JPH09248187A - 完全長ｃＤＮＡライブラリーの作成方法 - Google Patents
完全長ｃＤＮＡライブラリーの作成方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 効率良く5'Cap サイトの標識が可能な新たな
方法とこの標識方法を用いた完全長cDNAライブラリーの
作成方法の提供。 【解決手段】 mRNAの完全長に対応するcDNAのライブラ
リーを作成する方法であって、mRNAの5'Cap (7MeG ppp
N)サイトに存在するジオール構造に、タッグになる分子
を化学結合させる工程、前記タッグ分子を結合させたmR
NAを鋳型とし、oligo dTをプライマーとして逆転写によ
りRNA-DNA 複合体を形成する工程、及び形成されたRNA-
DNA 複合体の内、mRNAの完全長に対応するDNA を有する
複合体を、タッグ分子の機能を利用して、分離する工程
を含む完全長cDNAライブラリーの作成方法。mRNAの5'Ca
p サイトに存在するジオール構造を過ヨウ素酸ナトリウ
ムで酸化開環してジアルデヒドとし、次いでヒドラジン
末端を有するタッグ分子を前記ジアルデヒドと反応させ
ることでタッグ分子を結合させたmRNAを調製する。
方法とこの標識方法を用いた完全長cDNAライブラリーの
作成方法の提供。 【解決手段】 mRNAの完全長に対応するcDNAのライブラ
リーを作成する方法であって、mRNAの5'Cap (7MeG ppp
N)サイトに存在するジオール構造に、タッグになる分子
を化学結合させる工程、前記タッグ分子を結合させたmR
NAを鋳型とし、oligo dTをプライマーとして逆転写によ
りRNA-DNA 複合体を形成する工程、及び形成されたRNA-
DNA 複合体の内、mRNAの完全長に対応するDNA を有する
複合体を、タッグ分子の機能を利用して、分離する工程
を含む完全長cDNAライブラリーの作成方法。mRNAの5'Ca
p サイトに存在するジオール構造を過ヨウ素酸ナトリウ
ムで酸化開環してジアルデヒドとし、次いでヒドラジン
末端を有するタッグ分子を前記ジアルデヒドと反応させ
ることでタッグ分子を結合させたmRNAを調製する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、完全長cDNAライブ
ラリー作成法に関する。更に詳しくは、mRNAの化学修飾
を利用した、完全長cDNA精製法による完全長cDNAライブ
ラリー作成法に関する。
ラリー作成法に関する。更に詳しくは、mRNAの化学修飾
を利用した、完全長cDNA精製法による完全長cDNAライブ
ラリー作成法に関する。
【０００２】
【従来の技術】cDNA合成法は医学生物学分野の研究で必
須の技術であり、遺伝子転写物の解析法として不可欠で
ある。全てのDNA 遺伝情報は転写物を介して生理活性を
示すが、それを解析する強力な手段がcDNAクローニング
である。従来法におけるcDNA合成においては、oligo dT
をプライマーとしてポリA サイトから合成されたcDNAラ
イブラリーの中で最終的にクローンが単離される。とこ
ろが、殆どの場合、転写単位の全長が合成されていない
為に転写単位の全構造が解析できないのが実状である。
この為、通常のcDNAライブラリーでは、プライマー伸長
法による5'上流領域の合成、またはランダム プライマ
ーを用いたcDNA合成を用いて5'上流領域をウォーキング
(walking) することが全長構造解明に必須のステップと
なる。
須の技術であり、遺伝子転写物の解析法として不可欠で
ある。全てのDNA 遺伝情報は転写物を介して生理活性を
示すが、それを解析する強力な手段がcDNAクローニング
である。従来法におけるcDNA合成においては、oligo dT
をプライマーとしてポリA サイトから合成されたcDNAラ
イブラリーの中で最終的にクローンが単離される。とこ
ろが、殆どの場合、転写単位の全長が合成されていない
為に転写単位の全構造が解析できないのが実状である。
この為、通常のcDNAライブラリーでは、プライマー伸長
法による5'上流領域の合成、またはランダム プライマ
ーを用いたcDNA合成を用いて5'上流領域をウォーキング
(walking) することが全長構造解明に必須のステップと
なる。
【０００３】しかるに、上記従来のcDNA合成法には次の
問題がある。 (1) ランダム プライマーを用いると転写物のかなりの
領域をカバーするcDNAができる。しかし、それらは短い
断片であり、ポリ Aから5'Cap サイトまで含んだクロー
ンは単離できない。 (2) oligo dTをプライマーとして用いたcDNAは全て3'端
を含む。しかし、逆転写酵素が5'Cap サイトまで届かな
いため、5'上流をプライマー伸長法及び5'RACE等で再度
単離解析せねばならない。 (3) 既存の完全長cDNAを単離する方法は、前述の従来の
いかなる方法もその効率が十分でない(100μg mRNAから
200 万組換え体ファージ）。そこで、実用的にはもっと
効率の高い手法の開発が望まれる。
問題がある。 (1) ランダム プライマーを用いると転写物のかなりの
領域をカバーするcDNAができる。しかし、それらは短い
断片であり、ポリ Aから5'Cap サイトまで含んだクロー
ンは単離できない。 (2) oligo dTをプライマーとして用いたcDNAは全て3'端
を含む。しかし、逆転写酵素が5'Cap サイトまで届かな
いため、5'上流をプライマー伸長法及び5'RACE等で再度
単離解析せねばならない。 (3) 既存の完全長cDNAを単離する方法は、前述の従来の
いかなる方法もその効率が十分でない(100μg mRNAから
200 万組換え体ファージ）。そこで、実用的にはもっと
効率の高い手法の開発が望まれる。
【０００４】完全長cDNA合成法の従来の技術として、次
のような方法が挙げられる。5'Capサイトの標識法とし
て、酵母またはHela細胞のCap 結合蛋白を用いる方法
(I. Edery et al., "An Efficient Strategy To Isolat
e Full-Length cDNAs Based onan mRNA Cap Retention
Procedure (CAPture)", MCB, 15, 3363-3371, 1995)、
また5'Cap のない不完全cDNAをアルカリフォスファター
ゼによりリン酸を除去し、その後タバコモザイクウィル
スの脱キャップ酵素を反応させ、完全長cDNAのみリン酸
が露出することを利用した方法(K. Maruyama et al., "
Oligo-capping: asimple method to replace the cap s
tructure of eukaryotic mRNAs with oligoribonucleot
ides", Gene, 138, 171-174, 1995., S. Kato et al.,
"Construction of a human full-length cDNA bank",
Gene, 150, 243-250, 1995) 、等々が挙げられる。
のような方法が挙げられる。5'Capサイトの標識法とし
て、酵母またはHela細胞のCap 結合蛋白を用いる方法
(I. Edery et al., "An Efficient Strategy To Isolat
e Full-Length cDNAs Based onan mRNA Cap Retention
Procedure (CAPture)", MCB, 15, 3363-3371, 1995)、
また5'Cap のない不完全cDNAをアルカリフォスファター
ゼによりリン酸を除去し、その後タバコモザイクウィル
スの脱キャップ酵素を反応させ、完全長cDNAのみリン酸
が露出することを利用した方法(K. Maruyama et al., "
Oligo-capping: asimple method to replace the cap s
tructure of eukaryotic mRNAs with oligoribonucleot
ides", Gene, 138, 171-174, 1995., S. Kato et al.,
"Construction of a human full-length cDNA bank",
Gene, 150, 243-250, 1995) 、等々が挙げられる。
【０００５】これらの従来法の完全長cDNA合成法の効率
が十分でない理由として次の項目が挙げられる。 5'Cap サイトの認識が、アデノウィルスCap 結合蛋白
やタバコモザイクウィルスの脱キャップ酵素の様に蛋白
酵素の反応に依存している為、完全長cDNA(RNA)の選択
の段階で高い効率が期待できない。 逆転写酵素がcDNAの第１鎖を合成する際、5'Cap サイ
トまで合成鎖が伸長しない。 第１鎖が合成された後の第２鎖合成のプライマー配列
の付加、第２鎖の合成効率、２重鎖cDNAのクローニング
効率の問題。 以上の様に多段階にわたるcDNA合成ライブラリー作成に
おいては、〜の各ステップがそれぞれ問題となる。
が十分でない理由として次の項目が挙げられる。 5'Cap サイトの認識が、アデノウィルスCap 結合蛋白
やタバコモザイクウィルスの脱キャップ酵素の様に蛋白
酵素の反応に依存している為、完全長cDNA(RNA)の選択
の段階で高い効率が期待できない。 逆転写酵素がcDNAの第１鎖を合成する際、5'Cap サイ
トまで合成鎖が伸長しない。 第１鎖が合成された後の第２鎖合成のプライマー配列
の付加、第２鎖の合成効率、２重鎖cDNAのクローニング
効率の問題。 以上の様に多段階にわたるcDNA合成ライブラリー作成に
おいては、〜の各ステップがそれぞれ問題となる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明は、第１
に、完全長cDNAの単離を目的とする従来のキャップ結合
蛋白やタバコモザイクウィルスの脱キャップ酵素等の蛋
白酵素反応より効率良く5'Cap サイトの標識が可能な新
たな方法を提供すること、第２に、この新たな5'Cap サ
イトの標識方法を用いた完全長cDNAライブラリーの作成
方法を提供することを目的とする。
に、完全長cDNAの単離を目的とする従来のキャップ結合
蛋白やタバコモザイクウィルスの脱キャップ酵素等の蛋
白酵素反応より効率良く5'Cap サイトの標識が可能な新
たな方法を提供すること、第２に、この新たな5'Cap サ
イトの標識方法を用いた完全長cDNAライブラリーの作成
方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、mRNAの完全長
に対応するcDNAのライブラリーを作成する方法であっ
て、mRNAの5'Cap (7MeG ppp N)サイトに存在するジオー
ル構造に、タッグになる分子を結合させる工程、前記タ
ッグ分子を結合させたmRNAを鋳型とし、oligo dTをプラ
イマーとして逆転写によりRNA-DNA 複合体を形成する工
程、及び形成されたRNA-DNA 複合体の内、mRNAの完全長
に対応するDNA を有する複合体を、タッグ分子の機能を
利用して、分離する工程を含むことを特徴とする完全長
cDNAライブラリーの作成方法に関する。
に対応するcDNAのライブラリーを作成する方法であっ
て、mRNAの5'Cap (7MeG ppp N)サイトに存在するジオー
ル構造に、タッグになる分子を結合させる工程、前記タ
ッグ分子を結合させたmRNAを鋳型とし、oligo dTをプラ
イマーとして逆転写によりRNA-DNA 複合体を形成する工
程、及び形成されたRNA-DNA 複合体の内、mRNAの完全長
に対応するDNA を有する複合体を、タッグ分子の機能を
利用して、分離する工程を含むことを特徴とする完全長
cDNAライブラリーの作成方法に関する。
【０００８】
【発明の実施の態様】本発明の方法では、5'Cap サイト
の認識を高め、完全長cDNA(RNA) の選択の段階の効率を
高めるために、5'Cap サイトに特異的構造であるジオー
ル構造を利用して5'Cap サイトの標識を化学合成法によ
り行う（図１参照) 。即ち、本発明の方法では、mRNAの
5'Cap (7MeG ppp N)サイトに存在するジオール構造に、
タッグになる分子を化学結合させる。このタッグ分子は
5'Cap サイトに化学的に結合しており、タッグ分子で標
識されたmRNAを鋳型として完全長cDNAを合成し、完全長
cDNAライブラリーを作成する。
の認識を高め、完全長cDNA(RNA) の選択の段階の効率を
高めるために、5'Cap サイトに特異的構造であるジオー
ル構造を利用して5'Cap サイトの標識を化学合成法によ
り行う（図１参照) 。即ち、本発明の方法では、mRNAの
5'Cap (7MeG ppp N)サイトに存在するジオール構造に、
タッグになる分子を化学結合させる。このタッグ分子は
5'Cap サイトに化学的に結合しており、タッグ分子で標
識されたmRNAを鋳型として完全長cDNAを合成し、完全長
cDNAライブラリーを作成する。
【０００９】タッグ分子のmRNAの5'Cap サイトへの結合
は、図２に示すように、例えば、5'Cap サイトのジオー
ル構造を酸化剤、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム(NaI
O4) 等で酸化開環してジアルデヒドとし、次いでヒドラ
ジン末端を有するタッグ分子を前記ジアルデヒドと反応
させることで行うことができる。上記ヒドラジン末端を
有するタッグ分子としては、例えば、ヒドラジン末端を
有するビオチン分子やアビジン分子を挙げることができ
る。また、タッグ分子として抗原や抗体等の反応特異性
を有する分子を用いることもできる。タッグ分子として
用いる特異標識物には特に制限はない。
は、図２に示すように、例えば、5'Cap サイトのジオー
ル構造を酸化剤、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム(NaI
O4) 等で酸化開環してジアルデヒドとし、次いでヒドラ
ジン末端を有するタッグ分子を前記ジアルデヒドと反応
させることで行うことができる。上記ヒドラジン末端を
有するタッグ分子としては、例えば、ヒドラジン末端を
有するビオチン分子やアビジン分子を挙げることができ
る。また、タッグ分子として抗原や抗体等の反応特異性
を有する分子を用いることもできる。タッグ分子として
用いる特異標識物には特に制限はない。
【００１０】タッグ分子の結合から完全長cDNAのクロ
ーニングまでの工程の一例（タッグ分子：ビオチン）
が図３〜４に示されている。 ジオール基のビオチン化 第１のcDNA鎖の合成 リボヌクレアーゼＩ(RNase I) 消化 完全長cDNA複合体の捕獲（アビジンビーズ使用） RNase H 消化（アビジンビーズからの分離） ターミナル デオキシヌクレオチジル 転写酵素によ
るＧ末端の付加 オリゴＣでプライマーした第２鎖合成 SacI及びXhoIでの切断 λベクターによるクローニング
ーニングまでの工程の一例（タッグ分子：ビオチン）
が図３〜４に示されている。 ジオール基のビオチン化 第１のcDNA鎖の合成 リボヌクレアーゼＩ(RNase I) 消化 完全長cDNA複合体の捕獲（アビジンビーズ使用） RNase H 消化（アビジンビーズからの分離） ターミナル デオキシヌクレオチジル 転写酵素によ
るＧ末端の付加 オリゴＣでプライマーした第２鎖合成 SacI及びXhoIでの切断 λベクターによるクローニング
【００１１】タッグ分子を結合して標識したmRNAは、こ
れを鋳型とし、oligo dTをプライマーとして逆転写によ
りRNA-DNA 複合体を形成する。oligo dTをプライマーと
する逆転写法によるRNA-DNA 複合体の形成は、常法によ
り行うことができる。
れを鋳型とし、oligo dTをプライマーとして逆転写によ
りRNA-DNA 複合体を形成する。oligo dTをプライマーと
する逆転写法によるRNA-DNA 複合体の形成は、常法によ
り行うことができる。
【００１２】さらに、形成されたRNA-DNA 複合体の内、
mRNAの完全長に対応するDNA を有する複合体を、タッグ
分子の機能を利用して、分離する。具体的には、１本鎖
RNA を切断するRNA 分解酵素でRNA-DNA 複合体を消化し
て、mRNAの完全長に対応しないDNA を有する複合体の１
本鎖RNA 部を切断してこの複合体からタッグ分子を切除
し、次いで、タッグ分子を有するmRNAの完全長に対応す
るDNA を有する複合体（5'Cap まで伸長した完全長cDN
A）をタッグ分子の結合性を利用して分離する。例え
ば、タッグ分子がビオチン分子である場合、RNA-DNA 複
合体がタッグ分子として有するビオチン分子を、固相持
体上に担持したアビジンと結合させて、mRNAの完全長に
対応するDNA を有する複合体を分離することができる。
また、タッグ分子がアビジン分子である場合、RNA-DNA
複合体がタッグ分子として有するアビジン分子を、固相
持体上に担持したビオチンと結合させてmRNAの完全長に
対応するDNA を有する複合体を分離することもできる。
mRNAの完全長に対応するDNA を有する複合体を、タッグ
分子の機能を利用して、分離する。具体的には、１本鎖
RNA を切断するRNA 分解酵素でRNA-DNA 複合体を消化し
て、mRNAの完全長に対応しないDNA を有する複合体の１
本鎖RNA 部を切断してこの複合体からタッグ分子を切除
し、次いで、タッグ分子を有するmRNAの完全長に対応す
るDNA を有する複合体（5'Cap まで伸長した完全長cDN
A）をタッグ分子の結合性を利用して分離する。例え
ば、タッグ分子がビオチン分子である場合、RNA-DNA 複
合体がタッグ分子として有するビオチン分子を、固相持
体上に担持したアビジンと結合させて、mRNAの完全長に
対応するDNA を有する複合体を分離することができる。
また、タッグ分子がアビジン分子である場合、RNA-DNA
複合体がタッグ分子として有するアビジン分子を、固相
持体上に担持したビオチンと結合させてmRNAの完全長に
対応するDNA を有する複合体を分離することもできる。
【００１３】即ち、本発明の１つの態様は、mRNAの完全
長に対応するcDNAのライブラリーを作成する方法であっ
て、mRNAの5'Cap (7MeG ppp N)サイトに存在するジオー
ル構造に、ビオチン分子を結合させる工程、前記ビオチ
ン分子を結合させたmRNAを鋳型とし、oligo dTをプライ
マーとして逆転写によりRNA-DNA 複合体を形成する工
程、及び形成されたRNA-DNA 複合体を、１本鎖RNA を切
断するRNA 分解酵素で消化して、mRNAの完全長に対応し
ないDNA を有する複合体の１本鎖RNA 部を切断すること
によりこの複合体からビオチン分子を切除する工程 ビオチン分子が結合したmRNAの完全長に対応するDNA を
有する複合体を、固相持体上に担持したアビジンと結合
させて分離する工程を含むことを特徴とする完全長cDNA
ライブラリーの作成方法である。
長に対応するcDNAのライブラリーを作成する方法であっ
て、mRNAの5'Cap (7MeG ppp N)サイトに存在するジオー
ル構造に、ビオチン分子を結合させる工程、前記ビオチ
ン分子を結合させたmRNAを鋳型とし、oligo dTをプライ
マーとして逆転写によりRNA-DNA 複合体を形成する工
程、及び形成されたRNA-DNA 複合体を、１本鎖RNA を切
断するRNA 分解酵素で消化して、mRNAの完全長に対応し
ないDNA を有する複合体の１本鎖RNA 部を切断すること
によりこの複合体からビオチン分子を切除する工程 ビオチン分子が結合したmRNAの完全長に対応するDNA を
有する複合体を、固相持体上に担持したアビジンと結合
させて分離する工程を含むことを特徴とする完全長cDNA
ライブラリーの作成方法である。
【００１４】また、本発明の別の態様は、mRNAの完全長
に対応するcDNAのライブラリーを作成する方法であっ
て、mRNAの5'Cap (7MeG ppp N)サイトに存在するジオー
ル構造に、アビジン分子を結合させる工程、前記アビジ
ン分子を結合させたmRNAを鋳型とし、oligo dTをプライ
マーとして逆転写によりRNA-DNA 複合体を形成する工
程、及び形成されたRNA-DNA 複合体を、１本鎖RNA を切
断するRNA 分解酵素で消化して、mRNAの完全長に対応し
ないDNA を有する複合体の１本鎖RNA 部を切断すること
によりこの複合体からアビジン分子を切除する工程 アビジン分子が結合したmRNAの完全長に対応するDNA を
有する複合体を、固相持体上に担持したビオチンと結合
させて分離する工程を含むことを特徴とする完全長cDNA
ライブラリーの作成方法である。
に対応するcDNAのライブラリーを作成する方法であっ
て、mRNAの5'Cap (7MeG ppp N)サイトに存在するジオー
ル構造に、アビジン分子を結合させる工程、前記アビジ
ン分子を結合させたmRNAを鋳型とし、oligo dTをプライ
マーとして逆転写によりRNA-DNA 複合体を形成する工
程、及び形成されたRNA-DNA 複合体を、１本鎖RNA を切
断するRNA 分解酵素で消化して、mRNAの完全長に対応し
ないDNA を有する複合体の１本鎖RNA 部を切断すること
によりこの複合体からアビジン分子を切除する工程 アビジン分子が結合したmRNAの完全長に対応するDNA を
有する複合体を、固相持体上に担持したビオチンと結合
させて分離する工程を含むことを特徴とする完全長cDNA
ライブラリーの作成方法である。
【００１５】前記１本鎖RNA を切断するRNA 分解酵素と
しては、例えば、リボヌクレアーゼＩを挙げることがで
きる。尚、RNA-DNA 複合体からmRNAの完全長に対応する
DNAを有する複合体を選別する方法として、１本鎖RNA
を切断するRNA 分解酵素を用いる方法以外の方法を利用
することもできる。複合体を選別する方法にも特に制限
はない。
しては、例えば、リボヌクレアーゼＩを挙げることがで
きる。尚、RNA-DNA 複合体からmRNAの完全長に対応する
DNAを有する複合体を選別する方法として、１本鎖RNA
を切断するRNA 分解酵素を用いる方法以外の方法を利用
することもできる。複合体を選別する方法にも特に制限
はない。
【００１６】さらに本発明の方法では、分離されたmRNA
の完全長に対応するDNA を有する複合体から、cDNAを回
収する。cDNAの回収は、例えば、分離されたmRNAの完全
長に対応するDNA を有する複合体に、タバコモザイクウ
ィルスアルカリホスファターゼを反応させることにより
行うことができる。また、cDNAの回収は、分離されたmR
NAの完全長に対応するDNA を有する複合体に、DNA-RNA
ハイブリッドを切断するRNase を作用させることにより
行うこともできる。DNA-RNA ハイブリッドを切断するRN
ase としては、例えば、RNase H を挙げることができ
る。
の完全長に対応するDNA を有する複合体から、cDNAを回
収する。cDNAの回収は、例えば、分離されたmRNAの完全
長に対応するDNA を有する複合体に、タバコモザイクウ
ィルスアルカリホスファターゼを反応させることにより
行うことができる。また、cDNAの回収は、分離されたmR
NAの完全長に対応するDNA を有する複合体に、DNA-RNA
ハイブリッドを切断するRNase を作用させることにより
行うこともできる。DNA-RNA ハイブリッドを切断するRN
ase としては、例えば、RNase H を挙げることができ
る。
【００１７】回収された第１のcDNA鎖を鋳型として、第
２のcDNA鎖を合成し、得られた第２のcDNA鎖をクローニ
ングすることにより、完全長cDNAライブラリーを得るこ
とができる。第２のcDNA鎖の合成は、例えば、第１のcD
NA鎖の3'端にRNA またはDNAのオリゴマーをライゲーシ
ョンして得られたcDNA鎖を鋳型とし、かつライゲーショ
ンしたオリゴマーの相補鎖オリゴマーをプライマーとし
て行なうことができる。あるいは、第１のcDNA鎖の3'端
にターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて
ポリG 、ポリC 、ポリA 、又はポリT を付加したcDNA鎖
を鋳型とし、各々に相補的なオリゴC 、オリゴG 、オリ
ゴT 、又はオリゴA をプライマーとして、第２のcDNA鎖
の合成を行うこともできる。即ち、単離された完全長第
１鎖cDNAより第２鎖を合成する為に、ターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼによるホモポリマ
ー法(homopolymer法) やRNA リガーゼによる１本鎖プラ
イマーを、第１鎖cDNA3'端または5'Cap を除去されたmR
NAの5'鎖に付加しポリメラーゼで伸長方法等を用いるこ
とができ、第２鎖を合成する方法も特に制限はない。
２のcDNA鎖を合成し、得られた第２のcDNA鎖をクローニ
ングすることにより、完全長cDNAライブラリーを得るこ
とができる。第２のcDNA鎖の合成は、例えば、第１のcD
NA鎖の3'端にRNA またはDNAのオリゴマーをライゲーシ
ョンして得られたcDNA鎖を鋳型とし、かつライゲーショ
ンしたオリゴマーの相補鎖オリゴマーをプライマーとし
て行なうことができる。あるいは、第１のcDNA鎖の3'端
にターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて
ポリG 、ポリC 、ポリA 、又はポリT を付加したcDNA鎖
を鋳型とし、各々に相補的なオリゴC 、オリゴG 、オリ
ゴT 、又はオリゴA をプライマーとして、第２のcDNA鎖
の合成を行うこともできる。即ち、単離された完全長第
１鎖cDNAより第２鎖を合成する為に、ターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼによるホモポリマ
ー法(homopolymer法) やRNA リガーゼによる１本鎖プラ
イマーを、第１鎖cDNA3'端または5'Cap を除去されたmR
NAの5'鎖に付加しポリメラーゼで伸長方法等を用いるこ
とができ、第２鎖を合成する方法も特に制限はない。
【００１８】
【発明の効果】本発明によれば、mRNAの5'Cap サイトを
化学的に修飾を加えることにより、効率良く完全長cDNA
を選択できる。この利点は、修飾が5'Cap サイトを認識
する為の修飾が酵素反応に全く依存せず、mRNAの5'Cap
サイト構造に特徴的なdiol残基を利用した化学反応に依
存する為、バックグラウンドが低くなおかつ非常に高い
効率を得るものである。本発明の方法では、完全長cDAN
の回収を特異的選択性の高い RNase ONE処理ビオチン−
アビジン反応等を利用した固相化系で行うことができる
ため、量産的ロボティックスによるライブラリー生産を
も可能にする。
化学的に修飾を加えることにより、効率良く完全長cDNA
を選択できる。この利点は、修飾が5'Cap サイトを認識
する為の修飾が酵素反応に全く依存せず、mRNAの5'Cap
サイト構造に特徴的なdiol残基を利用した化学反応に依
存する為、バックグラウンドが低くなおかつ非常に高い
効率を得るものである。本発明の方法では、完全長cDAN
の回収を特異的選択性の高い RNase ONE処理ビオチン−
アビジン反応等を利用した固相化系で行うことができる
ため、量産的ロボティックスによるライブラリー生産を
も可能にする。
【００１９】
【実施例】本実施例は図３〜４にアウトラインを示す工
程からなる。本法は次の９つの工程よりなる。 ジオール基のビオチン化 第１のcDNA鎖の合成 リボヌクレアーゼＩ(RNase I) 消化 完全長cDNA複合体の捕獲（アビジンビーズ使用） RNase H 消化（アビジンビーズからの分離） ターミナル デオキシヌクレオチジル 転写酵素によ
るＧ末端の付加 オリゴＣでフライマした第２鎖合成 SacI及びXhoIでの切断 λベクターによるクローニング
程からなる。本法は次の９つの工程よりなる。 ジオール基のビオチン化 第１のcDNA鎖の合成 リボヌクレアーゼＩ(RNase I) 消化 完全長cDNA複合体の捕獲（アビジンビーズ使用） RNase H 消化（アビジンビーズからの分離） ターミナル デオキシヌクレオチジル 転写酵素によ
るＧ末端の付加 オリゴＣでフライマした第２鎖合成 SacI及びXhoIでの切断 λベクターによるクローニング
【００２０】RNA 調製 脳0.5 〜1gの組織片を10mlの懸濁液D でホモジェナイズ
し、pH4.0 の 2M 酢酸ナトリウム1ml と、同量のフェノ
ール/ クロロホルム( 体積比5:1)混液を加え抽出した。
抽出後水層に同量のイソプロパノールを加えると、RNA
が水相から分離沈澱した。この試料を氷の上で１時間イ
ンキュベーションした後、15分間4000rpm で冷却遠心機
にかけ、沈澱物を回収した。この検体を70％エタノール
で洗い、8ml の水に溶解後2ml の5MNaCl、1 ％CTAB(cet
yltrimethylammonium bromide)、4M尿素、50mMTrisを含
むpH7.0 の水溶液16mlを加えることでRNA を沈澱させ、
ポリサッカライドを除いた(CTAB 沈澱) 。続いて室温で
4000rpm 、15分間遠心機にかけ、RNA を4ml の 7M グア
ニジン−Clに溶解した。そして２倍量のエタノールを加
えた後、氷上で１時間インキュベーションし、15分間40
00rpm 遠心機にかけ、生じた沈澱物を70％エタノールで
洗いRNA を回収した、これを再度水に溶解し、RNA の純
度をOD比260/280(>1.8) と230/260(<0.45)を読むことに
よって計測した。
し、pH4.0 の 2M 酢酸ナトリウム1ml と、同量のフェノ
ール/ クロロホルム( 体積比5:1)混液を加え抽出した。
抽出後水層に同量のイソプロパノールを加えると、RNA
が水相から分離沈澱した。この試料を氷の上で１時間イ
ンキュベーションした後、15分間4000rpm で冷却遠心機
にかけ、沈澱物を回収した。この検体を70％エタノール
で洗い、8ml の水に溶解後2ml の5MNaCl、1 ％CTAB(cet
yltrimethylammonium bromide)、4M尿素、50mMTrisを含
むpH7.0 の水溶液16mlを加えることでRNA を沈澱させ、
ポリサッカライドを除いた(CTAB 沈澱) 。続いて室温で
4000rpm 、15分間遠心機にかけ、RNA を4ml の 7M グア
ニジン−Clに溶解した。そして２倍量のエタノールを加
えた後、氷上で１時間インキュベーションし、15分間40
00rpm 遠心機にかけ、生じた沈澱物を70％エタノールで
洗いRNA を回収した、これを再度水に溶解し、RNA の純
度をOD比260/280(>1.8) と230/260(<0.45)を読むことに
よって計測した。
【００２１】RNA のジオール部位へのビオチンの結合
（図２ステップ) RNA のジオール部位（１方はCAP 、他方はRNA の3'端）
にビオチンを結合させる為に、２段階の反応を行った。
即ち、ジオール基の酸化とそれに続くビオチンヒドラジ
ド(Sigma社) と酸化RNA 体のカップリング反応である。
まず、10〜20μg のmRNAを、pH4.5 の66mM酢酸ナトリウ
ム緩衝液と酸化剤としての過ヨウ素酸ナトリウムを含む
50μl 中の溶液で処理する。この酸化反応は遮光条件の
元、氷の上で45分間行う。続いて、5 μl の5Mリチウム
クロライド、1μl の10％SDS 、同量のイソプロパノー
ルを加え、-20 ℃で30分間インキュベーションした後、
4 ℃で15分間15000rpm遠心機にかけ沈澱させる。RNA の
沈澱物を70% エタノールで洗い、RNase-freeの水50μl
に再溶解させる。その試量にpH6.1 の1M酸化ナトリウム
5 μl 、10％SDS 5 μl 、更に10mM Biocytin Hydrazid
e(水溶液)150μl を加える。試料は室温(22-26℃) で終
夜インキュベーションし、最後に5M NaCl 5 μl 、pH6.
1 の1M酢酸ナトリウム7.5 μl 、および2.5 倍量のエタ
ノールを加え、氷の上で１時間インキュベーションした
後、4 ℃で15分間遠心し、ビオチン化したRNA を再沈澱
させる。RNA 沈澱物を70% エタノールで１回洗い、更に
80% エタノールで洗った。最後にRNase-freeの水に再溶
解したら、第１の cDNA 鎖の調製の材料として用いる。
（図２ステップ) RNA のジオール部位（１方はCAP 、他方はRNA の3'端）
にビオチンを結合させる為に、２段階の反応を行った。
即ち、ジオール基の酸化とそれに続くビオチンヒドラジ
ド(Sigma社) と酸化RNA 体のカップリング反応である。
まず、10〜20μg のmRNAを、pH4.5 の66mM酢酸ナトリウ
ム緩衝液と酸化剤としての過ヨウ素酸ナトリウムを含む
50μl 中の溶液で処理する。この酸化反応は遮光条件の
元、氷の上で45分間行う。続いて、5 μl の5Mリチウム
クロライド、1μl の10％SDS 、同量のイソプロパノー
ルを加え、-20 ℃で30分間インキュベーションした後、
4 ℃で15分間15000rpm遠心機にかけ沈澱させる。RNA の
沈澱物を70% エタノールで洗い、RNase-freeの水50μl
に再溶解させる。その試量にpH6.1 の1M酸化ナトリウム
5 μl 、10％SDS 5 μl 、更に10mM Biocytin Hydrazid
e(水溶液)150μl を加える。試料は室温(22-26℃) で終
夜インキュベーションし、最後に5M NaCl 5 μl 、pH6.
1 の1M酢酸ナトリウム7.5 μl 、および2.5 倍量のエタ
ノールを加え、氷の上で１時間インキュベーションした
後、4 ℃で15分間遠心し、ビオチン化したRNA を再沈澱
させる。RNA 沈澱物を70% エタノールで１回洗い、更に
80% エタノールで洗った。最後にRNase-freeの水に再溶
解したら、第１の cDNA 鎖の調製の材料として用いる。
【００２２】第１の cDNA 鎖の調製（図２ステップ） 10μg のビオチン化mRNAを使ってSuperscript II (Gibc
o BRL)の2000unitにより、0.5mM 5-methyl-dCTP 、1mM
dATP、1mM dTTP、1mM dGTPの存在化で、100 μl バッフ
ァー（50mM Tris-HCl, 75mM KCl, 3mM MgCl2, 10mM DT
T）の中で逆転写反応を行なった。プライマーとして、5
μg のオリゴヌクレオチド 3'NMTTTTTTTTTTTTGAGCTCTG
AATCAAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG5'（N:どの核酸塩基でも
可、M:G かAかC ）を用いた。反応は42℃、45分間行
い、続いて反応液を50℃で20分インキュベーションし
た。この反応を始める際、20μl の反応液を採取し、そ
れに1 μlの[ α-32P]-dGTP(3000Ci/mmol、10μCi/ μl
、Amersham) を加えることにより、第１の cDNA 鎖の
合成効率を測定した。RI標識した20μl の反応液中0.5
μlをDE-81 ペーパー上にスポットし、pH7.0 の0.5M−
リン酸ナトリウムで３回洗った前後のRI活性を測定し計
算した。
o BRL)の2000unitにより、0.5mM 5-methyl-dCTP 、1mM
dATP、1mM dTTP、1mM dGTPの存在化で、100 μl バッフ
ァー（50mM Tris-HCl, 75mM KCl, 3mM MgCl2, 10mM DT
T）の中で逆転写反応を行なった。プライマーとして、5
μg のオリゴヌクレオチド 3'NMTTTTTTTTTTTTGAGCTCTG
AATCAAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG5'（N:どの核酸塩基でも
可、M:G かAかC ）を用いた。反応は42℃、45分間行
い、続いて反応液を50℃で20分インキュベーションし
た。この反応を始める際、20μl の反応液を採取し、そ
れに1 μlの[ α-32P]-dGTP(3000Ci/mmol、10μCi/ μl
、Amersham) を加えることにより、第１の cDNA 鎖の
合成効率を測定した。RI標識した20μl の反応液中0.5
μlをDE-81 ペーパー上にスポットし、pH7.0 の0.5M−
リン酸ナトリウムで３回洗った前後のRI活性を測定し計
算した。
【００２３】完全長cDNAのRNase 保護（図２ステップ
） どのような塩基の箇所でも１本鎖RNA を消化することが
可能なRNase ONETTM(Promega社) で処理することによ
り、逆転写によって完全にcDNAが伸長されなかったmRN
A、およびmRNAの3'末端に標識されたビオチン残基を取
り除いた。具体的には第１鎖 cDNA 合成の際、RI標識さ
れた反応液20μl と非標識の80μl 分を一緒にプールし
た後、40μl のRNase I バッファー、355 μl の水、そ
して50unitのRNase I を使って試料を30分間30℃でイン
キュベーションした。
） どのような塩基の箇所でも１本鎖RNA を消化することが
可能なRNase ONETTM(Promega社) で処理することによ
り、逆転写によって完全にcDNAが伸長されなかったmRN
A、およびmRNAの3'末端に標識されたビオチン残基を取
り除いた。具体的には第１鎖 cDNA 合成の際、RI標識さ
れた反応液20μl と非標識の80μl 分を一緒にプールし
た後、40μl のRNase I バッファー、355 μl の水、そ
して50unitのRNase I を使って試料を30分間30℃でイン
キュベーションした。
【００２４】完全長cDNAの採取（図２ステップ) アビジンコートしたマグネティックビーズへの非特異的
吸着を防止する為、2.5mg の酵母tRNA(DNase Iで前処理
した) を加え、500 μl に調製し１時間氷上でインキュ
ベーションした。RNase I で処理したcDNAを上記の前処
理されたビーズに加え、pH8.0 の0.25M-EDTA、0.5M-NaC
l を含むバッファー中、磁気を帯びたビーズが沈澱しな
いよう、15分間室温で時折振り混ぜながらインキュベー
ションした。その後ビーズを pH8.0 0.5M-EDTAで４回、
0.4 ％SDS で１回、その後nuclease-free の水で３回洗
浄する。試料を100 μl のRNaseHバッファーの中で37℃
で30分間2 unitのRNaseHで処理後、0.1%のSDS と共にビ
ーズをインキュベーションすることによりビーズから完
全長cDNAを分離した。不完全なRNaseH処理の為ビーズか
ら離れないcDNAに関しては、更にpH9.0 、65℃で10分間
Tris-Formate バッファーの中でアルカリ加水分解を行
うことにより回収できる。回収された完全長１本鎖cDNA
はフェノール／クロロホルムで一度抽出され、G25/G50
sephadexクロマトグラフィーに付された。RI活性を持っ
たフラクションは表面をシリコン処理したエッペンドル
フチューブに集めて、試料を真空で引くことによって10
μl にまで減じた。
吸着を防止する為、2.5mg の酵母tRNA(DNase Iで前処理
した) を加え、500 μl に調製し１時間氷上でインキュ
ベーションした。RNase I で処理したcDNAを上記の前処
理されたビーズに加え、pH8.0 の0.25M-EDTA、0.5M-NaC
l を含むバッファー中、磁気を帯びたビーズが沈澱しな
いよう、15分間室温で時折振り混ぜながらインキュベー
ションした。その後ビーズを pH8.0 0.5M-EDTAで４回、
0.4 ％SDS で１回、その後nuclease-free の水で３回洗
浄する。試料を100 μl のRNaseHバッファーの中で37℃
で30分間2 unitのRNaseHで処理後、0.1%のSDS と共にビ
ーズをインキュベーションすることによりビーズから完
全長cDNAを分離した。不完全なRNaseH処理の為ビーズか
ら離れないcDNAに関しては、更にpH9.0 、65℃で10分間
Tris-Formate バッファーの中でアルカリ加水分解を行
うことにより回収できる。回収された完全長１本鎖cDNA
はフェノール／クロロホルムで一度抽出され、G25/G50
sephadexクロマトグラフィーに付された。RI活性を持っ
たフラクションは表面をシリコン処理したエッペンドル
フチューブに集めて、試料を真空で引くことによって10
μl にまで減じた。
【００２５】１本鎖cDNAのoligo dG テイリング（図２
ステップ） 上記により回収された１本鎖cDNAに oligo dG を付加す
る為、pH6.9 の200mM-NaCacodylate、1mM MgCl2 、1mM
CoCl2 、1mM 2-メルカプトエタノール、100 μMdGTP の
50μl バッファー下で37℃30分間32unitのターミナル
デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ(Takara
社) を用い反応させた。EDTAを最終濃度が50mMになるよ
うに加え、フェノール／クロロホルムで抽出後、G25/G1
00クロマトグラフィーに付された。回収されたdGテイリ
ング cDNA は真空吸引によってサンプルチューブ内で30
μl まで減じた。
ステップ） 上記により回収された１本鎖cDNAに oligo dG を付加す
る為、pH6.9 の200mM-NaCacodylate、1mM MgCl2 、1mM
CoCl2 、1mM 2-メルカプトエタノール、100 μMdGTP の
50μl バッファー下で37℃30分間32unitのターミナル
デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ(Takara
社) を用い反応させた。EDTAを最終濃度が50mMになるよ
うに加え、フェノール／クロロホルムで抽出後、G25/G1
00クロマトグラフィーに付された。回収されたdGテイリ
ング cDNA は真空吸引によってサンプルチューブ内で30
μl まで減じた。
【００２６】第２鎖cDNA合成（図２ステップ） 6 μl の第２鎖低バッファー(pH8.75 の 200mM Tris-C
l、100mM KCl 、100mM(NH4)2SO4 、20mM MgSO4、1% Tri
ton X100、1mg/mlBSA)、そして3 μl の第２鎖高バッフ
ァー (pH9.2 の 200mM Tris-Cl、600mM KCl 、20mM MgC
l2) とSacIおよびSpeIの制限酵素の認識配列を含む第２
鎖プライマー アダプター(5'GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCT
CACTAGTCCCCCCCCCCC3')600ng、0.25mMのdNTP'S、15unit
のExTaqポリメラーゼ (Takara社) 、150 unitのアンプ
リガーゼ、耐熱性 DNAリガーゼ(Epicentre社) 、3 unit
のハイブリダーゼ、耐熱性 RNase H (Epicentre 社) を
加え、 oligo dG-テイルド第１鎖cDNAを含む最終容量60
μl の液に調製した。この反応液を55℃で5 分間、続い
て0.3 ℃／分の割合で55℃から35℃まで徐々に温度を下
げ、15分間35℃、次に15分間72℃でサーマルサイクラー
で温度をコントロールし反応させる。アニーリング／伸
長は、35℃で1 時間と65℃で30分間、試料を１回インキ
ュベーションすることによって繰り返された。最後に試
料をフェノール/ クロロホルムで抽出し、エタノール沈
澱により回収した。
l、100mM KCl 、100mM(NH4)2SO4 、20mM MgSO4、1% Tri
ton X100、1mg/mlBSA)、そして3 μl の第２鎖高バッフ
ァー (pH9.2 の 200mM Tris-Cl、600mM KCl 、20mM MgC
l2) とSacIおよびSpeIの制限酵素の認識配列を含む第２
鎖プライマー アダプター(5'GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCT
CACTAGTCCCCCCCCCCC3')600ng、0.25mMのdNTP'S、15unit
のExTaqポリメラーゼ (Takara社) 、150 unitのアンプ
リガーゼ、耐熱性 DNAリガーゼ(Epicentre社) 、3 unit
のハイブリダーゼ、耐熱性 RNase H (Epicentre 社) を
加え、 oligo dG-テイルド第１鎖cDNAを含む最終容量60
μl の液に調製した。この反応液を55℃で5 分間、続い
て0.3 ℃／分の割合で55℃から35℃まで徐々に温度を下
げ、15分間35℃、次に15分間72℃でサーマルサイクラー
で温度をコントロールし反応させる。アニーリング／伸
長は、35℃で1 時間と65℃で30分間、試料を１回インキ
ュベーションすることによって繰り返された。最後に試
料をフェノール/ クロロホルムで抽出し、エタノール沈
澱により回収した。
【００２７】制限酵素による切断とクローニング（図２
ステップ） cDNAを、標準条件下で制限酵素であるエンドヌクレアー
ゼ、SacIおよびXhoIで処理し、引き続きSephadex G25-G
100 のクロマトグラフィーにかけた。フラクションは上
述のようにサンプルチューブに集めた。最後に、200ng
のcDNAが lambda ZapII ベクターに組み込まれた。この
ベクターは、製造者が推奨する5 μl バッファー中でSa
cIやXhoIおよび 200unitの T4 DNA リガーゼ(New Engla
nd Biolabs社) によって事前に調製しておいたものであ
る。
ステップ） cDNAを、標準条件下で制限酵素であるエンドヌクレアー
ゼ、SacIおよびXhoIで処理し、引き続きSephadex G25-G
100 のクロマトグラフィーにかけた。フラクションは上
述のようにサンプルチューブに集めた。最後に、200ng
のcDNAが lambda ZapII ベクターに組み込まれた。この
ベクターは、製造者が推奨する5 μl バッファー中でSa
cIやXhoIおよび 200unitの T4 DNA リガーゼ(New Engla
nd Biolabs社) によって事前に調製しておいたものであ
る。
【００２８】最終的に得られたライブラリーの評価 (1) 回収率、クローニング効率：各ステップの収率を表
１にまとめた。最終的に図５に示す様に10μg のmRNAを
出発材料とした場合、2 ×106 ヶのリコンビナント プ
ラークを得ることができた。
１にまとめた。最終的に図５に示す様に10μg のmRNAを
出発材料とした場合、2 ×106 ヶのリコンビナント プ
ラークを得ることができた。
【００２９】
【表１】
【００３０】(2) ライブラリーの評価：インスリン
レセプター mRNA (5.2kb) を用いて、その5'端（INS5:
TCCAAATGAAATGCTCCTCC, INS6: ATTGGCTCATGAAGGTTCT
T）、3'端（INS3: CTTTCTGGCAGTGACTATGA, INS4: TGTCC
GCATCGAGAAGAACA）を増幅する２つのプライマーセット
により、当遺伝子の5'端、3'端部がライブラリーの中に
含まれているか否かを測定した。図６に示すように第１
鎖 cDNA を選択しない場合とビーズに結合しなかった分
画には3'端部の224bp の増幅物が見られるが、5'端部の
170bp は見られなかったのに対し、本法で得られた完全
長ライブラリーは5'端部の170bp の産物が明瞭に見られ
る。
レセプター mRNA (5.2kb) を用いて、その5'端（INS5:
TCCAAATGAAATGCTCCTCC, INS6: ATTGGCTCATGAAGGTTCT
T）、3'端（INS3: CTTTCTGGCAGTGACTATGA, INS4: TGTCC
GCATCGAGAAGAACA）を増幅する２つのプライマーセット
により、当遺伝子の5'端、3'端部がライブラリーの中に
含まれているか否かを測定した。図６に示すように第１
鎖 cDNA を選択しない場合とビーズに結合しなかった分
画には3'端部の224bp の増幅物が見られるが、5'端部の
170bp は見られなかったのに対し、本法で得られた完全
長ライブラリーは5'端部の170bp の産物が明瞭に見られ
る。
【００３１】GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate deh
ydrogenase) 遺伝子を用いた末端の塩基配列−図７に示
す様にGAPDH 遺伝子を5'端プローブ3'端プローブで完全
長ライブラリーのレプリカフィルターにハイブリダイゼ
ーションを行った。3'端プローブでポジティブシグナル
を示したプラークの80％が5'端プローブにおいてもポジ
ティブを示すことにより、このライブラリーの80％は完
全長cDNAを示す。更にこれらより３ヶのクローンを単離
し、λファージDNA を調製後、インサート両端の塩基配
列をABI377で決定した。その結果を図８及び９に示す。
5'、3'端とも完全長cDNAが合成されていると考えられ
る。3'端は共通のサイトよりプライミングしており、5'
端もCap サイト特有のC 伸長−T 伸長構造がみられ、5'
サイトを完全に含んだライブラリーであることが証明さ
れた。
ydrogenase) 遺伝子を用いた末端の塩基配列−図７に示
す様にGAPDH 遺伝子を5'端プローブ3'端プローブで完全
長ライブラリーのレプリカフィルターにハイブリダイゼ
ーションを行った。3'端プローブでポジティブシグナル
を示したプラークの80％が5'端プローブにおいてもポジ
ティブを示すことにより、このライブラリーの80％は完
全長cDNAを示す。更にこれらより３ヶのクローンを単離
し、λファージDNA を調製後、インサート両端の塩基配
列をABI377で決定した。その結果を図８及び９に示す。
5'、3'端とも完全長cDNAが合成されていると考えられ
る。3'端は共通のサイトよりプライミングしており、5'
端もCap サイト特有のC 伸長−T 伸長構造がみられ、5'
サイトを完全に含んだライブラリーであることが証明さ
れた。
【図１】 両端（5'Cap サイト、3'サイト）にジオール
構造を有するmRNAの構造を示す。
構造を有するmRNAの構造を示す。
【図２】 mRNAの5'Cap サイトのジオール構造の酸化及
びビオチンヒドラジドの付加反応を示すスキーム。
びビオチンヒドラジドの付加反応を示すスキーム。
【図３】 完全長cDNA合成法の各ステップ（前半）を示
すスキーム。
すスキーム。
【図４】 完全長cDNA合成法の各ステップ（後半）を示
すスキーム。
すスキーム。
【図５】 完全長cDNAライブラリーの合成効率を示すス
キーム。
キーム。
【図６】 5'サイト、3'サイトのプライマーを用いた完
全長cDNA合成の確認。インスリンレセプターmRNAを例に
とり、両端のプライマーを用いて完全長cDNA合成産物の
存在を確認した。
全長cDNA合成の確認。インスリンレセプターmRNAを例に
とり、両端のプライマーを用いて完全長cDNA合成産物の
存在を確認した。
【図７】 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydro
genase) 5'、3'両末端のクローンをプローブとしたコロ
ニハイブリダイゼーション。 上図：コロニハイブリダイゼーションのパターン（左：
5'領域のプローブ、右：3'領域のプローブ） 下図：GAPDH mRNA 1228BP のマップ
genase) 5'、3'両末端のクローンをプローブとしたコロ
ニハイブリダイゼーション。 上図：コロニハイブリダイゼーションのパターン（左：
5'領域のプローブ、右：3'領域のプローブ） 下図：GAPDH mRNA 1228BP のマップ
【図８】 GAPDH の5'端のシーケンス。GAPDH のcDNAク
ローンをプローブに選択してきた３種のcDNAクローン
（18.1, 20.1, 22.1）の塩基配列。前記3 つのクローン
は報告されている5'塩基配列よりも、長い塩基配列であ
った。
ローンをプローブに選択してきた３種のcDNAクローン
（18.1, 20.1, 22.1）の塩基配列。前記3 つのクローン
は報告されている5'塩基配列よりも、長い塩基配列であ
った。
【図９】 GAPDH の3'端のシーケンス。GAPDH のcDNAク
ローンをプローブに選択してきた３種のcDNAクローン
（18.1, 20.1, 22.1）の塩基配列。完全長cDNA合成時の
oligo プライマーが見られる。
ローンをプローブに選択してきた３種のcDNAクローン
（18.1, 20.1, 22.1）の塩基配列。完全長cDNA合成時の
oligo プライマーが見られる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クラウディオ シュナイダー イタリア、99−34012 トリエステ パド リシアノ、サイエンス パーク、ラボラト リオ ナシオナーレ コンソルシオ イン テルユニバーシタリオ ビオテクノロジエ
Claims (16)
- 【請求項１】 mRNAの完全長に対応するcDNAのライブラ
リーを作成する方法であって、 mRNAの5'Cap (7MeG ppp N)サイトに存在するジオール構
造に、タッグになる分子を化学結合させる工程、 前記タッグ分子を結合させたmRNAを鋳型とし、oligo dT
をプライマーとして逆転写によりRNA-DNA 複合体を形成
する工程、及び形成されたRNA-DNA 複合体の内、mRNAの
完全長に対応するDNA を有する複合体を、タッグ分子の
機能を利用して、分離する工程を含むことを特徴とする
完全長cDNAライブラリーの作成方法。 - 【請求項２】 タッグ分子がmRNAの5'Cap サイトに存在
するジオール構造と結合可能な官能基を有するビオチン
分子であり、固相持体上に担持したアビジンと、RNA-DN
A 複合体がタッグ分子として有するビオチン分子との結
合性を利用して、mRNAの完全長に対応するDNA を有する
複合体を分離する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 タッグ分子がmRNAの5'Cap サイトに存在
するジオール構造と結合可能な官能基を有するアビジン
分子であり、固相持体上に担持したビオチンと、RNA-DN
A 複合体がタッグ分子として有するアビジン分子との結
合性を利用して、mRNAの完全長に対応するDNA を有する
複合体を分離する請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 mRNAの5'Cap サイトに存在するジオール
構造を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化開環してジアルデヒ
ドとし、次いでヒドラジン末端を有するタッグ分子を前
記ジアルデヒドと反応させることでタッグ分子を結合さ
せたmRNAを調製する請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 ヒドラジン末端を有するタッグ分子が、
ヒドラジン末端を有するビオチン分子またはアビジン分
子である請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 １本鎖RNA を切断するRNA 分解酵素で前
記RNA-DNA 複合体を消化して、mRNAの完全長に対応しな
いDNA を有する複合体の１本鎖RNA 部を切断してこの複
合体からタッグ分子を切除し、次いで、タッグ分子を有
するmRNAの完全長に対応するDNA を有する複合体を分離
する請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 mRNAの完全長に対応するcDNAのライブラ
リーを作成する方法であって、 mRNAの5'Cap (7MeG ppp N)サイトに存在するジオール構
造に、ビオチン分子を結合させる工程、 前記ビオチン分子を結合させたmRNAを鋳型とし、oligo
dTをプライマーとして逆転写によりRNA-DNA 複合体を形
成する工程、及び形成されたRNA-DNA 複合体を、１本鎖
RNA を切断するRNA 分解酵素で消化して、mRNAの完全長
に対応しないDNA を有する複合体の１本鎖RNA 部を切断
することによりこの複合体からビオチン分子を切除する
工程 ビオチン分子が結合したmRNAの完全長に対応するDNA を
有する複合体を、固相持体上に担持したアビジンと結合
させて分離する工程を含むことを特徴とする完全長cDNA
ライブラリーの作成方法。 - 【請求項８】 mRNAの完全長に対応するcDNAのライブラ
リーを作成する方法であって、 mRNAの5'Cap (7MeG ppp N)サイトに存在するジオール構
造に、アビジン分子を結合させる工程、 前記アビジン分子を結合させたmRNAを鋳型とし、oligo
dTをプライマーとして逆転写によりRNA-DNA 複合体を形
成する工程、及び形成されたRNA-DNA 複合体を、１本鎖
RNA を切断するRNA 分解酵素で消化して、mRNAの完全長
に対応しないDNA を有する複合体の１本鎖RNA 部を切断
することによりこの複合体からアビジン分子を切除する
工程 アビジン分子が結合したmRNAの完全長に対応するDNA を
有する複合体を、固相持体上に担持したビオチンと結合
させて分離する工程を含むことを特徴とする完全長cDNA
ライブラリーの作成方法。 - 【請求項９】 １本鎖RNA を切断するRNA 分解酵素がリ
ボヌクレアーゼＩである請求項６〜８のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項１０】 分離されたmRNAの完全長に対応するDN
A を有する複合体から、cDNAを回収する請求項１〜９の
いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１１】 cDNAの回収を、分離されたmRNAの完全
長に対応するDNA を有する複合体に、タバコモザイクウ
ィルスアルカリホスファターゼを反応させることにより
行う請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 cDNAの回収を、分離されたmRNAの完全
長に対応するDNA を有する複合体に、DNA-RNA ハイブリ
ッドを切断するRNase を作用させることにより行う請求
項１０記載の方法。用して、分離する工程 - 【請求項１３】 DNA-RNA ハイブリッドを切断するRNas
e がRNase H である請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 回収された第１のcDNA鎖を鋳型とし
て、第２のcDNA鎖を合成し、得られた第２のcDNA鎖をク
ローニングする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項１５】 第１のcDNA鎖の3'端にRNA またはDNA
のオリゴマーをライゲーションして得られたcDNA鎖を鋳
型とし、かつライゲーションしたオリゴマーの相補鎖オ
リゴマーをプライマーとして、第２のcDNA鎖の合成を行
なう請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 第１のcDNA鎖の3'端にターミナルヌク
レオチドトランスフェラーゼを用いてポリG 、ポリC 、
ポリA 、又はポリT を付加したcDNA鎖を鋳型とし、各々
に相補的なオリゴC 、オリゴG 、オリゴT 、又はオリゴ
A をプライマーとして、第２のcDNA鎖の合成を行う請求
項１５記載の方法。
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