FR2733765A1 - Methode de couplage specifique de la coiffe de l'extremite 5' d'un fragment d'arnm - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une méthode de couplage spécifique de la coiffe de l'extrémité 5' d'un fragment d'ARNm eucaryote par une molécule fonctionnalisée par un groupe amine. La présente invention fournit également une méthode d'isolement d'extrémité 5' d'ARNm et une méthode de préparation d'extrémité 3' d'ADNc.
Description
La présente invention concerne une méthode de couplage spécifique de la coiffe à l'extrémité 5' des ARN messagers (ARNm) eucaryotes. La présente invention concerne également une méthode d'isolement d'ARNm d'Eucaryotes comportant la coiffe à l'extrémité 5'. En outre la présente invention concerne une méthode de préparation d'extrémité 3' d'ADNc et notamment d'ADNc complet. La présente invention comporte en outre des trousses de réactifs pour la mise en oeuvre desdites méthodes et des ARNm couplés spécifiquement par la coiffe en 5'. Enfin la présente invention concerne une méthode de capture de protéine reconnaissant des ARN messagers.
L'étude des gènes et de leur produit d'expression, les ARNm, est encore limitée par la possibilité de caractériser précisément l'extrémité 5' des ARNm qui comprend notamment l'origine de transcription. En effet, les techniques classiquement utilisées pour caractériser et isoler des
ARNm spécifiques passent par l'isolement des clones d'ADNc correspondants. Or par construction, ces clones sont plus ou moins tronqués dans les parties correspondant aux extrémités 5' des ARNm. Des améliorations certaines ont été récemment apportées dans l'isolement et la caractérisation des extrémités 5'. Frohman et Coll. (1) et Delort et Coll. (2) on décrit l'isolement des extrémités 5' des ADNc au moyen d'adjonction d'un homopolymère à leurs extrémités afin de faciliter le clonage de l'ADNc complet après amplification en chaine par polymérase ("ACP =
PCR" en anglais).Toutefois, les exemples d'application rapportés avec ces méthodes concernaient uniquement des ARN messagers relativement abondants. Delort et Coll. (2) ont montré que la méthode était difficilement applicable à des espèces moléculaires faiblement exprimées. L'inefficacité de la méthode est dûe à l'adjonction de séquences homopolymériques à l'extrémité 3' des ADNc grâce à l'activité de la terminale transférase. En effet, dans ce cas, l'amorce utilisée pour initier la synthèse du deuxième brin (dénomée amorce retour) puis éventuellement pour les ACP subséquentes contient nécessairement une queue homopolymérique à son extrémité 3'.Cette queue homopolymérique, de séquence anticomplémentaire de celle ajoutée à l'extrémité de 3' des ADNc, peut s'hybrider sur des séquences homopolymériques internes contribuant ainsi à la genèse de fragment d'ADN plus court que le fragment attendu.
ARNm spécifiques passent par l'isolement des clones d'ADNc correspondants. Or par construction, ces clones sont plus ou moins tronqués dans les parties correspondant aux extrémités 5' des ARNm. Des améliorations certaines ont été récemment apportées dans l'isolement et la caractérisation des extrémités 5'. Frohman et Coll. (1) et Delort et Coll. (2) on décrit l'isolement des extrémités 5' des ADNc au moyen d'adjonction d'un homopolymère à leurs extrémités afin de faciliter le clonage de l'ADNc complet après amplification en chaine par polymérase ("ACP =
PCR" en anglais).Toutefois, les exemples d'application rapportés avec ces méthodes concernaient uniquement des ARN messagers relativement abondants. Delort et Coll. (2) ont montré que la méthode était difficilement applicable à des espèces moléculaires faiblement exprimées. L'inefficacité de la méthode est dûe à l'adjonction de séquences homopolymériques à l'extrémité 3' des ADNc grâce à l'activité de la terminale transférase. En effet, dans ce cas, l'amorce utilisée pour initier la synthèse du deuxième brin (dénomée amorce retour) puis éventuellement pour les ACP subséquentes contient nécessairement une queue homopolymérique à son extrémité 3'.Cette queue homopolymérique, de séquence anticomplémentaire de celle ajoutée à l'extrémité de 3' des ADNc, peut s'hybrider sur des séquences homopolymériques internes contribuant ainsi à la genèse de fragment d'ADN plus court que le fragment attendu.
Un deuxième facteur limitant la sensibilité de la méthode est lié à l'amplification de fragments d'ADNc synthétisés par amorçage non spécifique. Ces fragments d'ADNc sont autant de cibles possibles pour l'amorce retour pourvu qu'ils présentent une séquence homopolymérique favorable à l'hybridation.
Pour pallier les inconvénients liés à l'adjonction de queue homopolymérique, Dumas Milne Edwards et al. (3) ont ligaturé à l'extrémité 3' des ADNc un oligonucléotide fonctionalisé (étiquette) grâce à l'activité de la ARN ligase du phage T4. La fonctionalisation de l'oligonucléotide visait à empêcher l'auto-ligature des étiquettes. Pour cela, I'oligonucléotide devait présenter une extrémité 5' P et extrémité 3' sans fonction hydroxyle. L'étiquetage des ADNc simple brin est supérieur à l'adjonction d'une queue homopolymérique, car une séquence définie est ajoutée à la molécule d'ADNc. Aussi, les difficultés liées à l'utilisation d'une amorce ayant une séquence homopolymérique à son extrémité 3' sont totalement éliminées. Ceci a considérablement amélioré l'isolement d'extrémité 5' d'ADNc.Les deux stratégies décrites précédemment présentent encore la limitation de partir d'ADNc ctest-à-dire, le produit de l'activité de la transcriptase, Or il est connu que l'enzyme peut avoir des difficultés à recopier les brins d'ARN messager, dans certaines régions riches en structures secondaires par exemple.
Pour contourner cette difficulté il a été proposé d'étiquetter directement les ARNm (4 - 7). Dans ce cas, à l'extrémité 5' de l'ARNm, après élimination de la coiffe, un oligonucléotide est ligaturé à l'extrémité des
ARNm. Cette méthode présente l'avantage de marquer spécifiquement les
ARN à leur extrémité 5' à l'aide d'une séquence connue qui peut être utilisée comme cible d'amorces spécifiques utilisables pour synthétiser les deuxièmes brins ADNc et éventuellement pour réaliser des ACP. Toutefois, les manipulations réalisées sur les ARN, en particulier le nombre de réactions enzymatiques à réaliser limitent l'usage que l'on peut faire de cette méthode à des quantités importantes d'ARNm.
ARNm. Cette méthode présente l'avantage de marquer spécifiquement les
ARN à leur extrémité 5' à l'aide d'une séquence connue qui peut être utilisée comme cible d'amorces spécifiques utilisables pour synthétiser les deuxièmes brins ADNc et éventuellement pour réaliser des ACP. Toutefois, les manipulations réalisées sur les ARN, en particulier le nombre de réactions enzymatiques à réaliser limitent l'usage que l'on peut faire de cette méthode à des quantités importantes d'ARNm.
Il a enfin été décrit un procédé de purification d'ARNm (8) dans lequel on utilise les propriétés d'une protéine particulière de reconnaître et se lier à la coiffe de l'extrémité 5' des ARNm après sélection des hétéroduplexes ADNc-ARNm. Cette méthode implique en effet la formation préalable d'hétéroduplexes ARNm-ADNc et ne peut donc s'appliquer qu'à des ARNm de configuration linéaire ou préalablement dénaturés.
Toutefois, dans les conditions dénaturantes nécessaires à la linéarisation de la molécule d'ARN pour favoriser la fixation de la coiffe, ladite protéine décrite dans ce procédé se dénature également et perd ses propriétés de reconnaissance et d'affinité. Aucune des méthodes décrites à ce jour ne permet donc l'isolement des ARN messagers complets.
Le but de la présente invention est donc de fournir une méthode permettant d'isoler les ARN messagers complets qui ne présente pas les inconvénients précités.
Pour ce faire, la présente invention fournit une méthode de couplage spécifique de la coiffe de l'extrémité 5' d'un fragment d'ARNm eucaryote par une molécule fonctionnalisée par un groupe amine qui comporte les étapes suivantes
a) on modifie spécifiquement l'extrémité 3' dudit fragment d'ARNm,
de sorte que le dernier nucléotide ne comporte plus de groupe OH en
position 2' et 3'
b) on réalise une oxydation spécifique de diol en dialdéhyde sur la
fonction 2', 3'-cis diol de la méthyl guanosine de l'extrémité 5'
desdits fragments d'ARNm; et
c) on réalise le couplage de la 2', 3' dialdéhyde obtenue à l'étape b)
avec la fonction amine de ladite molécule biologique.
a) on modifie spécifiquement l'extrémité 3' dudit fragment d'ARNm,
de sorte que le dernier nucléotide ne comporte plus de groupe OH en
position 2' et 3'
b) on réalise une oxydation spécifique de diol en dialdéhyde sur la
fonction 2', 3'-cis diol de la méthyl guanosine de l'extrémité 5'
desdits fragments d'ARNm; et
c) on réalise le couplage de la 2', 3' dialdéhyde obtenue à l'étape b)
avec la fonction amine de ladite molécule biologique.
On entend ici par "molécule fonctionnalisée par un groupe amine" une molécule qui comporte naturellement ou une molécule à laquelle on a adjoint un groupe amine. Le groupe amine peut être présent sous forme d'une fonction comportant un groupe amine tel que, hydrazide ou carbazide notamment thiocarbazide ou semicarbazide.
L'extrémité 5' des ARN messagers est protégée par une structure particulière : la coiffe. La coiffe est formée d'une guanosine méthylée en position 7 et unie à l'extrémité 5' de la première base de l'ARN par une liaison 5'-5' tri-phosphate. Dans certains cas la guanosine est méthylée en positions 2 et 7. Enfin pour de rares messagers et pour de nombreux petits
ARN nucléaires, la guanosine est triméthylée en positions 2, 7, 7 (9). Le sucre (ribose) de ce nucléoside particulier a une fonction 2', 3'-cis diol.
ARN nucléaires, la guanosine est triméthylée en positions 2, 7, 7 (9). Le sucre (ribose) de ce nucléoside particulier a une fonction 2', 3'-cis diol.
Dans une molécule d'ARNm seules les deux extrémités (5' avec la coiffe et 3' avec le dernier sucre 2', 3'-OH) présentent ces diols. C'est pourquoi, selon la présente invention, pour diriger le couplage de la molécule biologique contenant une fonction amine spéficiquement vers l'extrémité 5' on modifie spécifiquement l'extrémité 3' desdites molécules d'ARN.
Selon la présente invention il ne subsiste plus alors qu'un seul diol en 5' qui est oxydé en 2', 3' dialdéhyde dans des conditions d'oxydation spécifiques bien connues de l'homme de l'art (10, 11). Le dialdéhyde obtenu peut ensuite réagir avec de nombreux réactifs contenant notamment des molécules comportant une fonction amine primaire. Le couplage de molécules photo-activables et la biotinylation de protéines, d'oligonucléotides et d'ARN ont déjà été décrits en faisant réagir le dialdéhyde avec de la NH2-biotine (10, 13), mais la fixation se fait de manière aléatoire sur la molécule et en particulier non spécifiquement à l'extrémité 5' dans le cas d'acides nucléiques.
A l'étape a) on entend par "modification de l'extrémité 3'" la substitution, transformation ou élimination desdits groupes OH de la dernière base ou l'élimination ou l'adjonction à l'extrémité 3' dudit fragment d'ARNm d'un ou plusieurs nucléotides, de sorte que le dernier nucléotide de l'extrémité 3' ne comporte plus de groupe OH en position 2' et 3' du cycle osidique.
L'objectif de l'étape a) est de supprimer la fonction 2', 3' diol de l'extrémité 3' de sorte que l'oxydation spécifique de fonction diol ne se produise pas à l'extrémité 3', mais seulement à l'extrémité 5'.
L'étape a) est facultative dans la mesure où certains fragments d'ARNm ne comportent pas de diol en position 2' et 3' de la dernière base de leur extrémité 3'.
Dans un mode de réalisation, la modification de l'étape a) se fait par adjonction à l'extrémité 3' dudit fragment d'ARNm d'un nucléotide ou d'un oligonucléotide dont l'extrémité 3' ne comporte pas de fonction 2', 3' diol.
Le nucléotide ou l'oligonucléotide adjoint peut présenter à son extrémité 3', par exemple, au moins un groupe OH en 2' et 3' bloqué par un groupe protecteur.
La liaison entre l'extrémité 3' du fragment d'ARNm et le nucléotide ou l'oligonucléotide peut se faire par une liaison internucléotidique 3'-5' avec l'extrémité 5' du nucléotide ou oligonucléotide selon des méthodes connues de l'homme de l'art.
Dans un mode de réalisation particulier, on réalise une ligature d'un nucléoside diphosphate en 3' et 5' (pNp), notamment par l'adjonction de pCp, en utilisant l'ARN ligase du phage T4 (14-15).
Lorsque le fragment d'ARNm comporte une extrémité 3' polyA se terminant en 3' par une fonction 2', 3' diol à l'étape a), la modification spécifique de l'extrémité 3' dudit fragment d'ARNm est réalisée par hydrolyse alcaline suivie d'une étape de séparation des fragments à extrémité 3' polyA générés par l'hydrolyse alcaline.
En effet, l'hydrolyse alcaline se fait spécifiquement à l'extrémité 3'.
Elle génère plusieurs fragments dont un premier fragment comportant la coiffe en 5' et les autres ont une extrémité 5' OH, et leur extrémité 3' est du type 3'phosphate, 2'phosphate ou (2', 3') cyclophosphate, sauf un fragment comportant l'extrémité 3' du fragment d'ARNm initial qu'il faut donc éliminer.
Cette élimination peut se faire par tous moyens appropriés connus.
Les fragments d'ARNm comportent le plus souvent une extrémité 3' constituée par un fragment polyA. Dans ce cas on peut éliminer ledit deuxième fragment, en particulier par fixation sur des oligonucléotides oligo dT, notamment à l'aide d'une colonne de chromatographie comportant une phase solide sur laquelle des oligo dT sont fixés.
L'hydrolyse alcaline est avantageusement une hydrolyse alcaline ménagée, notamment en présence de NaOH 0.1NI à 4"C.
Uoxydation des diol du type a-glycol par l'acide périodique (HI04) ou par le tétracétate de plomb provoque spécifiquement la coupure de liaison C-C entre les deux fonctions hydroxyl et la formation de dialdéhydes.
Dans un mode de réalisation particulier à l'étape b), ledit réactif d'oxydation spécifique des diols en dialdéhyde est du périodate, notamment de sodium.
Dans un mode de réalisation à l'étape c) les groupements dialdéhydes formés par oxydation réagissent principalement avec des amines, dans des conditions de pH acide, notamment un pH variant entre 4 et 6, pour former des bases de Schiff. Ces bases sont ensuite stabilisées par réduction avec un borohydrure tel que NaBH4 et préférentiellement un cyanoborohydrure tel que NaBH3CN, pour stabiliser la fonction hydrazone qui se trouve alors transformée en hydrazide.
De façon appropriée ladite molécule fonctionnalisée est une molécule biologique. Comme molécule biologique on peut citer en particulier les protéines telles que l'avidine ou des anticorps, les vitamines ou des molécules ligands entrant en jeu dans des interactions ligand/récepteur, ou encore des oligonucléotides.
La présente invention fournit également une méthode de marquage spécifique de la coiffe de l'extrémité 5' d'un fragment d'ARNm eucaryote, caractérisée en ce qu'on utilise une méthode de couplage selon la présente invention, dans laquelle ladite molécule est une molécule de marquage.
On entend ici par molécule de marquage" une molécule pouvant être détectée, directement ou indirectement c'est-à-dire après liaison par interaction ou couplage covalent avec une autre molécule et/ou une phase solide. Par détection directe" on entend notamment les cas où ladite molécule comporte elle-même un élément détectable tel qu'un atome radioactif, ou ladite molécule est couplée à une enzyme que l'on peut détecter à l'aide d'un substrat chromogénique ou ladite molécule est couplée à une molécule fluorescente. Par "détection indirecte" on entend notamment les cas où ladite molécule est susceptible de réagir de manière physico-chimique ou par couplage covalent avec une autre molécule ellemême comportant un élément détectable directement tel qu'un atome radioactif, une enzyme ou une molécule fluorescente.
La présente invention a également pour objet une méthode d'isolement de l'extrémité 5' d'un ARNm Eucaryote dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'on utilise une méthode de couplage selon la présente invention, dans laquelle ladite molécule est une molécule permettant l'isolement du fragment d'ARNm auquel elle est couplée.
On entend par extrémité 5' d'un fragment d'ARNm" tout fragment qui comprend la coiffe méthyl-guanosine en 5'.
Par "molécule permettant l'isolement", on entend une molécule permettant l'isolement de façon directe ou indirecte du fragment d'ARNm auquel elle est couplée. Par "isolement direct" on peut citer le cas de la précipitation dans le cas d'une protéine. Par "isolement indirect" on peut citer le cas où ladite molécule est susceptible de réagir avec une phase solide ou une deuxième molécule fixée sur une phase solide.
La présente invention a également pour objet un trousse de réactifs utile pour la mise en oeuvre d'une méthode de couplage, de marquage ou d'isolement selon la présente invention, caractérisé en ce qu'elle comporte:
- des réactifs de modification à l'extrémité 3' desdits ARNm
- des réactifs d'oxydation de la fonction 2'3'-diol à l'extrémité 5' en
dialdéhyde; et
- des réactifs de couplage covalent entre la dialdéhyde et ladite
fonction amine de ladite molécule.
- des réactifs de modification à l'extrémité 3' desdits ARNm
- des réactifs d'oxydation de la fonction 2'3'-diol à l'extrémité 5' en
dialdéhyde; et
- des réactifs de couplage covalent entre la dialdéhyde et ladite
fonction amine de ladite molécule.
En particulier, ledit réactif d'oxydation est du périodate de sodium.
Selon un mode de réalisation, lesdits réactifs de couplage avec ladite fonction amine comportent un tampon acide à pIi entre 4 et 6 et un réactif de réduction consistant en un borohydrure.
Selon une variante avantageuse, lesdits réactifs de modification de ladite extrémité 3' sont des réactifs permettant le couplage de l'extrémité 3' dudit ARNm avec l'extrémité 5' d'un oligonucléotide ou d'un nucléotide ne comportant pas de fonction 2', 3' diol à son extrémité 3'.
En particulier, lesdits réactifs de modification de l'extrémité 3' dudit
ARNm consistent en un nucléotide 3', 5' diphosphate pNp et une enzyme de ligature ARN ligase T4
La présente invention, permet aussi d'isoler l'extrémité 5' d'ARNm et notamment d'ARNm complets en tirant partie de la réactivité chimique de leur extrémité 5' et de la possibilité de la modifier chimiquement spécifiquement pour l'extrémité 5', de lui fixer une molécule biologique telle que la biotine. Par la suite, les ARN ainsi marqués peuvent être sélectionnés par les techniques classiques permettant de les sélectioner, par exemple par l'utilisation de billes magnétiques couplées à de la streptavidine dans le cas d'ARN biotinylés. Dans ce cas, l'invention permet de purifier par capture sur bille d'avidine ou de streptavidine des messagers coiffés donc complets ou les extrémités 5' de messagers complets.
ARNm consistent en un nucléotide 3', 5' diphosphate pNp et une enzyme de ligature ARN ligase T4
La présente invention, permet aussi d'isoler l'extrémité 5' d'ARNm et notamment d'ARNm complets en tirant partie de la réactivité chimique de leur extrémité 5' et de la possibilité de la modifier chimiquement spécifiquement pour l'extrémité 5', de lui fixer une molécule biologique telle que la biotine. Par la suite, les ARN ainsi marqués peuvent être sélectionnés par les techniques classiques permettant de les sélectioner, par exemple par l'utilisation de billes magnétiques couplées à de la streptavidine dans le cas d'ARN biotinylés. Dans ce cas, l'invention permet de purifier par capture sur bille d'avidine ou de streptavidine des messagers coiffés donc complets ou les extrémités 5' de messagers complets.
Plus précisément, la présente invention a donc en outre pour objet une méthode d'isolement d'ARNm complet notamment à l'extrémité 5', dans un échantillon biologique, caractérisée en ce que
a) on réalise le marquage spécifique de la coiffe à l'extrémité 5' de
l' ARNm avec une première molécule biologique P1 selon la
méthode de couplage de la présente invention pour obtenir le
conjugué P1-ARNm
b) on met ledit ARNm marqué par ladite première molécule
biologique (P1-ARNm) en présence d'une phase solide sur laquelle
se trouve fixée une deuxième molécule biologique P2 qui interagit
et se lie de façon non covalente avec ladite première molécule de
manière à former un complexe (P2 / P1-ARNm);;
c) on sépare ladite phase solide revêtue du complexe P2 / P1-ARNm
de l'échantillon et,
d) on effectue éventuellement la décomplexation pour récupérer
l'ARNm marqué P1-ARNm.
a) on réalise le marquage spécifique de la coiffe à l'extrémité 5' de
l' ARNm avec une première molécule biologique P1 selon la
méthode de couplage de la présente invention pour obtenir le
conjugué P1-ARNm
b) on met ledit ARNm marqué par ladite première molécule
biologique (P1-ARNm) en présence d'une phase solide sur laquelle
se trouve fixée une deuxième molécule biologique P2 qui interagit
et se lie de façon non covalente avec ladite première molécule de
manière à former un complexe (P2 / P1-ARNm);;
c) on sépare ladite phase solide revêtue du complexe P2 / P1-ARNm
de l'échantillon et,
d) on effectue éventuellement la décomplexation pour récupérer
l'ARNm marqué P1-ARNm.
Dans un mode de réalisation, comme première (P1) et deuxième molécule biologique (P2), on utilise des molécules biologiques qui interagissent entre elles par une liaison de type non covalent. De tels couples sont bien connus. On peut citer notamment les couples antigène/anticorps tel que digoxigénine (DIG) / anticorps antidigoxigénine (anti DIG) ou des interéactions entre molécules biologiques de type biotine/avidine ou streptavidine ou encore des réactions d'hybridation entre acides nucléiques complémentaires.
La fixation de P2 sur la phase solide peut être covalente ou non covalente selon des méthodes connues de l'homme de l'art.
Dans un mode de réalisation particulier, P1 est l'hydrazide de biotine et P2 est l'avidine ou la streptavidine. Dans ce cas, on peut séparer l'avidine du conjugué botine-ARNm par simple chauffage, à environ 95"C dans du 2% SDS.
La phase solide peut être constituée par la face interne du récipient dans lequel se trouve l'échantillon biologique ou un élément tel que des billes que l'on introduit dans ledit récipient.
La méthode d'isolement d'ARNm selon l'invention peut comporter une étape supplémentaire de coupure entre P1 et ledit ARNm dans laquelle on sépare ladite première molécule biologique P1, pour récupérer l'ARNm non couplé.
La présente invention a également pour objet une trousse de réactifs d'isolement utile pour la mise en oeuvre d'une méthode d'isolement d'extrémité 5' d'ARNm selon l'invention, caractérisé en ce qu'elle comporte les éléments d'une trousse de réactifs de couplage d'ARNm spécifique de la coiffe en 5' avec une dite première molécule biologique P1 selon la présente invention et une phase solide sur laquelle se trouve fixée de façon covalente ou non covalente une dite deuxième molécule biologique P2.
La présente invention a également pour objet une méthode de préparation d'extrémité 5' d'ADNc et notamment d'ADNc complet caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes
a) on effectue une transcription inverse d'extrémité 5' et
notamment d'ARNm complet obtenu par une méthode d'isolement
d'extrémité 5' d'ARNm selon la présente invention
b) on élimine les ARN simples brins et fragments d'ARN non
hybridés pour obtenir une population d'hétéroduplexes
ADNc/ARNm dans lesquels l'ARNm est un ARNm complet dont la
coiffe en 5' est couplée spécifiquement par une dite première
molécule.
a) on effectue une transcription inverse d'extrémité 5' et
notamment d'ARNm complet obtenu par une méthode d'isolement
d'extrémité 5' d'ARNm selon la présente invention
b) on élimine les ARN simples brins et fragments d'ARN non
hybridés pour obtenir une population d'hétéroduplexes
ADNc/ARNm dans lesquels l'ARNm est un ARNm complet dont la
coiffe en 5' est couplée spécifiquement par une dite première
molécule.
c) on capture lesdits hétéroduplexes à l'aide d'une phase solide
revêtue de ladite deuxième molécule biologique et,
d) on effectue une déshybridation des hétéroduplexes pour
récupérer les ADNc complets.
revêtue de ladite deuxième molécule biologique et,
d) on effectue une déshybridation des hétéroduplexes pour
récupérer les ADNc complets.
Avantageusement à l'étape b), l'élimination des ARN simples brins ou fragments d'ARN non hybridés s'effectue par traitement enzymatique à l'aide d'une enzyme qui dégrade les ARN simples brins ou non hybridés et conserve intacts les hétéroduplexes ARN/ADN.
En particulier, après synthèse d'un ADNc, l'élimination par la
RNAse T1 ou des Nucléases S1 des molécules d'ARN ou des fragments d'ARN libres conduit à l'obtention d'une population d'hétéroduplexes contenant une molécule d'ARNm coiffé. Le couplage, notamment la biotinylation de la molécule d'ARN permet sa capture par les méthodes mentionnées cidessus et donc la purification de molécules d'extrémité 5' d'ADNc et notamment d'ADNc complets.
RNAse T1 ou des Nucléases S1 des molécules d'ARN ou des fragments d'ARN libres conduit à l'obtention d'une population d'hétéroduplexes contenant une molécule d'ARNm coiffé. Le couplage, notamment la biotinylation de la molécule d'ARN permet sa capture par les méthodes mentionnées cidessus et donc la purification de molécules d'extrémité 5' d'ADNc et notamment d'ADNc complets.
La présente invention a également pour objet une méthode de capture d'une protéine Po reconnaissant un ARNm dans laquelle on utilise de l'ARNm obtenu par une méthode d'isolement selon la présente invention, que l'on met en présence de ladite protéine, puis on récupère le complexe (Protéine/ARNm complet) et on effectue une décomplexation pour récupérer ladite protéine.
Ledit ARNm utilisé peut être couplé à ladite molécule P1 ou en être séparé. De même, ledit ARNm ou conjugué P1-ARNm peut être fixé à une phase solide. En particulier, le conjugué P1-ARNm peut être fixé à une phase solide par l'intermédiaire d'une interaction avec ladite molécule P2 elle-même fixée sur ladite phase solide.
Cette méthode de capture peut s'appliquer en particulier à au moins deux situations biologiquement intéressantes
- isolement de protéines impliquées dans la régulation de la
traduction et de la stabilité des ARN messagers
- si les ARNm sont des ARNpré-messagers, la préparation peut être
utilisée pour capturer des protéines ou des complexes (SNURPS)
intervenant dans l'épissage.
- isolement de protéines impliquées dans la régulation de la
traduction et de la stabilité des ARN messagers
- si les ARNm sont des ARNpré-messagers, la préparation peut être
utilisée pour capturer des protéines ou des complexes (SNURPS)
intervenant dans l'épissage.
D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples de réalisation détaillée qui vont suivre. Ces exemples sont illustrés par la figure 1 qui représente l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide, d'oligonucléotides non coiffés (colonnes A et B) et coiffés (colonnes C et D) marqués par ligature de pCp radioactif 32P et qui ont été soumis au procédé biotinylation de la coiffe décrit dans l'exemple 1 (colonnes B et D) ou non soumis à ce procédé (colonnes A et C).
EXEMPLE 1: Marquage spécifique de la coiffe 5' d'ARNm
1. Ligature du nucléoside biphosphate pCp à l'extrémité 3' d'ARN messager.
1. Ligature du nucléoside biphosphate pCp à l'extrémité 3' d'ARN messager.
1 g ARN est incubé dans un milieu réactionnel final de 10 cil en présence de:
a) 5u d'ARN ligase du phage T4 dans le tampon fournit par le
fabricant (Gribco - BRL) et,
b) 40u de l'inhibiteur des ARNase : RNAzine commercialisé par la
Société Proméga et,
c) 2 > 1 de 32pCp Amersham #PB 10208. L'incubation peut être
réalisée à 37"C pendant 2 heures ou toute la nuit à 7-8 C.
a) 5u d'ARN ligase du phage T4 dans le tampon fournit par le
fabricant (Gribco - BRL) et,
b) 40u de l'inhibiteur des ARNase : RNAzine commercialisé par la
Société Proméga et,
c) 2 > 1 de 32pCp Amersham #PB 10208. L'incubation peut être
réalisée à 37"C pendant 2 heures ou toute la nuit à 7-8 C.
2. Obtention de l'ARN sous sa forme coiffée et non coiffée.
L'ARN est obtenu par transcription in vitro à partir d'une matrice d'ADN double brin portant le promoteur de l'ARN polymérase du phase T7.
2.1. Production de la matrice d'ADN double brin.
Les matrices d'ADN double brin sont obtenues par PCR de la façon suivante: un oligonucléotide de séquence 5' CT TAA TAC GAC TCA CTA TAG
CAT CCT ACT CCC ATC CAA TTC CAC CCT AAC TCC TCC CAT CTC CAC 3' (la séquence promotrice de l'ARN polymérase du phage T7 est en italique) est amplifié en utilisant un primer 5' de séquence 5' CT TAA TAC GAC TCA CTA TAG CAT C 3' et un primer 3' de séquence 5' GTG GAG ATG CGA CGA GTT AGG
GTG 3'. Chaque réaction est réalisée dans un volume de 100 cil et contient
2mM MgCl2 ; 200 zani de chacun des dNTP; 60 pmoles de chacun des primers;
îng de matrice ADN simple brin et 2,5 unités de Taq ADN polymérase. Les
conditions d'amplification sont les suivantes : 1 cycle comprenant 3 min. à
94 C, 30 sec. à 530C et 30 sec. à 72"C ; 25 cycles comprenant 1 min. à 94 C,
30 sec. à 53"C et 30 sec. à 72 C; ; 1 cycle avec 1 min. à 94 C, 30 sec. à 53"C et
5 min. à 72"C. Les produits d'amplification sont alors séparés par
électrophorèse sur gel acrylamide 10 % non dénaturant puis visualisés par
UV shadowing. Les matrices d'ADN double brin sont alors éluées du gel,
soumises à une extraction phénolique puis récupérées par précipitation
alcoolique.
CAT CCT ACT CCC ATC CAA TTC CAC CCT AAC TCC TCC CAT CTC CAC 3' (la séquence promotrice de l'ARN polymérase du phage T7 est en italique) est amplifié en utilisant un primer 5' de séquence 5' CT TAA TAC GAC TCA CTA TAG CAT C 3' et un primer 3' de séquence 5' GTG GAG ATG CGA CGA GTT AGG
GTG 3'. Chaque réaction est réalisée dans un volume de 100 cil et contient
2mM MgCl2 ; 200 zani de chacun des dNTP; 60 pmoles de chacun des primers;
îng de matrice ADN simple brin et 2,5 unités de Taq ADN polymérase. Les
conditions d'amplification sont les suivantes : 1 cycle comprenant 3 min. à
94 C, 30 sec. à 530C et 30 sec. à 72"C ; 25 cycles comprenant 1 min. à 94 C,
30 sec. à 53"C et 30 sec. à 72 C; ; 1 cycle avec 1 min. à 94 C, 30 sec. à 53"C et
5 min. à 72"C. Les produits d'amplification sont alors séparés par
électrophorèse sur gel acrylamide 10 % non dénaturant puis visualisés par
UV shadowing. Les matrices d'ADN double brin sont alors éluées du gel,
soumises à une extraction phénolique puis récupérées par précipitation
alcoolique.
2.2. Synthèse de l'ARN coiffé ou non coiffé.
L'ARN est obtenu par transcription in vitro de la matrice ADN double brin en utilisant le kit de transcription "AmoliScribe T7" (Epicentre technologies). Lorsque le milieu réactionnel comporte les 4 NTP, l'ARN produit est dépourvu de coiffe (il est alors doté d'une extrémité 5' de type 5'pppGpNpN...). Pour obtenir l'ARN coiffé, le GTP est remplacé par un analogue de la coiffe, le m7G(5')ppp(5')G. Ce composé, reconnu par la polymérase, est incorporé à l'extrémité 5' du transcrit naissant lors de l'étape d'initiation de la transcription. Toutefois, il ne peut pas être incorporé lors de l'étape d'élongation. Aussi, l'ADN servant de matrice pour la synthèse de l'ARN a été conçu de telle sorte que le brin codant ne porte qu'une seule Cytosine en position +1.
3. Oxydation de la coiffe en 5'
On dissout 0,1 OD d'ARN : on a utilisé deux oligoribonucléotides de 47 et 46 nucléotides dont 1 coiffé (+Cap, 47 nucléotides), et l'autre non coiffé (-Cap, 46 nucléotides).
On dissout 0,1 OD d'ARN : on a utilisé deux oligoribonucléotides de 47 et 46 nucléotides dont 1 coiffé (+Cap, 47 nucléotides), et l'autre non coiffé (-Cap, 46 nucléotides).
+Cap : -m7 GpppCCAUCCUAC UCCCAUCCAAUUCCACCC UAACUCCUCCCAUCUCCAC -Cap: pppCCAUCCUACUCCCAUoeAAUUCCACCCUAACUCCUCCCAUCUCCAC dans 3ciel de tampon acétate (0.1 M acétate de sodium pH 5.2) et 3X1 de solution de periodate de sodium 0. 1 M préparée extemporanément.
On incube le mélange 1 heure à l'obscurité. Puis on arrête la réaction en ajoutant 4 > 1 d'éthylène glycol 10 %. On effectue une précipitation éthanolique du produit et on dialyse contre de l'eau.
4. Couplage du dialdéhyde avec de la biotine
On dissout le produit d'oxydation obtenu à l'étape précédente dans 50R1 d'acétate de sodium à plI entre 5 et 5.2 et 50a1 de solution d'hydrazide de biotine 0.02M préparée extemporanément dans un mélange méthoxyéthanol/eau (1:1) de formule:
On dissout le produit d'oxydation obtenu à l'étape précédente dans 50R1 d'acétate de sodium à plI entre 5 et 5.2 et 50a1 de solution d'hydrazide de biotine 0.02M préparée extemporanément dans un mélange méthoxyéthanol/eau (1:1) de formule:
On a utilisé un espaceur au sein de l'hydrazide de biotine ayant n=5.
On peut très bien utiliser les autres hydrazides disponibles dans le commerce: avec n variant de 0 à 5.
Puis on incube 2 heures à 37"C. On précipite à l'éthanol et on dialyse contre de l'eau distillée.
EXEMPLE 2 : Capture de l'ARNm marqué avec des billes magnétiques
1. Les billes magnétiques revêtues de Streptavidine sont préparées selon les instructions du fournisseur (CPG Inc. USA). Les ARN sont ajoutés dans un tampon d'hybridation (NaCl 1,5 M, pll 5-6). Puis après 30 minutes d'incubation le matériel non fixé et non biotinylé est éliminé. Les billes sont lavées plusieurs fois à l'eau avec 1% de SDS.
1. Les billes magnétiques revêtues de Streptavidine sont préparées selon les instructions du fournisseur (CPG Inc. USA). Les ARN sont ajoutés dans un tampon d'hybridation (NaCl 1,5 M, pll 5-6). Puis après 30 minutes d'incubation le matériel non fixé et non biotinylé est éliminé. Les billes sont lavées plusieurs fois à l'eau avec 1% de SDS.
2. Récupération de l'ARNm
On incube les billes obtenues 15 minutes à 95 C dans de l'eau contenant 2% de SDS.
On incube les billes obtenues 15 minutes à 95 C dans de l'eau contenant 2% de SDS.
EXEMPLE 3 : Résultats expérimentaux
Dans les deux cas, figures 1 et 2, les résultats expérimentaux présentés correspondent à des autoradiogrammes de gel d'acrylamide 12 % de 0,4 mm d'épaisseur en tampon TBE.
Dans les deux cas, figures 1 et 2, les résultats expérimentaux présentés correspondent à des autoradiogrammes de gel d'acrylamide 12 % de 0,4 mm d'épaisseur en tampon TBE.
La figure 1 montre les résultats obtenus avec des oligoribonucléotides de 47 nucléotides dont les séquences nucléotidiques correspondent aux séquences données ci-dessus (exemple 1)
Colonnes A et B : oligonucléotide de 46 nucléotides sans coiffe marqué au pCp radioactif (exemple 1, 1.) soumis (B) ou non soumis (A) au procédé décrit en exemple 1, paragraphes 3.et 4. Colonnes C et D oligonucléotide de 47 nucléotides avec coiffe marqué au pCp radioactif soumis (D) ou non soumis (C) au procédé décrit en exemple 1 (paragraphes 1. à 4.).
Colonnes A et B : oligonucléotide de 46 nucléotides sans coiffe marqué au pCp radioactif (exemple 1, 1.) soumis (B) ou non soumis (A) au procédé décrit en exemple 1, paragraphes 3.et 4. Colonnes C et D oligonucléotide de 47 nucléotides avec coiffe marqué au pCp radioactif soumis (D) ou non soumis (C) au procédé décrit en exemple 1 (paragraphes 1. à 4.).
La différence de migration observée entre les colonnes A et C est due à la présence de la coiffe sur les oligonucléotides migrant dans la colonne C. La différence de migration observée entre les colonnes C et D est dûe à la biotynilation de la coiffe des oligonucléotides. Ceci démontre la spécificité de la biotynilation de la coiffe.
La Figure 2 montre les résultats obtenus lors de la récupération des oligonucléotides biotynilés et capturés par la streptavidine magnétique.
L'oligonucléotide a été marqué au pCp radioactif en 3', puis soumis au procédé décrit dans l'exemple 1.1. Par la suite, les oligonucléotides biotynilés ont été capturés avec des billes magnétiques comme décrit dans l'exemple 2. Puis incubés, 5 (colonne A), 15 (colonne B) et 30 (colonne C) minutes à 950C en présence de 2a/o SDS.
Les produits de la réaction ont été analysés par électrophorèse en gels de 12 % polyacrylamide en conditions dénaturantes (7M urée). Les gels ont subi une autoradiographie. Dans cette manipulation, les liaisons hydrazones n'ont pas été réduites.
Les bandes supérieures (flèche s) correspondent aux ARNs biotynilés avec la liaison hydrazone unissant le linker de la biotine et de l'oligoribonucléotide. Les bandes inférieures (flèche i) correspondent aux molécules (oligoribonucléotide) oxydées. La liaison hydrazone n'ayant pas été stabilisée au cours du chauffage, elle peut se casser et l'oligoribonucléotide retourne à la forme dialdéhyde. La colonne D présente l'oligoribonucléotide marqué au pCp comme décrit dans l'exemple 1.1.
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Wiley and Sons, Inc.
Wiley and Sons, Inc.
Claims (26)
1. Méthode de couplage spécifique de la coiffe de l'extrémité 5' d'un fragment d'ARNm eucaryote par une molécule fonctionnalisée par un groupe amine, dans laquelle on effectue les étapes suivantes
a) on modifie spécifiquement l'extrémité 3' dudit fragment d'ARNm,
de sorte que la dernière base ne comporte plus de groupe OH en
position 2' et 3'
b) on réalise une oxydation spécifique de diol en dialdéhyde sur la
fonction 2', 3'-cis diol de la méthyl guanosine de l'extrémité 5' dudit
fragment d'ARNm ; et
c) on réalise le couplage du 2', 3' dialdéhyde obtenue à l'étape b)
avec la fonction amine de ladite molécule.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la modification de l'étape a) se fait par adjonction à l'extrémité 3' dudit fragment d'ARNm d'un nucléotide ou d'un oligonucléotide dont l'extrémité 3' ne comporte pas de fonction 2', 3' diol.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'à l'étape a) la modification spécifique de l'extrémité 3'dudit fragment d'ARNm est réalisée par ligature d'un nucléoside 3', 5' diphosphate (pNp) en utilisant l'ARN ligase du phage T4.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, lorsque le fragment d'ARNm comporte une extrémité 3' polyA se terminant en 3' par une fonction 2', 3' diol à l'étape a), et la modification spécifique de l'extrémité 3' dudit fragment d'ARNm est réalisée par hydrolyse alcaline, suivie d'une étape de séparation des fragments à extrémité 3' polyA générés par l'hydrolyse alcaline.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'on réalise l'oxydation spécifique d'une fonction diol en fonction dialdéhyde de l'étape b) avec du périodate.
6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce qu'à l'étape c), on réalise le couplage de la dialdéhyde avec ladite fonction amine en milieu acide suivi d'une réduction avec un borohydrure.
7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que ladite molécule fonctionnalisée est une molécule biologique.
8. Méthode de marquage spécifique de la coiffe de l'extrémité 5' d'un fragment d'ARNm Eucaryote, caractérisée en ce qu'on utilise une méthode de couplage selon l'une des revendications 1 à 7 dans laquelle ladite molécule est une molécule de marquage.
9. Méthode d'isolement de l'extrémité 5' d'un ARNm eucaryote dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'on utilise une méthode de couplage selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle ladite molécule est une molécule permettant l'isolement du fragment d'ARNm auquel elle est couplée.
10. Trousse de réactifs utile pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'elle comporte
- des réactifs de modification spécifique de l'extrémité 3' d'ARNm 2',
3' diol
- des réactifs d'oxydation de la fonction 2'3'-diol à l'extrémité 5' en
dialdéhyde; et
- des réactifs de couplage covalent entre la dialdéhyde et ladite
fonction amine de ladite molécule.
11. Trousse de réactifs selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit réactif d'oxydation est du périodate de sodium.
12. Trousse de réactifs selon la revendication 10 ou 11, caractérisée en ce que lesdits réactifs de couplage avec ladite fonction amine comportent un tampon acide à pH entre 4 et 6 et un réactif de réduction consistant en un borohydrure.
13. Trousse de réactifs selon l'une des revendications 10 à 12 caractérisée en ce que lesdits réactifs de modification de ladite extrémité sont des réactifs permettant le couplage de l'extrémité 3' dudit ARNm avec l'extrémité 5' d'un oligonucléotide ou d'un nucléotide ne comportant pas de fonction 2', 3' diol à son extrémité 3'.
14. Trousse de réactifs selon la revendication 13, caractérisée en ce que lesdits réactifs de modification de l'extrémité 3' dudit ARNm consistent en un nucléotide 3', 5' diphosphate pNp et une enzyme de ligature ARN ligase T4.
15. Méthode d'isolement de l'extrémité 5' d'un ARNm eucaryote dans un échantillon biologique selon la revendication 9, caractérisée en ce que:
1) on réalise le couplage spécifique de la coiffe à l'extrémité 5' de 1'
ARNm avec une première molécule P1 selon l'une des
revendications 1 à 7 pour obtenir le conjugué P1-ARNm;;
2) on met ledit ARNm marqué par ladite première molécule
biologique (P1-ARNm) en présence d'une phase solide sur laquelle
se trouve fixée une deuxième molécule P2 qui se lie de façon
covalente ou non covalente avec ladite première molécule de
manière à former un conjugé ou respectivement un complexe
(P2 / P1-ARNm)
3) on sépare ladite phase solide revêtue du conjugué au complexe
P2 / P1-ARNm de l'échantillon et,
4) on effectue éventuellement la coupure de la liaison covalente ou
la décomplexation entre P2 et P1 pour récupérer l'ARNm couplé P 1 -ARNm.
16. Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que P1 et
P2 sont des molécules biologiques qui. interagissent de façon non covalente et forment un complexe.
17. Méthode selon l'une des revendications 15 ou 16, caractérisée en ce que P1 est l'hydrazide de biotine et P2 est l'avidine ou la streptavidine.
18. Méthode selon l'une des revendications 15 à 17 caractérisée en ce que la phase solide est constituée par la face interne du récipient dans lequel se trouve l'échantillon biologique ou un élément tel que des billes que l'on introduit dans ledit récipient.
19. Méthode selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisée en ce qu'on isole un ARNm complet.
20. Méthode selon l'une des revendications 15 à 19, caractérisée en ce qu'elle comporte une étape supplémentaire de coupure entre P1 et ledit
ARNm, pour récupérer l'ARNm non couplé.
21. Trousse de réactifs utile pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une des revendications 15 à 20, caractérisé en ce qu'elle comporte
-les éléments d'une trousse de couplage spécifique de la coiffe 5'
d'ARNm avec ladite première molécule selon l'une des
revendications 1 à 9,
- et une phase solide sur laquelle se trouve fixée ladite deuxième
molécule.
22. Méthode de préparation et isolement d'extrémité 3' d'ADNc, notamment d'ADNc complet, dans laquelle on effectue les étapes suivantes
a) on effectue une transcription inverse d'ARNm obtenu par une
méthode d'isolement selon l'une des revendications 9 ou 15 à 20;
b) on élimine les ARN simples brins et fragments d'ARN non
hybridés pour ne conserver qu'une population d'hétéroduplexes
ADNc/ARNm dans lesquels 1'ARNm est un ARNm dont la coiffe en 5'
est couplée spécifiquement par une dite première molécule.
c) on capture lesdits hétéroduplexes à l'aide d'une phase solide
revêtue de ladite deuxième molécule et,
d) on effectue une déshybridation des hétéroduplexes pour
récupérer les ADNc.
23. Méthode selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'à l'étape b), l'élimination des ARN simples brins ou fragments d'ARN non hybridés s'effectue par traitement enzymatique à l'aide d'une enzyme qui dégrade les ARN simples brins ou non hybridés et conserve intacts les hétéroduplexes ARN/ADN.
24. Méthode selon la revendication 23, caractérisée en ce qu'à l'étape b) on utilise une enzyme RNase T1 ou une nucléase S1.
25. ARNm couplé spécifiquement par la coiffe de l'extrémité 5' à unedite molécule, obtenu par une méthode selon l'une des revendications 1 à9ou 15à19.
26. Méthode de capture d'une protéine Po reconnaissant un ARNm, dans laquelle on met en présence ladite protéine avec de l'ARNm obtenu par une méthode d'isolement selon l'une des revendications 15 à 20, puis on récupère le complexe (Po/ARNm complet) et on effectue une décomplexation pour récupérer ladite protéine Po.
Priority Applications (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9505221A FR2733765B1 (fr) | 1995-05-02 | 1995-05-02 | Methode de couplage specifique de la coiffe de l'extremite 5' d'un fragment d'arnm |
| FR9509467A FR2733762B1 (fr) | 1995-05-02 | 1995-08-03 | Methode de couplage specifique de la coiffe de l'extremite 5' d'un fragment d'arnm et preparation d'arnm et d'adnc complet |
| AT96914259T ATE227346T1 (de) | 1995-05-02 | 1996-04-29 | Verfahren zur spezifischen kopplung einer schutzgruppe an das 5'-ende eines mrna-fragmentes und die herstellung von mrna und vollständiger cdna |
| US08/930,102 US6022715A (en) | 1995-05-02 | 1996-04-29 | Method for the specific coupling of the cap of the 5' end of an mRNA fragment and preparation of mRNA and complete cDNA |
| PCT/FR1996/000651 WO1996034981A2 (fr) | 1995-05-02 | 1996-04-29 | METHODE DE COUPLAGE SPECIFIQUE DE LA COIFFE DE L'EXTREMITE 5' D'UN FRAGMENT D'ARNm ET PREPARATION D'ARNm ET D'ADNc COMPLET |
| CA002220045A CA2220045C (fr) | 1995-05-02 | 1996-04-29 | Methode de couplage specifique de la coiffe de l'extremite 5' d'un fragment d'arnm et preparation d'arnm et d'adnc complet |
| AU59829/96A AU719217B2 (en) | 1995-05-02 | 1996-04-29 | Method for the specific coupling of the cap of the 5' end of an mRNA fragment and preparation of mRNA and of complete cDNA |
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| EP96914259A EP0824598B1 (fr) | 1995-05-02 | 1996-04-29 | METHODE DE COUPLAGE SPECIFIQUE DE LA COIFFE DE L'EXTREMITE 5' D'UN FRAGMENT D'ARNm ET PREPARATION D'ARNm ET D'ADNc COMPLET |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| FR9505221A FR2733765B1 (fr) | 1995-05-02 | 1995-05-02 | Methode de couplage specifique de la coiffe de l'extremite 5' d'un fragment d'arnm |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2733765A1 true FR2733765A1 (fr) | 1996-11-08 |
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Family
ID=9478607
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9505221A Expired - Lifetime FR2733765B1 (fr) | 1995-05-02 | 1995-05-02 | Methode de couplage specifique de la coiffe de l'extremite 5' d'un fragment d'arnm |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2733765B1 (fr) | 1997-07-25 |
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