WO1998042852A1 - Expression von herbizid-bindenden polypeptiden in pflanzen zur erzeugung von herbizidtoleranz - Google Patents

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WO1998042852A1
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Achim Möller
Ralf-Michael Schmidt
Helmut Schiffer
Udo Rabe
Udo Conrad
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing herbicide-tolerant plants by expressing an exogenous herbicide-binding polypeptide in plants or parts of plants.
  • the invention further relates to the use of the corresponding nucleic acids coding for a polypeptide, an antibody or parts of an antibody with herbicide-binding properties in transgenic plants and the plant itself transformed in this way.
  • Transgenic plants are currently used in various biotechnological areas. Examples are insect-resistant plants (Vaek et al. Plant Cell 5 (1987), 159-169), virus-resistant plants (Powell et al. Science 232 (1986), 738-743) and ozone-resistant plants (Van Camp et al. BioTech 12: 165-168 (1994). Examples of genetically engineered quality increases are: increasing the shelf life of fruit (Oeller et al. Science 254 (1991), 437-439), increasing the starch production in potato tubers (Stark et al.
  • the herbicide tolerance is characterized by a type or level of increased tolerance of the plant or of parts of plants to the applied herbicide. This can be done in different ways.
  • the known methods are the use of a metabolism gene such as, for example, the pat gene in connection with glufosinate resistance (WO 8705629) or a target enzyme which is resistant to the herbicide, such as in the case of enolpyruvylshiki-mat-3-phosphate synthase ( WO 9204449), which is resistant to glyphosate, and the use of a herbicide in cell and tissue culture for the selection of tolerant plant cells and from them sulting resistant plants as described for acetyl CoA carboxylase inhibitors (US 5162602, US 5290696).
  • a metabolism gene such as, for example, the pat gene in connection with glufosinate resistance (WO 8705629) or a target enzyme which is resistant to the herbicide, such as in the case of enolpyruvylshiki
  • Antibodies are proteins that are part of the immune system. Common to all 5 antibodies is their spatial, globular structure, the structure of light and heavy chains as well as their fundamental ability to bind molecules or parts of a molecular structure with high specificity (Alberts et al., In: Molecular Biology of the Cell, 2nd edition 1990 , VCH Verlag, ISBN 3-527-27983-0,
  • hybrid somatic cell lines as a source of antibodies against specific antigens is based on ar-
  • each hybridoma cell is derived from a single B cell as a clone, all of the antibody molecules produced have the same structure, including the antigen binding site. This method has greatly promoted the use of antibodies because now antibodies with a single, known
  • phage display method 40 for producing antibodies in which the immune system and the various immunizations in the animal are bypassed, has existed for some years.
  • the affinity and specificity of the antibody is tailored in vitro (Winter et al., Ann. Rev. I Munol. 12 (1994), 433-455; Hoogenboom TIBTech Vol 15 (1997), 62-70).
  • Gene segments which contain the 45 coding sequence of the variable region of antibodies, ie the antigen binding site are fused with genes for the coat protein of a bacteriophage. Then you infect bacterial with phages containing such fusion genes.
  • the resulting phage particles now have envelopes with the antibody-like fusion protein, with the antibody-binding domain pointing outwards.
  • the phage which contains the desired antibody fragment and specifically binds to a specific antigen can now be isolated from such a phage display library.
  • Each phage isolated in this way produces a monoclonal, antigen-binding polypeptide which corresponds to a monoclonal antibody.
  • the genes for the antigen binding site which are unique for each phage, can be isolated from the phage DNA and used to construct complete antibody genes.
  • This resistance-imparting gene is isolated from such a microorganism, cloned into suitable vectors and then, after successful transformation, expressed in herbicide-sensitive crop plants (WO 96/38567).
  • the object of the present invention was to develop a novel, generally applicable, genetic engineering method for producing herbicide-tolerant transgenic plants.
  • This object was surprisingly achieved by a method of expressing an exogenous polypeptide, antibody or parts of an antibody with herbicide-binding properties in the plants.
  • a first subject of the present invention relates to the production of a herbicide-binding antibody and the cloning of the associated gene or gene fragment.
  • a suitable antibody is first generated that binds the herbicide. This can include by immunizing a vertebrate, usually a mouse, rat, dog, horse, donkey or goat with an antigen.
  • the antigen is a herbicidally active compound which is linked or associated via a functional group to a higher molecular weight carrier such as bovine serum albumin (BSA), chicken egg white (ovalbumin), keyhole limpet hemocyanin (KLH) or other carriers.
  • BSA bovine serum albumin
  • ovalbumin chicken egg white
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • This approach initially provides a polyclonal serum that contains antibodies with different specificities.
  • the first approach uses the fusion of antibody-producing cells with cancer cells to form a hybridoma cell culture that continuously produces antibodies. By separating the clones it contains, it ultimately leads to a homogeneous cell line that produces a defined monoclonal antibody.
  • the cDNA is the so-called single-chain anti ⁇ body (Single chain antibody - scFv) for the antibody or parts of the antibody from such a monoclonal cell line. Isolated. These cDNA sequences can then be cloned into expression cassettes and used for functional expression in prokaryotic and eukaryotic organisms, including plants.
  • a herbicide-resistant plant can also be produced by cloning the gene of this catalytic antibody and expressing it in a plant.
  • the invention particularly relates to expression cassettes, the coding sequence of which codes for a herbicide-binding polypeptide or its functional equivalent, and the use thereof for the production of a herbicide-tolerant plant.
  • the nucleic acid sequence can e.g. be a DNA or a cDNA sequence.
  • Coding sequences suitable for insertion into an expression cassette according to the invention are, for example, those which contain a DNA sequence from a hybridoma cell which codes for a polypeptide with herbicide-binding properties and which impart resistance to inhibitors of plant enzymes to the host.
  • an expression cassette according to the invention also contain regulatory nucleic acid sequences which control the expression of the coding sequence in the host cell.
  • an expression cassette according to the invention comprises upstream, i.e. a promoter at the 5 'end of the coding sequence and downstream, i.e. at the 3 'end a polyadenylation signal and optionally further regulatory elements which are operatively linked to the intervening coding sequence for the polypeptide with herbicide-binding properties and / or transit peptide.
  • An operative link is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can perform its function as intended in the expression of the coding sequence.
  • sequences preferred but not limited to the operative linkage are targeting sequences to ensure subcellular localization in the apoplast, in the plasma membrane, in the vacuole, in plastids, in the mitochondrion, in the endoplasmic reticulum (ER), in the cell nucleus, in oil - corpuscles or other compartments and translation enhancers such as the 5 'guiding sequence from the tobacco mosaic virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987) 8693-8711).
  • any promoter that can control the expression of foreign genes is suitable as promoters of the expression cassette according to the invention.
  • a plant promoter or a promoter derived from a plant virus is preferably used in particular.
  • the CaMV 35S promoter from the cauliflower mosaic virus is particularly preferred (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294).
  • This promoter contains different identification sequences for transcriptional effectors, which in their entirety lead to permanent and constitutive expression of the introduced gene (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202).
  • the expression cassette according to the invention can also contain a chemically inducible promoter, by means of which the expression of the exogenous polypeptide in the plant can be controlled at a specific point in time.
  • a chemically inducible promoter by means of which the expression of the exogenous polypeptide in the plant can be controlled at a specific point in time.
  • promoters as e.g. the PRPl promoter (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), a promoter induced by salicylic acid (WO 95/1919443), a promoter induced by benzenesufonamide (EP 388186), a by Scisic acid-inducible (EP335528) or an ethanol- or cyclohexanone-inducible (W09321334) promoter are described in the literature and can be used inter alia be used.
  • promoters are particularly preferred which ensure expression in tissues or parts of plants in which the herbicidal action develops. Promoters which ensure leaf-specific expression should be mentioned in particular.
  • the promoter of the cytosolic FBPase from potatoes or the ST-LSI promoter from potatoes should be mentioned (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245).
  • the expression cassette according to the invention can therefore contain, for example, a seed-specific promoter (preferably the USP or LEB4 promoter, the LEB4 signal peptide, the gene to be expressed and an ER retention signal.
  • a seed-specific promoter preferably the USP or LEB4 promoter, the LEB4 signal peptide, the gene to be expressed and an ER retention signal.
  • the structure of the cassette is shown in FIG. 1 using the example of a single chain Antibody (scFv gene) is shown schematically as an example.
  • An expression cassette according to the invention is produced by fusing a suitable promoter with a suitable polypeptide DNA and preferably a DNA coding for a chloroplast-specific transit peptide inserted between the promoter and polypeptide DNA and a polyadenylation signal according to common recombination and cloning techniques, as described, for example, in T. Maniatis, EF Fritsch and J.
  • sequences which target in the apoplasts, plastids, the vacuole, in the plasma membrane, the mitochondrium, the endoplasmic reticulum (ER) or due to a lack of corresponding operative sequences remaining in the compartment of formation, the cytosol ensure (Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423). Localization in the ER and the cell wall has proven particularly beneficial for the amount of protein accumulation in transgenic plants
  • the invention also relates to expression cassettes whose coding sequence codes for a herbicide-binding fusion protein, part of the fusion protein being a transit peptide which controls the translocation of the polypeptide.
  • Chloroplast-specific transit peptides are particularly preferred which, after translocation of the herbicide-binding polypeptide into the plant chloroplasts, are enzymatically split off from the herbicide-binding polypeptide part.
  • the transit peptide is particularly preferably derived from plastidic transketolase (TK) or a functional equivalent of this transit peptide (e.g. the transit peptide of the small subunit of the Rubisco or the ferredoxin NADP oxidoreductase).
  • the polypeptide DNA or cDNA required for the production of expression cassettes according to the invention is preferably amplified with the aid of the polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Methods for DNA amplification by means of PCR are known, for example from Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990).
  • the PCR-generated DNA fragments can expediently be checked by sequence analysis to avoid polymerase errors in constructs to be expressed.
  • the inserted nucleotide sequence coding for a herbicide-binding polypeptide can be produced synthetically or obtained naturally or contain a mixture of synthetic and natural DNA components.
  • synthetic nucleotide sequences are generated with codons that are preferred by plants. These codons preferred by plants can be determined from codons with the highest protein frequency, which are described in most interesting plant species can be expressed.
  • various DNA fragments can be manipulated in order to obtain a nucleotide sequence which expediently reads in the correct direction and which is equipped with a correct reading frame.
  • adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • the promoter and terminator regions according to the invention should expediently be provided in the transcription direction with a linker or polylinker which contains one or more restriction sites for the insertion of this sequence.
  • the linker has 1 to 10, usually 1 to 8, preferably 2 to 6, restriction sites.
  • the linker has a size of less than 100 bp within the regulatory areas, often less than 60 bp, but at least 5 bp.
  • the promoter according to the invention can be both native or homologous and foreign or heterologous to the host plant.
  • the expression cassette according to the invention contains, in the 5 '-3' transcription direction, the promoter according to the invention, any sequence and a region for the transcriptional termination. Different termination areas are interchangeable.
  • Preferred polyadenylation signals are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially contain T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid correspond to pTiACH ⁇ (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 ff) or functional equivalents.
  • An expression cassette according to the invention can contain, for example, a constitutive promoter (preferably the CaMV 35 S promoter), the LeB4 signal peptide, the gene to be expressed and the ER retention signal.
  • a constitutive promoter preferably the CaMV 35 S promoter
  • the structure of the cassette is shown schematically in Figure 2 using the example of a single-chain antibody (scFv gene).
  • the amino acid sequence KDEL lysine, aspartic acid, glutamic acid, leucine
  • KDEL lysine, aspartic acid, glutamic acid, leucine
  • the fused expression cassette which codes for a polypeptide with herbicide-binding properties, is preferably cloned into a vector, for example pBin19, which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens.
  • Agrobacteria transformed with such a vector can then be used in a known manner to transform plants, in particular crop plants, such as e.g. of tobacco plants can be used, for example by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • the transformation of plants by agrobacteria is known, among other things, from F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S.D. Kung and R. Wu,
  • transgenic plants can be regenerated from the transformed cells of the wounded leaves or leaf pieces which contain a gene integrated into the expression cassette according to the invention for the expression of a polypeptide with herbicide-binding properties.
  • an expression cassette according to the invention is inserted as an insert in a recombinant vector whose vector DNA contains additional functional regulation signals, for example sequences for replication or integration.
  • Suitable vectors are inter alia in "Method in Plant Molecular Biology and Biotechnology” (CRC Press), Chap. 6/7, p.71-119 (1993).
  • the expression cassettes according to the invention can be cloned into suitable vectors which enable their multiplication, for example in E. coli.
  • suitable vectors include pBR332, pUC series, M13mp series and pACYC184.
  • Another object of the invention relates to the use of an expression cassette according to the invention for the transformation of plants, plant cells, plant tissues or parts of plants.
  • the aim of the use is preferably to impart resistance to inhibitors of plant enzymes.
  • the expression can take place specifically in the leaves, in the seeds or in other parts of the plant.
  • Such transgenic plants, their reproductive material and their plant cells, tissue or parts thereof are a further subject of the present invention.
  • transformation The transfer of foreign genes into the genome of a plant is called transformation. There are the described
  • Plant tissues or plant cells used for transient or stable transformation are protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic approach with the gene gun, electroporation,
  • the construct to be expressed is preferably cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res.
  • Agrobacteria transformed with an expression cassette according to the invention can then be used in a known manner to transform plants, in particular crop plants, such as cereals,
  • Functionally equivalent sequences which code for a herbicide-binding polypeptide are, according to the invention, those sequences which, despite a different nucleotide sequence, still have the desired functions. Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described here, as well as artificial nucleotide sequences, for example those obtained by chemical synthesis and adapted to the codon usage of a plant.
  • a functional equivalent is also understood to mean, in particular, natural or artificial mutations of an originally isolated sequence encoding the herbicide-binding polypeptide, which furthermore show the desired function. Mutations include substitutions, additions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues.
  • the present invention also encompasses those nucleotide sequences which are obtained by modification of this nucleotide sequence. The aim of such a modification can e.g. further narrowing down the coding sequence contained therein or e.g. also the insertion of further restriction enzyme interfaces.
  • Functional equivalents are also those variants whose function is weakened or enhanced compared to the original gene or gene fragment.
  • artificial DNA sequences are suitable as long as they induce the desired resistance to herbicides, as described above.
  • Such artificial DNA sequences can be determined, for example, by back-translating proteins constructed using molecular modeling, which have herbicide-binding activity, or by in vitro selection. Coding DNA sequences which are obtained by back-translating a polypeptide sequence according to the codon usage specific for the host plant are particularly suitable. The specific codon usage can easily be determined by a person skilled in plant genetic methods by computer evaluations of other, known genes of the plant to be transformed.
  • Sequences which code for fusion proteins are to be mentioned as further suitable nucleic acid sequences according to the invention, part of the fusion protein being a non-plant herbicide-binding polypeptide or a functionally equivalent part thereof.
  • the second part of the fusion protein can be, for example, another polypeptide with enzymatic activity or an antigenic polypeptide sequence with the aid of which it is possible to detect scFvs expression (for example mye-tag or his-tag).
  • this is preferably a regulatory protein sequence, such as a signal or transit peptide, which directs the polypeptide with herbicide-binding properties to the desired site of action.
  • the invention also relates to the expression products produced according to the invention and to fusion proteins composed of a transit peptide and a polypeptide with herbicide-binding properties.
  • Resistance or tolerance in the context of the present invention means the artificially acquired resistance to the action of plant enzyme inhibitors. It includes the partial and, in particular, the complete insensitivity to these inhibitors for at least one generation of plants.
  • the primary site of action of herbicides is generally leaf tissue, so that leaf-specific expression of the exogenous herbicide-binding polypeptide can offer adequate protection.
  • the action of a herbicide need not be limited to the leaf tissue, but can also be tissue-specific in all other parts of the plant.
  • constitutive expression of the exogenous herbicide-binding polypeptide is advantageous.
  • inducible expression may also appear desirable.
  • the effectiveness of the transgenically expressed polypeptide with herbicide-binding properties can be determined, for example, in vitro by increasing the number of shoots on herbicide-containing medium by means of graduated concentration series or by means of seed germination tests.
  • a change in the type and level of herbicide tolerance of a test plant can be tested in greenhouse experiments.
  • the invention also relates to transgenic plants transformed with an expression cassette according to the invention, and to transgenic cells, tissues, parts and propagation material of such plants.
  • Transgenic crop plants such as e.g. Cereals, corn, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, potato, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species.
  • transgenic plants, plant cells, tissues or parts can be treated with an active ingredient which inhibits the plant enzymes, as a result of which those which have not been successfully transformed Plants, cells, tissues or parts of plants die.
  • suitable active ingredients are, in particular, 5- (2-chloro-4- (trifluoromethylphenoxy) -2-nitrobenzoic acid (acifluorfen) and 7-chloro-3-methylquinoline-8-carboxylic acid (Quinmerae), and also metabolites and functional derivatives of these compounds DNA inserted into the expression cassettes according to the invention and coding for a polypeptide with herbicide-binding properties can thus also be used as a selection marker.
  • the present invention offers the advantage that, after induction of a selective resistance of the crop plant to plant enzyme inhibitors, these inhibitors can be used as specific herbicides against non-resistant plants.
  • these inhibitors can be used as specific herbicides against non-resistant plants.
  • the following herbicidal compounds from groups bl - b41 can be mentioned as non-limiting examples of such inhibitors:
  • b2 amides allidochlor (CDAA), benzoylprop-ethyl, bromobutide, chlorothiamide, dimepiperate, dimethenamid, diphenamid, etobenzanid (benzchlomet), flamprop-methyl, fosamin, isoxaben, monalide, naptalame, pronamid (propyzamid), propanil
  • b3 aminophosphoric acids bilanafos, (bialaphos), buminafos, glufosinate-ammonium, glyphosate, sulfosate
  • 2,4-D, 2,4-DB clomeprop, dichlorprop, dichlorprop-P, dichlorprpp-P (2,4-DP-P), fenoprop (2,4,5-TP), fluoroxypyr, MCPA, MCPB, mecoprop, mecoprop-P, napropamide, napropanilide, tri-clopyr
  • b9 Bleacher clomazone (dimethazone), diflufeniean, fluorochloridone, flupoxam, fluridone, pyrazolate, sulcotrione (chloromesulone)
  • BlO carbamates asulam, barban, butylate, carbetamide, chlorobufam, chloropropam, cyeloate, desmedipham, dialallate, EPTC, esproearb, molinate, orbencarb, pebulate, phenisopham, phenmedipham, propam, prosulfocarb, pyributicarb, sulfallate (CD ), terbu-carb, thiobencarb (benthiocarb), tiocarbazil, triallate, vernolate
  • bl2 chloroacetanilides acetochlor, alachlor, butachlor, butenachlor, diethatyl ethyl, dimethachlor, metazachlor, metolachlor, pretilachlor, propachlor, prynachlor, terbuchlor, thenylchlor, xylachlor
  • bl3 cyclohexenones alloxydim, caloxydim, clethodim, cloproxydim, cycloxydim, sethoxydim, tralkoxydim, 2- ⁇ 1- [2- (4-chlorophenoxy) propyloxyi - minolbutyl ⁇ '3-hydroxy-5- (2H-tetrahydrothiopyran-3-yl) - 2-cyclohexen-l-one
  • bl7 Dinitroani1ine benefin, butralin, dinitramine, ethalfluralin, fluchloralin, isopropalin, nitralin, oryzalin, pendimethalin, prodiamine, profluralin, trifluralin
  • bl8 dinitrophenols bro ofenoxim, dinoseb, dinoseb-acetate, dinoterb, DNOC bl9
  • Diphenyl ether acifluorfen-sodium, aclonifen, bifenox, chloronitrofen (CNP), difenoxuron, ethoxyfen, fluorodifen, fluoroglycofen-ethyl, fomesafen, furyloxyfen, lactofen, nitrofen, nitrofluorfen, oxyfluorfen
  • b21 ureas benzthiazuron, buturon, chlorbromuron, chloroxuron, chlorto- luron, cumyluron, dibenzyluron, cycluron, dimefuron, diuron, dymron, ethidimuron, fenuron, fluormeturon, isoproturon, isouron, karbutilate, linuron, methabenzthiazuron, metobenzu- ron, metoxuron, monolinuron , monuron, neburon, siduron, tebutiuron, trimeturon
  • Imidazolinones imazamethapyr, imazapyr, imazaquin, imazethabenz-methyl (imazame), imazethapyr
  • b26 phenols bromoxynil, ioxynil b27 phenoxyphenoxypropionic acid esters: clodinafop, cyhalofop-butyl, diclofop-methyl, fenoxaprop-ethyl, fenoxaprop-p-ethyl, fenthiapropethyl, fluazifop-butyl, fluazifop-p-butyl, haloxyfoxy-ethopethyl-ethoxyethyl -p-methyl, isoxapyrifop, propaquizafop, quizalofop-ethyl, quizalofop-p-ethyl, quizalofop-tefuryl
  • b29 phenylpropionic acids chlorophenprop-methyl b30
  • Protoporphyrinogen IX oxidase inhibitors benzofenap, cinidon-ethyl, flumiclorac-pentyl, flumioxazin, flumipropyn, flupropacil, fluthiacet-ethyl, pyrazoxyfen, sulfentrazone, thidiazimin
  • b32 pyridazines chloridazon, maleic hydrazide, norflurazon, pyridate
  • pyridinecarboxylic acids clopyralid, dithiopyr, picloram, thiazopyr
  • b3 pyrimidyl ethers pyrithiobac acid, pyrithiobac sodium, KIH-2023, KIH-6127
  • Sulfonylureas amidosulfuron, azimsulfuron, bensulfuron-methyl, chlorimuron-ethyl, chlorosulfuron, cinosulfuron, cyclosulfamuron, ethamet- sulfuron methyl, ethoxysulfuron, flazasulfuron, halosulfuron-methyl, imazosulfuron, pyrosulfuron, metsulfuron, metsulfuron, metsulfuron ethyl, rimsulfuron, sulfometuron-methyl, thifensulfuron-methyl, triasulfuron, tribenuron-methyl, triflusulfuron-methyl
  • b37 triazines ametryn, atrazin, aziprotryn, cyanazine, cyprazine, desme- tryn, dimethamethryn, dipropetryn, eglinazin-ethyl, hexazinone, procyazine, prometon, prometryn, propazin, secbumeton, simazin, simetryn, terbumeton, terbutryn, terbutryn, terbutryn, terbutryn, terbutryn - magazine
  • b40 üracile bromacil, lenacil, terbacil b41
  • Functionally equivalent derivatives of plant enzyme inhibitors have a comparable spectrum of activity to the specifically named substances, with lower, equal or higher inhibitory activity (e.g. expressed in g inhibitor per hectare of cultivated area, required to completely suppress the growth of non-resistant plants).
  • cloning steps carried out in the context of the present invention such as e.g. Restriction cleavages, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. coli cells, cultivation of bacteria, multiplication of phages and sequence analysis of recombinant DNA were carried out as with Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6).
  • the bacterial strains used below (E. coli, XL-I Blue) were obtained from Stratagene.
  • the Agrobacterium strain used for plant transformation (Agrobacterium tumefaeiens, C58C1 with the plasmid pGV2260 or pGV3850kan) was developed by Deblaere et al. (Nucl. Acids Res. 13 (1985) 4777).
  • the LBA4404 agrobacterial strain (Clontech) or other suitable strains can be used.
  • the vectors pUC19 (Yanish-Perron, Gene 33 (1985), 103-119) pBlues- script SK- (Stratagene), pGEM-T (Promega), pZerO (Invitrogen), pBinl9 (Bevan et al., Nucl Acids Res. 12 (1984) 8711-8720) and pBinAR (Höfgen and Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230).
  • nucleotides 11749-11939 was used as PvuII-
  • the HindIII fragment was isolated and cloned after addition of Sphl linkers to the PvuII site between the SpHI-HindII site of the vector, resulting in the plasmid pBinAR (Höfgen and Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230).
  • herbicides are not immunogenic, they have to be attached to a carrier material such as e.g. KLH can be coupled. If there is a reactive group in the molecule, this coupling can take place directly, otherwise a functional group is introduced during the synthesis of the herbicide or a reactive precursor is selected during the synthesis in order to couple these molecules to the carrier molecule in a simple reaction step. Examples of couplings are described by Miroslavic Ferencik in "Handbook of Immunochemistry", 1993, Chapman & Hall, in the chapter Antigens, pages 20-49.
  • this modified carrier molecule e.g. Balb / c mice immunized.
  • the spleen cells of these animals are removed and fused with myeloma cells in order to cultivate hybrids.
  • "herbicide-modified BSA” is also used as an antigen in order to distinguish the immune response against the hapten from the KLH response.
  • the starting point for the investigation was a monoclonal antibody which specifically recognizes the herbicide Quinmerae and which also has a high binding affinity.
  • the selected hybridoma cell line is characterized in that the secreted monoclonal antibodies directed against the herbicide antigen Quinmerae have a high affinity and the specific sequences of the immunoglobulins are available (Berek, C. et al., Nature 10 316, 412-418 (1985)).
  • This monoclonal antibody against Quinmerae was the starting point for the construction of the single-chain antibody fragment (scFv-antiQuinmerac).
  • mRNA was isolated from the hybridoma cells and in cDNA
  • variable immunoglobulin genes VH and VK served as a template for the amplification of the variable immunoglobulin genes VH and VK with the specific primers VH1 BACK and VH FOR-2 for the heavy chain and VK2 BACK and MJK5 FON X for the light chain (Clackson et al., Nature 352, 624 -628 (1991)).
  • the functional characterization (antigen binding activity) of the constructed scFv-antiQuinmerac gene was carried out after expression in a bacterial system.
  • the scFv-antiQuinmerac was developed using the method of Hoogenboom, H.R. et al., Nucleic Acids
  • the scFv-antiQuinmerac gene was cloned downstream of the LeB4 promoter.
  • the LeB4 promoter isolated from Vicia faba shows a strictly seed-specific expression of various foreign genes in tobacco (Bäumlein, H. et al., Mol. Gen.
  • the constructed expression cassette was cloned into the binary vector pGSGLUC 1 (Saito et al., 1990) and transferred into the Agrobacterium strain EHA 101 by electroporation. Recombinant agrobacterial clones were used for the subsequent transformation of Nicotiana tabacum. 70-140 tobacco plants were regenerated per construct. After self-fertilization, seeds from various developmental stages were harvested from the regenerated transgenic tobacco plants. The soluble proteins were obtained from these seeds after extraction in an aqueous buffer system.
  • the constructed scFv-antiQuinmerac gene had a size of approx. 735 bp.
  • the variable domains were fused together in the order VH-L-VL.
  • the starting point for the investigations was a single-chain antibody fragment against the herbicide Quinmerae (scFv-anti Quinmerae).
  • the functional characterization (antigen binding activity) of this constructed scFv-anti- Quinmerae gene was carried out after expression in a bacterial system and after expression in tobacco leaves. The activity and the specificity of the antibody fragment constructed was checked in ELISA tests.
  • the scFv-antiQuinmerac gene was cloned downstream of the USP promoter.
  • the USP promoter isolated from Vicia faba shows a strictly seed-specific expression of various foreign genes in tobacco (Fiedler, U. et al., Plant Mol. Biol. 22, 669-679 (1993)).
  • scFv-anti-Quinmerac polypeptide By transporting the scFv-anti-Quinmerac polypeptide into the endoplasmic reticulum, a stable accumulation of large amounts of antibody fragments was achieved.
  • the scFv-antiQuinmerac gene was identified with a signal peptide sequence that prevents entry into the endoplasmic see the reticulum and the ER retention signal SEKDEL, which ensures that it remains in the ER (Wandelt et al., 1992), merges (Fig. 1).
  • the constructed expression cassette was cloned into the binary vector pGSGLUCl (Saito et al., 1990) and transferred into the Agrobacterium strain EHA 101 by electroporation. Recombinant agrobacteria clones were used for the subsequent transformation of Nicotiana tabacum. After self-fertilization, seeds of various developmental stages were harvested from the regenerated transgenic tobacco plants. The soluble proteins were obtained from these seeds after extraction in an aqueous buffer system.
  • the scFv-anti- Quinmerac gene was cloned downstream of the CaMV 35 S promoter. This strong constitutive promoter mediates expression of foreign genes in almost all plant tissues (Benfey and Chua, Science 250 (1990), 956-966). By transporting the scFv-anti-Quinmerac protein into the endoplasmic reticulum, a stable accumulation of large amounts of antibody fragments in the leaf material was achieved.
  • the scFv-antiQuinmerac gene was first fused with a signal peptide sequence which ensures entry into the endoplasmic reticulum and the ER retention signal KDEL, which ensures that it remains in the ER (Wandelt et al., Plant J. 2 (1992), 181-192) .
  • the constructed expression cassette was cloned into the binary vector pGSGLUC 1 (Saito et al., Plant Cell Rep. 8 (1990), 718-721) and transferred into the Agrobacterium strain EHA 101 by electroporation. Recombinant agrobacterial clones were used for the subsequent transformation of Nicotiana tabacum. About 100 tobacco plants were regenerated.
  • Leaf material from various stages of development was removed from the regenerated transgenic tobacco plants.
  • the soluble proteins were obtained from this leaf material after extraction in an aqueous buffer system. Subsequent analyzes (Western blot analyzes and ELISA tests) showed that a maximum accumulation of greater than 2% of biologically active, antigen-binding scFv-antiQuinmerac polypeptide could be achieved in the leaves.
  • the high expression values were The antibody fragment was found in green leaves, but also in senescent leaf material.
  • the PCR amplification of the one-chain antibody cDNA was carried out in a DNA thermal cycler from Perkin Elmer.
  • the reaction mixtures contained 8 ng / ⁇ l single-stranded template cDNA, 0.5 ⁇ M of the corresponding oligonucleotides, 200 ⁇ M nucleotides (Pharmacia), 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3
  • the plasmid pGSGLUC 1 was transformed into Agrobacterium tumefaeiens C58Cl: pGV2260.
  • tobacco plants Nicotiana fcaJbacum cv. Samsun NN
  • the starting point of the investigations was a single-chain antibody fragment expressed in tobacco plants against the herbicide Quinmerae (scFv-anti Quinmerae).
  • the amount and activity of the synthesized scFv-antiQuinmerac polypeptide were determined in Western blot analyzes and ELISA tests.
  • the foreign gene was controlled under the control of the CaMV 53S promoter as a translation fusion with the LeB4 signal peptide (N-terminal) and the ER retention signal KDEL (C- terminal).
  • the scFv-antiQuinmerac polypeptide was transported into the endoplasmic reticulum, a stable accumulation of high amounts of active antibody fragment was achieved. After harvesting the leaf material, pieces were frozen at -20 ° C (1), lyophilized (2) or dried at room temperature (3).
  • soluble proteins were obtained from the respective leaf material by extraction in an aqueous buffer and the scFv-antiQuinmerac polpypeptide was purified by affinity chromatography. Equal amounts of purified scFv-anti-Quinmerac polypeptide (frozen, lyophilized and dried) were used to determine the activity of the antibody fragment (Fig. 6).
  • Fig. 6 A shows the antigen binding activity of the scFv-antiQuinmerac polypeptide purified from fresh (1), lyophilized (2) and dried leaves (3).
  • Fig. 6 B the respective amounts of scFv-anti-Quinmerac protein (about 100 ng) that were used for the ELISA analyzes are determined by means of Western blot analyzes. The sizes of the protein molecular weight standards are shown on the left. The same antigen binding activities were found.

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Abstract

Verfahren zur Herstellung von Herbizid-toleranten Pflanzen durch Expression eines Herbizid-bindenden Antikörpers in den Pflanzen.

Description

Expression von Herbizid-bindenden Polypeptiden in Pflanzen zur Erzeugung von Herbizidtoleranz
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von herbizidtoleranten Pflanzen durch Expression eines exogenen Herbizid-bindenden Polypeptides in Pflanzen oder Pflanzenteilen. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der entsprechenden Nukleinsäuren codierend für ein Polypeptid, einen Antikörper oder Teilen eines Antikörpers mit Herbizid-bindenden Eigenschaften in transgenen Pflanzen und die auf diese Weise transformierte Pflanze selbst.
Es ist bekannt, daß mit Hilfe von gentechnischen Verfahren gezielt Fremdgene in das Genom einer Pflanze übertragen werden können. Dieser Prozeß wird als Transformation und die resultierenden Pflanzen werden als transgene Pflanzen bezeichnet. Transgene Pflanzen werden derzeit in unterschiedlichen biotechnologischen Bereichen eingesetzt. Beispiele sind insektenresistente Pflanzen (Vaek et al. Plant Cell 5 (1987), 159-169), virusresistente Pflanzen (Powell et al. Science 232 (1986), 738-743) und ozonre- sistente Pflanzen (Van Camp et al. BioTech. 12 (1994), 165-168). Beispiele für gentechnisch erzielte Qualitätssteigerungen sind: Erhöhung der Haltbarkeit von Früchten (Oeller et al. Science 254 (1991), 437-439), Erhöhung der Stärkeproduktion in Kartoffelknollen (Stark et al. Science 242 (1992), 419), Veränderung der Stärke- (Visser et al. Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289-296) und Lipidzusammensetzung (Voelker et al. Science 257 (1992), 72-74) und Produktion pflanzenfremder Polymere (Poirer et al. Science 256 (1992), 520-523).
Ein wichtiges Ziel der pflanzenmolekulargenetischen Arbeiten ist die Erzeugung von Herbizidtoleranz. Die Herbizidtoleranz ist gekennzeichnet durch eine in Art oder Höhe gesteigerten Verträglichkeit der Pflanze oder von Pflanzenteilen gegenüber dem appli- zierten Herbizid. Diese kann auf verschiedene Arten bewerkstelligt werden. Die bekannten Methoden sind die Nutzung eines Meta- bolismusgens wie z.B. das pat-Gen in Zusammenhang mit der Glufo- sinat-Resistenz (WO 8705629) oder einem gegenüber dem Herbizid resistenten Zielenzym wie im Falle der Enolpyruvylshiki - mat-3-Phosphat-Synthase (WO 9204449), die resistent ist gegen Glyphosat , sowie die Verwendung eines Herbizids in Zeil- und Ge- webekultur zur Selektion toleranter Pflanzenzellen und daraus re- sultierender resistenter Pflanzen wie bei Acetyl CoA Carboxylase Hemmstoffen beschrieben (US 5162602, US 5290696).
Antikörper sind Proteine als Bestandteil des Immunsystems. Allen 5 Antikörpern gemeinsam ist ihre räumliche, globuläre Struktur, der Aufbau aus leichter und schwerer Kette sowie ihre prinzipielle Fähigkeit, Moleküle oder Teile einer Molekülstruktur mit hoher Spezifität binden zu können (Alberts et al., in: Molekularbiologie der Zelle, 2. Auflage 1990, VCH Verlag, ISBN 3-527-27983-0,
10 1198-1237) . Aufgrund dieser Eigenschaften wurden Antikörper für vielfältige Aufgaben genutzt. Man unterscheidet dabei die Anwendung der Antikörper im tierischen und menschlichen Organismen, die sie produzieren, die sogenannte in-situ Anwendungen und die ex-situ Anwendungen, d.h. die Nutzung der Antikörper nach Isola-
15 tion aus den produzierenden Zellen oder Organismen (Whitelam und Cockburn, TIPS Vol.1 , 8 (1996), 268-272).
Die Verwendung hybrider somatischer Zellinien (Hybridomas) als Quelle für Antikörper gegen ganz bestimmte Antigene geht auf Ar-
20 beiten von Köhler und Milstein zurück (Nature 256 (1975) 495-97). Nach diesem Verfahren lassen sich sogenannte monoklonale Antikörper herstellen, die eine einheitliche Struktur besitzen und durch Zellfusion erzeugt werden. Dabei werden Milzzellen einer immunisierten Maus mit Zellen eines Mausmyeloms fusioniert. So entste-
25 hen Hybridomazellen, die sich unbegrenzt vermehren. Gleichzeitig sezernieren die Zellen spezifische Antikörper gegen das Antigen, mit dem die Maus immunisiert worden war. Die Milzzellen liefern die Fähigkeit zur Antikörperproduktion, während die Myelomzellen die unbegrenzte Wachstumsfähigkeit und die kontinuierliche Anti-
30 körpersekretion beisteuern. Da jede Hybridomazelle sich als Klon von einer einzigen B-Zelle ableitet, besitzen alle erzeugten Antikörpermoleküle dieselbe Struktur einschließlich der Antigenbin- dungsstelle. Diese Methode hat die Anwendung von Antikörpern stark gefördert, da jetzt Antikörper mit einer einzigen, bekann-
35 ten Spezifität und einer homogenen Struktur unbegrenzt zur Verfügung stehen. Monoklonale Antikörper finden breite Anwendung in der Immundiagnostik und als Therapeutika .
Seit einigen Jahren gibt es die sogenannte Phagen-Display-Methode 40 zur Herstellung von Antikörpern, bei der das Immunsystem und die verschiedenen Immunisierungen im Tier umgangen werden. Hierbei wird die Affinität und Spezifität des Antikörpers in vitro maßgeschneidert (Winter et al., Ann. Rev. I munol . 12 (1994), 433-455; Hoogenboom TIBTech Vol 15 (1997), 62 -70). Gensegmente, die die 45 kodierende Sequenz der variablen Region von Antikörpern enthält, d.h. die Antigen-Bindestelle, werden mit Genen für das Hüllprotein eines Bakteriophagen fusioniert. Dann infiziert man Bakte- rien mit Phagen, die solche Fusionsgene enthalten. Die entstehenden Phagenpartikel besitzen nun Hüllen mit dem antikörperähnlichen Fusionsprotein, wobei die antikörperbindende Domäne nach außen zeigt. Aus einer solchen Phagen-Display-Bibliothek läßt sich 5 nun der Phage isolieren, der das gewünschte Antikörperfragment enthält und spezifisch an ein bestimmtes Antigen bindet. Jeder so isolierte Phage erzeugt ein monoklonales, antigenbindendes Poly- peptid, das einem monoklonalen Antikörper entspricht. Die Gene für die Antigenbindungstelle, die für jeden Phagen einzigartig 10 sind, kann man aus der Phagen-DNA isolieren und zur Konstruktion vollständiger Antikörpergene einsetzen.
Auf dem Gebiet des Pflanzenschutzes wurden Antikörper ins- besonders als analytisches Mittel ex-situ zum qualitativen und
15 quantitativen Nachweis von Antigenen genutzt. Dies schließt den Nachweis von Pflanzeninhaltstoffen, Herbiziden oder Fungiziden in Trinkwasser (Sharp et al. (1991) ACS Symp Ser. , 446 (Pestic. Re- sidues Food Saf.) 87-95), Bodenproben (WO 9423018) oder in Pflanzen oder Pflanzenteilen sowie die Nutzung von Antikörpern
20 als Hilfsmittel zur Reinigung von gebundenen Molekülen ein.
Die Produktion von Immunglobulinen in Pflanzen wurde erstmals von Hiatt et al., Nature, 342 (1989), 76 - 78 beschrieben. Das Spektrum reicht von Ein-Ketten-Antikörpern bis zu multimeren se- 25 kretorischen Antikörpern (J. Ma und Mich Hein, 1996, Annuals New York Academy of Sciences, 72 - 81) .
Neuere Versuche nutzen Antikörper in-situ zur Pathogenabwehr in Pflanzen, insbesondere von Viruserkrankungen durch Expression von 30 spezifischen Antikörpern oder Teilen davon gerichtet gegen Virushüllproteine in Pflanzenzellen (Tavladoraki et al . , Nature 366 (1993), 469-472; Voss et al . , Mol. Breeding 1 (1995), 39-50).
Ein analoger Ansatz ist auch zur Abwehr der Infektion der Pflanze 35 durch Nematoden genutzt worden (Rosso et al., Biochem Biophys Res Com, 220 (1996) 255-263) . Für eine pharmazeutische Anwendung sind Beispiele bekannt, die die Antikörper-Expression in-situ in Pflanzen für eine orale Immunisierung nutzen (Ma et al., Science 268 (1995), 716-719; Mason und Arntzen, Tibtech Vol 13 (1996), 40 388-392) . Von der Pflanze gebildete Antikörper werden dabei aus Pflanzen oder für den Verzehr geeigneten Pflanzenteilen über den Mund, Rachen oder Verdauungstrakt dem Körper zugeführt und verursachen einen wirksamen Immunschutz. Weiterhin wurde in Pflanzen bereits ein Ein-Ketten-Antikörper (single chain antibody) gegen 45 das niedermolekulare Pflanzenhormon Abscisinsäure exprimiert und eine verringerte Pflanzenhormonverfügbarkeit aufgrund von Absei- sinsäurebindung in der Pflanze beobachtet (Artsaenko et al., The Plant Journal (1995) 8 (5), 745-750).
Die chemische Unkrautbekämpfung in agrarwirtschaftlich bedeuten- den Kulturen setzt den Einsatz von hochselektiven Herbiziden voraus. In einigen Fällen ist es jedoch schwierig, Herbizide mit ausreichender Selektivität zu entwickeln, die keine Schädigung der Ertragspflanze verursachen. Die Einführung von Herbizid-resi- stenten oder -toleranten Kulturpflanzen kann zur Lösung dieses Problems beitragen.
Der Entwicklung von Herbizid-resistenten Kulturpflanzen durch Gewebekultur oder Samenmutagenese und natürliche Auswahl sind Grenzen gesetzt. So können nur diejenigen Pflanzen über Gewebekultur - techniken manipuliert werden, deren Regeneration zu ganzen Pflanzen aus Zellkulturen gelingt. Außerdem können Kulturpflanzen nach Mutagenese und Selektion unerwünschte Eigenschaften zeigen, die durch teilweise mehrmalige Rückkreuzungen wieder beseitigt werden müssen. Auch wäre die Einbringung einer Resistenz durch Kreuzung auf Pflanzen der selben Art beschränkt.
Aus diesen Gründen ist der gentechnische Ansatz, ein für die Resistenz codierendes Gen zu isolieren und in Kulturpflanzen gezielt zu übertragen, dem klassischen Züchtungsverfahren überle- gen.
Die molekularbiologische Entwicklung von Herbizid-toleranten bzw. Herbizid-resistenten Kulturpflanzen setzt bisher voraus, daß der Wirkmechanismus des Herbizides in der Pflanze bekannt ist und daß Gene, die Resistenz gegen das Herbizid vermitteln gefunden werden können. Viele gegenwärtig kommerziell genutzten Herbizide wirken, indem sie ein Enzym einer essentiellen Aminosäure-, Lipid- oder Pigmentbiosynthese blockieren. Durch Veränderung der Gene dieser Enzyme dergestalt, daß das Herbizid nicht mehr gebunden werden kann und durch Einbringung dieser veränderten Gene in Kulturpflanzen läßt sich Herbizid-Toleranz erzeugen. Alternativ können zum Beispiel in der Natur analoge Enzyme beispielsweise in Mikroorganismen gefunden werden, die eine natürliche Resistenz gegenüber dem Herbizid zeigen. Dieses Resistenz vermittelnde Gen wird aus einem .derartigen Mikroorganismus isoliert, in geeignete Vektoren umkloniert und anschließend nach erfolgreicher Transformation in Herbizid-sensitiven Kulturpflanzen zur Expression gebracht (WO 96/38567) . Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung eines neuartigen allgemein einsetzbaren, gentechnologischen Verfahrens zur Erzeugung von Herbizid-toleranten transgenen Pflanzen.
Diese Aufgabe wurde überraschenderweise gelöst durch ein Verfahren der Expression eines exogenen Polypeptides, Antikörpers oder Teilen eines Antikörpers mit Herbizid-bindenden Eigenschaften in den Pflanzen.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Herstellung eines Herbizid-bindenden Antikörpers und die Klonierung des zugehörigen Gens bzw. Genfragmentes.
Es wird zunächst ein geeigneter Antikörper erzeugt, der das Herbizid bindet. Dies kann u.a. durch Immunisierung eines Wirbeltiers, meist Maus, Ratte, Hund, Pferd, Esel oder Ziege mit einem Antigen erfolgen. Das Antigen ist dabei eine herbizid wirksame Verbindung, die über eine funktionelle Gruppe an einen höher- molekularen Träger wie Rinderserumalbumin (BSA) , Hühnereiweiß (Ovalbumin) keyhole limpet hemocyanin (KLH) oder andere Träger gekoppelt oder assoziiert vorliegt. Die Immunantwort wird nach mehrmaliger Antigenapplikation mit gängigen Methoden nachvollzogen und so ein geeignetes Antiserum isoliert. Dieser Ansatz liefert zunächst ein polyklonales Serum, das Antikörper mit unter- schiedlichen Spezifitäten enthält. Für den gezielten in-situ Gebrauch ist es notwendig, die für einen einzelnen spezifischen monoklonalen Antikörper codierende Gensequenz zu isolieren. Zu diesem Zweck stehen verschiedene Wege offen. Der erste Ansatz nutzt die Fusion von Antikörper-produzierenden Zellen mit Krebs - zellen zu einer ständig Antikörper produzierenden Hybridomazell- kultur, die durch Vereinzelung der enthaltenen Klone letztlich zu einer homogenen, einen definierten monoklonalen Antikörper produzierenden Zellinie führt.
Aus einer derartigen monoklonalen Zellinie wird die cDNA für den Antikörper bzw. Teile des Antikörpers, den sog. Ein-Ketten-Anti¬ körper (Single chain antibody - scFv) isoliert. Diese cDNA-Se- quenzen können dann in Expressionskassetten kloniert und zur funktionellen Expression in prokaryotischen und eukaryotischen Organismen» einschließlich Pflanzen genutzt werden.
Es ist auch möglich über Phagen-Display-Banken Antikörper zu selektieren, die Herbizidmoleküle binden und katalytisch in ein Produkt mit nicht herbiziden Eigenschaften umsetzen. Methoden zur Herstellung katalytischer Antikörper sind in Janda et al.,
Science 275 (1997) 945-948, Chemical selection for catalysis in combinatorial Antibody libraries; Catalytic Antibodies, 1991, Ciba Foundation Symposium 159, Wiley- Interscience Publication beschrieben. Durch Klonierung des Gens dieses katalytischen Antikörpers und dessen Expression in einer Pflanze kann im Prinzip ebenfalls eine Herbizid-resistente Pflanze erzeugt werden.
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Expressionskassetten, deren kodierende Sequenz für ein Herbizid-bindendes Polypeptid oder dessen funktionelles Äquivalent codiert, sowie deren Verwendung zur Herstellung einer Herbizid-toleranten Pflanze. Die Nukleinsäuresequenz kann dabei z.B. eine DNA- oder eine cDNA-Se- quenz sein. Zur Insertion in eine erfindungsgemäße Expressionskassette geeignete kodierende Sequenzen sind beispielsweise solche, die eine DNA-Sequenz aus einer Hybridomazelle enthalten, die für ein Polypeptid mit Herbizid-bindenden Eigenschaften codiert und die dem Wirt Resistenz gegen Inhibitoren pflanzlicher Enzyme verleihen.
Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten beinhalten außerdem regulative Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der co- dierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine erfindungsgemäße Expressions- kassette stromaufwärts, d.h. am 5 '-Ende der codierenden Sequenz einen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3' -Ende ein Polyadeny- lierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Ele- mente, welche mit der dazwischenliegenden codierenden Sequenz für das Polypeptid mit Herbizid-bindenden Eigenschaften und/oder Transitpeptid operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, codierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der codierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten aber nicht darauf beschränkten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Plasmamembran, in der Vakuole, in Piastiden, ins Mitochon- drium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Öl- körperchen oder anderen Kompartimenten und Translationsverstärker wie die 5 ' -Führungssequenz aus dem Tabak Mosaic Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987) 8693-8711).
Als Promotoren der erfindungsgemäßen Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflan- zenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Pro- motor aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus (Franck et al., Cell 21(1980) 285-294). Dieser Promotor enthält unterschiedliche Er- kennungssequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamtheit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des eingeführten Gens führen (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202) .
Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen Polypeptids in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren wie z.B. der PRPl-Promotor (Ward et al. , Plant.Mol. Biol.22 (1993) , 361-366) , ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/1919443) , ein durch Benzenesufonamid-induzierbarer (EP 388186) , ein durch Ab- scisinsäure-induzierbarer (EP335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (W09321334) Promotor sind der Literatur beschrieben und können u.a. verwendet werden.
Weiterhin sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen sich die Herbizidwirkung entfaltet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine Blatt-spezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245).
Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors konnten Einketten-An- tikörper stabil bis zu 0,67% des gesamten löslichen Samenproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen exprimiert werden (Fiedler und Conrad, Bio/Technology 10(1995), 1090-1094). Da auch eine Expression in ausgesäten oder keimenden Samen möglich und im Sinne der vorliegenden Erfindung erwünscht sein kann, sind entsprechend Keimungs- und Samen-spezifische Promotoren ebenfalls erfindungsgemäß bevorzugte regulative Elemente. Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann daher beispielsweise einen samenspezifischen Promotor (bevorzugt den USP- oder LEB4-Promotor, das LEB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen und ein ER-Retenti- onssignal enthalten. Der Aufbau der Kassette ist in der Abbildung 1 am Beispiel eines Einketten-Antikörpers (scFv-Gen) schematisch beispielhaft dargestellt.
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten Polypeptid-DNA und vorzugsweise einer zwischen Promotor und Polypeptid-DNA insertierten für ein Chloroplasten-spezifisches Transitpeptid kodierenden DNA sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Labora- tory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.
Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in den Apoplasten, Piastiden, die Vakuole, in die Plasmamembran, das Mi- tochondrium, das Endoplasmatische Retikulum (ER) oder durch ein Fehlen entsprechender operativer Sequenzen einen Verbleib im Kom- partiment des Entstehens, dem Zytosol, gewährleisten (Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423). Für die Menge der Proteinakkumulation in transgenen Pflanzen besonders förderlich erwiesen hat sich eine Lokalisation im ER sowie der Zellwand
(Schouten et al. , Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792; Artsaenko et al., Plant J. 8 (1995) 745-750).
Gegenstand der Erfindung sind auch Expressionskassetten, deren kodierende Sequenz für ein Herbizid-bindendes Fusionsprotein kodiert, wobei Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des Polypeptides steuert. Besonders bevorzugt sind Chloroplasten-spezifische Transitpeptide, welche nach Translokation des Herbizid-bindenden Polypeptides in die Pflanzen- chloroplasten vom Herbizid-bindenden Polypeptid-Teil enzymatisch abgespalten werden. Insbesondere bevorzugt ist das Transitpeptid abgeleitet von plastidärer Transketolase (TK) oder einem funktio- nellen Äquivalent dieses Transitpeptids (z.B. das Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Rubisco oder der Ferredoxin NADP Oxidoreduktase) .
Die zur Herstellung erfindungsgemäßer Expressionskassetten erforderliche Polypeptid-DNA oder -cDNA wird vorzugsweise mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Verfahren zur DNA-Amplifikation mittels PCR sind bekannt, beispielsweise aus Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990) . Zweckmäßigerweise können die PCR-erzeugten DNA-Fragmente durch Sequenzanalyse zur Vermeidung von Polymerase- fehlern in zu exprimierenden Konstrukten überprüft werden.
Die insertierte Nucleotid-Sequenz codierend für ein Herbizid-bindendes Polypeptid kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten. Im allgemeinen werden synthetische Nucleotid-Sequenzen mit Codons erzeugt, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Codons können aus Codons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nucleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Zweckmäßigerweise sollten die erfindungsgemäßen Promotor- und die Terminator-Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker inner- halb der regulatorisehen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der erfindungsgemäße Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die erfindungsgemäße Expressionskassette beinhaltet in der 5' -3' -Transkripti- onsrichtung den erfindungsgemäßen Promotor, eine beliebige Sequenz und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z.B. Transitionen und Trans - Versionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerre- pair" , Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "bluntends" , können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.
Von besonderer Bedeutung für den erfindungsgemäßen Erfolg ist das Anhängen des spezifischen ER-Retentionssignals SEKDEL (Schuoten, A. et al. Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781 - 792), die durchschnittliche Expressionshöhe wird damit verdreifacht bis vervierfacht. Es können auch andere Retentionssignale, die natürlicher- weise bei im ER lokalisierten pflanzlichen und tierischen Proteinen vorkommen, für den Aufbau der Kassette eingesetzt werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadeny- lierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA- Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHδ entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 ff) oder funktioneile Äquivalente.
Eine erfindungsgemäße Expressionskassette kann beispielsweise einen konstitutiven Promotor (bevorzugt den CaMV 35 S-Promotor ) , das LeB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen und das ER-Reten- tionssignal enthalten. Der Aufbau der Kassette ist in Abbildung 2 am Beispiel eines Einketten-Antikörpers (scFv-Gen) schematisch dargestellt. Als ER-Retentionssignal wird bevorzugt die Amino- säuresequenz KDEL (Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin) verwendet.
Vorzugsweise wird die fusionierte Expressionskassette, die für ein Polypeptid mit Herbizid-bindenden Eigenschaften codiert, in einen Vektor, beispielsweise pBinl9, kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren. Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z.B. von Tabakpflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agro- bakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Enginee- ring and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu,
Academic Press, 1993, S. 15-38 und aus S.B. Gelvin, Molecular Ge- netics of T-DNA Transfer from Agrobacterium to Plants, gleichfalls in Transgenic Plants, S. 49-78. Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekann- ter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die ein in die erfindungsgemäße Expressionskassette integriertes Gen für die Expression eines Polypeptides mit Herbizid-bindenden Eigenschaften enthalten.
Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für ein Herbizidbindendes Polypeptid codierenden DNA wird eine erfindungsgemäße Expressionskassette als Insertion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktionelle Regulationssignale, beispielsweise Sequenzen für Replikation oder Inte- gration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methode in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S.71-119 (1993) beschrieben.
Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klonierungstechniken können die erfindungsgemäßen Expressionskassetten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonie- rungsvektoren sind u.a. pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pA- CYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren können, wie z.B. pBinlθ (Bevan et al. (1980) Nucl. Acids Res. 12, 8711) . 5
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette zur Transformation von Pflanzen, Pflanzenzellen, -geweben oder Pflanzenteilen. Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Vermittlung von 0 Resistenz gegen Inhibitoren pflanzlicher Enzyme.
Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch in den Blättern, in den Samen oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen. Solche transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut sowie 5 deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen
20 Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus
Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten- transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, der biolistische Ansatz mit der Genkanone, die Elektroporation,
25 die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der Agrobacterium-vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu,
30 Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu.Rev. Plant Physiol. Plant Molec.Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res.
35 12 (1984) 8711) .
Mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide,
40 Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies, verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterien- lösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert
45 werden. Funktioneil äquivalente Sequenzen, die für ein Herbizid-bindendes Polypeptid codieren, sind erfindungsgemäß solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nucleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit na- türlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an die Codon-Usage einer Pflanze angepaßte, künstliche Nucleotid-Sequen- zen.
Unter einem funktioneilen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten das Herbizid-bindende Polypeptid codierenden Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nucleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation dieser Nucleotidsequenz erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen codierenden Sequenz oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym- Schnittstellen sein.
Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abge- schwächt oder verstärkt ist.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschte Resistenz gegenüber Herbiziden induzieren. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine, die Herbizid-bindende Aktivität aufweisen oder durch in vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifi- sehen Codon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Codon-Nut- zung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.
Als weitere erfindungsgemäße geeignete äquivalente Nukleinsäure- Sequenzen sind zu nennen Sequenzen, welche für Fusionsproteine kodieren, wobei Bestandteil des Fusionsproteins ein nicht-pflanzliches Herbizid-bindendes Polypeptid oder ein funktionell äquivalenter Teil davon ist. Der zweite Teil des Fusionsproteins kann z.B. ein weiteres Polypeptid mit enzymatischer Aktivität sein oder eine antigene Polypeptidsequenz mit deren Hilfe ein Nachweis auf scFvs Expression möglich ist (z.B. mye-tag oder his-tag) . Bevorzugt handelt es sich dabei jedoch um eine regulative Proteinsequenz, wie z.B. ein Signal- oder Transitpeptid, das das Polypeptid mit Herbizid-bindenden Eigenschaften an den gewünschten Wirkort leitet.
Gegenstand der Erfindung sind aber auch die erfindungsgemäß erzeugten Expressionsprodukte, sowie Fusionsproteine aus einem Transitpeptid und einem Polypeptid mit Herbizid-bindenden Eigenschaften.
Resistenz bzw. Toleranz bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung die künstlich erworbene Widerstandsfähigkeit gegen die Wirkung pflanzlicher Enzym-Inhibitoren. Sie umfaßt die partielle und, insbesondere, die vollständige Unempfindlichkeit gegenüber diesen Inhibitoren für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.
Der primäre Wirkort von Herbiziden ist im allgemeinen das Blattgewebe, so daß eine blattspezifische Expression des exogenen Her- bizid-bindenden Polypeptides ausreichenden Schutz bieten kann. Es ist jedoch naheliegend, daß die Wirkung eines Herbizids nicht auf das Blattgewebe beschränkt sein muß, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze gewebespezifisch erfolgen kann.
Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen Herbizid-bindenden Polypeptides von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.
Die Wirksamkeit des transgen exprimierten Polypeptides mit Herbi- zid-bindenden Eigenschaften kann beispielsweise in vitro durch Sproßmeristemvermehrung auf Herbizid-haltigem Medium über abgestufte Konzentrationsreihen oder über Samenkeimungstests ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Herbizidverträglichkeit einer Testpflanze in Gewächshausversuchen gete- stet werden.
Gegenstand der Erfindung sind außerdem transgene Pflanzen, transformiert mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermehrungsgut solcher Pflan- zen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene Kulturpflanzen, wie z.B. Getreide, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspecies.
Die transgenen Pflanzen, Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile können mit einem Wirkstoff, der die pflanzlichen Enzyme inhibiert, behandelt werden, wodurch die nicht erfolgreich transformierten Pflanzen, -zellen, -gewebe oder Pflanzenteile absterben. Beispiele für geeignete Wirkstoffe sind insbesondere 5- (2-Chlor-4- (trifluormethyDphenoxy) -2-nitrobenzoesäure (Acifluorfen) und 7-Chlor-3-methylchinolin-8-carbonsäure (Quinmerae) , sowie Metabolite und funktionelle Derivate dieser Verbindungen. Die in die erfindungsgemäßen Expressionskassetten insertierte, für ein Polypeptid mit Herbizid-bindenden Eigenschaften codierende DNA, kann somit auch als Selektions arker verwendet werden.
Insbesondere bei Kulturpflanzen bietet die vorliegende Erfindung den Vorteil, daß nach Induktion einer selektiven Resistenz der Kulturpflanze gegenüber pflanzlichen Enzym-Inhibitoren diese Inhibitoren als spezifische Herbizide gegen nicht resistente Pflanzen eingesetzt werden können. Als nicht-limitierende Beispiele für derartige Inhibitoren können genannt werden die folgenden herbiziden Verbindungen aus den Gruppen bl - b41 :
bl 1, 3, 4-Thiadiazolen: buthidazole, cyprazole
b2 Amide: allidochlor (CDAA) , benzoylprop-ethyl , bromobutide, chlort- hiamid, dimepiperate, dimethenamid, diphenamid, etobenzanid (benzchlomet) , flamprop-methyl, fosamin, isoxaben, monalide, naptalame, pronamid (propyzamid) , propanil
b3 Aminophosphorsäuren: bilanafos, (bialaphos) , buminafos, glufosinate-ammonium, gly- phosate, sulfosate
b4 Aminotriazolen: amitrol
b5 Anilide: anilofos, mefenacet
b6 Aryloxyalkansäuren:
2,4-D, 2,4-DB, clomeprop, dichlorprop, dichlorprop-P, dich- lorprpp-P (2,4-DP-P), fenoprop (2,4,5-TP), fluoroxypyr, MCPA, MCPB, mecoprop, mecoprop-P, napropamide, napropanilide, tri- clopyr
b7 Benzoesäuren: chloramben, dicamba b8 Benzothiadiazinonen: bentazon
b9 Bleacher: clomazone (dimethazone) , diflufeniean, fluorochloridone, flu- poxam, fluridone, pyrazolate, sulcotrione (chlormesulone)
blO Carbamaten: asulam, barban, butylate, carbetamid, chlorbufam, chlorpro- pham, cyeloate, desmedipham, diallate, EPTC, esproearb, moli- nate, orbencarb, pebulate, phenisopham, phenmedipham, pro- pham, prosulfocarb, pyributicarb, sulfallate (CDEC) , terbu- carb, thiobencarb (benthiocarb), tiocarbazil, triallate, ver- nolate
bll Chinolinsäuren: quinclorac, quinmerae
bl2 Chloracetaniliden: acetochlor, alachlor, butachlor, butenachlor, diethatyl ethyl, dimethachlor, metazachlor, metolachlor, pretilachlor, propachlor, prynachlor, terbuchlor, thenylchlor, xylachlor
bl3 Cyclohexenonen: alloxydim, caloxydim, clethodim, cloproxydim, cycloxydim, sethoxydim, tralkoxydim, 2- {1- [2- (4-Chlorphenoxy) propyloxyi - minolbutyl} ' 3-hydroxy-5- (2H-tetrahydrothiopyran-3-yl) - 2-cyclohexen-l-on
bl Dichlorpropionsäuren: dalapon
bl5 Dihydrobenzofurane : ethofumesate
bl6 Dihydrofuran-3-one: flurtamone
bl7 Dinitroani1ine : benefin, butralin, dinitramin, ethalfluralin, fluchloralin, isopropalin, nitralin, oryzalin, pendimethalin, prodiamine, profluralin, trifluralin
bl8 Dinitrophenole: bro ofenoxim, dinoseb, dinoseb-acetat, dinoterb, DNOC bl9 Diphenylether: acifluorfen-sodium, aclonifen, bifenox, chlornitrofen (CNP) , difenoxuron, ethoxyfen, fluorodifen, fluoroglycofen-ethyl, fomesafen, furyloxyfen, lactofen, nitrofen, nitrofluorfen, oxyfluorfen
b20 Dipyridylene: cyperquat, difenzoquat-methylsulfat, diquat, paraquat di- chlorid
b21 Harnstoffe: benzthiazuron, buturon, chlorbromuron, chloroxuron, chlorto- luron, cumyluron, dibenzyluron, cycluron, dimefuron, diuron, dymron, ethidimuron, fenuron, fluormeturon, isoproturon, isouron, karbutilat, linuron, methabenzthiazuron, metobenzu- ron, metoxuron, monolinuron, monuron, neburon, siduron, tebu- thiuron, trimeturon
b22 Imidazole: isocarbamid
b23 Imidazolinone: imazamethapyr, imazapyr, imazaquin, imazethabenz-methyl (ima- zame) , imazethapyr
b24 Oxadiazole: methazole, oxadiargyl, oxadiazon
b25 Oxirane: tridiphane
b26 Phenole: bromoxynil, ioxynil b27 Phenoxyphenoxypropionsäureester: clodinafop, cyhalofop-butyl, diclofop-methyl, fenoxaprop- ethyl, fenoxaprop-p-ethyl, fenthiapropethyl, fluazifop-butyl, fluazifop-p-butyl, haloxyfop-ethoxyethyl, haloxyfop-methyl, haloxyfop-p-methyl, isoxapyrifop, propaquizafop, quizalofop- ethyl, quizalofop-p-ethyl, quizalofop-tefuryl
b28 Phenylessigsäuren: chlorfenac (fenac)
b29 Phenylpropionsäuren: chlorophenprop-methyl b30 Protoporphyrinogen-IX-Oxydase-Hemmer : benzofenap, cinidon-ethyl, flumiclorac-pentyl , flumioxazin, flumipropyn, flupropacil, fluthiacet- ethyl, pyrazoxyfen, sulfentrazone, thidiazimin
b31 Pyrazole: nipyraclofen
b32 Pyridazine: chloridazon, maleic hydrazide, norflurazon, pyridate
b33 Pyridincarbonsäuren: clopyralid, dithiopyr, picloram, thiazopyr
b3 Pyrimidylethern: pyrithiobac-säure, pyrithiobac-sodium, KIH-2023, KIH-6127
b35 Sulfonamide: flumetsulam, metosulam
b36 Sulfonylharnstoffe: amidosulfuron, azimsulfuron, bensulfuron-methyl, chlorimuron- ethyl, chlorsulfuron, cinosulfuron, cyclosulfamuron, ethamet- sulfuron methyl, ethoxysulfuron, flazasulfuron, halosulfuron- methyl, imazosulfuron, metsulfuron-methyl, nicosulfuron, pri- misulfuron, prosulfuron, pyrazosulfuron-ethyl, rimsulfuron, sulfometuron-methyl, thifensulfuron-methyl, triasulfuron, tribenuron-methyl, triflusulfuron-methyl
b37 Triazine: ametryn, atrazin, aziprotryn, cyanazine, cyprazine, desme- tryn, dimethamethryn, dipropetryn, eglinazin-ethyl, hexazi- non, procyazine, prometon, prometryn, propazin, secbumeton, simazin, simetryn, terbumeton, terbutryn, terbutylazin, trie- tazin
b38 Triazinone: ethiozin, metamitron, metribuzin
b39 TriazQlcarboxami e: triazofenamid
b40 üracile: bromacil , lenacil, terbacil b41 Verschiedene: benazolin, benfuresate, bensulide, benzofluor, butamifos, ca- fenstrole, chlorthal-dimethyl (DCPA) , cinmethylin, dichlobe- nil, endothall, fluorbentranil, mefluidide, perfluidone, pi- perophos
Funktioneil äquivalente Derivate pflanzlicher Enzym-Inhibitoren besitzen ein vergleichbares Wirkungsspektrum wie die konkret genannten Substanzen, bei niedrigerer, gleicher oder höherer inhi- bitoriseher Aktivität (z.B. ausgedrückt in g Inhibitor pro Hektar Anbaufläche, erforderlich zur vollständigen Unterdrückung des Wachstums nicht-resistenter Pflanzen) .
Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:
Allgemeine Klonierungsverfahren
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonie- rungsschritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gel- elektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt.
Die im folgenden verwendeten Bakterienstämme (E. coli, XL-I Blue) wurden von Stratagene bezogen. Der zur Pflanzentransformation verwendete Agrobakterienstamm (Agrobacterium tumefaeiens, C58C1 mit dem Plasmid pGV2260 oder pGV3850kan) wurde von Deblaere et al. beschrieben (Nucl. Acids Res. 13 (1985) 4777). Alternativ können auch der Agrobakterienstamm LBA4404 (Clontech) oder andere geeignete Stämme eingesetzt werden. Zur Klonierung wurden die Vektoren pUC19 (Yanish-Perron, Gene 33(1985), 103-119) pBlues- cript SK- (Stratagene) , pGEM-T (Promega) , pZerO (Invitrogen) , pBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12(1984) 8711-8720) und pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230) benutzt.
Sequenzanalyse rekombinanter DNA
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Pharmacia nach der Methode von Sanger (Sanger et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) , 5463-5467) . Erzeugung pflanzlicher Expressionskassetten
In das Plasmid pBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12, 8711 (1984)) wurde ein 35S CaMV Promotor als EcoRI-Kpnl-Fragment (entsprechend den Nukleotiden 6909-7437 des Cauliflower-Mosaik- Virus (Franck et al. Cell 21 (1980) 285) inseriert. Das Polyade- nylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmides pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835), Nukleotide 11749-11939 wurde als PvuII-Hindlll-Fragment isoliert und nach Addition von Sphl-Linkern an die PvuII-Schnittstelle zwischen die SpHI-Hindlll Schnittstelle des Vektors kloniert. Es entstand das Plasmid pBi- nAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230) .
Anwendungsbeispiele
Beispiel 1
Da Herbizide nicht immunogen sind, müssen sie an ein Trägermaterial wie z.B. KLH gekoppelt werden. Befindet sich eine reak- tive Gruppe im Molekül, kann diese Kopplung direkt erfolgen, ansonsten wird während der Synthese des Herbizides eine funktionelle Gruppe eingeführt oder eine reaktive Vorstufe während der Synthese ausgesucht, um diese Moleküle in einem einfachen Reaktionsschritt an das Trägermolekül zu koppeln. Beispiele für Kop- plungen sind bei Miroslavic Ferencik in "Handbook of Immunoche- mistry" , 1993, Chapman & Hall, im Kapitel Antigene, Seite 20 - 49 beschrieben.
Durch wiederholte Injektion dieses modifizierten Trägermoleküls (Antigens) werden z.B. Balb/c-Mäuse immunisiert. Sobald im Serum genügend Antikörper mit Bindung an das Antigen im ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) nachweisbar sind, werden die Milz- zellen dieser Tiere entnommen und mit Myelomzellen fusioniert um Hybride zu kultivieren. Im ELISA wird zusätzlich als Antigen "Herbizid-modifiziertes BSA" verwendet, um die gegen das Hapten gerichtete Immunantwort von der KLH-Antwort zu unterscheiden.
Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern erfolgt in Anlehnung an bekannte Methoden, wie z.B. beschrieben in "Practical Immuno- logy", Leslie Hudson und Frank Hay, Blackwell Scientific
Publications, 1989 oder in "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice" , James Goding, 1983, Academic Press, Inc., oder in "A practical guide to monoclonal antibodies", J.Liddell und A. Cryer,1991, John Wileyfc Sons; oder Achim Möller und Franz Emling "Monokonale Antikörper gegen TNF und deren Verwendung". Europäische Patentschrift EP-A260610. Beispiel 2
Ausgangspunkt der Untersuchung war ein monoklonaler Antikörper der spezifisch das Herbizid Quinmerae erkennt und der außerdem 5 eine hohe Bindungsaffinität aufweist. Die selektionierte Hybrido- mazellinie ist dadurch charakterisiert, daß die sekretierten, gegen das Herbizid-Antigen Quinmerae gerichteten monoklonalen Antikörper eine hohe Affinität aufweisen und die spezifischen Sequenzen der Immunglobuline verfügbar sind (Berek, C. et al., Nature 10 316, 412-418 (1985)). Dieser monoklonale Antikörper gegen Quinmerae war Ausgangspunkt für die Konstruktion des Einketten-Antikör- perfragmentes (scFv-antiQuinmerac) .
Zunächst wurde mRNA aus den Hybridomzeilen isoliert und in cDNA
15 umgeschrieben. Diese cDNA diente als Matrize für die Amplifikation der variablen Immunglobulingene VH und VK mit den spezifischen Primern VH1 BACK und VH FOR-2 für die schwere Kette sowie VK2 BACK und MJK5 FON X für die leichte Kette (Clackson et al . , Nature 352, 624-628 (1991)). Die isolierten variablen Immunglobu-
20 line waren Ausgangspunkt für die Konstruktion eines Einketten-An- tikörperfragmentes (scFv-antiQuinmerac) . Bei der nachfolgenden Fusions- PCR wurden drei Komponenten VH,VK und ein Linkerfragment in einem PCR-Reaktionsansatz vereinigt und das scFv-antiQuinmerac simplifiziert (Abb. 3 ).
25
Die funktionelle Charakterisierung (Antigenbindungsaktivität) des konstruierten scFv-antiQuinmerac-Gens erfolgte nach Expression in einem bakteriellen System. Das scFv-antiQuinmerac wurde dazu nach der Methode von Hoogenboom, H.R. et al., Nucleic Acids
30 Research, 19, 4133-4137 (1991) als lösliches Antikörperfragment in E.coli synthetisiert. Die Aktivität und die Spezifität des konstruierten Antikörperfragmentes wurden in ELISA-Tests überprüft (Abb.4 ) .
35 Um eine samenspezifische Expression des Antikörperfragmentes in Tabak zu ermöglichen, wurde das scFv-antiQuinmerac Gen stromabwärts vom LeB4-Promotor kloniert. Der aus Vicia faba isolierte LeB4-Promotor zeigt eine streng samenspezifische Expression von verschiedenen Fremdgenen in Tabak (Bäumlein, H. et al., Mol. Gen.
40 Genet. 225, 121-128 (1991)). Durch Transport des scFv-antiQuinme- rac Polypeptides in das endoplasmatische Retikulum wurde eine stabile Akkumulation hoher Antikörperfragmentmengen erreicht. Das scFv-antiQuinmerac Gen wurde zu diesem Zweck mit einer Signalpep- tidsequenz, die den Eintritt in das endoplasmatische Retikulum
45 und dem ER-Retentionssignal SEKDEL, das ein Verbleiben im ER gewährleistet (Wandelt et al.,1992), fusioniert (Abb. 5 ). Die konstruierte Expressionskassette wurde in den binären Vektor pGSGLUC 1 (Saito et al., 1990) kloniert und durch Elektroporation in den Agrobacterium-Stamm EHA 101 transferiert. Rekombinante Agrobakterienklone wurden für die nachfolgende Transformation von Nicotiana tabacυm verwendet. Pro Konstrukt wurden 70-140 Tabakpflanzen regeneriert. Von den regenerierten transgenen Tabakpflanzen wurden nach Selbstbefruchtung Samen verschiedenener Entwicklungsstadien geerntet. Von diesen Samen wurden die löslichen Proteine nach Extraktion in einem wässrigen Puffersystem erhal- ten. Die Analyse der transgenen Pflanzen zeigt, daß durch die Fusion des scFv-antiQuinmerac Gens mit der DNA-Sequenz des ER-Re- tentionssignals SEKDEL eine maximale Akkumulation von 1,9 % scFv- antiQuinmerac Protein im reifen Samen erzielt werden konnte.
Das konstruierte scFv-antiQuinmerac Gen hatte eine Größe von ca. 735 bp. Die variablen Domänen wurden in der Reihenfolge VH-L-VL miteinander fusioniert.
Die spezifische Selektivität wurde in den Extrakten der reifen Tabaksamen mit einem direkten ELISA bestimmt. Die dabei erhaltenen Werte zeigen deutlich, daß die Proteinextrakte funktioneil aktive Antikörperfragmente enthalten.
Beispiel 3
Samenspezifische Expression und Anreicherung von Einketten-Anti- körperfragmenten im endoplasmatischen Retikulum von Zellen transgener Tabaksamen kontolliert durch den USP- Promotor.
Ausgangspunkt der Untersuchungen war ein Einzelketten-Antikörper- fragment gegen das Herbizid Quinmerae (scFv-anti Quinmerae) . Die funktionelle Charakterisierung (Antigenbindungsaktivität) dieses konstruierten scFv-anti- Quinmerae Genes erfolgte nach Expression in einem bakteriellen System und nach Expression in Tabakblät- tern. Die Aktivität und die Spezifität des konstruierten Antikörperfragmentes wurde in ELISA-Tests überprüft.
Um eine samenspezifische Expression des Antikörperfragmentes in Tabak zu ermöglichen, wurde das scFv-antiQuinmerac Gen stromab- wärts vom USP-Promotor kloniert. Der aus Vicia faba isolierte USP-Promotor zeigt eine streng samenspezifische Expression von verschiedenene Fremdgenen in Tabak (Fiedler, U. et al., Plant Mol. Biol. 22, 669-679 (1993)). Durch Transport des scFv-anti- Quinmerac Polypeptides in das endoplasmatische Retikulum wurde eine stabile Akkumulation hoher Antikörperfragmentmengen erreicht. Das scFv-antiQuinmerac Gen wurden zu diesem Zweck mit einer Signalpeptidsequenz, die den Eintritt in das endoplasmati- sehe Retikulum und dem ER-Retentionssignal SEKDEL, das ein Verbleiben im ER gewährleistet (Wandelt et al., 1992), fusioniert (Abb. 1 ) .
Die konstruierte Expressionskassette wurde in den binären Vektor pGSGLUCl (Saito et al., 1990) kloniert und durch Elektroporation in den Agrobacterium-Stamm EHA 101 transferiert. Rekombinante Agrobaktrienklone wurden für die nachfolgende Transformation von Nicotiana tabacυm verwendet. Von den regenerierten transgenen Ta- bakpflanzen wurden nach Selbstbefruchtung Samen verschiedener Entwicklungsstadien geerntet. Von diesen Samen wurden die löslichen Proteine nach Extraktion in einem wässrigen Puffersystem erhalten. Die Analyse der transgenen Pflanzen zeigt, daß durch die Fusion des scFv-antiAcifluorfen Gens mit der DNA-Sequenz des ER- Retentionssignals SEKDEL unter Kontrolle des USP-Promotors bereits ab Tag 10 der Samenentwicklung Einketten-Antikörperfrag- mente mit Bindeaffinität für Quinmerae synthetisiert wurden.
Beispiel 4
Um eine ubiquitäre Expression des Antikörperfragmentes in der Pflanze, speziell in Blättern, zu erreichen, wurde das scFv-anti- Quinmerac -Gen stromabwärts vom CaMV 35 S-Promotor kloniert. Dieser starke konstitutive Promotor vermittelt eine Expression von Fremdgenen in nahezu allen pflanzlichen Geweben (Benfey und Chua, Science 250 (1990), 956 - 966). Durch Transport des scFv-anti- Quinmerac Proteins in das endoplasmatische Retikulum wurde eine stabile Akkumulation hoher Antikörperfragmentmengen im Blattmaterial erreicht. Das scFv-antiQuinmerac Gen wurde zunächst mit einer Signalpeptidsequenz, die den Eintritt in das endoplasmatische Retikulum und dem ER-Retentionssignal KDEL, das ein Verbleiben im ER gewährleistet (Wandelt et al., Plant J. 2(1992), 181 - 192) fusioniert. Die konstruierte Expressionskassette wurde in den binären Vektor pGSGLUC 1 (Saito et al., Plant Cell Rep. 8 (1990), 718 - 721) kloniert und durch Elektroporation in den Agrobakterium -Stamm EHA 101 transferiert. Rekombinante Agrobak- terienklone wurden für die nachfolgende Transformation von Nicotiana tabacυm verwendet. Es wurden ungefähr 100 Tabakpflanzen regeneriert. Von den regenerierten transgenen Tabakpflanzen wurde Blattmaterial verschiedenener Entwicklungsstufen entnommen. Von diesem Blattmaterial wurden die löslichen Proteine nach Extraktion in einem wässrigen Puffersystem erhalten. Nachfolgende Analysen (Western-Blot-Analysen und ELISA-Tests) zeigten, daß in den Blättern eine maximale Akkumulation von größer 2 % an biologisch aktivem, antigenbindendem scFv-antiQuinmerac Polypeptid erzielt werden konnte. Die hohen Expressionswerte wurden in ausgewachse- nen grünen Blättern ermittelt, aber auch in seneszentem Blattmaterial konnte das Antikörperfragment nachgewiesen werden.
Beispiel 5
5
PCR-Amplifikation eines Fragmentes der cDNA codierend für den Ein-Ketten-Antikörper gegen Acifluorfen bzw. Quinmerae mithilfe synthetischer Oligonukleotide.
0 Die PCR-Amplikation der Ein-Ketten-Antikörper cDNA wurde in einem DNA-Thermal Cycler der Firma Perkin Eimer durchgeführt. Die Reaktionsgemische enthielten 8 ng/μl einzelsträngige Matrizen- cDNA , 0,5 μM der entsprechenden Oligonukleotide, 200 μM Nukleotide (Pharmacia), 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3
15 bei 25°C, l,5mM MgC12) und 0.02 U/μl Taq Polymerase (Perkin Eimer) . Die Amplifikationsbedingungen wurden wie folgt eingestellt:
Anlagerungstemperatur: 45°C
Denaturierungstemperatur : 94°C,
20 Elongationstemperatur: 72°C,
Anzahl der Zyklen: 40
Es resultierte ein Fragment von ca. 735 Basenpaaren, das in den Vektor pBluescript ligiert wurde. Mit dem Ligationsansatz wurde 25 E. coli XL-I Blue transformiert und das Plasmid amplifiziert. Zur Anwendung und Optimierung der Polymerase Kettenreaktion siehe: Innis et al., 1990, PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, Academic Press.
30 Beispiel 6
Herstellung transgener Tabakpflanzen, die eine cDNA codierend für einen Ein-Ketten-Antikörper mit Herbizid-bindenden Eigenschaften exprimieren.
35
Das Plasmid pGSGLUC 1 wurde in Agrobacterium tumefaeiens C58Cl:pGV2260 transformiert. Zur Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana fcaJbacum cv. Samsun NN) wurde eine 1:50 Verdünnung einer Übernachtkultur einer positiv transformierten Agrobakte-
40 rienkolonie in Murashige-Skoog Medium (Physiol. Plant. 15 (1962) 473 ff.) mit 2% Saccharose (2MS-Medium) benutzt. Blattscheiben steriler Pflanzen (zu je ca. 1 cm2) wurden in einer Petrischale mit einer 1:50 Agrobakterienverdünnung für 5-10 Minuten inkubiert. Es folgte eine 2-tägige Inkubation in Dunkelheit bei
45 25°C auf 2MS-Medium mit 0,8% Bacto-Agar. Die Kultivierung wurde nach 2 Tagen mit 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit weitergeführt und in wöchentlichem Rhythmus auf MS-Medium mit 500 mg/1 Claforan (Cefotaxime-Natrium) , 50 mg/1 Kanamycin, 1 mg/1 Benzyl- aminopurin (BAP) , 0,2 mg/1 Naphtylessigsäure und 1,6 g/1 Glukose weitergeführt. Wachsende Sprosse wurden auf MS-Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/1 Claforan und 0,8% Bacto-Agar überführt.
Beispiel 7
Stabile Akkumulation des Einketten-Antikörperfragmentes gegen das Herbizid Quinmerae im endoplasmatischen Reticulum.
Ausgangspunkt der Untersuchungen war ein in Tabakpflanzen expri - miertes Einketten-Antikörperfragment gegen das Herbizid Quinmerae (scFv-anti Quinmerae). Menge und Aktivität des synthetisierten scFv-antiQuinmerac Polypeptides wurden in Western-Blot-Analysen und ELISA-Tests bestimmt.
Um eine Expression des scFv-antiQuinmerac-Gens im endoplasmati - sehen Retikulum zu ermöglichen, wurde das Fremdgen unter der Kontrolle des CaMV 53S-Promotors als eine Translationsfusion mit dem LeB4-Signalpeptid (N-terminal) und dem ER-Retentionssignal KDEL (C-terminal) exprimiert. Durch Transport des scFv-antiQuin- merac Polypeptids in das endoplasmatische Retikulum wurde eine stabile Akkumulation hoher Mengen an aktivem Antikörperfragment erreicht. Nach Ernte des Blattmaterials wurden Stücke bei -20°C eingefroren (1) , lyophilisiert (2) oder bei Raumtemperatur getrocknet (3) . Die löslichen Proteine wurden aus dem jeweiligen Blattmaterial durch Extraktion in einem wässrigen Puffer erhalten und das scFv-antiQuinmerac Polpypeptid affinitätschromato- graphisch gereinigt. Gleiche Mengen an gereinigtem scFv-antiQuin- merac Polypeptids (eingefroren, lyophilisiert und getrocknet) wurden für die Bestimmung der Aktivität des Antikörperfragmentes eingesetzt (Abb. 6) . In Abb. 6 A ist die Antigenbindungsaktivität des aus frischen (1) , lyophilisierten (2) und getrockneten Blättern (3) gereinigten scFv-antiQuinmerac Polypeptides darge- stellt. In Abb. 6 B sind die jeweiligen Mengen an scFv-antiQuin- merac Protein (etwa 100 ng) , die für die ELISA-Analysen eingesetzt wurden, mittels Western-Blot-Analysen bestimmt. Die Größen der Proteinmolekulargewichtsstandards sind links dargestellt. Dabei wurden etwa gleiche Antigenbindungsaktivitäten festgestellt.
Beispiel 8
Zum Nachweis der Herbizid-Toleranz der ein Polypeptid mit Herbi¬ zid-bindenden Eigenschaften produzierenden transgenen Tabakpflan- zen wurden diese mit unterschiedlichen Mengen Acifluorfen bzw. Quinmerae behandelt. In allen Fällen konnte im Gewächshaus gezeigt werden, daß die ein scFv-antiAcifluorfen bzw. ein scFv-an- tiQuinmerac exprimierenden Pflanzen im Vergleich zur Kontrolle eine Toleranz gegenüber den entsprechenden Herbiziden zeigen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Herbizid-toleranten Pflanzen 5 durch Expression eines exogenen Herbizid-bindenden Polypeptids in den Pflanzen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem exogenen Herbizid-bindenden Polypeptid um ein 0 Einketten-Antikörperfragment handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem exogenen Herbizid-bindenden Polypeptid um einen kompletten Antikörper oder um ein davon abgeleitetes Fragment 5 handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Herbizid um 5- (2-Chlor-4- (trifluormethyDphen- oxy) -2-nitrobenzoesäure handelt. 0
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Herbizid um 7-Chlor-3-methylchinolin-8-carbon- säure handelt.
5 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um mono- oder dikotyle Pflanzen handelt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es 30 sich bei der Pflanze um Tabak handelt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des exogenen Polypeptids konsti- tutiv in der Pflanze erfolgt.
35
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des exogenen Polypeptids in der Pflanze induziert wird.
40 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des exogenen Polypeptids in den Blättern der Pflanze erfolgt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekenn- 45 zeichnet, daß die Expression des exogenen Polypeptids in den Samen der Pflanze erfolgt.
Zeichn.
12. Expressionskassette für Pflanzen bestehend aus einem Promotor, einem Signalpeptid, einem Gen codierend für die Expression eines exogenen Herbizid-bindenden Polypeptids, einem ER-Retentionssignal und einem Terminator.
5
13. Expressionskassette nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß als konstitutiver Promotor der CaMV 35S-Promotor verwendet wird.
10 14. Expressionskassette nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß als zu exprimierendes Gen das Gen eines Einketten-Antikörperfragmentes eingesetzt wird.
15. Expressionskassette nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, 15 daß als zu exprimierendes Gen das Gen oder Genfragment eines Herbizid-bindenden Polypeptides als Translationsfusion mit anderen funktioneilen Proteinen wie zum Beispiel Enzymen, To- xinen, Chromophoren und Bindeproteinen eingesetzt wird.
20 16. Expressionskassette nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das zu exprimierende Polypeptidgen aus einer Hybridoma- zelle oder mit Hilfe anderer rekombinanter Methoden - wie z.B. der Antikörper-Phage-Display Methode - gewonnen wird.
25 17. Verwendung der Expressionskassette nach Anspruch 12 zur
Transformation von dicotylen oder monokotylen Pflanzen, die konstitutiv samen- oder blatt-spezifisch ein exogenes Herbizid-bindendes Polypeptid exprimieren.
30 18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expressionskassette in einen Bakterienstamm transferiert und die entstandenen rekombinanten Klone zur Transformation von dicotylen oder monokotylen Pflanzen, die konstitutiv Samen- oder blattspezifisch ein exogenes Herbizid-bindendes
35 Polypeptid exprimieren, verwendet.
19. Verwendung der Expressionskassette nach Anspruch 12 als Se- lektionsmarker .
40 20. Verwendung einer transformierten Pflanze wie nach Anspruch 18 oder 19 erhalten zur Herstellung eines Herbizid-bindenden Polypeptids .
45
21. Verfahren zur Transformation einer Pflanze durch Einbringen einer Gensequenz, die für ein Herbizid-bindendes Polypeptid codiert, in eine Pflanzenzelle, in Kallusgewebe, eine ganze Pflanze und Protoplasten von Pflanzenzellen.
5
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformation mit Hilfe eines Agrobacteriums insbesondere der Art Agrobacterium tumefaeiens erfolgt.
10 23. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformation mit Hilfe der Elektroporation erfolgt.
24. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformation mit Hilfe der particle bombardment Methode er-
15 folgt.
25. Herstellung eines Herbizid-bindenden Polypeptides durch Expression eines Gens codierend für ein derartiges Polypeptid in einer Pflanze bzw. Zellen einer Pflanze und anschließende
20 Isolierung des Polypeptides.
26. Pflanze enthaltend eine Expressionskassette gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionskassette Toleranz gegenüber einem Herbizid vermittelt.
25
27. Pflanze nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß sie tolerant gegenüber 5- (2-Chlor-4- (trifluormethyl)phenoxy) -2-nitrobenzoesäure ist.
30 28. Pflanze nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß sie tolerant gegenüber 7-Chlor-3-methylchinolin-8-carbonsäure ist.
29. Verfahren zur Bekämpfung von unerwünschtem Pflanzenwuchs in transgenen Herbizid-resistenten Kulturpflanzen dadurch ge-
35 kennzeichnet, daß Herbizide eingesetzt werden, gegen die die Kulturpflanze Herbizid-bindende Polypeptide oder Antikörper bildet.
30. Herbizid-bindende Polypeptide bzw. Antikörper mit hoher Bin- 40 deaffinität zu 5- (2-Chlor-4- (trifluormethyDphenoxy) -2-nitro- benzoesäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie gemäß Anspruch 25 hergestellt werden.
45
31. Herbizid-bindende Polypeptide bzw. Antikörper mit hoher Bindeaffinität zu 7-Chlor-3-methylchinolin-8-carbonsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie gemäß Anspruch 25 hergestellt werden.
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