BG103831A - Експресия на хербицид-свързващи полипептиди в растенията за създаване на поносимост спрямо хербициди - Google Patents

Експресия на хербицид-свързващи полипептиди в растенията за създаване на поносимост спрямо хербициди Download PDF

Info

Publication number
BG103831A
BG103831A BG103831A BG10383199A BG103831A BG 103831 A BG103831 A BG 103831A BG 103831 A BG103831 A BG 103831A BG 10383199 A BG10383199 A BG 10383199A BG 103831 A BG103831 A BG 103831A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
chloro
plant
antibody
expression
plants
Prior art date
Application number
BG103831A
Other languages
English (en)
Inventor
Jens Lerchl
Achim Moeller
Ralf-Michael Schmidt
Helmut Schiffer
Udo Rabe
Udo Conrad
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Basf Aktiengesellschaft filed Critical Basf Aktiengesellschaft
Publication of BG103831A publication Critical patent/BG103831A/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Методът за създаване на поносимост в растения спрямо хербициди се осъществява чрез експресия на хербицидсвързващо антитяло в растенията.

Description

Настоящето изобретение се отнася до метод за получаване на растения с поносимост спрямо хербициди, чрез експресия на екзогенен хербицид-свързващ полипептид в растения или в части от растения. Изобретението се отнася освен това до използване на съответни нуклеинови киселини, кодиращи полипептид, антитяло или части на антитяло с хербицид-свързващи свойства в трансгенни растения и по този начин до трансформираното растение само по себе си.
Предшествуващо състояние на техниката
Известно е, че с помощта на методите на генното инженерство, могат целенасочено в генома на растението да се въведат чужди гени. Този процес се нарича трансформация и получените растения се наричат трансгенни. Трансгенни растения се използват понастоящем в различни биотехнологични области. Така напр. са описани растения, резистентни спрямо инсекти (Vaek et al. Plant Cell 5 (1987), 159-169), растения, резистентни спрямо вируси (Powell et al. Science 232 (1986), 738-743) и растения, резистентни спрямо озон (Van Camp et al. BioTech. 12 (1994), 165-168). Примери за подобряване на качеството по пътя на генното инженерство са: повишаване на съхраняемостта на • · • · • · ·
900.99-ПБ
плодове (Oeller et al. Science 254 (1991), 437-439); повишаване на продукцията на нишесте в картофени растения (Stark et al., Science 242 (1992), 419), промяна на нишестения състав (Visser et al. Mol. Gen. Genet. 225 '(1991), 289-296), промяна на липидния състав (Voelker et al. Science 257 (1992), 72-74) и продукция на непривични за растението полимери (Poirer et al. Science 256 (1992), 520-523).
Важна цел на работата в областта на молекулната генетика на растенията е да се създаде поносимост спрямо хербициди. Тя се изразява с повишена по вид или по сила поносимост на растенията или на части от тях спрямо приложен хербицид. Тази поносимост може да се повлияе по различен начин. Познатите методи се състоят в използване на ген на метаболизъм, напр. patgen, в зависимост от глуфозинатна резистентност (WO 8705629) или на хербицид-резистентен целеви ензим, както е напр. в случая с Enolpyruvylshiki-mat-3-phosphat-Synthase (WO 9204449), който е резистентен спрямо глифосфат, както и използване на хербицид в клетъчни и тъканни култури за селекция на растителни клетки с добра поносимост и на получените резистентни растения, както е описано за ацетил СоА карбоксилазни инхибитори (US 5162602, US 5290696).
Антителата са протеини, които са част от имунната система. Всички антитела имат пространствена глобуларна структура, изградена от по-леки и по-тежки вериги. Те по принцип имат способността да могат да свързват молекули или части от структурата на молекули с голяма специфичност (Alberts et al.,: Molekularbiologie der Zelle, 2. Aiiflage 1990, VCN Verlag, ISBN 3527-27983-0, 1 198-1237). Въз основа на тези свойства антителата се използват за различни цели. При това се различава използване • · · · • · · · ·
900.99-ПБ • ·· • ·· • · · ·· · •· • · · ·
на антитела в животински или човешки организми, които ги продуцират, тъй наречените in-situ използване, както и ex-situ използване, т.е. използването на антитела след изолиране от продуциращите клетки или организми (Whitelam und Cockburn, TIPS Vol. 1, 8 (1996), 268-272).
Използването на хибридни соматични клетъчни линии (хибридоми) като източник на антитела спрямо конкретно определени антигени е познато от работите на Koehler и Milstein (Nature 256 (1975) 495-97) и след това. По този метод се получават тъй наречените моноклонални антитела, които притежават единна структура и са получени чрез клетъчно сливане. За целта клетки от далака на имунизирана мишка се сливат с клетки на мишимиелом. Така се получават хибридомни клетки, които се размножават неограничено. Същевременно клетките отделят специфични антитела срещу антигени, с които мишката е била имунизирана. Клетките от далака създават възможност за продукция на антитела, докато миеломните клетки осигуряват неограничена възможност за растеж и направляват непрекъснатата секреция на антитела. Тъй като всяка хибридомна клетка се отделя като клон от една единствена В-клетка, то всички изградени молекули на антитела притежават еднаква структура, включително на антигенсвързващото място. Този метод дава тласък на използването на антитела, тъй като чрез него са на разположение неограничен брой антитела с еднаква, позната специфичност и с хомогенна структура. Моноклонални антитела намират вече приложение при имунодиагностиката и като терапевтични средства.
От няколко години съществува тъй нареченият PhagenDisplay-метод за получаване на антитела, при който се избягва въздействие върху имунната система и някои имунизирания на • · • ·
900.99-ПБ
животни. При това афинитетът и специфичността на антителата in vitro се изравняват (Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994), 433-455; Hoogenboom TlBTech Vol 15 (1997), 62-70). Гениите сегменти, които съдържат кодиращата секвенция на променлив регион от антитела, т.е. антиген-свързващите мяста, се сливат с гени за обвиващ протеин на бактериофаг. След това бактериите се инфектират с фаги, които съдържат такива слети гени. Получаващите се части от фаги притежават сега обвивки от антитяло-подобни слети протеини, при което свързващите антителата домени се показват навън. От такава Phagen-Displayбиблиотека могат да се изолират фаги, които съдържат желаните фрагменти от антитела и са свързани специфично към определен антиген. Всяка изолирана по този начин фага произвежда моноклонален, антигенсвързващ полипептид, който отговаря на едно моноклонално антитяло. Гените на антигенсвързващото място, които са различни за всяка фага, могат да се изолират от фага-ДНК и да се вложат в конструкция на пълноценни антитялогени.
В областта на растителната защита, антителата се използват особено като средство за анализ ex-sito за количесвено и качествено доказване на антигени. Това включва доказване на съдържанието на вещества в растенията, на хербициди или фунгициди в питейната вода (Sharp et al. (1991) ACS Symp Ser., 446 (Pestic. Residues Food Saf.) 87-95), в проби от пръст (WO 9423018) или в растения или части от растения. Освен това антитела се използват като помощно средство за почистване от свързани молекули.
Продукцията на имуноглобулини в растения за пръв път е описана от Hiatt et al., Nature, 342 (1989), 76-78. Спектърът се
ЙШ
··
900.99-ПБ ···· • ·· ♦ ·· ·· простира от едноверижни антитела, до многоверижни секреторни антитела (J. Ма und Mich Hein, 1996, Annuals New York Academy of Sciences, 72- 81).
При по-нови опити, антитела се използват in-situ за защита от патогени в растения, по-специално от вирусни заболявания, чрез експресия на специфични антитела или части от тях, насочена срещу вирусни обвивни протеини в растителни клетки (Tavladoraki et al., Nature 366 (1993), 469-472; Voss et al., Mol. Breeding 1 (1995), 39-50).
Подобно приложение е използването за защита от инфекция на растенията чрез нематоди (Rosso et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 220 (1996), 255-263). Известни са също примери за фармацевтично приложение на експресията на антитела in-situ в растения за нуждите на орално имунизиране, напр. (Ма et al., Science 268 (1995), 716-719; Mason und Arntzen, Tibtech Vol. 13 (1996), 388-392). Изградените от растението антитела при това се приемат чрез растението или чрез консумиране на подходящи части от растението, като се усвояват чрез устата, фаринкса или стомашночревтния тракт на тялото и причиняват активен имунитет. Освен това е известно експресиране на едноверижни антитела (single chain antibody) в растения срещу нискомолекулния растителния хормон абсцизинова киселина, при което се наблюдава понижено наличие на растителния хормон въз основа на свързването на абсцизиновата киселина в растението (Artsaenko et al., The Plant Journal (1995), 8. (5), 745-750).
Борбата c плевели по химически начин при важните за селското стопанство култури изисква използването на високоселективни хербициди. В някои случаи все пак е трудно да се създадат хербициди с достатъчно висока селективност, които да
900.99-ПБ
·· • • ·· • · • • ·· ·· • · • а ·· • · • а
·· · • · • •
• • · • · • · а аа ааа
• • • · • • •
·· • ···· а·· аа аа ··
не причиняват вреди на културното растение. Създаването на резистентни към хербицида или понасящи хербицида културни растения може да допринесе за решаване на този проблем.
На разработването на резистентни към хербициди културни растения чрез тъканни култури или мутагенеза на семената и естествен подбор се поставят граници. Така чрез генното инженерство могат да се манипулират само тези растения,
регенерирането на които става от клетъчната култура до цялото растение. Освен това културните растения могат да проявят след мутагенеза и селекция нежелани свойства, които биха могли да бъдат отстранени чрез частично многократно обратно кръстосване. Също би могло да бъде ограничено създаването на резистентност чрез кръстоска върху растения от същия вид.
От тези съображения от присадката, създадена по пътя на генното инженерство трябва да се изолира кодиращ резистентност ген и целенасочено да се прехвърли, при използване на
класическите методи за отглеждане на растението.
Развитието на поносимост спрямо хербициди по пътя на молекулната биология, напр. създаването на културни растения резистентни спрямо хербициди, изискваше досега въздействащият механизъм на хербицида в растението да е познат и да бъде намерен ген, който да причинява резистентност спрямо хербицида. Много от търговски използваните понастоящем хербициди действат чрез блокиране на ензим, необходим за биосинтезата на основна аминокиселина, липид или пигмент. Чрез промяна на гена на този ензим се стига до това, че хербицидът не може повече да се свърже и чрез въвеждане на тези променени гени в културните растения се създава поносимост спрямо хербицида. Алтернативно, примерно в природата могат да се намерят аналогични
900.99-ПБ
·· ·· • ·· ·· ··
• · • · ·· · • • · • ·
• • • · • • · • ·
• • · • · • · ··· ···
• • • · • • •
···· ···· ··· ·· • · ··
ензими, напр. в някои микроорганизми, които способстват за природна резистентност спрямо хербициди. Този способстващ за резистентност ген се изолира от такъв микроорганизъм, клонира се в подходящи вектори и накрая след успешна трансформация се въвежда за експресия в културно растение, което е чувствително спрямо хербицид (WO 96/38567).
Задача на настоящето изобретение е да се създаде нов вид общоприложим метод на генното инженерство за отглеждане на понасящи хербицида трансгенни растения.
Техническа същност на изобретението
Сега по неочакван начин е създаден метод за експресия на екзогенни полипептиди, антитела или части от антитела, които притежават свойството да свързват хербицида в растенията.
Един първи обект на изобретението представлява получаването на хербицид-свързващо антитяло и клониране на принадлежащия ген, съответно генен фрагмент.
Първоначално се продуцира антитяло, което да свързва хербицида. Това може да стане напр. чрез имунизиране на гръбначни животни, най-често мишка, плъх, куче, кон, магаре или коза с антиген: Антигенът при това е хербицидно активно вещество, което е присъединено или асоциирано чрез функционална група към високомолекулен носител, като говежди серумен албумин (BSA), кокоши белтък (овалбумин), keyhole limpet хемоцианин (KLH) или други носители. Имунният отговор след многократно използване на антиген при допълтнително провеждане по бързите методи води до изолиране на подходящ антисерум. Този продукт доставя първоначално поликлонален серум, който съдържа антитела с различна специфичност. За целите на използване insitu е необходимо да се изолира секвенция, кодираща за • ·
900.99-ПБ
·· • ♦ • ·· ···
9· ·· ··· ·· определени специфични моноклонални тела. За постигане на тази цел има различни пътища. Първият от тях използва сливане на клетки, продуциращи антитела с ракови клетки до една постоянно продуцираща антитела хибридома-клетъчна култура, която чрез уеднаквяване на получените клони накрая води до получаване на хомогенна, дефинирана моноклонална, продуцираща антитела клетъчна линия.
От една такава моноклонална клетъчна линия се изолира кДНК за антитела, съответно части от антитела, на тъй-наречените едноверижни антитела (single chain amtibody - scFv). Тези кДНК-секвенции могат след това да се клонират в експресионна касета и да се използват за функционална експресия в прокариотни и еукариотни организми, включително в растения.
Възможно е също по метода Phagen-Displey-Banken да се селекционират антитела, които да свързват молекулите на хербицида и да се получи каталитично продукт, който не притежава хербицидни свойства. Методи за получаване на каталитични антитела са описани от Janda et al., в Science 275 (1997) 945-948, Chemical selection for catalysis in combinatorial Antibodiy libraries; Catalytic Antibodies, 1991, Ciba Foundation Symposium 159, WileyInterscience Publication. Чрез клониране на гена на това каталитично антитяло и експресията му в растение може по принцип също така да се получи резистентно спрямо хербицид растение.
Обект на изобретението са по-специално експресионни касети, кодиращите секвенции на които кодират за хербицидсвързващ полипептид или за негови функционални еквиваленти, както и тяхното използване за получаване на устойчиви спрямо хербициди растения. Секвенцията от нуклеинови киселини може при това да бъде напр. една ДНК- или кДНК-секвенция. За
900.99-ПБ
въвеждане в експресионната касета, съгласно изобретението, на подходящи кодиращи секвенции се предлагат напр. такива, които съдържат една ДНК-секвенция, получена от една хибридомна клетка, която кодира за полипептид с хербицид-свързващи свойства и която осигурява на гостоприемника резистентност спрямо инхибиторни растителни ензими.
Експресионната касета съгласно изобретението съдържа освен това регулативна секвенция от нуклеинови киселини, която направлява експресията на кодираща секвенция в клетките на гостоприемника. Съгласно една предпочитана форма на изпълнение на изобретението, експресионната касета обхваща по направление нагоре, т. е. на 5’-края на кодиращата секвенция един промотор и по направление надолу, т.е. на 3’-края на секвенцията един полиаденилиращ сигнал и в даден случай други регулационни елементи, които с намиращата се помежду кодираща секвенция са свързани оперативно с пептида с хербицидсвързващи свойства и/или с транспептид. Под понятието оперативно свързване се разбира последователното подреждане на промотор, кодираща секвенция, терминатор и в даден случай други регулиращи елементи, по такъв начин, че да може всеки от регулиращите елементи да изпълни своята функция при експресията на кодиращите секвенции по предназначение. Предпочитаните за оперативното свързване секвенции, без изобретението да се ограничава до тях, са целевите-секвенции за осигуряване на субцелуларна локализация в апопластите, в плазмените мембрани, във вакуолите, в пластиците, в митохондриума, в ендоплазматичния ретикулум (ER), в ядрото на клетката, в маслените телца и в други части и транслационните усилватели, като напр. 5’900.99-ПБ ·· ·· • · · · · • · • · · • · ········ · • · •· •· •· •· • ·♦ ·· въвеждащата секвенция от Tabak Mosaic
Virus
Acids Res. 1 5 (1 987), 8693-871 1).
Като промотор на експресионната касета
• · ··· нието е подходящ общо взето всеки промотор, съгласно изобретекойто може да направлява експресията на фрагменти. Така напр. се използва по-специално растителен промотор, или промотор, който произхожда от растителин вирус. Особено предпочитан е CaMV35δ-προΜθτορ от цветно зеле-Mosaic Virus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294). Този промотор съдържа различни отличителни секвенции за транскрипционални ефектори, които в тяхната цялост водят до постоянна и конститутивна експресия на въведения ген (Benfey et al., EMBO J., 8 (1989), 2195-2202).
Експесионната касета съгласно изобретението може да съдържа също химически индуциращ се промотор, чрез който експресията на екзогенни полипептиди в растенията може да бъде направлявана до един определен момент във времето. Такива промотори , като напр. PRP1-промотор (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22(1993), 361-366), промотор, индуциращ се чрез салицилова киселина (WO 95/1919443), промотор, индуциращ се от бензенсулфонамид (ЕР 388186), промотор, индуциращ се от абсцизинова киселина (ЕР 335528), съответно промотор, индуциращ се от етанол или циклохексанон (WO 9321334), са описани в литературата и могат също така да бъдат използвани.
Освен това са предпочитени особено промотори, които окигуряват експресия в тъкани или части от растения, в които се разпространява действието на хербицида. По-специално трябва да бъдат споменати промотори, които осигуряват специфична експресия в листата. Могат да се споменат промоторите на
900.99-ПБ ·· ·· • · • · ··
• · ·· ·· • ··
цитозолна FB-фаза от картофи или ST-LSI промотор от картофи (Stockhaus et al., EMBO J., 8 (1989), 2445-245).
C помощта на промотор, специфичен за семена, могат да се експресират едноверижни-антитела, стабилни до 0.67 % спрямо общата стойност на разтворими семе-протеини в семената на трансгенни тютюневи растения (Fiedler und Conrad, Bio/Technology 10 (1995), 1090-1094). Тъй като е възможна също експресия в засети или покълнали семена, то по смисъла на настоящето изобретение, специфични промотори от кълнове или семена могат да са също така предпочитани регулиращи елементи съгласно изобретението. Експресионната касета съгласно изобретението може да съдържа също напр. специфичен за семена промотор (за предпочитане USP- или ЬЕВ4-прдмотор, 1_ЕВ4-сигнален пептид), който съдържа гена за експемиране и един ER-задържащ сигнал. Изграждането на касетата е показано схематично на фигура 1, като пример за едноверижно антитяло (scFv-Gen).
Получаването на експресионна касета съгласно изобретението се провежда чрез сливане на подходящ промотор с подходяща полипептид-ДНК и за предпочитане инсерция на един междинен промотор и полипептид-ДНК, за една хлоропластиспецифична, кодираща транзитен пептид ДНК, както и един полиаденилиращ сигнал, при използване на бързи рекомбинационни и клониращи техники, каквито са описани например от Т. Maniatis, E.F. Fritsch и J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), също и от t. J. Silhavy, M.L. Berman und L. W. Enguist, в Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984), и от Ausubel, F.M. et al., • ·
900.99-ПБ
·* ·· • » · · • · · · • ·· · · · • · · · · · · ·*·· ·«·· ··· ·· ·· ··
Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, and Wiley-I nterscience (1987).
Особено предпочитани са секвенции, които са насочени към апопласти, пластиди, вакуоли, плазмени мембрани, митохондрии, ендоплазматичен ретикулум (ER) или чрез отсъствие на съответна оперативна секвенция на мястото на създаване осигуряват оставането на цитозол (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423). За количеството на натрупване на протеин в трансгенни растения се оказва особено необходима локализация в ER, както и в стената на клетката (Schouten et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792; Artsaenko et al., Plant J., 8, (1995), 745-750).
Обект на изобретението са също експресионни касети, кодиращата секвенция на които кодира хербицид-свързващ слят протеин, при което част от слетия протеин е транзитен пептид, който направлява транслокация на полипептида. Особено предпочитани са хлоропласт-специфични транзитни пептиди, които след транслокация на хербицид свързващите полипептиди в растителните хлоропласти се отцепват ензимно от хербицидсвързващата полипептидна част. Особено се предпочита транзитният пептид да се отстрани от пластидната транскетолаза (ТК) или един функционален еквивалент на този транзитен пептид (напр. транзитен пептид на малките елементи на Rubisko или на Ferredoxin NADP- оксидоредуктаза).
Необходимите за получаване на експресионни касети съгласно изобретението полипептид-ДНК или кДНК се амплифицират за предпочитане с помощта на метода Polimerase Chain
Reaction (PCR). Познати са методи за ДНК-амплификация чрез
PCR, напр. описаните от Innes et al., PCR Protocols, A Guide to
Methods and Applications, Academic Press (1990). Целесъобразно φφ φφ • φ φ ·
900.99-ПБ • · • φ • ·Φ· ·φφφ • Φ φφ φφ φφ φφ
е получените по метода PCR ДНК-фрагменти да се подлагат на изпитване чрез секвенционен анализ за избягване на грешки на полимеразата в конструкта, подлежащ на експресия.
Включената нуклеотидна секвенция, кодираща за хербицидсвързващ полипептид може да се получи по синтетичен път или да е получена в природата, или да съдържа смес от синтетични и природни ДНК-съставни части. Общо взето синтетичните нуклеотидни секвенции се получават с кодони, които са предпочитани от растения. Тези предпочитани от растенията кодони могат да се определят от кодони с по-високо протеиново число, които се експресират най-често в интересни растителни видове. При получаване на експресионна касета могат да се обработят различни ДНК-фрагменти, за да се получи нуклеотидна секвенция, която целесъобразно е насочена в коректната посока и която е изградена с коректен Leseraster. За свързване на ДНК-фрагментите един с друг могат към фрагментите да се присъединят адаптери или свързваща ДНК.
По целесъобразен начин трябва областите на промотора и терминатора в посока на транскрипцията да бъдат снабдени с свързваща ДНК или с много свързващи ДНК, които съдържат едно или повече рестрикционни места за въвеждане на тази секвенция. По правило свързващата ДНК има 1 до 10, най-често 1 до 8, за предпочитане 2 до 6 рестрикционни места. Общо взето свързващата ДНК има в регулаторната област големина по-малка от 100 Ьр, често пъти по-малка от 60 Ьр и все пак най-малко 5 Ьр. Промоторът съгласно изобретението може да бъде както природен продукт, съответно хомоложен, така и чужд, съответно хетероложен за растението гостоприемник. Експресионната касета съгласно изобретението съдържа в 5’-3’-транскрипционно
900.99-ПБ • · » · направление промотора, съгласно изобретението, една произволна секвенция и една област на транскрипционното прекратяване. Различните области на прекратяване на синтезата са произволно взаимозаменяеми.
Освен това могат да се въведат манипулации, които осигуряват протичащите рестрикционни етапи или с които се отстранява излишната ДНК или се отстраняват рестрикционните места на късане. Където става въпрос за инсерция, делеция или заместване, като напр. транзиция и тренсверсия, могат да се използват in vitro мутагенеза, primerre-pair, рестрикция или лигиране. При подходящи манипулации, като напр. рестрикция, chewing-back или допълване на натрупвания за bluntends, комплементарните краища на фрагментите могат да бъдат на разположение за лигиране.
От особено значение за успеха на решението съгласно изобретението е прикачването на специфичен ER-задържащ сигнал SEKDEL (Schuoten, A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792), c което се утроява до учетворява средната величина на експресията. За изграждане на касетата могат да бъдат въведени също и други задържащи сигнали, които обикновено са локализирани в ER растителни и животински протеини.
Предпочитаните полиаденйлиращи сигнали са растителните полиаденилиращи сигнали, за предпочитане такива, които отговарят по същество на T-DNA-полиаденилиращи сигнали от Agrobacterium tumefaciens, особено отговарящите на ген-З на ТDNA (Octopin Syntase) от Ti-плазмиди pTiACHS (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) стр. 835 и следващи) или на техни функционални еквиваленти.
·· ·· ·· ·· • · · ·
900.99-ПБ • · · • · · ···
··
Една експресионна касета съгласно изобретението може да съдържа например конститутивен промотор (за предпочитане CaMV 35 S-промотор), 1_еВ4-сигнален пептид, ген за експресия и ER-задържащ сигнал. Изграждането на касета е представено схематично на Фигура 2, например за едноверижно антитяло (scFv-Gen), Като ER-задържащ сигнал се използва за предпочитане аминокиселинната последователност KDEL (лизин, аспарагинова киселина, глутаминова киселина, левцин).
За предпочитане сливащата експресионна касета, която кодира за полипептид с хербицид-свързващи свойства е клонирана във вектор, например pBinl9, който е подходящ да трансформира Agrobacterium tumefaciens. Трансформираните с такъв вектор агробактерии могат след това да се използват по познат начин за трансформиране на растения, по-специално на културни растения, като напр. тютюневи растения, при което напр. използваните листа или късчета от листа се промиват в бактериен разтвор и след това се култивират в подходяща среда. Трансформация на растения с акробактерии е позната между другото от публикацията на F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, издадена от S.D. Kung и R. Wu, Academic Press, 1993, стр. 15-38 и от публикацията на S.B. Gelvin, Molecular Genetics of T-DNA Transfer from Agrobakterium to Plants, публикувана също в Transgenic Plants, стр. 49-78. От трансформираните клетки на използваните листа, съответно късове от листа, могат по познат начин да се регенерират трансгенни растения, които съдържат интегриран в касетата съгласно изобретението ген за експресия на полипептид с хербицид-свързващи свойства.
900.99-ПБ ·· • · · · • · • · · • · ···· ···· ·· ·· ·· • · · · ·· • · · · ·· • · · ······ •· · · • ·· ·· ··
За трансформация на растение-гостоприемник с една, кодирана за хербицид-свързващ полипептид ДНК, се изгражда експресионна касета съгласно изобретението, въведена като инсерция в рекомбинантен вектор, чиято векторна ДНК съдържа допълнително функционални регулационни сигнали, например секвенции за репликация или интеграция. Подходящи вектори са описани между другото в Metods in Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press), Kap. 6/7, стр. 71 -1 19 (1 993).
При използване на цитираните по-горе рекомбинантни техники и техники за клониране, експресионните касети съгласно изобретението могат да се клонират в подходящи вектори, които да дават възможност за тяхното размножаване, напр. в Е. coli.
Подходящи клонирани вектори са между другото pBR332, pUCсерии, М13тр-серии и pA-CYC184. Особено подходящи са бинерни вектори, които могат да се реплицират както в Е. coli, така и в агробактерии, като напр. pBinl 9 (Bevan et al. (1980) Nucl.
Acids Res. 12, 8711).
Друг обект на изобретението е използване на експресионни касети съгласно изобретението за трансформация на растения, растителни клетки, тъкани и части от растения. Цел на използването е за предпочитане създаване на резистентност срещу инхибитори на растителни ензими.
При това според избора на промоторите експресията се осъществява специфично в листата, в семената или в други части на растенията. Такива трансгенни растения, техни плодове, както и клетки, тъкани или части от растението, са друг обект на настоящето изобретение.
Пренасянето на чужди гени в генома на растение се нарича трансформация. При това се използват описаните методи за
900.99-ПБ .· *
.....17 трансформация и регенерация на растения от растителни тъкани и растителни клетки за провеждане на преходна или стабилна трансформация. Подходящи методи са трансформация на протопласти чрез полиетиленгликол-индуцирано приемане на
ДНК, биолитично въвеждане на генканон, електропорообразуване,
инкубиране на сухи ембриони в съдържащи ДНК разтвори, микроинжектиране и генен трансфер с помощта на агробактерия. Посочените методи са описани, напр. от В. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, в Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, издадена от S.D. Kung и R. Wu, Academic Press, 1 993, стр. 128-143, както и в Portykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225), За предпочитане конструктът, който подлежи на експресия се клонира в един вектор, който е подходящ, за да се трансформира Agrobacterium tumefaciens, напр. pBinl 9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 871 1),
Трансформираните c помощта на експресионната касета съгласно изобретението агробактерии могат след това по познат начин да се използват за трансформация на растения, поспециално на културни растения, като пшеница, царевица, соя, ориз, памук, захарна тръстика, канола, слънчоглед, лен, картофи, тютюн, домати, рапица, люцерна, салата и различни видове памук, ореховидни и лозя, напр. при което заболелите листа и листни късове си промиват в разтвор на агробактерии и след това се култивират в подходящ разтвор.
Функционално еквивалентни секвенции, които кодират хербицид-свързващ полипептид, съгласно изобретението, са такива секвенции, които освен различаващата се нуклеотидна секвенция имат други желани функционални групи, функционалните еквиваленти обхващат по този начин природно наличните варианти на описаните тук секвенции, както и изкуствени, които
900.99-ПБ • ·
са получени напр. чрез химически синтез, пригодени за кодон-
използване при растение, изкуствени нуклеотидни секвенции.
Под понятието функционални еквиваленти се разбират поспециално природни или изкуствени мутации на предварително изолирана кодираща хербицид-свьрзващ полипептид секвенция, която проявява освен това желана функция. Мутациите обхващат заместване, прибавяне делеция, замяна или инсерция на един или повече нуклеотидни участъка. Така например съгласно изобретението се обхващат също и такива нуклеотидни секвенции, които се получават чрез модификация на тези нуклеотидни секвенции. Цел на такава модификация може напр. да бъде следващо ограничаване на получената кодираща секвенция в него или напр. също включване на други места на късане от рестрикционни ензими.
Функционални еквиваленти са също такива варианти, чието действие е изравнено с изходния ген, съответно генни фрагменти с отслабено или усилено действие, в сравнение с изходния ген, съответно генен фрагмент.
Освен това са подходящи изкуствени ДНК секвенции, доколкото те, както е описано по-горе, индуцират желаната резистентност спрямо хербициди. Такива изкуствени ДНК секвенции могат напр, да проявят хербицид-свързваща активност при обратен повтор чрез молекулно моделиране на конструирани протеини или да бъдат получени чрез селекция in-vitro. Особено подходящи са кодиращи ДНК секвенции, които се получават чрез обратен повтор на полипептидна секвенция, съгласно специфично спрямо растението-гостоприемник използване на кодон. Специфично използване на кодон може лесно да се осъществи с познатите на
900.99-ПБ
специалиста методи на генно инженерство при растения, чрез компютърно систематизиране на други познати гени за трансформиране на растения.
Като друга подходяща за използване съгласно изобретението еквивалентна секвенция на нуклеинова киселина трябва да се споменат секвенции, кодиращи слят протеин, при което съставната част на слетия протеин е част от хербицид-свързващ полипептид, който не е от растителен произход или част от негов функционален еквивалент. Втората част на слетия протеин може напр. да бъде друг полипептид с ензимна активност или една антиген полипептидна секвенция, с помощта на която е възможно доказването на scFvs експресия (напр. myc-tag или his-tag).
За предпочитане това се отнася до една регулативна протиенова секвенция, като напр. сигнален или транзитен пептид, който въвежда полипептида с хербицид-свързващи свойства на желаното място за действие.
Предмет на изобретението са обаче също получените съгласно изобретението експресионни продукти, както слети протеини от транзитен пептид и полипептид с хербицид-свързващи свойства.
Понятията резистентност, съответно поносимост в рамките на настоящето изобретение означава изкуствено придобита устойчивост срещу действието на растителни ензим-инхибитори. Тя обхваща частична и по-специално пълна нечувствителност срещу тези инхибитори с продължителност най-малко на една генерация на растението.
Първичното място на действие на хербицидите е обикновено растителната тъкан, така че специфична за листата експресия на екзогенни хербицид-свързващи полипептиди осигурява достатъчна пак случаят • · · » • · · • · · •·· 999 когато
900.99-ПБ • · · <
защита. Близък до това е все хербицида не трябва да се ограничи само до тъканите на листата а може да въздейства също върху всички други останали части от растението специфично спрямо тъканите.
Освен това конститутивната експресия на екзогенен хербицид-свързващ полипептид дава предимство. От друга страна може също една възможност за индуциране на експресия да бъде желателна.
Действието на трансгенни експресионни полипептиди с хербицид-свързващи свойства може да се установи напр. in-vitro чрез увеличаване на кълнове върху хербицид-съдържаща среда
спрямо постепенно променяща се поредица от концентрации или чрез тестове с покълвано на семена. При това определено растение може да се подложи на изпитания във вегетационна къща, за да се определи вида и големината на промяната в поносимостта спрямо хербициди.
Обект на изобретението са също така трансгенни растения, трансформирани с експресионна касета, съгласно изобретението, както и трансгенни клетки, тъкани, части и плодове от такива растения. Особено предпочитани при това са трансгенни културни растения, като напр. пшеница, царевица, соя, ориз, памук, захарна тръстика, канола, слънчоглед, лен, картофи, тютюн, домати, рапица, люцерна, салата и различни видове памук, ореховидни и лозя.
Трансгенните растения, растителни клетки, растителни тъкани или части от растения могат да се обработят с вещество, което инхибира растителните ензими, така че неуспешно трансформираните растения, растителни клетки, растителни тъкани или части от растения да бъдат унищожени.
• · · • · ·
900.99-ПБ
Примери за подходящи активни вещества са по-специално 5-(2-хлор-4-(трифлуорметил)фенокси)-2-нитробензоена киселина (Acifluorfen) и 7-хлор-З-метилхинолин-8-карбоксилна киселина (Quinmerac), както и метаболити и функционални производни на тези съединения. Кодиращата полипептид ДНК с хербицидсвързващи свойства, която се въвежда в експресионната касета
съгласно изобретението, може да се използва също като селекционен маркер.
Особено при културни растения, настоящето изобретение осигурява предимството, че след индукция на селективна
резистентност на културното растение спрямо растителни ензиминхибитори, тези инхибитори могат да се използват като специфични хербициди срещу нерезизсентни растения. Като примери на такива инхибитори могат да бъдат посочени следните хербицидно действащи съединения от групите 61 до 641, без изобретението да се ограничава до тях:
1,3,4-тиадиазоли:
бутидазол, ципразол, амиди:
алидохлор (CDAA), бензоилпроп-етил, бромобутид, хлордимепиперат, диметенамид, дифенамид, етобензанид (бензхломет), флампроп-метил, фозамин, изоксабен, моналид, нафталам, пронамид (пропизамид), пропанил, аминофосфорни киселини:
биланафос (биалафос), буминафос, глуфозинат-амониум, глуфозат, сулфозат, аминотриазоли:
амитрол, анилиди:
• ·
900.99-ПБ • · *2*2 анилофос, мефенасет арилоксиалканови киселини:
2,4-D, 2,4-DB, хломепроп, дихлорпроп, дихлорпроп-Р, дихлорпроп-Р (2,4-DP-P), фенопроп (2,4,5-ТР), трифлуорооксипир, МСРА, МСРВ, мекопроп, мекопроп-Р, напропамид, напропанилид, трихлопир, бензоени киселини:
хлорамбен, дикамба, бензотиадиазинони:
бентазон, избелващи средства:
хломазон (диметазон), дифлуфеникан, флуорохлоридон флупоксам, флуридон, пиразолат, сулкотрион (хлормезулон),
610 карбамати:
азулам, барбан, бутилат, карбетамид, хлорбуфам, хлор-
профам, циклоат, десмедифам, диалат, ЕРТС, еспрокарб, молинат, орбенкарб, пебулат, фенизофам, фенмедифам, профам, просулфокарб, пирибутикарб, сулфалат (CDEC), тербукарб, тиобенкарб (бентиокарб), тиокарбазил, триалат, фернолат,
611 хинолинови киселини:
хинхлорак, хинмерак,
612 хлорацетанилиди:
ацетохлор, алахлор, бутахлор, бутенахлор, диетатил етил, диметахлор, метазахлор, метолахлор, претилахлор, пропахлор, принахлор, тербухлор, тенилхлор, ксилахлор,
613 циклохексанони:
алоксидим, калоксидим, клетодим, клопроксидим, циклоксидим, сетоксидим, тралкоксидим, 2-{1-[2-(4-хлорфенокси)-
900.99-ПБ
пропилоксиимино]бутил}’-3-хидрокси-5-(2Н-тетрахидротиопиран3-ил)-2-циклохексен-1 - он,
614 дихлорпропионови киселини:
далопон,
615 дихидробензофурани:
етофумезат,
616 дихидрофуран-3-они:
флуртамон,
617 динитроанилини:
бенефин, бутралин, динитрамин, еталфлуразин, флухлоралин, изолропалин, нитралин, оризалин, пендиметалин, продиамин, профлуралин, трифлуралин,
618 динитрофеноли:
бромофеноксим, диносеб, диносеб-ацетат, динотерб,
DNOC,
619 дифенилетери:
ацифлуорфен-натрий, аклонифен, бифенокси, хлорнитрофен (CNP), дифеноксурон, етоксифен, флуородифен, флуорогликофен-етил, фомезафен, фурилоксифен, лактофен, нитрофен, нитрофлоурфен, оксифлуорфен,
620 дипиридилен:
циперкват, дифензокват-метилсулфат, дикват, паракват дихлорид,
621 карбамиди:
бензтиазурон, бутурон, хлорбромурон, хлороксурон, хлортолурон, сумилурон, дибензилурон, циклурон, димефурон, диурон, димрон, етидимурон, фенурон, флуорметурон, изопротурон, изоурон, карбутилат, линурон, метабензтиазурон, • ·
900.99-ПБ
метобензурон, метоксурон, монолинурон, монурон, небурон, сидурон, тебутиурон, триметурон,
622 имидазоли:
изокарбамид,
623 имидазолинони:
имаземетапир, имазапир, имазаквин, имазетабенз-метил (имазам), имазетапир,
624 оксадиазоли:
метазол, оксадиаргил, оксадиазон,
625 оксирани:
тридифан,
626 феноли:
бромоксинил, йоксинил,
627 естери на феноксифеноксипропионовата киселина: клодинафор, циналофоп-бутил, диклфоп-метил, фенокса- пропетил, феноксапроп-р-етил, фентиапропетил, флуазифопбутил, флуазифоп-р-бутил, халоксифоп-етоксиетил, халоксифопметил, халоксифоп-р-метил, изоксапирифоп, пропаквизафоп, квизалофоп-етил, квизалофоп-р-етил, квизалофоп-тефурил,
628 фенилоцетна киселина:
хлорфенак (фенак),
629 фенилпропионови киселини:
хлорофенпроп-метил,
630 протопорфириноген-1Х-оксидазни инхибитори: бензофенап, синидон-етил, флумихлорак-пентил, флумиоксазин, флумипропил, флупропацил, флутиацет-метил, пиразоксифен, сулфентразон, тидиазимин,
631 пиразоли:
нипираклофен,
900.99-ПБ
632 пиридазини:
хлоридазон, малеинхидразид, норфлуразон, пиридат,
633 пиридинкарбоксилни киселини хлопиралид, дитиопир, пиклорам, тиазопир,
634 пиримидилови етери:
пиритиобак-киселина, пиритиобак-натрий, KIH-2023, KIH6127,
635 сулфонамиди:
флуметсулам, метосулам,
636 сулфонилкарбамиди:
амидосулфурон, азидсулфурон, бенсулфурон-метил, хлоримуронетил, хлорсулфурон, циносулфурон, циклосулфамурон, етаметсулфурон метил, етоксисулфурон, флазасулфурон, халосулфурон-метил, имазосулфурон, метсулфурон-метил, никосулфурон, примисулфурон, просулфурон, пиразосулфуронетил, римсулфурон, сулфометурон-метил, трифенсулфурон-метил, триасулфурон, трибенурон-метил, трифлусулфурон-метил,
637 триазини:
аметрин, атразин, азипротрин, циназин, ципразин, дезметрин, диметаметрин, дипропетрин, еглиназин-етил, хексазинон, проциазин, прометон, прометрин, пропазин, секбуметон, симазин, симетрии, тербуметон, тербутрин, тербутилазин, тритазин,
638 триазинони:
етиозин, метамитрон, метрибузин,
639 триазолкарбоксамиди:
триазофенамид,
640 урацили:
бромацил, ленацил, тербацил,
641 различни:
««tow
900.99-ПБ
641 различни:
беназолин, бенфурезат, бенсулид, бензофлуор, бутамифос, кафенстрол, хлортал-диметил (DCPA), цинметилин, дихлобенил, ендотал, флуорбентранил, мефлуидид, перфлуидон, пиперофос.
Функционално еквивалентните производни на растителни ензим-инхибитори притежават сравним спектър на действие, както конкретно посочените съединения, при по-ниска, еднаква или по-висока инхибиторна активност (напр. изразена в g инхибитор на хектар обработваема площ, необходими за пълно подтискане на растежа на нерезистентни растения).
Примери за изпълнение на изобретението
Изобретението се пояснява от следващите примери, без да се ограничава до тях.
Общ метод на клониране
Етапите на клониране, провеждани в рамките на настоящето изобретение, като напр. рестрикционни отцепвания, агарознагел-електрофореза, пречистване на ДНК-фрагменти, трансфер на нуклеинови киселини върху нитроцелулоза и найлонови (полиамидни) мембрани, свързване на ДНК-фрагменти, трансформация на клетки от Е coli, отглеждане на бактерии, размножаване на фаги и секвенц-анализ на рекомбинантна ДНК се провеждат по начина, описан от Sambrook et al., (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6).
Използваните по-долу бактериални щамове (Е. coli, XL-I Blue) се взимат от Stratagene. Използваните за растителна трансформация агробактерийни щамове (Agrobacterium tumefaciens, С58С1 с
900.99-ПБ • ·
плазмид pGV2260 или pGV3850kan) са описани от Debiaere et al (Nucl. Acids Res. 1 3 (1 985), 4777). Алтернативно могат да се използват също агробактериен щам LBA4404 (Ciontech) или други подходящи щамове. За клониране се използват векторите pUCl9 (Yanish-Perron, Gene 33(1985), 1 03-1 1 9), pBluescript SK(Stratagene), pGEM-T (Promega), pZerO (Invitrogen), pBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acides Res. 12(1 984) 871 1 -8720) и pBinAR (Hoefgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221 -230).
Секвенционен анализ на рекомбинантна ДНК
Секвенирането на рекомбинантна ДНК молекула се провежда с уред за ДНК-секвениране чрез лазерна флуоресценция на фирмата Pharmacia, по метода на Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977), 5463-5467).
Получаване на растителна експресионна касета
В плазмид pBin! 9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12, 8711 (1984)) се вмества (инсерция) 35S CaMV промотор като EcoRIKpnl-фрагмент (отговарящ на нуклеотиди 6909-7437 на CauliflowerMosaik-Virus (Franck et al. Cell 21 (1980) 285). Полиаденилиращ сигнал на ген 3 на T-DNA на Ti-плазмида pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, (1984), 835). Нуклеотидът 11 794-1 1939 се изолира като Pvull-Hindlli-фрагмент и след прибавяне на Sphl-свързваща ДНК се клонира към рестрикционно място Pvull, между SpHI-Hindlll рестрикционно място на вектора. При това се получава плазмид pBi-nAR (Hoefgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990). 221-230).
900.99-ПБ .· .· · :::-: -:
··»*···· · · · · · · · · ·
Примери за използване
Пример 1
Тъй като хербицидите не са имуногенни, те трябва да се свържат с носител, като напр. KLH. Това свързване може да се проведе директно, ако в молекулата има функционална група, иначе по време на синтезата на хербицида ще трябва да се въведе функционална група или да се намери реактивоспособен предварителен етап по вр&ме на синтезата, така че тази молекула да се свърже в един прост реакционен етап. Примери за начини на свързване са описани от Miroslavic Ferencik в Handbook of Immunochemistry, 1993, Chapman & Hall, Kapitel Antigene, стр. 20-49.
Чрез повтарящо се инжектиране на тази модифицирана носеща молекула (антиген) се имунизират напр. Balb/с-мишки. Тъй като в серума има достатъчно антитела с връзка към антиген, които могат да се докажат по метода ELISA (ensyme linked immuno sorbent assay), то се взимат клетки от далака на тези животни и се сливат с миеломни клетки, за да се култивира хибрид. ELISA се използва по-нататък като антиген хербицидмодифициран BSA, за да се разграничат насоченият спрямо Hapten имунен отговор от този, насочен спрямо KLH-отговора.
Получаването на моноклонални антитела се провежда, като се следват познатите методи, напр. описани в Practical Immunology, Leslie Hudson und Frank Hay, Blackwell Scientific
Publications, 1989, или в Monoclonal antibodies: Principles and
Practice, James Goding, 1983, Academic Press, Inc., или в A practical guide to monoclonal antibodies, J. Liddell und A. Cryer,
1991, John Wiley&Sons; или Achim Moeller und Franz Emling мм
Verwendung
900.99-ПБ ·· 99 9 ···· ·· • ·· · · · · · · · · ·
9 9 9 9 9 9 99
9 9 9999999999
9 9 9 9 99
9999 9999 999 ·· ····
Monoklonale Antikoerper gegen TNF und deren
Патентно описание EP-A260610.
Пример 2
Изходна точка на изследването е моноклонално антитяло, което различава специфично хербицида Quinmerak и което освен това показва висок свързващ афинитет. Селекционираните хибридомни клетъчни линии се характеризират с това, че секретираните насочени срещу хербицидния антиген Quinmerak моноклонални антитела проявяват висок афинитет и са на разположение специфичните секвенции на имуноглобулин (Berek, С. et al., Nature 316, 412-418 (1985)). Това моноклонално антитяло срещу Quinmerac е изходна точка за конструкция на едноверижен антитяло фрагмент (scFv-antiQuinmerac).
Най-напред се изолира mRNA от хибридомни клетки и се вписва в кДНК. Тази кДНК служат като матрици за амплификация на вариращи имуноглобулини VH и VK със специфични Primern VH1 BACK и VH FOR-2 за тежки вериги, както и VK2 BACK и MJK5 FON X за леки вериги (Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)). Изолираните вариращи имуноглуболини са изходна точка за констрикция на едноверижно-антитяло фрагмент (scFv-antiQuinmerac). При следващата фузия по метода PCR три компонента VH, VK и свързващ фрагмент се обединяват в една PCR-реакционна вставка и scFv-antiQuinmerac се амплифицира (Фиг. 3).
Функционалната характеристика (антигенсвързваща активност) на конструирания scFv-antiQuinmerac-ген се извършва чрез експресия на бактериална система. При това се синтезира scFv-antiQuinmerac по метода на Hoogenboom, H.R. et al., Nucleic
Acids Research, 19, 4133-4137 (1991) като разтворим фрагмент от
··
900,99-ПБ ···· ····
• ·« ·· ··
·· · • • • • ·
• 4 • • • • ·
• · • · • · • ···
• · • • •
• · · · · • · • ·
антитяло в Е. coli. Активността и специфичността на конструирания фрагмент от антитяло се определя чрез теста ELISA (Фиг.4).
За да стане възможно провеждане на семе-специфична експресия на фрагмент от антитяло в тютюн се клонира scFvantiQuinmerac-ген по посока надолу от LeB4-npoMOTopa. Изолираният от Vicia faba LeB4-npoMOTop проявява силна семеспецифична експресия на различни чужди гени в тютюн (Baeumlein, Н. et. al., Mol. Gen. Genet., 225, 121-128 (1991)). Чрез транспорт на scFv-antiQuinmerac полипептида в ендоплазматичния ретикулум се постига стабилно натрупване на високи количества от фрагменти от антитяло. Генът scFv-antiQuinmerac се слива за тази цел със сигнал-пептидна секвенция, която осигурява входа в ендоплазматичния ретикулум и на ER-задържащия сигнал SEKDEL, който осигурява задържане в ER (Wandelt et al., 1992), (Фиг. 5).
Конструираната експресионна касета се клонира в бинерния вектор pGSGLUC 1 (Saito et al., 1990) и се пренася чрез електропорообразуване в Agrobakterium-Stamm ЕНА 101. Рекомбинантният агробактериен клон се използва за следващата трансформация на Nicotiana tabacum. За конструкт се регенерират 70-140 тютюневи растения. От регенерираните трансгенни тютюневи растения се събират семена в различни стадии на развитие при j оплождане по естествен начин. От тези семена се получават разтворими протеини след екстракция във водна буферна система. Анализът на трансгенни растения показва, че чрез сливане на scFv-antiQuinmerac ген с ДНК-секвенция на ER- j
Ϊ задържащия сигнал SEKDEL може да се получи максимално I натрупване от 1.9 % scFv-antiQuinmerac протеин в узрели семена.
I « · ··«
900.99-ПБ
Конструираният scFv-antiQuinmerac ген има големина от около 735 Ьр. Вариращите домени са слети един с друг в последователност VH-L-VL.
Специфичната селективност се определя в екстракти на узрели семена от тютюн чрез директен тест ELISA. Получените при това стойности показват ясно, че протеиновите екстракти съдържат функционалноактивни фрагменти от антитела.
Пример 3
Специфична за семена експресия и обогатяване на едноверижни фрагменти от антитяло в ендоплазматичен ретикулум от клетки на трансгенни тютюневи семена, контролирана от USP-
промотор
Изходната точка на изследването е едноверижен фрагмент от антитяло срещу хербицида Quinmerac (scFv-antiQuinmerac). Функционалното характеризиране (активност на свързването на антиген) на този конструиран scFv-antiQuinmerac-ген се провежда след експресия в бактериална система и след експресия в листа от тютюн. Активността и специфичността на конструираните фрагменти от антитяло се определят чрез тест ELISA.
За да се осъществи специфична спрямо семена експресия на фрагменти от антитела в тютюн се клонира scFv-antiQuinmeracген по направление надолу от USP-промотор. Изолираният от Vicia faba USP-промотор проявява силна специфична спрямо семена експресия на различни чужди гени в тютюн (Fiedler, U. et al., Plant Mol. Biol. 22, 669-679 (1993)). Чрез пренос на scFvantiQuinmerac полипептида в ендоплазматичния ретикулум се постига стабилно натрупване на високи количества от фрагменти от антитяло. Генът scFv-antiQuinmerac се слива за тази цел със
900.99-ПБ
·· ·· 9 99 99 99
• · • · 99 9 9 9 • 9 •
• • 9 9 9 9 9 9 •
• 9 9 9 9 9 9 • • 9 999
• ···· 9 9999 9 9 9 999 99 • • 9 • • ·
сигнал-пелтидна секвенция, която осигурява входа в ендоплазматичния ретикулум и на ER-задържащия сигнал SEKDEL, който осигурява задържане в ER (Wandelt et al., 1992), (Фиг. 1).
Конструираната експресионна касета се клонира в бинерния вектор pGSGLUC 1 (Saito et al., 1990) и се пренася чрез електропорообразуване в Agrobakterium-Stamm ЕНА 101. Рекомбинантният агробактериен клон се използва за следващата трансформация на Nicotiana tabacum. От регенерираните трансгенни тютюневи растения се събират семена в различни стадии на развитие при оплождане по естествен начин. От тези семена се получават разтворими протеини след екстракция във водна буферна система. Анализът на трансгенни растения показва, че чрез сливане на scFv-antiQuinmerac-ген с ДНК-секвенция на ERзадържащия сигнал SEKDEL под контрола на USP-промотор вече след ден 10 на развитие на семената се синтезират едноверижни фрагменти, със свързващ афинитет спрямо Quinmerac.
Пример 4
За получаване на юбиквитерна експресия на фрагменти от антитела в растения, специално в листа се клонира scFv-antiQuinmerac-ген по направление надолу от CaMV 35 S-промотор. Този силно конституивен промотор предизвиква експесия на чужди гени почти във всички растителни тъкани (Benfey und Chua, Science 250, (1990), 956-966). Чрез пренос на scFv-antiQuinmerac протеина в ендоплазматичния ретикулум се постига стабилно натрупване на високи количества от фрагменти от антитяло в листния материал. Генът scFv-antiQuinmerac се слива за тази цел със сигнал-пептидна секвенция, която осигурява входа в ендоплазматичния ретикулум и на ER-задържащия сигнал KDEL, ·· · ·· ·· 99
9999 99 9 9 9999
9 9 9 9 9 9 9 9
99 9999 999 999
900.99-ПБ ..· ..· зз който осигурява задържане в ER (Wandelt et al., Plant J. 2 (1992), 181-192). Конструираната експресионна касета се клонира в бинерния вектор pGSGLUC 1 (Saito et al., Plant Cell Rep. 8 (1990), 718-721) и се пренася чрез електропорообразуване в Agrobakterium-Stamm ЕНА 101. Рекомбинантният агробактериен клон се използва за следващата трансформация на Nicotiana tabacum. Регенерират се около 100 тютюневи растения. От
регенерираните трансгенни тютюневи растения се събира растителен материал. От този растителен материал се получават разтворими протеини след екстракция във водна буферна система. Следващите анализи (Western-Blot-анализи и тестове ELISA) показват, че в листата може да се получи максимално натрупване от 2 % биологично активен антиген-свързващ scFvantiQuinmerac протеин. Високите стойности на експресия се развиват в развити зелени листа, но също така в чувствителен листен материал може да се докаже наличие на фрагменти от антитела.
Пример 5
PCR-приложение на фрагмент от кДНК, кодираща едноверижно антитяло срещу Acifluorfen, съответно Quinmerac, с помощта на синтенични олигонуклеиди
PCR-приложението на едноверижно антитяло кДНК се провежда в апарат DNA-Thermal Cycler на фирмата Perkin Elmer.
Реакционната смес, съдържаща 8 ng/μΙ едноверижна матричнакДНК, 0.5 μΜ от съответните олигонуклеиди, 200 μΜ нуклеотиди (Pharmacia), 50 mM KCI, 10 тМ Tris-HCI (pH 8.3 при 25°С, 1.5 тМ
MgCl2) и 0.02 U/μΙ Taq полимераза (Perkin Elmer). Условията за приложение са следните:
900.99-ПБ ·· ·· · ·· ·· ·· ···· ♦ · · · · · · · • · ······· • · · ·· · · ······ • · · · · · · ···· ···· ··· ·· ·· ··
Температура на съхранение45°С
Температура за денатуриране94°С
Температура за елонгация72°С
Брой на циклите:40
В резултат се получава фрагмент с около 735 основни двойки, който се лигира във вектор pBluescript. С лигирането се трансформира Е. coli XL-I Blue и протича амплификация на плазмида. За
приложение и оптимизиране на полимеразната верижна реакция виж: Innes et al., 1990, PCR Protocols, a Guide to Metods and
Aplications, Academic Press.
Пример 6
Получаване на трансгенни тютюневи растения, които експесират кДНК, кодираща едноверижно антитяло с хербицидсвързващи свойства
Плазмидът pGSGLUC 1 се трансформира в Agrobacterium tumefaciens С58С1 :pGV2260. За трансформация на тютюневи растения (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) се използва 1:50 разреждане на култура, престояла една нощ от положително трансформирана колония на агробактерии в среда MurashigeSkoog Medium (Physiol. Plant. 15 (1962), 473 и следващи) c 2 % захароза (2Мв-среда). Листни отрези от стерилни растения (всяко едно около 1 cm2) се инкубират в продължение на 5 до 10 минути в съдче на Петри, при разреждане на агробактериите 1:50. Следва инкубиране в продължение на 2 дни на тъмно при 25°С върху 2MSсреда с 0.8 Bacto-Agar. Култивирането се провежда по-нататък след 2 дни в продължение на 16 часа на светлина и 8 часа на тъмно и след това се продължава в седмичен ритъм върху MSсреда с 500 mg/l Claforan (Cefotaxame-Natrium), 50 mg/l ·· ·· • · · · ·
900.99-ПБ • · · • · ♦··· ····
·· • · • ·
канамицин, 1 mg/l бензиламинопурин (ВАР), 0.2 mg/l нафтилоцетна киселина и 1.6 g/l глюкоза. Растящите филизи се прехвърлят в MSсреда с 2 % захароза, 250 mg/'l Claforan и 0.8 % Bacto-Agar.
Пример 7
Стабилно натрупване на едноверижни фрагменти от антитяло срещу хербицида Quinmerac в ендоплазматичен ретикулум
Изходна точка на изследването е експресиран в тютюневи растения едноверижен фрагмент от антитяло срещу хербицида Quinmerac (scFv-anti Quinmerac). Количеството и активността на синтезираните scFv-anti Quinmerac-полипептиди се определят чрез Western-Blot-анализи и тестове ELISA.
За да се даде възможнаст за експресия на scFv-antiQuinmerac ген в ендоплазматичен ретикулум се експресират чужди гени под контрола на CaMV 35 S-промотор, като транслационно сливане с ЕеВ4-сигнален пептид (N-края) и ER-задържащ сигнал KDEL (Скрая). Чрез транспорт на scFv-antiQuinmerac-полипептида в ендоплазматичния ретикулум се постига стабилно натрупване на високи количества фрагменти от антитяло в листата. След отстраняване на растителния материал, късовете се замразяват при -20° С (1), лиофилизират (2) или се сушат при стайна температура (3). Разтворимите протеини се получават от съответния листен материал чрез екстракция с воден буфер и scFv-antiQuinmeracполипептидът се пречисва чрез афинитетна хроматография. Еднакви количества от пречистените scFv-antiQuinmerac полипептиди (след замръзяване, лиофилизиране и сушене) се използват за определяне на активността на фрагментите от антитяло (Фиг. 6). На Фиг. 6А е показана активността за свързване на антиген на пречистени scFv-antiQuinmerac • · ♦ е а а аа
900.99-ПБ • a ·· • · ·
полипептиди от свежи (1), лиофилизирани (2) и изсушени (3) листа. На Фиг. 6А са дадени съответните количества scFvantiQuinmerac-протеин (около 100 ng), определени чрез тестове ELISA и Western-Blot-анализи. Величините на стандартите за протеин-молекулно тегло са представени в ляво. При това се установява почти еднаква антиген-свързваща активност.
Пример 8
За доказване на поносимостта спрямо хербициди на трансгенни тютюневи растения, продуциращи полипептид с хербицидсвързващи свойства, те се обработват с различни количества от хербицидите Acifluorfen и съответно Quinmerac. Във всички случаи е доказано във вегетационна къща, че s с F v-anti Ac if I u o rf e η, съответно scFv-antiQuinmerac експресиращите растения проявяват поносимост срещу съответните хербициди в сравнение с контролите.

Claims (27)

  1. Патентни претенции
    1. Метод за получаване на растения, с поносимост спрямо 5-(2-хлор-4-(трифлуорметил)фенокси)-2-нитробензоена киселина, съответно спрямо 7-хлор-3-метилхинолин-8-карбоксилна киселина, чрез експресия в растенията на екзогенно антитяло, свързващо 5-(2-хлор-4-(трифлуорметил)фенокси)-2-нитробензоена киселина, съответно 7-хлор-3-метилхинолин-8-карбоксилна киселина.
  2. 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че екзогенното антитяло е фрагмент от едноверижно антитяло.
  3. 3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че екзогенното антитяло е цяло антитяло или фрагмент от антитяло.
  4. 4. Метод съгласно претенции 1 до 3, характеризиращ се с това, че растението е едносемеделно или двусемеделно.
  5. 5. Метод съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че растението е тютюн.
  6. 6. Метод съгласно претенции 1-5, характеризиращ се с това, че експресията на екзогенно антитяло се провежда конститутивно в растението.
  7. 7. Метод съгласно претенции 1-5, характеризиращ се с това, че експресията на екзогенно антитяло се индуцира в растението.
  8. 8. Метод съгласно претенции 1-5, характеризиращ се с това, че експресията на екзогенно антитяло се провежда в листата на растението,
  9. 9. Метод съгласно претенции 1-5, характеризиращ се с това, че експресията на екзогенно антитяло се провежда в семената на растението.
    900.99-ПБ
  10. 10. Експресионна касета за растения, характеризираща се с това, че се състои от промотор, сигнален пептид, ген, кодиращ експресия на екзогенно антитяло, свързващо 5-(2-хлор-4(трифлуорметил)фенокси)-2-нитробензоена киселина, съответно
    7-хлор-3-метилхинолин-8-карбоксилна киселина, ER-задържащ • ·· ·· ·· • е 9 · · · ·· • · · · · ·* • · · · ······ • ·· « · «·· ·« ·· ·· сигнал и терминатор.
  11. 11. Експресионна касета съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че като конститутивен промотор се използва CaMV 35S-npoMOTop.
  12. 12. Експресионна касета съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че като ген за експресия се въвежда едноверижен фрагмент от антитяло.
  13. 13. Експресионна касета съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че като ген за експресия се въвежда едноверижен фрагмент от антитяло, свързващо 5-(2-хлор-4-(трифлуорметил)фенокси)-2-нитробензоена киселина, съответно 7-хлор-Зметилхинолин-8-карбоксилна киселина, за транслационно сливане с други функционални протеини, напр. ензими, токсини, хромофори и свързани протеини.
  14. 14. Експресионна касета съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че антителата за експресиране се получават от хибридомни клетки или с помощта на други рекомбинантни методи - като напр. по метода антитяло-Phage-Display.
  15. 15. Използване на експесионна касета съгласно претенция 10 за трансформация на едносемеделни и двусемеделни растения, които експресират конститутивно семе- или лист-специфично екзогенно антитяло, свързващо 5-(2-хлор-4-(трифлуорметил)фенокси)-2-нитробензоена киселина, съответно 7-хлор-З- метилхинолин-8-карбоксилна киселина.
    900.99-ПБ • ·· 9999
    99 9 9 9 9 99
    9 9 9 9 9 99
    9 9 9 9 999999
    9 9 9 99
    999 99 9999
  16. 16. Използване съгласно претенция 15, характеризиращо се с това, че експесионната касета трансферира бактериен щам и създаденият рекомбинантен клон се използва за трансформация на едносемеделни и двусемеделни растения, които експресират конститутивно семе- или лист-специфично екзогенно антитяло, свързващо 5-(2-хлор-4-(трифлуорметил)фенокси)-2-нитробензоена киселина, съответно 7-хлор-З-метилхинолин-8-карбоксилна киселина.
  17. 17. Използване на експресионна касета съгласно претенция 10 като селекционен маркер.
  18. 18. Използване на растение, което съдържа експресионна касета съгласно претенции 10 до 14, за получаване на антитяло, свързващо 5-(2-хлор-4-(трифлуорметил)фенокси)-2-нитробензоена киселина, съответно 7-хлор-З-метилхинолин-8-карбоксилна киселина.
  19. 19. Метод за трансформация на растение, чрез въвеждане на секвенция, която кодира антитяло, свързващо 5-(2-хлор-4(трифлуорметил)фенокси)-2-нитробензоена киселина, съответно 7хлор-З-метилхинолин-8-карбоксилна киселина, в растителна клетка, в калусна тъкан, в цялото растение и протопласти на растителни клетки.
  20. 20. Метод съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че трансформацията се провежда с помощта на агробактерия, поспециално от вида Agrobacterium tumefaciens.
  21. 21. Метод съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че трансформацията се провежда чрез електропорообразуване.
  22. 22. Метод съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че трансформацията се провежда с помощта на метода на бомбандиране с частици.
    900.99-ПБ
  23. 23. Метод за получаване на свързващо 5-(2-хлор-4-(трифлуорметил)фенокси)-2-нитробензоена киселина, съответно 7-хлор-Зметилхинолин-8-карбоксилна киселина антитяло, чрез експресия
    ·· ·· • ·· «ф • Ф • · • · фф · • • · • · • • • · • • · • · • • ф • · • ф ··· ··· • • • * • е • ···· ···· ··· фф ·· фф
    на ген, кодиращ такова антитяло в растение, съответно в клетки на растение и следващо изолиране на антитялото.
  24. 24. Растение, съдържащо експресионна касета съгласно претенция 10, характеризиращо се с това, че експресионната касета осигурява поносимост на растението спрямо 5-(2-хлор-4(трифлуорметил)фенокси)-2-нитробензоена киселина, съответно 7-хлор-3-метилхинолин-8-карбоксилна киселина.
  25. 25. Метод за борба с нежелана растителност в трансгенни, резистетни спрямо 5-(2-хлор-4-(трифлуорметил)фенокси)-2нитробензоена киселина, съответно 7-хлор-3-метилхинолин-8карбоксилна киселина, характеризиращ се с това^-че се въвеждат хербицидите 5-(2-хлор-4-(трифлуорметил)фенокси)-2-нитробензоена киселина, съответно 7-хлор-3-метилхинолин-8-карбоксилна киселина, срещу които културното растение изгражда свързващи антитела.
  26. 26. Антитяло, с афинитет за свързване на 5-(2-хлор-4-(трифлуорметил)фенокси)-2-нитробензоена киселина, характеризиращо се с това, че е получено съгласно претенция 23.
  27. 27. Антитяло, с афинитет за свързване на 7-хлор-З-метилхинолин-8-карбоксилна киселина, характеризиращо се с това, че е получено съгласно претенция 23.
BG103831A 1997-03-25 1999-10-22 Експресия на хербицид-свързващи полипептиди в растенията за създаване на поносимост спрямо хербициди BG103831A (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19712507 1997-03-25
PCT/EP1998/001731 WO1998042852A1 (de) 1997-03-25 1998-03-24 Expression von herbizid-bindenden polypeptiden in pflanzen zur erzeugung von herbizidtoleranz

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BG103831A true BG103831A (bg) 2000-07-31

Family

ID=7824568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG103831A BG103831A (bg) 1997-03-25 1999-10-22 Експресия на хербицид-свързващи полипептиди в растенията за създаване на поносимост спрямо хербициди

Country Status (22)

Country Link
US (1) US6472587B1 (bg)
EP (1) EP0970231A1 (bg)
JP (1) JP2001517952A (bg)
KR (1) KR20010005631A (bg)
CN (1) CN1253593A (bg)
AR (1) AR012176A1 (bg)
AU (1) AU748740B2 (bg)
BG (1) BG103831A (bg)
BR (1) BR9808061A (bg)
CA (1) CA2284862A1 (bg)
EA (1) EA199900840A1 (bg)
GE (1) GEP20022841B (bg)
HU (1) HUP0001659A3 (bg)
ID (1) ID24832A (bg)
IL (1) IL131916A0 (bg)
NO (1) NO994681L (bg)
NZ (1) NZ337956A (bg)
PL (1) PL336080A1 (bg)
SK (1) SK126499A3 (bg)
TR (1) TR199902348T2 (bg)
WO (1) WO1998042852A1 (bg)
ZA (1) ZA982467B (bg)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9726955D0 (en) * 1997-12-19 1998-02-18 Zeneca Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US6906245B1 (en) 1998-04-30 2005-06-14 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing transgenic plants resistant to weed control compounds which disrupt the porphyrin pathways of plants
WO2000007430A2 (en) 1998-08-04 2000-02-17 Cargill, Incorporated Plant fatty acid desaturase promoters
AU5482299A (en) * 1998-08-12 2000-03-06 Maxygen, Inc. Dna shuffling to produce herbicide selective crops
CN113684187B (zh) * 2021-09-22 2023-07-18 江南大学 一种分泌氟啶草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用
CN114908059B (zh) * 2022-05-12 2023-04-07 江南大学 一株双草醚单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3765449D1 (de) 1986-03-11 1990-11-15 Plant Genetic Systems Nv Durch gentechnologie erhaltene und gegen glutaminsynthetase-inhibitoren resistente pflanzenzellen.
CA1335412C (en) * 1987-03-27 1995-05-02 Eric B. Swanson Microspore-based selection system and products thereof
US5290696A (en) 1988-11-10 1994-03-01 Regents Of The University Of Minnesota Method for imparting cyclohexanedione and/or aryloxyphenoxypropanioc acid herbicide tolerance to maize plants
US5162602A (en) 1988-11-10 1992-11-10 Regents Of The University Of Minnesota Corn plants tolerant to sethoxydim and haloxyfop herbicides
AU655945B2 (en) 1990-08-31 1995-01-19 Monsanto Technology Llc Glyphosate tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
IT1248361B (it) * 1991-06-28 1995-01-05 Enea Vettori plasmidici per l'espressione di geni in piante
IL109159A (en) 1993-03-29 2003-11-23 Isk Biotech Corp Immunoassays for tetrachloroiso-phthalonitrile and its metabolites and antibodies for use therein
DE4444708A1 (de) * 1994-12-15 1996-06-20 Basf Ag Verwendung von Herbiziden vom Auxin-Typ zur Behandlung von transgenen Kulturpflanzen
DE19546751B4 (de) 1994-12-23 2005-02-17 Bayer Cropscience Ag Selektive Herbizide auf Basis von Heteroaryloxy-acetamiden
FR2734842B1 (fr) 1995-06-02 1998-02-27 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides
WO1997004088A1 (en) 1995-07-20 1997-02-06 Sumitomo Chemical Company, Ltd. Porphyrin-accumulating type herbicide resistance gene

Also Published As

Publication number Publication date
ID24832A (id) 2000-08-24
HUP0001659A2 (hu) 2000-09-28
GEP20022841B (en) 2002-11-25
JP2001517952A (ja) 2001-10-09
IL131916A0 (en) 2001-03-19
WO1998042852A1 (de) 1998-10-01
SK126499A3 (en) 2000-05-16
ZA982467B (en) 1999-09-27
PL336080A1 (en) 2000-06-05
US6472587B1 (en) 2002-10-29
CA2284862A1 (en) 1998-10-01
HUP0001659A3 (en) 2002-03-28
CN1253593A (zh) 2000-05-17
NO994681D0 (no) 1999-09-24
KR20010005631A (ko) 2001-01-15
BR9808061A (pt) 2000-03-08
NO994681L (no) 1999-11-24
AU748740B2 (en) 2002-06-13
EA199900840A1 (ru) 2001-04-23
TR199902348T2 (xx) 2000-01-21
AR012176A1 (es) 2000-09-27
EP0970231A1 (de) 2000-01-12
NZ337956A (en) 2001-04-27
AU7640598A (en) 1998-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Perrin et al. Transgenic pea seeds as bioreactors for the production of a single-chain Fv fragment (scFV) antibody used in cancer diagnosis and therapy
Khoudi et al. Production of a diagnostic monoclonal antibody in perennial alfalfa plants
Artsaenko et al. Potato tubers as a biofactory for recombinant antibodies
Owen et al. Synthesis of a Functional Anti–Phytochrome Single–Chain Fv Protein in Transgenic Tobacco
Stöger et al. Cereal crops as viable production and storage systems for pharmaceutical scFv antibodies
Fiedler et al. High-level production and long-term storage of engineered antibodies in transgenic tobacco seeds
Negrouk et al. Highly efficient transient expression of functional recombinant antibodies in lettuce
US5990385A (en) Protein production in transgenic alfalfa plants
BG103831A (bg) Експресия на хербицид-свързващи полипептиди в растенията за създаване на поносимост спрямо хербициди
US20030208797A1 (en) Production of antibodies
CZ339099A3 (cs) Exprese polypeptidů vázajících herbicid v rostlinách k vytvoření tolerance k herbicidu
MXPA99008672A (en) Expression of herbicide-binding polypeptides in plants to produce herbicide tolerance
AU737242B2 (en) Expression of fungicide-binding polypeptides in plants for generating fungicide tolerance
Korouzhdehy et al. Expression of biological active VHH camelid single domain antibody in transgenic tobacco
AU756886B2 (en) Protein production in transgenic alfalfa plants
Floss et al. Expression of complete antibodies in transgenic plants
KR0155453B1 (ko) 담배식물을 통해 사람 비이형 간염 바이러스 조립된 형태의 재조합 항체를 제조하는 방법
Conrad et al. Expression of antibody fragments in plant cells
KR0121768B1 (ko) 담배식물을 통해 사람 b형 간염 바이러스 재조합 항체를 제조하는 방법
EP1042478A1 (en) Herbicide binding proteins and transgenic plants containing them
Vaquero-Martin et al. Production of tumor-specific antibodies in tobacco
HEMA-QUEBEC C5-1 from hybridoma C5-1 from alfalfa
JPH11514239A (ja) スクロースリン酸シンターゼのコード配列を使用した可溶性固形分の改変
CZ382199A3 (cs) Produkce rostlin tolerantních k fungicidům expresí polypeptidů vázajících fungicidy v rostlině