

-30 100±3 6 131土 9

- 10 100±0 nef . 8 135土 9

-9 108 ±1 ― nef. 10 143土 2

- 8 109±7 ― nef. 15 144土 1

- 7 111±2 ― nef. 20 142±12

-6 122±8 ― nef. 25 144土 8

-5 133±6 nef. 30 140±10

- 4 127±4 nef. 35 141±10

-3 132±7 ― nef. 40 155土 5

- 2 132±7 nef. 45 153士 9

-1 131±9 nef. 50 155±10

0 131±8 55 156土 7

2 136±9 60 156士 6

4 129±6

"nef." は、 1 /zMのネフイラセタムで処理を意味する, nは 7である。 2 ラット海馬スライスの後シナプス電位に及ぼすネフイラセタムの影響（用量依存性） nef iracetam 後電位

(% of original amplitude) 平均値土 S D

0.001 95土 6

0.01 94土 5

0.1 111土 9

1 156土 6

10 144±11

(nは 5〜7)

ラット海馬スライス切片において、ネフイラセタム処理で増強されたシナブス後電位に及ぼすひーブンガ口トキシンの影

電位 {% of the original amplitude) 時間平均値土 SD処理時間平均値土 S D処理

(分） (分）

-30 100±5 3 88土 6 —BuTX

-10 100±0 ― nef. 4 79±10 BuTX

-9 114±4 ― nef. 5 77土 6

-8 121±1 ― nef. 6 86土 7

-7 121±5 <- nef. 7 84土 8

- 6 121±6 ― nef. 8 86土 3

-5 129±9 nef. 9 89土 4

- 4 129±5 ― nef. 10 96土 9

-3 132±3 ― nef. 11 144土 5

-2 132±7 nef. 12 132土 3

-1 132±4 nef. 13 139土 9

0 135±6 —BuTX 14 140土 6

2 90±5 —BuTX 15 147土 7 nef. ； 1 Mのネフィラセ夕厶、

BuTX； ΙΟΟηΜのひ—ブンガ口トキシン- n ； 5 ラット海馬切片を用いたネフイラセタムで増強されたシナブス後電位に及ぼすメカミラミンの影響時間麦電位（％ of the original amplitude)

(分）平均値土 SD処理 (分）平均値士 SD処理

-30 100士 7 3 124土 8 *-meca.

-10 100土 0' nef. 4 129土 4 -meca.

-9 108土 7— nef. 5 129土 9

-8 113士 5- nef. 6 137土 9

-7 123±10- nef. 7 137土 5

-6 136±10- nef. 8 139土 5

-5 137土 9' nef. 9 143土 5

- 4 137土 9' nef. 10 145土 6

-3 140±10- nef. 11 150土 7

-2 139土 8- nef. 12 150土 8

- 1 141土 7· nef. 13 153土 9

0 144土 8- ^-meca. 14 154土 5

1 128±10- ^-meca. 15 155土 4

2 123土 7· ^-meca.

nef. ； 1 Μのネフィラセ夕厶、

meca. ； 3 Mのメカミラミンを、 nは 5である,

ラット海馬スライス切片を用いた、ネフイラ

電位増強作用に及ぼす P K C阻害剤又は P K A阻害剤の影 Ϊ シナプス後電位 of the original amplitude)

GF109203X H-89

(分）平均値土 SD 平均値土 SD

-30 102土 3 103土 4

O C

-10 100土 0 O C nef. 100土 0— nef.

-9 94.2土 6.8—个 nef a. 109±2.2 —nef.

CD

-8 96.2土 9.5— nef. 112±4.6 ^nef.

- 7 99.7土 11.2 ― nef. 116±6 — nef.

-6 99.4土 12.1 ― nef. 116±7.2 —nef.

-5 105土 10.8 ― nef. 122±9.8 —nef.

-4 103.4土 128±11.35 —nef.

-3 102 5 + 132±17— nef.

- 2 101.1土 12.5 ― nef. 136±16.3^nef.

- 1 108.2土 13.6 ― nef. 142±9.8 —nef.

0 106土 11.4 144±8.3

2 105.5土 11.7 145±7.3

4 99.25土 11 150±7

6 105.5土 12 151±6.5

8 104.5土 12.7 154±9

10 108.8土 11.6 155±8

nef. ； 1 Mのネフィラセ夕厶、 nは 5である。

GF109203X； PKCの選択的阻害剤。

H - 89； PKAの阻害剤（N- [2- (p- Bromocinnamylamino)ethyl] -5-isoquinolinesulfonamide · 2HC ) 表 6 ラット海馬切片スライスを用いたペアパルス処理によるシ

ナプス後電位に及ぼすネフィラセタムの影響 interpulse 促進（％ of the 1st pulse)

間隔

(秒/ 1000) ネフイラセタム（ネフイラセタム（+ )

平均値土 SD 平均値土 SD

50 164±22 125±17

100 134±21 116±18

150 124±17 112±15

nは 5である。

ネフィラセタム投与前と 1 0分間の投与時に、スライスに対して 5 0〜 1 5 0 m s e cの様々な時間間隔のぺァパルスを与ぇた。ネフィラセタム投与後のスライスでは、ペアパルスによる促進が見られた。即ち、最初のパルスで得られた反応の約 1 2 0 %にまで次のパルスによる反応が増強した。ただし、ネフイラセ夕ム処理前よりは一貫して低いパルスであり（表 6) 、おそらくネフイラセタムが興奮性神経伝達物質のグル夕ミン酸遊離を最大限にまで高めていることによるものと思われる。

実施例 2 [インビト口転写及びァフリカツメガエル卵母細胞への翻訳（表 7〜 1 0 ；図 3) ]

ラットひ 4 32受容体および 7 受容体、 G l uR l , 2， 3受容体、および NP 1 5 2、 NP 1 5 3に対する mRN Aを既述のとおり構築した。アフリカッメガエル卵母細胞を手技にて卵巣から分離し、コラゲナーゼ（ 0.

で処理後、ノくース液 [B a r t h S o l u t i o n ; 塩化ナトリウム（ 8 8 mM) 、塩化力リウ厶（ 1 mM) 、炭酸水素ナトリウム（ 2. 4 mM) 、硫酸マグネシゥム（ 0. 8 2mM) 、亜硝酸カルシウム（ 0. 3 3 mM) 、塩化カルシゥム（ 0. 4 1 mM) およびトリス（ 7. 5mM； pH 7. 6 ) ] 中でー晚インキューべ一トした。卵母細胞にひ 4 2またはひ 7の mRNAを注入し、 1 8 °C でインキュ —ベ— トした。ある場合には、 N P 1 5 2および N P 1 5 3を a β 2およびひ 7受容体と一緒に発現させた。注入を終えた卵母細胞をィンキュペートし、 2〜7日後に記録チェンバーに移し、室温（ 2 0から 2 2°C) で標準力エル用リンゲル液 [塩化ナトリウム（ 1 1 5 mM) , 塩化カリウム ( 2 mM) , 塩化カルシウム（ 1 . 8 mM) ， H E P E S ( 5 mM, p H 7. 0) ] で常時灌流した。内因性のムスカリン性 AC h受容体の影響を取り除くために、細胞外液に 1 Mのァトロピンを添加した。 AC hで活性化された電流を 2電極電位固定法により増幅器（G e n e C l amp— 5 0 0、 Ax o n I n s t r um e n t, I n c. U S A) で記録した。電流解析にはマイクロコンピュー夕一と p C l ampソフトウェア (Ax o n I n s t r um e n t , I n c. ； V e r s i o n 6 ) を使用した。その結果、ネフイラセタムが実際に n AC h受容体に作用するかどうかの確認を試みた。また、アフリカッメガエル卵母細胞に 7およびひ 4 2受容体を発現させ、 AC hにより電流を誘発した。また、ひ —ブンガ口トキシンはひ 7受容体を強く抑制し、メカミラミンは、 a 4 β 2受容体の電流を強く抑制した（図 3) 。

従って、これらの受容体が海馬に存在し、ネフイラセ夕厶によるシナプス後電位の促進に関与するという見解が支持される。

更に、ネフイラセタム処理（ 1 M) は時間依存的に AC h誘発電流を増強し、処理後 6 0分の時点で 4 /82受容体で 1 8 0 %、 7受容体で 1 9 5 %のレべルまで達した（表 7) 。

表 7 アフリカッメガエル卵母細胞に発現させたひ 7及びひ 4 /S 2 受容体電流におけるネフイラセタムの影響（経時変化）

% of the original amplitude

ネフイラセタム（+ ) ネフイラセ夕厶（一）時間 a A β 2 a I a A β 2 a 7

(分）

平均値土 SD 平均値土 SD 平均値土 SD 平均値土 SD

(n= 8) (n= 8) (n= 5) (η= 5)

- 30 128±5 100±2

-20 116±4 100±3

-10 100±0 100±0 100±0 100±0

0 108.9±4.2 139.3±11.9 98±3.1 100±1

10 119±10.6 155.3±16 97±4·2 99±2

20 129.4±13.2 176.6±5.1 96±3·6 99±3

30 160.7±12.6 194.6±8.8 95±5.6 98±2

40 172.2± 14.2 193.6±2.2 95±2.1 98±1

50 178.8±12.2 192.1±2.8 94±3.4 98±4

60 180.1±9.3 195±6.3 94±2.2 97±3

AC h誘発電流の増強は、ひ 4 /S 2受容体ではネフイラセタムの 0. 0 0 0 1 //M以上の濃度で見られ、ひ 7受容体では 0. 0 1 M以上の濃度で見られた。誘発電流の最大値は、前者ではネフイラセ夕ム 0. 1 /M、後者では 1 Mの濃度で達した（表 8) 。ネフイラセ夕ムは、卵母細胞の n AC h受容体チャンネルから流入するカルシウムにより誘発される塩素イオン（C 1— ) 電流には影響を与えなかった（デ一夕を示さず）。このことはネフィラセタムが nAC h受容体には作用するが、カルシウムにより活性化される塩素イオンチャンネルには作用しないことを示している。また、ひ 4 2受容体およびひ 7受容体の両者で、ネフィラセタム投与後も AC hの用量反応曲線はシフトしなかった（表 9 ) 。

表 8 アフリカッメガエル卵母細胞膜上に発現させたひ 7

及びひ 4 β 2受容体におけるネフィラセタムの影響

(用量反応性）ネフイラセ夕ム % of the original amplitude

a ^ β 2 a I

平均値土 SD 平均値土 SD

0.0001 100.2±15.5

0.001 150.3±13.6

0.01 211.6±20.5 97.4±5.5

0.1 225.1± 18.9 181.4±10.8

1 160.7±12.6 194.6±8.8

10 155.9±17.6 116.1±7.2

nは、 5〜8。

このことは、ネフイラセタムによる AC h誘発電流の増強が、 AC hに対する親和性を変化させたからではないことを意味する。この増強作用は、どちらの受容体においても GF 1 0 9 2 0 3 Xで完全に抑制された。これはネフィラセタムが P K C活性化を介して電流を増強したことを示唆する。

これに加えて、活性型の PKC抑制べプチド（NP 1 5 2 ; ひ PKC I ) を同時発現させたひ 4 β 2受容体やひ 7受容体では、ネフィラセタムによる電流の増強は見られなかった（P e u n o v a, N. 等、 Na t u r e 3 6 4, 4 5 0 - 4 5 3, 1 9 9 3 ) 。

一方、不活性型の PKC抑制ペプチド（NP 1 5 3 ； i PKC I ) を同時発現させたひ 4 32やひ 7受容体では、前者で 1 6 9. 3 %、後者で 1 9 3. 6 %の増強が見られた（表 1 0) 。この結果は、ネフイラセタムが PKC経路に作用し、 PKCの活性化によって A C h誘発電流の持続性増強を引き起こす証拠となるものである。

表 9 ァフリカツメガエル卵母細胞膜上に発現させたひ 4 β 2受容体 (：対して AC h誘発電流に及ぼすネフィラセタムの処理の影響 normalized response (%)

AC h a A β 2 a A β 2 7 a 7 nef. (-) nef. ( + ) nef. (—） nef. ( + 平均値平均値平均値平均値

0.1 0 0 0 0

1 3 2 0.5 1.5

10 43 36 1 3

100 75 66 28 35

1000 100 100 100 100

(十） nef. ；ネフィラセ夕厶を添加（ 1 〃M)

(-) nef. ネフイラセタムの添加なし。

nは 5である。

0 アフリカッメガエル卵母細胞のネフイラセ夕厶の AC h 誘発電流の増強に及ぼす選択的 P K C阻害剤及び P K C 抑制べプチドの影響

% of the original amplitude a A β 2 a ( 平均値土 SD 平均値土 SD nef. (一） 95±5.6 98±2 nef. (十） 160±5.6 194.6±8.8 GF109203X 79.3±15 102.2±9.6 GF109203X + nef. 80·5±10 108±6 NP152 78±12.5 95±3.1

NP152 + nef. 78.1±10 96.1±6 NP153 80±9 97±5

NP153 十 nef. 169.3±12 193.6±17.7 Staurosporine 90±8 101±8 Staurosporine + nef. 93±13 103±12 H89 98.8±12 99.4±5.8

H89 十 nef. 163.9±20 180.4±19.6 NP210 95.5±8 99±12

NP210 + nef. 160±18 188±21 NP211 94±11 98±12

ΝΡ2Π + nef. 162±21 196±22 GDP SS 96 ±10 100±11

GDP^S +nef. 185 ±14 201±18 nef. ； 1 のネフィラセタム、

GF； ΙΟΟηΜの GF109203X；

NP152；ひ- PKC ， PKC抑制べプチド

NP153； i - PKdPKC抑制 (不活性型) ぺプチド

HP89；プロティンキナーゼ A(PKA)の選択的阻害薬

(N-[2-ip-Bromocinnamylamino)ethyl]-5-isoquinol inesulf onamide

■ 2HC )

NP210；活性型 PKA 抑制べプチド

NP211；非活性を PKA 抑制べプチド

GDP/SS；広汎な G蛋白質抑制薬

nは 6から 8である。

PKA に関連する H- 89， NP-210, NP- 211の存在下、ネフイラセタムの著明な増強効果が見られた。また、 G蛋白質（GTP結合蛋白質）の抑制剤（GDPSS) の存在下でも同様な効果が見られた。一方、 PKCの選択的阻害薬であるスタウロスポリン（Staurosporine) 存在下ではネフイラセタムの効果は全く見られなかった。以上のことより、ネフィラセタムの作用は PKCを介したものであることが確認された。

実施例 3 [ネフィラセタムによる海馬スライスからのグルタミン酸遊離促進] モルモット海馬スライスを用いて、グル夕ミン酸の遊離をテト口ドトキシン

( 0. 5 ntM； TTX) の有無、電気刺激（ES) の有無の条件下で行った。また、海馬スライスは、一ブンガ口トキシン（ 5 0 n M ) 又はメカミラミン

(m e c amy 1 am i n e ； MCAと略す； 3〃M) の存在下または非存在下で、ネフイラセタム（ 1 /zM) を含む標準液中で定量試験を行った。各々のバ一は、独立した実験の平均値（土 SD) を示す。有意差はフィッシヤーの最少二乗法による ANNOVAによった。

海馬スライスを一対の銀電極（ 1 0 H z， 5 V, 0. 1 m s e c i n d u r a t i o n) 1分間隔で 1 0分間刺激した。あるスライスは、テトロドトキシンの存在下又は非存在下で、標準 AS CF (人工髄液） 9 5 % 酸素、 5 % 炭酸ガス 3 6 °Cの条件下でインキユーべィトした。他のスライスは、ひ一ブンガ口トキシン又はメカミラミンの存在下又は非存在下で、ネフィラセ夕厶を投与した。グルタミン酸のメディウ厶中への分泌量は、 HPL Cにより測定した。表 1 1 一 1 グルタミン酸の分泌分泌グル夕ミン酸]

処理

nmo /mg protein/lOmin.

1 St(ES-) 0.86±0.3

2 St(ES + ) 2.03±0.4

3 St(ES + ) +テトロドトキシン 0.85±0.3

4 St(ES + ) +ネフィラセタム 3.23± 0.5(a)

5 St(ES + ) +ひ一ブンガ口トキシン 1.68±0.2(b)

6 St(ES + ) +メラミラミン 2.45±0.3(c)

(a) (2)と（4)の対比において、 0.01の有意差。

(b) (2)と（4)の対比において、 0.01の有意差。

(c) (6)と（4)の対比において、 0.1の有意差。

St(ES-) ；電気刺激なし： SKES + ) ；電気刺激有り。

海馬スライスを用いた実験では、電気刺激による脱分極で興奮性伝達物質のグル夕ミン酸が分泌された。ネフイラセタムの 1 Mの濃度の処理により、グルタミン酸の分泌を有意に増加させた（表 1 1 一 1 ) 。ネフィラセタム処理による (グルタミン酸の分泌）増加は、明らかにひ一ブンガ口トキシンやメカミラミンで抑制された（表 1 1 — 1 ) 。この結果は、ネフイラセタムが神経系の nAC h 受容体を活性化し、グルタミン酸の分泌を増強することを示すものである。表 1 1 - 2

ラット海馬 CA1領域から記録されるニコチン感受性微少興奮性シナブス後電流 (mEPSC) のネフィラセタムによる増強効果及びその効果に対するひ- BuTX, MCA の作用

時間（秒） mEPSCCnormal ized frequency)

平均値土 SD

2 0.92土 0.12

4 0.93土 0.09

6 0.90土 0.09

8 0.86土 0.08 10 0.90土 0.06

12 0.90土 0.05

14 0.90土 0.05

16 0.93土 0.06

18 0.93土 0.05

20 0.97土 0.04

22 0.97土 0.04

24 0.96土 0.03

26 0.97土 0.02

28 0.98± 0.02

30 0.98土 0.01

32 0.97土 0.04

34 0.92土 0.05

36 0.93土 0.04

38 0.96土 0.03

40 0.95土 0.03

42 0.97土 0.03

44 0.96土 0.03

46 0.98土 0.02

48 0.99土 0.02

50 0.99土 0.02

52 .01土 0.01

54 .00土 0.01

56 .02土 0.01

58 .02士 0.01

60 • 00土 0 コチン添加（ 1秒間） [500nM ]

62 .29土 0.13

64 .25土 0.07

66 .25土 0.07

68 .27土 0.10

70 .33土 0.11

72 .32土 09

74 .36土 09

76 .34土 08

78 .34土 0.08

80 .34土 0.07

82 .34土 0.07

84 .36土 0.06

86 .37土 0.06

88 .38士 0.05

90 .38士 0.05

92 .42土 0.06

94 .38士 0.05

96 .38土 05

98 .33土 06

100 .34土 06

102 .33± 06

104 .34土 04

106 .37土 0.04

108 .38土 0.04

110 .38士 0.04

112 .39土 0.04 114 1.39士 0.04

116 1.38土 0.04

77777777177777777777777777777777777777777818 1.37士 0.04

12^^^ 2 22223333344444555556677776667888889y99y02 0428046802468026480264268048026428064806 1.35土 0.04

ネフイラセタム [ 1 M] を 1 0分間（ 6 0 0秒間）適用する

その間記録せず。

以下 1 2分後（ 7 2 0秒後）から記録再開 c

ニコチン添加（ 1秒間） [500nM]

766666677766688 866688887777777 33332200031 959557680985524071 441098552. -64 460460802015土土土土土士土士土土士土士土士士土土土土土 ±±±土土土土士

ocoioooooooooooooooooooooooooooooooooooooo

ooooooooo loooloolollllloollloollloocoloco 398877^3888818873556630190087115719821456-

ニコチン添加 ( 1秒間） [500nM] -ひ- BuTX+MCA

-ひ- BuTX + MCA

-ひ- BuTX+MCA

-a- BuTX+MCA

- -BuTX + MCA

-α-BuTX+MCA

-α-BuTX + CA

-α-BuTX + MCA

-ひ- BuTX十 MCA

-α-BuTX+MCA 802 1.01土 0.04 —ひ- BuTX + MCA

804 1.00土 0.03 -BuTX + MCA

806 1.02土 0.04 — - BuTX + MCA

808 1.00土 0.03 —ひ - BuTX + MCA

810 1.01土 0.02 —ひ- BuTX+MCA

812 1.00土 0.04 —ひ- BuTX+MCA

814 0.99土 0.03 —ひ— ΒυΤ) (十 MCA

816 0.98土 0.03 —ひ -BuTX + MCA

818 0.97土 0.02 -a-BuTX + MCA

820 0.95土 0.04 —ひ一 BuTX + MCA

822 0.96士 0.06 —ひ- BuTX + MCA

824 0.98土 0.04 —ひ- BuTX + MCA

826 1.07土 0.05 ひ- BuTX + MCA

828 1.02土 0.04 —ひ- BuTX + MCA

830 0.90土 0.03 —ひ -BuTX + MCA

832 1.00土 0.03 —ひ - BuTX + MCA

834 0.96土 0.04 —ひ - BuTX + MCA

836 0.95土 0.02 —ひ- BuTX + MCA

838 0.98土 0.03 — - BuTX十 MCA

840 0.95士 0.04 —ひ- BuTX + MCA

a -BuTX：ひ —ブンガ口トキシン（50nM)

MCA：メカミラミン（3 M)

n=20

胎仔ラット脳の海馬 CA1領域から細胞を採取し、この細胞を 1 0〜 1 4日間培養し、初代神経培養系を作製した。この細胞にパッチクランプ法を適用し、内因性のニコチン感受性微少興奮性シナプス後電流（mEPSC) を記録した。はじめにニコチンによる内因性 mEPSCに対する作用を検討した。その結果、ニコチンによる増強効果が見られたことから、この培養系はニコチン受容体を介したシナプス伝達系が存在することが確認された。次にネフイラセタムを 1 0分間添加し、本薬を十分に洗浄した後、ニコチンを適用した。その結果、 mEPSCはニコチン単独の効果よりさらに増強した。続いてニコチン ACh受容体の阻害薬であるひ- BuTX + MCA存在下、ニコチンを適用したところ、 mEPSCはもとのレベルまで復した。これらのことから、ネフィラセタムのによる mEPSCに対する増強効果はニコチン ACh受容体を介したものであることが示唆された。

表 1 1 - 3

ラット海馬 CA1領域から記録されるニコチン感受性微少興奮性シナプス後電流 (mEPSC) のネフイラセタムによる増強効果及びその効果に対する GF109203X の作用

時間（秒） mEPSCCnormalized frequency;

平均値土 SD

2 1.02士 0.11 -GF109203Xを実験終了まで継続的添加 4 1.03士 0.09

6 1.00土 0.08

8 0.96土 0.06

10 1.00土 0.07

12 1.00土 0.05

14 1.00土 0.07

16 0.96土 0.04

18 0.93土 0.05

20 0.97土 0.04

22 0.95土 0.03

24 0.96 + 0.03

26 0.97土 0.05

28 1.02土 0.06

30 1.00土 0.04

32 0.97土 0.03

34 0.92土 0.02

36 0.93士 0.04

38 0.98士 0.04

40 0.97土 0.03

42 0.97土 0.04

44 0.96土 0.06

46 0.98土 0.05

48 1.02土 0.04

50 1.03士 0.05

52 1.01土 0.06

54 1.00土 0.04

56 1.02土 0.03

58 1.02土 0.04

60 1.00土 0.06 -ニコチン添加（ 1秒間） [500nM] 62 1.61土 0.12

64 1.51土 0.09

66 1.44土 0.06

68 1.41土 0.05

70 1.39土 0.10

72 1.46土 0.01

74 1.44土 0.01

76 1.39土 0

78 1.39土 0.04

80 1.32 + 0.02

82 1.28土 0.01

84 1.24土 0.01

86 1.27土 0.01

88 1.28土 0.02

90 1.27士 0.04

92 1.23土 0.04 94 1.12土 0.01

96 1.19土 0.06

98 1.22土 0.05

100 1.20土 0.05

102 1.33土 0.06

104 L27土 0.01

106 1.30士 0.01

108 1.34土 0.01

110 1.31土 0.01

112 1.30土 0.03

11 A 1.32土 0.03

116 1.34土 0.02

110 Q 1.36土 0.02

120 1.35土 0.03

ネフィラセタム [ 1 J M] を 1 0分間（ 6 0 0秒間）適用する。その間記録せず c ί

以下 1 2分後（ 7 2 0秒後) か ≡|J ^fc ¾ Si

ΤΎ Ι7Π 0

720 1.14土 υ· υυ ^ * i^ I 1 j

722 1.18土

724 1.12土

726 1.12土

728 1.02土 n u, 11

730 1.06土 0 u . 1 o \J

732 1.04土 0 11

734 1.01土 0.08

736 1.03士 0.01

738 1.15士 0.02

740 1.13土 0.05

742 1.13土 0.08

744 1.15土 0.08

746 1.20土 0.05

748 1.23土 0.07

750 1.19土 0.04

752 1.19土 0.04

754 1.20土 0.04

756 1.24土 0.05

758 1.24士 0.03

760 1.24土 0.03

762 1.24土 0.05

764 1.27土 0.05

766 1.28土 0.06

768 1.28土 0.06

770 1.26土 0.06

772 1.23土 0.04

774 1.23土 0.06

776 1.23土 0.07

778 1.23土 0.10 GF109203X： ΙΟΟηΜ

n=5

上述と同様な方法で、 PKCの選択的阻害薬である GF 1 0 9 2 0 3 X存在下、はじめにニコチンの効果を検討した。その結果、はじめにニコチンによる内因性 mE P S Cの増強効果が見られた。次にネフイラセタムを 1 0分間添加し、本薬を十分に洗浄した後、 GF 1 0 9 2 0 3 X存在下ニコチンを適用した。その結果、 mE P S Cはニコチン単独の効果より減少し、もとのレベルまで復した。これらのことから、ネフィラセタムのによる mE PS Cに対する増強効果は PKCを介したものであることが示唆された。

実施例 4 a [非 NMD A受容体電流に及ぼすネフィラセタムの効果]

ラット海馬 C A 1領域を用いた後シナプス電位（P S) の記録の実験手法は、前記と同様に行った。 A P V ( 1 0 0 Μ) ( η = 5 ) あるいは DN Q X ( 5 iiU) (n = 5 ) の存在下で、ネフイラセタム（ Ι iM) の投与前後で記録した。

表 1 2 ラット海馬 C A 1領域から記録されたシナプス後電位

(非匪 DA受容体電流）に及ぼすネフィラセタムの効果時間（分）後電位 (% of original amplitude)

DNQX APV

平均値土 SD 平均値土 SD

4 76±6 110±9 — nef.

5 78±8 112±8 ^nef.

6 78±10 112±9 ^nef.

7 76±6 112±7 — nef.

8 77±7 114±7 — nef.

9 78±8 115±8 — nef.

10 79±10 120±6

nef. ； 1 〃Mのネフイラセ夕厶： nは 5である。

APV； D— 2—アミノー 5—ホスホバレリン酸

DNQX； 6, 7—ジニトロキノザリン 2， 3—ジオンネフィラセタム投与による海馬神経伝達の促進は、非 N—メチルー D—ァスパラキン酸（非 NMDA) 受容体の選択的拮抗剤 6, 7—ジニトロキノザリン一 2, 3—ジオン（DNQX) で抑制された（表 1 2) 。しかし、 NMDA受容体の選択的拮抗剤 D— 2—アミノー 5—ホスホバレリン酸（AP V) では抑制されなかつた（表 1 2) 。

この結果は、ネフイラセ夕厶によるシナプス後電位の増強を起こしているのはひ一アミノ一 3—ヒドロキシ一 5 —メチルー 4 —イソキサゾ口プロピオン酸 (AMP A) Zカイニン酸受容体電流であることを示唆した。

実施例 4 b [アフリカッメガエル卵母細胞に発現させた G 1 uR 1 , 2, 3受容体におけるカイ二ン酸誘発電流に及ぼすネフイラセ夕厶の効果]

G 1 u R 1 , 2， 3受容体をアフリカッメガエル卵母細胞に発現させた。カイニン酸（ 1 0 0〃Μ) により誘発された細胞膜電流をネフィラセタム（ 1 /Μ) 処理の前後で記録した（η = 5) 。保持電位は— 3 OmVに設定した。ネフイラセタムは AMPA (G 1 uR 1， 2， 3 ) 受容体電流を全く増強しなかった（図 1 ) 。従って、ネフイラセタムによる後シナプス電位の増強は、シナプス後の AMP AZカイニン酸受容体の調節を介して生ずるものではないことが示されたここで述べた結果は、明らかに向知性薬の標的として n AC h受容体があることを説明している。

実施例 5 [AC h誘発電流に及ぼすネフィラセタムの効果]

2電極電位固定法で細胞の膜電流を記録した（T. N i s h i z a k i等、 B r a i n R e s. 6 8 7, 2 1 4, i 9 9 5 ) 正常型 A C h受容体を発現している単一卵母細胞にネフイラセ夕厶を 1 0分間投与し、その前後に 1 0分間隔でァセチルコリン（ 1 0 0 //M) を投与した。保持電位は一 3 OmV。野生型アセチルコリン（nACh) 受容体を従来のとおりアフリカッメガエル卵母細胞に発現させ（K. S u m i k a w a等、 M 0 1. b r a i n R e s . 5， 1 8 3、 1 9 8 9) 、 ACh ( 1 0 0 // M) の適用により内向き膜電流を誘発した（表 1 3) 。電流の誘発記録は 1 0分毎に行われ、その際に生じた電流の自然減少は 5 %以内であった（データを示さず）。本発明で用いた向知性薬ネフイラセタムを低濃度（ 1マイクロモル濃度以下）で 1 0分間投与すると、 AC h誘発電流の振幅は顕著に減少したが、薬物の洗い出し後は徐々に回復した（表 1 3) _c 電流減少の程度は、ネフイラセ夕厶 0. 0 1 〃Mで 7 0 % (n二 7 ) 、 0. 1 β Μで 6 2 % ( η二 7 ) であった。

表 1 3 AC h誘発電流に及ぼすネフイラセタムの効果

(% of original amplitude)

時間ネフィラセタム

(分）

0.01 M 0. l M 1 M 10 M

平均値土 SD 平均値土 SD 平^値土 SD 平均値土 SD

-10 100±0 100±0 100±0 100±0

0 30±9 38±11 134±10 155±15

10 37±13 45±14 150±15 158±11

20 40±15 49±15 155±18 162±20

30 63±19 54±15 170±21 169±16

40 65 ±20 66±16 188±16 177±19

50 75±18 80±20 190±25 195±20

60 94 ±23 90±21 209±28 216±16

70 104±19 103±20 219±20 230±18

80 106±20 120±19 244±29 260±22

90 105±15 122±14 243 ±20 255±18

(n= 7)

これとは対照的に、より高濃度（マイクロモル濃度域）のネフイラセタムで 1 0分間処理した場合、電流は徐々に大きくなり、薬物の洗い出し後 9 0分の時点で 2 4 3 % (n= 7， 1 〃M) あるいは 2 5 5 % (n = 7, 1 0〃M) に達した（表 1 3) 。低濃度のネフィラセタム（ 0. 1 M) により電流が抑制されている状態で、マイクロモル濃度（ 1 以上）のネフイラセ夕厶を投与した結果、薬物作用は抑制から増強に転じた（表 1 3及び表 1 4) 。

このことより、ネフィラセタムの二相性の作用には少なくとも 2種類の異なつた情報伝達経路の関与が示唆される。表 1 4 アメリカッメガエル卵母細胞で発現させたシビレ

エイの n ACh受容体（α， β, r, δ) に及ぼ

すネフィラ時間 (分リ % of the original amplitude

平均値土 SD

-10 100±0 — nef. (0.01 M)

0 32±9

10 39±8

20 43±12 ^nef. (1/zM)

30 140±15

40 158±7

50 163±10

(n = 7) nef. ；ネフイラセタム処理実施例 6 a [カルシウム依存性クロライド電流と正常型 n ACh受容体を通過するカルシウム流入に及ぼすネフィラセタムの効果]

シナプス後電位（PS) の記録、及び、電圧クランプ記録は、前述の方法によつた。アフリカッメガエルの卵母細胞における、 ACh受容体の発現は、前述の方法によった。

ァトロピンを含まない力エル用リンゲル液中で、 AC h受容体を発現していない卵母細胞に対してァセチルコリン（ 1 0 0 を投与した。保持電位は一 3 OmV。ァフリカツメガエル卵母細胞発現系における AC h誘発電流は、 AChによりゲート（開閉機構）が制禦されるチャンネル電流と、カルシウム依存性のクロライド電流の 2者から成ることが知られている（R. M i 1 e d i 等， J. Phy s i o l . 3 5 7, 1 7 3, 1 9 8 4) 。しかしながら、ネフィラセタムは、内因性のムス力リン性 AC h受容体の刺激によるカルシウム依存性クロライド電流に影響を与えなかった（図 2) 。

実施例 6 b

正常型 AC h受容体を発現している卵母細胞にカルシウムグリーンを負荷した c カルシウムを含まない細胞外液（e x t Ca²⁺ (― ) ) と通常の細胞外液中で AC h ( 1 00 M) を投与した際の、細胞内カルシウム（ [C a ^{2 +} ] ,) と誘発電流（ I A ) を記録した（卵母細胞にカルシウムグリーン T M— 1 (Mo l e c u l a r P r ob e s, I n c. USA) を注入する。）。カルシゥムの上昇は、螢光強度の増分 I ) を基線強度（ I n t e n s i t y) で除し、更にカルシウム含まない溶液で得た電流振幅（/ A) で除して正規化したものである。

表 1 5では、各値は 7個の卵母細胞より得られた平均値（SD；標準偏差）である。アフリカッメガエル卵母細胞発現系における AC h誘発電流は、ァセチルコリンによりゲート（開閉機構）が制禦されるチャンネル電流と、カルシウム依存性のクロライド電流の中で、ネフイラセタムは、 n AC h受容体チャンネルのカルシウム透過性に影響を与えなかった（表 1 5) 。実施例 6 a及び 6 bの結果は、ネフィラセタムはァセチルコリンでゲ一ト制禦されるチヤンネル電流を変えるが、カルシウム感受性クロライド（C 1— ) 電流には影響を与えないことを示唆した。

表 1 5 正常型 AC h受容体における C a透過性に及ぼす

ネフィラセタムの効果 normalized Ca²⁺ rise

(Δ increase of intensity/base intensity

/current amplituse

mean土 SD

Ca ⁺ -free solution 0±0

normal solution 6.5± 1.5

normal solution +ネフイラセ夕ム（ 1 // M) 6.6±1.4

nは 7である。実施例 7 a [ネフィラセタムが介在する PK A活性化による AC h誘発電流の制禦]

正常型 AC h受容体を発現している卵母細胞、又は PK A燐酸化部位を欠く変異型 A— C h受容体（m 7 ΔΡ K A/S e r 3 5 3， 3 5 4 m (5 Δ P K A / S e r 3 6 1， 3 6 2 ) を発現している卵母細胞に対して、 AC h ( 1 0 0〃M) をネフィラセタム（ 0. 0 1 M) 処理前後に適用した。正常型 AC h受容体発現の卵母細胞に対しては、記録 1 5分前より H— 8 9 ( 1 M に投与するか、または実験の 24時間前に百日咳毒素（0. 1 に投与した。表 1 6に示した電流は、ネフイラセ夕ム投与前および投与後 3 0分の時点で記録したものである。保持電位は一 3 0mV。この表では、各値は 7個の卵母細胞より得られた平均値である。

ネフイラセタムによる電流抑制と増強を介在する細胞内情報系を明らかにすることを試みた。

c AMP依存性蛋白キナーゼ（P KA) の選択的抑制剤である H 8 9は、 0. 0 1 //Mのネフイラセタムが示す AC h誘発電流の抑制作用を抑制し、逆に、ネフイラセ夕ム処理後 3 0分で 7 2 % ( nは 7 ) の増強があつた（表 1 6 ) 。このことは、低濃度域のネフィラセタムによる電流抑制が PK Aの活性化を介することを示唆している。

同様に、ネフイラセタム（ 0. 0 1 は、 G蛋白質（G i / o) 阻害剤の百日咳毒素（PTX) を投与した卵母細胞を用いた実験においても、 H 8 9で投与した時とと同程度に AC h誘発電流抑制作用を抑制し、逆に、増強した（表 1 6) o

このことは、ネフイラセタ厶の抑制作用が百日咳毒素感受性 G蛋白質を介した PK A活性化によるものであることを示唆している。

これに加えて、マイクロモル（//M) 濃度域のネフイラセタムによる電流の促進効果は、 H 8 9で一層増強した（デ一夕を示さず）。 H 8 9存在下で 1 //Mのネフィラセタムの処理を行った結果、 3 0分後の増強の程度は 1 3 6 % (n = 5) (データーは示さず。）であった。この結果より 1 M以上の高濃度のネフィラセタムでも PKAを活性化し、電流抑制作用を保持することが強く示唆された。但し、電流の増強作用が前面に出るため、抑制作用はマスクされてしまうことになろう。

ネフイラセタムによる電流抑制が受容体の P K A燐酸化によるものか否かを更に調べるために、 7および (5サブュニット上の PKA燐酸化部位を欠いた変異型 AC h受容体（m yAPKAZS e r 3 5 3， 3 5 4 m δΔΡΚΑ/S e r 3 6 1 , 3 6 2 ) をアフリカッメガエル卵母細胞膜に発現させた。

この系では、ネフイラセ夕ム（ 0. O l ^M) は変異型 AC h受容体における AC h誘発電流を滅少させず、逆に増加させた。この増加の程度は、投与後 3 0 分で 1 5 9 % (n = 7 ) であった（表 1 6 ) 。この結果は、ネフイラセタムは PK Aの活性化に起因する AC h受容体の PK A燐酸化により電流を抑制することを示している。

そのような抑制作用が n AC h受容体の PK A燐酸化によるものか否かを更に調べるために、 7および 5サブュニット上の P K A燐酸化部位を欠いた変異型 AC h受容体（m γΔΡΚΑ/S e r 3 5 3， 3 5 4 m (5ΔΡ KA/S e r 3 6 1 , 3 6 2 ) をアフリカッメガエル卵母細胞膜上に発現させた細胞では、本発明に係る物質（ 0. 0 1 / M) は変異型 AC h受容体における AC h誘発電流を減少させず、逆に増加させた（表 1 6 ) 。この結果は、本発明に係る物質は PK Aの活性化に起因する AC h受容体の PK Aの燐酸化により電流を抑制することを示す。

本発明に係る物質は、カルシウム依存性 P K Cの活性化と受容体に対する P K Cによる燐酸化により、 A C h制御チャンネル電流を増強と P K Aの活性化という、 2種類の情報伝達経路に影響を与えることが明確に示された。

表 1 6 ネフイラセタムが介在する P K A活性化による AC h

誘発電流の制禦

% of the original amplitude

m 7 ΔΡΚΑ 時間 α β y δ a β 7 δ +H89 α β γ δ +ΡΤΧ m δ ΔΡΚΑ

(分）

平均値土 SD 平均値土 SD 平均値土 SD 平均値土 SD

-10 100±0 100±0 100±0 100±0 nef

0 30±9 166±16 154±4 115±4

10 37±13 170±20 156±10 118±6

20 40±15 173±18 160±7 151±6

30 63±19 172±13 168±11 159±20 nef. ； 0.01〃 Mのネフイラセ夕厶処理。（nは 7) 実施例 7 b [正常型 AC h受容体を発現している卵母細胞、又は PKC燐酸化部位欠損変異型 AC h受容体に対するネフィラセタムの効果]

正常型 A C h受容体を発現している卵母細胞、または P K C燐酸化部位を欠く変異型 AC h受容体（πι γΔΡΚΑ/S e r 3 5 3， 3 5 4 m (5ΔΡΚΑ/ S e r 3 6 1 , 3 6 2 ) を発現している細胞に対して、 G F 1 0 9 2 0 3 X ( 1 0 0 ηΜ) の存在および非存在下で、あるいはカルシウムを含まない細胞外液中で、 AC h ( 1 0 0 Μ) を投与した。

各値は 7個の卵母細胞より得られた平均値である。マイクロモル濃度域（ 1〜 1 0 j U) のネフイラセタムにより増強される AC h誘発電流は、選択的 PKC 阻害剤である GF 1 0 9 2 0 3 Xの存在下では逆に抑制され、その値はネフィラセ夕ム投与後 3 0分の時点で 6 0 % ( n = 7 ) になった（表 1 7 ) 。これは、ネフィラセタムが PKCの活性化を介して AC h受容体電流を増強することを示している。カルシウムを含有しない溶液中ではこの増強は全く起こらず、 GF 1 0 9 2 0 3 X 投与時と同程度のレベルまで低下した（表 1 7 ) 。

更に、ひおよび 5サブュニット上の PKC燐酸化部位を欠いた変異型 AC h受容体（m APKC/S e r 3 3 3 m dAPKC/S e r 3 7 7 ) (V. M. G e h l e等、 Mo l . B r a i n R e s. 5, 1 8 3, 1 9 9 1 ) では、ネフィラセ夕厶（ 1 M) は電流の増強を起こさなかった（表 1 7) 。以上の結果より、ネフイラセタ厶は、カルシウム依存性 PKCの活性化と受容体の PKC燐酸化により、 AC h制禦チャンネル電流を増強することを示している。このように、ネフィラセタムは 2種類の異なる情報伝達経路に作用しているようである。即ち、一方は百日咳毒素感受性 G蛋白質の制禦を受ける PKA活性化であり、他方は力ルシゥ厶依存性の P K Cの活性化である。

1 7 ネフイラセタムが介在する PKC活性化による AC h

誘発電流の制禦

% of the original amplitude

時日 ^E ma APKC α β 7 δ + ; /3 r ο + (分） α β 7 δ m d APKC GF109203X extCa²⁺ (一）平均値土 SD 平均値土 SD 平均値土 SD 平均値土 SD

-10 100±0 100±0 100±0 100±0 — nef. 0 134±10 74±3 70±3 81±4

10 150±15 75±7 68±15 61±6

20 155±18 59±7 63±9 52±7

30 170±21 50±6 60±16 48±5 nef. ； 1 //Mのネフイラセタム処理。（n = 7) 実施例 8 A [シナプス後電位（P S) に及ぼすネフイラセタムの効果] 海馬の錐体細胞層の C A 1領域からのシナプス後電位の記録は前述と同様の方法で行った。ラットの脳より海馬のスライスを切り出し、錐体細胞層の CA 1領域よりフィ一ルドシナプス後電位を記録した。スライスは図に示した濃度のネフィラセタムで処理したものである。表 1 8は、ネフイラセタムの各濃度における効果の時間経過をまとめたものである。各値は、 - 1 0分（基線）の時点で記録されたシナプス後電位に対する比率（％) である（n = 6) 。ネフィラセタムが介在する信号伝達の機能面での役割を評価する目的で、海馬の錐体細胞層の C A 1領域から樹状突起のフィールドシナプス後電位を記録した。

興味深いことに、ここでもネフイラセ夕ムは、シナプス後電位に対して用量依存性の二相性効果を示した。即ち、低濃度（ 0. 1 M以下）では短期的な抑制が起こり、高濃度（ 1 /M以上）では LTPに似た長期的な増強が見られた（表 1 8 - 1 ) o 1 8— 1 シナプス後電位（P S) に及ぼすネフイラセタムの効果シナプス後電位（P S) (% of original amplitude) 時間ネフィラセ夕厶

、71リ

1 1

0.01 /M 0.1 Μ 1 10 M 平均 1直土 S D 平均値土 S D 平均 1直土 S D 平均 1直土 S D

5 100 + 3 100土 4

- 20 100 + 5 100 + 3 100 + 7 100±5

- 1 π0 1 Λ0 Λ0±0 Λ 100±0 100±0 100± 0 — ne†

Λ Λ _4— Ο O

- 9 100±8 108± 1 97± 7 — nei

-8 ± 9 109 + 2 110± b — nei

- 7 O _L_

81±9 91 ±9 lll±2 115± 6 — nei

- 6 75 ±8 87±6 122+8 121 + 8 — nef

つ

- 5 76±8 85± 9 133 + 6 116 + 3 nei

- 4 74±8 81 ± 13 127 + 4 122±9 — nei

-6 b土 b _i_ r*

土 b 132±7 l b± 7 — nei o /4 _i_ π I *7 „ - 土 ί 1ύ ±7

-丄 lol ±9 loo±b nei

8 Ο1 _ ±|_ 11 8 o 11 _ ±i_ b lc51 ±8

4 Ο -J- Ο 8d土 b l a± b ld OCbT _±i_ b

6 83±12 85±9 131±9 135±8

8 85±9 87±13 135±9 137±6

10 85±5 87±12 143±2 137±6

15 86±5 88±9 144±1 143±6

20 85±9 94±10 142±12 4±2

25 85±13 100±14 144±8 143±5

30 86±5 101±7 140±10 143±7

35 86±1 106±8 141±10 144±8

40 89±3 111±10 155±5 I45±12

45 88±4 109±9 153±9 142±5

50 92±2 111±6 155±10 142±5

55 93±6 110±10 156±7 143±9

60 94±5 m±9 156±6 144±11

(nは 6である。）

表 1 8 - 2

集合興奮性シナプス後電位（f EPSP) に及ぼすネフイラセタムの効果

f EPSP (¾ of base l i ne EPSP s l ope)

時間（分）対照群ネフイラセタム（ 1 M)

平均値土 SD 平均値土 SD

9999999999 . - - - - 19999 - 99 I 111

000087058525974729061

¾肚は ± ± ± ± ± ±士 ± ± ±土十一土土 ± ±

平均値土 SD 平均値土 SD

2244638961111155 3 o 24354742

-30 103 土 5

- 10 100 0 ネフィラセタム添加 0 120 8 ( 1 0分間）

5 151 10

10 173 18

15 170 8

20 175 14

25 180 12

30 180 土土士土土士土土 ±±±±±土土 ±±± 15

35 182 土 17

40 183 16

45 185 19

50 190 17

55 195 14

60 192 16

90 191 18

120 198 20

150 198 12

180 190 19

210 186 14

240 180 20

対照群： n=5 ネフイラセタム群： n=7

ネフィラセ夕厶による海馬シナプス伝達の長期増強作用について検討した。方法として、ラット脳より海馬脳切片を切り出し、 Shaf f er側枝より電気刺激を行い、 CA1 領域維体細胞層より集合興奮性シナプス後電位（f EPSP) を記録した。ネフイラセタム（ 1 〃M) を海馬切片に 1 0分間適用した。その結果、ネフイラセ夕厶の適用後から徐々に f EPSPが増強し始め、その効果は実験終了時の 2 4 0 分後まで見られた（表 1 8 - 2 ) 。一方、対照群（無処置群）では何ら変化が見られなかった。以上のことから、ネフイラセ夕ムはテ夕ヌス刺激なしで、長期に f SPを増強する作用を有することが明らかにされた。次に、本薬のこの効果がテタヌス刺激を用いた長期増強 ατρ)作用の発現メカ二ズ厶と相違するのかどうかについて検討を行なった。方法は（ 1 ) テ夕ヌス刺激のみ群、（ 2) ネフイラセタム +テタヌス刺激群、（ 3 ) テ夕ヌス刺激 +ネフィラセタム群、の 3群で比較検討した。その結果、ネフイラセタムにより増強した fEPSPはその後のテ夕ヌス刺激を適用しても、更なる増強は見られなかった。また、反対にテ夕ヌス刺激により増強した fEPSPはその後のネフィラセタムの添加においても更なる増強は見られなかった。これら 2つの fEPSPの増強の大きさはテタヌス刺激のみの大きさと変わらなかった。以上のことから、ネフイラセ夕厶の作用は LTPと共有したメカニズムであることが示唆された（表 1 8 — 3 ) 表 1 8 - 3

集合興奮性シナプス後電位（fEPSP) に対するテタヌス刺激およびネフイラセタムの相互作用比較

fEPSP (% of baseline EPSP slope)

時間（分）夕テ夕ヌス刺激ネフイラセ夕厶テタヌス刺激のみ群 +テ夕ヌス刺激群 +ネフィラセタム平均値土 SD 平均値土 SD 平均値土 SD

-テ夕ヌス

-nef.添加

テ夕ヌス：テタヌス激（100Hz for lsec)

nef.添加：ネフイラセタ厶添加（ 1 0分間）

テタヌス刺激： n=7 ネフイラセタム添加十テ夕ヌス刺激群： n=7

テ夕ヌス刺激 +ネフィラセタム添加群： n=7

LTPは記憶の細胞レベルのモデルとして最も集中的に研究されており（T. V. P. B 1 i s s等、 N a t u r e 3 6 1 , 3 1， 1 9 9 3 ) 、今回観られたような LTP様効果は、向知性薬が記憶や学習を改善する際の共通メカニズム (M. S a r t e r等 T r e n d s P h a r m a c o l . S c i . 1 2， 4 5 6， 1 9 9 1 ) であろう。

実施例 8 b [ひ—ブンガ口トキシン及びメカミラミンの存在下における、ネフィラセタムのシナプス後電位に及ぼす効果]

ひ一ブンガ口トキシン（ 1 0 0 nM) (nは 5 ) 、あるレ、はメカミラミン（ 3 iM (nは 5) の存在下で、ネフイラセタム（ 1 /M) を海馬切片に投与した c ネフィラセ夕厶によるシナプス後電位の持続的上昇は、 7 n受容体の選択的拮抗剤ひ一ブンガ口トキシンや、神経系の n AC h受容体の非選択的拮抗剤メカミラミンの存在下で抑制された（表 1 9一 1 ) 。

1 9一 i 0L -づーガ O カミラミンの存在下におけるネフイラ電位に及ぼす効果シナプス後電位（％ of original amplitude) 時 H

(分） "一 BuTX メカミラミン（3 / M)

平均値土 SD 平均値土 SD

-30 100±5

-10 100±4

-5 100±0 100±0 < -BuTX or meca.

-4 77±6 81±6 < -BuTX or meca.

-3 63±5 56±5 < -BuTX or meca.

-2 43±1 50±9 < -BuTX or meca.

- 1 44±2 47±4 -BuTX or meca.

0 43±1 41±3 < -BuTX or meca. 十 nef i 1 52±2 63±7 -BuTX or meca. nef 2 54±9 63±5 < -BuTX or meca. nef 3 53±9 63±4 - -BuTX or meca. nef 4 54±5 63±8 -BuTX or meca. nef 5 53±10 65±10< -BuTX or meca. nef 6 55±4 68±5 -BuTX or meca. nef 7 55±6 70±4 -BuTX or meca. nef i 8 59±8 73±7 -BuTX or meca. nef i 9 64±3 75±6 < -BuTX or meca. nef i

10 65±7 78±9

11 63±3 95±10 ++++++++ 12 63±7 97±8

13 65±6 108±7

14 75±3 122±8

15 83±8 126±5

16 133±5 134±5

17 133±9 145±10

18 133±4 150±9

19 140±5 153±8

20 141±8 153±6

BuTX；ひ一ブンガ口トキシン（100〃M)

meca；メカミラミン（3 /M)

nefi. ；ネフイラセタム（1 zM)

(n= 5) 表 1 9一 2

集合興奮性シナプス後電位（iEPSP) におけるネフイラセタムの効果に対するひ -BuTXの作用

fEPSP(¾ of baseline EPSP slope)

時間（分）ネフイラセタム（ 1 /M)

平均値土 SD

- 30 103土 1.5

- 20 96土 6 - の時点からひ- BuTXを実験終了まで継続的に添加

-15 98土 10.5

-10 99土 7.5 —ネフィラセタム添加（ 1 0分間）

-5 98土 6

0 99土 10.5

5 92土 4.5

10 105土 5.5

15 100土 5.5

20 104土 3

25 106土 6.7

30 108士 8

35 108土 6.5

40 102土 5.3

45 104土 7.3

50 108土 4.5

55 102土 5

60 106土 5.5

n=5

a -BuTX： 50nM

上述と同じく海馬切片を用いて、ニコチン受容体阻害薬存在下におけるネフィラセタムの集合興奮性シナプス後電位（fEPSP) に対する作用について検討した。主な神経性ニコチン ACh受容体として 7および 4 2の 2種類があることが知られている。そこで、 BuTX (ひ 7の選択的阻害薬）及び MCA (ひ 4 /S 2の選択的阻害薬）の存在下、ネフイラセ夕ムを適用したところ、その増強効果は全く見られなかった（表 1 9— 2及び表 1 9— 3) 。以上のことより、ネフイラセタムの増強効果はニコチン ACh受容体を介してものであることが示唆された。表 1 9 一 3

集合興奮性シナプス後電位（fEPSP) におけるネフイラセタムの効果に対する MCAの作用

fEPSP(¾ of baseline EPSP slope)

時間（分）ネフィラセ夕厶

平均値土 SD

-30 103土

-20 95士 2 の時点から MCAを実験終了まで継続的に添加

- 15 97土 4

- 10 100土 0 —ネフィラセタム添加（ 1 0分間）

-5 98土 2.5

0 102土 6.5

5 96土 6.5

10 91土 4

15 94土 3

20 96士 2 .5

25 93士 4

30 94土 6

35 97土 1 .5

40 100土 5

45 98土 2

50 99土 3 .5

55 101土 5.5

60 103土 8

n=5

MCA： 3 /M

実施例 8 c [PKC阻害剤又は PKA阻害剤存在下でのシナプス後電位に対するネフィラセタムの効果]

H— 8 9 ( 1 〃M ) または G F 1 0 9 2 0 3 X ( 1 0 0 nM) の存在および非存在下で、ネフイラセ夕ム（ 0. 0 1および 1 〃M) 投与前後のシナプス後電位を測定した。各値は、基線の時点でのシナプス後電位に対するネフイラセ夕ム処理後 1 0分の時点でのシナプス後電位の比率（％) である（n = 5 ) 。卵母細胞発現系の場合と同様に、ネフイラセタム低濃度（ 0. 1 〃M) での減少は、 H 8 9の処理により抑制され、また、ネフイラセ夕厶高濃度での増強は GF 1 0 9 2 0 3 X投与により抑制された（表 2 0 ) 。これは、ネフイラして海馬の神経伝達を別々に調節していることを示している。

表 2 0 H 8 9又は GF 1 0 9 20 3 X存在下での海馬シナプス後

電位におけるネフィラセタム処理の影響シナプス後電位 (% of original amplitude)

ネフイラセ対照郡 H - 89 ( 1 χ/Μ) GF109203X (ΙΟΟηΜ) 夕厶（ M) 平均値土 SD 平均値土 SD 平均値土 SD

0.01 85±5 103±8 50±5

1 143±2 155±8 108.8±11.6

AC h誘発電流の研究で示した結果はシビレエイの n AC h受容体から得られたものであつたが、神経系の n AC h受容体として最も豊富なひ 7やひ 4 2 受容体（P. B. S. C l a r k e等、 J. Ne u r o s c i . 5, 1 3 0 7, 1 9 8 5 : E. Wa d a b e等、 J. C omp. Ne u r o l . 2 8 4, 3 1 4， 1 9 8 9 : C. M. F l o r e s等、 Mo l . Ph a rma c o l . 4 1 , 3 1 , 1 9 9 2 ： E . D om i n g u e z d e l T o r o等， J . C om . Ne u r o l . 3 4 9, 3 2 5, 1 9 9 4 ) を発現させた細胞でも、マイクロモル濃度域のネフィラセタムは PKC活性化を介して持続性の電流増強を引き起こした。よって、シビレエイの nACh受容体での作用に一般化できることが示唆される。

表 2 1

集合興奮性シナプス後電位（fEPSP) におけるネフイラセタムの効果に対する H- 89の作用

fEPSPg of basel ine EPSP sl ope)

時間（分） 000024577761 8350448490559 ネフイラセ夕厶（1〃Μ)

士土士土土土土土土士土土

345 ο 平均値土 SD

- 30

-20 この時点から H-89を実験終了まで継続的に添加

-15

-10 ネフィラセタム添加（ 1 0分間）

- 5 17

0 20

5 21

10 22

15 21

20 22

25 24

30 23

n=5

H-89： 1 / M

H-89： N- [2-( p-Bromocinnamylamino)ethyl ] -5-i soquinol inesulf onamide · 上述と同じく海馬切片を用いて、 PKC 及び PKA阻害薬存在下におけるネフイラセタムの集合興奮性シナプス後電位（fEPSP) に対する作用について検討を行なつた。 H- 89 (PKAの選択的阻害薬）の存在下、ネフイラセタムを適用したところ著明な増強効果が見られた。一方、 GF109203X (PKCの選択的阻害薬）の存在下、ネフィラセタムを適用したところ、その増強効果は全く見られなかった（表 2 1 及び表 2 2 ) 。以上のことより、ネフィラセタムの増強効果は PKCを介してものであることが示唆された。表 2 2

集合興奮性シナプス後電位（fEPSP) におけるネフイラセ夕厶の効果に対する GF109203Xの作用

fEPSP(¾ of basel ine EPSP s l ope)

時間（分）ネフイラセ夕厶（1〃M)

平均値土 SD

-30 102土 3

-20 100土 4—二の時点から GF109203Xを実験終了まで継続的に添加

-15 98土 5

-10 100土 0 « ネフィラセタム添加（ 1 0分間）

-5 98士 7

0 96士 10

5 99土 11

10 99土 12

15 105士 11

20 103土 12

25 103土 14

30 101土 13

35 108土 14

40 106土 11

45 106+ 12

50 99士 11

55 106土 12

60 105土 13

FF5

GF109203X： ΙΟΟηΜ

表 2 3

集合興奮性シナプス後電位（fEPSP) におけるネフイラセタムの効果に対する APVの作用

fEPSP(% of basel ine EPSP s lope)

時間（分）ネフイラセ夕ム（ 1〃 M)

平均値土 SD

n=5

APV： 100 / M

APV： 2 - amino - 5 - phospho謂 alerate

上述と同じく海馬切片を用いて、 NMDA受容体阻害薬存在下におけるネフイラセタムの集合興奮性シナプス後電位（fEPSP) に対する作用について検討を行なつた。 APV (剛 DAの選択的阻害薬）の存在下、ネフイラセ夕厶を適用したところ著明な増強効果が見られた（表 2 3 ) 。以上のことより、ネフィラセタムの増強効果は匪 D A受容体を介したものでないことが示唆された。表 2 4

In vivo脳での興奮 1生シナプス後電位に対するネフィラセタムの効果

興奮性シ- プス後電位（％ of baseline spike amplitude) 時間（分）対照群ネフイラセタム（7.5mg/kg)

平均値土 SD 平均値士 SD

-30 98土 6 99土 5

-20 102士 5 105 土 3

-10 100士 4 98 ± 3

0 100士 0 100 土 0 —ネフィラセタム投与

10 103土 4 120 士 3

20 100土 5 127 土 9

30 98土 9 151土 15

40 100士 3 148 土 8

50 105土 5 186 土 25

60 102土 8 166 土 20

70 103土 7 181 土 15

80 100土 10 173 土 24

90 99土 6 159 土 21

100 96土 5 174 士 12

110 102土 7 168 土 17

120 100土 5 173 土 20

130 106土 3 189 土 22

140 100土 2 177 土 15

150 109土 6 185 土 17

160 103土 8 171 土 20

170 104土 4 165 土 13

180 96土 7 159 土 16

190 95士 9 165士 19

200 94土 11 183 土 19

210 99土 9 192 土 25

220 96土 8 206 土 22

230 97士 11 175 土 19

240 94土 13 180 土 24

480 90土 14 182 士 22

720 88土 12 170 土 20

960 82士 16 167 土 25

対照群： n=5 ネフイラセタム群： n=5

In vivo脳での興奮性シナプス後電位（PS) に対するネフイラセタムの効果について検討を行なった。

マウスを麻酔下、その頭部を固定し、海馬部位の顆粒細胞層に電極を揷入し、 PSを記録した。ネフイラセ夕ムは 7.5mg/kgを筋注した。その結果、ネフイラセ夕ムの投与により長期に著明な興奮性シナプス後電位の増強効果が見られた。その効果は 9 6 0分後においても確認された。以上のことにより、上述の海馬脳切片を用いた in vi tro実験の結果と同様に in vi voにおいても確認された。産業上の利用可能性

本発明の医薬は、テタヌス刺激なしに、海馬神経伝達を長期間亢進させる作用 ( L T P様作用）を有する。このような作用を有するために、本発明の医薬は、正常圧水頭症による痴呆症の治療薬として有用である。また、本発明の医薬はァルツハイマー病の治療薬、予防薬としても有用である。 P K C経路の長期間活性化と、シナプス前ニコチン性ァセチルコリン受容体の長期間活性化との相互作用により、グルタミン酸の分泌を増大させ、電気刺激なしで、海馬神経伝達を持続的に促進させる物質は、向知性薬として有用である。

また、本発明において見いだした、電気刺激なしでいわゆる L T P様作用を有する物質は、向知性薬として有用である。

P K Cの経路を長期間活性化とシナプス前 n A C h受容体を長期間活性化の相互作用による、グルタミン酸の分泌の長期間増大させ、電気刺激なしで海馬神経伝達を持続的に促進させる物質は、アルツハイマー病薬等の向知性薬、正常圧水頭症による痴呆症の治療薬又は予防薬として有用である。

Claims

請求の範囲

1 . プロテインカイネース Cの活性化経路を長期間活性化させる物質を有効成分とする向知性薬。

2 . プロティンカイネース Cの長期活性化と前ニコチン性ァセチ儿コリン受容体の長期活性化の相互作用をもたらす物質を有効成分とする向知性薬。

3 . プロテイン力イネ一ス Cの活性化経路を長期間活性化させ、プロテイン力イネース Cとの相互作用によりシナプス前ニコチン性ァセチルコリン受容体を長期間活性化し、グルタミン酸の分泌を長期間増大させることにより、海馬神経伝達を長期間改善させる物質を有効成分とする向知性薬。

4 . 電気刺激を必要としない L T P様作用を誘発する物質を有効成分とする向知性薬。

5 . 向知性薬が、慢性硬膜下血症による痴呆症に対する治療薬である、請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の向知性薬。

6 . 向知性薬が、水頭症による痴呆症に対する治療薬である、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の向知性薬。

7 . 物質が、次の一般式（ 1 ) _:

[式中、 Rは水素原子または水酸基を示し、

R ¹ は水素原子またはメチル基を示し、

ハロゲン原子、トリフルォロメチル基、

ニトロ基、

1〜 4個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキル基、

1〜 4個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルコキシル基、

1〜 7個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキルメルカプト基、一般式— S— (CH₂) _n-CH (R³) (R⁴) [式中の nは 1又は 2を示し、 R ³ は水素原子又はメチル基を示し、 R ⁴ は水酸基又は一般式 — N (R^s) (R⁹) (式中の R⁸ は水素原子又はメチル基を示し、 R⁹ はメチル基、ベンジル基、又は置換ベンジル基を示し、あるいは R 8及び R 9が一緒になつて式中の窒素原子と共に置換ピロリジン環を示す。）で表されるアミノ基を示す。 ]

で表される置換アルキルメルカプト基、

次の一般式： — S 0₂R⁵ (式中の R⁵ は、ァミノ基又は 1〜3個の炭素原子を有するアルキル基を示す。）で表されるスルフォニル基、及び

次の一般式：一 COO (CH₂) ₂— N (R⁶) (R⁷) (式中の R⁶及び R⁷ はそれぞれ独立に水素原子、メチル基、又はェチル基を示す。）で表される置換ァミノエトキシカルボニル基からなる群から選ばれる基である。 ]

で表される 2—ォキソー 1―ピロリジニルアルキルカルボン酸ァミド又はその製薬上許容できる酸付加塩である請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の向知性薬。

8. 物質が、下記の化合物：

(1) 2—ォキソ一 1—ピロリジニル酢酸 2, 6—ジメチルァニリド；

(2) 4—ヒドロキシ— 2—ォキソ一 1 —ピロリジニル酢酸 2， 6—ジェチルァニリド；

(3) 4ーヒドロキシ— 2—ォキソ一 1 —ピロリジニル酢酸 2, 6—ジメチルァニリド； (4) 2— [ 2 —ォキソ一ピロリジニル] プロピオン酸 N— 3 —ピリジニ儿アミド；

(5) 2 —ォキソ— 1 —ピロリジニル酢酸 4 —イソプロピルメルカプトァニ U K；

(6) 2 - [ 2 —ォキソ— 1 —ピロリジニル] — 1 —プロピオン酸— 4— ( 2 ーブチルメルカプト）一ァニリド；

(7) 2 - [ 2 —ォキソ一 1 —ピロリジニル] —プロピオン酸— 4 —イソプロピルァニリド；

(8) 2— [ 2 —ォキソ一 1 一ピロリジニル] 一プロピオン酸一 2， 4—ジメチルァニリド；

(9) 2— [ 2 —ォキソ— 1 一ピロリジニル] —プロピオン酸ー 2， 4 , 6 - トリメチルァニリド；

(10) 2 - [ 2 —ォキソ一 1 —ピロリジニル] —プロピオン酸ー 2 —メトキシ一 5—メチルァニリド；

(11) 2— [ 2 —ォキソ一 1 —ピロリジニル] 一プロピオン酸一 2， 6—ジクロロァニリド；

(12) 2 —ピロリドンーァセタミド；

(13) 1 —ァニツイル一 2 —ピロリジノン；及び

(14) 4ーヒドロキシー 2—ォキソ一 1 一ピロリジンァセ夕ミド；

からなる群から選ばれる化合物である、請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の向知性薬。

9 . 物質が、 2 —ォキソ— 1 一ピロリジニル酢酸 2， 6—ジメチルァニリド- 2 —ピロリドン一ァセタミド、 1 ーァニソィルー 2 —ピロリジノン、及び 4 —ヒドロキシー 2—ォキソ— 1 ―ピロリジンァセ夕ミドからなる群より選ばれる化合物である、請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の向知性薬。

1 0 . 物質が、ネフイラセタムである、請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の向知性薬。

1 1. 次の一般式（ 1 )

[式中、 Rは水素原子または水酸基を示し、

R¹ は水素原子またはメチル基を示し、

R² はピリジル基または 1〜3個の同一又は異なる置換基で置換された置換フェニル基を示す。ここでフヱニル基上の置換基は、

ハロゲン原子、

トリフルォロメチル基、

二卜 π基、

1〜 4個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキル基、

1〜4個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルコキシル基、

1〜 7個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキルメルカプト基、一般式— S— (CH₂) n-CH (R³) (R⁴) [式中の nは 1又は 2を示し R ³ は水素原子又はメチル基を示し、 R ⁴ は水酸基又は一般式一 N (R⁸) (R⁹) (式中の R⁸ は水素原子又はメチル基を示し、 R⁹ はメチル基、ベンジル基、又は置換ベンジル基を示し、あるいは R 8及び R 9が一緒になつて式中の窒素原子と共に置換ピロリジン環を示す。）で表されるアミノ基を示す。 ]

で表される置換アルキルメルカプト基、

次の一般式：一 S0₂R⁵ (式中の R⁵ は、了ミノ基又は 1〜 3個の炭素原子を有するアルキル基を示す。）で表されるスルフォニル基、及び次の一般式： — C〇〇（CH₂) ₂— N (R^e) (R⁷) (式中の R ⁶及び R ⁷ はそれぞれ独立に水素原子、メチル基、又はェチル基を示す。）で表される置換アミノエトキシカルボニル基からなる群から選ばれる基である。 ]

で表される 2—ォキソ一 1 一ピロリジニルアルキルカルボン酸ァミド又はその製薬上許容できる酸付加塩を有効成分とする、脳の神経伝達の長期改善剤。

1 2. 次の、（1 から（14)の群の中から選ばれる化合物を有効成分とする脳の神経伝達物質の長期改善剤。

(1) 2—ォキソ— 1 —ピロリジニル酢酸 2, 6—ジメチルァニリド；

(2) 4ーヒドロキシ— 2—ォキソ一 1 一ピロリジニル酢酸 2, 6—ジェチルァニリド；

(3) 4—ヒドロキシ一 2—ォキソ一 1 一ピロリジニル酢酸 2， 6—ジメチルァニリド；

(4) 2— [ 2—ォキソ—ピロリジニル] プロピオン酸 Ν— 3—ピリジニルアミド；

(5) 2—ォキソ— 1 —ピロリジニル酢酸 4—イソプロピルメルカプトァニリド、；

(6) 2 - [2—ォキソ— 1 一ピロリジニル] — 1 —プロピオン酸— 4— ( 2 一プチルメルカプト） —ァニリド；

(7) 2 - [ 2—ォキソ一 1 —ピロリジニル] 一プロピオン酸ー 4一イソプロピルァニリド；

(8) 2— [2—ォキソ一 1 —ピロリジニル] 一プロピオン酸ー 2, 4—ジメチルァ二リド；

(9) 2— [ 2—ォキソ一 1 —ピロリジニル] —プロピオン酸— 2, 4, 6 - トリメチルァニリド；

(10 2— [2—ォキソ一 1 —ピロリジニル] 一プロピオン酸一 2—メトキシ一 5 —メチル了ニリド；

(1 1 ) 2— [ 2 —ォキソ— 1 —ピロリジニル] —プロピオン酸ー 2 , 6 - ロロァニリド；

(12) 2 —ピロリドン一ァセタミド；

(13) 1 —ァニフィルー 2 —ピロリジノン、又は、

(14) 4 —ヒドロキシ一 2 —ォキソ一 1 —ピロリジンァセタミド； '

1 3 . ネフイラセ夕ムを有効成分とするプロテイン力イネ一ス Cの活性化経路の長期活性化剤。

1 4 . ネフイラセタムを有効成分とする電気刺激を必要としない L T P様作用の誘発剤。

1 5 . ネフイラセ夕ムを有効成分とする、プロテインカイネース Cの活性化経路の長期間活性化と、シナプス前ニコチン性ァセチルコリン受容体を長期間活性化の相互作用による、分泌グルタミン酸の長期増加剤。

1 6 . ネフイラセタムを有効成分とする、プロテインカイネース Cの活性化経路の長期活性化と、シナプス前ニコチン性ァセチルコリン受容体の長期活性化に基づく、脳神経の伝達の長期改善剤。

1 7 . ネフイラセ夕ムを有効成分とする、プロテインカイネース Cの活性化経路を活性化させることによる、電気刺激を必要としない L T P様作用の誘発に基づく、脳の慢性硬膜下血症による痴呆症に対する治療薬。

1 8 . ネフイラセタムを有効成分とする、プロテインカイネース Cの活性化経路を活性化させることによる、電気刺激を必要としない L T P様作用の誘発に基づく、水頭症による痴呆症に対する治療薬。

1 9 . ネフイラセタムを有効成分とする、プロテインカイネース C活性化経路の活性化とシナプス前ニコチン性ァセチルコリン受容体の長期活性化の相互作用により、分泌グルタミン酸を長期間増大させ、海馬神経伝達を長期間改善させることを特徴とする向知性薬。

2 0 . ネフイラセタムを有効成分とする、プロテインカイネース C活性化経路、シナプス前ニコチン性ァセチルコリン受容体を活性化し、グルタミン酸分泌を長期間増大させる海馬神経伝達の長期改善剤。

2 1 . ネフィラセ夕厶を有効成分とする分泌グル夕ミン酸の長期増加剤。

2 2 . プロテインカイネース Cの活性化経路を長期間活性化させる物質の向知性薬製造のための使用。

2 3 . プロテイン力イネ一ス Cの長期活性化と前ニコチン性ァセチ儿コリン受容体の長期活性化の相互作用をもたらす物質の向知性薬製造のための使用。

2 4 . プロテイン力イネ一ス Cの活性化経路を長期間活性化させ、プロテインカイネース Cとの相互作用によりシナプス前ニコチン性ァセチルコリン受容体を長期間活性化し、グルタミン酸の分泌を長期間増大させることにより、海馬神経伝達を長期間改善させる物質の向知性薬製造のための使用。

2 5 . 電気刺激を必要としない L T P様作用を誘発する物質の向知性薬製造のための使用。

2 6 . 向知性薬が、慢性硬膜下血症による痴呆症に対する治療薬である、請求項 2 2〜 2 4のいずれか 1項に記載の使用。

2 7 . 向知性薬が、水頭症による痴呆症に対する治療薬である、請求項 2 2〜 2 5のいずれか 1項に記載の使用。

2 8 . 物質が、次の一般式（ 1 ) ：

0 0

、

N— CH— I CI—隱一 R² ( 1 )

I

R R¹

[式中、 Rは水素原子または水酸基を示し、

R ^! は水素原子またはメチル基を示し、 R² はピリジル基または 1〜3個の同一又は異なる置換基で置換された置換フェニル基を示す。ここでフエニル基上の置換基は、

ハロゲン原子、

トリフルォロメチル基、

二卜 o基、

ァセチル基、

1〜 4個の炭素原子を有する直鎖又は分技鎖のアルキル基、

1〜 7個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキルメルカプト基、一般式— S— (CH₂) _n-CH (R³) (R⁴) [式中の nは 1又は 2を示し、 R ³ は水素原子又はメチル基を示し、 R ⁴ は水酸基又は一般式一 N (R⁸) (R⁹) (式中の R⁸ は水素原子又はメチル基を示し、 R⁹ はメチル基、ベンジル基、又は置換ベンジル基を示し、あるいは R 8及び R 9が一緒になつて式中の窒素原子と共に置換ピロリジン環を示す。）で表されるアミノ基を示す。 ]

で表される置換アルキルメルカプト基、

次の一般式： — S0₂R⁵ (式中の R⁵ は、ァミノ基又は 1〜3個の炭素原子を有するアルキル基を示す。）で表されるスルフォニル基、及び

次の一般式： — COO (CH₂) ₂ - N (R⁶) (R⁷) (式中の R⁶及び R^T はそれぞれ独立に水素原子、メチル基、又はェチル基を示す。）で表される置換ァミノエトキシカルボニル基からなる群から選ばれる基である。 ]

で表される 2—ォキソ— 1一ピロリジニルアルキルカルボン酸ァミド又はその製薬上許容できる酸付加塩である請求項 22〜2 7のいずれか 1項に記載の使用。

2 9. 物質が、下記の化合物：

(1) 2—ォキソ— 1—ピロリジニル酢酸 2， 6—ジメチルァニリド；

(2) 4ーヒドロキシ— 2—ォキソ— 1—ピロリジニル酢酸 2, 6—ジェチルァニリド；

(3) 4 —ヒドロキシ一 2 —ォキソ一 1 一ピロリジニル酢酸 2， 6—ジメチルァニリド；

(4) 2— [ 2 —ォキソ一ピロリジニル] プロピオン酸 N— 3 —ピリジニ儿アミド；

(5 2 —ォキソ一 1 —ピロリジニル酢酸 4 —イソプロピルメルカプトァニリド、；

(6) 2— [ 2 —ォキソ— 1 一ピロリジニル] — 1 —プロピオン酸— 4— ( 2 ーブチルメルカプト）一ァニリド；

(7 2 - [ 2 —ォキソ一 1 —ピロリジニル] —プロピオン酸ー 4 —イソプロピルァニリド；

(9) 2— [ 2 —ォキフー 1 一ピロリジニル] 一プロピオン酸一 2 , 4 , 6 - トリメチルァニリド；

(10、 2— [ 2 —ォキソ一 1 —ピロリジニル] —プロピオン酸一 2 —メトキシ一 5 —メチルァニリド；

(11) 2— [ 2 —ォキソ一 1 —ピロリジニル] —プロピオン酸ー 2， 6 —ジクロロァニリド；

(12) 2―ピロリドン一ァセタミド；

(13) 1 —ァニフィル一 2 —ピロリジノン；及び

(14) 4 ーヒドロキシ一 2 —ォキソ一 1 —ピロリジンァセタミド；

からなる群から選ばれる化合物である、請求項 2 2〜2 7のいずれか 1項に記載の使用。

3 0 . 物質が、 2 —ォキツー 1 —ピロリジニル酢酸 2 , 6 —ジメチルァニリド、 2 —ピロリドン一ァセタミド、 1 ーァニソィルー 2 —ピロリジノン、及び 4 -ヒドロキシ— 2—才キリ— 1 一ピロリジンァセ夕ミドからなる群より選ばれる化合物である、請求項 2 2〜2 7のいずれか 1項に記載の使用。

3 1. 物質が、ネフイラセタムである、請求項 2 2〜 2 7のいずれ i項に記載の使用。

3 2. 次の一般式（ 1 ) ：

[式中、 Rは水素原子または水酸基を示し、

R¹ は水素原子またはメチル基を示し、

R² はピリジル基または 1〜3個の同一又は異なる置換基で置換された置換フニル基を示す。ここでフニル基上の置換基は、

ハロゲン原子、

トリフルォロメチル基、

二トロ基、

ァセチル基、

1〜4個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキル基、

1〜7個の炭素原子を有する直鎖又は分技鎖のアルキルメルカプト基、一般式— S— (CH₂) „-CH (R^s) (R⁴) [式中の nは 1又は 2を示し、 R ³ は水素原子又はメチル基を示し、 R ⁴ は水酸基又は一般式 — N (R⁸) (R⁹) (式中の R⁸ は水素原子又はメチル基を示し、 R⁹ はメチル基、ベンジル基、又は置換ベンジル基を示し、あるいは R 8及び R 9が一緒になつて式中の窒素原子と共に置換ピロリジン環を示す。）で表されるアミノ基を示す。 ]

で表される置換アルキルメルカプト基、

次の一般式： — S〇₂R⁵ (式中の R⁵ は、了ミノ基又は 1〜 3個の炭素原子を有するアルキル基を示す。）で表されるスルフォニル基、及び

次の一般式： — COO (CH₂) ₂ - N (R⁶) (R⁷) (式中の R ⁶及び R ⁷ はそれぞれ独立に水素原子、メチル基、又はェチル基を示す。）で表される置換アミノエトキシカルボニル基からなる群から選ばれる基である。 ]

で表される 2—ォキソ一 1 一ピロリジニルアルキルカルボン酸ァミド又はその製薬上許容できる酸付加塩の脳の神経伝達の長期改善剤製造のための使用。

3 3. 次の、（ 1 ) 力、ら（ 1 4) の群の中から選ばれる化合物の脳の神経伝達物質の長期改善剤製造のための使用。

(1) 2—ォキソ— 1 —ピロリジニル酢酸 2， 6—ジメチルァニリド；

(2) 4ーヒドロキシ— 2—ォキソ一 1 —ピロリジニル酢酸 2， 6—ジェチルァユリド；

(3) 4—ヒドロキシ— 2—ォキソ一 1 —ピロリジニル酢酸 2, 6—ジメチルァニリド；

(4) 2— [2—ォキソ—ピロリジニル] プロピオン酸 N— 3—ピリジニル了ミド；

(5) 2—ォキソ一 1 一ピロリジニル酢酸 4—イソプロピルメルカプトァニリト'、；

(6) 2— [2—ォキソ— 1 一ピロリジニル] ― 1 一プロピオン酸— 4一（ 2 ーブチルメルカプト）一ァニリド；

(7) 2— [ 2—ォキソ一 1 —ピロリジニル] —プロピオン酸一 4—イソプロピルァニリド；

(8) 2— [ 2—ォキソ一 1 一ピロリジニル] —プロピオン酸ー 2, 4—ジメチルァニリド； (9) 2— [2—ォキソ一 1一ピロリジニル] 一プロピオン酸ー 2, 4， 6— トリメチルァニリド；

(10、 2 - [2—ォキソ一 1一ピロリジニル] 一プロピオン酸一 2—メトキシ一 5—メチルァニリド；

CIO 2— [ 2—ォキソ一 1一ピロリジニル] —プロピオン酸ー 2, 6—ジクロロァニリド；

(12) 2—ピロリドンーァセタミド；

(13) 1ーァニツイルー 2—ピロリジノン、又は、

(14) 4ーヒドロキシ一 2—ォキソ一 1—ピロリジンァセタミド；

34. ネフイラセタムのプロテイン力イネ一ス Cの活性化経路の長期活性化剤製造のための使用。

35. ネフィラセタムの電気刺激を必要としない LTP様作用の誘発剤製造のための使用。

36. ネフイラセタムのプロテイン力イネ一ス Cの活性化経路の長期間活性化と、シナプス前ニコチン性ァセチルコリン受容体を長期間活性化の相互作用による、分泌グルタミン酸の長期増加剤製造のための使用。

37. ネフイラセタムのプロテイン力イネ一ス Cの活性化経路の長期活性化と、シナプス前ニコチン性ァセチルコリン受容体の長期活性化に基づく、脳神経の伝達の長期改善剤製造のための使用。

38. ネフイラセタムのプロテイン力イネ一ス Cの活性化経路を活性化させることによる、電気刺激を必要としない LTP様作用の誘発に基づく、脳の慢性硬膜下血症による痴呆症に対する治療薬製造のための使用。

39. ネフイラセタムのプロテインカイネース Cの活性化経路を活性化させることによる、電気刺激を必要としない LTP様作用の誘発に基づく、水頭症による痴呆症に対する治療薬製造のための使用。

40. ネフイラセ夕厶のプロテインカイネース C活性化経路の活性化とシナプス前ニコチン性ァセチルコリン受容体の長期活性化の相互作用により、分泌グ儿夕ミン酸を長期間増大させ、海馬神経伝達を長期間改善させることを特徴とする向知性薬製造のための使用。

4 1 . ネフイラセタムのプロテインカイネース C活性化経路、シナプス前ニコチン性ァセチルコリン受容体を活性化し、グル夕ミン酸分泌を長期間増大させる海馬神経伝達の長期改善剤製造のための使用。

4 2 . ネフィラセタムの分泌グルタミン酸の長期増加剤製造のための使用。 4 3 . プロテインカイネース Cの活性化経路を長期間活性化させる物質を患者に投与することを特徴とする向知性のための処置方法。

4 4 . プロテインカイネース Cの長期活性化と前二コチン性ァセチルコリン受容体の長期活性化の相互作用をもたらす物質を患者に投与することを特徴とする向知性のための処置方法。

4 5 . プロテインカイネース Cの活性化経路を長期間活性化させ、プロテインカイネース Cとの相互作用によりシナプス前ニコチン性ァセチルコリン受容体を長期間活性化し、グルタミン酸の分泌を長期間増大させることにより、海馬神経伝達を長期間改善させる物質を患者に投与することを特徴とする向知性のための処置方法。

4 6 . 電気刺激を必要としない L T P様作用を誘発する物質を患者に投与することを特徴とする向知性のための処置方法。

4 7 . 向知性のための処置が、慢性硬膜下血症による痴呆症に対する治療である、請求項 4 3〜4 6のいずれか 1項に記載の方法。

4 8 . 向知性のための処置が、水頭症による痴呆症に対する治療である、請求項 4 3〜 4 6のいずれか 1項に記載の方法。

4 9 . 物質が、次の一般式（ 1 ) ：

[式中、 Rは水素原子または水酸基を示し、

R¹ は水素原子またはメチル基を示し、

ハロゲン原子、

トリフルォロメチル基、

ニトロ基、

ァセチル基、

1〜4個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキル基、

1〜 4個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のァルコキシル基、

1〜 7個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキルメルカプト基、一般式— S— (CH₂) „-CH (R³) (R⁴) [式中の nは 1又は 2を示し、 R ³ は水素原子又はメチル基を示し、 R ⁴ は水酸基又は一般式 — N (R⁸) (R⁹) (式中の R⁸ は水素原子又はメチル基を示し、 R⁹ はメチル基、ベンジル基、又は置換ベンジル基を示し、あるいは R 8及び R 9が一緒になつて式中の窒素原子と共に置換ピロリジン環を示す。）で表されるアミノ基を示す。 ]

で表される置換アルキルメルカプト基、

次の一般式： — S0₂R⁵ (式中の R⁵ は、ァミノ基又は 1〜 3個の炭素原子を有するアルキル基を示す。）で表されるスルフォニル基、及び

次の一般式： — COO (CH₂) ₂ - N (R⁶) (R⁷) (式中の R ⁶及び R ⁷ はそれぞれ独立に水素原子、メチル基、又はェチル基を示す。）で表される置換ァミノエトキシカルボニル基からなる群から選ばれる基である。 ]

で表される 2 —ォキソ— 1 —ピロリジニルアルキルカルボン酸ァミド又はその製薬上許容できる酸付加塩である請求項 4 3〜4 8のいずれか 1項に記載の方法。

5 0 . 物質が、下記の化合物：

(1 ) 2 —ォキツー 1 —ピロリジニル酢酸 2， 6 —ジメチルァニリド；

(2) 4ーヒドロキシ一 2 —ォキソ一 1 ーピ αリジニル酢酸 2 , 6—ジェチルァニリド；

(3) 4 —ヒドロキシー 2 —ォキソ— 1 —ピロリジニル酢酸 2 , 6—ジメチルァニリド；

(4) 2— [ 2 —ォキソ—ピロリジニル] プロピオン酸 Ν— 3—ピリジニルアミド；

(5) 2—ォキソ— 1 —ピロリジニル酢酸 4—イソプロピルメ儿カプトァニリド、；

(6) 2— [ 2 —ォキソ一 1 一ピロリジニル] 一 1 —プロピオン酸— 4— ( 2 一プチルメルカプト）一ァニリド；

(7) 2 - [ 2 —ォキソ— 1 —ピロリジニル] 一プロピオン酸— 4 一イソプロピルァニリド；

(8) 2— [ 2 —ォキソ一 1 —ピロリジニル] 一プロピオン酸一 2 , 4—ジメチルァニリド；

(9) 2— [ 2 —ォキソ— 1 一ピロリジニル] —プロピオン酸ー 2 , 4， 6— トリメチルァニリド；

(10) 2 - [ 2 —ォキソ— 1 —ピロリジニル] —プロピオン酸— 2 —メトキシ — 5—メチルァニリド；

(1 1) 2— [ 2 —ォキソ一 1 —ピロリジニル] —プロピオン酸一 2， 6—ジクロロァニリド； ( 12) 2 —ピロリドンーァセタミド；

(13) 1 —ァニフィルー 2 —ピロリジノン；及び

(14) 4ーヒドロキシ一 2 一ォキソ一 1 ―ピロリジンァセ夕ミド；

からなる群から選ばれる化合物である、請求項 4 3〜4 8のいずれか 1項に記載の方法。

5 1 . 物質が、 2 —ォキソ一 1 一ピロリジニル酢酸 2 , 6—ジメチルァニリド、 2 —ピロリドン一ァセ夕ミド、 1 ーァニフィル一 2 —ピロリジノン、及び 4 一ヒドロキシー 2—ォキソ一 1 —ピロリジンァセ夕ミドからなる群より選ばれる化合物である、請求項 4 3〜4 8のいずれか 1項に記載の方法。

5 2 . 物質が、ネフイラセタムである、請求項 4 3〜4 8のいずれ 1項に記載の方法。

5 3 . 次の一般式（ 1 ) _:

[式中、 Rは水素原子または水酸基を示し、

R ¹ は水素原子またはメチル基を示し、

R ² はピリジル基または 1〜3個の同一又は異なる置換基で置換された置換フェニル基を示す。ここでフエニル基上の置換基は、

ハロゲン原子、

トリフルォロメチル基、

ニトロ基、

ァセチル基、

1〜4個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキル基、 1〜 4個の炭素原子を有する直鎖又は分技鎖のァルコキシル基、

1〜 7個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキルメルカプト基、一般式— S— (CH₂) _n-CH (R³) (R⁴) [式中の nは 1又は 2を示し、 R ³ は水素原子又はメチル基を示し、 R ⁴ は水酸基又は一般式 — N (R⁸) (R⁹) (式中の RS は水素原子又はメチル基を示し、 R⁹ はメチル基、ベンジル基、又は置換ベンジル基を示し、あるいは R 8及び R 9が一緒になつて式中の窒素原子と共に置換ピロリジン環を示す。）で表されるアミノ基を示す。 ]

で表される置換アルキルメルカプト基、

次の一般式：一 S0₂R⁵ (式中の R⁵ は、ァミノ基又は 1〜3個の炭素原子を有するアルキル基を示す。）で表されるスルフォニル基、及び

次の一般式：ー COO (CH₂) ₂— N (R⁶) (R⁷) (式中の R ⁶及び R ⁷ はそれぞれ独立に水素原子、メチル基、又はェチル基を示す。）で表される置換アミノエトキシカルボニル基からなる群から選ばれる基である。 ]

で表される 2—ォキソ— 1—ピロリジニルアルキルカルボン酸ァミド又はその製薬上許容できる酸付加塩を患者に投与することを特徵とする脳の神経伝達の長期改善のための処置方法。

5 4. 次の、（1) から（14)の群の中から選ばれる化合物を患者に投与することを特徴とする脳の神経伝達物質の長期改善のための処置方法。

(1) 2—ォキソ一 1—ピロリジニル酢酸 2， 6—ジメチルァニリド；

(2) 4—ヒドロキシー 2—ォキソ— 1—ピロリジニル酢酸 2， 6—ジェチルァニリド；

(3) 4ーヒドロキシ— 2—ォキソ— 1一ピロリジニル酢酸 2， 6—ジメチルァニリド；

(4) 2— [ 2—ォキソ一ピロリジニル] プロピオン酸 N— 3—ピリジニルアミド； (5) 2 —ォキソ一 1 —ピロリジニル酢酸 4 —イソプロピルメ儿カプトァニリド、；

(6) 2 - [ 2 —ォキソ— 1 —ピロリジニル] 一 1 一プロピオン酸一 4— ( 2 一プチルメルカプト）一ァニリド；

(7) 2— [ 2 —ォキソ— 1 一ピロリジニル] —プロピオン酸— 4 —イソプロピルァニリド；

(8) 2— [ 2 —ォキソ一 1 一ピロリジニル] 一プロピオン酸— 2， 4ージメチルァニリド；

(9) 2— [ 2 —ォキソ一 1 —ピロリジニル] —プロピオン酸— 2， 4， 6 - トリメチルァニリド；

(10) 2— [ 2 —ォキツー 1 —ピロリジニル] 一プロピオン酸ー 2 —メトキシ一 5—メチルァニリド；

(11) 2— [ 2 —ォキソ一 1 —ピロリジニル] 一プロピオン酸一 2 , 6—ジクロロァニリド；

(12) 2 —ピロリドン一ァセタミド；

(13) 1 —ァニソィルー 2 —ピロリジノン、又は、

(14) 4 —ヒドロキシー 2—ォキソ一 1 ―ピロリジンァセ夕ミド；

5 5 . ネフィラセタムを患者に投与することを特徴とするプロティンカイネース Cの活性化経路の長期活性化のための処置方法。

5 6 . ネフイラセ夕厶を患者に投与することを特徴とする電気刺激を必要としない L T P様作用の誘発のための処置方法。

5 7 . ネフイラセ夕ムを患者に投与することを特徴とする、プロテイン力イネース Cの活性化経路の長期間活性化と、シナプス前ニコチン性ァセチルコリン受容体を長期間活性化の相互作用による、分泌グルタミン酸の長期増加のための処置方法。

5 8 . ネフイラセ夕厶を患者に投与することを特徵とする、プロテイン力イネース cの活性化経路の長期活性化と、シナプス前ニコチン性ァセチ儿コリン受容体の長期活性化に基づく、脳神経の伝達の長期改善のための処置方法。

5 9 . ネフイラセタムを患者に投与することを特徴とする、プロテイン力イネース Cの活性化経路を活性化させることによる、電気刺激を必要としない L T P 様作用の誘発に基づく、脳の慢性硬膜下血症による痴呆症に対する治療のための処置方法。

6 0 . ネフイラセタムを患者に投与することを特徴とする、プロテイン力イネース Cの活性化経路を活性化させることによる、電気刺激を必要としない L T P 様作用の誘発に基づく、水頭症による痴呆症に対する治療のための処置方法。

6 1 . ネフイラセ夕厶を患者に投与することを特徴とする、プロテイン力イネース C活性化経路の活性化とシナプス前ニコチン性ァセチルコリン受容体の長期活性化の相互作用により、分泌グルタミン酸を長期間増大させ、海馬神経伝達を長期間改善させることを特徴とする向知性のための処置方法。

6 2 . ネフイラセ夕厶を患者に投与することを特徴とする、プロテインカイネ- ス C活性化経路、シナプス前ニコチン性アセチルコリン受容体を活性化し、グル夕ミン酸分泌を長期間増大させる海馬神経伝達の長期改善のための処置方法。

6 3 . ネフィラセタムを患者に投与することを特徴とする分泌グルタミン酸の長期増加のための処置方法。