明 細 書 修飾生理活性蛋白質及びそれを含有する医薬組成物 技術分野
本発明は、 トランスグルタ ミナ一ゼの基質となる G i n残基を有する生理活性 蛋白質と、 分枝型 G a lまたは分枝型 G a I NA cを有するアミノ酸誘導体の分 岐鎖リガン ドとを、 トランスグルタ ミナ一ゼの存在下に反応せしめて、 前記生理 活性蛋白質中のグルタミ ン残基の y—力ルポキシアミ ド基と前記分岐鎖リガン ド 中の末端一級ァミノ基との間にアミ ド結合を形成させることからなる、 肝実質細 胞表面に存在するァシァ口糖蛋白質レセブターに対する結合親和性がァシァ口ォ 口ソムコイ ドに比べ低い肝臓集積性を有する蛋白質の修飾体、 その製造方法、 及 び、 当該蛋白質を含有してなる医薬組成物に関する。
本発明の蛋白質の修飾体は、 その元となる生理活性蛋白質が有する生理活性を 保持しているので、 医薬などの有効成分と して有用である。 背景枝術
近年、 バイオテクノ ロジーの発展に伴い、 種々の生理活性蛋白質が大量生産可 能となり、 新しい医薬品の候補物質として期待を集めている。 しかし、 これらを 実用化するためには解決すべき問題が多数あり、 中でもその体内動態の厳密な制 御は治療効果増強と副作用軽減を達成するための重要な課題と考えられている。 例えば遺伝子組換え型ヒ トイ ンターロイキン一 2 ( r h I L - 2 ) の抗腫瘍効果 に関しては数多くの研究がなされ、 マウスの肉腫 ( S a r c o ma) 、 乳癌 (m a mm a r y t umo r) 等で効果が、 臨床的には黒色腫 (me l a n oma) , 血管内皮腫 (h ema n g i o e n d o t h e l i oma) 等で抗腫瘍効果が認 められているが、 消化器固形癌に対しては、 動物実験においても臨床的にも r h I L一 2単独では期待されたほどの効果が得られていない。 さらに r h I L— 2 は静脈内投与後の血中半减期が短いため、 その抗腫瘍効果を発揮するには高投与 量を必要とする。 ところが r h I L— 2を大量に投与するとキヤ ビラ リ一 リー
ク シ ン ド ローム ( c a p i l l a r y l e ak s y n d r ome) と呼ば れる深刻な副作用を起こ し、 肺や肝臓での浮腫などの影響を与える。 r h I L— 2の治療効果を上げるためにはその体内動態制御が必要となる。 このような問題 を解决するために、 最近 r h I L— 2封入リポゾーム、 あるいはガラク トース含 有リポソ一ムの I L一 2製剤を用い肝類洞細胞周囲に r h I L— 2を集積させ、 肝類洞リ ンパ球等の活性増強による転移性及び原発性肝癌に対する免疫療法の研 究がなされている (J p n. J . C a n c e r C h e mo t h e r , ( 1 99 4 ) , 2 1 ( 1 3 ) , 2 1 0 5 - 2 1 0 7 )
一方、 哺乳類の肝細胞には、 ガラク トース (G a lと略す) あるいは N-ァセ チルガラク トサミ ン (Ga l NA cと略す) を分枝型糖鎖末端にもつ糖蛋白質に 対する特異的な膜結合性レセブターであるァシァ口糖蛋白質レセプ夕一 (AS G Rと略す) が存在することが知られている (A s hwe l l , G . , e t a l . , An n u. R e v. B i o c h e m, 1 982 , 5 1, 5 3 1 — 554 ) 。 該レセブターによる糖蛋白質の取り込み機構は、 結合親和性が高くか つ強力なものである。 これらの性質、 さらに A S G Rが肝実質細胞に特異的に存 在するこ とから、 該レセブターは医薬品や遺伝子 D N Aを代謝的に重要な本細胞 へ特異的に送達させるためのターゲヅティ ングシステムとして注目されている (Wu , G. Y. , e t a l . , J . B i o l . C h e m. , ( 1 98 7 ) , 2 6 2 , 44 2 9 - 44 3 2 ) 0
該レセブターによる糖認識機構に関する単離した分枝型オリゴ糖鎖や合成 G a 1誘導体での構造一活性相関研究の結果、 結合親和性の強さは G a 1残基間の距 離と分枝パターンにより、 テトラアンテナ型 > ト リアンテナ型 > >バイアンテナ 型 > >モノアンテナ型 Ga lの順であることが明かとなっている (L e e , Y. C. , e t a 1. , J . B i o l . C h e m. , ( 1 9 8 3 ) , 2 58 , 1 9 9 - 2 02 ; K aw a g u c h i , K . , e t a l . , Ar c h. B i o c h e m. B i o p h y s . , ( 1 9 8 0 ) , 205 ,
3 88 - 3 9 5 ; C o n n o l l y D. T. , e t a l . , J . B i o l . C h em. , ( 1 9 82 ) , 2 5 7 , 93 9 - 945 ; L e e ,
R . T . , e t a 1. , B i o c h e m i s t r y, ( 1 9 84 ) ,
2 3 , 42 5 5 - 42 5 9 ) 0
これらの知見から G a 1あるいは Ga I NA cを分枝させた合成リガン ドを用 い D N Aゃリポソームを肝臓へ集積させ、 細胞内へ取り込ませる試みが行われた
(特開平 5— 2 02 08 5号 ; H a e n s l e r J . , e t a 1. , B i o c o n j u ga t e C h em. , ( 1 9 9 3 ) , 4 , 8 5— 9 3 ; Me rw i n, J . R. , B i o c o n j u g a t e C h em. , ( 1 9 9 4 ) , 5 , 6 1 2 - 6 2 0 ) 。
しかし、 このようなレセブターを介したエン ドサイ ト一シス機構を利用した ド ラヅグデリバリ一システム (DD Sと略す) においては、 合成した人工リガン ド による細胞内への取り込み効率の低さが課題となっている。 この原因はこれらの 合成リガン ドの A S G Rに対する結合親和性が、 天然のリガン ドであるァシァ口 ォロソムコイ ド (A S OR) やァシァ口フエツイ ン等の糖蛋白質糖鎖に比べ低い ためであることがわかってきた (L e e , R. T . , e t a 1. , G l y c o c o n j u g a t e J . , ( 1 9 8 7 ) 4, 3 1 7— 3 2 8 ; B i e s s e n , E . A. L . , e t a 1. , J . Me d . C h e m. , 1 9 9 5, 3 8 , 1 5 3 8— 1 5 46 ) 。 結合親和性が弱いために、 これらの G a l又は G a l N A cを有する合成したリガン ドは、 AS GRと十分に結合することができず、 肝 実質細胞へ取り込まれにく く、 薬効の発現が十分ではなかった。
一方、 我々は動物由来の トランスグルタ ミナ一ゼを利用して蛋白質を種々の化 合物のアルキルアミ ン誘導体により位置選択的に修飾するための方法を開発して きた。 しかし、 この方法では、 生理活性蛋白質、 例えば r h I L— 2等のアミノ 酸配列の中のグルタ ミ ン残基に直接アルキルアミ ン誘導体を結合させることは困 難であり、 当該生理活性蛋白質に動物由来の トランスグルタ ミナーゼにより結合 可能なグルタ ミ ン残基を有するペプチドを導入する とによ り、 当該生理活性蛋 白質誘導体とアルキルアミ ン誘導体とが結合した修飾体を得ていた (P C T/J P 9 5/0 0 2 98 (WO 9 6/0 6 1 8 1 ) ) 。
さ らに我々は、 トランスグルタ ミナ一ゼのうち特に蛋白質中の G l n残基に対 する基質特異性が広い微生物由来トランスグル夕 ミナーゼ (B— T G) を利用す ることにより、 生理活性蛋白質、 例えば r h I L— 2等のアミノ酸配列に新たな
ペプチ ド分子を導入するこ となしに、 当該生理活性蛋白質のアミ ノ酸配列中のグ ル夕 ミ ン残基を位置選択的に、 ポリ リジンやポリエチレングリコールなどのポリ アルキレングリコールのアルキルアミ ン誘導体を用いて修飾を行い得ることを開 発してきた (特願平 6— 2 7 0 1 0 2号 (特開平 8— 8 9 2 7 8号) ; P CT/ J P 9 5/0 1 9 9 4 (WO 9 6/ 1 0 0 89 ) ) 。
本発明者らは、 このような合成リガン ドで修飾した修飾体の A S G Rに対する 結合親和性が弱く、 当該修飾体が肝実質細胞に取り込まれに くいという問題点や、 このような合成リガン ドで修飾した修飾体を製造するためには生理活性蛋白質に G 1 n残基を有するぺブチ ドを結合させなければならないという問題点を解決す るために、 種々検討してきた。
本発明者らは、 このような合成リガン ドで修飾した生理活性蛋白質の修飾体が、 肝臓において肝実質細胞以外の細胞、 例えば肝類洞リンパ球等に直接作用して当 該生理活性蛋白質の薬理効果を発現することができれば、 このような合成リガン ドで修飾した修飾体の持っている肝実質細胞に対する結合親和性の低さを逆に利 用することによ り、 サイ ト力イ ン等の生理活性蛋白質を肝臓へ集積させ、 さらに 肝実質細胞へは取り込まれにくいので肝臓中での生理活性蛋白質の保持が可能で あることから、 肝臓中における他の標的細胞の細胞膜上に存在する特異的レセブ ターに結合することにより、 サイ トカイ ンの作用の発現が期待できることに着目 した。
また、 肝臓への夕一ゲッティ ングにより、 肺などへの移行量を減少させること になるので、 rhIL-2 の標的臓器以外における副作用を减少させることも可能とな る。
そして、 このような肝臓集積性を有し、 肝実質細胞に取り込まれることなく肝 類洞リ ンパ球等の活性増強により生理活性蛋白質の薬理効果を有効に発現させる ためには、 当該生理活性蛋白質をリポソームなどで製剤化するのではなく、 直接 かつ可能な限り生理活性蛋白質の活性を保持したまま修飾する必要があると考え られた。
例えば、 r h I L— 2の活性を保持したまま位置選択的に分枝型の G a 1又は Ga l NA cなどの合成リガン ドで修飾し、 r h I L— 2を肝実質細胞に取り込
まれることなく、 肝実質細胞周辺に集積させることができれば、 標的細胞である 肝類洞リ ンパ球上の I L一 2 レセブター ( I L— 2 R ) に結合することにより、 それらの活性を増強させ、 転移性及び原発性肝癌に対する抗腫癟効果が期待され ることに着目 した。
しかし、 このような分岐型リガン ドで修飾した蛋白質の肝臓集積及び肝臓にお ける活性発現についての知見はまだ得られておらず、 ま してや標的臓器以外の副 作用の低下についての知見はこれまで全く得られていなかった。 発明の開示
本発明者らは、 微生物由来の トランスグルタ ミナーゼ (B— T G ) を用いて、 酸性又は塩基性ァミ ノ酸骨格を持つ分枝型 G a 1 リガン ドで位置選択的に修飾し た遺伝子組換えヒ トインターロイキン一 2 ( r h I L - 2 ) などの生理活性物質 が、 未修飾体に対し生物活性を保持し、 肝臓集積性を示し、 且つ肝実質細胞へ取 り込まれにく く、 さらにはマウス肝癌モデルにおいて未修飾 r h I L— 2に対し 強く腫癌縮小させるとの知見を得た。 同様に分枝型 Gal リガン ドで修飾したヒ ト インタ一フエロン-ひが未修飾体に対し生物活性を保持し、 肝臓集積性を示すとの 知見を得た。
さらに 2種の トランスグル夕 ミナーゼを用い該 G a l リガン ドとポリエチレン グルコール誘導体とをそれそれ位置選択的に 1分子づっ導入した I L一 2由来融 合蛋白質は、 より高い肝臓集積性を示すという知見を得た。
本発明はかかる知見に基づき完成された。
即ち、 本発明の目的は、 合成リガン ドの A S G Rに対する結合親和性が天然型 糖鎖に比べ弱いことを利用し、 肝臓において生理活性の発現が期待される蛋白質 をリガン ド修飾し、 該生理活性蛋白質を透択的に肝臓へ集積させ、 肝臓中に存在 する該生理活性蛋白質に対する標的細胞を活性化したり、 発生する活性酸素を除 去することにより、 抗腫瘍効果、 抗ウィルス効果、 抗炎症効果等の増強を計ると ともに、 血中及び他の臓器への移行量を減少させることにより副作用を軽減させ た生理活性蛋白質の修飾体、 及び、 それを含有してなる肝臓集積性に優れた医薬 組成物を提供することである。
また、 本発明の目的は、 前記の生理活性蛋白質の修飾体及び製薬上許容される 担体とを含有してなる肝臓集積性を有し副作用を軽減させた医薬組成物を提供す ることにある。
さらに、 本発明の目的は、 微生物由来の ト ラ ンスグルタ ミナ一ゼを用いて生理 活性蛋白質を位置選択的に修飾することにより、 生理活性蛋白質の修飾体の製造 方法を提供することにある。
本発明は、 分子量が 1 X 1 0 3〜 2 X 1 0 5の範囲であって、 少なく とも 1個の ト ラ ンスグルタ ミナ一ゼの基質となる G l n残基を有する生理活性蛋 ΰ Κと、 肝 実質細胞表面に存在するァシァ口糖蛋白質レセブターに対する結合親和性がァシ ァロォ口ソムコイ ドに比べ低く、 かつ、 トランスグルタ ミナ一ゼの基質となるァ ミノ基及びガラク トース ( G a l ) 基又は N—ァセチルガラク トサミ ン ( G a l N A c ) 基を有するアミノ酸誘導体からなる分岐鎖リガン ドとを、 微生物由来の トランスグルタ ミナーゼの存在下に反応せしめて、 前記生理活性蛋白質中のグル タ ミ ン残基のァ —カルポキシアミ ド基と前記分岐鎖リガン ド中の末端ァミノ基と の間にアミ ド結合を形成させることにより製造し得る生理活性蛋白質の修飾体、 及び、 製薬上許容される担体とを含有してなる肝臓集積性を有する医薬組成物に 関する。
また、 本発明は、 分子星が 1 X 1 0 3〜 2 X 1 0 5の範囲であって、 少なく とも 1個の トランスグルタ ミナ一ゼの基質となる G i n残基を有する生理活性蛋白質 と、 肝実質細胞表面に存在するァシァ口糖蛋白質レセブタ一に対する結合親和性 がァシァ口才口ソムコイ ドに比べ低く、 かつ、 トランスグルタ ミナ一ゼの基質と なるア ミノ基及びガラク トース ( G a l ) 基又は N—ァセチルガラク トサミ ン ( G a l N A c ) 基を有するアミノ酸誘導体からなる分岐鎖リガン ドとを、 微生 物由来の 卜ラ ンスグルタ ミナ一ゼの存在下に反応せしめて、 前記生理活性蛋白質 中のグルタ ミ ン残基の y—カルボキシアミ ド基と前記分岐鎖リガン ド中の末端ァ ミノ基との間にアミ ド結合を形成させることにより製造し得る、 肝実質細胞表面 に存在するァシァ口糖蛋白質レセブターに対する結合親和性がァシァ口才ロソム コイ ドに比べ低い肝臓集積性を有する生理活性蛋 ή質の修飾体に関する。
さらに、 本発明は、 分子量が 1 X 1 0 3〜 2 X 1 0 5の範囲であって、 少なく と
も 1個の トラ ンスグルタ ミナ一ゼの基質となる G l n残基を有する生理活性蛋白 質と、 肝実質細胞表面に存在するァシァ口糖蛋白質レセブターに対する結合親和 性がァシァ口才口ソムコイ ドに比べ低く、 かつ、 トランスグルタ ミナ一ゼの基質 となるアミノ基及びガラク ト一ス (Ga l ) 基又は N—ァセチルガラク トサミ ン (G a l NA c ) 基を有するアミノ酸誘導体からなる分岐鎖リガン ドとを、 微生 物由来の トラ ンスグルタ ミナーゼの存在下に反応せしめて、 前記生理活性蛋白質 中のグルタミ ン残基の y—力ルポキシアミ ド基と前記分岐鎖リガン ド中の末端ァ ミノ基との間にアミ ド結合を形成させてなる、 前記生理活性蛋白質の修飾体の製 造方法に関する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 ( G a 1 ) 3 の合成方法を示す。
第 2図は、 P E G 1 2の合成方法を示す。
第 3図は、 ( G a 1 N A c ) 3 の合成方法を示す。
第 4図は、 (Ga l ) 一 T y r— B o c及び (Ga l NA c ) 3 — T y r— B 0 cの合成方法を示す。
第 5図は、 (G a l ) 3- r h I L _ 2、 (Ga l NA c ) 3- r h I L- 2, 及び、 A S 0 Rの血漿及び肝臓中の濃度推移を示す。
第 6図は、 (G a l ) 3— r h I L— 2の A S◦ R同時投与における臓器分布を 示す。
第 7図は、 (G a l ) 3— I N F—ひの A S 0 R同時投与における臓器分布を示 す。
第 8図は、 P E G 1 2、 (G a l ) 3— r X 2— I L一 2の血漿及び肝臓中の瀵 度推移を示す。
第 9図は、 (Ga l ) 3— r h I L— 2及び (G a l NA c) r h I L - 2 のマウス分離肝細胞への取り込み及び分解量の推移を示す。
第 1 0図は、 (G a l ) 3— r h I L— 2の S 9 08. D 2. v p 2肝移植系マ ウスにおける効果を示す。
第 1 1図は、 (G a l ) r h I L— 2の副作用の結果 (臓器重量測定) を示
す。
第 1 2図は、 (G a l) 3— r h I L— 2の副作用の結果 (血液生化学試験) を 示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明の分子量が l x l 03〜 2 x l O sの範囲、 好ま しくは 2 x 1 03〜2 x l 05、 より好ま しくは 5 X 1 03〜 2 X 1 05の範囲であって、 少なく とも 1個のト ランスグルタ ミナ一ゼの基質となる G l n残基を有する生理活性蛋白質と しては、 肝臓へ集積させることにより活性の增強ゃ副作用の軽减が得られる蛋白質であり、 好ま しくは分子中に微生物由来トランスグルタ ミナ一ゼの基質となるグルタ ミ ン 残基を少なく とも 1個有するものであれば特に制限はない。 本発明の生理活性蛋 白質を例示すれば、 例えば、 肝細胞成長因子 (H G F) 等の肝細胞増殖調節因子 ; イ ンターロイ キン一 2 ( I L - 2 ) 、 イ ンタ一ロイキン一 1 2 ( I L— 1 2 ) 、 インターフェロン一ひ、 イ ンターフェロン一/?、 腫瘈壊死因子 (TN F) 等のサ ィ トカイ ン ; スーパーォキサイ ドデイスムターゼ ( S OD) 等の抗酸化酵素等が 挙げられる。 特に、 インターロイキン一 2 ( I L— 2 ) やイ ンターフェロ ンなど は肝臓への蓄積が望まれており好ま しい例である。
これらの生理活性蛋白質はその由来を問わず、 動物由来のものであっても、 植 物由来であっても、 微生物由来であってもよい。 また、 大腸菌、 酵母、 チヤィニ ーズハムスターォバリ一細胞等にこれらの蛋 0苣の遺伝子を組み込み発現させて 生産された蛋白質であってもよい。 また、 本発明の生理活性蛋白質は、 共存蛋白 質による影響を最小限に抑えるため、 使用前に可能な限り精製しておくのが望ま しい。
本発明の該生理活性蛋白質は、 分子中に トランスグルタ ミナ一ゼ、 より望ま し くは微生物由来の トランスグルタ ミナ一ゼに対する基質となる G 1 η残基を少な く とも 1個有するものが好ま しい。 生理活性蛋白質の分子中の G i n残基が微生 物由来の トランスグル夕 ミナ一ゼに対する基質とな りうるかについては、 佐藤ら の (P C T/J P 9 5/0 0 2 98 ) 蛍光剤である MD Cの導入を確認する方法
に準じて行うことができる。
生理活性蛋白質の分子中にこのような G 1 n残基がない場合には、 微生物由来 の トランスグルタ ミナ一ゼに対する基質となる G 1 n残基を少なく とも 1個有す るペプチ ドを当該生理活性蛋白質の C末端又は N末端などに結合させて、 当該生 理活性蛋白質に微生物由来の トランスグルタ ミナーゼに対する基質となる G i n 残基を導入することもできる。 このためのペプチ ドとしては、 アミ ノ酸数が 3 ~ 2 0個程度のものであり、 少なく とも 1個の G i n残基を有するものである。 よ り具体的には、 アミノ酸の一文字表記法で、
P— K一 P— Q— Q— F— M、
R-P -K -P -Q-Q - F -G-L,
R-P -K - P - Q-Q- F -M,
で示されるアミ ノ酸配列を有するぺブチ ドを例示することができる。
生理活性蛋白質に微生物由来の トランスグルタ ミナーゼに対する基質となる G I n残基を有するペプチドを導入する方法は、 佐藤らの方法 (WO 9 6/0 6 1 8 1 ) に基づいて行うことができる。
また、 生理活性蛋白質の分子中に微生物由来の トランスグルタ ミナーゼに対す る基質となる G i n残基を有する場合 ( I L一 2のような場合) であっても、 さ らに前記のようなペプチ ドを結合させることができる。 このような場合には微生 物由来の ト ラ ンスグルタ ミナーゼが選択的に分子中の G i n残基と反応し、 当該 ペプチ ド中の G i n残基を基質特異性の異なる微生物由来の 卜ラ ンスグルタ ミナ ーゼ以外の トランスグルタ ミナーゼ、 例えば、 哺乳類由来の トランスグルタ ミナ ーゼと反応させることにより、 生理活性蛋白質を異なる 2種以上のリガン ドで修 飾することもできる。
例えば、 I L— 2で例示すれば、 I L— 2の N末端に P— K一 P— Q— Q— F 一 Mのようなァミノ酸配列を有するぺプチ ドを結合させて、 動物由来の ト ラ ンス グルタ ミナーゼを用いて当該ぺブチ ド中の G 1 n残基にポリエチ レ ングリ コール アルキルアミ ンなどのリガン ドを導入し、 次いで微生物由来の トランスグルタ ミ ナーゼを用いて本発明の分岐鎖リガンドを選択的に I L— 2のアミノ酸配列中に 導入することができる。
微生物由来の トランスグルタ ミナ一ゼを用いることにより、 分子中の特定の位 置の G 1 n残基のみに選択的に目的とする リガン ドを導入することができるとい うことを見出したことも本発明の知見のひとつである。
本発明に用いる分岐鎖リガン ドと しては、 肝実質細胞表面に存在する A S G R に対する結合親和性が A S O Rに比べ低いもの、 より望ましくはマウス分離肝細 胞を用いた取り込み実験において、 そのリガン ドによる修飾蛋白質が細胞内に取 り込まれないものである。 即ち、 ァシァ口フェツイ ンあるいは A S 0 R糖鎖中の ガラク ト一スを末端にもつ分枝型糖鎖構造をもとに合成した 2分枝あるいは 3分 枝型のガラク トースあるいは N—ァセチルガラク トサミ ンを含有するリガン ドで ある。 分枝のための骨格構造と してはグルタ ミ ン酸、 ァスパラギン酸、 リ ジン等 の酸性アミノ酸又は塩基性アミ ノ酸からなるアミ ノ酸、 あるいは ト リス (ヒ ドロ キシメチル) ァミノメタン等が挙げられる。 さらに、 トランスグルタ ミナーゼの 基質となるため、 末端にアルキルァミ ン基を有するものである。
よ り詳細には、 本発明の トランスグルタ ミナ一ゼの基質となるアミ ノ基及びガ ラク トース (G a l ) 基又は N—ァセチルガラク トサミ ン (G a l NA c ) 基を 有するアミノ酸誘導体からなる分岐鎖リガン ドは、 次式一般式 ( I )
Z一 A A— W ( I )
(式中、 AAは置換基 Z又は Wのいずれのほうが N—末端であってもよい 1個 又は 2個の塩基性ァミノ酸又は酸性ァミ ノ酸を示し、 AAが 2個のアミノ酸か らなるときはこれらのァ ミ ノ酸はひ位又はひ位以外の位置でァミ ド結合をして いてもよく、
Wは式一 X 1— ( C H2) n - N H 2 (式中、 nは 1〜8の整数であり、 X1は W が AAで示されるアミノ酸のァミ ノ基に結合する場合は一 CO—を示し、 Wが AAで示されるアミノ酸のカルボキシル基に結合する場合は— NH—を示す。 ) で示されるアルキルアミ ン誘導体であり、
Zは式一 X2— ( C H 2 C H 20 ) p— R又は式— X2— ( C H 2) q - 0 R (式 中、 Rはガラク トース (G a l ) 又は N—ァセチルガラク トサミ ン (Ga l N A c ) であり、 pは 1〜6の整数であり、 qは 1〜1 8の整数であり、 X2は Z が A Aで示されるァミノ酸のァミ ノ基に結合する場合は一 CO—を示し、 が
AAで示されるアミノ酸のカルボキシル基に結合する場合は一 NH—を示す。 ) で示される G a lまたは Ga l NA cを有する基である。 )
で示される分枝型 G a l又は G a l NA cを有するアミ ノ酸誘導体が好ま しい。 前記一般式 ( I〉 で示される分岐鎖リガン ドの基 AAとしては、 1個又は 2個 の同一又は異なるグルタ ミ ン酸又はァスパラギン酸から誘導されるものが好ま し い。
さらに詳細には、 本発明の分岐鎖リガン ドと して次式 ( I I ) から (XV) で 示される化合物を例示することができる。
X-CO X-CO
(II)
NH-Y (III)
NH-Y X-C
X-CO
(上記一般式 ( I I ) ~ (X I ) 中、 Xは R— ( 0 C H C H 2) p— NH—ま たは R— 0 ( C H q - N H - (ただし、 Rはガラク トースまたは N—ァセチル ガラク トサミ ン、 pは 1〜 6の整数、 qは 1〜 1 8の整数) であり、 Yは一 C O - ( C H N H 2 (ただし、 nは 1 ~ 8の整数) である。 )
Z-NH
(XII)
CO-W
1-N
-NH •NH
■NH : -NH
CONrVco-w ( IV)
(上記一般式 (X I I ) 〜 (X I V) 中、 Zは R ( 0 C H
2C H
2)
PC〇一また は R— 0 ( C H
2)
qC0— (ただし、 Rはガラク トースまたは N—ァセチルガラ
ク トサミ ン、 pは 1〜 6の整数、 qは 1〜 1 8の整数) であり、 Wは一 NH ( C H
2) nN Η (ただし、 ηは 1〜 8の整数) である。 )
(上記一般式 (XV) 中、 Qは R ( 0 C H 2 C H 2) —または R— 0 ( C H 2) ·>- (ただし、 Rはガラク トースまたは N—ァセチルガラク トサミ ン、 pは 1 ~ 6 の整数、 qは 1〜 1 8の整数であり、 Yは— C 0 ( C H nN H 2 (ただし、 nは 1〜 8の整数) である。 )
本発明の分岐鎖リガン ドと しては、 その目的に応じて、 また、 生理活性蛋白質 の種類に応じて、 前記した種々のものを使用することができる。 より具体的には、 一般式 ( I V) で示される 卜 リアンテナ型のリガン ドが好ま しく、 さらに具体的 には次式 (XV I )
(式中、 G a lはガラク トースを示す。 )
で示される リガン ド (以下、 (G a l ) 3ともいう。 ) や、 次式 (XV I I )
(式中、 Ga l NA cは N—ァセチルガラク トサミ ンを示す。 )
で示される リガン ド (以下、 (Ga l NA c ) 3ともいう。 ) が好ま しい。 なお、 前記式 (XVI) で示されリガン ド (G a l ) 3は、 第 1図の化合物 ( 3— 1 4) で 示される リガン ドであり、 前記式 (XVII) で示されるリガン ド (G a l NA c ) 3は、 第 3図において化合物 ( 1 4) と して示される リガン ドである。
本発明の分岐鎖リガン ドは、 通常の有機化学の合成方法により製造することが できる。 通常は、 モノ又はジアミノ酸にブトキシカルポニル基などのペプチ ド化 学で常用される保護基で保護されたァミ ノ基を冇するアルキル基の誘導体を反応 させて、 モノ又はジアミノ酸のァミノ基が保護されたアルキルアミ ン誘導体を形 成させ、 次いで G a 1基又は G a 1 N A c基を有する基を導入させた後、 保護基 を脱離させて目的とするリガン ドを合成することができる。 また、 前記反応にお いて、 アルキルアミ ン基の導入と G a l基又は G a l NA c基を有する基の導入 の順序を逆にすることもできる。
より詳細には、 一般式 ( I I ) から (X I ) で表される分岐鎖リガン ドの合成 は、 例えば次のようにして行うことができる。 即ち、 特公平 5— 2 0 2 0 8 5号 における方法にしたがってグルタ ミ ン酸、 ァスパラギン酸を利用して N— B o c 一アルキルアミ ンが結合した分枝型骨格構造を構築する。 次にその力ルポキシル 基と、 糖の水酸基をァセチル基で保護した ト リエチレングリ コ一ルァミ ン誘導体 のァミ ノ基とを、 脱水縮合条件下、 具体的には反応に関与しない溶媒 (例えば、 ァセ トニ ト リル、 ジメチルホルムアミ ド、 塩化メチレン、 塩化エチレン等) 中で、 適当な触媒 (例えば、 N—ヒ ドロキシスクシンイ ミ ド、 N, N ' ージシクロへキ シルカルポジイ ミ ド等) の存在下、 0 °C〜室温の反応温度で 1〜 2 4時間反応さ せた後、 脱保護することにより得ることができる。
一般式 (X I I ) から (X I V) で表される化合物の合成は、 H a e s 1 e r らの方法 (B i o c o n j u g a t e C h e m. , ( 1 9 9 3 ) , 4, 8 5— 9 3 ) をもとにリ ジンを利用してアルキルアミン結合分枝型骨格構造を構 築することができる。
一般式 (XV) で表される化合物の合成は、 B i e s s e nらの方法 (J . Me d . C h em. , ( 1 9 9 5 ) , 3 8 , 1 5 3 8— 1 5 4 6 ) をも
とに ト リス (ヒ ドロキシメチル) ァミノメタンを利用しアルキルアミ ン結合分枝 型骨格構造を構築することができる。
前記した方法に準じて式 (XV I ) で示される リガン ドを製造することができ る (第 1図参照) 。 また、 前記式 (XV I I ) で示される (G a l NA c ) 3 も これらの方法に準じて製造することもできるが、 以下に示す方法によ り効率的に 製造することができる (第 3図参照) 。
まず、 ガラク トサミ ン又はその塩をァセチル化して、 水酸基が保護基で保護さ れた N—ァセチルガラク トサミ ンを得、 次いでこれを ト リフルォロメタンスルホ ン酸 ト リメチルシリルなどの縮合剤の存在下に閉環させて次式 (XV I I I )
(式中、 Qは、 水素原子又は水酸基の保護基を示す。 )
で示される化合物とする。 この式 (XV I I I ) で示される化合物の保護基がァ セチル基である化合物が、 ^ 3図中で化合物 ( 8 ) として記載されている化合物 である。
—方、 2— [ 2— (2—クロ口エ トキシ) エトキシ] エタノール (第 3図中の 化合物 ( 1 ) ) を、 カリゥムフ夕ルイ ミ ドなどの金厲化ィ ミ ドなどを用いてァミ ノ化し、 生成したアミノ基をべンジルォキシカルポニル基などの保護基で保護し た化合物 (第 3図中の化合物 ( 4 ) ) を製造する。
得られたァミ ノ基が保護された 2— [ 2— ( 2—アミノエ トキシ) エ トキン] エタノールと、 前記式 (XV I I I ) で示される化合物を ト リフルォロメタンス ルホン酸ト リメチルシリルなどの縮合剤の存在下に反応させた後、 保護基を脱離 させると次式 (X I X)
98/13381
(式中、 Qは、 水素原子又は水酸基の保護基を示す。 )
で示される化合物を製造するこ とができる。 この式 (X I X) で示される化合物 の N—ァセチルガラク トサミ ンの水酸基の保護基がァセチル基である化合物が、 第 3図中で化合物 ( 1 0 ) として示されている。
得られた式 (X I X) で示される化合物と、 N— (t e r t—ブトキシカルポ ニル) 一 L—グルタ ミン酸ーひ 一べンジルエステル及び L—グルタ ミ ン酸ーひ, ァージベンジルエスデル p—トルエンスルホン酸塩を出発原料にして合成する ことができる次式 (XX)
(式中、 Qは、 水素原子又はアミノ基の保護基を示す。 )
で示される化合物とを、 D C Cなどの縮合剤の存在下に縮合させ、 必要に応じて 保護基を脱離させることにより 目的とする式 (XV I I ) で示される リガン ドを 製造することができる。
置換基 Qで示される水酸基又はァミノ基の保護基としては、 通常のペプチド化
学において使用されるものを使用することができるが、 ァセチル基、 tーブトキ シカルポニル基 (B o c ) 、 ベンジルォキシカルポニル基 ( C b z ) などが好ま しい。
したがって、 本発明は、 前記した方法による式 (XV I I ) で示されるリガン ドの製造方法を提供するものでもある。
また、 これらの分岐鎖リガン ドと生理活性蛋白質とを微生物由来の トランスグ ルタ ミナーゼ (B— T G) の存在下に反応せしめる方法は、 高原らの方法 (特開 平 8— 8 9 2 7 8号) あるいは佐藤らの方法 (WO 9 6/0 6 1 8 1 ) に準じて、 水溶液中、 よ り好ま しくは p H 7. 5前後で、 室温で 1 2時間、 生理活性蛋白質、 合成リガン ド、 及びトランスグルタ ミナーゼ、 より好ま しくは微生物由来トラン スグルタ ミナーゼを反応させる。 生理活性蛋白質と合成リガン ドとの濃度比は 1 : 1 0 0 - 1 : 2 0 0 0の範囲がよい。 また トランスグルタ ミナーゼの使用量は 蛋白質 l nmo l当たり 0. 0 1〜 1ユニッ トである。 さらに合成リガン ドに加 え、 ポリエチレングリコールのアルキルアミン誘導体による 2分子修飾により、 蛋白質の血中における滞留性及び安定性を高め、 肝臓への集積量を高めることも 可能である。 即ち、 基質特異性の異なる 2種の トランスグルタ ミナーゼ、 より望 ましくは微生物由来トランスグルタ ミナーゼとモルモッ ト肝由来トランスグルタ ミナ一ゼを使い分けることにより、 2つの異なる基質をそれそれ位置選択的に結 合させることができる。
本発明の医薬組成物は、 リカ'ン ドに結合させる生理活性蛋白質に応じて、 悪性 腫瘍治療剤、 抗ウィルス剤、 抗リウマチ剤、 抗アレルギー剤、 免疫調節剤、 循環 機能改善剤、 内分泌機能改善薬、 蛋白質の異常発現あるいは機能異常によって生 じる疾患に対する治療薬などと して使用することができる。
本発明の医薬組成物は、 例えばその用途に応じて、 静注および筋注などの注射 剤、 直腸投与剤、 油脂性坐剤、 水溶性坐剤などのいずれかの製剤形態に調製する ことができる。 これらの各種製剤は、 通常用いられている賦形剤、 増量剤、 結合 剤、 湿潤化剤、 崩壊剤、 表面活性剤、 潤滑剤、 分散剤、 緩衝剤、 保存剤、 溶解補 助剤、 防腐剤、 無痛化剤、 安定化剤などを必要に応じて用いて常法により製造す ることができる。 使用可能な無毒性の上記添加物と しては、 例えば乳糖、 果糖、
ブドウ糖、 でん粉、 ゼラチン、 炭酸マグネシウム、 合成ケィ酸マグネシウム、 夕 ルク、 ステアリ ン酸マグネシウム、 メチルセルロース、 カルボキシメチルセル口 ースまたはその塩、 アラビアゴム、 ポリエチレングリコール、 シロップ、 ヮセリ ン、 グリセリ ン、 エタノール、 プロピレングリコール、 クェン酸、 塩化ナト リ ウ ム、 亜硫酸ソーダ、 リ ン酸ナ ト リウムなどが挙げられる。
本発明の医菓組成物の投与方法は、 静脈内投与、 皮下投与、 筋肉内投与、 絰粘 膜投与等の非絰ロ投与が好ま しく、 より望ましくは静脈内投与がよい。 また、 そ の投与量と しては肝臓への送達効率を最大にするため、 肝臓の実質細胞に存在す るァシァ口糖蛋白質レセブターへの飽和結合量より低い量であることが望ましい < 従来の修飾されていない生理活性蛋白質の投与量に比べて、 本発明の修飾体の投 与量はより小量 (少なく とも 1 / 4程度) とすることができる。
その投与量は、 使用する生理活性蛋白質によっても異なるのみならず、 用法、 患者の年齢、 性別、 症状の程度などを考慮して適宜決定される。 本発明の医薬組 成物はその肝臓集積性によ り投与量を未修飾蛋白質の数分の一程度までさげるこ とができる。
また、 本発明は、 本発明の生理活性蛋白質の修飾体の治療又は予防に有効な量 を投与してなる、 ヒ トを含む動物の疾患、 例えば、 悪性腫癡、 ウィルス感染、 ァ レルギ一性疾患、 免疫性疾患、 循環器系疾患、 および内分泌系疾患などの疾患の 治療法又は予防法を提供するものである。
さらに、 本発明は、 本発明の生理活性蛋白質の修飾体の治療 · 予防に必要な量 を含有してなる治療 , 予防、 例えば、 悪性腫瘍治療剤、 抗ウィルス剤、 抗リウマ チ剤、 抗アレルギー剤、 免疫調節剤、 循環機能改善剤および内分泌機能改善剤な どの薬剤の製造のための使用を提供するものである。 実施例
以下に本発明を、 実施例と してより具体的に説明するが、 本発明はこれらの具 体例に限定されるものではない。 実施例 1 ( G a l ) r h I L - 2の調騁
0. 2 5 Mの N a C lを含む 5 0 mM酢酸緩衝液 ( p H 5. 0 ) に溶解した r h I L— 2溶液 ( 3 9mL) を 2 0 0 mMト リスー塩酸緩衝液 ( p H 7. 5 ) で 予め平衡化した S e p h a d e x G - 2 5 c o l umn (P h a rma c i a社製) にアブライ し、 同緩衝液で溶出した。 溶出液を 2 8 O nmの吸光度でモ 二ターし蛋白質の溶出画分を得た ( 48 mL) 。 この溶出画分の蛋白質濃度を 5
に調製した ( 3 3 0 m L ) 。
この溶出画分に、 第 1図に示したように、 佐藤らの方法 (P C T/J P/9 5 / 0 0 2 98 ) にしたがって合成した分枝型 G a l リガン ド ( (Ga l ) 3、 47 2 m g ) を添加した。
該反応液に微生物由来ト ラ ンスグルタ ミナーゼ 6 0 Uを添加し、 室温でー晚ィ ンキュベー 卜 した。
反応液を 「S e p— P a k C 8 C a r t r i d g e」 (Wa t e r s社製) で前処理後、 「YMC— P a c k C 8— AP」 カラム ( 4. 6 x 2 5 0 mm、 山村化学社製) を用いた逆相 H P L Cにより数回にわたって精製し、 未反応の r h I L— 2画分及び (Ga l ) 3を除去した。
精製物の純度を 「P h a s t s y s t em」 (P h a r ma c i a社製) を 用いた S D S— PAGE ( 「H omo g e n i o u s 2 0 j ゲル使用) により 分析した結果、 (G a l ) 3修飾体 ( (G a l ) r h I L - 2 ) は未修飾体に 対し (G a l ) 3が 1分子結合したと予想される約 2 K D a程度分子量が上昇した 位置にのみ蛋白質由来のバン ドを確認した。
収量 5. 3 m g (収率 2 1 %) 。 この分取画分の一部をサンプリ ング後、 P B S (—) ( p H 7. 5 ) で予め平衡化した S e p h a d e x G - 2 5 c o l umnにアブライ し、 同緩衝液で溶出し蛋白質画分を得た (収量 3. 1 m g) 。 実施例 2 P E G 1 2. ( G a 1 ) 3— r X 2— I L一 2の調製
( 1 ) P E G 1 2 - r X 2— I L一 2の調製
佐藤らの方法 (P CT/J P/9 5/ 0 0 2 98 ) にしたがって調製した r X 2 - I L - 2 ( h I L - 2の N末端に P— K一 P— Q— Q— F— Mのアミノ酸配 列が付加した融合蛋白質) の 5 m L溶液を、 1 0 0 mMト リスー塩酸緩衝液 ( 1
0 mM C a C l 2含有、 p H 7. 5 ) で予め平衡化した S e p h a d e x G— 2 5 c o l umn (P h a r ma c i a社製) にアブライ し、 同緩衝液で溶出 した。 溶出液を 28 O nmの吸光度でモニターし蛋白質の溶出画分を得た ( 6 m L ) 。 この溶出画分の蛋白質濃度を 2 5 zM/mLに調製した ( 1 0 mL) 。 この溶出画分に、 第 2図に示したように、 佐藤らの方法 (P C T/J P/9 5 / 0 0 2 9 8 ) にしたがって合成したポリエチレングリコールアルキルアミン (第 2図の式 ( 2— 3 ) 、 P E G 1 2、 平均分子量 1 2 KD a、 7 5 0 m g ) を 添加した。
該反応液にモルモッ ト肝由来ト ラ ンスグルタ ミナーゼ (S i gma社製) 2 U を添加し、 室温で一晩インキュベー ト した。
反応液を rS e p— P a k C 8 C a r t r i d g ej (Wa t e r s社製) で前処理後、 「YMC— P a c k C 8 -AP」 カラム (4. 6 x 2 5 0 mm, 山村化学社製) を用いた逆相 H P L Cによ り数回にわたって精製し、 未反応の r X 2 - I L一 2画分及び P E G 1 2を除去した。
精製物の純度を rP ha s t s y s t emj (P h a r ma c i a社製) を 用いた S D S— PAGE ( 「H omo g e n i o u s 20」 ゲル使用) により 分析した結果、 PE G 1 2修飾体 (P E G 1 2— Γ Χ 2— I L一 2 ) は未修飾体 に対し P E G 1 2が 1分子結合したと予想される約 2 O KD a程度分子量が上昇 した位置にのみ蛋白質由来のバン ドを確認した。 収量 0. 4 84 m g (収率 1 2 %) 。
( 2 ) P E G 1 2. ( G a 1 ) 3— r X 2— I L一 2の調製
上記 P E G 1 2— r X 2— I L— 2溶液を 2 0 0 mMト リス—塩酸緩衝液 ( p H 7. 5 ) で予め平衡化した S e p h a d e x G - 2 5 c o l umn (P h a r ma c i a社製) にアブライ し、 同緩衝液で溶出した溶出液を 2 8 0 nmの 吸光度でモニターし蛋白質の溶出画分を得た ( 3 mL) 。 この溶出画分の蛋白質 濃度を 5 >uM/mLに調製し ( 3 mL) 、 佐藤らの方法 (P C T/J P/ 95 / 0 0 2 9 8 ) にしたがって合成したガラク ト一ス リガン ド ( (G a l ) 3、 1 7 m g) を添加した。 該反応液に微生物由来トランスグルタ ミナ一ゼ 1 5 Uを添加し、 室温で一晚イ ンキュベート した。
反応液を 「S e p— P a k C 8 C a r t r i d g e」 (Wa t e r s社製) で前処理後、 「YMC— P a c k C 8— AP」 カラム (4. 6 x 2 5 0 mm, 山村化学社製) を用いた逆相 H P L Cにより数回にわたって精製し、 未反応の P E G 1 2— r X 2— I L— 2画分及び (G a l ) 3を除去した。
精製物の純度を 「P h a s t s y s t emj ( P h a r m a c i a社製) を 用いた S D S - PAG E ( 「H o m o g e n i o u s 2 0」 ゲル使用) により 分析した結果、 P E G 1 2 , (Ga l ) 3修飾体 (P E G 1 2 , (G a l ) r X 2 - I L - 2 ) は P E G 1 2— r X 2— I L— 2に対し (G a l ) 3が 1分子結 合したと予想される約 2 K D a程度分子量が上昇した位置にのみ蛋白質由来のパ ン ドを確認した。 収量 0. 0 5 m g (収率 1 %) 。 実施例 3 ( (Ga 1 N A c ) 3の合成 (第 3闵参照) )
( 1 ) 化合物 (4 ) の合成.
化合物 ( 4 ) の合成は山田らの方法 (特開平 5— 20 2 085号) を改良して 行った。 2— [2— (2—クロ口エトキシ) エ トキシ] エタノール (化合物 ( 1 ) ) 5 0 0 g ( 2. 96 m o 1 ) をカリ ウムフタルイ ミ ド 59 6 g ( 3. 22 m o 1 ) の D M F ( 3. 5 L ) 混合液に加え、 油浴 ( 1 0 0 °C ) 中で加熱しながら 1 7時 間撹拌した。 反応液を室温まで冷却し、 不溶物をろ過後、 ろ液を減圧濃縮した。 残渣を塩化メチレン ( 3 0 0 m L) で抽出し、 溶媒を減圧留去することにより黄 色油状物 (粗製物) と して化合物 ( 2 ) 89 5. 6 gを得た。
得られた粗製物を E t 0 H ( 1 4 L) に溶解し、 8 0 %ヒ ドラジン 1水和物 1 98 m L ( 3. 2 7 m o 1 ) を加えた後、 メカニカルスターラーで撹拌しながら 2時間加熱還流した。 反応液を室温まで冷却後、 不溶物をろ過し、 減圧濃縮した。 残渣に塩化メチレン 3 Lを加え、 室温下 3 0分撹拌後、 不溶物をろ過した。 ろ液 を減圧滷縮することによって、 化合物 ( 3 ) を黄色油状物 (粗製物) として 48 4 g得た。
上記化合物 ( 3 ) 48 3. 8 gを水 5. 4 Lに溶解し、 氷水浴中にて冷却し た。 撹杵しながら N a H C 03 ( 2 7 3 g ) と塩化べンジルォキシカルボニル ( 3 3 %トルエン溶液、 1 5 5 O mL) を交互に 5回づっ加えた後、 室温下でー晚撹
拌した。 反応液を分層後、 水槽を舴酸ェチルで抽出した。 合わせた有機層を飽和 食塩水で洗浄後、 無水硫酸マグネシウムで乾燥した。 溶媒を減圧留去して得られ た残渣を、 酢酸ェチルを溶出液とするシリカゲルカラムクロマ トグラフィー (シ リカゲル = 4 K g) で精製することにより、 標記化合物 ( 4 ) を無色油状物と し て 3 9 3 g得た。
( 2 ) 化合物 ( 9 ) の合成
ガラク トサミ ン誘導体である化合物 ( 9 ) の合成は特開平 5— 2 0 20 8 5号 の方法に従って行った。
即ち、 ガラク トサミ ン塩酸塩 (化合物 ( 5 ) ) 1 5 0 gを Me OH 2. 8 L 及びト リェチルァミ ン 1 9 0 mLの混合溶媒に溶解し、 室温にて無水酢酸 1. 2 5 Lを滴下した。 室温にて一晩撹拌後、 溶媒を減圧留去した。 ついで、 ビリジ ン 1 5 00 mL及び無水酢酸 5 00 m Lを加え、 室温にて一晩撹拌した。 再 び溶媒を減圧留去後、 残渣を酢酸ェチル溶液と し、 水洗し、 さらに濃縮を した。 析出した結晶をろ取し、 ろ液を濃縮後、 残渣をシリカゲルクロマ トグラフィー で精製することにより、 ひ、 ?一アセテート体 (化合物 ( 7 ) 、 ( 6 ) ) 混合物 ( 2 : 1 ) 8 9. 4 gを得た (シリカゲル = 4 k g、 C H C l 3 : Me OH= 1 0 さらに母液を濃縮乾固した後、 シリカゲルカラムクロマ トにて精製し、 ひーァ セテート体 (化合物 ( 7 ) ) 2 3. 9 gを得た (シリカゲル = 4 k g、 A c O E t )
上記、 ひ、 3—アセテー ト体 (化合物 ( 7 ) 、 ( 6 ) ) 混合物 ( 2 : 1 ) 8 1. 4 gを 1 , 2—ジクロロェタン (E D C) 1 Lに溶解し、 室温にて ト リフルォロ メタンスルホン酸ト リメチルシリル (TMS O T f ) 3 9. 8 mLを滴下した。 40°Cにて一晩反応後、 E t 3Nを 2倍当量加えた後、 溶媒を留去した。 一方、 上 記ひ一アセテー ト体 (化合物 ( 7 ) ) 2 3. 9 gを、 1 , 2—ジクロロェタン (E D C) 3 0 0 mLに溶解し、 室温にて TM S O T f 1 1 . 7 mLを滴下した。 40 °Cで 3時間反応後、 E t 3Nを 2倍当量加えた後、 溶媒を留去した。 残渣を併 せてシリカゲルクロマ トグラフィーにより精製し、 化合物 ( 8 ) 8 3. 6 gを
得た (シリカゲル = 4 k g、 C H C l 3 : Me OH= 2 0 : 1 ) 。
上記化合物 ( 8 ) 83. 0 g及び先に合成した化合物 ( 4 ) 1 42. 8 g を、 1, 2—ジクロロメタン 1 Lに溶解し、 MS 4 A (モレキュラーシーブス 4 A) 存在下、 5 0 °Cにて T M S 0 T f 5 3. 2 m Lを滴下した。 室温にて一晩 撹拌して反応させた後、 水 1 L中に加え、 クロ口ホルム 2 Lで抽出した。 水 洗、 飽和食塩水で洗浄後、 無水硫酸ナ ト リ ウムで乾燥後、 溶媒を減圧留去した。 残渣をシリカゲルカラムクロマ トにて 2度に渡り精製し、 1 45 gの標記化合物 (化合物 ( 9 ) ) を得た (シリカゲル = 4 k g、 A c O E t→C H C l 3 : Me O H= 20 : l ~ 1 0 : l ) 。
( 3 ) 化合物 ( 1 4 ) ( (G a 1 N A c ) の合成
上記化合物 ( 9 ) 7 1. 1 を、 £ 1^€^ 1. 5乙に溶解し、 p—トルエン スルホン酸 1水和物 2 2. 8 gを加え、 5 %P d/C 2 2. 6 g存在下水素雰 囲気下、 室温にて一晩撹拌した。 反応液をセライ トでろ過後、 減圧にて濾縮乾固 した。 残渣をァセ トニ ト リル 5 O O mLを用いて溶解及び濃縮乾固の操作を 4回 行なった。 残渣をァセ トニ ト リル 2 0 0 mLに溶解し、 N—メチルモルホリンを 1 3. 3 m L加え、 化合物 ( 1 0 ) の溶液を調製した。
一方、 佐藤らの方法 (P C T/J P 9 5/0 0 2 98 (WO 96 / 0 6 1 8 1 ) ) に従って、 N— (t e r t—ブトキシカルボニル) 一 L一グルタ ミ ン酸一 ひ一ペンジルエステル及び L一グルタ ミ ン酸一ひ , ァ ージベンジルエスデル p 一トルエンスルホン酸塩を出発原料にして合成した化合物 ( 1 1 ) 1 9. 3 g の DMF 1 0 O mL溶液を氷水浴にて冷却し、 N—ヒ ドロキシコハク酸ィ ミ ド 1 3. 7 g、 D C C 4. 6 3 gを加え数分間撹拌した。 この反応液に上記化合 物 ( 1 0 ) 7 8 gのァセ トニ ト リル溶液 2 0 0 m Lを滴下し、 冷却下 ( 1 5 °C) で一晩撹拌した。 不溶物をろ別し、 溶媒を減圧留去後、 残渣をシリカゲル力 ラムクロマトグラフィーで糟製することにより中間体である化合物 ( 1 2 ) を無 色固体として 1 6. l g得た (シリカゲル = 4 k g、 CH C l 3 : M e OH = 2 0 : 1〜 1 0 : 1 ) 。 化合物 ( 1 2 ) の構造については FAB— M S ( m/ z ( M + H ) + 1 8 7 0. 9 ) により確認した。
調製した化合物 ( 1 2 ) 1 5 . 3 gの塩化メチレン ( 6 5 mL) 溶液を氷水 浴にて冷却し、 ト リ フルォロ酢酸 (T F A) 6 5 m Lを加えた後、 室温下で 1 時間撹拌した。 溶媒を減圧留去した後、 残留 T F Aを除くために、 残渣を E t O H 5 0 m Lに溶解し、 減圧乾固した。 この操作を 3回繰り返した後、 残渣を塩 化メチレン 7 O mLに溶解し、 氷水浴で冷却しながら 2 8 % N a OM e /M e 0 H溶液を加え中和した。 溶媒を減圧留去後、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグ ラフィ一にて精製することにより、 中間体である化合物 ( 1 3 ) 1 1 . 2 gを 得た (シリカゲル = 4 6 0 g、 C H2C l 2 : M e O H = 1 0 : 1 - 3 : 1 ) 。 化 合物 ( 1 3 ) の構造については、 'H NM R及び エレク トロスブレーイオン化四 重極型マススぺク ト ロメ ト リー ( E S I + Q I M S ) により確認した。
' H NMR ( 6 0 0 MH z, CD C l a) : δ
2. 0 1 ( s, A c , 9 H) 、 2 . 0 2 ( s , A c , 9 H) 、
2. 0 5 ( s, A c , 9 H) 、 2 . 1 5 ( s, A c, 9 H) 、
3. 0 5 - 3. 1 6 ( b r , - C H 2- N H 2, 2 H)
E S I + Q I MS : m/ z ( M + H ) + 1 7 7 0. 4 上記化合物 ( 1 3 ) 6. 6 4 gを M e O H 1 8 4 m Lに溶解し-、 氷水浴で 冷却しながら、 2 8 % N a 0 M e /M e 0 H溶液 0. 8 3 m Lを加えた。 室温 下で 5時間撹拌後、 反応液を氷水浴で冷却し、 M e O Hで十分洗浄した D ow e X 5 0 Wを加え、 反応液を中和した。 樹脂をろ別後、 溶媒を減圧留去し、 残渣を
5 0 °Cで一晚减圧乾燥することにより、 ( G a 1 N A c ) (化合物 ( 1 4 ) ) を 3. 4 g得た。
1 . 4 8 - 1 . 5 5 (m , 2 H ) 7 0 - 1 8 3 ( m, 4 H ) 、
2. 0 4 - 2. 1 2 (m, 2 H) 1 7 ( s 9 H ) 、
2. 1 6 - 2. 2 4 (m , 2 H ) 4 7 ( t 4 H ) 、
2. 5 5 ( t , 2 H ) 、 3 . 1 4 ( t 2 H ) 、
3. 4 5 - 3. 5 8 (m, 6 H) 、 3 7 0 - 3 9 5 ( m, 4 1 H )
4. 0 2 - 4. 0 8 (m, 6 H) 、 4 1 2 - 4 1 8 ( b r , 2 H)
4. 3 2 - 4. 42 (m, 2 H) 、 4 6 3 ( d , 2 H )
13 C NM R ( 1 5 0MH z、 D 20 ) : δ
2 3. 0、 2 5. 4、 2 5. 9、 2 7 2 2 7 6 2 7. 9、
3 2. 2、 3 2. 6 3 5. 8、 3 9 7 4 0 0 4 9. 6、
5 3. 1、 54. 0 5 4. 2、 6 1 7 6 8 6 6 9. 5、
6 9. 6、 7 0, 2 7 0. 4、 7 1 8 7 5 9 1 02. 3、 1 74. 3、 1 74 3、 1 7 5. 4 1 7 5. 6、 1 7 6. 6、
1 7 7. 5
E S I + Q I M S m/ z (M + H ) 1 3 9 3. 1 実施例 4 ( G a 1 N A c ) I L - 2の調
0. 2 5 Mの Na C lを含む 5 0 mM酢酸緩衝液 (p H 5. 0 ) に溶解した r h I L— 2溶液 ( 1 l mL) を 2 0 0 mMト リスー塩酸緩衝液 ( p H 7. 5) で 予め平衡化した S e p h a d e x G— 2 5カラム (P h a rma c i a社製) にアプライ し、 同緩衝液で溶出した。 溶出液を 2 80 nmの吸光度でモニターし 蛋白質の溶出画分を得た ( 2 0 mL、 6. 5 M) 。 この溶出画分の蛋白質濃度 を に調製した ( 26 mL) 。
この溶出画分のうち 1 3 mLを、 前記実施例 3に示す方法にしたがって合成し た分枝型 N—ァセチルガラク トサミ ンリガン ド ( (G a l NA c ) 3、 3. 4 7 m ) を添加した。 該反応液に微生物起源トラ ンスグルタ ミナーゼ約 3 2. 5 Uを 添加し、 室温で 一晩イ ンキュベー ト した。
反応液を 「S e p— p a k C 8 C a r t r i d g ej (Wq a t e r s社 製) で前処理後、 「YMC— P a c k C 8— APj カラム (4. 6 x 2 50 m m、 山村化学社製) を用いた逆相 H P L Cによ り数回にわたって精製し、 未反応 の I L— 2画分及び (Ga l NA c ) 3 を除去した。
精製物の純度を 「P h a s t s y s t emj (P h a rma c i a社製) を 用いた S D S— PAGE ( rH om o g e n i o u s 2 0」 ゲル使用) により 分析した結果、 ( G a 1 N A c ) 3 修飾体 ( (G a l NAc ) 3— r h I L— 2 ) は未修飾体に対し (Ga l NA c) が 1分子結合したと予想される約 2 KD a
程度分子量が上昇した位置にのみ蛋白質由来のバン ドを確認した。 収量、 40 1 μ. g (収率 4 0 %) 。
分取画分の一部を P B S ( p H 7. 4 ) で平衡化したモルカッ ト L (LGC、 ミ リポア社製) で濃縮操作を繰り返し行うことによ り、 バヅファー交換を行った。 実施例 5 (G a l ) I N F -ひの調
凍結乾燥されたヒ ト I N F— a ( 2 b ) (生化学工業社製) 2 0 0 ^ 3を 1 4 6 5 1の 2 0 0 mMト リスー塩酸緩衝液 ( p H 7. 5 ) に溶解させた後、 合成 した分枝型ガラク トースリガン ド ( (G a l ) 、 6. 5 m g) を添加した。 該 反応液に微生物起源トランスグルタ ミナーゼ約 0. 7 Uを添加し、 室温で 4時間 インキュベー ト した。
反応液を 「YMC— P a c k C 8 -A P」 カラム (4. 6 x 2 5 0 mm, 山 村化学社製) を用いた逆相 HP L Cにより数回にわたって精製し、 未反応の I N F - a ( 2 b) 画分及び (G a l ) 3 を除去した。 分取画分を P B S ( p H 7. 4 ) で平衡化したモルカッ ト L ( L G C、 ミ リポア社製) で澳縮操作を繰り返し 行うことにより、 バッファー交換を行った。
精製物の純度を 「P ha s t s y s t em」 (P h a r ma c i a社製) を 用いた S D S— PAGE ( 「H om o g e n i o u s 2 0」 ゲル使用) により 分析した結果、 (G a l ) , 修飾体 ( (G a l ) I N F - α ) は未修飾体に対 し (Ga l ) が 1分子結合したと予想される約 2 KD a程度分子量が上昇した 位置にのみ蛋白質由来のバン ドを確認した。 収量 1 50〃 ε (収率 7 5 %) 。 実施例 6 (G a l ) -T v r -B o c. (Ga l NAC) - T.v r -B o c
の調製
ョードラベル化のための T y r誘導体の合成は田村らの方法 (T.Tamura et al., Anal.Biochem. 216, 335-344 ( 1994)) に従って行った (第 4図参照) 。 即ち 3 0;umo lの (Ga l ) あるいは (G a l NA c ) 3 を 3. 6 m lのジメチル ホルムアミ ド中に溶解させ、 1 . 1 3 gの B 0 c— T y r— N H S ( S i ma 社製) を添加し、 5 0てで 5時間撹拌した。 反応液を冷却後、 1 Nの N a OHを
加え、 遠心分離により沈殿物を除去した。 該上澄み液を 1 % (w) のビリジン及 び齚酸で平衡化した S e p h a d e x G— 2 5カラム (フアルマシア社製、 1. 6 X 7 0 c m) に添加し、 2 8 0 nmでモニタ一された Ty r— B o c誘導 体化画分を分取した。 該分取画分を凍結乾燥後、 再度 0. 1 %T FA溶液に溶解 させ、 「 I n e r t s i l 〇 D S— 2」 カラム ( 4. 6 x l 5 0 mm、 G L S c i e n c e I n c . 社製) を用いた逆相 H P L Cによ り精製し、 ビーク純 度 9 0 %以上の T y r— B o c誘導体 1 4. 7 m g ( (Ga l ) 3— T y r— B o c ) 及び 2 8. 9 m g ( (Ga l NA c ) 3— T y r— B o c ) を得た。 なお、 生 成物の構造は、 エレク トロスブレーイオン化マススぺク トロメ ト リ一 (E S I— MS ) により確認した。
E S I - M S :
(Ga l ) - T y r -B o c ; m/z (M + H) + 1 5 3 2. 8、 (G a l NA c ) -T y r -B o c ; m/z ( M + H ) + 1 6 5 5. 6 実施例 7 修飾位證の確認
上記実施例 1の (Ga l ) r h I L - 2の逆相 H P L Cサンブリ ング画分及 び r h I L— 2の凍結乾燥体各 l O O i g ( I L— 2換算) を辻らの方法 (B i o c h e m i s t r y, ( 1 98 7 ) , 2 6 , 3 1 2 9 - 3 1 3 4 ) にし たがい還元カルボキシメチル化した。 該還元力ルポキシメチル化体の凍結乾燥粉 末 5 0〃 gを炭酸水素アンモニゥム緩衝液 (ρ Η 7. 9 ) 5 0〃 Lに溶かし、 Γ V 8 p r o t e a s e」 2 gを加え 3 7 °Cで 2 2時間消化した後、 凍結乾 燥した。 続いて 「T P C K— ト リブシン」 を 50 mM炭酸水素アンモニゥ ム緩衝液 (P H 7. 9 ) 5 0〃 Lに溶かして加え、 3 7 °Cで 4時間酵素分解した。 反応液をそのまま L C/M Sにより分析することによりぺプチドマヅブを作製し 比較した結果、 (G a l ) 3— r h I L— 2において G 1 n— 7 4を含むアミノ酸 配列由来のビークの消失が観察された。 この結果、 本発明の分岐鎖リガン ド (G a 1 ) 3は B— T Gにより r h I L— 2の G i n— 7 4に位置選択的に結合してい ることを確認した。
実施例 8 修飾体の I L一 2 件
AT C Cより入手した I L— 2依存性マウス細胞 「C T L L一 2j (AT C C T I B 2 1 4 ) を用い、 G i l l s らの方法 (J . 1 m m u n d . , 1 2 0 , 2 0 2 7 ( 1 9 78 ) ) であるチミ ジンの取込みを標識にした T一 e e l 1増殖 アツセィ法にしたがって (G a l ) 3— r h I L— 2、 (G a l NA c ) 3— r h I L一 2、 P E G 1 2 , (G a l ) 3- r X 2— I L一 2及び r h I L— 2の I L 一 2生物活性を測定した。
その結果、 (Ga l ) 3— r h I L— 2の r h I L— 2に対する比活性は 1 02 %であり、 修飾体は I L一 2の生物活性を保持していることが示された。 また、 (G a l NA c ) 3— r h I L— 2の r h I L— 2に対する比活性は 1 1 0 %であ り、 (G a l NA c ) 3 修飾体は I L一 2の生物活性を保持していることが示さ れた。 さらに、 P E G 1 2 , (Ga l ) 3— r X 2— I L— 2の r X 2— I L— 2 に対する比活性は 1 26 %であり、 2分子修飾体は r X 2— I L— 2の生物活性 を保持していることが示された。 実施例 9 修飾休 I N Fのほ件
ヒ ト I F Nバイオアツセィは、 F L細胞を用い、 ウィルスによる細胞変性効果 の阻止に基づく渡部らの方法 (Lymphokines and Interf erones; A Practical Ap proach, IRL Press, Oxford, 1987) に従って行った。 即ち、 1 0 0 % 細胞変性 を引き起こす量のウィルスを用いたとき、 細胞をあらかじめ I F N 試料希釈 液で処理しておく ことによってウィルスによる細胞変性が 5 0 %に阻止されたと きの試料希釈液の I F N力価を 1単位 ( I U) とし、 ヒ ト I N F— α標準品 ( ミ ド リ十字社製) の力価をもとに (G a l ) 3— I N F— α及び I N F—ひの I FN 生物活性を算出した。
その結果、 ( G a 1 ) 3— I N F—ひ、 I N F—ひの生物活性はそれそれ 1 · 1 7 1 08 I U/mg、 及び、 1 . 4 2 X 1 08 I U/m gであった。 よって (G a l ) 3— I N F— αの未修飾 I N F—ひに対する比活性は 8 2 %であり、 修 飾体は I NF— α ( 2 b) の生物活性を保持していることが示された。
実施例 1 0 修飾休の肝牖集 件
マウス (C 5 7 B L/6、 C RJ社、 6W、 ) に (G a l ) 3— r h I L— 2、 (G a l NA c ) — r h I L— 2、 ァシァ口才口ソムコイ ド (AS OR、 B i d e rらの方法 (Eur. J. Biochem. , ( 1995), 230, 207-212) に従いヒ トォロソム コイ ド (OR o r a 1 - a c i d g l y c o p r o t e i n、 S i gma 社製より調製) 及び r h I L— 2を 3. 2 nm o l/k gで静脈内投与し、 一定 時間後 ( 2分、 1 5分、 3 0分、 6 0分) 、 採血及び肝臓の採取を行った。 血漿 は常法により採取し、 検体濃度を E L I S Aにより測定した。 肝臓は 0. 1 %B SA含有 P B S (—) の 9倍量を添加してホモジナイズし、 3 0 00 rpmで 5分間 速心分離した後、 上清を E L I S A用バヅファー ( 0. 0 5 M T r i s H C 1、 I mM M g C l 0. 1 5 M N a C l、 0. 0 5 % (V/V) 、 T w e e n 2 0、 0. 0 2 % (W/ V ) N a N 1 % (W/ V ) B S A 、 p H 8. 1 ) で 希釈し E L I S Aで肝臓中濃度を測定した。
なお、 I L一 2の E L I S Aは一次抗体として抗ヒ ト I L— 2マウスモノクロ 一ナル枋体 (ベーリンガーマンハイ ム社製) 、 二次抗体として調製した抗ヒ ト I L一 2ゥサギポリク口一ナル抗体、 三次抗体と してはアルカ リフォスファタ一ゼ 標識抗ゥサギ I g G (r + L ) ポリ クローナル抗体 (ャギ) (TAG O社製) を 用いて行った。 一方、 AS O Rの E L I S Aは一次抗体として精製抗ヒ ト ひ 1— a c i d g l y c o p r o t e i n ヒッジポリクロ一ナル抗体 (B i n d i n g S i t e社製) 、 二次抗体と して精製抗ヒ ト ひ 1一 a c i d g 1 y c o p r o t e i n ゥサギポリクローナル抗体、 三次抗体と してはアルカリ フォス ファタ一ゼ標識抗ゥサギ I g G ( ァ +L) ポリクローナル抗体 (ャギ) (TAG 0社製) を用いて行った。
その結果、 第 5図のように血漿中の (G a l ) 3— r h I L— 2、 (Ga l NA c ) r h I L - 2濃度は r h I L— 2に比べ低い推移を示したのに対し、 肝臓 中 ¾度は (G a l ) 3— r h I L— 2、 (Ga l NA c) 3— r h I L— 2がはる かに高く推移し、 (Ga l ) 3及び (G a l NA c ) 3修飾によ り I L— 2の肝臓 への集積が可能であることが示された。 (Ga l ) 3— r h I L— 2及び (G a l N A c ) — r h I L— 2の肝臓中における AU C (臓器中濃度一時間曲線下面積)
は r h I L— 2のそれそれ 3. 5倍、 6. 2倍であった。 また A S O Rについて は、 血漿中濃度は投与直後の濃度は高いのもののすぐに消失したのに対し、 肝臓 中濃度は (G a l ) r h I L - 2 ( G a 1 N A c ) 3— r h I L— 2より も さらに高く推移した。
さらに (G a l ) 3— r h I L— 2の肝臓集積が人工リガン ドである (Ga l ) 3と肝実質細胞表面に存在するァシァ口糖蛋白質レセブター (A S GR) との B i n d i n gによることを証明するため、 B i d e rらの方法 (E u r . J. B i o c h e m. , ( 1 9 9 5 ) , 2 3 0 , 2 0 7— 2 1 2 ) にしたがい調 製したァシァ口ォロソムコィ ド (A S O R) 同時投与による集積阻害実験を行つ た。
マウス (C 5 7 B L/6 , C R J社, 6W, ) に (Ga l ) 3- r h I L - 2 の 5 0〃 g/k g ( I L— 2換算) 及び A S ORを 1 3 22 g/k g ( I L - 2の 1 0当量) を同時投与し、 2分後採血及び主要臓器 (肝臓、 宵臓、 肺) の採 取を行った。 各検体濃度を E L I S Aで定量し、 同量投与した r h I L— 2及び (G a l ) 3— r h I L— 2と比較した。
その結果、 第 6図に示すように肝臓における集積量が AS O R同時投与により r h I L— 2と同程度に低下し、 (Ga l ) 3— r h I L— 2の肝集積が AS GR を介したものであることが確認された。
また、 (G a l ) 3— I N F—ひについても同様に A S 0 R同時投与による肝臓 への集積阻害実験を行った。 マウス (C 5 7 B L/6 ) に (G a l ) 3— I N F— αの 5 0〃 g/k g ( I N F換算) 及び A S O Rを l O S l ^ g/k g ( 1 0当 量) を同時投与し、 2分後採血及び主要臓器 (肝臓、 腎臓) の採取を行った。 各 検体濃度を E L I S Aで定量し、 I NF— α及び (G a l ) 3— I N F— αの谟度 と比較した。
その結果、 第 7図に示すように (Ga l ) 3— r h I L— 2と同様 (G a l ) 3 一 I NF— αについても、 肝臓への集積量が未修飾 I N F—ひの 6倍程度に増加 した。 さらに肝臓における集積量が、 A S 0 R同時投与により未修飾 I N F— α と同程度に低下し、 本集積が A S GRを介したものであることが示された。
一方、 PE G 1 2 , (G a l ) 3_ r X 2— I L— 2の体内動態についても同様
にマウス (C 5 7 B L/6 , C R J社, 6 W, ) に検体を 3 3 z g/k g ( I L一 2換算) で静脈内投与し、 一定時間後 ( 2分、 1 5分、 6 0分) 、 採血及び 肝臓の採取を行った。 血漿は常法により採取し、 検体濃度を E L I S Aにより測 定した。 肝臓は 0. 1 %B SA含有 PB S (—) を 9倍量添加しホモジナイズし、 3 0 0 0 r pmで 5分間遠心分離した後、 上清を前記 E L I S A用バヅファ一で 希釈し E L I S Aで組織中濃度を測定し、 投与量当たりの割合で比較した。
その結果、 第 8図のように血漿中濃度は r h I L— 2に比べ高い推移を示した。 肝臓中濃度は (Ga l ) 3— r h I L— 2より さらに高く推移し、 AU C (臓器中 濃度一時間曲線下面積) は r h I L— 2の約 1 2倍であった。 実施例 1 1 修飾休の肝細胞結合
修飾体の肝細胞結合試験は B e r r yらの方法 (M.N. Berry et. al . , J. Cell Bi ol., 43, 506-520 (1969)) を改良したコラゲナーゼ還流法によ り調製したマウス 分離肝細胞を用いて行った。 即ち、 マウス ( C 5 7 B L/6 , 7 W, ) 7匹を それそれコラゲナーゼ (夕イブ I、 和光純薬社製) により還流後、 肝臓の各葉を 切断した。 各肝臓を細胞ろ過器でろ過後、 低速遠心操作 ( 5 0 gx 1 m i n) で 集めた肝細胞を、 1 5 0 mmの組織培養用 D i s h (岩城硝子社製) を用い、 1 0 %F B S入り D— MEM培地 (G i b c o社製、 1 0 0 U/mLペニシ リ ン、 1 0 0 z g/mLス ト レブ トマイ シン、 5 0 z g/mLゲンタマイ シン含有) に て 3 7°Cの C 02 イ ンキュベータ一 ( 5 % C 02 ) にて、 1〜 4時間培養した。 ディ ッシュ面に接着した細胞のみをコラゲナ一ゼで処理後、 ひとまとめにして 3 回の低速遠心操作 ( 5 0 Gx l m i n) により肝実質細胞を精製した (合計 1. 1 χ 1 0 β 個、 B i o av a i l a b i l i t y 9 3 %) 。 6 we l lのコラ ゲナーゼコートプレート上、 8 x 1 05 個/ w e l 1の肝実質細胞を、 上記 1 0 %F B S入 D— MEM培地中、 3 7 °Cで一晩培養し結合試験に用いた。
肝細胞結合試験は C h a n gらの方法 (T.Chang et al. , BBA 942. 57-64 (19 8)) に従って行った。 ほぼ c o n f 1 u e n tな状態となった細胞を 1 0 mM C a C 12 含有 D— P B Sで 2回洗浄後、 0. 1 % B S Aを含む該緩衝液を添加 し 4°Cで、 3 0分イ ンキュベート した。 クロラ ミ ン T法によ り 12SIラベルした種
々の濃度の (G a l ) 3— T y r— B o c ( 1 . 8 0 1 0 s c p m/ra g ) , (G a l NA c ) - T y r - B o c ( 1 . 4 9 x 1 05 c p m/m g ) , A S O R ( 3. 1 6 1 06 c p m/ i g ) ( 0. 1 % B S Aを含む該緩衝 液中に溶解) l mLを添加し、 4°Cで 2時間イ ンキュベート した。 一方、 非特異 的な結合については該ラベル溶液中にそれそれ 8 7 . 5 mMの N—ァセチルガラ ク トサミ ン ( S i gma社製) を添加して行った。 インキュベート した各細胞は、 4 °C中冷却した D— P B Sで 2回洗浄後、 ブレー トをー 2 0 °Cで 3 0分以上放置 後、 0. 5 % 303を含む 0 . I N N a 0 H溶液 1 m 1 による溶解液のうち 0. 8 m lの放射能から非特異的な結合による分を差し引き、 全量に換算したものを 結合画分とした。 結合試験は各ポイ ン ト n = 2で行った。 また、 細胞の総蛋白質 量は該溶解液 0. 1 m lよ り L o r r y法によ り算出した。
[結合量] ( p m o l /m g c e l l p r o t e i n ) に対する [結合量 /非結合量] ( L / g c e l l p r o t e i nj を、 S c a t c h a r d 1 o t した結果、 すべての検体で p 1 o tが双曲線状となり 2種類の結合が あることがわかった。 結合部位が 2種類有り、 それそれが相互作用がないとして G a u s s— N e w t o n法を用いた最小自乗法を応用した S c a t c h a r d解析を行い各検体の高親和性の解離定数 (K d 1 ) を比較した結果; A S 0 R の K d が約 0. 8 nMであるのに対し、 (G a l ) 3— T y r— B o c、 ( G a 1 N A c ) T y r - B o cのそれはそれそれ数十 nMのオーダーレベルであり, (G a l A c ) 3— T y r— B o cのそれの方力 s (G a l ) - T y r - B o c よりもより低かった。 この結果、 合成した 2種人工リガン ドは天然糖鎖型リガン ドを持つ A S O Rに比べ、 2オーダ一程度 A S G Rに対する結合親和性が低く、 その強さは A S O R》 (G a l NA c ) 3> ( G a l ) 3の順であることがわかつ た。 実施例 1 2 修飾休の肝細胞取り认み
修飾体の肝細胞結合試験は結合試験と同様にマウス ( C 5 7 B L/ 6 , 9 W, cf) 3匹をコラゲナ一ゼ還流し、 低速遠心により精製した肝実質細胞 (計 6. 0 1 07 個、 B i o a v a i l a b i l i t y 9 2 %) を 6 w e l lのコ
ラゲナーゼコー トプレート上、 6 1 05 個/ w e l lで 1 0 % F B S入り D— M E M培地 ( G i b c 0社製、 1 0 0 U / m Lペニシリ ン、 1 0 0〃 g/m Lス ト レブトマイ シン、 S O g/m Lゲンタマイ シン含有) 中、 3 7 °C、 5 % C 02中で一晩培養したものを用いた。
肝細胞取り込み試験も C h a n gらの方法 (T.Chang et al., BBA 942. 57-64 ( 1988)) を参考にして行った。 ほぼ c o n f l u e n tな状態となった細胞を 0. 1 % B S A、 l O mMH e p e s入り D— M E M培地 ( p H 7 . 4 ) で 1 回洗浄 後、 該緩衝液を添加し、 3 7 °C、 5 % C 02 中で 3 0分インキュベート した。 ク 口ラ ミ ン T法により ' 251 ラベルした 2 4 nMの ( G a l ) a - r h I L - 2 ( 1 . 1 4 1 0 7 c p m/u g ( I L— 2換算) 、 (G a l NA c ) 3- r h I L - 2
( 1 . 0 9 x 1 0 ' c p m/ g ( I L一 2換算) 及び A S O R ( 3 . 1 6 1 06 c p m/u g ) (該緩衝液中に溶解) I m Lを添加し、 3 7 °Cで一定時間
( 0分、 3 0分、 1時間、 2時間、 4時間) イ ンキュベート した。 一方、 非特異 的な取り込みについては該ラベル溶液中にそれそれ 1 0 O mMの N—ァセチルガ ラク トサミンを添加して行った。 イ ンキュベート した各プレートは反応後氷浴上 に移し、 培地の一部をサンプリ ングした後、 4。C中冷却した 2 0 mM E G T A 入り D— P B S溶液 (C a 2 +、 M g 2 +を含まず) を添加し 5分間放置することに よる洗浄を 2回繰り返し、 さらに冷却した D— P B S溶液 ( C a 2\ M g 2 +を含 まず) で 1 回洗浄後、 プレートを— 2 0 °Cで、 3 0分以上放置した。 各 w e l l の 0 . 5 % S D Sを含む 0 . I N N a 0 H溶液 1 m 1による溶解液のうち 0 . 8 m lの放射能から非特異的な取り込みによる分を差し引き全量に換算したもの を取り込み画分量と した。 一方、 培地中の総ト リクロロ醉酸可溶化画分の放射能 から非特異的な分解による分を差し引いたものを分解画分と した。 取り込み試験 は各ポイ ン ト n = 3で行った。 また細胞の総蛋白質量は該溶解液◦ . 1 m lにつ いて L o r r y法により算出した。
その結果、 第 9図 (A) のように A S O Rは、 イ ンキュベート 3 0分より取り 込み成分が観察され、 1時間で飽和に達した。 また分解成分は時間経過にともな ぃ徐々に增加し、 その量は 4時間後が最も高かった。
一方、 (G a l ) 3— r h I L— 2は、 第 9図 ( C ) のように取り込み及び分解
成分がほとんど観察されず、 A S 0 Rに比べ肝実質細胞に取り込まれにくいこと が示された。 この結果、 肝実質細胞に特異的に存在する A S G Rに対する リガン ドの結合親和性を 2オーダー程度低下させることにより、 その修飾体は静脈内投 与により レセブタ一を認識して肝臓へは集積できるものの、 肝実質細胞へは取り 込まれにくい性質を付与しうることが示された。
( G a l N A c ) 3— r h I L— 2は、 第 9図 (B ) のように、 比較的短時間で 取り込まれることがわかった。 先の実験から明らかなように ( G a l NA c ) r h I L— 2は A S G Rに対する親和性は低いので、 肝臓に選択的に達し、 比較 的早期に代謝されることが望ま しい薬剤の D D S製剤に好ま しいことがわかった。 実施例 1 3 修飾体の杭 Bfjj効果
実験は線維肉腫 ( S 9 0 8 . D 2 . V p 2 ) を肝移植 ( 7 . 5 x 1 0 4 c e 1 1 /m o u s e ) したマウス (B 1 0 D 2 , 6 W, を用い、 移植後 7 曰目より ( G a l ) ― r h I L— 2及び r h I L— 2を計 5回 ( 0 . 5 〃 g/ s h o t ) 静脈内投与し ( n = 4 ) 、 2 8 日目に解剖検査を行った。 その結果、 第 1 0図に 示すように r h I L— 2投与群に比べ ( G a l ) 3— r h I L— 2投与群は著しい 腫癍の縮小が観察され、 (G a l ) 3— r h I L— 2は r h I L— 2に対し抗腫瘪 効果が増強されていることが示された。 実施例 1 4 修飾休の啬忡
実験はマウス (B 1 0 D 2 , 6 W, $ ) を用い、 (G a l ) 3- r h I L - 2 及び r h I L— 2を一日 2回 5 日間連続 ( 1 . 5 g/ d a y , 4 . 4 g/ d a y , 1 3 . 3 ju g / d a y , 4 0 g/ d a y、 濃度は全て I L一 2換算) 静 脈内投与し ( n = 3 ) 、 最終投与 2時間後に解剖検査を行った。 評価項目として は肝臓、 肺及び腎臓の臓器重量 (湿重量) の測定と血清を採取して富士ドライケ ムによる血液生化学試験を行った。
その結果、 第 1 1図に示すように肺での (G a l ) r h I L - 2の臓器重量 % (W/W) の増加は同じ投与量の r h I L— 2に比べ低い傾向を示し、 4 0〃 gZd a y投与群において r h l L— 2はコン トロールである生理食塩水投与群
に比べ有意な増加が観察されたのに対し、 (G a l ) 3— r h I L— 2では有意な 増加が観察されなかった。 一方、 肝臓においては (Ga l ) 3— r h I L— 2、 r h I L— 2ともに投与量の増加にともない臓器重量%の増加が観察され、 40〃 g/d a y投与群において r h I L— 2、 (G a l ) 3— r h I L— 2ともにコン トロールである生理食塩水投与群に比べ有意な増加が親察されたものの、 両者に 大きな違いは見られなかった。 さらに腎臓においては (G a l ) r h I L - 2、 r h I L— 2ともに投与量を増加させても臓器重量の増加が見られなかった。 一方、 血液生化学検査の結果、 第 1 2図に示すように、 G O T ( g 1 u t a m i c o x a l o a c e t i c t r a n s am i n a s e ) 、 GP T (g l u t a m i c y r u v i c t r a n s am i n a s e) , TB I L- S (t o t a l b i 1 i r u b i n ) では投与量の增加にともない、 (G a l ) 3— r h I L— 2、 r h I L— 2ともに増加が観察されたが、 r h I L— 2の方が高い 値を示す傾向にあった。 一方、 T P— S ( t o t a l p r o t e i n) 、 A L B— S (a l b um i n N B UN— S (b l o o d u r e a n i t r o g e n ) では投与量の增加による観察値の増加は見られなかった。
以上の結果、 ( G a 1 ) 3— r h I L— 2の毒性は肺において r h I L— 2 に 比べ低い傾向を示し、 肝臓や腎臓においてもその上昇は見られないことから、 本 発明の修飾体が他の臓器に毒性を与えることなく、 肝臓へ集積していることが示 された。