WO2000078979A1 - Verfahren zur erhöhung der widerstandskraft von kulturpflanzen gegen chemischen stress - Google Patents

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WO2000078979A1
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haloalkyl
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Wilhelm Rademacher
Steven J. Bowe
Karl-Otto Westphalen
Karin Herbers
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)

Definitions

  • the present invention relates to a process for increasing the resistance of crop plants to chemical stress, triggered in particular by insufficiently selective or improperly applied herbicides, characterized in that a plant is produced using molecular genetic methods in which the activity of the enzyme flavanon-3 -hydroxylase is reduced.
  • the method according to the invention is characterized in that the enzyme flavanone-3-hydroxylase by molecular genetic methods (for example antisense construct, co-suppression, the expression of specific antibodies or the expression of specific inhibitors) in whole or in part, continuously or temporarily, in the entire plant or reduced activity in parts of the plant.
  • molecular genetic methods for example antisense construct, co-suppression, the expression of specific antibodies or the expression of specific inhibitors
  • the resistance of the plants produced by the process according to the invention is increased above all against glyphosates, glucosinate ammonium and compounds of the formula I, against cyclohexenon herbicides such as setoxydim, cycloxydim, tepraloxydim or clefoxydim and bromoxynil.
  • the invention relates to plants with increased resistance to insufficiently selective and improperly applied herbicides which were prepared by the method according to the invention by expressing a flavanone-3-hydroxylase in an antisense orientation and whose enzymatic activity of the flavanone-3-hydroxylase was reduced is.
  • the productivity of crops can be reduced in many ways by stress factors. These include: viral diseases, bacterial and fungal pathogens, damaging insects, nematodes, snails, bite, heat, coolness, cold, lack of water, too high water content in the soil, soil salinity, too high radiation intensity, competition for light, water and nutrients due to accompanying flora, excessive ozone in the air surrounding the plants, harmful emissions, e.g. from industrial plants or motor vehicles, improper or inapplicable herbicide applications, especially in fruit and wine crops, treatments with herbicides, insecticides, fungicides, bioregulators or leaf fertilizers too low Selectivity, foliar application of pesticides or fertilizers during intense sun exposure.
  • stress factors include: viral diseases, bacterial and fungal pathogens, damaging insects, nematodes, snails, bite, heat, coolness, cold, lack of water, too high water content in the soil, soil salinity, too high radiation intensity, competition for light, water and nutrients due to accompanying flora, excessive
  • the object of the present invention was accordingly to find methods by means of which the resistance of crop plants to chemical stressors, in particular to herbicides, is improved to a greater extent.
  • Acylcyclohexadiones such as Prohexadione-Ca and Trinexapac-ethyl (older name: Cimectacarb) are used as bioregulators to inhibit plant growth. Their bioregulatory effect arises from the fact that they block the biosynthesis of gibberellins that promote length growth. Due to their structural relationship to 2-oxoglutaric acid, they inhibit certain dioxygenases that require 2-oxoglutaric acid as co-substrate (Rademacher, W, Biochemical effects of plant growth retardants, in: Plant Biochemical Regulators, Gausman, HW (ed.) , Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 169-200 (1991)).
  • prohexadione-Ca, trinexapac-ethyl and other acylcyclohexadiones inhibit 2-oxoglutaric acid-dependent hydroxylases, which are important in the metabolism of phenolic substances.
  • F3H flavonone-3-hydroxylase
  • acylcyclohexadiones also inhibit other, previously unknown, 2-oxoglutaric acid-dependent hydroxylases.
  • the flavonoids eriodictyol, proanthocyanidins which are substituted on the C atom 3 with hydrogen, e.g. Luteforol, luteoliflavan, apigeniflavan and tricetiflavan, as well as homogeneous and heterogeneous oligomers and polymers are increasingly formed from the above-mentioned and structurally related substances.
  • flavanone-3-hydroxylase F3H
  • phenols hydroxycinnamic acid p-coumaric acid, ferulic acid, sinapic acid
  • salicylic acid or umbelliferone including the homogeneous and heterogeneous Rogenic oligomers and polymers are found in plants after reducing the enzyme activity of the enzyme flavanone-3-hydroxylase (F3H).
  • R 1 , R 2 are hydrogen, nitro, halogen, cyano, C 1 -C 6 -alkyl
  • R 3 is hydrogen, halogen or Ci-C ⁇ -alkyl
  • R 4 , R 5 are hydrogen, halogen, cyano, nitro, C 1 -C 4 -alkyl
  • R 4 and R 5 together form a C -C 6 alkanediyl chain which can be substituted one to four times by C ⁇ -C 4 alkyl and / or interrupted by oxygen or an optionally substituted C 1 -C 4 alkyl can;
  • R 4 and R 5 together with the associated carbon form a carbonyl or a thiocarbonyl group
  • R 6 is hydrogen, -CC alkyl, Ci -C 4 haloalkyl,
  • R 7 is hydrogen or Ci -C 4 alkyl
  • R 8 C x -C 4 alkyl
  • R 9 , R 12 are hydrogen or Ci -C 4 alkyl
  • R 4 and R 9 or R 4 and R "or R 5 and R 2 or R 5 and R 3 together form a C 2 -C 6 alkanediyl chain which can be substituted one to four times by C1-C4 alkyl and / or can be interrupted by oxygen or an optionally substituted C ⁇ -C 4 alkyl nitrogen;
  • R 5 is a pyrazole of the formula II linked in the 4 position
  • R 16 Ci -C 6 alkyl; ZH or S0 2 R 17 ;
  • R 17 C1-C4-alkyl, C 1 -C 4 -haloalkyl, phenyl or phenyl, which is partially or completely halogenated and / or carries one to three of the following groups: nitro, cyano, C 1 -C 4 -alkyl, Ci-C -Halogenalkyl, -CC 4 alkoxy or C ⁇ -C 4 haloalkoxy;
  • R i8 hydrogen or C ⁇ -C alkyl ⁇
  • b2 Arnide allidochlor (CDAA), benzoylprop-ethyl, bromobutide, chlorine-hiamid, dimepiperate, dimethenamid, diphenamid, etobenzanid (benzchlomet), f lamprop-methyl, fosamin, isoxaben, monalide, naptalame, pronamid (propyzamid), propanil b3 aminophosphoric acids: bi lanafos, (bialaphos), bummafos, gluf osmate-ammonium, glyphosate, sulf osate
  • 2,4-D, 2,4-DB clomeprop, dichlorprop, dichlorprop-P, dichloroprop-P (2,4-DP-P), fenoprop (2,4,5-TP), fluoroxypyr, MCPA, MCPB, mecoprop, mecoprop-P, napropamide, napropanilide, tri-clopyr
  • b9 Bleacher clomazone (dimethazone), diflufenican, fluorochloridone, flupoxam, fluridone, pyrazolate, sulcotrione (chloromesulone)
  • blO carbamates asulam, barban, butylate, carbetamide, chlorobufam, chloropropam, cycloate, desmedipham, dialallate, EPTC, esprocarb, molinate, orbencarb, pebulate, phenisopham, phenmedipham, propam, prosulfocarb, pyributicarb, sulfallate (CDEC ), terbu-carb, thiobencarb (benthiocarb), tiocarbazil, triallate, vernolate
  • bl2 chloroacetanilides acetochlor, alachlor, butachlor, butenachlor, diethatyl ethyl, dimethachlor, metazachlor, metolachlor, pretilachlor, propachlor, prynachlor, terbuchlor, thenylchlor, xylachlor
  • bl3 cyclohexenones alloxydim, caloxydim, clethodim, cloproxydim, cycloxydim, sethoxydim, tralkoxydim, 2- ⁇ 1- [2- (4-chlorophenoxy) propyloxyi - mino] butyl ⁇ '3-hydroxy-5- (2H-tetrahydrothiopyran-3-yl) -2-cyclohexen-l-one
  • bl7 Dinitroaniline benefin, butralin, dinitramine, ethalfluralin, fluchloralin, isopropalin, nitralin, oryzalin, pendimethalin, prodiamine, profluralin, trifluralin
  • bl8 dinitrophenols bromofenoxim, dinoseb, dinoseb-acetate, dinoterb, DNOC
  • Diphenyl ether acifluorfen-sodium, aclonifen, bifenox, chloronitrofen (CNP), difenoxuron, ethoxyfen, fluorodifen, fluoroglycofen-ethyl, fomesafen, furyloxyfen, lactofen, nitrofen, nitrofluorfen, oxyfluorfen
  • Imidazolinones imazamethapyr, imazapyr, imazaquin, imazethabenz-methyl (imazame), imazethapyr b24 oxadiazoles: methazole, oxadiargyl, oxadiazon
  • phenoxyphenoxypropionic acid ester clodinafop, cyhalofop-butyl, diclofop-methyl, fenoxaprop-ethyl, fenoxaprop-p-ethyl, fenthiapropethyl, fluazifop-butyl, fluazifop-p-butyl, haloxyfop-ethoxyethyl, haloxyfop-methyl, haloxyfopap-pif-methyl , propaquizafop, quizalofop-ethyl, quizalofop-p-ethyl, quizalofop-tefuryl
  • Protoporphyrinogen-LX oxidase inhibitors benzofenap, cinidon-ethyl, flumiclorac-pentyl, flumioxazin, flumipropyn, flupropacil, fluthiacet-methyl, pyrazoxyfen, sulfentrazone, thidiazimin
  • b32 pyridazines chloridazon, maleic hydrazide, norflurazon, pyridate
  • pyridinecarboxylic acids clopyralid, dithiopyr, picloram, thiazopyr
  • b34 pyrimidyl ethers pyrithiobac acid, pyrithiobac sodium, KIH-2023, KIH-6127
  • Sulfonylureas amidosulfuron, azimsulfuron, bensulfuron-methyl, chlorimuron-ethyl, chlorosulfuron, cinosulfuron, cyclosulfamuron, ethamet- sulfuron methyl, ethoxysulfuron, flazasulfuron, halosulfuron-methyl, imazosulfuron-methyl, metsulfuron, metsulfuron misulfuron, prosulfuron, pyrazosulfuron-ethyl, rimsulfuron, sulfometuron-ethyl, thifensulfuron-methyl, triasulfuron, tribenuron-methyl, triflusulfuron-methyl b37 triazines: ametryn, atrazine, aziprotryn, cyanazine, cyprazine, dimethetrin-trynyn-dynetr-trynyn
  • the process according to the invention can be used successfully in the crops of wheat, barley, rye, oats, rice, corn, millet, sugar cane, banana, tomato, tobacco, paprika, potato, rapeseed, sugar beet, soybeans, cotton and fruit trees from the family Rosaceae, such as apple, pear, plum, plum, peach, nectarine and cherry, as well as with grapevines, but also with other plants not mentioned by name.
  • test plants were cultivated in plastic pots of approximately 300 ml volume on loamy sand with approximately 3% humus content.
  • the various herbicides were applied at a shoot length of approx. 12 cm.
  • a visual assessment of the degree of damage was carried out approximately 20 days after herbicide treatment. example 1
  • Ripe tomato fruits from Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymakers were washed, dried and the pericarp was freed from seeds, middle columnella and wooden parts using a sterile blade.
  • the pericarp (approx. 50 g) was frozen in liquid nitrogen. The material was then crushed in a mixer. The comminuted material was mixed with 100 ml homogenizing medium in a pre-cooled mortar. The suspension was then transferred to centrifuge cups by pressing through sterile gauze cloths. Then 1/10 vol 10% SDS was added and mixed well. After 10 minutes on ice, 1 volume of phenol / chloroform was added, the centrifuge cup closed and mixed well.
  • RNA 20 ⁇ g of total RNA were initially mixed with 3.3 ⁇ l of 3M sodium acetate solution, 2 ⁇ l of IM magnesium sulfate solution and made up to 100 ⁇ l of final volume with DEPC water.
  • a microliter RNase-free DNase (Boehringer Mannheim) was added and incubated at 37 ° for 45 min. After removing the enzyme by shaking with phenol / chloroform / isoamyl alcohol, the RNA was precipitated with ethanol and the pellet was taken up in 100 ⁇ l DEPC water. 2.5 ⁇ g RNA from this solution were transcribed into cDNA using a cDNA kit (Gibco BRL).
  • the PCR reaction was carried out using the Perkin-Elmer tTth polymerase according to the manufacturer's instructions. 1/8 of the cDNA was used as template (corresponds to 0.3 ⁇ g RNA).
  • the PCR program was:
  • the fragment was cloned into Promega's vector pGEM-T according to the manufacturer's instructions.
  • the correctness of the fragment was checked by sequencing.
  • the PCR fragment was isolated using the restriction sites Ncol and Pstl present in the polylinker of the vector pGEM-T and the protruding ends were blunt-ended using the T4 polymerase. This fragment
  • Fragment A (529 bp) contains the 35S promoter of the CaMV (nucleotides 6909 to 7437 of the cauliflower mosaic virus).
  • Fragment B Fragment of the F3H gene in the antisense orientation.
  • Fragment C (192 bp) contains the termination signal of the octopine synthase
  • a second antisense construct should be generated using a larger F3H fragment.
  • the 5 'RACE method (System for Rapid amplification of cDNA ends) was used for the cloning of a larger fragment of the F3H.
  • the cDNA first strand synthesis was carried out according to the manufacturer's instructions using the GSP-1 (gene-specific primer) 5 '-TTCAC-CACTGCCTGGTGGTCC-3'. Following an RNase digest, the cDNA was purified using the GlassMAX spin system from Life Tecgnologies TM in accordance with the manufacturer's instructions.
  • a cytosine homopolymer was added to the 3 'end of the purified single-stranded F3H cDNA using the terminal deoxynucleotydil transferase according to the manufacturer's instructions.
  • the 5 'extended F3H cDNA was amplified using a second gene-specific primer (GSP-2) which binds in the region 3' before the GSP-1 recognition sequence and thus enables a "nested” PCR Manufacturer supplied "5 'RACE abrided anchor primer", which is complementary to the homopolymeric dC tail of the cDNA.
  • GSP-2 second gene-specific primer
  • the cDNA fragment amplified in this way and designated as FSH ex ended was cloned into the vector pGEM-T from Promega according to the manufacturer's instructions.
  • the identity of the cDNA was confirmed by sequencing.
  • the FSHextended cDNA fragment was isolated using the restriction sites Ncol and Pstl present in the polylinker of the vector pGEM-T and the protruding ends under Conversion using T4 polymerase and blunt ends.
  • This fragment was cloned into a Smal (blunt) cut vector pBinAR (Höfgen and Willmitzer, 1990) (see Figure 3).
  • This vector mediates resistance to the antibiotic kanamycin in plants.
  • the DNA constructs obtained contained the PCR fragment in sense and antisense orientation. The antisense construct was used to generate transgenic plants.
  • Fragment A (529 bp) contains the 35S promoter of the CaMV (nucleotides 6909 to 7437 of the cauliflower mosaic virus).
  • Fragment B Fragment of the F3H gene in the antisense orientation.
  • Fragment C (192 bp) contains the termination signal of the octopine synthase gene.
  • Tomato seeds (Lycopersicon esculentum Mill. Cv. Moneymaker) were incubated in 10% incubation in 4% sodium hypochlorite solution, then washed 3-4 times with sterile distilled water and placed on MS medium with 3% sucrose, pH 6, 1 for germination . After a germination period of 7-10 d, the cotyledons could be used for the transformation.
  • Day 2 Sterile filter paper was placed on the plates coated with the tobacco suspension culture without air bubbles. The cross-cut cotyledons were placed on top with the top down. The petri dishes were incubated for 3 days in the culture room.
  • Day 5 The agrobacterial culture (LBA4404) was sedimented by centrifugation at approx. 3000 g for 10 min and resuspended in MS medium so that the OD was 0.3. The cotyledon fragments were added to this suspension, which were incubated with gentle shaking for 30 minutes at room temperature. The cotyledon fragments were then dried off somewhat on sterile filter paper and placed back on their starting plates for the continued cultivation for 3 days in the culture room.
  • Non-genetically modified and genetically modified tomato plants of the "Moneymaker” variety were grown in the greenhouse.
  • the genetically modified tomato plants expressed the gene flavanon -3-hydroxylase in an antisense orientation.
  • Both the non-genetically modified plants and the genetically modified plants were treated with different concentrations of glyphosate. It was found that the plants which contained the flavanone 3-hydroxylase gene in the antisense orientation have a high resistance to glyphosate.

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Abstract

Verfahren zur Erhöhung der Widerstandskraft von Kulturpflanzen gegen chemischen Stress, ausgelöst insbesondere durch ungenügend selektive oder unsachgemäss applizierte Herbizide dadurch gekennzeichnet, dass mit molekulargenetischen Methoden eine Pflanze hergestellt wird, in der die Aktivität des Enzyms Flavanon-3-hydroxylase reduziert ist.

Description

Verfahren zur Erhöhung der Widerstandskraft von Kulturpflanzen gegen chemischen Streß
Beschreibung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung der Widerstandskraf von Kulturpflanzen gegen chemischen Streß, ausgelöst insbesondere durch ungenügend selektive oder un- sachgemäß applizierte Herbizide, dadurch gekennzeichnet, daß mit molekulargenetischen Methoden eine Pflanze hergestellt wird, in der die Aktivität des Enzyms Flavanon-3 -hydroxylase reduziert ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Flavanon- 3 -hydroxylase durch molekulargenetische Verfahren (z.B. Antisense-Konstrukt, Co-Suppression, der Expression spezifischer Antikörper oder der Expression spezifischer Inhibitoren) ganz oder teilweise, andauernd oder vorübergehend, in der gesamten Pflanze oder in Teilen der Pflanze in seiner Aktivität reduziert ist.
Dabei ist die Widerstandskraft der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Pflanzen vor allem gegen Glyphosate, Glu- fosinate-ammonium und Verbindungen der Formel I, gegen Cyclohexe- non-Herbizide wie Sethoxydim, Cycloxydim, Tepraloxydim oder Cle- foxydim sowie Bromoxynil erhöht.
Weiterhin betrifft die Erfindung Pflanzen mit erhöhter Wider - standskraft gegenüber ungenügend selektiven und unsachgemäß ap- plizierten Herbiziden, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durch Expression einer Flavanon-3 -hydroxylase in Antisens-Orientierung hergestellt wurden und deren enzymatische Aktivität der Flavanon-3 -hydroxylase reduziert ist.
Die Produktivität von Kulturpflanzen kann in vielfältiger Weise durch Streßfaktoren reduziert werden. Zu nennen sind hier unter anderem: Virenerkrankungen, bakterielle und pilzliche Pathogene, schädigende Insekten, Nematoden, Schnecken, Wildverbiß, Hitze, Kühle, Kälte, Wassermangel, zu hoher Wassergehalt des Bodens, Bo- denversalzung, zu hohe Strahlungsintensität, Konkurrenz um Licht, Wasser und Nährstoffe durch Begleitflora, zu hoher Ozongehalt in der die Pflanzen umgebenden Luft, pflanzenschädigende Emissionen, z.B. aus Industriebetrieben oder Kraftfahrzeugen, unsachgemäße oder nicht optimal auszubringende Herbizidanwendungen, besonders in Obst- und Weinkulturen, Behandlungen mit Herbiziden, Insektiziden, Fungiziden, Bioregulatoren oder Blattdüngern von zu gerin- ger Selektivität, Blattapplikationen von Pflanzenschutzmitteln oder Düngern während intensiver Sonneneinstrahlung.
Die meisten der genannten Stressoren können allgemein als "Chemi- scher Streß" zusammengefaßt werden. Hier sind nur im begrenzten Umfang Möglichkeiten für Gegenmaßnahmen gegeben. Zu nennen ist hier insbesondere der Einsatz von Antidots zur Minimierung herbizidbedingter Schäden bei Kulturpflanzen. Der Einsatz von Antidots beschränkt sich jedoch auf bestimmte herbizide Wirkstoffklassen und ist nur für Gramineen von Bedeutung. Antidots für Totalherbizide wie Glyphosate oder Glufosinate-ammoniurn sind nicht für die Praxis verfügbar, da ihr Einsatz nicht zu befriedigenden Resultaten führt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war demgemäß das Auffinden von Verfahren, mit deren Hilfe die Widerstandskraft von Kulturpflanzen gegen chemische Stressoren, insbesondere gegen Herbizide, in breiterem Umfang verbessert wird.
Ausgehend von physiologischen Untersuchungen mit Wachstums- regulatoren aus der Gruppe der Acylcyclohexadione wurden nun überraschend gentechnologische Verfahren verfügbar, mit deren Hilfe sich Kulturpflanzen erzeugen lassen, die gegen eine Reihe von chemischen Stressoren, insbesondere Herbizide, widerstandstä- hig sind.
Acylcyclohexadione wie Prohexadion-Ca und Trinexapac-ethyl (ältere Bezeichnung: Cimectacarb) werden als Bioregulatoren zur Hemmung des pflanzlichen Längenwachstums eingesetzt. Ihre bioregu- latorische Wirkung kommt dadurch zustande, daß sie die Biosynthese von längenwachstumsfördernden Gibberellinen blockieren. Dabei hemmen sie aufgrund ihrer strukturellen Verwandtschaft zu 2-Oxoglutarsäure bestimmte Dioxygenasen, die 2-Oxoglutarsäure als Co-Substrat benötigen (Rademacher, W, Biochemical effects of plant growth retardants, in: Plant Biochemical Regulators, Gaus- man, HW (ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 169-200 (1991) ) . Es ist bekannt, daß derartige Verbindungen auch in den Stoffwechsel von Phenolen eingreifen und so bei mehreren Pflanzenarten eine Hemmung der Anthocyanbildung bewirken können (Rade- macher, W et al . , The mode of action of acylcyclohexanediones - a new type of growth retardant, in: Progress in Plant Growth Regulation, Karssen, CM, van Loon, LC, Vreugdenhil, D (eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1992)). Derartige Effekte auf den Haushalt phenolischer Inhaltsstoffe werden als ursächlich für die Nebenwirkung von Prohexadion-Ca gegen Feuerbrand angegeben (Rade- macher, W et al., Prohexadione-Ca - a new plant growth regulator for apple with interesting biochemical features, Poster auf dem 25th Annual Meeting of the Plant Growth Regulation Society of America, 7.-10. Juli 1998, Chicago). A. Lux-Endrich (Dissertation Technische Universität München in Weihenstephan, 1998) findet im Verlauf ihrer Untersuchungen zum Wirkmechanismus von Prohexadion- Ca gegen Feuerbrand, daß es in Zellkulturen von Apfel durch Prohexadion-Ca zu einer mehrfachen Erhöhung des Gehaltes an phenolischen Substanzen kommt und daß dabei eine Reihe von sonst nicht vorhandenen Phenolen auftritt. Im Rahmen dieser Untersuchungen wurde weiterhin gefunden, daß unter dem Einfluß von Pro- hexadion-Ca relativ hohe Mengen von Luteoliflavan und Eriodyctiol in Sproßgewebe von Apfel auftreten. Luteoliflavan kommt in Apfelgewebe normalerweise nicht vor und Eriodyctiol tritt als Inter- ediat des Flavonoidstoffwechseis nur in geringen Mengen auf. Die zu erwartenden Flavonoide Catechin und Cyanidin waren im behan- delten Gewebe jedoch nicht nachweisbar oder traten nur in deutlich reduzierten Mengen auf (S. Rommelt et al, Vortrag 8th International Workshop on Fire Blight, Kusadasi, Türkei, 12.-15. Oktober 1998) .
Es kann als gesichert gelten, daß Prohexadion-Ca, Trinexapac- ethyl und andere Acylcyclohexadione 2-Oxoglutarsäure-abhängige Hydroxylasen inhibieren, die im Stoffwechsel phenolischer Substanzen von Bedeutung sind. Dabei handelt es sich primär um Fla- vanon-3-hydroxylase (F3H) (W. Heller und G. Forkmann, Bio- synthesis, in: The Flavonoids, Harborne, JB (ed.), Chapman and Hall, New York, 1988) . Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, daß Acylcyclohexadione auch weitere, bislang unbekannte, 2-Oxoglutarsäure-abhängige Hydroxylasen hemmen. Es dürfte ferner naheliegend sein, daß ein Mangel an Catechin, Cyanidin oder ande- ren Endprodukten der Flavonoidsynthese von der Pflanze registriert wird und daß über einen Feedback-Mechanismus die Aktivität des Schlüsselenzyms Phenylalaninammoniumlyase (PAL) erhöht wird. Durch die weiterhin existierende Hemmung der F3H können diese Flavonoid-Endprodukte jedoch nicht gebildet werden, und es kommt zu einer vermehrten Bildung von Luteoliflavan, Eriodyctiol und anderer Phenole (Abbildung 1) .
Durch die Reduktion der Enzymaktivität des Enzyms Flavanon-3-hydroxylase (F3H) werden die Flavonoide Eriodictyol, Proanthocyani - dine, die am C-Atom 3 mit Wasserstoff substituiert sind, z.B. Lu- teoforol, Luteoliflavan, Apigeniflavan und Tricetiflavan, sowie homogene und heterogene Oligomere und Polymere aus den genannten und strukturell verwandten Substanzen vermehrt gebildet.
Erhöhte Konzentratonen der Phenole Hydroxyzimtsäure (p-Cumar- säure, Ferulasäure, Sinapinsäure) , Salicylsäure oder Umbellife- ron, einschließlich der aus ihnen gebildeten homogenen und hete- rogenen Oligomere und Polymere werden nach Reduktion der Enzym- aktivität des Enzyms Flavanon-3-hydroxylase (F3H) in Pflanzen festgestellt.
Ausgehend von diesen Befunden und den daraus abgeleiteten Hypothesen wurden gentechnisch veränderte Kulturpflanzen erzeugt, in denen Flavanon- 3 -hydroxylase durch Anti-Sense-Konstrukte ganz oder teilweise, dauerhaft oder vorübergehend, in der gesamten Pflanze oder in einzelnen Pflanzenorganen oder -geweben in ihren Aktivitäten reduziert waren, so daß hier der Gehalt an Phenolen und somit die Widerstandsfähigkeit der neuartigen Pflanzen gegen chemischen Streß erhöht war.
Besonders war bei den transgenen Pflanzen in denen die Flava- non- 3 -hydroxylase Aktivität mit molekulargenetischen Methoden reduziert war, eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen chemischen Streß, ausgelöst insbesondere durch ungenügend selektive oder unsachgemäß applizierte Herbizide festzustellen. Dieser Effekt wurde vor allem bei Applikation der Herbizide Glyphosate, Glufo- sinate-ammonium, Verbindungen der Formel (I), Cyclohexenon-Herbi - ziden wie Sethoxydim, Cycloxydim, Tepraloxydim oder Clefoxydim und bei Bromoxynil beobachtet.
Weiterhin wird die Widerstandskraft gegen den herbiziden Wirk- stoff der Formel I erhöht, wobei in Verbindungen der Formel I und deren landwirtschaftlich brauchbaren Salze
Figure imgf000005_0001
R3 die Variablen folgende Bedeutungen haben:
R1, R2 Wasserstoff, Nitro, Halogen, Cyano, Cι-C6-Alkyl,
Ci-Cβ-Halogenalkyl, Cι-C6-Alkoxy, Ci-Cβ-Halogenalkoxy, Cι-C6-Alkylthio, Cx -C6 -Halogenalkylthio, Cι-C6-Alkyl- sulfinyl, Ci-Cβ-Halogenalkylsulfinyl, Cι-C6 -Alkylsulfonyl oder Ci-Cβ-Halogenalkylsulfonyl;
R3 Wasserstoff, Halogen oder Ci-Cε -Alkyl;
R4, R5 Wasserstoff, Halogen, Cyano, Nitro, Cι-C4 -Alkyl,
Cι-C4-Alkoxy-Cι-C -alkyl, Di- (Cx-C4-alkoxy) -Cι-C -alkyl, Di- (Cι-C -alkyl) -amino-C!-C -alkyl, [2,2-Di- (Cι-C - alkyl) -hydrazino- 1] -Cι-C -alkyl , Ci-Cδ-Alkyliminooxy- Ci -C4 -alkyl , Ci -C -Alkoxycarbonyl -Cj - C4 -alkyl , C1-C4 -Alkylthio-Cι-C4 -alkyl, Cχ-C4 -Halogenalkyl, Cι-C4 -Cyanoalkyl, C3-C8-Cycloalkyl, C1-C4 -Alkoxy, Ci-C4 -Alkoxy-C2-C4 -alkoxy, Ci -C4 -Halogenalkoxy, Hydroxy, Cι-C4-Alkylcarbonyloxy, Cι-C -Alkylthio, C1-C4 -Halogen- alkylthio, Di- (Cχ-C4 -alkyl) -amino, COR6, Phenyl oder Benzyl, wobei die beiden letztgenannten Substituenten partiell oder vollständig halogeniert sein können und/ oder eine bis drei der folgenden Gruppen tragen können: Nitro, Cyano, Cχ-C4 -Alkyl, Cχ-C4-Halogenalkyl, Cι-C4 -Alkoxy oder C1-C4 -Halogenalkoxy;
oder
R4 und R5bilden gemeinsam eine C -C6 -Alkandiyl -Kette, die ein- bis vierfach durch Cχ-C4 -Alkyl substituiert sein kann und/ oder durch Sauerstoff oder einen gegebenenfalls Cι-C4 -Alkyl substituierten Stickstoff unterbrochen sein kann;
oder
R4 und R5bilden gemeinsam mit dem zugehörigen Kohlenstoff eine Carbonyl- oder eine Thiocarbonylgruppe;
R6 Wasserstoff, Cι-C -Alkyl, Ci -C4 -Halogenalkyl,
Cχ-C4 -Alkoxy, Ci -C4-Alkoxy-C -C4 -alkoxy, C1-C4 -Halogenalkoxy, C3-C6-Alkenyloxy, C -C6-Alkinyloxy oder NR7R8;
R7 Wasserstoff oder Ci -C4 -Alkyl;
R8 Cx-C4-Alkyl ;
X O , S , NR9 , CO Oder CRiOR11 ;
Y 0 , S , NR12 , CO oder CR^R*4 ;
R9, R12 Wasserstoff oder Ci -C4-Alkyl;
R10, R11, R13, R1« Wasserstoff, C3.-C4 -Alkyl, C1-C4 -Halogenalkyl,
C1-C4 -Alkoxycarbonyl, Cι-C4-Halogenalkoxycarbσnyl oder
CONR7R8;
oder R4 und R9oder R4 und R" oder R5 und R 2 oder R5 und R3 bilden gemeinsam eine C2 -C6 -Alkandiyl -Kette, die ein- bis vierfach durch C1-C4 -Alkyl substituiert sein kann und/oder durch Sauerstoff oder einen gegebenenfalls Cχ-C4 -Alkyl substi- tuierten Stickstoff unterbrochen sein kann;
R5 ein in 4 -Stellung verknüpftes Pyrazol der Formel II
Figure imgf000007_0001
Rl6 Z
wobei
R16 Ci -C6-Alkyl; Z H oder S02R17;
R17 C1-C4 -Alkyl, C1-C4 -Halogenalkyl, Phenyl oder Phenyl, das partiell oder vollständig halogeniert ist und/ oder eine bis drei der folgenden Gruppen trägt: Nitro, Cyano, Cι-C -Alkyl, Ci -C -Halogenalkyl, Cι-C4-Alkoxy oder Cχ-C4 -Halogenalkoxy;
Ri8 Wasserstoff oder Cι-Cδ-Alkyl
wobei X und Y nicht gleichzeitig für Sauerstoff oder Schwefel stehen.
Die folgende Liste von Verbindungen mit herbizider Wirkung zeigt mögliche Wirkstoffe auf, bei denen ebenfalls in Pflanzen in denen die Enzymaktivität der Flavanon-3 -hydroxylase durch Antisens -Kon- strukte ganz oder teilweise reduziert ist, eine höhere Wider - Standskraft gegen das betreffende Herbizide beobachtet werden kann. Die Liste ist jedoch nicht auf diese Wirkstoffe beschränkt.
bl 1, 3, 4-Thiadiazolen: buthidazole, cyprazole
b2 Arnide: allidochlor (CDAA) , benzoylprop-ethyl , bromobutide, chlort - hiamid , dimepiperate , dimethenamid, diphenamid, etobenzanid (benzchlomet ) , f lamprop-methyl , fosamin, isoxaben, monalide, naptalame, pronamid (propyzamid) , propanil b3 Aminophosphorsauren : bi lanafos , (bialaphos ) , bummafos , gluf osmate-ammonium , gly- phosate , sulf osate
b4 Aminotriazolen : amitrol
b5 Anil ide : anilofos, mefenacet
b6 Aryloxyalkansauren:
2,4-D, 2,4-DB, clomeprop, dichlorprop, dichlorprop-P, dich- lorprop-P (2,4-DP-P), fenoprop (2,4,5-TP), fluoroxypyr, MCPA, MCPB, mecoprop, mecoprop-P, napropamide, napropanilide, tri- clopyr
b7 Benzoesauren: chloramben, dicamba
b8 Benzothiadiazinonen: bentazon
b9 Bleacher: clomazone (dimethazone) , diflufenican, fluorochloridone, flu- poxam, fluridone, pyrazolate, sulcotrione (chlormesulone)
blO Carbamaten: asulam, barban, butylate, carbetamid, chlorbufam, chlorpro- pham, cycloate, desmedipham, diallate, EPTC, esprocarb, moli- nate, orbencarb, pebulate, phenisopham, phenmedipham, pro- pham, prosulfocarb, pyributicarb, sulfallate (CDEC) , terbu- carb, thiobencarb (benthiocarb) , tiocarbazil, triallate, ver- nolate
bll Chinolinsauren: quinclorac, quinmerac
bl2 Chloracetaniliden: acetochlor, alachlor, butachlor, butenachlor, diethatyl ethyl, dimethachlor , metazachlor, metolachlor, pretilachlor, propachlor, prynachlor, terbuchlor, thenylchlor, xylachlor
bl3 Cyclohexenonen: alloxydim, caloxydim, clethodim, cloproxydim, cycloxydim, sethoxydim, tralkoxydim, 2- {1- [2- (4-Chlorphenoxy)propyloxyi - mino]butyl} ' 3-hydroxy-5- (2H-tetrahydrothiopyran-3-yl) - 2-cyclohexen-l-on
bl4 Dichlorpropionsäuren: dalapon
bl5 Dihydrobenzofurane: ethofumesate
blβ Dihydrofuran-3-one: flurta one
bl7 Dinitroaniline: benefin, butralin, dinitramin, ethalfluralin, fluchloralin, isopropalin, nitralin, oryzalin, pendimethalin, prodiamine, profluralin, trifluralin
bl8 Dinitrophenole: bromofenoxim, dinoseb, dinoseb-acetat, dinoterb, DNOC
bl9 Diphenylether: acifluorfen-sodium, aclonifen, bifenox, chlornitrofen (CNP) , difenoxuron, ethoxyfen, fluorodifen, fluoroglycofen-ethyl, fomesafen, furyloxyfen, lactofen, nitrofen, nitrofluorfen, oxyfluorfen
b20 Dipyridylene: cyperquat, difenzoquat-methylsulfat, diquat, paraquat di- chlorid
b21 Harnstoffe: benzthiazuron, buturon, chlorbromuron, chloroxuron, chlorto• luron, cumyluron, dibenzyluron, cycluron, dimefuron, diuron, dymron, ethidimuron, fenuron, fluormeturon, isoproturon, isouron, karbutilat, linuron, methabenzthiazuron, metobenzu- ron, metoxuron, monolinuron, monuron, neburon, siduron, tebu- thiuron, trimeturon
b22 Imidazole: isocarbamid
b23 Imidazolinone: imazamethapyr, imazapyr, imazaquin, imazethabenz-methyl (ima- zame) , imazethapyr b24 Oxadiazole: methazole, oxadiargyl, oxadiazon
b25 Oxirane: tridiphane
b26 Phenole: bromoxynil, ioxynil
b27 Phenoxyphenoxypropionsäureester: clodinafop, cyhalofop-butyl , diclofop-methyl, fenoxaprop- ethyl, fenoxaprop-p-ethyl, fenthiapropethyl, fluazifop-butyl, fluazifop-p-butyl, haloxyfop-ethoxyethyl, haloxyfop-methyl, haloxyfop-p-methyl , isoxapyrifop, propaquizafop, quizalofop- ethyl, quizalofop-p-ethyl, quizalofop-tefuryl
b28 Phenylessigsäuren: chlorfenac (fenac)
b29 Phenylpropionsäuren: chlorophenprop-methyl
b30 Protoporphyrinogen-lX-Oxydase-Hemmer : benzofenap, cinidon-ethyl, flumiclorac-pentyl , flumioxazin, flumipropyn, flupropacil, fluthiacet-methyl, pyrazoxyfen, sulfentrazone, thidiazimin
b31 Pyrazole: nipyraclofen
b32 Pyridazine: chloridazon, maleic hydrazide, norflurazon, pyridate
b33 Pyridincarbonsäuren: clopyralid, dithiopyr, picloram, thiazopyr
b34 Pyrimidylethern: pyrithiobac-säure, pyrithiobac-sodium, KIH-2023, KIH-6127
b35 Sulfonamide: flumetsulam, metosulam
b36 Sulfonylharnstoffe: amidosulfuron, azimsulfuron, bensulfuron-methyl, chlorimuron- ethyl, chlorsulfuron, cinosulfuron, cyclosulfamuron, ethamet- sulfuron methyl, ethoxysulfuron, flazasulfuron, halosulfuron- methyl, imazosulfuron, metsulfuron-methyl, nicosulfuron, pri- misulfuron, prosulfuron, pyrazosulfuron-ethyl, rimsulfuron, sulfometuron- ethyl, thifensulfuron-methyl, triasulfuron, tribenuron-methyl, triflusulfuron-methyl b37 Triazine: ametryn, atrazin, aziprotryn, cyanazine, cyprazine, desme- tryn, dimethamethryn, dipropetryn, eglinazin-ethyl, hexazi- non, procyazine, prometon, prometryn, propazin, secbumeton, simazin, simetryn, terbumeton, terbutryn, terbutylazin, trie- tazin
b38 Triazinone: ethiozin, metamitron, metribuzin
b39 Triazolcarboxamide: triazofenamid
b40 Uracile: bromacil , lenacil , terbacil
b41 Verschiedene: benazolin, benfuresate, bensulide, benzofluor, butamifos, ca- fenstrole, chlorthal-dimethyl (DCPA) , cinmethylin, dichlobe- nil, endothall, fluorbentranil, mefluidide, perfluidone, pi - perophos
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich erfolgreich bei den Kulturpflanzen Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Mais, Hirse, Zuckerrohr, Banane, Tomate, Tabak, Paprika, Kartoffel, Raps, Zuk- kerrübe, Soja, Baumwolle und um Obstgehölze aus der Familie der Rosaceen, wie Apfel, Birne, Pflaume, Zwetschge, Pfirsich, Nektarine und Kirsche sowie bei Weinreben, aber auch bei anderen nicht namentlich genannten Pflanzen, anwenden.
In Gewächshausversuchen konnte die erfindungsgemäß erhöhte
Resistenz gegen eine Reihe von Herbiziden belegt werden. Bei diesen Versuchen wurden Testpflanzen in Plastiktöpfen von ca. 300 ml Volumen auf lehmigen Sand mit ungefähr 3 % Humusanteil kultiviert. Die verschiedenen Herbiziden wurden bei einer Sproßlänge von ca. 12 cm appliziert. Eine visuelle Ermittlung des jeweiligen Schädigungsgrades erfolgte ungefähr 20 Tage nach Herbizidbehandlung. Beispiel 1
Klonierung des Gens einer Flavanone-3-Hydroxylase aus Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymaker
Reife Tomatenfrüchte von Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymaker wurden gewaschen, getrocknet und mittels einer sterilen Klinge das Perikarp von Samen, mittlere Kolumnella und Holzteilen befreit. Das Perikarp (ca. 50 g) wurde in fluessigem Stickstoff eingefroren. Das Material wurde anschliessend in einem Mixer zerkleinert. Das zerkleinerte Material wurde in einem vorgekühlten Mörser mit 100 ml Homogenisierungs-Medium versetzt und gemischt. Die Suspension wurde dann in Zentrifugenbecher überführt, indem sie durch sterile Mulltücher gepreßt wurde. Anschließend wurde 1/10 Vol 10% SDS hinzugefügt und gut gemischt. Nach 10 Minuten auf Eis, wurde 1 Vol Phenol/Chloroform zugegeben, der Zentrifugenbecher verschlossen und gut gemischt. Nach 15 minütiger Zentrifugation bei 4000 rpm wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Es schlössen sich drei weitere Phenol/ Chloroform Extraktionen und eine Chloroform Extraktion an. Im folgenden wurde 1 Vol 3 M NaAC (Na-Acetat) und 2.5 Vol Ethanol zugegeben. Die Fällung der Nukleinsäuren erfolgte über Nacht bei -20°C. Am nächsten Morgen wurden die Nukleinsäuren für 15 Minuten bei 10000 rpm in der Kühlzentrifuge (4°C) pelletiert. Der Über- stand wurde verworfen und das Pellet in 5-lo ml kaltem 3 M NaAc resuspendiert. Dieser Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Das Pellet wurde mit 80%igem Ethanol gewaschen. Das vollständig getrocknet Pellet wurde in ca. 0,5 ml sterilem DEPC (Diethylpyro- carbonat) Wasser aufgenommen und die RNA-Konzentration photome- trisch bestimmt.
20 μg gesamt RNA wurden zunächst mit 3,3 μl 3M Natriu acetat-Lö- sung, 2 μl IM Magnesiumsulfat-Lösung versetzt und auf 100 μl Endvolumen mit DEPC Wasser aufgefüllt. Dazu wurde ein Microliter Rnase freie Dnase (Boehringer Mannheim) gegeben und 45 min bei 37° Grad inkubiert. Nach Entfernen des Enzyms durch ausschütteln mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol wurde die RNA mit Ethanol gefällt und das Pellet in 100 μl DEPC Wasser aufgenommen. 2,5 μg RNA aus dieser Lösung wurden mittels eines cDNA-Kits (Gibco BRL) in cDNA umgeschrieben.
Unter Verwendung von Aminosäuresequenzen die aus für Flava- none-3-Hydroxylase kodierenden cDNA Klonen abgeleitet wurden, konnten konservierte Bereiche in der Primärsequenz identifiziert werden (Britsch et al., Eur. J. Biochem. 217, 745 -754 (1993), die als Grundlage für das Design von degenerierten PCR Oligo- nukleotiden dienten. Das 5' Oligonukleotid wurde unter Verwendung der Peptidsequenz SRWPDK (Aminosäure 147-152 in der Sequenz FL3H PETHY aus Petunia hybrida. ermittelt und hatte folgende Sequenz: 5'-TCI (A/C) G (A/G) TGG CC (A/C/G) GA (C/T) AA (A/G) CC-3. > Die Sequenz des unter Verwendung der Peptidsequenz DHQAW (Aminosäure 276281 in der Sequenz FL3H PETHY aus Petunia hybrida ) abgeleiteten Oligonukleotides lautete wie folgt: 5'-CTT CAC ACA (C/ G/T) GC (C/T) TG (A/G) G (A/G)TC-3.
10
Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung der tTth-Polymerase von Perkin-Elmer nach Herstellerangaben durchgeführt. Als Template wurden 1/8 der cDNA eingesetzt (entspricht 0,3 μg RNA). Das PCR- Programm lautete:
15
30 Zyklen
94 Grad 4 sec
40 Grad 30 sec
72 Grad 2 min
20 72 Grad 10 min
Das Fragment wurde nach Herstellerangaben in den Vektor pGEM-T von Promega kloniert.
25 Die Richtigkeit des Fragmentes wurde durch Sequenzierung überprüft. Das PCR Fragment wurde unter Verwendung der im Polylinker des Vektors pGEM-T vorhandenen Restriktionsschnittstellen Ncol und Pstl isoliert und die überstehenden Enden unter Verwendung der T4-Polymerase in glatte Enden überführt. Dieses Fragment
30 wurde in einen Smal (blunt) geschnittenen Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Sei. 66: 221 -230 (1990)) kloniert (siehe Abbildung 2). Dieser enthält den 35S-Promotor des CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck et al . , Cell 21: 285 - 294 (1980)) und das Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens (Gielen et al.,
35 EMBO J. 3: 835 - 846 ( 1984)). Dieser Vector vermittelt in Pflanzen Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin. Die erhaltenen DNA Konstrukte enthielten das PCR Fragment in Sense und Antisense Orientierung. Das Antisensekonstrukt wurde zur Erzeugung transgener Pflanzen eingesetzt.
40
Abbildung 2: Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S-Promotor des CaMV (Nukleotide 6909 bis 7437 des Blumenkohlmosaikvirus) . Fragment B Fragment des F3H Gens in Antisense-Orientierung. Fragment C (192 Bp) enthält das Terminationssignal des Octopin-Synthase
45 Gens. Klonierung eines größeren cDNA Fragmentes der Flavanone-3-Hydroxylase aus Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymaker unter Verwendung des 5 'RACESystems.
i Um auszuschließen, dass die Erzeugung von Pflanzen mit reduzierter RNA Fließgleichgewichtsmenge der F3H aufgrund der geringen Größe des im Antisensekonstrukt verwendeten F3H PCR Fragmentes nicht erfolgreich ist, sollte ein zweites Antisense-Konstrukt unter Verwendung eines größeren F3H Fragmentes erzeugt werden.
Zum Zweck der Klonierung eines größeren Fragmentes der F3H wurde die 5 'RACE Methode (System for Rapid amplification of cDNA ends) angewendet .
Verlängerung des F3H PCR Fragmentes durch die 5' RACE-Methode unter Verwendung des 5 'RACE System for rapid amplification of cDNA ends, Version 2-0 von Life Tecgnologies™.
Aus reifen Tomatenfrüchten von Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymaker wurde gesamt RNA isoliert (siehe oben) .
Die cDNA Erststrang-Synthese wurde nach Herstellerangaben unter Verwendung des GSP-1 (Gen spezifischer Primer) 5' -TTCAC- CACTGCCTGGTGGTCC-3 ' durchgeführt. Im Anschluß an einen Rnase Ver- dau, wurde die cDNA unter Anwendung des GlassMAX spin Systems von Life Tecgnologies™ gemäß den Herstellerangaben aufgereinigt .
An das 3 ' Ende der gereinigten einzelsträngigen F3H cDNA wurde unter Verwendung der terminalen deoxynukleotydil-Transferase ge- maß den Herstellerangaben ein Cytosin Homopolymer addiert.
Die Amplifikation der 5' verlängerten F3H cDNA erfolgte unter Verwendung eines zweiten Gen spezifischen Primers (GSP-2) der im Bereich 3' vor der GSP-1 Erkennungsequenz bindet und somit eine ,,nested" PCR ermöglichte. Als 5'Primer wurde der vom Hersteller gelieferte "5 'RACE abrided anchor primer" verwendet, der komplementär zum homopolymeren dC-Schwanz der cDNA ist.
Das so amplifizierte und als FSHex ended bezeichnete cDNA Fragment wurde nach Herstellerangaben in den Vektor pGEM-T von Promega kloniert.
Die Identität der cDNA wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Das FSHextended cDNA Fragment wurde unter Verwendung der im Polylinker des Vektors pGEM-T vorhandenen Restriktionsschnittstellen Ncol und Pstl isoliert und die überstehenden Enden unter Verwendung der T4-Polymerase und glatter Enden überführt. Dieses Fragment wurde in einen Smal (blunt) geschnittenen Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990) kloniert (siehe Abbildung 3) . Dieser enthält den 35S-Promotor des CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck et al . , 1980) und das Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens (Gielen et al., 1984). Dieser Vektor vermittelt in Pflanzen Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin. Die erhaltenen DNA Konstrukte enthielten das PCR Fragment in Sense und Antisense Orientierung. Das Antisensekonstrukt wurde zur Er- zeugung transgener Pflanzen eingesetzt.
Abbildung 3: Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S-Promotor des CaMV (Nukleotide 6909 bis 7437 des Blumenkohlmosaikvirus) . Fragment B Fragment des F3H Gens in Antisense-Orientierung. Fragment C (192 Bp) enthält das Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens.
Beispiel 2
Herstellung transgener Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymaker die ein Teilfragment der Flavanone-3-Hydroxylase in Antisense Orientierung exprimieren.
Es wurde die Methode nach Ling et al., Plant Cell Report 17, 843 - 847 ( 1998 ) genutzt. Die Kultivierung erfolgt bei ca. 22°C unter einem 16 h - Licht / 8 h - Dunkel - Regime.
Tomatensamen (Lycopersicon esculentum Mill. cv. Moneymaker) wurden durch 10 minütige Inkubation in 4%iger Natriumhypochlorit- lösung inkubiert, anschließend 3 - 4 mal mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen und auf MS Medium mit 3 % Saccharose, pH 6 , 1 zur Keimung ausgelegt. Nach einer Keimdauer von 7 - 10 d konnten die Kotyledonen für die Transformation eingesetzt werden.
Tag 1: Petrischalen mit dem Medium "MSBN" wurden mit 1,5 ml einer ca. 10 d alten Tabaksuspensionskultur überschichtet. Die Platten wurden mit Folie abgedeckt und bis zum nächsten Tag bei Raumtemperatur inkubiert.
Tag 2: Auf die mit der Tabaksuspensionskultur beschichteten Platten wurde steriles Filterpapier luftblasenfrei aufgelegt. Darauf wurden die quer geschnittenen Keimblätter mit der Oberseite nach unten aufgelegt. Die Petrischalen wurden für 3 Tage im Kulturenraum inkubiert. Tag 5: Die Agrobakterienkultur (LBA4404) wurde durch Zentri- fugation bei ca. 3000g für 10 min sedimentiert und in MS-Mediu resuspendiert, so daß die OD 0,3 beträgt. In diese Suspension wurden die Keimblattstückchen gegeben, die unter leichtem Schütteln für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Anschließend wurden die Keimblattstückchen auf sterilem Filterpapier etwas abgetrocknet und wieder zurück auf ihre Ausgangsplatten für die Fortsetzung der Cocultivierung für 3 Tage im Kulturenraum gelegt.
Tag 8: Die cocultivierten Keimblattstückchen wurden auf MSZ2K50+ß gelegt und für die nächsten 4 Wochen im Kulturenraum inkubiert. Danach erfolgte die Subkultivierung.
Sich bildende Sprosse wurden auf Wurzelinduktionsmedium gebracht.
Nach erfolgreicher Bewurzelung konnten die Pflanzen getestet und ins Gewächshaus überführt werden.
Beispiel 3
Erhöhung der Widerstandskraft in gentechnologisch modifizierten Tomaten die eine Flavanon-3 -hydroxylase in Antisens-Orientierung enthalten gegenüber Glyphosate.
Nicht gentechnisch modifizierte und gentechnologisch modifizierte Tomatenpflanzen der Sorte "Moneymaker" wurden im Gewächshaus gezüchtet. Die gentechnologisch modifizierten Tomatenpflanzen ex- primierten das Gen Flavanon -3 -hydroxylase in Antisens -Orientie- rung . Sowohl die nicht gentechnologisch modifizierten Pflanzen als auch die gentechnologisch modifizierten Pflanzen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen an Glyphosate behandelt. Dabei zeigte sich, daß die Pflanzen, die das Flavanon-3 -hydroxylase Gen in Antisens-Orientierung enthielten eine hohe Widerstandskraf gegenüber Glyphosate aufweisen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Erhöhung der Widerstandskraft von Kulturpflan- zen gegen chemischen Streß, ausgelöst insbesondere durch ungenügend selektive oder unsachgemäß applizierte Herbizide, dadurch gekennzeichnet, daß mit molekulargenetischen Methoden eine Pflanze hergestellt wird, in der die Aktivität des Enzyms Flavanon-3-hydroxylase reduziert ist.
2. Verfahren zur Erhöhung der Widerstandskraft von Kulturpflanzen gegen chemischen Streß gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Flavanon-3-hydroxylase durch molekulargenetische Verfahren (z.B. Antisense-Konstrukt, Co-Sup- pression, der Expression spezifischer Antikörper oder der Expression spezifischer Inhibitoren) ganz oder teilweise, andauernd oder vorübergehend, in der gesamten Pflanze oder in Teilen der Pflanze in seiner Aktivität reduziert ist.
3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Kulturpflanzen um Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Mais, Hirse, Zuckerrohr, Banane, Tomate, Tabak, Paprika, Kartoffel, Raps, Zuckerrübe, Soja, Baumwolle und um Obstgehölze aus der Familie der Rosaceen, wie Apfel, Birne, Pflaume, Zwetschge, Pfirsich, Nektarine und Kirsche sowie um Weinrebe handelt.
4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Widerstandskraft gegen den herbiziden Wirkstoff Gly- phosate erhöht wird.
5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Widerstandskraft gegen den herbiziden Wirkstoff Glu- fosinate-ammonium erhöht wird.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Widerstandskraft gegen Verbindungen der Formel I erhöht wird, wobei in Verbindungen der Formel I und deren landwirtschaftlich brauchbaren Salze
Figure imgf000017_0001
ariablen folgende Bedeutungen haben:
R , R2 Wasserstoff, Nitro, Halogen, Cyano, Cχ-C6-Alkyl,
Ci-Cβ -Halogenalkyl, Cι-C6-Alkoxy, Cι-C6 -Halogenalkoxy, Cι-C6-Alkylthio, Cι-C6-Halogenalkylthio, Cχ-Cδ-Alkyl- sulfinyl, Cι-C6 -Halogenalkylsulfinyl, Ci -C6 -Alkyl - sulfonyl oder Ci -Z& -Halogenalkylsulfonyl;
R3 Wasserstoff, Halogen oder Cχ-C6 -Alkyl;
R4, R5 Wasserstoff, Halogen, Cyano, Nitro, Cι-C4-Alkyl, Ci -C4 -Alkoxy-Ci - C4 -alkyl ,
Di- (C1-C4-alkoxy) -C -C -alkyl, Di- (Cχ-C4 -alkyl) -ami- no-Cχ-C4-alkyl, [2, 2-Di - (C -C4 - alkyl) -hydrazino-1] -Cχ-C4 -alkyl, Cχ-C6 -Alkyliminooxy-
Cχ-C4 -alkyl, C1 - C4 -Alkoxycarbonyl -Cχ-C4 -alkyl, Cx -C -Alkylthio-C -C4 - alkyl , Cx - C4 -Halogenalkyl , Cχ-C -Cyanoalkyl, C3-C8-Cycloalkyl, Cχ-C4 -Alkoxy, Cχ-C4 -Alkoxy-C2-C4-alkoxy, Cχ-C -Halogenalkoxy, Hydroxy, Cχ-C4 -Alkylcarbonyloxy, Cχ-C4 -Alkylthio,
Cχ-C4-Halogenalkylthio, Di- (Cχ-C4 -alkyl) -amino, COR6, Phenyl oder Benzyl, wobei die beiden letztgenannten Substituenten partiell oder vollständig halogeniert sein können und/oder eine bis drei der folgenden Gruppen tragen können:
Nitro, Cyano, C -C4 -Alkyl, Cχ-C4 -Halogenalkyl, Cχ-C4-Alkoxy oder Cχ-C4 -Halogenalkoxy;
oder
R4 und R5bilden gemeinsam eine C -Ce -Alkandiyl-Kette, die ein- bis vierfach durch Cχ-C4 -Alkyl substituiert sein kann und/oder durch Sauerstoff oder einen gegebenenfalls Cχ-C -Alkyl substituierten Stickstoff unterbrochen sein kann;
oder
R4 und R5bilden gemeinsam mit dem zugehörigen Kohlenstoff eine Carbonyl- oder eine Thiocarbonylgruppe;
R6 Wasserstoff, Cχ-C4 -Alkyl, Cχ-C4-Halogenalkyl, Cx -C4 -Alkoxy, C -C4 -Alkoxy-C -C -alkoxy, Cχ-C4 -Halogenalkoxy, C3 -C6 -Alkenyloxy, C3-C6-Alkinyl- oxy oder NR7R8; R7 Wasserstof f oder Cχ - C4 -Alkyl ;
R8 Cx - C4 - Alkyl ;
X O, Ξ, NR9, CO oder CR0RH;
Y 0, S, NRi2, CO oder CR3R4;
R9, Ri2 Wasserstoff oder C -C4 -Alkyl;
Rio, Rii, Ri3, R Wasserstoff, Cχ-C -Alkyl, Cχ-C -Halogenalkyl,
Cχ-C4 -Alkoxycarbonyl, Cχ-C4 -Halogenalkoxycarbonyl oder CONR7R8;
oder
R4 und R9oder R4 und R10 oder R5 und Ri2 oder R5 und Ri3 bilden gemeinsam eine C2 -C& -Alkandiyl -Kette, die ein- bis vierfach durch Cχ-C4 -Alkyl substituiert sein kann und/oder durch Sauerstoff oder einen gegebenenfalls
C -C4 -Alkyl substituierten Stickstoff unterbrochen sein kann;
R15 ein in 4 -Stellung verknüpftes Pyrazol der Formel II
Figure imgf000019_0001
R" Z
wobei
Ri6 Cχ-C5 -Alkyl;
Z H oder SO2RI7;
R17 Cχ-C4 -Alkyl, Cχ-C4 -Halogenalkyl, Phenyl oder Phenyl, das partiell oder vollständig halogeniert ist und/oder eine bis drei der folgenden Gruppen trägt:
Nitro, Cyano, Cχ-C4 -Alkyl, Cχ-C4 -Halogenalkyl, Cχ-C -Alkoxy oder Cχ-C -Halogenalkoxy;
R8 Wasserstoff oder Cχ-C6 -Alkyl wobei X und Y nicht gleichzeitig für Sauerstoff oder Schwefel stehen.
7. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Widerstandskraft gegen Cyclohexenon-Herbizide wie
Sethoxydim, Cycloxydim, Tepraloxydim oder Clefoxydim erhöht wird.
8. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Widerstandskraft gegen das Herbizid Bromoxynil erhöht wird.
9. Pflanze mit erhöhter Widerstandskraf gegenüber ungenügend selektiven und unsachgemäß applizierten Herbiziden herge- stellt nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Aktivität des Enzyms Flavanon- 3 -hydroxylase reduziert ist.
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