WO1998020122A1

WO1998020122A1 - PROCEDE DE FORMATION D'UNE BANQUE D'ADNc DANS TOUTE SA LONGUEUR

Info

Publication number: WO1998020122A1
Application number: PCT/JP1997/003992
Authority: WO
Inventors: Yoshihide Hayashizaki
Original assignee: The Institute Of Physical And Chemical Research
Priority date: 1996-11-01
Filing date: 1997-10-31
Publication date: 1998-05-14
Also published as: JP3441899B2; CA2270414A1; DE69731234D1; CA2270414C; DE69738603T2; EP0990702B1; EP0990702A1; EP1469069B1; DE69731234T2; JPH10127291A; EP1469069A1; EP0990702A4; DE69738603D1; US6143528A

Description

明細書

完全長 cDNAライブラリ一の作成方法

技術分野

本発明は、完全長 cDNAライブラリ一作成法に関する。更に詳しくは、 mRNAの化学修飾を利用した、完全長 cDNA精製法による完全長 cDNAライブラリ一作成法に関する。

背景技術

cDNA合成法は医学生物学分野の研究で必須の技術であり、遺伝子転写物の解析法として不可欠である。全ての DNA 遺伝情報は転写物を介して生理活性を示すが、それを解析する強力な手段が cDNAクローニングである。従来法における cDNA合成においては、 oligo dTをプライマーとしてポリ A サイ卜から合成された cDNAライブラリーの中で最終的にクローンが単離される。ところカ^ 殆どの場合、転写単位の全長が合成されていない為に転写単位の全構造が解析できないのが実状である。この為、通常の cDNAライブラリ一では、プライマ一伸長法による 5'上流領域の合成、またはランダムプライマ一を用いた cDNA合成を用いて 5'上流領域をゥォ一キング (walking) することが全長構造解明に、須のステップとなる。

しかるに、上記従来の cMA合成法には次の問題がある。

(1) ランダムプライマ一を用いると転写物のかなりの領域をカバーする cDNAができる。し力、し、それらは短い断片であり、ポリ Aから 5' Cap サイトまで含んだクローンは単離できないことが多い。

(2) oligo dTをプライマ一として用いた cDNAは全て 3'端を含む。しかし、逆転写酵素が 5' Cap サイトまで届かない場合は、 5'上流をプライマー伸長法及び 5' RACE 等で再度単離解析せねばならない。

(3) 既存の完全長 cDNAを単離する方法は、前述の従来のいかなる方法もその効率が十分でない（lOO g mRNAから 200 万組換え体ファージ）。そこで、実用的にはもっと効率の高、手法の開発が望まれる。

完全長 cDNA合成法の従来の技術として、次のような方法が挙げられる。 5' Cap サイ卜の標識法として、酵母または Hela細胞の Cap結合蛋白を用いる方法 (I. Edery et al. ， An Efficient Strategy To Isolate Full- Length cDNAs Based on an mRNA Cap Retention Procedure (CAPture)'， MCB, 15, 3363-3371, 1995)、また 5' Cap のない不完全 cDNAをアルカリフォスファタ一ゼによりリン酸を除去し、その後タバコモザイクウィルスの脱キヤップ酵素を反応させ、完全長 cDNAのみリン酸が露出することを利用した方法（K. Maruyama et al. , ' Oligo- capping: a simple method to replace the cap structure of eukaryotic mRNAs with oligoribonucleotides"， Gene, 138， 171-174, 1995.， S. Kato et al.，

" Construction of a human full-length cDNA bank"， Gene, 150, 243-250, 1995) 、等々が挙げられる。

これらの従来法の完全長 cDNA合成法の効率が十分でな L、理由として次の項目が挙げられる。

① 5' Cap サイ卜の認識が、アデノウイルス Cap結合蛋白やタバコモザイクウィルスの脱キヤップ酵素の様に蛋白酵素の反応に依存している為、完全長 cDNA(RNA) の選択の段階で高い効率が期待できない。

②逆転写酵素が cDNAの第 1鎖を合成する際、 5' Cap サイ卜まで合成鎖が伸長しない。

③第 1鎖が合成された後の第 2鎖合成のプライマー配列の付加、第 2鎖の合成効率、 2重鎖 cDNAのクローニング効率及びクロ一ニングのための宿主べクタ一系の以上の様に多段階にわたる cDNA合成ライブラリ一作成においては、 ①〜③の各ステツプがそれぞれ問題となる。

そこで本発明者は、

第 1に、完全長 cDNAの単離を目的とする従来のキヤップ結合蛋白やタバコモザイクウィルスの脱キャップ酵素等の蛋白酵素反応より効率良く 5' Cap サイ卜の標識が可能な新たな方法を提供すること、

第 2に、この新たな 5' Cap サイ卜の標識方法を用いた完全長 cDNAライブラリ一の作成方法を提供することを目的として、新たな完全長 cDNAライブラリ一の作成方法を提供を見出し、先に特許出願した〔特願平 8— 6 0 4 5 9号〕。この方法は、上記キヤップ結合蛋白やタバコモザィクウィルスの脱キヤップ酵素等の蛋白酵素反応より効率良く 5' Cap サイ卜の標識ができ、その結果、完全長 cDNAライブラリ一の作成をより容易にするものであった。

ところ力 <、本発明者がこの方法についてさらに検討した結果、ジオール構造をジアルデヒド化する工程において mRNAが切断されやすく、完全長 cDNAの合成効率を悪くしていることが判明した。

そこで、本発明の目的は、蛋白酵素反応より効率良く 5' Cap サイトを標識する方法を利用する完全長 cDNAライブラリ一の作成方法であって、 mRNAが切断されることによる完全長 cDNAの合成効率の低下を回避できる、より高い効率で完全長 cDNAを合成できる方法を提供することにある。発明の開示

本発明は、 mRNAの完全長に対応する cDNAのライブラリ一を作成する方法であつて、

mRNAを鏵型とし、プライマ一（例えば、 oligo dT等）より逆転写により RNA-DNA複合体を形成する工程、

RNA-DNA複合体を形成している mRNAの 5' Cap (^7MeG _ppp N)サイ卜に存在するジオール構造に、タツグになる分子を化学結合させる工程、及び

タツグ分子を結合した A- DNA複合体の内、 mRNAの完全長に対応する DNA を有する複合体を、タツグ分子の機能を利用して、分離する工程、

を含むことを特徴とする完全長 cDNAライブラリ一の作成方法に関する。図面の簡単な説明

図 1は、両端（5' Cap サイト、 3'サイト）にジオール構造を有する mRNAの構造を示す。

図 2は、 mRNAの 5' Ca サイトのジオール構造の酸ィ匕及びビォチンヒドラジドの付加反応を示すスキーム。

図 3は、完全長 cDNA合成法の各ステップ（前半）を示すスキーム。

図 4は、完全長 cDNA合成法の各ステップ（後半）を示すスキーム。図 5は、実施例 2で得られた電気泳動後のォートラジォグラフを示す写真。発明を実施するための形態

本発明の方法では、 5' Cap サイ卜の認識を高め、完全長 cDNA(RNA) の選択の段階の効率を高めるために、 5' Cap サイ卜に特異的構造であるジオール構造を利用して 5' Cap サイトの標識を化学合成法により行う（図 1参照）。

即ち、本発明の方法では、 mRNAを錶型とし、 oligo dTをプライマーとして逆転写により RNA-DNA 複合体を形成し、 RNA-DNA 複合体を形成している mRNAの 5' Cap ( ^7MeG _ppp N)サイ卜に存在するジオール構造に、タツグになる分子を化学結合させる。このタツグ分子は 5' Cap サイトに化学的に結合しており、タツグ分子で標識された mRNAを有する RNA-DNA複合体から完全長 cDNAライブラリーを作成する。本発明の方法の特徴は、 RNA- DNA 複合体を形成した後に mRNAをタツグ分子で標識することにある。 RNA-DNA ハイプリッド構造は、 mRNAをタツグ分子で標識するために必要なジォ一ル構造のァルデヒド化の際に生じる mRNAの化学的切断を阻止でき、その結果、完全長 cDNAの合成効率を高めることができる。

夕ッグ分子の mRNAの 5' Ca サイ卜への結合は、図 2に示すように、例えば、 5' Cap サイトのジオール構造を酸化剤、例えば、過ヨウ素酸ナトリゥム（NaI0₄) 等で酸化開環してジアルデヒドとし、次いでヒドラジン末端を有するタツグ分子を前記ジアルデヒドと反応させることで行うことができる。また、本発明の方法においては、 mRNAが RNA-DNA ハイプリッド構造により保護されていることから、ジオール構造の酸化開環を比較的強い酸化条件としても mRNAの化学的酸化を伴うことなく行うことができるという利点がある。

上記ヒドラジン末端を有するタツグ分子としては、例えば、ヒドラジン末端を有するピオチン分子やアビジン分子を挙げることができる。また、タツグ分子として抗原や抗体等の反応特異性を有する分子を用いることもできる。夕ッグ分子として用いる特異標識物には特に制限はない。

第 1の cMA鎖の合成①から 2本鎖完全長 cDNAの合成⑦までの工程の一例（夕ッグ分子：ピオチン）が図 3〜4に示されている。

①第 1の cMA鎖の合成（RNA- DNA 複合体の合成） ② RNA DNA複合体の mRNAのジオール基のピオチン化

③リボヌクレアーゼ I (RNase I) 消化

④完全長 cDNA複合体の捕獲（ァビジンビーズ使用）

⑤ RNase H 消化（アビジンビーズからの一本鎖 cDNAの分離）

⑥ターミナルデォキシヌクレオチジルトランスフェラ一ゼによる G末端の付加

⑦オリゴ Cでプライマーした第 2鎖（ 2本鎖完全長 cDNA) の合成

本発明の方法では、 mRNAを鎌型とし、プライマ一を始点として逆転写により RNA-DNA 複合体を形成する。プライマ一としては、例えば、 oligo dT等を用いることができる。また、 oligo dT等のプライマ一を用いた逆転写法による RNA- DNA 複合体の形成は、常法により行うことができる。

つぎに、 A-DNA 複合体にタツグ分子を結合して標識し、標識された RNA- DNA 複合体の内、 mRNAの完全長に対応する DNA を有する複合体を、タツグ分子の機能を利用して、分離する。

具体的には、 1本鎖 RNA を切断する RNA分解酵素で RNA- DNA 複合体を消化して、 mRNAの完全長に対応しない DNA を有する複合体の 1本鎖 RNA 部を切断してこの複合体からタツグ分子を切除し、次いで、タツグ分子を有する m Aの完全長に対応する DNA を有する複合体（5' Cap まで伸長した完全長 cDNA) をタツグ分子の結合性を利用して分離する。

例えば、タツグ分子がピオチン分子である場合、 RNA- DNA複合体がタツグ分子として有するピオチン分子を、固相担体上に担持したアビジンと結合させて、 mRNAの完全長に対応する DNA を有する複合体を分離することができる。また、夕ッグ分子がアビジン分子である場合、 RNA-DNA 複合体がタツグ分子として有する了ビジン分子を、固相担体上に担持したビォチンと結合させて mRNAの完全長に対応する DNA を有する複合体を分離することもできる。

即ち、本発明の 1つの態様は、 mRNAの完全長に対応する cDNAのライブラリーを作成する方法であって、

mRNAを鐯型とし、 oligo dT等のプライマーより逆転写により RNA-DNA 複合体を形成する工程、 RNA-DNA 複合体を形成している mRNAの 5' Cap (^7MeG _ppp N)サイ卜に存在するジオール構造に、ピオチン分子を結合させる工程、

ピオチン分子を結合した RNA-DNA 複合体を、 1本鎖 RNA を切断する A分解酵素で消化して、 mKNAの完全長に対応しない DNA を有する複合体の 1本鎖 RNA 部を切断することによりこの複合体からピオチン分子を切除する工程、及び

ピオチン分子が結合した mRNAの完全長に対応する DNA を有する複合体を、固相担体上に担持したァビジンと結合させて分離する工程、

を含むことを特徴とする完全長 cDNAライブラリ一の作成方法である。

また、本発明の別の態様は、 mRNAの完全長に対応する cDNAのライブラリーを作成する方法であって、

mRNAを鏵型とし、 oligo dT等のプライマーより逆転写により A-DNA 複合体を形成する工程、

RNA-DNA複合体を形成している mRNAの 5' Cap ( ^MeG _ppp N)サイ卜に存在するジオール構造に、アビジン分子を結合させる工程、

アビジン分子を結合した RNA- DNA 複合体を、 1本鎖 RNA を切断する RNA分解酵素で消化して、 mRNAの完全長に対応しない DNA を有する複合体の 1本鎖 RNA 部を切断することによりこの複合体から了ビジン分子を切除する工程、及び

アビジン分子が結合した mRNAの完全長に対応する DNA を有する複合体を、固相担体上に担持したピオチンと結合させて分離する工程、

前記 1本鎖 RNA を切断する RNA 分解酵素としては、例えば、リボヌクレアーゼ Iを挙げることができる。尚、 RNA- DNA複合体から mRNAの完全長に対応する DNA を有する複合体を選別する方法として、 1本鎖 RNA を切断する RNA 分解酵素を用いる方法以外の方法を利用することもできる。複合体を選別する方法にも特に制限はない。

さらに本発明の方法では、分離された mRNAの完全長に対応する DNA を有する複合体から、 cDNAを回収する。 cDNAの回収は、例えば、分離された mRNAの完全長に対応する DNA を有する複合体に、タバコモザイクウィルスアルカリホスファタ一ゼを反応させることにより行うことができる。また、 cDNAの回収は、分離された mRNAの完全長に対応する DNA を有する複合体に、腿 -■ ハイプリッドを切断する RNase を作用させることにより行うこともできる。 DNA-RNA ハイプリッドを切断する RNase としては、例えば、 RNase H を挙げることができる。

回収された第 1の cDNA鎖を鎳型として、第 2の cDNA鎖を合成し、得られた第 2 の cDNA鎖をクローニングすることにより、完全長 cDNAライブラリーを得ることができる。第 2の cDNA鎖の合成は、例えば、第 1の cDNA鎖の 3'端に RNA または DNA のオリゴマーをライゲージヨンして得られた cDNA鎖を铸型とし、かつライゲ一シヨンしたオリゴマーの相補鎖オリゴマーをプライマーとして行なうことができる。あるいは、第 1の cDNA鎖の 3'端にタ一ミナルヌクレオチドトランスフェラ一ゼを用いてポリ G 、ポリ C 、ポリ A 、又はポリ T を付加した cDNA鎖を铸型とし、各々に相補的なォリゴ C 、ォリゴ G 、ォリゴ T 、又はォリゴ A をプライマーとして、第 2の cDNA鎖の合成を行うこともできる。

即ち、単離された完全長第 1鎖 cDNAより第 2鎖を合成する為に、ターミナルデォキシヌクレオチジルトランスフェラ一ゼによるホモポリマー法（homopolymer 法）や RNA リガーゼによる 1本鎖プライマーを、第 1鎖 CDNA3'端または 5' Cap を除去された mRNAの 5'鎖に付加しポリメラーゼで伸長方法等を用いることができ、第 2鎖を合成する方法も特に制限はない。

本発明によれば、 mRNAの 5' Cap サイトを化学的に修飾を加えることにより、効率良く完全長 cDNAを選択できる。この利点は、修^ iが 5' Cap サイトを認識する為の修飾が酵素反応に全く依存せず、 mRNAの 5' Cap サイト構造に特徴的な diol残基を利用した化学反応に依存する為、バックグラウンドが低くなおかつ非常に高い効率を得るものである。

さらに本発明の方法によれば、 mRNAの 5' Cap サイ卜の化学的修飾を RNA-DNA複合体を形成した後に行うことで、化学的に不安定な mRNAの 5' Cap サイ卜の化学的修飾の際の分解を防止して、完全長 cDNAの合成効率の低下を回避でき、より高い効率で完全長 cDNAを合成できる。

また、本発明の方法では、完全長 cDNAの回収を特異的選択性の高い RNase ONE 処理ピオチンーァビジン反応等を利用した固相化系で行うことができるため、量産的ロボティックスによるライブラリー生産をも可能にする。実施例

以下、本発明を実施例によりさらに説明する。

実施例 1

本実施例は図 3〜4にァゥトラインを示す工程からなる。本法は次の 7つのェ程よりなる。

①第 1の cDNA鎖の合成（RNA- DNA複合体の合成）

©RNA-DNA複合体の mRNAのジオール基のビォチン化

③リボヌクレアーゼ I (RNase I) 消化

④完全長 cDNA複合体の捕獲（アビジンビーズ使用）

⑤ RNase H 消化（ァビジンビーズからの分離）

⑥ターミナルデォキシヌクレオチジル転写酵素による G末端の付カロ

⑦オリゴ Cでプライマした第 2鎖合成

RNA調製

脳 0. 5〜lgの組織片を 10mlの懸濁液でホモジヱナイズし、 pH4. 0 の 2M 酢酸ナトリウム lml と、同量のフエノール/ クロ口ホルム（体積比 5 : 1)混液を加え抽出した。抽出後水層に同量のイソプロパノールを加えると、 RNA が水相から分離沈澱した。この試料を氷の上で 1時間ィンキュベーシヨンした後、 15分間 4000rpm で冷却遠心機にかけ、沈澱物を回収した。この検体を 70%エタノールで洗い、 8ml の水に溶解後 2tnl の 5丽 aCl、 1 %CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)、 4M尿素、 50mMTrisを含む pH7. 0 の水溶液 16mlを加えることで RNA を沈澱させ、ポリサッカライドを除いた（CTAB 沈澱）。続いて室温で 4000rpm、 15分間遠心機にかけ、 RNA を 4ml の 7M グァニジン—C1に溶解した。そして 2倍量のエタノールを加えた後、氷上で 1時間インキュベーションし、 15分間 4000rpm 遠心機にかけ、生じた沈澱物を 70%エタノールで洗い RNA を回収した、これを再度水に溶解し、 RNA の純度を 0D比 260/280 1. 8) と 230/260 (く 0. 45)を読むことによって計測した。

第 1鎖 cDNAの調製 (図 2ステツプ①）

15 g の mRNAを使って Superscript II (Gibco BRL) 3000unit により、最終容量 165 β ϊ の反応液中で、 5-メチル - dCTP、 dATP、 dTTP、 dGTP各々 0. 54mM、 50mM Tris-HCl (pH8. 3 ) 、 75mM KC1、 3mM MgCl ₂ 、 lOmM DTTヽ 52ng/ 〃1 BSA ヽ RNase インヒビター 5 unit の条件下で逆転写反応を行った。 Xho I の認識配列を含むォリゴヌクレオチド 3 '

匪 TTTTTTTTTTTTGAGCTCTGAATCAAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG5'

(N : どの核酸塩基でも可、 M : G 、 A 、 C のいづれか） 12. 6 1 をプライマーとして用いた。この反応を始める際、反応液の 1/4 を採取し、それに 1. 5 β \ の

[ α 32Ρ ] - dGTP (3000Ci/mmol 、 10 Ci/ \ 、 Amersham) を加えるこことにより、第 1鎖 cDNAの合成効率を測定した。 RI標識した反応液の 0. 5 μ ΐ を DE-81 ペーパー上にスポットし、 0. 5Μリン酸ナ卜リゥム緩衝液（ρΗ7. 0 ) で 3 回洗った前後の ΚΙ活性を測定し、計算した。その後、 RI標識した反応液と非標識の反応液を混合し、 0. 5Μ EDTA 8 1 、 10% SDS 2 、プロティナーゼ

(Proteinase) K 20 を加え、 45°Cで 15分間加熱した。フヱノール Zクロロホルムによる抽出、エタノール沈澱後、沈澱を RNase フリーに処理してある水（以下 RNase フリー水とする） 47 1 に溶解した。

RNA ジオールのピオチン化 (図 2ステップ②）

RNA のジオール部位（Cap構造のある 5 ' 末端と、ポリ A鎖のある 3 ' 末端のリボースの双方に存在）にピオチンを結合させるために、 2段階の反応を行った。それらは、ジオール基の酸化とそれに続くピオチンヒドラジ卜と酸化 RNA体の力ップリング反応である。

まず、逆転写反応で得られた RNA-第 1鎖 cDNA複合体 15 μ を、 6. 6mM 酢酸ナトリゥム緩衝液（pH4. 5 ) と、酸化剤として過ヨウ素酸ナトリゥムを用いて 50〃1 の反応液中で処理する。この酸化反応は遮光条件の元、氷上で 45分間行う。続いて、 5M塩化ナトリウム 11 1 、 10%SDS 0. 5 / 1 、そして同量のイソプロパノールを加え、 60分間氷上に放置した後、 4 でで 15分間 15000rpm遠心し沈澱させる。沈澱物は 70%エタノールで洗い、 RNase フリー水 50〃1 に再溶解させる。その試料に 1M酢酸ナトリウム（pH6. 1 ) 5 U 、 10%SDS 5 1 、 10mMピオチンヒドラジド（Sigma 社） 150 μ ΐ を加え、室温（22-26 °C ) で終夜反応させる。最後に、 5M NaCl 5 〃1 、 1M酢酸ナトリウム（pH6. 1 ) 75〃1 、および 2. 5 倍量のエタノ

—ルを加え、 1 時間の氷上冷却後、 4 °Cにおいて 15分間遠心し、ピオチン化した RNA-DNA複合体を再沈澱させる。沈澱物は 70%エタノールで 1回、更に 80 %エタノールで 1回洗い、 KNase フリー水 70 1 に溶解する。

ENase Iによる完全長 cDNAの選択 (図 2ステップ③）

1 本鎖 RNA を消化する RNase Iで処理することにより、逆転写反応時に完全な cDNAの伸長が得られなかった mRNA、および mRNAの 3 ' 末端に標識されたピオチン残基を取り除いた。具体的には、ピオチン化反応で得られた試料 70 1 に 10 X RNase Iバッファー（lOOmM Tris-HCl (pH7. 5)、 50mM EDTA 、 2M NaOAc) 10〃 1 、 RNase I (RNase One ^TM : Promega社） 200unit を加えて、 37°Cで 15分間 1本鎖 RNA を消化した。

完全長 cDNAの採取 (図 2 ステップ④⑤）

アビジンコートしたマグネティックビーズに cDNAが非特異的吸着するのを防止するため、 100 βもの酵母 tRNA (DNase I処理したもの）を 5mg (500 〃1 ) のマク不アイックヒーズ (magnetic porous glass (ΜΡυ particles coated with streptavidin (CPG, NJ) ) に加え、 1 時間氷上に放置した後、 50mM EDTA 、 2MNaClの溶液にて洗った。このビーズを 50mM EDTA 、 2M NaCl の溶液 500 μ ΐ 中に懸濁し、 RNase I処理を施された cDNAを加えた。室温にて 30分間撹拌することで、マグネティックビーズと完全長 cDNAを結合させた。完全長 cDNAを捕獲したビーズを 50mM EDTA 、 2M NaCl の溶液で 4 回、 0. 4 % SDS、 50 μ g/ μ ΐ 酵母 tRNAで 1 回、 10mM NaCl 、 0. 2raM EDTA, lOmM Tris-HCl (pH7. 5 ) 、 20% グリセロールで 1 回、 50 ^/ 1 酵母 tRNA水溶液で 1 回、 ase H バッファー（20mM

Tris-HCl (pH7. 5) . lOmM MgCl ₂ 、 20mM KC1 、 0. ImM EDTAヽ 0. ImM DTT ) で 1 回洗浄した後、 RNase Hノくッファー 100 / 1 に懸濁し、 RNase H 3 unitを加え、 37。C 下 30分間加温した。その後、 10% SDS 1 1 、 0. 5M EDTA 2 μ ΐ を加えて、 10分間、 65°Cに曝し、その上清を回収した。このようにして回収された 1 本鎖完全長 cDNA はフエノール/クロ口ホルムで抽出され、スピードバッグにて液量を 100 1 以下に減じてから G25/G100 Sephadex クロマトグラフィーに付した。 RI活性を持つた分画はシリコン処理したマイクロチューブに収集するとともに、グリコーゲン 2 〃g を加え、エタノ一ル沈澱にて得られた沈澱物を 30〃 1 の超純水に溶解した。

1本鎖 cDNAへのォリゴ dG付加 (図 2 ステップ⑥）上記により回収された 1本鎖 cDNA30 1 は、最終容量 50 / 1 の反応液中で、 200 mMカコジル酸ナ卜リゥム（pH6. 9 ) 、 Im MgCl ₂、 ImM CoCl ₂ 、 ImM 2-メルカプトエタフール、 100 M dGTPの条件のもと、ターミナルデォキシヌクレオチジルトランスフヱラ一ゼ（TaKaRa社） 32 unit を用いて 37°Cで 30分間のオリゴ dG付カロ反応に付された。反応終了時に EDTAを 50mMとなるように加え、一連のフヱノール Zクロ口ホルムによる抽出、エタノール沈澱を経て、 31 1 の超純水に溶解した。

第 2鎖 cDNA合成 (図 2 ステップ⑦）

第 1鎖 cDNAを铸型にした第 2鎖 cDNAの合成は以下のように行った。最終容量 60 \ の反応系で、第 2鎖低バッファー（200mM Tris- HC1 (pH8. 75) 、 lOOmM KCl 、 lOOmM (NH ₄) ₂S0₄、 20mM MgS0₄、 1% Triton X - 100 、 lmg/ μ 1BSA) 3 //、第 2鎖高バッファ一 (200mM Tris-HCl (pH9. 2)、 600mM KCl 、 20mM MgCl ₂) 3〃1 、 dCTP、 dATP、 dTTP、 dGTP各々 0. 25mM、 ^ - NADH 6 μ ΐ , オリゴ dG付加された第 1 鎖 cDNA31 1 、第 2鎖プライマ一- ァダプタ一：

5 ' GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCTCACTAGTCCCCCCCCCCC3' (Sac I および Spe I の認識配列を含む） 600ng を加え、 Ex Taq DNAポリメラ一ゼ（TaKaRa Ex Taq ： TaKaRa社） 15 unitヽ耐熱性 DNA リガ—ゼ（Ampligase : Epicentre) 150 unit 、耐熱性 RNase H (Hybridase ： Epicentre ) 3 unit によって第 2鎖 cDNAを合成した。 0. 5M EDTA を 1 / 1 加えることで反応を停止させ、更に蛋白成分を溶解するために、 10% SDS 1 〃1 、プロティナ一ゼ（Proteinase) K 10 〃g の存在下に 45°Cで 15分間加熱し、最終的にフヱノール Zクロ口ホルムによる抽出、エタノール沈澱にて精製した 2本鎖完全長 cDNAを得た。

以上の方法により得られた二本鎖完全長 cDNAから、 λ ΖΡΑΙΙ (STRATAGENE)を用いてライブラリ一を得た。クローニングの為の packaging lysateは GIGAPAK Glod (ST TAGENE)を用いて常法により行った。その結果、 15 g の mRNAより 2. 5 X 10⁷ ケの組み換え体ファ―ジを得た。ランダムにピックァップ後、常法により、 in vivo excison によりプラスミドクローンに変換し、ライブラリーの揷入 cDNAの長さをァガロースゲル電気泳動で測定し、集計した。その結果を表 1に示す。

表 1の結果及び下記の表 2の結果（特願平 8— 6 0 4 5 9号の方法（前法）により得たライブラリーの評価結果、後述の比較例 1 ) とを比較すると、本発明の方法により得られた cDNAの平均鎖長が前法と比較して有意に増加しているばかりでなく、フラグメントサイズが 5 0 0 0を超える長鎖のクローン数が 2倍以上に増加している。このことは、本発明の方法が、長鎖かつ完全長の cDNAを得るという観点から、前法より遙に優れていることを示すものである。

表 1 揷入平均長： 1 8 1 0 b p フ ,

ノノノゲ Z ノ k 1 廿ソノノ u ノ女乂 ^ノ k！^

揷人なし 7 0

0 5 0 0 8 0. 8

1 0 0 0 2 8 9 2 9. 7

1 5 0 0 2 3 2 2 3. 8

2 0 0 0 1 5 2 1 5. 6

2 5 0 0 1 1 0 1 1. 3

3 0 0 0 4 1 4. 2

3 5 0 0 3 7 3. 8

4 0 0 0 3 4 3. 5

4 5 0 0 1 4 1.

5 0 0 0 1 8 1. 8

5 5 0 0 1 3 1. 3

6 0 0 0 6 0. 6

6 5 0 0 8 0. 8

7 0 0 0 6 0. 6

> 7 0 0 0 6 0. 6

口 p 1 1 0 4 4 1 0 0. 0

表 2 挿入平均長： 1 6 0 2 b p フラグメントサイズノノ安乂ヽノ k

Q

挿入なし 0 -

0〜 5 0 0 7

I U · Ο

〜1 0 0 0 0 L Q 0 0 0. U

〜 1 5 0 0 A o

6 4 U L 0. Ο

A 1

〜2 0 0 0 1

丄 4 1

丄丄 0. 0

〜 9 U U Q

o 丄 Q 1

〜 3 0 0 0 4 u π

π o Ο Ω

U U Π Q 0 L . 0

〜4 0 0 0 2 5 2. 8

〜4 5 0 0 1 1 1. 2

〜 5 0 0 0 1 4 1. 6

〜5 5 0 0 5 0. 6

〜6 0 0 0 2 0. 2

〜6 5 0 0 1 0. 1

〜 7 0 0 0 2 0. 2

> 7 0 0 0 2 0. 2

口計 9 8 7 1 0 0. 0

比較例 1

実施例 1と同様にして得た mRNAを用い、特願平 8— 6 0 4 5 9号の方法（前法）により得た二本鎖完全長 cDNAのライブラリ一について、実施例 1と同様の方法で揷入 cDNAの長さをァガロースゲル電気泳動で測定し、集計した。その結果を上記表 2に示す。尚、二本鎖完全長 cDNAは以下の方法により調製した。

mRNA-cDNA複合体の合成

10 g の mRNAを使って Superscript II (Gibco BRL)の 2000unitにより、 0.5mM 5-methyl-dCTP 、 lmM dATP、 ImM dTTP、 lmM dGTPの存在化で、 100 μΐ バッファ一 (50raM Tris-HCl, 75mM KC1, 3mM MgCl₂, lOmM DTT) の中で逆転写反応を行なつた。プライマ一として、 5 zg のオリゴヌクレオチド

3'匪 TTTTTTTTTTTTGAGCTCTGAATCAAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG5' (N：どの核酸塩基でも可、 M:G 力、 A 力、 C ) を用いた。反応は 42° (、 45分間行い、続いて反応液を 50°Cで 20分ィンキュベーションして mRNA-cDNA複合体を合成した。

上記反応後、即座にサンプルを氷上に移した。次いで 4 ill の 0.5M EDTA 、 8 μΐ の 5Μ NaCl 及び 163 μΐ の Η₂0(最終容量が 200 μΐ になるように）をサンプルに添加した。攪拌及び軽く遠心した後、混合物を 1.5ml のエツペンドルフ管に移し、 100 μ ΐ のフヱノール/卜リス及び 100 μ \ のクロ口ホルムを添加した。攪拌し、 2分間氷上で冷却した後、 15, 000rpm で 3 分間遠心分離した。水相を除去した後、新たなエツペンドルフ管に移した。次いで、 100 μ ΐ のクロ口ホルムを添加し、攪拌し、 2分間氷上で冷却した後、 15，000rpm で 3 分間遠心分離した。水相を除去した後、新たなエツペンドルフ管に移した。 500 μ ΐ の 100%エタノールを添加し、攪拌し、少なくとも 10分間氷上で冷却した。次いで少なくとも 10分間 16000rpmで遠心分離した。ついで、 70%及び 80% エタノールで 2 回洗浄した。殆どの放射性ヌクレオチドが除去されたことを、上澄液のガイガーカウンターによる測定で確認した。得られたぺレットを 47 1 の水に懸濁した。

この反応を始める際、 20 の反応液を採取し、それに 1 の [ ひ-³² P] -dGTP(3000Ci/mmoU 10 ^ Ci/ β \ 、 Amersham) を加えることにより、第 1の cDNA 鎖の合成効率を測定した。 RI標識したの反応液中 0. 5 β ΐ を DE - 81 ペーパー上にスポットし、 ρΗ7. 0 の 0. 5Μ -リン酸ナトリゥムで 3回洗った前後の RI活性を測定し計算した。

RNA のジオール部位へのピオチンの結合

mRNA-cDNA複合体の mRNAのジオール部位（1方は CAP 、他方は RNA の 3'端）にピオチンを結合させる為に、 2段階の反応を行った。即ち、ジオール基の酸化とそれに続くピオチンヒドラジド（Sigma社）と酸化 A 体のカツプリング反応であ。

上記工程で得られた 47 μ 1 の水に懸濁した mENA-cDNA複合体（1. 5ml のェッぺンドルフ管中）に、 pH4. 5 の 66mM酢酸ナトリゥム緩衝液 3. 3 μ ΐ と酸化剤としての 0. 2 Μ 過ヨウ素酸ナトリウム 1. 290 μ ΐ を添加し、攪拌後、遮光条件の下、氷の上で 45分間酸化反応を行った。

続いて、 11 1 の 5Μ塩化ナトリウム、 0. 5 β \ の 10%SDS、 6 1 のイソプロパノールを加え、氷上で 30分間インキュベーションした後、 10〜20分間遠心分離した。この間に 10mMビォチンヒドラジン（long arm)水溶液 (3. 7mg/lml) を調製した。

遠心分離で生成した沈澱物を 80% エタノール 200 β \ で洗い、水に再溶解させた。その試料に pH6. 1 の 1M酢酸ナトリウム 5 μ \ 、 10%SDS 5 / 1 、更に 10mMピオチンヒドラジン水溶液 0 μ \ を加えた。試料は氷上で 1 時間インキュベーシヨンし、 20分間遠心し、 70% エタノールで 2回洗った。最後に適当量の水に再懸濁し、次の工程の材料として用いた。

完全長 cDNAの RNase 保護

どのような塩基の箇所でも 1本鎖 ENA を消化することが可能な RNase 0NET™ (Promega社）で処理することにより、逆転写によって完全に cDNAが伸長されなかつた mRNA、および mKNAの 3'末端に標識されたビォチン残基を取り除いた。具体的には mRNA cDNA複合体の合成の際、 RI標識された反応液 20 / 1 と非標識の 80 1 分を一緒にプールした後、の RNase I ノくッファー、 355 β ΐ の水、そして 50unitの RNase I を使って試料を 30分間 30°Cでインキュベーションした。

完全長 cDNAの採取

アビジンコートしたマグネティックビーズへの非特異的吸着を防止する為、 2. 5mg の酵母 tRNA(DNase Iで前処理した）を加え、 500 μ ϊ に調製し 1時間氷上でインキュベーションした。 RNase I で処理した cDNAを上記の前処理されたビーズに加え、 pH8. 0 の 0. 25M- EDTA、 0. 5M- NaCl を含むバッファ一中、磁気を帯びたビーズが沈澱しないよう、 15分間室温で時折振り混ぜながらィンキュベーシヨンした。その後ビーズを pH8. 0 0. 5M- EDTAで 4回、 0. 4 %SDS で 1回、その後、ヌクレアーゼフリーの水で 3回洗浄した。試料を 100 μ ΐ の KNaseHバッファーの中で 37°Cで 30分間 2 unitの RNaseHで処理後、 0. 1%の SDS と共にビーズをインキュべ —シヨンすることによりビーズから完全長 cDNAを分離した。不完全な RNaseH処理の為ビーズから離れない cDNAに関しては、更に _PH9. 0 、 65°Cで 10分間

Tris - Formate バッファ一の中でアル力リ加水分解を行うことにより回収できる。回収された完全長 1本鎖 cDNAはフヱノ一ル Zクロロホルムで一度抽出され、 G25/G50 sephadexク口マトグラフィ一に付された。 RI活性を持ったフラクシヨンは表面をシリコン処理したエツペンドルフチューブに集めて、試料を真空で引くことによって 10 1 にまで減じた。

1本鎖 cDNAの oligo dG ティリング

上記により回収された 1本鎖 cDNAに oligo dG を付加する為、 pH6. 9 の 200mM-NaCacodylate, ImM MgCl ₂ 、 ImM CoCl ₂ 、 ImM 2 -メルカプトエタノール、 100 MdGTP の 50〃1 バッファー下で 37。C30分間 32unitのターミナルデォキシヌクレオチジルトランスフヱラ一ゼ (Takara社）を用い反応させた。 EDTAを最終濃度が 50mMになるように加え、フエノール/クロ口ホルムで抽出後、 G25/G100 クロマトグラフィ一に付された。回収された dGティリング cDNA は真空吸引によつてサンプルチューブ内で 30 1 まで減じた。

第 2鎖 cDNA合成

6 μ ΐ の第 2鎖低バッファー（ρΗ8. 75 の 200mM Tris - Cl、 lOOmM KC1 、 lOOmM (NH₄) ₂S0₄、 20mM MgS0₄、 1% Triton X100、 lmg/mlBSA)、そして 3 β \ の第 2鎖高バッファ一（ρΗ9· 2 の 200mM Tris - Cl、 600mM KC1 、 20mM MgCl ₂) と Saclおよび Spelの制限酵素の認識配列を含む第 2鎖ブライマ一アダプタ―

(5' GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCTCACTAGTCCCCCCCCCCC3' ) 600ng、 0. 25mMの dNTP' S、 15unitの ExTaq ポリメラ一ゼ（Takara社）、 150 unitのアンプリガーゼ、耐熱性 DNAリガーゼ（Epicentre社）、 3 unitのハイブリダ一ゼ、耐熱性 RNase H (Epicentre 社）を加え、 oligo dG-ティルド第 1鎖 cDNAを含む最終容量 60 μ 1 の液に調製した。この反応液を 55°Cで 5分間、続いて 0. 3 °CZ分の割合で 55°Cから 35°Cまで徐々に温度を下げ、 15分間 35°C、次に 15分間 72°Cでサ一マルサイクラ —で温度をコントロールし反応させた。アニーリング/伸長は、 35°Cで 1 時間と 65°Cで 30分間、試料を 1回ィンキュベーションすることによって繰り返された。最後に試料をフヱノール/ クロ口ホルムで抽出し、エタノール沈澱に付して、二本鎖 cDNAを回収した。得られた二本鎖くについて、実施例 1と同様にして、挿入 cDNAの鎖長を測定した。実施例 2

本実施例では、 RNA-DNA ハイプリッド構造が、 mRNAをタツグ分子で標識するために必要なジオール構造のアルデヒド化の際に生じる tnRNAの化学的切断を阻止でき、その結果、完全長 cDNAの合成効率を高めることができることを示すため、以下のレーン 1〜4 の 4種の異なる工程を経て得られた RNA- DNA複合体を変性ァガロース泳動後のオートラジオグラフの結果を図 5に示す（尚、サイズマーカ一は A Hind IIIである）。図 5に示す結果において、レーン 1と 2 とを比較すると、レーン 1の方がレ一ン 2より長鎖のものが多く、予め cDNA合成により形成した RNA-DNAハイプリッド構造によって mRNAの化学的切断が阻止されていることが分かる。さらに、レーン 3と 4 とを比較すると、レーン 3の方がレーン 4より長鎖のものが多く、予め cDNA合成により形成した RNA-DNA ハイプリッド構造によって mRNAの化学的切断が阻止されていることが分かる。

〔レーン 1〕 lO^gmRNA→0)cDNA合成 ( [α -³²P] dGTPで標識） —②ピオチン化—③ァビジンビーズで完全長のもののみ捕捉—変性ァガロース泳動

〔レーン 2〕 ΙΟ ^gmRNA—②ピオチン化→0)cDNA合成（ [α—³² P] dGTPで標識） →③ァビジンビーズで完全長のもののみ捕捉—変性ァガロース泳動

〔レーン 3〕 5 gmRNA →( cDNA合成（ [α— ³² P] dGTPで標識） —②ピオチン化—変性ァガロース泳動

〔レーン 4〕 5 β mRNA—②ピオチン化→0)cDNA合成 ( [a -^3ZP] dGTPで標識） →変性ァガロース泳動

具体的な方法及び条件を以下に示す。

〔レーン 1〕

①第 1鎖 cDNA合成： [a— ³²P] dGTPで標識

[l]mRNA 10

プライマ一 8.4 ^g

M [1] と [2] を加えて最終 100 μ\ となる量

[2] 5 X第一鎖ノくッファー（GIBCO BRL) 18.18 μ 1

0.1M DTT 9.09 μ\

lOmM dNTP mix* 5.91 μΐ

[α ^3ΖΡ] dGTP (10/ Ci/ μΐ) 1.0 βΐ

RNase インヒビター（25000U/ml) 0.91 μΐ

Superscript ™ΙΙ RNase Η 逆転写酵素 (200U/ 1) (GIBCQ BRL) 10.0 μ\

計 100 β\

*5 - methy卜 dCTP、 dATPヽ dTTPヽ dGTPヽ各々 10mMから成る。

[1] を 65°Cにて 10分間、熱変性後、直ちに氷上に移動させた。

次いで、 [1] と [2] をアニーリング温度 35°Cで 1 分間インキュベートしてから、混合する。反応後フヱノ一ル Zクロ口ホルムによる抽出、エタノール沈澱を経て、 47〃1 RNase フリーの水に溶解した。

② RNAジオールのピオチン化

(a) ジオールの酸化

(1) 上記で得られたサンプル 47^1

1M NaOAc (pH4.5) 3.3 / 1

0.2M NaI0₄ 1.29 /1

喑所、氷上にて 45分間放置する。

(2) 5M NaCl 11 μΐ

10%SDS 0.5 il

イソプロパノール 61 \

を加え、 30分間 4 °Cにおいてインキュベートした後、 15000rpm 、 15分間（4 °C) の遠心にて得られた沈澱を 70% エタノールにて 2回リンスし、 50 1 RNase フリ一の水に溶解した。

(b) ピオチン化

(DIM NaOAc (pH6.1) 5 μ\

10%SDS 5 β\

10mM ピオチンヒドラジド（Sigma) 150 1

を加え、室温にて終夜反応させた。

(2)1M NaOAc (pH6.1) 75 /1

5M NaCl 5 zl

エタノール 750 /1

を加え、氷上にて 1 時間放置後、 15000rpm、 15分間（4 °C) 遠心し、沈澱を 70% エタノールにて 2回リンスした。最終的に 70〃1 RNase フリーの水に溶解した。 ③ストレブトアビジンビーズを用いた完全長 cDNAの捕獲

(a) 完全長 cDNAの選択

上記で得られたサンプル 70〃1

lO RNase I バッファ一 10 1

RNase One ™(Promega) (10U// 1) 2Q 1

計 100 β\

37°C, 15分間ィンキュベ一シヨンした。

(b) ストレブ卜アビジンビーズによる完全長 cDNAの捕獲

(1) ストレプトアビジンビーズ（MPG)とビォチン化 RNA- DNAの結合

ス卜レプトアビジン被覆磁性多孔質ガラス（Magnetic porous glass (MPG))

(CPG, NJ) (lmg/ml) 500 /1

ビォチン化 RNA-第 1鎖 cDNA 100 μ 1

室温で 30分間撹拌した。

(2) MPGの洗浄

[l]50mM EDTAヽ 2M NaCl の溶液で 4 回

[2] 0.4% SDS、酵母 tRNAの溶液で 1 回

[3] lOmM NaCl、 0.2mM EDTAヽ 10mM Tris- HCl(pH7.5)、

20% グリセロールで 1 回

[4] 50 Hg/ μ\ 酵母 t A水溶液で 1 回

[5] RNase Hバッファー (20mM Tris- HCl(pH7.5)、 lOtnM MgCl₂、

20mM C 0. IraM EDTAヽ 0. ImM DTT ) で 1 回

(3) RNase Hによる完全長 cDNAの回収

[1] RNase Hパヽソファー 100〃1

RNase H 3unit

を洗浄した MPG に加え、 37°C下 30分間加温した。

[2] 10% SDS \μ\

0.5Μ EDTA 2 μ 1

を加え、 10分間、 65°Cし、上清を回収した。

(c) 上清をフエノール Zクロ口ホルムによる抽出、エタノール沈澱にて精製した _c 〔レーン 2 〕

① RNAジオールのピオチン化

(a) ジオールの酸化

(DmRNA (10 /g) 47〃1

1 NaOAc (pH4.5) 3.3 1

0.2M NaI0₄ 1.29/ 1

暗所、氷上にて 45分間放置する。

(2)5M NaCl 11 \

イソプロパノール 61 μΐ

を加え、 30分間 4 °Cにおいてインキュベートした後、 15000rpm、 15分間（4 °C) の遠心にて得られた沈澱を 70% エタノールにて 2回リンスし、 50〃1 RNase フリ一の水に溶角罕した。

(b) ピオチン化

(DIM NaOAc (pH6.1) 5μ1

10%SDS 5βΙ

lOtnM ピオチンヒドラジド（Sigma) 150〃1

を加え、室温にて終夜反応させる。

(2)1M NaOAc (pH6.1) 75 β\

エタノール 750/U

を加え、氷上にて 1 時間放置後、 15000rpm、 15分間（4 °C) 遠心し、沈澱を 70% エタノールにて 2回リンスした。最終的に RNase フリーの水に溶解した。

②第 1鎖 cDNA合成： [ α - ³² P ] dGTPで標識

[1] ピオチン化 mRNA 5〃g

プライマー 8.4 g

Dff [1] と [2] を加えて最終 100 βΐ となる量

[2] 5 X第一鎖くッファー（GIBCO BRL) 18.18 μ 1

BSA (2.5/^/ ^) 2.21 \

[a- ³²P] dGTP (10 iCi/ μϊ 1.0 β\

RNase インヒビター（25000U/ml) 0.91 1

Superscript ™II RNase H -逆転写酵素

(2Q0U///1) (GIBCO BRL) 10.0 μΐ

計 100 μ 1

*5- methyl- dCTP、 dATPヽ dTTPヽ dGTPヽ各々 lOmMから成る。

次いで、 [1] と [2] をアニーリング温度 35°Cで 1 分間インキュベートしてから、混合した。

③ストレプトァビジンビーズを用 L、た完全長 cDNAの捕獲

(a) 完全長 cDNAの選択

上記で得られたサンプル 100〃1

10 X RNase I バッファ一 50 1

RNase One ™ (Promega ) (10}/ μΐ) ul

OT 345 μ 1

計 500 μ 1

30°C,30 分間インキュベーションした。

(b) ストレブ卜ァビジンビーズによる完全長 cDNAの捕獲

(1) ストレプトアビジンビーズ（MPG)とビォチン化 RNA- DNA の結合

ストレプトアビジン被覆磁性多孔質ガラス（Magnetic porous glass (MPG))

(CPG, NJ) (lmg/ml) 500〃1

上記で得られたサンプル 500 1

室温で 30分間撹拌した。

(2) MPGの洗浄

[l]50mM EDTAヽ 2M NaCl の溶液で 4 回

[2] 0.4% SDS、

酵母 tRNAの溶液で 1 回 [3] lOmM NaCl、 0.2mM EDTAヽ lOmM Tris- HCl(pH7.5)、

20% グリセロールで 1 回

[4] 50 Ug/ μΐ 酵母 tRNA水溶液で 1 回

[5]RNase H バッファー (20mM Tris- HCl(pH7.5)、 lOmM MgCl₂、

20mM KC1、 0. ImM EDTAヽ 0. ImM DTT ) で 1 回

(3)RNase Hによる完全長 cDNAの回収

[URNase H バッファ一 100〃1

RNase H 3unit

を洗浄した MPG に加え、 37°C下 30分間加温した。

[2] 10% SDS Ιμΐ

0.5Μ EDTA 2 β 1

を加え、 10分間、 65°Cし、上清を回収した。

(c) 上清をフエノール Zクロ口ホルムによる抽出、エタノール沈澱にて精製した。〔レーン 3〕

①第 1鎖 cDNA合成： [α-³²Ρ] dGTPで標識

[1] mRNA 5 ig

プライマ一 8.4 /g

Dff [1] と [2] を加えて最終 100 μ\ となる量

[2] 5Χ第一鎖バッファー (GIBCO BRL) 18.18〃1

0.1M DTT 9.09 μΐ

lOmM dNTP mix* 5.91 μΐ

[α-32Ρ] dGTP (10 Ci/ β\) 1.0〃1

RNase インヒビター（25000U/ml) 0.91 μΐ

Superscript ™ΙΙ RNase Η -逆転写酵素

(20QU/ /1) (GIBCO BRL) 10.0 μΐ

計 100 μ 1

*5 - methyl- dCTP、 dATPヽ dTTPヽ dGTPヽ各々 10mMから成る。 [1] を 65 Cにて 10分間、熱変性後、直ちに氷上に移動させた。

次いで、 [1] と [2] をァ二一リング温度 35。Cで 1 分間インキュベートしてから、混合した。反応後フノール Zクロ口ホルムによる抽出、エタノール沈澱を経て、

47 β lRNase フリ一の水に溶解した。

② RNA ジオールのピオチン化

(a) ジオールの酸ィ匕

(1) 上記で得られたサンプル

1M NaOAc (pH4. 5) 3. 3 ΐ

0. 2M NaI0₄ 1. 29 1

暗所、氷上にて 45分間放置する ₍

(2) 5M NaCl

難 DS 0. 5 l

ィソプロパノ一ル 61 μ ΐ

を加え、 30分間 4 °Cにおいてィンキュベートした後、 15000rpm 、 15分間（4 °C) の遠心にて得られた沈澱を 70% エタノールにて 2回リンスし、 50〃1 RNase フリ一の水に溶解した。

(b) ピオチン化

(D IM NaOAc (pH6. 1) 5 1

10%SDS 5 1

lOmM ピオチンヒドラジド（Sigma) 150 μ \

を加え、室温にて終夜反応させる。

(2) 1M NaOAc (pH6. 1) 75 1

5M NaCl 5 / 1

エタノール 750

を加え、氷上にて 1 時間放置後、 15000rpm、 15分間（4 °C) 遠心し、沈澱を 70% エタノールにて 2回リンスした。最終的に 70 / 1 RNase フリーの水に溶解した。 ③ストレプトアビジンビーズを用いた完全長 cDNAの捕獲

(a) 完全長 cDNAの選択

上記で得られたサンプル 70〃 1 lOxRNase I バッファー 10

RNase One ™ (Promega) (1QU/^1) 20^1

計 100 1

37°C, 15分間インキュベーションした。

(b) ストレプトアビジンビーズによる完全長 cDNAの捕獲

(1) ストレプトアビジンビーズ（MPG)とビォチン化 RNA-DNA の結合

(CPG, NJ) (1 mg/ml) 500 μ\

ピオチン化 RNA-第 1鎖 cDNA 100 β\

室温で 30分間撹拌した。

(2) MPGの洗浄

[l]50mM EDTAヽ 2M NaCl の溶液で 4 回

[2]0.4% SDS、 50/ g// l 酵母 tRNAの溶液で 1 回

[3] lOmM NaCl、 0.2mM EDTA, lOmM Tris- HCl(pH7.5)、

20% グリセロールで 1 回

[4] 50 β / i 酵母 tRNA水溶液で 1 回

[5] RNase H バッファー（20mM Tris- HCl(pH7.5)、 lOmM MgCl₂、

20mM KC1、 0. ImM EDTA, 0. Im DTT ) で 1 回

(3) RNase Hによる完全長 cDNAの回収

[1] RNase H バッファー 100 / 1

RNase H 3unit

を洗浄した MPG に加え、 37°C下 30分間加温した。

[2110% SDS \μ\

0.5Μ EDTA 2 β 1

を加え、 10分間、 65°Cし、上清を回収した。

(a) ジオールの酸ィ匕

(DmRNA (5 g) 47 μ\

1Μ NaOAc (pH4.5) 3.3 βΐ

0.2M NaI0₄ 1.29/^1

暗所、氷上にて 45分間放置する。

(2)5M NaCl 11〃1

10%SDS O. μΐ

イソプロパノール 61 1

を加え、 30分間 4 °Cにおいてインキュベートした後、 15000rpm、 15分間（4 °C) の遠心にて得られた沈澱を 70% エタノールにて 2回リンスし、 50〃1 RNase フリ一の水に溶解した。

(b) ピオチン化

[1]1M NaOAc (pH6.1) 5 1

lOmM ピオチンヒドラジド（Sigma) 150 / 1

を加え、室温にて終夜反応させる。

[2] 1M NaOAc (pH6.1) 75^1

5M NaCl 5 β\

エタノール 750 1

②第 1鎖 cDNA合成： [ α - ^{3 Z}P] dGTPで標識

[1] ピオチン化 mRNA 5 μも

プライマー 8.4

m [1] と [2] を加えて最終 loo β\ となる量

[2] 5 X第一鎖ノくッファー（GIBCO B L) 18.18 μ 1

0.1M DTT 9.09 β\

lOmM dNTP mix* 5.91/ l BSA (2. 2.27 μ\

[a -32?] dGTP (10 Ci/ μΐ) 1.0 μΐ

RNase インヒビター（25000U/ml) 0.91 /1

Superscript ™II RNase H 逆転写酵素

(2QQU/ 1) (GIBCO BRL) 10.0 μΐ

計 100 μ 1

*5- methyl- dCTP、 dATP、 dTTPヽ dGTPヽ各々 lOmMから成る。

③ストレプトアビジンビーズを用いた完全長 cDNAの捕獲

(a) 完全長 cDNAの選択

上記で得られたサンプル 100 μΐ

10 X RNase I バッファ一 50 βΐ

RNase One ™ (Promega ) (10U/ 1) 5 μΐ

D 345^1

計 500 μ 1

30°C,30 分間インキュベーションした。

(b) ストレプトアビジンビーズによる完全長 cDNAの捕獲

ス卜レプトアビジン被覆磁性多孔質ガラス（Magnetic porous glass (MPG)) (CPG, NJ) (lmg/ml) 500 μ\

上記で得られたサンプル 500 μΐ

室温で 30分間撹拌した。

(2) MPGの洗浄

[l]50mM EDTAヽ 2M NaCl の溶液で 4 回

[2] 0.4% SDS、酵母 tRNAの溶液で 1 回

[3]腿 NaCl、 0.2mM EDTAヽ lOmM Tris- HCl(pH7.5)、

20% グリセロールで 1 回 [4] 50 μ / μΛ 酵母 tRNA水溶液で 1 回

[5] RNase H バッファ一 (20mM Tris- HCl (pH7. 5)、 lOmM MgCl ₂、

20mM KC1、 0. ImM EDTAヽ 0. lmM DTT ) で 1 回

(3)RNase Hによる完全長 cDNAの回収

Cl] RNase H バッファ一 100〃1

RNase H 3unit

を洗浄した MPG に加え、 37°C下 30分間加温した。

[2] 10% SDS

0. 5M EDTA 2 1

を加え、 10分間、 65°Cし、上清を回収。

(c) 上清をフヱノール Zクロ口ホルムによる抽出、エタノール沈澱にて精製した _c

Claims

請求の範囲

1 . mRNAの完全長に対応する cDNAのライブラリ一を作成する方法であって、 mRNAを鐯型とし、プライマーより逆転写により RNA DNA複合体を形成する工程、 RNA-DNA複合体を形成している mRNAの 5' Cap (^7MeG _ppp N)サイ卜に存在するジオール構造に、タツグになる分子を化学結合させる工程、及び

タツグ分子を結合した RNA DNA 複合体の内、 mRNAの完全長に対 -応する DNA を有する RNA- DNA複合体を、タツグ分子の機能を利用して分離する工程、

を含むことを特徴とする完全長 cDNAライブラリ一の作成方法。

2 . ブライマ一が oligo dTである請求項 1に記載の方法。

3 . mRNAの 5' Cap サイ卜に存在するジオール構造を過ヨウ素酸ナトリゥムで酸化開環してジアルデヒドとし、次いでヒドラジン末端を有するタツグ分子を前記ジアルデヒドと反応させることで夕ッグ分子を結合させた mRNAを調製する請求項 1または 2に記載の方法。

4 . ヒドラジン末端を有するタツグ分子が、ヒドラジン末端を有するビォチン分子（ピオチンヒドラザィド）またはヒドラジン末端を有するアビジン分子（ァビジンヒドラザィド）である請求項 3記載の方法。

5 . 1本鎖 RNA を切断する RNA分解酵素でタッグ分子を結合した RNA-DNA複合体を消化して、 mRNAの完全長に対応しない DNA を有する複合体の 1本鎖 RNA 部を切断してこの複合体からタツグ分子を切除し、次いで、タツグ分子を有する mRNA の完全長に対応する DNA を有する複合体を分離する請求項 1記載の方法。

6 . タツグ分子が mRNAの 5' Cap サイトに存在するジオール構造と結合可能な官能基を有するピオチン分子であり、固相担体上に担持したアビジンと、 RNA- DNA 複合体がタッグ分子として有するビォチン分子との結合性を利用して、 mRNAの完全長に対応する DNA を有する複合体を分離する請求項 1または 2に記載の方法。

7 . タツグ分子が mRNAの 5' Cap サイトに存在するジオール構造と結合可能な官能基を有するアビジン分子であり、固相担体上に担持したピオチンと、 RNA-DNA 複合体が夕ッグ分子として有するァビジン分子との結合性を利用して、 mRNAの完全長に対応する DNA を有する複合体を分離する請求項 1または 2に記載の方法。

8 . mRNAの完全長に対応する cDNAのライブラリ一を作成する方法であって、 mRNAを錶型とし、プライマーより逆転写により RNA-DNA 複合体を形成する工程、 NA-DNA複合体を形成している mRNAの 5' Cap ( ^7MeG _ppp N)サイ卜に存在するジオール構造に、ピオチン分子を結合させる工程、

ピオチン分子を結合した RNA-DNA 複合体を、 1本鎖 RNA を切断する RNA 分解酵素で消化して、 mRNAの完全長に対応しない DNA を有する複合体の 1本鎖 RNA 部を切断することによりこの複合体からビォチン分子を切除する工程、及び

9 . mRNAの完全長に対応する cDNAのライブラリ一を作成する方法であって、 mRNAを銪型とし、プライマーより逆転写により RNA - DNA複合体を形成する工程、

アビジン分子を結合した RNA-DNA 複合体を、 1本鎖 RNA を切断する RNA分解酵素で消化して、 mRNAの完全長に対応しない DNA を有する複合体の 1本鎖 RNA 部を切断することによりこの複合体からァビジン分子を切除する工程、及び

アビジン分子が結合した mRNAの完全長に対応する DNA を有する複合体を、固相担体上に担持したビォチンと結合させて分離する工程、

1 0 . プライマーが oligo dTである請求項 8または 9に記載の方法。

1 1 . 1本鎖 RNA を切断する RNA 分解酵素がリボヌクレアーゼ Iである請求項 5、 8〜 1 0のいずれか 1項に記載の方法。

1 2 . 分離された mRNAの完全長に対応する DM を有する複合体から、 1本鎖完全長 cDNAを回収する請求項 1〜 1 1のいずれか 1項に記載の方法。

1 3 . 分離された mRNAの完全長に対応する DNA を有する複合体に、タバコモザイクウイルスアルカリホスファタ一ゼを反応させることにより Cap サイ卜より夕ッグ分子を切り離すことにより、 1本鎖完全長 cDNAを回収する請求項 1 2記載の方法。

1 4 . 1本鎖完全長 cDNAの回収を、分離された mRNAの完全長に対応する DNA を有する複合体に、 DNA-RNA ハイプリッドの KNA 鎖を切断する為、 RNase を作用させることにより行う請求項 1 2記載の方法。

1 5 . DNA-RNA ハイプリッドの RNA鎖を切断する RNase 力 <RNase H である請求項 1 4記載の方法。

1 6 . 回収された第 1の 1本鎖完全長 cDNA鎖を铸型として、第 2の cDNA鎖を合成し、得られた第 2の cDNA鎖を合成後、完全長二重鎖 cDNAをクローニングする請求項 1〜 1 5のいずれか 1項に記載の方法。

1 7 . 第 1の cDNA鎖の 3'端に RNA または DNA のォリゴマーをライゲーシヨンして得られた cDNA鎖を鏵型とし、かつライゲ一シヨンしたオリゴマーの相補鎖オリゴマーをプライマーとして、第 2の cDNA鎖の合成を行なう請求項 1 6記載の方法 c

1 8 . 3'端に鎳型なしにポリ G 、ポリ (：、ポリ A 、又はポリ T を合成できる酵素を用いて第 1の cDNA鎖の 3'端にポリ G 、ポリ C 、ポリ A 、又はポリ T を付カロした cDNA鎖を铸型とし、かつ各々に相補的なォリゴ C 、ォリゴ G 、ォリゴ T 、又はオリゴ A をプライマーとして、第 2の cDNA鎖の合成を行う請求項 1 7記載の方法 _c

1 9 . 3'端に錶型なしにポリ G 、ボリ (：、ポリ A 、又はポリ T を合成できる酵素がタ一ミナルヌクレオチドトランスフヱラ一ゼである請求項 1 8記載の方法。