WO1998042371A1 - Neue verwendung von antithrombin iii - Google Patents

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WO1998042371A1
WO1998042371A1 PCT/AT1998/000078 AT9800078W WO9842371A1 WO 1998042371 A1 WO1998042371 A1 WO 1998042371A1 AT 9800078 W AT9800078 W AT 9800078W WO 9842371 A1 WO9842371 A1 WO 9842371A1
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WO
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iii
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heparin
heparins
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PCT/AT1998/000078
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French (fr)
Inventor
Hans-Peter Schwartz
Anton Philapitsch
Ludwig Pichler
Wilfried Auer
Yendra Linnau
Original Assignee
Baxter Aktiengesellschaft
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Publication date
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Priority to EP98909214A priority patent/EP0971732A1/de
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans

Definitions

  • the invention relates to a new use of antithrombin III.
  • Antithrombin III is a plasmatic protein that has an anticoagulant effect by inhibiting thrombin, the factors IXa, Xa, XIa, Xlla and plasmin.
  • AT III deficiency (or hereditary thrombophilia) is an autosomal dominant hereditary disease with a tendency to thrombosis or embolism due to reduced formation of AT III.
  • Acquired AT III deficiency can e.g. with consumption coagulopathy (DIC), sepsis, cirrhosis of the liver or with nephrotic syndrome.
  • DIC consumption coagulopathy
  • sepsis sepsis
  • cirrhosis of the liver or with nephrotic syndrome.
  • AT III deficiency symptoms can occur with heart valve prostheses, postoperative, thromboembolic complications, with estrogen therapy or with asparagine therapy.
  • Heparin is a coagulation-inhibiting polymer made of D-glucuronic acid and D-glucosamine that occurs in the body (lungs, liver, thymus, spleen and basophilic mast cells) and contains several molecules of sulfuric acid per structural unit. Heparin inhibits the effect of thrombin on, for example, fibrinogen by binding to AT III, which is why heparin is also referred to as a cofactor for AT III. Furthermore, heparin also inhibits the effects of thrombokinase and thereby the conversion of prothrombin to thrombin, as well as the Agglomera ⁇ tion of the platelets and the clotting reaction.
  • Heparin AT III has an inhibitory effect on the arterial coagulation factors Va, IXa, Xa and Xlla and has an activating effect on lipoprotein lipase.
  • heparin treatment can also cause serious side effects.
  • the cause of a heparin-induced thrombocytopania and the associated risk of thrombosis are assumed to be immunological reactions that are not predictable. Due to the inhibition of platelet aggregation, bleeding often occurs as part of heparin therapy.
  • heparins are routinely administered primarily for prophylaxis but also for the treatment of thrombosis and embolism. Hematomas (“bruises”) often occur especially when heparins are administered subcutaneously, which patients often find very painful.
  • the object of the present invention is therefore to provide an improved prophylaxis and therapy treatment of thromboses and embolisms, which can be used primarily for routine use in hospitals and no longer has the disadvantages of conventional heparin administration.
  • This object is achieved according to the invention by using AT III for the manufacture of a pharmaceutical preparation for preventing bleeding during anticoagulation therapy, in particular for the manufacture of a pharmaceutical preparation for prophylaxis or treatment of thrombosis.
  • the inhibition of platelet aggregation can also be prevented or treated, and the bleeding time can be shortened.
  • AT III is also provided only once ⁇ a pharmaceutical preparation with AT III as an effective component are available which may be provided for subcutaneous administration, III for the preparation of a subcutaneous medicament to be administered.
  • the present invention therefore also relates to a pharmaceutical preparation for subcutaneous injection, which preparation contains AT III as the or one of the essential active components.
  • the subcutaneous preparation contains AT III in a relatively high concentration, corresponding to at least 2 times the concentration usual for in vitro products.
  • a concentration in the range from 100 to 5000 ATH HI / ml is usually chosen, preferably between 500 and 3000 ATH HI / ml, depending on the purity of the protein used.
  • AT III is also used as an IV or IM product for Intended use suggested.
  • the AT III used according to the invention can be contained in various types of preparations, for example in combination with high-affinity heparins or heparinoids with affinity for AT III, preferably as an AT III-heparin (or heparinoid) complex (heparinoids is a collective term for natural occurring, semi-synthetic and synthetic mucopolysaccharides with heparin-like effects).
  • a preferred production process for such a complex is described in AT-PS 379 310, wherein human plasma or AT III-containing plasma fractions are mixed with heparin or heparinoid and the heparin or heparinoid complex formed is purified by adsorption on an anion exchanger.
  • Such a preparation is commercially available under the designation Atheplex ® (Fa. Immuno, AT).
  • Atheplex ® Fa. Immuno, AT.
  • this method can also be carried out with starting solutions which have been produced by the recombinant DNA technology.
  • AT III is preferably used in the context of an anticoagulation therapy which comprises a heparin treatment.
  • the pain associated with the heparin injection (as a side effect of the anticoagulation therapy) can be greatly reduced or even prevented with the combined administration of AT III and heparin or of AT III complexed with heparin.
  • patients at risk of heparin-induced thrombocytopania can be treated.
  • the preparation for subcutaneous administration according to the invention can contain different types of heparin.
  • heparins in low molecular weight with a molecular weight of about 1500 to 10,000 or in high molecular weight with a Molecular weight of about 10,000 to 30,000 daltons may be included.
  • the preparation according to the invention has a surprisingly high functional half-life. Due to its novel absorption and pharmacokinetics, the preparation according to the invention is characterized by an exceptional bioavailability of AT III or heparin.
  • the components of the preparation are preferably mixed and administered by the choice of the heparins or the heparinoids or their AT III affinity such that the heparins or heparinoids contained in vivo have a functional half-life of more than 10 hours, in particular of more than 20 hours, in certain cases even more than 30 hours.
  • the pharmaceutical preparation according to the invention is produced by completing a purified preparation containing AT III and optionally heparin, according to methods known per se, by combining it with suitable buffer, auxiliary, preservative and / or stabilizing substances or protease inhibitors and is filled in a form suitable for administration and is preferably stored in a stable manner, optionally in a lyophilized or frozen state.
  • the effective dosage of the preparation when used depends on the individual patient (height, body weight, condition, blood count, .
  • the AT III concentration in the preparation according to the invention or for the application according to the invention is preferably selected such that administration of a dose of 5 to 10,000 U AT HI / kg body weight in a volume of less than 20 ml, in particular less than 10 ml, preferably less than 5 ml, most preferably less than 2 ml.
  • the preparation according to the invention is preferably subjected to a method for inactivating infectious or pathogenic material, in particular viruses.
  • These inactivation treatment is preferably ensured with a surfactant and / or heat treatment, for example by a heat treatment in the solid state, in particular a steam treatment according to EP-0 159 311, or EP-0 519 901 or EP-0 674 531.
  • Treatments for inactivating viruses also include treatment with chemical or chemical / physical methods, e.g. with chaotropic substances according to W094 / 13329, DE 44 34 538 or EP-0 131 740 (solvent) or the photo inactivation.
  • Irradiation or nanofiltration is also a preferred physical method for depleting viruses in the context of the present invention.
  • the invention also relates to a kit for subcutaneous injection comprising a pharmaceutical preparation containing AT III, instructions for the use of the preparation for subcutaneous injection, and optionally an application device suitable for subcutaneous injection, preferably a syringe.
  • This syringe has one in relation to i. m. -Spray very thin needle to facilitate penetration under the skin.
  • the pharmaceutical preparation in the kit is preferably provided in a container in lyophilized form, but it can also be provided in liquid form, in which case, however, it is then preferably stored in deep-frozen form.
  • 1A and 1B the local tolerance of heparin and Atheplex ® on the mouse; 2: the pain-inducing effect of heparin in the rat paw model;
  • FIG. 4 shows the comparison of the ristocetin-dependent Plötenaggrega- tion of heparin and Atheplex ®.
  • Fig. 5 the determination of the half-life of heparin and Atheplex ® .
  • Example 1 Haematoma formation in mice after subcutaneous injection of heparin or the preparation according to the invention (currently the best way of carrying out the invention in the opinion of the applicant)
  • mice 15 male NMRI mice are a total of g in weight of 25 to 30 having heparin (I MUNO AG, Wien) or preparation according to the invention (Atheplex ®, obtainable from IMMUNO AG, Vienna.) Treated as follows:
  • the animals were sacrificed on day 4 and the subcutaneous changes were assessed pathologically and anatomically.
  • Control animals which had received isotonic saline analogue, never showed hematomas.
  • the section confirmed the visual assessment of the 4th day.
  • Example 2 Examination of the pain-triggering effect of a subcutaneous injection of heparin and the preparation according to the invention in the rat paw model
  • a mercury monometer was connected to a 10 ml syringe, the piston of which was equipped with a short, bullet-shaped plug. This syringe applied increasing pressure to the rat paw (26.7 mbar / s). The pain threshold was given as the pressure in mbar that is necessary to trigger a defense reaction of the animal.
  • mice Female Sprague-Dawley rats weighing between 250 and 350 g were used for the study.
  • the pain threshold was measured before the injection (previous value) and every hour up to 6 hours after the intraplantar injection of heparin (multiple doses) or Atheplex ® (multiple doses) or isotonic saline (100 ⁇ l, negative control).
  • the values after injection of test or control substances were expressed as a percentage of the previous value.
  • Figs. 2 heparin
  • Fig. 3 theplex ® produced (x + SJJ-).
  • the abscissa represents the time axis (hours after intraplantar injection).
  • Heparin (Fig. 2) was tested in doses 1, 3, 10, 40 and 130 IU on 10 animals each. From 10 IU, progressive, severe pain occurs, with no further dose dependency being discernible.
  • Atheplex ® (Fig. 3) was tested in doses 10, 40, 130 and 200 units of heparin (n respectively 10). Here too there is initial pain, which, however, diminishes as the duration progresses. The timing and extent of this decrease are dose-dependent:
  • Example 3 In vitro investigation of the inhibition of platelet aggregation by heparin and by the preparation according to the invention
  • the influence of the substances on the platelet aggregation takes place by means of a turbidometric method using an aggregometer (from Chronolog).
  • a turbidometric method using an aggregometer from Chronolog.
  • To 400 ⁇ l of a formaldehyde-fixed platelet preparation (250,000 cells per ⁇ l), 25 ⁇ l of an FVIII-vWF preparation and 25 ⁇ l sample or buffer to be tested are added as a control. After an incubation of 3 min at 37 ° C., the aggregation is started with 50 ⁇ l ristocetin sulfate (10 mg / ml). The aggregation is evaluated via the increase in the aggregation curve.
  • the reference value is the aggregation with buffer addition.
  • Example 4 Determination of the half-life of subcutaneously injected heparin and subcutaneously injected preparation according to the invention

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Abstract

Beschrieben wird die Verwendung von AT III zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Verhinderung von Blutung während einer Antikoagulanstherapie sowie eine pharmazeutische Präparation zur subkutanen Injektion, welche AT III als Wirkkomponente enthält.

Description

Neue Verwendung von Antithrombin III
Die Erfindung betrifft eine neue Verwendung von Antithrombin III.
Antithrombin III (AT III) ist ein plasmatisches Protein, das gerinnungshemmend wirkt, indem es Thrombin, die Faktoren IXa, Xa, XIa, Xlla und Plasmin inhibiert.
AT III -Mangel (oder hereditäre Thrombophilie) ist eine autoso- mal-dominante erbliche Erkrankung mit Thrombose- bzw. Embolie- neigung infolge verminderter Bildung von AT III.
Erworbener AT III-Mangel kann z.B. bei Verbrauchskoagulopathien (DIC), Sepsis, Leberzirrhose oder beim nephrotischen Syndrom auftreten .
Ebenso kann es bei Herzklappenprothesen, postoperativen, throm- boembolischen Komplikationen, bei der Östrogentherapie oder bei der Asparaginasetherapie zu AT III -Mangelerscheinungen kommen.
Alle diese Syndrome werden derzeit u.a. mit AT III -Gabe behandelt, wobei die Applikation stets intravenös erfolgte (siehe dazu von Kries et al . , Eur. J. Pediatr. 144 , 191-194 (1985)).
Heparin ist ein im Körper (Lunge, Leber, Thymus , Milz und baso- phile Mastzellen) vorkommendes, gerinnungshemmendes Polymer aus D-Glukuronsäure und D-Glukosamin, das pro Struktureinheit mehrere Moleküle Schwefelsäure enthält . Heparin hemmt die Wirkung von Thrombin auf z.B. Fibrinogen durch Bindung an AT III, weshalb Heparin auch als Cofaktor für AT III bezeichnet wird. Weiters inhibiert Heparin auch die Wirkung von Thrombokinase und dadurch die Umwandlung von Prothrombin zu Thrombin, sowie die Agglomera¬ tion der Thrombozyten und der Blutgerinnungsreaktion.
Heparin AT III hat eine inhibierende Wirkung auf die arteriellen Blutgerinnungsfaktoren Va, IXa, Xa und Xlla und wirkt aktivierend auf die Lipoproteinlipase . Die Heparin-Behandlung kann jedoch auch ernste Nebenwirkungen hervorrufen. So werden als Ursache für eine Heparin-induzierte Thrombozytopänie und ein damit verbundenes Thromboserisiko immunologischer Reaktionen vermutet, die nicht vorhersehbar sind. Aufgrund einer Inhibition der Plättchenaggregation kommt es auch häufig zu Blutungen im Rahmen einer Heparin-Therapie .
Klinisch werden Heparine routinemäßig vor allem zur Prophylaxe aber auch zur Therapie von Thrombosen und Embolien verabreicht. Hiebei treten vor allem bei der subkutanen Verabreichung von Heparinen, die von den Patienten oft als sehr schmerzhaft empfunden wird, häufig Hämatome ("blaue Flecken") auf.
Verfahren zur Gewinnung von Heparin sind zahlreich beschrieben; ein Beispiel für ein zur subkutanen Anwendung geeignetes Hepa- rinpräparat ist in der CA-PS 1 108 989 offenbart.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, eine verbesserte Prophylaxe und Therapiebehandlung von Thrombosen und Embolien zur Verfügung zu stellen, welche vor allem für den routinemäßigen Gebrauch im Krankenhaus verwendet werden kann und die Nachteile der herkömmlichen Heparin-Gabe nicht mehr aufweist .
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung von AT III zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Verhinderung von Blutungen während einer Antikoagulations- therapie, insbesondere zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Thrombose-Prophylaxe oder -Behandlung.
Obwohl die Verwendung von AT III gerade zur Verhinderung von Blutungen während der Therapie mit Heparin wegen der bekannten verstärkenden antikoagulativen Wirkung von Heparinen auf AT III an sich paradox ist (weil eigentlich eine verstärkte gerinnungs- inhibierende Wirkung erwartet werden mußte) , zeigt die erfindungsgemäße Verwendung überraschenderweise äußerst positive Wirkungen :
So konnte die Bildung von Hämatomen - im Vergleich zur herkömm- liehen Heparingabe - stark reduziert werden, die subkutane Injektion war auch weit weniger schmerzhaft und darüberhinaus zeigte die erfindungsgemäße Behandlung auch eine nicht zu erwartende Depotwirkung, wodurch die funktioneile Halbwertszeit von AT III und Heparin vor allem bei der subkutanen Injektion stark verlängert werden konnte. Damit ist es erstmals möglich, eine ausreichende Thromboseprophylaxe nicht durch die üblichen täglichen Injektionen von Heparin vorzunehmen, sondern die Behandlungen in längeren Zeitabständen durchzuführen, etwa in Abständen von 2, 3, 4 Tagen bis zu einer Woche, je nach zu verabreichender Dosis .
Erfindungsgemäß kann derart weiters sowohl die Inhibition der Plättchenaggregation verhindert bzw. behandelt, als auch die Blutungszeit verkürzt werden.
Das Risiko einer Thrombozytopänie sowie unerwünschter Blutungen im Rahmen einer Antikoagulanstherapie durch die erfindungsgemäße Präparation bzw. Verwendung wird erheblich reduziert. Es konnte in vitro nachgewiesen werden, daß die Thrombozytenaggregation durch AT III/Heparin nicht beeinflußt wird, während Heparin einen deutlich inhibitorischen Effekt zeigt.
Mit der erfindungsgemäßen Indikation für AT III wird auch erst¬ mals eine pharmazeutische Präparation mit AT III als Wirkkomponente zur Verfügung gestellt, die zur subkutanen Verabreichung vorgesehen werden kann, also die Verwendung von AT III zur Herstellung eines subkutan zu verabreichenden Arzneimittels.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch eine pharmazeutische Präparation zur subkutanen Injektion, welche Präparation AT III als die oder eine der wesentlichen aktiven Komponenten enthält. Die subkutane Präparation enthält AT III in einer relativ hohen Konzentration, entsprechend mindestens einer 2-fachen Konzentration der für in vitro-Produkte üblichen. Üblicherweise wird eine Konzentration im Bereich von 100 bis 5000 E AT HI/ml gewählt, bevorzugterweise zwischen 500 und 3000 E AT HI/ml, je nach Reinheit des eingesetzten Proteins. Daneben wird aber auch AT III als i.V.- oder i.m. -Produkt zur erfindungsge- mäßen Verwendung vorgeschlagen.
Das erfindungsgemäß eingesetzte AT III kann in verschiedenartigen Präparationen enthalten sein, beispielsweise in Kombination mit hochaffinen bzw. für AT III affinen Heparinen bzw. Heparino- iden, vorzugsweise als AT III-Heparin- (oder Heparinoid) -Komplex (Heparinoide ist ein Sammelbegriff für natürlich vorkommende, halbsynthetische und synthetische Mukopolysaccharide mit Hepa- rin-ähnlicher Wirkung) .
Ein bevorzugtes Herstellungsverfahren für einen solchen Komplex ist in der AT-PS 379 310 beschrieben, wobei Humanplasma oder AT III -haltige Plasmafraktionen mit Heparin bzw. Heparinoid versetzt werden und der gebildete Heparin- bzw. Heparinoidkomplex durch Adsorption an einem Anionenaustauscher gereinigt wird. Eine derartige Präparation ist im Handel unter der Bezeichnung Atheplex® (Fa. Immuno, AT) erhältlich. Selbstverständlich kann dieses Verfahren auch mit Ausgangslösungen durchgeführt werden, die durch die rekombinante DNA-Technologie hergestellt worden sind.
Bevorzugterweise wird die erfindungsgemäße Verwendung von AT III im Rahmen einer Antikoagulationstherapie, welche eine Heparinbe- handlung umfaßt, eingesetzt.
Wie erwähnt, lassen sich die mit der Heparin-Injektion verbundenen Schmerzen (als Nebenwirkung der Antikoagulationstherapie) mit der kombinierten Gabe von AT III und Heparin bzw. von an Heparin komplexiertem AT III stark verringern bzw. sogar verhindern. Daneben kommt es zu einer deutlich reduzierten Hämatombil- dung an der Injektionsstelle .
Insbesondere können erfindungsgemäß Patienten mit einem Risiko an Heparin- induzierter Thrombozytopänie behandelt werden.
Die erfindungsgemäße Präparation zur subkutanen Verabreichung kann verschiedene Heparinarten enthalten. Beispielsweise können Heparine in niedermolekularer Form mit einem Molekulargewicht von etwa 1500 bis 10 000 oder in hochmolekularer Form mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 bis 30 000 Dalton enthalten sein.
Die erfindungsgemäße Präparation weist eine überraschend hohe funktioneile Halbwertszeit auf. Aufgrund ihrer neuartigen Resorption und Pharmakokinetik ist die erfindungsgemäße Präparation durch eine außergewöhnliche Bioverfügbarkeit von AT III bzw. Heparin charakterisiert. Vorzugsweise werden die Komponenten der Präparation durch die Wahl der Heparine oder der Hepa- rinoide bzw. deren AT III -Affinität derart gemischt und verabreicht, daß die enthaltenen Heparine bzw. Heparinoide in vivo eine funktioneile Halbwertszeit von mehr als 10 Stunden, insbesondere von mehr als 20 Stunden, in bestimmten Fällen auch mehr als 30 Stunden, aufweist.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Präparation wird hergestellt, indem eine aufgereinigte AT III und gegebenenfalls Heparin enthaltende Präparation nach an sich bekannten Methoden fertiggestellt wird, indem es gegebenenfalls mit geeigneten Puffer-, Hilfs-, Konservierungs- , und/oder Stabilisierungssubstan- zen bzw. Proteaseinhibitoren vereinigt wird und in einer zur Verabreichung geeigneten Form abgefüllt und vorzugsweise lagerstabil, gegebenenfalls in lyophilisiertem oder gefrorenem Zustand, verpackt wird.
Die effektive Dosierung des Präparates bei der Anwendung richtet sich sehr individuell nach dem jeweiligen Patienten (Größe, Körpergewicht, Zustand, Blutbild, ...).
Vorzugsweise ist die AT III-Konzentration im erfindungsgemäßen Präparat bzw. für die erfindungsgemäße Anwendung derart gewählt, daß damit eine Verabreichung einer Dosis von 5 bis 10 000 E AT HI/kg Körpergewicht in einem Volumen von weniger als 20 ml, insbesondere von weniger als 10 ml, vorzugsweise weniger als 5 ml, am meisten bevorzugt weniger als 2 ml, ermöglicht wird.
Bevorzugterweise wird die erfindungsgemäße Präparation einem Verfahren zur Inaktivierung von infektiösem bzw. pathogenem Material, insbesondere Viren, unterzogen. Diese Inaktivierungsbe- handlung wird vorzugsweise mit einer Tensid- und/oder Hitzebehandlung gewährleistet, beispielsweise durch eine Hitzebehandlung in festem Zustand, insbesondere eine Dampfbehandlung gemäß der EP-0 159 311, oder der EP-0 519 901 oder der EP-0 674 531.
Weitere Behandlungen zur Inaktivierung von Viren umfassen auch die Behandlung mit chemischen oder chemisch/physikalischen Methoden, z.B. mit chaotropen Stoffen gemäß der W094/13329, DE 44 34 538 oder EP-0 131 740 (Lösungsmittel) oder die Photo- inaktivierung .
Die Bestrahlung oder Nanofiltration stellt ebenfalls ein bevorzugtes physikalisches Verfahren zur Abreicherung von Viren im Rahmen der vorliegenden Erfindung dar.
Schließlich betrifft die Erfindung auch ein Kit zur subkutanen Injektion umfassend eine AT III enthaltende pharmazeutische Präparation, Instruktionen für die Verwendung der Präparation zur subkutanen Injektion, sowie gegebenenfalls eine zur subkutanen Injektion geeignete Applikationseinrichtung, vorzugsweise eine Spritze. Diese Spritze hat eine im Verhältnis zu i . m. -Spritzen sehr dünne Nadel, um das Eindringen unter die Haut zu erleichtern.
Bevorzugterweise wird die pharmazeutische Präparation im Kit in einem Behälter in lyophilisierter Form zur Verfügung gestellt, sie kann aber auch in flüssiger Form bereitgestellt werden, wobei sie dann allerdings vorzugsweise in tiefgefrorener Form gelagert wird.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und der Zeichnungsfiguren, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, näher erläutert.
Es zeigen:
Fig. 1A und 1B : die lokale Verträglichkeit von Heparin und Atheplex® an der Maus; Fig. 2: die schmerzauslösende Wirkung von Heparin im Rattenpfoten-Modell ;
Fig. 3: die schmerzauslösende Wirkung von Atheplex® im Ratten- Modell;
Fig. 4: den Vergleich der Ristocetin-abhängigen Plättenaggrega- tion von Heparin und Atheplex®; und
Fig. 5: die Bestimmung der Halbwertszeit von Heparin und Atheplex®.
B e i s p i e l e :
B e i s p i e l 1 : Hämatombildung an Mäusen nach subkutaner Injektion von Heparin bzw. dem erfindungsgemäßen Präparat (derzeit nach Ansicht der A-nmelderin der beste Weg zur Ausführung der Erfindung)
In drei Durchgängen werden insgesamt jeweils 15 männliche NMRI- Mäuse im Gewicht von 25 bis 30 g mit Heparin (I MUNO AG, Wien) bzw. dem erfindungsgemäßen Präparat (Atheplex®, erhältlich von der Fa. IMMUNO AG, Wien) wie folgt behandelt:
1,5 IE Heparin 1,5 Heparineinheiten Atheplex®
15 IE Heparin 15 Heparineinheiten Atheplex®
Die Behandlung (0,5 ml) erfolgte subkutan im Bereich des Abdomens. Die Mäuse wurden täglich über 4 Tage auf Verfärbung der Subkutis untersucht. Veränderungen wurden wie folgt bewertet:
Score Größe nicht vorhanden 0 bis 0,5 cm2 1
0,6 - 4 cm2 2
< 4 cm2 3 - o
Score Verfärbung keine 0 geringgradige Intensität 1 mittelgradige Intensität 2 hochgradige Intensität 3
Schwellung keine 0 geringgradig 1 mittelgradig 2 hochgradig 3
Am 4. Tag wurden die Tiere getötet und die subkutanen Veränderungen pathologisch-anatomisch beurteilt.
Mittelwertsergebnisse gehen aus Tabelle 1 und Fig. 1 hervor.
TABELLE 1A
Score
1,5 IE 1 2 3 4 Tag
Heparin 2,86 2,66 2,26 1, 73
Atheplex® 1,20 0,40 0,20 0, 0
TABELLE 1B
Score
15 IE 1 2 3 ' 4 Tacr
Heparin 3,66 4,13 3,33 2,33
Atheulex® 2, 86 1,80 1,40 1, 33
Wie ersichtlich (Fig. 1A, B) , besteht bei 1,5 und 15 Heparineinheiten ein relativ deutlicher Unterschied zwischen den beiden getesteten Präparaten zugunsten von Atheplex®.
Kontrolltiere, die analog isotone Kochsalzlösung erhalten hatten, zeigten zu keinem Zeitpunkt Hämatome. Die Sektion bestätigte jeweils die visuelle Beurteilung des 4. Tages .
B e i s p i e l 2 : Untersuchung der schmerzauslösenden Wirkung einer subkutanen Injektion von Heparin und der erfindungsgemäßen Präparation im Rattenpfoten-Modell
Diese Wirkung wurde an der entzündeten Rattenpfote durch Bestimmung der Schmerzschwelle nach Randall & Selitto (Arch. Int. Pharmacodyn. 111 (1957), 409-419) bestimmt.
Dazu wurde ein Quecksilbermonometer mit einer 10 ml-Spritze verbunden, deren Kolben mit einem kurzen, geschoßförmigen Zapfen ausgerüstet war. Durch diese Spritze wurde steigender Druck auf die Rattenpfote ausgeübt (26,7 mbar/s) . Die Schmerzschwelle wurde angegeben als jener Druck in mbar, der notwendig ist, um eine Abwehrreaktion des Tieres auszulösen.
Zur Untersuchung wurden weibliche Sprague-Dawley-Ratten im Gewicht zwischen 250 und 350 g verwendet. Die Schmerzschwelle wurde jeweils vor der Injektion (Vorwert) und stündlich bis zu 6 Stunden nach der intraplantaren Injektion von Heparin (mehrere Dosen) bzw. Atheplex® (mehrere Dosen) oder isotoner Kochsalzlösung (100 μl, negative Kontrolle) gemessen. Die Werte nach Injektion von Test- oder Kontrollsubstanzen wurden in Prozent des Vorwertes ausgedrückt .
Die Ergebnisse gehen aus den Fig. 2 (Heparin) und Fig. 3 (Atheplex®) hervor (x + SJJ-) . Auf der Ordinate ist die prozen¬ tuelle Schmerzschwelle aufgetragen: 100 % = kein Schmerz; 0 % = maximaler Schmerz. Die Abszisse stellt die Zeitachse dar (Stunden nach intraplantarer Injektion) . Die oberste Kurve (Dreiecke) repräsentiert jeweils die Kontrolltiere (isotone Kochsalzlösung, n = 15; kein Schmerz) .
Heparin (Fig. 2) wurde in den Dosen 1, 3, 10, 40 und 130 IE an jeweils 10 Tieren geprüft. Ab 10 IE kommt es zu progredientem, starkem Schmerz, wobei keine weitere Dosisabhängigkeit erkennbar ist . Atheplex® (Fig. 3) wurde in den Dosen 10, 40, 130 und 200 Heparin-Einheiten getestet (n jeweils 10) . Auch hier kommt es initial zu Schmerz, der jedoch mit fortschreitender Dauer wieder abnimmt. Zeitpunkt und Ausmaß dieser Abnahme sind dosisabhängig :
10 Heparineinheiten: Umkehr nach der 2. Stunde, völlige Schmerzfreiheit nach 6 Stunden.
200 Heparineinheiten: Umkehr nach der 5. Stunde, Restschmerz zur 6. Stunde: 46,9 ± 3,0 % .
Diese Ergebnisse zeigen eine deutlich geringere Schmerzentwicklung durch die erfindungsgemäße Präparation im Gegensatz zur herkömmlichen Heparintherapie .
B e i s p i e l 3 : In vitro-Untersuchung der Inhibition der Plättchenaggregation durch Heparin und durch das erfindungsgemäße Präparat
Der Einfluß der Substanzen auf die Plättchenaggregation erfolgt mittels einer turbidometrischen Methode unter Verwendung eines Aggregometers (Fa. Chronolog) . Zu 400 μl einer formaldehydfi- xierten Thrombozytenpräparation (250 000 Zellen pro μl) werden 25 μl einer FVIII-vWF-Präparation und 25 μl zu testende Probe bzw. Puffer als Kontrolle zugesetzt. Nach einer Inkubation von 3 min bei 37°C wird die Aggregation mit 50 μl Ristocetinsulfat (10 mg/ml) gestartet. Die Auswertung der Aggregation erfolgt über den Anstieg der Aggregationskurve. Bezugswert ist die Aggregation mit Pufferzusatz.
Die Ristocetinsulfat-induzierte Plättchenaggregation wurde im Gegensatz zu Heparin durch AT III-komplexiertes Heparin nicht inhibiert. Die Versuche wurden auch mit einem gereinigten, re- kombinanten von Willebrand-Faktor wiederholt. Die Ergebnisse mit der vWF-abhängigen Aggregation sind mit der FVIII-vWF-abhängigen Reaktion ident . Beide lassen sich durch Heparinzusatz reduzieren, mit Zusatz von Atheplex® jedoch nicht. faktorielle Auswertung Einheiten Heparin in 500 ul Testgemisch Heparin Atheplex®
2,5 0 , 47 1 , 01
0,25 0 , 84 0 , 99
0,025 1 , 09 1 , 07 Pufferkontrolle (ohne Heparin) 1
Die Ergebnisse zeigen, daß Heparin die Aggregation dosisabhängig inhibiert, wogegen die Reaktion durch Atheplex® nicht bzw. nicht wesentlich beeinflußt wird.
B e i s p i e l 4 : Bestimmung der Halbwertszeit von subkutan injiziertem Heparin und subkutan injiziertem erfindungsgemäßen Präparat
An je 6 wachen Kaninchen (Weiße Neuseeländer, ca. 2,5 kg, beiderlei Geschlechts) werden in der Heparingruppe 6000 Einheiten unfraktioniertes Heparin pro kg subkutan verabreicht. In der Vergleichsgruppe werden 6000 Einheiten Heparin mit 1000 Einheiten AT III als Komplex (Atheplex®) subkutan injiziert. Eine Citratblutabnah e erfolgte über die Ohrvene 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60 Stunden nach der Applikation. Im gewonnenen Plasma wird der Heparinspiegel über eine angepaßte Thrombin- inhibitionsbestimmung mittels chromogenem Substrat (Fa. Coa- Chrom Diagnostika, Chromogenix) bestimmt. Die Berechnungen erfolgen nach biostatistischen Kriterien. In die Berechnung gingen alle Versuche der Heparin- 6000 E/kg und Atheplex®-Applikation 1000 E/kg (= 6000 Heparineinheiten/kg) im Kaninchenversuch ein.
Heparin 6000 E/kg Atheplex® 1000 E/kg subkutan subkutan
Hep.Best. (Ila-Inh.) Hep.Best. (Ila-Inh. ) AT III (Ag) lag time (h) 0,0006 6,02 10,7
Adsorption (l/h) 0,15 0,17 0,42
Eliminierung (l/h) 0,15 0,062 0,031 T/2 Adsorption (h) 4, 76 4,1 1, 66 ab Applikation 2,4 11, 5 17, 8
T/2 Eliminierung (h) 4,59 11, 2 22,7 ab Applikation 16,9 31,7 42,4
AUC (E/ml.h) 1939 2850
Maximum (E/ml) 4,1 8,2 4,2 Zeit Maximum (h) 12 18 18
Die vorliegenden Daten zeigen die Überlegenheit von komplexiertem Heparin mit AT III gegenüber nicht -komplexiertem Heparin. Eine gleiche Überlegenheit zeigt sich auch bei einer i.v.- Verabreichung von Atheplex® bezüglich Halbwertszeit und Recovery (Wiederfindung) .

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e :
1. Verwendung von Antithrombin III (AT III) zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Verhinderung von Blutungen während einer Antikoagulanstherapie.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Inhibition der Plättchenaggregation verhindert bzw. behandelt wird.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutungszeit verkürzt wird.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, daß AT III in Kombination mit hochaffinem Heparin eingesetzt wird.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein AT III-Heparinkomplex eingesetzt wird.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikoagulanstherapie die Behandlung mit Heparinen umf ßt .
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 , dadurch gekennzeichnet, daß Schmerzen als Nebenwirkung einer Antikoagulanstherapie verhindert werden.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Hämatombildung an der Injektionsstelle reduziert wird.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß Patienten mit einem Risiko der Heparin-induzierten Thrombozytopänie behandelt werden.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß AT III subkutan verabreicht wird. WO 98/42371 _, Λ PCT/AT98/00078
- 14 -
11. Pharmazeutische Präparation zur subkutanen Injektion, dadurch gekennzeichnet, daß es AT III umfaßt.
12. Präparation nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das AT III in Komplex mit Heparinen oder Heparinoiden enthalten ist .
13. Präparation nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie Heparine bzw. Heparinoide mit einer hohen Affinität zu AT III enthält.
14. Präparation nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß Heparine mit einem Molekulargewicht von 1500 bis 10 000 enthalten sind.
15. Präparation nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß Heparine mit einem Molekulargewicht von 10 000 bis 30 000 enthalten sind.
16. Präparation nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie Heparine bzw. Heparinoide mit einer funktioneilen Halbwertszeit von mehr als 10 Stunden, vorzugsweise mehr als 20 Stunden enthält.
17. Präparation nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine AT III -Konzentration enthält, die die Verabreichung einer Dosis von 5 bis 5000 E/kg in einem Volumen von weniger als 20 ml, insbesondere weniger als 10 ml, vorzugsweise weniger als 5 ml, erlaubt.
18. Kit zur subkutanen Injektion, dadurch gekennzeichnet, daß es die Präparation nach einem der Ansprüche 11 bis 17 sowie Instruktionen für die Verwendung der Präparation zur subkutanen Injektion umfaßt.
19. Kit zur subkutanen Injektion, dadurch gekennzeichnet, daß es die Präparation nach einem der Ansprüche 11 bis 18 sowie eine zur subkutanen Injektion geeignete Applikationsvorrichtung, vorzugsweise eine Spritze, umfaßt.
20. Kit nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation in einem Behälter in lyophilisierter Form vorliegt.
21. Kit nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation in flüssiger Form und gegebenenfalls tiefgefroren in einem Behälter vorliegt.
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