WO1999012972A1

WO1999012972A1 - Anticorps monoclonal contre des monocytes humains

Info

Publication number: WO1999012972A1
Application number: PCT/JP1998/004035
Authority: WO
Inventors: Junichi Masuyama
Original assignee: Junichi Masuyama
Priority date: 1997-09-10
Filing date: 1998-09-09
Publication date: 1999-03-18
Also published as: JP3593032B2; EP1013668A1; US6515111B1; CA2303431A1

Description

明細書ヒト単核球に対するモノクローナル抗体

技術分野 - ：本発明はヒト単核球に対するモノクローナル抗体であって、炎症反応の研究、治療に有用なヒト単核球の血管内皮細胞培養後の血管外遊走を阻止するモノクローナル抗体及びこれを産生するハイプリドーマに関する。背景技術

炎症反応は生体防御の上で最も重要な生体反応であり、細菌やウィルス感染による組織障害を最小限に抑え、力、つ組織修復を促進する。しかしまた炎症反応は自己免疫性疾患などの原因不明の難治性疾患のように生体にとつて進行性の障害を引き起こすこともある。従って、炎症反応の機序や病態の解明はこれらの難治性疾患の治療に不可欠である。炎症反応の機序を考えるにあたって、末梢循環白血球の血管外組織への遊走は炎症の最も早期に見られる現象で、その制御は慢性炎症性疾患の治療戦略の重要な目標となっている。

モノクローナル抗体の使用や分子生物学的手法によって、白血球の血管外遊走の機序は精力的に研究され 1 9 9 0年代に入り大きな進歩があった。すなわち、白血球が血管外へ遊走する第一段階は白血球，内皮細胞間のセレクチンを介する緩い接着（ローリング）で始まり、次に白血球を介するインテグリンの活性化によつて内皮細胞への強し、接着が誘導されることが明らかになつた。しかしながら、白血球の血管外遊走が完結するために必要な血管内皮細胞への接着後の白血球の遊走の機序については、 C D 3 1抗原が NK細胞、好中球、単球においてその因子であるという説があるものの、特に免疫反応において中心的な役割を果たす T リンパ球については全く不明である。 Tリンパ球の血管内皮細胞への接着後の血管外遊走については、接着した細胞がすべて遊走するわけではなく、明らかに選択性が働レ、ている。このような選択性を決める因子は慢性炎症発症や進展に重要な役割を担っていることが強く推定される。その因子の実体や機能を明らかにすることは、炎症研究や炎症治療の開発には極めて重要で、多くの研究者が待ち望んでいるものである。このような因子を研究するにはその因子に ¾ "するモククーナル抗体を得ることが有用であるが、今日まで未だ得られていない。

従って、本発明の目的はヒト白血球、特に単核球の血管内皮細胞接着後の血管外遊走に関与する因子に対するモノクローナル抗体を提供することにある。発明の開示

そこで、本発明者は上記課題を解決すべく種々検討した結果、ヒト血管内皮細胞と接着性を有するヒト単核球、及びコラーゲンゲル上で単層培養されたヒト血管内皮細胞からゲル内へ遊走したヒト単核球を組み合せて抗原として用い、また抗体のスクリーニングではコラーゲンゲル上に培養した血管内皮細胞で Tリンパ球の接着，遊走の阻止を判定することにより、ヒト単核球の血管内皮細胞接着後の血管外遊走を阻止するモノクローナル抗体が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、ヒト単核球に対するモノクローナル抗体であって、ヒト単核球の血管内皮細胞接着後の血管外遊走を阻止する能力を有するモノクローナル抗体を提供するものである。

また、本発明は上記のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを提供するものである。図面の簡単な説明

図 1は、健常人の顆粒球、単球及びリンパ球の蛍光強度（本発明モノクロ一ナル抗体との反応性）を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、ヒト単核球を抗原 _として用いる細胞融合法、すなわちヒト単核球で免疫された哺乳動物の抗体産生細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合させることにより得られる。 … · .— ' ここで免疫される哺乳動物としては、マウス、ゥサギ、ラット、ャギ、ニヮトリ等が挙げられるカ、マウスがより好ましい。

抗原としてはヒト単核球であればよいが、ヒト血管内皮細胞と接着するヒト単核球（a ) と、コラーゲンゲル上で単層培養されたヒト血管内皮細胞からゲル内へ遊走したヒト単核球（b ) とを組み合せて使用するのが好ましく、（a ) を感作用抗原とし、（b ) を最終免疫用抗原として用いるのが特に好ましい。ヒト単核球は、末梢血、関節液、胸水等から得ることができるが、末梢血から採取したものが好ましい。

免疫方法は一般的手法に従うことができ、例えば上記の抗原単核球を通常の緩衝液ゃ生理食塩水に懸濁させたもの、あるレ、はこれとフロインドのアジュバンドとの混合液を哺乳動物に腹腔内、皮下等の適当な経路で投与して一時刺激後、必要に応じて同様の操作を繰返せばよい。本発明においては、前記（a ) の単核球を腹腔内投与で 4回以上、前記（b ) の単核球を最終免疫として静脈内投与す ¾ のが好ましい。抗原とする単核球の投与量は、投与経路、哺乳動物の種類等に応じて適宜決定されるが、マウスに腹腔内又は静脈内投与する場合は、通常投与量が 1回あたり 1 X 1 0 ⁷個/マウス程度とするのが適当である。

最終免疫から 2〜4日後に抗体産生細胞、例えば脾臓細胞、リンパ節、末梢血等を採取する。抗体産生細胞としては脾臓細胞が好ましい。

骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）としては、既に確立されている公知の各種細胞株、例えばマウスにおける P3/NSl/l-Ag4-KNSl)、 SP2/0- Agl4(SP2)、 Ρ3Λ63 - Ag8(x63)、 P3/x63-Ag8. Ul CP3Ul), F0、 MCP- 11、 x63. 653、 S194等、またラットにおける 210. RCY3. Agl. 2. 3(Y3)等が使用できる。

上記抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合反応は、公知の方法、例えばポリェチレングリコール法、電気融合法等により行なわれる。

. 融合後、抗体産生能と増殖能を獲得したハイプリドーマの選択は、例えば HA T培地で数日〜数週間培養することにより行なわれる。 - - · 一かくして得られるハイプリドーマから、目的とする抗体の産生株の検索を行なう。該目的抗体産生株の検索は、ヒト単核球の血管内皮細胞接着後の遊走能を測定することにより行なわれる。すなわち、ヒト単核球と血管内皮細胞との接着は阻止せず、かつ接着後の遊走を阻止するハイプリドーマを選択する。

選択したハイプリドーマのクロ一ニングは、限界希釈法ゃソ一夕一ローン法等により行なうことができる力、限外希釈法によるのが好ましい。

かくして得られるハイプリドーマは、通常の培地で継代培養でき、また液体窒素中で容易に長期間安定に保存することができる。

上記ハイプリドーマからの本発明モノクローナル抗体の製造は、常法に従い該ハイプリドーマを培養し、培養上清から分離する方法、あるいは上記ハイプリド一マをこれと適合性のある哺乳動物に投与し、増殖させ、該動物の腹水より分離する方法等の通常の方法により実施できる。前者の方法は特に高純度のものを得るのに適しており、後者の方法は大量生産に適している。 '' 上記で製造された本発明のモノクローナル抗体は、さらに精製することもでき、例えば硫安分画法、 D E A Eセルロースカラ厶クロマトグラフィー等のゲル濾過法などの通常の分離手段によりィ厶ノグロブリン画分を単離することにより本発明のモノクローナル抗体を収得できる。実施例

次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。実施例 1

( 1 ) 抗原の調製

抗原はヒト末梢血単核球を動物に免疫する前にヒト臍帯静脈内皮細胞と共培養

-し、非接着性単核球を除いた残りの単核球（a) を使用した。ただし最終免疫においては、タイプ 1 コラーゲンゲル上に単層培養したヒト臍帯静脈内皮細胞に核球を添加し、 5時間後に単層内皮細胞下のコラーゲンゲル内へ遊走した単核球 (b) を単離し、これを抗原として用いた。すなわち、タイプ 1 コラーゲンの最終濃度を 0. 8 mgZTT にしたゲル状培養液を 6 0■のプラスチックペトリデイツシュに作り、この上に内皮細胞増殖因子を含む培養液に浮遊させたヒト臍帯静脈内皮細胞を加え単層になるように培養した。完全に単層になったのち、単核球を添加培養した。一定時間後、コラーゲンゲル上の内皮細胞とゲル内へ遊走しなかった単核球を 0. 4 %EDTAで除去したのち、コラーゲンゲルをコラーゲナ一ゼ処理し、ゲル内へ遊走した単核球（b) を単離した。

(2) 免疫

上記単核球（_a) をリン酸緩衝液に浮遊させ、マウスの場合 1匹あたり 1 X I 0⁷個を腹腔内へ注入した。これを 2〜4週ごとに 4回以上繰返した。最終免疫は、上述したようにコラーゲンゲル内から単離した約 1 X 1 0⁷個の遊走単核球（b) をマウス静脈内へ直接投与した。最終免疫 2〜4日後にマウスから脾臓を摘出して抗体産生細胞を含む 1 X 1 0³個の脾臓細胞浮遊液を調製し、ミエローマ細胞株との融合に供した。この細胞株は 1 0%ゥシ胎仔血清（FCS) を含む RPM I - 1 6 4 0培地で継代培養し、調製した脾臓細胞数の 5〜1 0分の

1を使用した。

( 3 ) 細胞融合

イスコフ培地に懸濁した P3/NS1/1- Ag4- KNS- 1)を 2 X 1 0⁷個と上記脾臓細胞 1 X 1 0⁸とを混合、遠心し、上清を吸引したのち、 3 7°Cに保温したポリェチレングリコール 4 0 0 0、 1 を緩徐に滴下した。次に、イスコフ培地をさらに計 1 0 になるまで同様に添加し、これを遠沈しブこのぢ、 -―ポリ—ヹチレングリコ一ルを含む上清を吸引した。細胞ペレツトをイン夕一ロイキン 6を添加した HA T 培地で脾臓細胞が 1 X 1 0 / m&にるように調製し、これを 1穴あたり 0 . 1 を 9 6穴平底プラスチゾクプレートに撒き、ハイプリドーマが十分増殖するまで 3 7 °Cにて培養した。 - — ノ —一

( 4 ) スクリーニング

選択されたハイプリドーマ群の培養上清を、ヒト単核球の血管内皮細胞接着後の遊走を測定する系を用いて、目的とする抗体を産生するハイプリドーマをスクリーニングした。すなわち、（ 1 ) で記述した方法を応用し、 9 6穴平底プラスチックプレートに添加したコラーゲンゲル 5 0 / ^の上に単層培養したヒト臍帯静脈内皮細胞を用いた。このように用意したプレートにハイプリドーマ上清を 5 0 ^とヒト単核球浮遊液 5 0 ^を加え培養した。一定時間後、非接着細胞を除去し、位相差顕微鏡で内皮細胞への単核球接着状態をハイプリドーマ培養上清未添加のコントロールと比較し、差のないものを選択した。次に、選択した穴の内皮細胞を 0 . 4 % E D T A溶液にてコラーゲンゲルより除去後、ゲル内へ遊走した単核球数を位相差顕微鏡下で測定した。コントロールに比べ、 5 0 %以上遊走を抑制したハイブリドーマを目的の抗体を産生しているものとして選択した。ヽ

( 5 ) 抗体産生ハイプリドーマのクローニング

選択したハイプリドーマのクローニングには限界希釈法を利用した。遊走抑制率の高レ、抗体を産生するハイブリドーマにっレ、て限界希釈法を 3〜 4回繰返し、安定して抗体価の高いハイプリドーマを選択し、これを該抗体産生ハイプリドーマ株とした。

( 6 ) 抗体の精製

得られたハイプリドーマ株を I L一 6を含む増殖培地に浮遊させて増殖させたのち、これを同系統のマウスの腹腔内へ注入して腹水を得た。次に、プロテイン Aカラムを使って腹水から I gG画分を精製した。

上記で得られたモノク口一ナル抗体 4 C 8は、そのィソタイプが I g G 3で、 1

リンパ球及び Tリンパ球を含む単核球の内皮細胞接着後の内皮細胞下への遊走をおよそ 80 %〜 90 %阻止した。 . 一得られた本発明 ωモノクローナル抗体の性質を挨討した ό そめ糸果、本発明モノクローナル抗体は、（ 1 ) ヒトリンパ球、 ΝΚ細胞、単球、好酸球を含む顆粒球、及び血管内皮細胞など接着性細胞に反応する；（2) ァクチン重合など細胞骨格蛋白質に変化を与える；（3) ヒトリンパ球にケモカイン様又は化学走化性物質様の遊走刺激を与える；（4) ヒトリンパ球の基質への接着を惹起させる； (5) CD 6 9抗原など細胞活性化関連分子の発現を誘導する；（ 6 ) 好酸球を含む顆粒球に反応し、細胞活性化を刺激する；（7) 抗リウマチ薬投与による慢性関節リゥマチ患者単核球、顆粒球の 4 C 8発現を抑制する；（ 8 ) 悪性腫瘍細胞に反応する等の作用を有することが判明した。次に、各項目についてその方法と結果を記載する。

1 ) ヒトリンパ球、 NK細胞、単球、好酸球を含む顆粒球、及び血管内皮細胞と反応する。

方法：モノクローナル抗体 4 C 8を蛍光標識キットで蛍光標識したのち、抗凝固剤を添加した採血管に採取した末梢血 0. 1;^にこれを適当量を加え、氷上で 30分静置した。これを氷冷した 0. 1 %ゥシ血清アルブミン（BSA) 添加リン酸緩衝液（PBS) で 3回洗浄後、溶血剤にて溶血させ、さらにパラホルムァルデヒドで固定した。血管内皮細胞は 0. 4 % E D Τ Α処理でプラスチックプレ —トより剝離させ、 3 x 1 0⁵個を白血球と同様に染色した。これら染色した細胞はフローサイトメトリーにて、顆粒球、単球、リンパ球各画分にゲーティングを行ない、それぞれの蛍光強度を測定した。

結果：図 1に示すように、健常者のリンパ球 '単球は、人により異なる力^ 90 %以上の細胞が 4 C 8抗原を発現し、リンパ球が最も強い蛍光強度を示し、単球がそれに続いた。リンパ球画分には約 1 0 %の NK細胞を含むので N K細胞もこの分子を発現しているのは明らかである。一方、顆粒球ではほとんど発現していなかつた。しかし、慢性関節リゥマチやその他の慢性炎症性疾患の一部の患者では顆粒球の 4 C 8抗原の明らかな発現がみられた。また、アトピー性疾患では好酸球に同様の発現がみられた。また、接着性細胞、例えば血内皮細胞で、増殖が止まった状態では発現がみられなかったが、増殖中の細胞では明らかな発現細胞集団がみられた。

2 ) ァクチン重合など細胞骨格蛋白質に変化を与える。

方法： 3〜 3 0 z g Z の精製抗 4 C 8抗体又はコントロール I g G 3を 1 0 0 // Zwel 1で 1 8時間、 4 °Cで処理した 9 6穴平底ブラスチックプレートを用意した。健常人末稍血から比重遠沈法にて単核球を採取し、次にこれのナイロンウールカラム素通り分画をリンパ球とし、 1 0 % じ 3を含む？1^ 1 - 1 6 4 0培地に懸濁した。リンパ球 3 X 1 0 ⁵個を用意したプレートの各穴に添加し、 1〜3時間 3 7 °Cで培養した。培養後、ピペットで細胞をよく吹き付けて採取し、これを P B Sで 1回洗净した。 Phal loidinは重合したァクチン、すなわちフイラメントァクチンに特異的に結合するので、蛍光標識した Phal loidinを 3 %バラフオル厶アルデヒドで固定した単核球に処理し、その結合程度をフローサイトメトリ一で調べた。 " 結果：フローサイトメトリーでゲーティングしたリンパ球画分では、 Phal loidin陽性細胞数はコントロール I g G 3で 2 0 %前後であつたが、抗 4 C 8抗体処理プレートでは濃度依存性に Phal loidin陽性細胞は増加し、最大 6 5 %に達した。これより、 4 C 8抗原を介する刺激はリンパ球にァクチンの重合を誘導することが明らかになつた。

3 ) ヒトリンパ球にケモカイン様の遊走刺激を与える。

方法：リンパ球表面上の 4 C 8抗原の刺激によってリンパ球の遊走が誘導されるかを調べるため、抗 4 C 8抗体をリガンドとして使用した。すなわち、 9 6穴平底プレートに抗 4 C 8抗体を種々の濃度で混ぜたコラ一ゲンゲルを作.り、；れに血清を含まない Ml 9 9培地に浮遊させたリンパ球 3 X 1 0⁵個を各穴に添加した。 3時間の培養後、 0. 4 %EDTAを加え、ゲル上に付着したリンパ球を除去し、位相差顕微鏡下でゲル内に遊走した単位面積当たりのリンパ球数を数えた。 ' 一 —- 結果：抗 4 C 8抗体 1 g Ζτ^の濃度で遊走刺激がみられ、 1 0 g Ζτηβで最大ではコントロールの 8倍に達した。しかし、 1 0 0〃 gZmの高濃度では再びコントロールレベルに戻り、ケモカインや化学走化性因子のように 1峰性の濃度依存性を示した。以上より、 4 C 8抗原を介する刺激はリンパ球に遊走を誘導することが明らかになった。

4) ヒトリンパ球の基質への接着を惹起させる。

方法： 2) に示したごとく抗 4 C 8抗体を処理したプレートをさらに 3 % BSAを 2時間、 3 7°Cで処理した。これに、 ⁵¹C rで標識したヒトリンパ球を 3 X 1 0⁵個添加し、 1時間、 3 7 °Cで培養した。培養後、非接着細胞を除去し、接着細胞を 1 Nの N a〇 Hで溶解させたのちガンマカウンタ一にてその放射活性を測定した。添加した細胞全体の放射活性とコントロール穴での放射活性の差を分母とし、また 4 C 8抗体処理穴の放射活性とコントロール穴での放射活性の差を分子として割り出した値を 1 0 0倍したものを％接着率とした。 ' 結果：抗 4 C 8抗体 1〜 1 0 0 g/ の濃度で、濃度依存性に細胞接着は増加し、 1 0 Q j g/r で約 S 0%の細胞がプレートへの接着を示した。一方、コントロール I g G 3では全濃度で細胞接着は 5 %以下であつた。 4 C 8抗原を介する刺激はリンパ球に基質への接着を著しく高めることが明らかになった。

5) CD 6 9抗原など細胞活性化関連分子の発現を誘導する。

方法： 2) に示したごとく抗 4 C 8抗体を処理したプレートを用意し、これに同様に調製したヒトリンパ球を添加した。 1時間培養後、リンパ球を採取し蛍光標識抗 CD 6 9モノクロ一ナル抗体で染色したのち、フローサイトメトリーで蛍光強度を測定した。

結果：コントロールでは約 2 %の陽性率に対し、抗 4 C 8抗体では約 2 0 %の細胞が、とくに C D 2 6陽性 Tリンパ球において、 C D 6 9陽性となつた。この陽性率は培養時間の延長によって増加した。 4 C 8抗原の刺激はリンパ球の活性化を惹起することが明らかになつた。 - '

6 ) 好酸球を含めた顆粒球に反応し、細胞活性化を刺激する。

方法： 4 C 8抗原は健常人顆粒球では発現しないが、慢性関節リウマチ患者などでは発現する。そこでこのような患者から顆粒球を採取し、 4 C 8抗原の刺激が顆粒球を活性化させるか調べた。すなわち、末梢血を 1 %デキストラン硫酸に 1 : 0 . 7 5の割合で混合し、 4 0〜 5 0分静置したのち上層をとり、これを Fi col l- Conray液へ重層した。 3 0分遠沈後、上清を吸引して細胞ペレツトを P B Sでさらに 4 °C下で 3回洗浄した。最後に顆粒球を R P M I — 1 6 4 0培地に浮遊させた。これを、 2 ) に示したごとく抗 4 C 8抗体を処理したプレートに添加した。 3 0分後、これらの細胞を採取し、細胞活性化により発現が増強する C D 1 1 b抗原を蛍光標識抗 C D 1 1 b抗体を用いフローサイトメトリーで調べた。

結果：抗 4 C 8抗体の濃度が高くなるにした力、、顆粒球表面の C D 1 1 b抗原の平均蛍光強度が有意に増強された。すなわち、 4 C 8抗原を介する刺激は粒球を活性化することが明らかになつた。

7 ) 抗リゥマチ薬投与による慢性関節リゥマチ患者単核球 ·顆粒球の 4 C 8発現抑制効果。

方法：リゥマチ患者末梢血単核球及び顆粒球を蛍光標識抗 4 C 8抗体で染色後、フローサイトメトリーにてリンパ球.単球 ·顆粒球の各分画の 4 C 8発現の平均蛍光強度を測定した。

結果：抗リゥマチ薬が奏功したリゥマチ患者では、未治療または活動期の患者に比べ、単核球の 4 C 8抗原は減弱し、とくに単球 4 C 8抗原の発現は約 1 / 4 に著しく減弱していた。また一部の活動期リウマチ患 ¾^の頼粒球に ¾現—し

4 C 8抗原は治療により消失した。すなわち、抗リウマチ薬の薬理作用の解明のほか、リゥマチ患者の単球などの 4 C 8の発現を調べることにより抗リゥマチ薬の効果判定や予測など臨床的な応用が可能である。

8 ) 悪性腫瘍細胞株に反応する。 - ^ 方法：悪性リンパ腫由来の細胞株 S 3と Jurkatを蛍光標識抗 4 C 8抗体で処理し、その 4 C 8抗原の発現をフローサイトメトリーで調べた。

結果： Jurkatには 4 C 8抗原は発現しなかったが、 SKW3では 8 5 %の細胞に 4 C 8抗原が陽性であった。ある種の腫瘍細胞には 4 C 8抗原が存在することが明らかになった。産業上の利用可能性

これまで、炎症を代表とする白血球の血管内皮細胞接着後の血管外遊走や悪性腫瘍の転移の機序にっレ、ては多くは未だ不明のままであるが、本発明によって、これらの機序が細胞、蛋白質、及び分子レベルで解析することが可能となった。また、本発明抗体によって認識される分子の発現がさまざまな病態や疾患と関連していることから、臨床診断 ·治療への応用が可能である。

Claims

請求の範囲 ―

1 . ヒト単核球に対するモノクローナル抗体であって、ヒト単核球の血管内皮細胞接着後の血管外遊走を阻止する能力を有するモノクローナル抗体。

2 . ヒト血管内皮細胞と接着するヒト単核球を感作用抗原と-し、コラーゲンゲル上で単層培養されたヒト血管内皮細胞からゲル内へ遊走したヒト単核球を最終免疫用抗原として免疫された哺乳動物の抗体産生細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との融合細胞により産生されるものである請求項 1記載のモノクローナル抗体。

3 . 請求項 1記載のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ。

4 . ヒト血管内皮細胞と接着するヒト単核球を感作用抗原とし、コラーゲンゲル上で単層培養されたヒト血管内皮細胞からゲル内へ遊走したヒト単核球を最終免疫用抗原として免疫された哺乳動物の抗体産生細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合させることにより得られるものである請求項 3記載のハイプリドーマ。