WO1997049823A1 - Ozon-induzierte genexpression in pflanzen - Google Patents

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WO1997049823A1
WO1997049823A1 PCT/EP1997/003187 EP9703187W WO9749823A1 WO 1997049823 A1 WO1997049823 A1 WO 1997049823A1 EP 9703187 W EP9703187 W EP 9703187W WO 9749823 A1 WO9749823 A1 WO 9749823A1
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plants
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gene
genes
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Roland Schubert
Heinrich Sandermann
Dietrich Ernst
Rüdiger Hain
Regina Fischer
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GSF - Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH
Bayer Aktiengesellschaft
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    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance

Definitions

  • the present invention relates to new DNA sequences, a method for producing new plants which contain a new DNA sequence, the coding sequence of which is expressed after ozone induction, these new plants and the use of the DNA sequences for generating ozone. responsive gene expression in plants and plant cells.
  • the present invention relates to a new promoter, the specificity of which is increased by eliminating its ozone responsiveness.
  • ozone Although ozone penetrates the plant cell by diffusion through open stomata, the ozone concentration in the intercellular spaces of the leaf is almost zero, regardless of the ambient ozone concentration (Laisk e_t al. (1989) Plant Physiol. JK>, 1163-1167). It is currently believed that ozone reacts rapidly with components of the cell walls and the plasma lemma and into reactive oxygen species such as superoxide anions, hydroxyl radicals and hydrogen peroxide, which are used in ozone-treated plant material using electron is magnetic resonance spectroscopy were detected, converted (Mehlhorn et AJL. (1990) Physiology Plantarum 79th, 377-383).
  • ozone causes an increased expression of various disease resistance genes, namely some PR (pathogenesis-related) proteins (Ernst et al. (1992) Plant Mol. Biol. 2JD, 673 -682; Ernst et al ⁇ (1996) J. Plant Physiol. 148, 215-221; Eckey-Kaltenbach et al ⁇ . (1994) Plant Physiol. IM * 67-74).
  • PR pathogenesis-related
  • Stilbene synthesis enzymes catalyze the synthesis of stilbenes such as resveratrol and pininovin from one molecule of p-coumaroyl-CoA or cinnamoyl-CoA and three units of malonyl-CoA. Both resveratrol and pininovin have phytoalexin properties and antifungal activity and, as phytoalexins, together with other stilbenes derived from phenylpropane metabolism, have an important function in the defense against pathogens (Hart (1981) Annu. Rev. Phytopathol. 19, 437-458).
  • STS genes occur in some unrelated plant species, such as Peanut (Schröder et al. (1988) Eur. J. Biochem. 112, 161-169), Weinrebe (Hain et ah (1993) Nature 361, 153-156) and Kiefer (Fliegmann et al ⁇ . (1992) Plant Mol Biol. 1J3, 489-503), and are organized in larger gene families consisting of six or more genes (Lanz et al. (1990) Planta 181, 169-175; Wiese et al _ (1994) Plant Mol. Biol. 2_6, 667-677).
  • DNA sequences encoding stilbene synthase are known, for example, from European patent EP 0 309 862, German patent application DE-A-41 07 396, European patent application 0 464 461 and US patent 5,500,367. These documents describe the isolation of stilbene synthase genes and their use in the generation of transgenic plants. The resulting transgenic plants have an increased resistance to various plant pests, such as fungi, bacteria, insects, viruses and nematodes. Plamides containing STS genes were deposited with the German Collection of Microorganisms (DSM), mecaniccheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, e.g. also the V ⁇ tl gene from grapevine in the plasmid pVstl under the accession number DSM 6002 (DE-A-41 07 396, EP-A-0 464 461, US patent 5,500,367).
  • DSM 6002 German Collection of Microorganisms
  • the STS expression it is desirable for the STS expression to be planted in transgenic (culture) plants which, owing to the STS genes introduced, have an increased resistance to disease, solely (and only) through the infestation of pathogens and not additionally (or previously) can be activated and controlled by undesirable environmental stress factors, such as ozone.
  • An important aspect here is the switching off of undesired non-specific environmental stimuli, e.g. the induction of certain defense genes by ozone, UV light, heavy metals, extreme temperatures and other abiotic stimuli.
  • Another object of the invention is to provide options for eliminating ozone induction, ie for switching off desired stimulation of gene expression by ozone.
  • a further object of the invention is therefore to provide DNA sequences which can be used to generate promoters which can be induced in a targeted manner.
  • so-called reporter genes the expression of which can be detected by simple enzymatic tests and which are well known in biotechnological research, can be used as bio-monitors in a very simple and reliable manner.
  • a further object of the invention is to provide a system with the aid of which certain genes, the gene products of which are able to detoxify reactive oxygen species in cells, are “switched on” when necessary, that is to say when there is a high ozone load can.
  • the provision of DNA sequences which are responsible for ozone-responsive gene regulation is intended to enable ozone-inducible expression of such
  • Vstl promoter that only has the base pairs up to and including -280 (and which therefore lacks the upstream Vstl promoter sequences) is no longer ozone-inducible. As mentioned above, this truncated promoter is still able to mediate pathogen-induced gene expression of the coding sequence controlled by it (see Fischer (1994) supra).
  • the ozone-responsive DNA sequence region described here for the first time thus comprises the base pairs -270 to -430 of the Vstl promoter from grapevine.
  • the present invention thus relates to the DNA sequence defined in claim 1 (SEQ ID NO: 1):
  • the DNA sequence according to the invention is a DNA sequence that comes from grapevine, and particularly preferably from the stilbene synthase gene Vstl from grapevine (base pairs -270 to -430).
  • the invention further relates to a promoter region of the V ⁇ tl gene which lacks at least the DNA sequence which comprises the base pairs -270 to -430 of the Vstl gene.
  • it is a promoter region of the Vstl gene which only comprises the sequence region from the translation start to base pair -270 of the Vstl gene.
  • the promoter region, which lacks the sequence range from -270 to -430 of the Vstl gene, is particularly preferably able to mediate pathogen-inducible gene expression in plants.
  • the invention further relates to chimeric nucleic acid molecules into which the DNA sequence of the base pairs -270 to -430 of the Vstl gene or at least one fragment of this sequence region has been introduced.
  • the chimeric nucleic acid molecules of the invention particularly preferably enable the ozone-inducible expression of the coding regions contained in them in plants due to the presence of the DNA sequence of the base pairs -270 to -430 of the Vstl gene or at least a partial region thereof .
  • the nucleic acid molecules according to the invention can be any nucleic acid molecules, in particular DNA or RNA molecules, for example cDNA, genomic DNA, mRNA etc. They can be naturally occurring molecules or those produced by genetic engineering or chemical synthesis methods.
  • Ozone induction of naturally ozone-inducible genes in plants and plant cells by deletion of the DNA sequence according to claim 1 or at least one fragment thereof in the genes which naturally contain this DNA sequence or a derivative thereof or a DNA sequence homologous to it , can be switched off.
  • a further advantage of the invention consists in the fact that genes which are not or not substantially inducible by ozone can be expressed in plants and plant cells using the nucleic acid sequences according to the invention in an ozone-inducible manner.
  • the nucleic acid sequence which is responsible for the ozone-inducible expression, or at least a fragment thereof controls the expression of genes whose gene products are capable of reactive oxygen species which arise, inter alia, as a result of ozone in plant cells can detoxify.
  • this controls Nucleic acid sequence the expression of catalase and / or superoxide dismutase genes.
  • the DNA sequence responsible for the ozone-inducible gene expression controls the expression of reporter genes, which is measured for the quantitative and / or qualitative determination of ozone concentrations and for the evaluation of ozone effects.
  • reporter genes can e.g. the uidA gene from E ⁇ . coli which codes for the enzyme ⁇ -glucuronidase (GUS), luciferase genes or other genes customary in plant biotechnology. Suitable reporter genes are known to any person skilled in the field of biotechnology, biochemistry or molecular biology.
  • the present invention further relates to vectors which contain the abovementioned DNA sequences or promoter regions or parts thereof.
  • the present invention thus also relates to vectors, in particular plasmids, cosmids, viruses, bacteriophages and other vectors which are common in genetic engineering and which contain the nucleic acid molecules according to the invention described above and which can optionally be used for the transfer of the nucleic acid molecules according to the invention to plants or plant cells.
  • the invention also relates to transformed microorganisms, such as bacteria, viruses, felts, which contain the nucleic acid sequences according to the invention.
  • This task is accomplished by the provision of the DNA sequence responsible for ozone induction and the provision of promoters which lack this sequence and which for this reason are no longer capable of gene expression which can be induced by ozone through controlled genes in plants and plant cells.
  • these are transformed plants and plant cells in which genes are inducibly expressed, whose gene products are able to detoxify reactive oxygen species in plant cells. These are particularly preferably catalase and / or superoxide dimethyl genes.
  • plants and plant cells can be generated, which express so-called reporter genes after induction by ozone and which can optionally be used as bio-monitors.
  • the invention thus relates to transgenic plants which contain the recombinant nucleic acid molecules described above, integrated in the plant genome.
  • these plants can be any plant. It is preferably a monocot or dicot crop.
  • monocotyledonous plants are the plants belonging to the genera Avena (oat), Triticum (wheat), Seeale (rye), Hordeum (barley), Oryza (rice), Panicum, Pennisetum, Setaria, sorghum (millet), Zea ( Corn).
  • the dicotyledonous crops include cotton, legumes such as legumes and in particular alfalfa, soybean, rapeseed, tomato, sugar beet, potatoes, ornamental plants, trees.
  • Other useful plants can be fruit (in particular apples, pears, cherries, grapes, citrus, pineapple and bananas), oil palms, tea, cocoa and coffee bushes, tobacco, sisal and, for medicinal plants, rauwolfia and digitalis.
  • the invention also relates to propagation material from plants according to the invention, for example seeds, fruits, cuttings, tubers, rhizomes, etc., and parts of these plants, such as plant cells, protoplasts and calli.
  • the plant cells include differentiated and undifferentiated plant cells (including protoplasts), as well
  • Plant cells including protoplasts in which the nucleic acid molecules according to the invention are integrated into the plant genome or as autonomous molecules (including transient transformation).
  • the invention relates to host cells, in particular prokaryotic and eukaryotic cells, which have been transformed or infected with a recombinant nucleic acid molecule or a vector described above, and cells which are derived from such host cells and contain the described nucleic acid molecules or vectors .
  • the host cells can be bacteria or fungal cells as well as plant or animal cells.
  • the present invention is also based on the object
  • This object is achieved by methods with the aid of which it is possible to produce new plants and plant cells which do not have this naturally occurring ozone-induced gene expression.
  • the present invention is also based on the object of processes for the production of plants and plant cells which contain such genes and their expression naturally not or not significantly activated by ozone, after ozone stimulation, to provide.
  • This object is achieved by methods by means of which plants and plant cells can be produced which, after the introduction of the DNA sequences according to the invention or at least a partial region thereof into genes which are naturally not or only weakly ozone-inducible, express these genes after ozone stimulation.
  • plants or plant cells can be modified using conventional genetic engineering transformation methods in such a way that the new nucleic acid molecules are integrated into the plant genome, i.e. that stable transformants are generated.
  • plants or plant cells which, owing to the lack of the nucleic acid sequence according to the invention or at least one fragment thereof, no longer exhibit ozone induction of the gene (s) naturally containing this sequence, are produced by a process which comprises the following steps: a) deletion of the im Defined DNA sequence or a sequence which can be derived from this sequence or which is homologous to this sequence, or at least one fragment of this sequence from a gene which regulatory elements after the deletion of the DNA sequence according to the invention for the, if necessary regulated, transcription and translation in plant cells are indispensable, comprises at least one coding sequence, and optionally a termination signal for the termination of the transcription and the addition of a poly-A tail to the corresponding transcript; b) transformation of plant cells with the gene or nucleic acid molecule produced in step a), and c) optionally the regeneration of transgenic plants and, if appropriate, the multiplication of the plants.
  • step a) instead of deleting the sequence responsible for the ozone induction, this sequence or at least a part thereof, for example by mutagenesis, can be inactivated or blocked and remain in the gene in inactivated form.
  • all manipulation measures can be carried out with the aid of generally customary methods and aids of recombinant genetic engineering (see, for example, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
  • the nucleic acid molecule which is transferred to plants or plant cells in step b) contains regulation elements which e.g. Enable pathogen-induced gene expression of the coding sequence.
  • plants or plant cells which, owing to the presence of the nucleic acid sequence according to the invention, which is essential or jointly responsible for ozone-induced expression of the genes containing them, or at least one fragment of this sequence, are produced by a process which comprises the following steps a) insertion of at least one DNA sequence according to the invention which can bring about an ozone-induced gene expression in plants, or a sequence which can be derived from this sequence or which is homologous to this sequence, or at least one fragment of this sequence in a gene , which is naturally not or not significantly expressed in an ozone-inducible manner b) transformation of plant cells with the gene or nucleic acid molecule produced in step a) which has all the elements which are naturally required for expression in plant cells, and c) if necessary the regeneration of transgenic cells Plants and gg f. the propagation of plants.
  • the gene is a catalase, superoxide dismutase or a common reporter gene.
  • Another object of the invention is to show advantageous uses of the nucleic acid sequences according to the invention.
  • the invention therefore encompasses uses of the new DNA molecules for the production of the plants and plant cells according to the invention described above, which are characterized either by the lack of an expression of a certain phenotypic characteristic which is normally influenced by ozone, or by the presence of the DNA sequence according to the invention Distinguish ozone-induced traits from non-transgenic plants and plant cells.
  • the invention encompasses the use of the nucleic acid molecules according to the invention for the production of plants which are characterized by an increased pathogen-induced but non-ozone-induced disease resistance.
  • the invention relates to the use of the nucleic acid sequences according to the invention or fragments thereof for the detection and identification of ozone-responsive nucleic acid elements.
  • ozone-responsive nucleic acid elements with the aid of common molecular biological methods, for example hybridization experiments or DNA-protein binding studies.
  • a first step for example, the poly (A) * RNA is isolated from a tissue that has been treated with ozone and a cDNA library is created.
  • a second step with the help of cDNA clones which are based on poly (A) * RNA molecules from an untreated tissue, those clones are identified from the acquired bank by means of hybridization whose corresponding poly (A) * RNA -Molecules are only induced during ozone treatment.
  • these identified cDNA ⁇ promoters are isolated, which via Ozone-reflective elements. Nucleic acid sequences and molecules can be useful tools in the study and characterization of these isolated promoters.
  • hybridization means hybridization under conventional hybridization conditions, preferably under stringent conditions, such as, for example, in Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
  • Nucleic acid molecules which hybridize with the molecules according to the invention can e.g. from genomic or from cDNA libraries.
  • nucleic acid molecules can be identified and isolated using the nucleic acid molecules according to the invention or parts of these molecules or the reverse complement of these molecules, e.g. by means of hybridization according to standard methods (see e.g. Sambrook et al, supra).
  • the invention thus also relates to the use of a DNA sequence according to the invention or of parts thereof for the identification and isolation of homologous sequences from plants or other organisms.
  • nucleic acid molecules which have the nucleotide sequences according to the invention or parts of these sequences exactly or essentially can be used as the hybridization probe.
  • the fragments used as the hybridization probe can also be synthetic fragments which were produced with the aid of the conventional synthetic techniques and whose sequence essentially corresponds to that of an inventive method Nucleic acid molecules. If genes which hybridize with the nucleic acid sequences according to the invention have been identified and isolated, a determination of the sequence and an analysis of the properties are necessary. For this purpose, a number of standard molecular, biochemical and biotechnological methods are available to the person skilled in the art.
  • the molecules hybridizing with the nucleic acid molecules according to the invention also include fragments, derivatives and allelic variants of the DNA molecules described above, which contain an ozone-responsive sequence, in active or inactivated form, or which are distinguished by the fact that they do not have this sequence have more.
  • derivative means that the sequences of these molecules differ from the sequences of the nucleic acid molecules described above at one or more positions and have a high degree of homology to these sequences.
  • Homology means a sequence identity of at least 40%, in particular an identity of at least 60%, preferably over 80% and particularly preferably over 90%.
  • the deviations from the nucleic acid molecules described above can be caused by deletion, addition, substitution, insertion or recombination.
  • nucleic acid molecules which are homologous to the molecules described above and which are derivatives of these molecules are generally variations of these molecules which represent modifications which have the same biological function. These can be both naturally occurring variations, for example sequences from other organisms, or mutations, whereby these modifications can have occurred naturally or have been introduced by targeted mutagenesis. Furthermore, the variations can be synthetically produced sequences.
  • allelich variants can be both naturally occurring and synthetically produced variants or those produced by recombinant DNA techniques. To prepare the introduction of foreign genes into higher plants or their cells, a large number of cloning vectors are available which generate a replication signal for JL. coli and a marker gene for the selection of transformed Bakt ⁇ rien cells contain.
  • Examples of such vectors are pBR322, pUC series, M13mp series, pACYC184 and others.
  • the desired sequence can be inserted into the vector at a suitable restriction interface.
  • the plasmid obtained is used for the transformation of Ej_ coli. Cells. Transformed E_ j . coli cells are grown in a suitable medium and then harvested and lysed. The plasmid is recovered. Restriction analysis, gel electrophoresis and other biochemical-molecular biological methods are generally used as the analysis method for characterizing the plasmid DNA obtained. After each manipulation, the plasmid DNA can be cleaved and DNA fragments obtained can be linked to other DNA sequences. Each plasmid DNA sequence can be cloned into the same or different plasmids.
  • a large number of known techniques are available for introducing DNA into a plant host cell, the person skilled in the art being able to determine the appropriate method in each case without difficulty. These techniques include the transformation of plant cells with T-DNA using Aqrobacterium tumefaciens or A ⁇ robacterium rhizoqene ⁇ as a transformation agent, the fusion of protoplasts, the direct gene transfer of isolated DNA into protoplasts, the electroporation of DNA, the introduction of DNA using the biolistic method as well as other options. Both stable and transient transformants can be generated.
  • Customary selection markers are those which impart to the transformed plant cells resistance to a biocide or an antibiotic such as kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, methotrexate, glyphosate, streptomycin, sulfonyl-urineoff, gentamycin or phosphinotricin, among others.
  • an antibiotic such as kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, methotrexate, glyphosate, streptomycin, sulfonyl-urineoff, gentamycin or phosphinotricin, among others.
  • the Ti or Ri pliffmid is used for the transplantation of the plant cell, at least the right boundary, but often the right and left boundary of the T-DNA contained in the Ti and Ri pliffmid, must be linked as a flank region with the genes to be introduced .
  • the DNA to be introduced must be cloned into special plasmids, either in an intermediate or in a binary one
  • the intermediate vectors can be integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria by homologous recombination. This also contains the vir region necessary for the transfer of the T-DNA. Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria. Using a helper plasmid, the intermediate vector can be transferred to Aqrobacterium tumefacien ⁇ (conjugation). Binary vectors can replicate in E_ ⁇ coli as well as in Agrobacteria. They contain a selection marker gene and a linker or
  • Polylinkers which are framed by the right and left T-DNA border region. They can be transformed directly into the agrobacteria (Holsters et al (1978) Molecular and General Genetics 163, 181-187).
  • the agrobacterium serving as the host cell is said to contain a plasmid which carries a vir reqion. The pre-region is necessary for the transfer of the T-DNA into the plant cell. Additional T-DNA may be present.
  • the Agrobacterium transformed in this way is used for the transformation of plant cells.
  • T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and is sufficiently described in EP 120 515; Hoekema in: The Binary Plant Vector System, Offsetdrokkerij Kanter ⁇ BV, Alblwie ⁇ erdam (1985) Chapter V; Fraley et al (1993) Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 and An et al (1985) EMBO J. 4, 277-287.
  • plant explants can expediently be cultivated with Aqrobacterium turnefacien ⁇ or Aqrobacterium rhizoqene ⁇ .
  • Whole plants can then be regenerated again from the infected plant material (for example leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension cells cultivated plant cells) in a suitable medium which can contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells .
  • the plants are regenerated using conventional regeneration methods using known nutrient media.
  • the plants or plant cells obtained can then be examined for the presence of the introduced DNA.
  • Other ways of introducing foreign DNA using the biological one are possible.
  • the transformed cells grow within the plant in the usual way (see also McCormick et al (1986) Plant Cell Reports 5, 81-84).
  • the resulting plants can be grown normally and crossed with plants that have the same transformed genetic makeup or other genetic makeup.
  • the resulting hybrid individuals have the corresponding phenotypic properties.
  • Two or more generations should be attracted to ensure that the phenotypic characteristic is stably retained and inherited. Seeds should also be harvested to ensure that the appropriate phenotype or other characteristics have been preserved.
  • transgenic lines can be determined using conventional methods, which are homozygous for the new nucleic acid molecules and which investigate their phenotypic behavior with regard to an existing or non-existing ozone-responsiveness and compare it with that of hemizygotic lines.
  • plant cells which contain the nucleic acid molecules according to the invention can also be further cultivated as plant cells (including protoplasts, calli, suspension cultures, etc.).
  • Another object of the present invention is the use of the nucleic acid molecules according to the invention or parts of these molecules or the reverse complements of these molecules for the identification and isolation of homologous molecules, the ozone-responsive elements comprise from plants or other organisms.
  • the ozone-responsive elements comprise from plants or other organisms.
  • the 5 'non-coding sequence region of the Vstl gene from grapevine referred to below as the promoter consists of 1570 base pairs.
  • This promoter whose sequence i.a. Known from German DE 41 07 396 and Fischer (1994) supra, using a conventional polymer chain reaction using the following oligonucleotides as primer and the plasmid pV ⁇ tl containing the complete Vstl gene (DE-A-41 07 396; Fischer (1994) supra) amplified as template:
  • the PCR reaction was performed according to the Perkin Elmer protocol (Norwalk, USA) using the Perkin Elmer native Taq DNA polymerase.
  • the DNA fragment amplified under customary PCR conditions was then subjected to the restriction enzymes HindII (the restriction portion is contained at the 5 'end of primer 1) and BamHI (the restriction site is contained at the 5' end of primer 2).
  • HindII the restriction portion is contained at the 5 'end of primer 1
  • BamHI the restriction site is contained at the 5' end of primer 2
  • resected and together with the BamHI / EcoRI fragment from the vector pBI101.2 (Jeffer ⁇ on (1987) Plant Mol. Biol. Reporter 5_, 387-405), which contains the / 8-glucuronidase reporter gene (GUS, uidA) from E_j. coli together with the termination signal de ⁇ nos gene from A.
  • turnefacJens contains, via which HindIII and EcoRI restriction portions of the pUCl ⁇ polylinker in the pUCl ⁇ plasmid (Yani ⁇ ch-Perron et aJU (1985) Gene 33., 103-119; available B. subcloned by Boehringer Mannheim). All cloning steps were carried out using common molecular biological techniques and aids (for example Sambrook et al. (1989) supra); Restriction enzymes and other enzymes used for the cloning were obtained from Boehringer Mannheim.
  • the resulting pUC clone thus contains a translation fusion of the ⁇ V ⁇ tl promoter ⁇ with the GUS gene, in which the first five STS codons in frame are linked to the GUS gene via a BamHI cut.
  • the sequence region of the fusion transition and the sequence of the V ⁇ tl promoter were determined using the enzymatic chain termination method (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) using the T7 sequencing -Kit from Pharmacia (Freiburg) checked for correctness.
  • the plasmid designations result from the approximate length of the respective promoter fragment, calculated from the transcription type, which is 73 base pairs away from the start codon (Hain et al. (1993) supra; Fischer (1994) supra).
  • the restriction interfaces used for the gradual shortening of the V ⁇ tl promoter are also shown schematically in FIG. 1.
  • pl500GUS The Hindlll / EcoRI fragment, which contains the complete STS promoter together with the GUS gene, was isolated from the plasmid pUC-Vstl / GUS described above and inserted between the restriction sites Hindlll and EcoRI in the polylinker of pPCV002.
  • - pl060GUS An 1130 bp promoter fragment was olated via the restriction sites BamHI and Sspl from pUC-V ⁇ tl / GUS i ⁇ and cloned in BamHI / HincII-linearized pUCl ⁇ (-> pUC1130).
  • the GUS gene was then isolated as BamHI / EcoRI fragment from pUC-V ⁇ tl / GUS and the BamHI and EcoRI cleavage site of pUC1130 was cloned in between. Finally, the fusion was isolated via a HindIII / EcoRI double digest and inserted into the polylinker of pPCV002 via the same interfaces. - p930GTJS: The 1.0 kb promoter fragment was over the
  • Restriction enzymes BamHI and HincII isolated from pUC-Vstl / GUS and inserted into the polylinker of pUCl ⁇ via the same restriction sites (-> pUClOOO). The cloning was then carried out analogously to pl060GUS.
  • p740GUS The 1.6 kb H ⁇ dlll / BamHI promoter fragment was isolated from the plasmid pUC-V ⁇ tl / GUS and digested with the restriction enzyme Dral. The resulting 810 bp. BamHI / Dral fragment was then cloned into pUCl ⁇ via the restriction sites BamHI and HincII (-> pUC810).
  • the GUS gene was then isolated as BamHI / EcoRI fragment from pUC-V ⁇ tl / GUS and the BamHI and EcoRI cleavage sites of pUC810 were cloned in between. Finally, the fusion was isolated via a HindIII / EcoRI double digest and inserted into the polylinker of pPCV002 via the same interfaces.
  • pUC-V ⁇ tl / GUS was digested with the restriction enzyme AfIII and the overhanging 5 'ends were filled with Klenow enzyme (from Boehringer Mannheim; dNTPs also from Boehringer Mannheim) according to the manufacturer's information. Subsequently, the restriction enzyme BamHI was cut and the resulting 620 bp promoter fragment was ligated in BamHI / HincII-linearized pUCl ⁇ (-> pUC620). After that, the cloning was carried out as continued for pl060GUS.
  • p500GUS A 570 bp. long ⁇ promoter fragment was isolated from pUC-V ⁇ tl / GUS via a BamHI / HaelII double digest and in
  • p280GTJS pUC-Vstl / GUS was digested with the restriction enzyme Banll, the overhanging ends were filled in with Klenow enzyme and the linearized vector was digested again with the restriction enzyme BamHI. After the isolation of the 350 bp long blunt end / BamHI promoter fragments, the cloning was continued in analogy to pl060GUS.
  • pI40GUS The pUC subclone pUC620 described above was digested with the restriction enzymes Neil and P ⁇ tl and the linearized vector was then purified and religated. This resulted in the deletion of the promoter sequences from -550 to -140 (-> pUC210).
  • the GUS gene was then isolated as a BamHI / EcoRI fragment from pUC-V ⁇ tl / GUS and the BamHI and EcoRI sections of pUC1130 were cloned in between. Finally, the foot was over a Hindlll / EeoRI
  • p40GUS The 110 bp promoter fragment was isolated together with the GUS gene by means of a Nhel / EcoRI double digest from pUC-Vstl / GUS and the fragment was then cloned into Xbal / EcoRI-linearized pPCV002.
  • the construct pl500GUS was digested with the restriction enzyme BamHI and the purified vector was then religated.
  • the BamHI cut parts which the vector pPCV002 naturally contains in its multiple cloning site next to the Hindlll cut parts (Koncz and Schell (1986) ⁇ upra), have thus eliminated the entire promoter fragment.
  • NicotJana tabacum cv. Petit Havana SRI (Maliga et al. (1973) Nature New Biol. 244, 29-30) was grown as a sterile shoot culture on hormone-free 1/2 LS medium (Lin ⁇ maier and Skoog (1965) Physiol.
  • the agrobacterial cultures used for the transformation of the tobacco leaf pieces were prepared as follows. First, the pPCVO02 derivatives described above were used in the E ⁇ . coli mobilization strain S17-1 (Simon et al. (1983) Bio / Technology 1, 784-790). The manufacturing took place
  • the transgenic tobacco shoots each containing one of the Vstl promoter / GUS fusions described above, were propagated ⁇ terilly via shoot culture, partially transferred to soil and in the greenhouse under normal conditions (22 ° C, 60% relative humidity, approx. 15,000 lux) cultivated until flowering.
  • the flowers were protected from cross-pollination by parchment bags and ripe seed capsules with seeds of the Fl generation were harvested after 4-6 weeks.
  • the Fl generation seed was designed on LS medium with 75 ⁇ g / ml kanamycin. This was done under sterile conditions directly from the capsule or after surface sterilization (1. brief washing with sterile water; 2. 2 min. Incubation in 70% ethanol; 3. 10 min.
  • the resistant Fl seedlings were transferred to earth, hardened and further cultivated under suitable conditions.
  • transgenic, canine-resistant tobacco seedlings were first transferred from agar plates into flower pots with a 2: 1 mixture of standard substrate (type T / ceremoniesstorfer / Lauterbach) with perlite and for 3 weeks in a climatic chamber with a 12-hour day / Night cycle, 15,000 lux, 25 ° C day temperature, 20 ° C night temperature, 65-70% humidity and filtered air incubated.
  • the fluorometric analysis of the GUS enzyme activity was carried out strictly according to Jefferson (1987) supra or Jefferson et al. (1987) EMBO J. 6, 3901-3907 using 4-methyl-umbelliferyl-glucuronide (MUG, Sigma, Kunststoff).
  • the concentration of the product 4-methylumbelliferone (MU) was measured with a fluorescence photometer (Perkin Elmer LS-2 B filter fluorimeter) in a quartz flow cell.
  • the GUS activity in plant extracts was calculated in pmol MU x mg " 1 x min" 1 .
  • the protein concentration in the tobacco leaf extracts was analyzed according to Bradford (1976). Biochem. 12_, 248-254.
  • Fl tobacco plants 11 weeks old from the stably transformed tobacco line, which contains the Vstl promoter / GUS fusion construct with the complete promoter region (plSOOGUS), were used in ozone gassing experiments.
  • GUS enzyme activities were measured fluorometrically in crude extracts from leaves, which were at different times during a 10-hour ozone exposure with different ozone concentrations (0.1 ⁇ l / 1 ozone, 0.2 ⁇ l / l ozone and 0.4 ⁇ l / 1 ozone) and one 14-hour post-incubation phase in pollutant-free air were determined.
  • transgenic tobacco lines which contain the 5 'deletions of the V ⁇ tl promoter described above in fusion with the bacterial GUS reporter gene were identified for the identification of ice-regulatory sequences which are responsible for the observed strong ozone induction of the STS promoter. analyzed as independent FO plants in ozone fumigation experiments. The primary rain rate was cultivated in sterile culture for several months and propagated via shoot culture. Fl tobacco plants (11 weeks old) of these stable transformants were also examined for ozone-induced GUS expression.
  • the transparent tobacco plants were treated with 0.1 ⁇ l / 1 ozone for 10 h and then incubated for a further 2 h in air free of harmful substances.
  • the GUS activity was determined in crude extracts from middle-aged leaves and compared with the enzyme activity in untreated control plants.
  • the results of the fluorometric analysis of the GUS enzyme activities are shown in Table 1. While the GUS activity with increasing shortening of the promoter region from -1500 to -430 results both in ozone-treated test plants and in untreated control plants in a slight decrease in the ozone induction (induction ⁇ factor drops from approx.
  • the additional deletion of the promoter region between -430 and -280 results in a drastic reduction in GUS expression in ozone-treated test plants. While plants in which the GUS gene is under the control of the -430-5 'deletion promoter show a 10-fold ozone induction compared to the control plants, in plants the expression of the GUS gene by the shorter -280- 5 'deletion promoter is controlled, only a maximum 2-fold induction of the GUS expression by ozone is observed. As a result, the promoter region contains the Vstl gene Grapevine comprising the base pairs -430 to -280 cis-active elements which are essential for a pronounced ozone-induced expression of the STS gene.
  • Figure 1 Restriction map of the Vstl promoter / GUS translation foot in the plasmid pUC-Vstl / GUS.
  • the plasmid contains a translation fusion of the Vstl promoter from the grapevine with the GUS gene from E ⁇ coli.
  • Table 1 GUS enzyme activities were determined fluorometrically in protein extracts from middle-aged leaves of ozone-treated (+) and untreated (-) independent tobacco teardrop formants.
  • the transgenic tobacco lines contain various 5 'deletions of the Vstl promoter in fusion with the bacterial GUS reporter gene.
  • FO transformants and FL plants (11 weeks old) were gassed with 100 nl / 1 ozone for 10 h and then incubated for 2 h in air free of harmful substances. Mean values ⁇ standard error; all analyzes were carried out as double experiments.
  • GUS enzyme activities were determined fluorometrically in protein extracts from middle-aged leaves of ozone-treated (+) and untreated (-) independent tobacco transformants.
  • the transgenic tobacco lines contain various 5 'deletions of the V ⁇ tl promoter in fusion with the bacterial GUS reporter gene.
  • F0 transformants and FL plants (11 weeks old) were gassed with 100 nl / 1 ozone for 10 h and then post-incubated in pollutant-free air for 2 h. Mean values ⁇ standard error; all analyzes were carried out as double tests.
  • GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAA CCTTCGTAAT GTT ⁇ ATGAAA TCAAAGTCAC 120

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue DNA-Sequenzen, eine Methode zur Erzeugung neuer Pflanzen, die eine neue DNA-Sequenz enthalten, deren kodierende Sequenz nach Ozon-Induktion exprimiert wird, diese neuen Pflanzen sowie die Verwendung der DNA-Sequenzen zur Erzeugung Ozon-responsiver Genexpression in Pflanzen und Pflanzenzellen. Andererseits betrifft die vorliegende Erfindung einen neuen Promotor, dessen Spezifität durch Beseitigung seiner Ozon-Responsivität erhöht ist.

Description

Ozon-Induzierte Genexpresβion in Pflanzen
Die vorliegende Erfindung betrifft neue DNA-Sequenzen, eine Methode zur Erzeugung neuer Pflanzen, die eine neue DNA-Sequenz enthalten, deren kodierende Sequenz nach Ozon-Induktion expri¬ miert wird, diese neuen Pflanzen sowie die Verwendung der DNA- Sequenzen zur Erzeugung Ozon-responsiver Genexpression in Pflanzen und Pflanzenzellen. Andererseits betrifft die vorlie¬ gende Erfindung einen neuen Promotor, dessen Spezifität durch Beseitigung seiner Ozon-Responsivität erhöht ist.
Die Ozonkonzentrationen in der unteren Troposphäre über den Kontinenten der Nördlichen Hemisphäre haben sich im Laufe der letzten hundert Jahre in Folge verstärkter industriellen Akti¬ vitäten ständig erhöht (Volz and Kley (1988) Nature 332, 240- 242) . Inzwischen erreichen die Ozonwerte vorübergehende Spit¬ zenkonzentrationen von 100 nl/1 bis 200 nl/1 in Europa und Nordamerika (Krupa e_t al. (1995) Environ. Pollut. 87, 119-126) .
Die Phytotoxizität des Luftschadstoffes Ozon ist gut untersucht und dokumentiert; z.B. in Heagle (1989) Annu. Rev. Phytopathol. 2J7, 397-423; Heath (1994) In: Alscher, Wellburn (ed) "Plant responses to the gaseous environment", pp. 121-145, Chapman & Hall, London. Eine verringerte Nettophotosynthese und ver¬ stärkte frühzeitige Seneszenz sind im allgemeinen das Ergebnis einer solchen Ozonbelastung, die dadurch geringeres Pflanzen¬ wachstum und niedrigere Ernteerträge zur Folge hat.
Obwohl Ozon mittels Diffusion durch offene Stomata in die Pflanzenzelle eindringt, ist die Ozonkσnzentration in den Interzellularräumen des Blattes fast gleich Null, unabhängig von der Umgebungs-Ozonkonzentration (Laisk e_t al. (1989) Plant Physiol. jK>, 1163-1167) . Es wird derzeit angenommen, daß Ozon rasch mit Bestandteilen der Zellwände und des Plasmalemmas reagiert und in reaktive SauerstoffSpezies wie Superoxid- Anionen, Hydroxylradikale und Wasserstoffperoxid, die in Ozon¬ behandeltem Pflanzenmaterial unter Verwendung von Elektronen- spinresonanzspektroskopie detektiert wurden, umgewandelt wird (Mehlhorn et aJL. (1990) Physiologie Plantarum 79., 377-383). Der sogenannte "oxidative burst", d.h. das rasche Entstehen einer relativ hohen Menge an reaktiven Sauerstoffspezies, kann durch Veränderung der Permeabilität der Plasmamβmbran, Inaktivierung von redoxsensitiven Proteinen und verstärkte Lipidperoxidation zu einer dramatischen Störung der normalen Zellfunktion führen.
Jüngste Untersuchungen zeigten, daß in Ozon-behandelten Pflan- zen eine verstärkte Biosynthese unspezifischer Abwehrenzyme, deren Aufgabe in dem Schutz lebender Zellen vor Schädigung durch oxidativen Streß besteht, stattfindet (Kangasjärvi et al. (1994) Plant, Cell and Environment 17, 783-794) . Dennoch ist die für die Ozon-induzierte Genaktivierung verantwortliche Signaltranβduktionskette, die die entsprechende Information über die Bildung apoplastischer reaktiver Sauerstoffspezies in den Zellkern trägt, bis heute nicht verstanden. Derzeit werden verschiedene Faktoren, wie Anstieg der Calciumkonzentration im Cytosol (Price et aJU. (1994) The Plant Cell 6, 1301-1310) , Bil- düng von Salicylsäure (Kleβsig and Malamy (1994) Plant Mol. Biol. 26, 1439-1458) und the Phytohoπnone Jaβmonsäure (Farmer
(1994) Plant Mol. Biol. 2_6, 1423-1437) und Ethylen (Ecker
(1995) Science 268, 667-674), als mögliche, durch oxidativen Streß verursachte Signalverbindungen, die generell an pflanz- liehen Abwehrreaktionen beteiligt sind, diskutiert.
In Untersuchungen mit Ozon-begasten Tabakpflanzen konnte ge¬ zeigt werden, daß Ozon eine verstärkte Expression verschiedener Krankheitsresistenzgene, nämlich einiger PR- (Pathogenesis- related) -Proteine, verursacht (Ernst et al. (1992) Plant Mol. Biol. 2JD, 673-682; Ernst et al^ (1996) J. Plant Physiol. 148, 215-221; Eckey-Kaltenbach et al^. (1994) Plant Physiol. IM* 67- 74) . Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß ein von Ozon verursachter oxidativer Streß die Expression und Regulation pflanzlicher Abwehrgene in ähnlicher Weise beeinflußt, wie er für Pathogenbefall beschrieben wurde. Gegenwärtig stehen nur sehr begrenzte Informationen über αis_-Regulationselemente und Transkriptionsfaktoren, die möglicherweise an der Kontrolle der Genexpreββion unβpezifiβcher Abwehrgene als Antwort auf ver- βchiedene Umwelteinflüsse beteiligt sind, zur Verfügung (Lee et al. (1994) Eur. J. Biochem. 226. 109-114) . Allerdings lassen bisherige Ergebnisse vermuten, daß im Fall der für die PR- Proteine kodierenden Gene getrennte oder zumindest nur teil- weise überlappende Signaltransduktionswege existieren (Somssich
(1994) In: Nover (ed) "Plant promoters and transcription fac- tors", pp. 163-179, Springer-Verlag, Berlin; Dolferuβ et al.
(1994) Plant Physiol. 105, 1075-1087) .
Für die Aktivität der an der Phytoalexinsynthese beteiligten Stilbensynthaβe (STS) ist ebenfalls bekannt, daß sie in adulten Pflanzen durch Umweltstreßfaktoren, wie z.B. Pathogenbefall (Langcake (1981) Physiol. Plant Pathol. 18_, 213-226), UV-Licht (Fritzemeier and Kindl (1981) Planta 151, 48-52) und Ozon (Rosemann et al. (1991) Plant Physiol. 97., 1280-1286) induziert wird. Im Gegensatz dazu wurde in Keimlingen ein konstitutives Expressionsmuster beobachtet (Sparvoli e_t al. (1994) Plant Mol. Biol. 21» 743-755) .
Stilbensynthaβeenzyme katalysieren die Synthese von Stilbenen wie Resveratrol bzw. Pinoβylvin aus einem Molekül p-Cumaroyl- CoA bzw. Cinnamoyl-CoA und drei Einheiten Malonyl-CoA. Sowohl Resveratrol als auch Pinoβylvin besitzen Phytoalexineigenschaf- ten und antifungale Aktivität und haben als Phytoalexine zusam- men mit anderen aus dem Phenylpropanstoffwechsel abgeleiteten Stilbenen eine wichtige Funktion in der Abwehr von Krankheits¬ erregern (Hart (1981) Annu. Rev. Phytopathol. 19., 437-458) .
STS-Gene kommen in einigen nicht miteinander verwandten Pflan- zenspecies, wie z.B. Erdnuß (Schröder et al. (1988) Eur. J. Biochem. 112, 161-169), Weinrebe (Hain et ah (1993) Nature 361. 153-156) und Kiefer (Fliegmann et al^. (1992) Plant Mol. Biol. 1J3, 489-503), vor und sind in größeren Genfamilien, bestehend aus sechs oder mehr Genen, organisiert (Lanz et al. (1990) Planta 181, 169-175; Wiese et al _ (1994) Plant Mol. Biol. 2_6, 667-677) .
Experimente mit transgenen Tabakzellen deuteten darauf hin, daß die Expression der Stilbensynthase hauptsächlich auf Transkrip- tionsebene reguliert wird und die Streß-induzierte Signaltrans- duktionskette in verschiedenen Pflanzenspezieβ im Laufe der Evolution konserviert worden ist (Hain et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15, 325-335) .
STS-Gene aus Erdnuß (Arachis hypoσaea) und Weinrebe (Vitis vinifera) wurden bereits isoliert (Schröder et al. (1988) supra bzw. Hain et al. (1993) supra) und in tranβgenen Pflanzen zur Expression gebracht (Hain et al. (1990) supra bzw. Hain e_t al. (1993) supra) .
Für Stilbensynthase kodierende DNA-Sequenzen sind beispiels¬ weise aus der europäischen Patentschrift EP 0 309 862, der deutschen Patentanmeldung DE-A-41 07 396, der europäischen Patentanmeldung 0 464 461 sowie der US-Patentschrift 5,500,367 bekannt. In diesen Dokumenten wird die Isolierung von Stilbensynthase-Genen und ihre Verwendung zur Erzeugung von transgenen Pflanzen beschrieben. Die resultierenden tranβgenen Pflanzen weisen eine erhöhte Resistenz gegenüber verschiedenen Pflanzenschädlingen, wie Pilzen, Bakterien, Insekten, Viren und Nematoden auf. STS-Gene enthaltene Plaβmide wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) , Maβcheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig hinterlegt, so z.B. auch das Vβtl-Gen aus Weinrebe in dem Plasmid pVstl unter der Hinterlegungsnummer DSM 6002 (DE-A-41 07 396, EP-A-0 464 461, US-Patent 5,500,367).
Während inzwischen auch die Verwendung von STS-kodierenden Se¬ quenzen zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen und veränder¬ ter Blütenfarbe beschrieben wurde (deutsche Patentanmeldung DE- A-44 40 200) , ist ein möglicher Zusammenhang zwischen STS-Gen- expression und Ozon-Induktion bis heute vollkommen unerforscht.
Es gibt inzwischen verschiedene Hinweise darauf, daß es für eine möglichst effiziente Krankheitsresistenz basierend auf der Expression von STS-Genen in transgene Pflanzen vorteilhaft ist, wenn die Expression des heterologes STS-Gens (bzw. der hetero- logen STS-Gene) in der Pflanze erst durch das angreifende Pathogen, d.h. erst durch die Interaktion von Pflanze und Krankheitserreger, stimuliert wird (Fischer and Hain (1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 125-130; Fischer (1994) "Optimierung der heterologen Expression von Stilbensynthaβe- genen für den Pflanzenschutz", Universität Hohenheim) . Hierfür spricht besonders die Beobachtung, daß die Pathogen-induzierte STS-Genexpression lokal auf den Infektionsort begrenzt ist und tranβient stattfindet, d.h. die STS-Expression steigt relativ rasch auf ein Maximum an und klingt innerhalb von weniger als 48 h wieder ab (Hain et al. (1993) supra) . Ebenso zeigten Untersuchungen mit transgenen Tabakpflanzen, in denen STS-Gene unter dem konstitutiven 35S RNA Promoter von Cauliflower Mosaic Virus zur Expression gebracht wurden, daß die in diesen Pflan¬ zen erzielte Krankheitsresistenz geringer ist als in Pflanzen, die die gleichen Gene unter Kontrolle des Pathogen-induzier- baren homologen STS-Promoters nach Pilzbefall exprimierten (Fischer and Hain (1994) supra; Fischer (1994) supra) . In jedem Fall ist es wünschenswert, daß die STS-Expression in transgenen (Kultur)pflanzen, die aufgrund der eingebrachten STS-Gene eine erhöhte Krankheitsresistenz aufweisen, alleine (und erst) durch den Befall von Pathogenen und nicht zusätzlich (bzw. bereits vorher) durch unerwünschte UmweltStreßfaktoren, wie Ozon, akti¬ viert und kontrolliert werden.
Es ist somit eine wichtige Aufgabe der biotechnologischen Pflanzenschutzforschung, eine spezifischere Expression pflanz- licher Abwehrgene in Pflanzen zu realisieren, um auf diesem
Wege molekularbiologische Strategien zur Erzeugung widerstände- kräftigerer Pflanzen kontrollierbar und effizient umsetzen zu können. Ein wichtiger Aspekt hierbei ist das Ausschalten uner¬ wünschter unspezifischer Umweltstimuli, wie z.B. die Induktion bestimmter Abwehrgene durch Ozon, UV-Licht, Schwermetalle, ex¬ treme Temperaturen und andere abiotische Stimuli.
Es ist somit eine wichtige Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue DNA-Sequenzen bereitzustellen, die unmittelbar an der Ozon-induzierten Expression von Resistenzgenen beteiligt sind.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Möglichkeiten zur Beseitigung der Ozon-Induktion, d.h. zur Ausschaltung uner- wünβchter Stimulierung der Genexpression durch Ozon, aufzuzei¬ gen.
Desweiteren ist es eine wichtige Aufgabe der Erfindung, eine DNA-Sequenz zu liefern, mit deren Hilfe Stilbensynthasegene erst nach Kontakt der Pflanze mit einem Pathogen und nicht durch Ozon-Stimulierung in transgenen Pflanzen zur Expression gebracht werden können.
Wie eingangs bereits erwähnt wurde, ist eine stete Zunahme der Ozonbelastung zu beobachten, die auch drastische Einflüsse auf die Vegetation ausübt. Die Beobachtung und Bestimmung der Ozon¬ konzentrationen in der Luft stellen bereits heute einen Schwer¬ punkt der chemischen, physikalischen und biologischen Umwelt- forschung dar. In diesem Zusammenhang stellen sogenannte Bio¬ monitoren, mit deren Hilfe Ozonbelastungen und deren Folgen, besonders der phytotoxischen Effekte, qualitativ und quanti¬ tativ einfach zu bestimmen sind, ein wichtiges Instrument dar.
Somit liegt eine weitere Aufgabe der Erfindung in der Bereit¬ stellung von DNA-Sequenzen, die zur Erzeugung gezielt Ozon- induzierbarer Promotoren verwendet werden können. Mit Hilfe solcher Promotoren können sog. Reportergene, deren Expression durch einfache enzymatische Tests nachweisbar ist und die in der biotechnologischen Forschung wohlbekannt sind, auf sehr einfache und zuverlässige Weise als Biomonitoren Einsatz finden.
Weiter ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein System bereitzu- stellen, mit dessen Hilfe bestimmte Gene, deren Genprodukte in der Lage sind, in Zellen reaktive Sauerstoffspezies zu entgif¬ ten, im Bedarfsfall, also bei hoher Ozonbelastung, "angeschal¬ tet" werden können. Genauer gesagt, soll durch die Bereitstel¬ lung von DNA-Sequenzen, die für Ozon-responsive Genregulation verantwortlich sind, eine Ozon-induzierbare Expression solcher
Gene, wie z.B. Katalaβe- und/oder Superoxiddismutasegene, mög¬ lich werden. Somit ist es eine Aufgabe der Erfindung, DNA- Sequenzen bereitzustellen, die zur Erzeugung eines durch Ozon induzierbaren zellulären "Ozon-Schutzsystems" eingesetzt werden können. Weitere Aufgaben der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.
Diese Aufgaben werden durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche, insbesondere basierend auf der Bereitstellung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, die unmittelbar an Ozon¬ induzierter Genexpression in Pflanzen beteiligt sind, gelöst.
Wir haben überraschend gefunden, daß eine bestimmte pflanzliche Nukleinsäuresequenz unmittelbar an der Ozon-reβponsiven STS- Expression beteiligt ist. Während Experimente mit transgenen Tabakkeimlingen und -pflanzen, die das gebräuchliche Reporter¬ gen uidA aus E± coli. das für eine /3-Glucuronidaβe kodiert, unter Kontrolle verschieden langer 5' -Deletionen des Vstl- Promotors aus Weinrebe exprinderen, darauf hinweisen, daß zumindest einige für die Pilzinduktion verantwortliche cis- Elemente in dem Bereich des Promotors liegen, der die Basen¬ paare -140 bis -280 (vom Transkriptionsβtart aus gerechnet) umfaßt (Fischer (1994) supra) , ist der Bereich der Vstl- Sequenz, der die Basenpaare -280 bis -430 umfaßt, für eine starke Aktivierung der Genexpression durch Ozon essentiell. Aufgrund unsere Experimente konnte gezeigt werden, daß ein Vstl-Promotor, der nur noch die Basenpaare bis einschließlich -280 besitzt (und dem somit die weiter upstream liegenden Vstl- Promotorsequenzen fehlen) nicht mehr Ozon-induzibel ist. Wie oben erwähnt, ist dieser verkürzte Promotor aber trotzdem noch in der Lage, Pathogen-induzierte Genexpression der durch ihn kontrollierten kodierenden Sequenz zu vermitteln (siehe Fischer (1994) supra) .
Unsere Analysen lassen desweiteren einen Zusammenhang zwischen der Behandlung von Pflanzen mit Ozon und einer verstärkten Bio¬ synthese bzw. Freisetzung von Ethylen in den Pflanzenzellen vermuten. Demnach ist eine Mitwirkung Ethylen-responsiver Elemente bei der Ozon-induzierten Genexpression nicht auszu¬ schließen. Entsprechend kann unter Berücksichtigung bekannter cis-Elemente, die derzeit im Zusammenhang mit Ethylen-Responsi- vität diskutiert werden (Sesβa et al. (1995) Plant Mol. Biol. 28. 145-153; Shinshi et aJU (1995) Plant Mol. Biol. 27, 923- 932) , eine Beteiligung des Sequenzbereichs des Vstl-Promotorβ, der die Baβenpaare -283 bis -273 umfaßt, an einer Ozon¬ induzierten STS-Genexpression nicht ausgeschlossen werden.
Somit umfaßt der hier erstmals beschriebene Ozon-responsive DNA-Sequenzbereich die Basenpaare -270 bis -430 des Vstl- Promotors aus Weinrebe.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung die im Anspruch 1 definierte DNA-Sequenz (SEQ ID NO:l) :
ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCC ACTTGACTTT TGAAAAGGAG GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAA CCTTCGTAAT GTTAATGAAA TCAAAGTCAC TCAATGTCCG AATTTCAAAC CTCANCAACC CAATAGCCAA T, die für Ozon-induzierte Genexpression in Pflanzen essentiell ist. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz um eine DNA-Sequenz, die aus Weinrebe, und besonders bevorzugt aus dem Stilbenβynthase-Gen Vstl aus Weinrebe (Baβenpaare -270 bis -430), stammt.
Die Erfindung betrifft weiter eine Promotorregion des Vβtl- Genβ, der mindestens die DNA-Sequenz, die die Baβenpaare -270 bis -430 des Vstl-Gens umfaßt, fehlt. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um eine Promotorregion des Vstl-Gens, die nur den Sequenzbereich vom Translationsstart bis Basenpaar -270 des Vstl-Gens umfaßt. Besonders bevorzugt ist die Promotorregion, der der Sequenzbereich von -270 bis -430 des Vstl-Gens fehlt, in der Lage, eine pathogen-induzierbare Genexpression in Pflanzen zu vermitteln.
Weiter betrifft die Erfindung Chimäre Nukleinsäuremoleküle, in die die DNA-Sequenz der Baβenpaare -270 bis -430 des Vstl-Gens oder mindeβtenβ ein Fragment dieses Sequenzbereichs eingeführt wurde. Besonders bevorzugt ermöglichen die Chimären Nuklein- βäuremoleküle der Erfindung aufgrund der Anwesenheit der DNA- Sequenz der Baβenpaare -270 bis -430 des Vstl-Gens oder mindes¬ tens eines Teilbereiches davon eine ozon-induzierbare Expres¬ sion der in ihnen enthaltenen kodierenden Regionen in Pflanzen. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können beliebige Nukleinsäuremoleküle sein, insbesondere DNA- oder RNA-Moleküle, beispielsweise cDNA, genomische DNA, mRNA etc. Sie können natürlich vorkommende oder durch gentechnische oder chemische Syntheseverfahren hergestellte Moleküle sein.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, Promotorregionen, Nukleinsäuremoleküle oder Vektoren besteht nun die Möglichkeit, pflanzliche Zellen mittels gentechnolo- gischer Methoden dahingehend zu verändern, daß sie eine ozon- induzierbare Merkmalsausprägung aufweisen. Weiter besteht nun die Möglichkeit, pflanzliche Zellen mittels gentechnologischer Methoden dahingehend zu verändern, daß sie ein oder mehrere Gene, die natürlicherweise aufgrund der Anwesenheit der DNA- Sequenz gemäß Anspruch 1 oder einer davon ableitbaren oder einer mit ihr homologen DNA-Sequenz Ozon-induzierbar ist, nicht mehr durch Ozon induzierbar, bevorzugt im wesentlichen durch Pathogene induzierbar, ausprägen.
Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß die
Ozon-Induktion von natürlicherweise Ozon-induzierbaren Genen in Pflanzen und Pflanzenzellen durch Deletion der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder mindestens eines Fragments davon in den Genen, die diese DNA-Sequenz oder eine davon ableitbare oder eine mit ihr homologe DNA-Sequenz natürlicherweise enthalten, ausgeschaltet werden kann.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß natür¬ licherweise nicht oder nicht wesentlich durch Ozon induzierbare Gene unter Verwendung der erfindungβgemäßen Nukleinsäuresequen- zen in Pflanzen und Pflanzenzellen Ozon-induzierbar ausgeprägt werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform kontrol¬ liert die Nukleinβäureβequenz, die für die Ozon-induzierbare Expression verantwortlich ist, oder mindestens ein Fragment davon, die Expression von Genen, deren Genprodukte in der Lage sind, reaktive Sauerstoffspezies, die u. a. als Folge von Ozon in Pflanzenzellen entstehen können, zu entgiften. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kontrolliert diese Nukleinsäuresequenz die Expression von Katalase- und/oder Superoxiddismutase-Genen.
In einer alternativen Aueführungsform kontrolliert die für die Ozon-induzierbare Genexpression verantwortliche DNA-Sequenz die Expression von Reportergene, die zur quantiativen und/oder qualitativen Bestimmung von Ozonkonzentrationen und zur Bewer¬ tung von Ozonauβwirkungen, gemessen wird. Solche Reportergene können z.B. das uidA-Gen aus E^. coli, das für das Enzym ß- Glucuronidase (GUS) kodiert, Luciferase-Gene oder andere in der pflanzlichen Biotechnologie gebräuchliche Gene sein. Geeignete Reportergene sind jedem in dem Gebiet der Biotechnologie, Biochemie oder Molekularbiologie ausgebildeten Fachmann bekannt.
Weiter betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren, welche die oben genannten DNA-Sequenzen oder Promotorregionen oder Teile davon enthalten. Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bakteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten und gegebenfalls für den Transfer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle auf Pflanzen bzw. Pflanzenzellen einge¬ setzt werden können.
Ebenso betrifft die Erfindung transformierte Mikroorganismen, wie Bakterien, Viren, Filze, die die erfindungβgemäßen Nuklein- säurββequenzen enthalten.
Es ist ebenso eine Aufgabe der Erfindung, neue Pflanzen und Pflanzenzellen bereitzustellen, die sich durch das Fehlen der Ozon-induzierbaren Expression von Genen, die natürlicherweise in Pflanzen durch Ozon induziert werden, auszeichnen.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der für die Ozon- Induktion verantwortlichen DNA-Sequenz und die Bereitstellung von Promotoren, denen diese Sequenz fehlt und die aus diesem Grund eine nicht mehr durch Ozon-induzierbare Genexpression der durch sie kontrollierten Gene in Pflanzen und pflanzlichen Zellen ermöglichen, gelöst.
Die Aufgabe, Ozon-responsive Genexpression von Genen, die natürlicherweise nicht durch Ozon induzierbar sind, zu ermög¬ lichen, wird ebenfalls durch Bereitstellung der erfindungsge¬ mäßen DNA-Sequenz gelöst. Dadurch werden Pflanzen und Pflanzen¬ zellen bereitgestellt, die gezielt bei Ozon-Anwesenheit bestimmte Merkmale ausprägen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es eich um transformierte Pflanzen und Pflanzenzellen, in denen Gene Ozon¬ induzierbar exprimiert werden, deren Genprodukte in der Lage, sind reaktive Sauerstoffspezies in Pflanzenzellen zu entgiften. Besonders bevorzugt handelt es sich hierbei um Katalase- und/oder Superoxiddiβmutaβe-Gene. Alternativ können Pflanzen und Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) erzeugt werden, die sog. Reportergene nach Induktion durch Ozon auβprägen und die ggf. als Biomonitoren eingesetzt werden können.
Gegenstand der Erfindung sind somit transgene Pflanzen, die die oben beschriebenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle, inte¬ griert in das pflanzliche Genom vorliegend, enthalten. Bei diesen Pflanzen kann es sich im Prinzip um jede beliebige Pflanze handeln. Vorzugsweise ist es eine monokotyle oder dikotyle Nutzpflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind die Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer) , Triticum (Weizen) , Seeale (Roggen) , Hordeum (Gerste) , Oryza (Reis) , Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) gehören. Bei den dicotylen Nutzpflanzen sind u.a. zu nennen Baumwolle, Leguminosen, wie Hülsenfrüchte und inβgesondere Alfalfa, Sojabohne, Raps, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Zierpflanzen, Bäume. Weitere Nutzpflanzen können Obst (inβbe- sondere Äpfel, Birnen, Kirschen, Weintrauben, Citrus, Ananas und Bananen), Ölpalmen, Tee-, Kakao- und Kaffeesträucher, Tabak, Sisal sowie bei Heilpflanzen Rauwolfia und Digitalis sein. Besonders bevorzugt sind die Getreide Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Reis, Mais und Hirse, Zuckerrübe, Raps, Soja, Tomate, Kartoffel und Tabak.
Gegenstand der Erfindung ist ferner Vermehrungβmaterial von erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Samen, Früchte, Stecklinge, Knollen, Wurzelstöcke etc., sowie Teile dieser Pflanzen wie Pflanzenzellen, Protoplasten und Kalli.
Die Pflanzenzellen umfassen differenzierte und undifferenzierte Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) , sowie
Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) , in denen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle integriert in das pflanzliche Genom oder als autonome Moleküle (einschließlich transiente Transformation) vorliegen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirts¬ zellen, insbesondere prokaryontische und eukaryσntische Zellen, die mit einem oben beschriebenen rekombinanten Nukleinsäure- molekül oder einem Vektor transformiert bzw. infiziert wurden, und Zellen, die von derartigen Wirtszellen abstammen und die beschriebenen Nukleinsäuremoleküle oder Vektoren enthalten. Die Wirtszellen können Bakterien oder Pilzzellen sowie pflanzliche oder tierische Zellen sein.
Der vorliegenden Erfindung liegt außerdem die Aufgabe zugrunde,
Verfahren zur Herstellung von Pflanzen und Pflanzenzellen aufzuzeigen, die sich durch Fehlen einer Ozon-induzierbaren Expression eines Gens, dessen Expreββion in Pflanzen und Pflanzenzellen natürlicherweise durch Ozon stimuliert wird, auszeichnen.
Diese Aufgabe wird durch Verfahren gelöst, mit deren Hilfe die Erzeugung neuer Pflanzen und Pflanzenzellen, die diese natürlicherweise vorkommende Ozon-induzierte Genexpression nicht aufweisen, möglich ist.
Der vorliegenden Erfindung liegt, wie oben bereits erwähnt, ebenfalls die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Herstellung von Pflanzen und Pflanzenzellen, die solche Gene, deren Expreββion natürlicherweise nicht oder nicht wesentlich durch Ozon aktiviert wird, nach Ozon-Stimulierung exprimieren, bereitzu¬ stellen. Diese Aufgabe wird durch Verfahren gelöst, mit deren Hilfe Pflanzen und Pflanzenzellen erzeugt werden können, die nach Einführung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder mindestens eines Teilbereiches davon in natürlicherweise nicht oder nur schwach ozoninduzierbare Gene diese Gene nach Ozon- Stimulierung exprimieren.
Zur Erzeugung solcher neuer Pflanzen bzw. Pflanzenzellen bieten sich verschiedene Methoden an. Zum einen können Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit Hilfe herkömmlicher gentechnologiβcher Transformationsmethoden derart verändert werden, daß die neuen Nukleinsäuremoleküle in das pflanzliche Genom integriert werden, d.h. daß stabile Transformanten erzeugt werden.
Erfindungsgemäß werden Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die aufgrund des Fehlens der erfindungsgemäßen Nukleinsäureβequenz oder mindestens eines Fragmentes davon eine Ozoninduktion des/der diese Sequenz natürlicherweise enthaltenden Gens/e nicht mehr zeigen, durch ein Verfahren hergestellt, das folgende Schritte umfaßt: a) Deletion der im Anspruch 1 definierten DNA-Sequenz bzw. einer Sequenz, die sich von dieser Sequenz ableiten läßt oder die mit dieser Sequenz homolog ist, oder mindestens eines Fragments dieser Sequenz aus einem Gen, das nach der Deletion der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz Regula¬ tionselemente, die für die, ggf. regulierte, Transkrip¬ tion und Translation in Pflanzenzellen unentbehrlich sind, mindestens eine kodierende Sequenz, sowie ggf. ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entβprechende Transkript umfaßt; b) Transformation pflanzlicher Zellen mit dem in Schritt a) hergestellten Gen bzw. Nukleinsäuremolekül, und c) ggf. die Regeneration transgener Pflanzen und ggf. die Vermehrung der Pflanzen. Alternativ kann in Schritt a) anstelle des Deletierenβ der für die Ozon-Induktion verantwortlichen Sequenz, diese Sequenz oder zumindest ein Teil davon, z.B. durch Mutageneβe, inaktiviert bzw. blockiert werden und in inaktivierter Form in dem Gen verbleiben. Unabhängig davon, auf welche Weise der Ozon- reβponβive Genbereich ausgeschaltet wird, können alle Manipulationsmaßnahmen mit Hilfe allgemein üblicher Methoden und Hilfsmittel der rekombinanten Gentechnik durchgeführt werden (βiehe z.B. Sambrook et. al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) .
In einer beβonderβ bevorzugten Ausführungsform enthält das Nukleinsäuremolekül, das in Schritt b) auf Pflanzen bzw. Pflanzenzellen übertragen wird, Regulationβelemente, die eine z.B. Pathogen-induzierte Genexpression der kodierenden Sequenz ermöglichen.
Erfindungsgemäß werden Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die aufgrund der Anwesenheit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure- sequenz, die für eine Ozon-induzierte Expression der sie enthaltenden Gene essentiell bzw. mitverantwortlich ist, oder mindestens eines Fragmentes dieser Sequenz, durch ein Verfahren hergestellt, das folgende Schritte umfaßt: a) Einfügung mindestens einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz, die in Pflanzen eine Ozon-induzierte Genexpression bewirken kann, oder einer Sequenz, die sich von dieser Sequenz ableiten läßt oder die mit dieser Sequenz homolog ist, oder mindestens eines Fragments dieser Sequenz in ein Gen, das natürlicherweise nicht oder nicht wesentlich Ozon-induzierbar exprimiert wird b) Transformation pflanzlicher Zellen mit dem in Schritt a) hergestellten Gen bzw. Nukleinsäuremolekül, das über sämtliche natürlicherweise für die Expression in Pflanzenzellen erforderlichen Elemente verfügt, und c) ggf. die Regeneration transgener Pflanzen und ggf. die Vermehrung der Pflanzen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es eich bei dem Gen um ein Katalaβe-, Superoxiddismutase- oder ein gebräuch¬ liches Reportergen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, vorteilhafte Verwendungen der erfindungβgemäßen Nukleinβäuresequenzen aufzuzeigen.
Die Erfindung umfaßt daher Verwendungen der neuen DNA-Moleküle zur Erzeugung der oben beβchriebenen erfindungβgemäßen Pflanzen und Pflanzenzellen, die eich entweder durch daβ Fehlen einer normalerweise durch Ozon beeinflußten Ausprägung eines bestimmten phänotypischen Merkmals auszeichnen, oder die gerade aufgrund der Anwesenheit der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz durch Ozon-induzierte Merkmalsäusprägung von nicht-transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen unterscheiden, gelöst.
Deβweiteren umfaßt die Erfindung die Verwendung der erfindungβ¬ gemäßen Nukleinsäuremolelüle zur Erzeugung von Pflanzen, die sich durch eine erhöhte pathogeninduzierte, aber nicht-ozonin¬ duzierte Krankheitsreβistenz auszeichnen.
Desweiteren betrifft die Erfindung die Verwendung der erfin¬ dungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder Fragmenten davon zur Auffindung und Identifizierung von Ozon-responβiven Nuklein- βäureelementen.
Solche Ozon-responsiven Nukleinsäurelemente kann der Fachmann mit Hilfe gängiger molekularbiologischer Methoden, z.B. Hybri- diβierungsexperimenten oder DNA-Protein-Bindungββtudien identi¬ fizierten. Dabei wird z.B. in einem ersten Schritt auβ einem Gewebe, welches mit Ozon behandelt wurde, die poly(A)* RNA isoliert und eine cDNA-Bank angelegt. In einem zweiten Schritt werden mit Hilfe von cDNA-Klonen, die auf poly(A)* RNA-Molekü- len aus einem nicht-behandelten Gewebe baβieren, auβ der erβten Bank mittels Hybridisierung diejenigen Klone identifiziert, deren korrespondierende poly(A)* RNA-Moleküle lediglich bei Ozonbehandlung induziert werden. Anschließend werden mit Hilfe dieser so identifizierten cDNAβ Promotoren isoliert, die über Ozon-reβponβive Elemente verfügen. Bei der Untersuchung und Charakterisierung dieser isolierten Promotoren können die Nukleinsäureβequenzen und -moleküle nützliche Instrumente darstellen.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Nukleinsäuremoleküle oder Fragmente davon, die mit einem der oben beβchriebenen Nukleinsäuremoleküle oder einer der oben beschriebenen DNA- Sequenzen der Erfindung hybridisieren. Der Begriff "Hybridi- sierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridi¬ sierung unter konventionellen Hybridisierungβbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie βie beispiels¬ weise in Sambrook e_t al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben sind.
Nukleinsäuremoleküle, die mit den erfindungβgemäßen Molekülen hybridisieren, können z.B. auβ genomischen oder aus cDNA- Bibliotheken isoliert werden.
Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nukleinsäure¬ moleküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reverβen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, z.B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z.B. Sambrook et al, supra) .
Somit betrifft die Erfindung ebenfalls die Verwendung einer erfindungβgemäßen DNA-Sequenz oder von Teilen davon zur Identi- fizierung und Isolierung homologer Sequenzen aus Pflanzen oder anderen Organismen.
Als Hybridiβierungββonde können z.B. Nukleinsäuremoleküle ver¬ wendet werden, die exakt oder im wesentlichen die erfindungs- gemäßen Nukleotidsequenzen oder Teile dieser Sequenzen auf¬ weisen. Bei den alβ Hybridiβierungβsonde verwendeten Fragmenten kann eβ eich auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen Syntheβetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der eines erfindungβgemäßen Nukleinsäuremoleküle übereinstimmt. Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den erfindungβgemäßen Nukleinsäure- βequenzen hybridisieren, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften erforderlich. Hierzu stehen dem Fachmann eine Reihe von molekularbiσlogiβchen, biochemiβchen und biotechnologiβchen Standardverfahren zur Verfügung.
Die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen hybridi¬ sierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beβchriebenen DNA-Moleküle, die eine Ozon-reβponβive Sequenz, in aktiver oder inaktivierter Form, enthalten oder die sich gerade dadurch auszeichnen, daß sie diese Sequenz nicht mehr aufweisen. Der Ausdruck "Derivat" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der oben beschriebenen Nuklein¬ säuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufwei¬ sen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindes¬ tens 40%, insbeβondere eine Identität von mindestens 60%, vorzugsweise über 80% und besondere bevorzugt über 90%. Die Abweichungen zu den oben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen können dabei durch Deletion, Addition, Substitution, Insertion oder Rekombination entβtanden sein.
Bei den Nukleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben beschriebenen Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle dar¬ stellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Moleküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biolo¬ gische Funktion ausüben. Es kann sich dabei βowohl um natür- licherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen auβ anderen Organiβmen, oder um Mutationen, wobei diese Modifikationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den alleliβchen Varianten kann es eich sowohl um natürlich auftretende alβ auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten handeln. Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungs- vektoren zur Verfügung, die ein Replikationββignal für JL. coli und ein Markergen zur Selektion tranβformierter Baktβrienzellen enthalten. Beiβpiele für derartige Vektoren βind pBR322, pUC- Serien, M13mp-Serien, pACYC184 uβw. Die gewünβchte Sequenz kann an einer passenden Restriktionββchnittβtelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plaβmid wird für die Tranβfor- mation von Ej_ coli.-Zellen verwendet. Tranβformierte E_j. coli- Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lyβiert. Das Plasmid wird wieder¬ gewonnen. Alβ Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionβ- analyβen, Gelelektrophoreβen und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipu¬ lation können die Plaβmid-DNA geβpalten und gewonnene DNA- Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtβzelle βtehen eine Vielzahl bekannter Techniken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierigkeiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Aqro- bacterium tumefaciens oder Aαrobacterium rhizoqeneβ alβ Transformationβmittel, die Fusion von Protoplaβten, den direkten Gentransfer iβolierter DNA in Protoplaβten, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten. Dabei können sowohl stabile als auch tranβiente Transformanten erzeugt werden.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per βe keine βpeziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentranβfer. Es können einfache Plaβmide wie z.B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eineβ selek- tierbaren Markergenβ notwendig. Dem Fachmann βind die gängigen Selektionβmarker bekannt und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen. Gebräuchliche Selek- tionβmarker βind βolche, die den tranβformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonyl-Harnetoff, Gentamycin oder Phoβphinotricin u.a. vermitteln.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzen¬ zelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich βein. Werden z.B. für die Tranβformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri- Plaβmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- und Ri-Plaβmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den ein¬ zuführenden Genen verbunden werden.
Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären
Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequen¬ zen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plaβmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helfer- plasmids kann der intermediäre Vektor auf Aqrobacterium tumefacienβ übertragen werden (Konjugation) . Binäre Vektoren können βowohl in E_^ coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder
Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al (1978) Molecular and General Genetics 163, 181-187) . Das alβ Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Reqion trägt, enthalten. Die vor-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Daβ derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transfor¬ mation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Tranβformation von Pflanzen¬ zellen iβt intenβiv unterβucht und ausreichend in EP 120 515; Hoekema in: The Binary Plant Vector System, Offsetdrokkerij Kanterβ B.V., Alblaββerdam (1985) Chapter V; Fraley et al (1993) Crit. Rev. Plant. Sei., 4, 1-46 und An et al (1985) EMBO J. 4, 277-287 beβchrieben worden.
Für den Tranβfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen- Explantate zweckmäßigerweiβe mit Aqrobacterium turnefacienβ oder Aqrobacterium rhizoqeneβ kultiviert werden. Auβ dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattetücke, Stengelβegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspenβionβ-kultivierte Pflanzen¬ zellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Anti¬ biotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen ent- halten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die
Regeneration der Pflanzen erfolgt nach üblichen Regenerations- methoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die βo erhal¬ tenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA unterβucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung deβ bioliβtiβchen
Verfahrens oder durch Protoplasten-Transformation βind bekannt (vgl. z.B. Willmitzer L. (1993) Transgenic Plante, in: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatiβe (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, edβ.) Vol. 2, 627-659, V.C.H. Weinheim - New York - Baβel - Cambridge).
Während die Tranβformation dikotyler Pflanzen bzw. deren Zellen über Ti-Plaβmid-Vektorsysteme mit Hilfe von Aqrobacterium tumefaclens wohl etabliert iβt, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen bzw. deren Zellen der
Transformation mittels Aqrobacterium-baβierender Vektoren sehr wohl zugänglich βind (Chan et al (1993) Plant Mol. Biol. 22, 491-506; Hiei et al (1994) Plant J. 6, 271-282; Deng et al (1990) Science in China 3_3, 28-34; Wilmink et al (1992) Plant Cell Reports 11, 76-80; May et al (1995) Bio/Technology 12,
486-492; Conner und Domiss (1992) Int. J. Plant Sei. 153, 550- 555; Ritchie et al (1993) Transgenic Res. 2, 252-265). Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen bzw. deren Zellen sind die Transformationen mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux (1994) Plant Physiol. 104. 37-48; Vaβil et al (1993) Bio/Technology 11, 1553-1558; Ritala et al (1994) Plant Mol. Biol. 2_4, 317-325; Spencer et al (1990) Theor. Appl. Genet. 79_, 625-631), die Protoplasten- Tranβformation, die Elektroporation von partiell peπneabilisierten Zellen, die Einbringung von DNA mittela Glaβfaβern.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al (1986) Plant Cell Reports 5, 81-84) . Die reβultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transfor- mierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phanotypische Merkmal stabil beibehal¬ ten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.
Ebenso können nach üblichen Methoden transgene Linien bestimmt werden, die für die neuen Nukleinsäuremoleküle homozygot sind und ihr phänotypisches Verhalten hinsichtlich einer vorhandenen bzw. nicht vorhandenen Ozon-Responβivität untersucht und mit dem von hemizygoten Linien verglichen werden.
Selbstverständlich können Pflanzenzellen, die die erfindungs¬ gemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten, auch als Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten, Kalli, Suspensionskulturen u.a.) weiterkultiviert werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieβer Moleküle zur Identifizierung und Isolierung homologer Moleküle, die Ozon-reβponβive Elemente umfassen aus Pflanzen oder anderen Organismen. Für die Definition des Begriffes "Homologie" siehe oben.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
BEISPIELE
Beispiel 1:
Konstruktion der 5' -Deletionen des Vstl-Promotors als GUS- Fusionβkonβtrukte in dem binären Vektor pPCV002
Der im folgenden alβ Promotor bezeichnete 5' -nicht-kodierende Sequenzbereich deβ Vstl-Gens aus Weinrebe besteht aus 1570 Baβenpaaren. Dieser Promotor, dessen Sequenz u.a. auβ der deutschen DE 41 07 396 und Fischer (1994) supra bekannt iβt, wurde mit Hilfe einer herkömmlichen Polymeraβe-Ketten-Reaktion unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide alβ Primer und dem das vollständige Vstl-Gen enthaltende Plaβmid pVβtl (DE-A- 41 07 396; Fischer (1994) supra) als Template amplifiziert:
5'- CCCCAAGCTT CCCCGGATCA CATTTCTATG AGT -3' (Primer 1, SEQ ID NO: 2)
5'- CGCGGATCCT CAATTGAAGC CATTGATCCT AGCT -3' (Primer 2, SEQ ID NO: 3) .
Die PCR-Reaktion wurde nach dem Protokoll von Perkin Eimer (Norwalk, USA) unter Verwendung der Nativen Taq DNA Polymerase von Perkin Eimer durchgeführt. Das unter üblichen PCR-Bedingun- gen amplifizierte DNA-Fragment wurde anβchließend mit den Restriktionsenzymen HindiII (dieβe Reβtriktionββchnittβteile ist am 5' -Ende von Primer 1 enthalten) und BamHI (dieβe Reβtriktionsschnittstelle iβt am 5' -Ende von Primer 2 enthal¬ ten) nachgeschnitten und zusammen mit dem BamHI/EcoRI-Fragment auβ dem Vektor pBI101.2 (Jefferβon (1987) Plant Mol. Biol. Reporter 5_, 387-405) , welcheβ das /8-Glucuronidase-Reportergen (GUS, uidA) auβ E_j. coli zusammen mit dem TerminationsSignal deβ nos-Gens aus A. turnefacJens enthält, über die Hindlll- und EcoRI-Reβtriktionββchnittβteilen des pUClβ-Polylinker in daβ pUClβ-Plaβmid (Yaniβch-Perron et aJU (1985) Gene 33., 103-119; erhältlich z.B. von Boehringer Mannheim) βubkloniert. Sämtliche Klonierungsβchritte wurden unter Verwendung gängiger molekular¬ biologischer Techniken und Hilfsmittel durchgeführt (z.B. Sambrook ejt al. (1989) supra) ; Reβtriktionβenzyme und andere für die Klonierungen eingesetzte Enzyme wurden von Boehringer Mannheim bezogen. Der resultierende pUC-Klon (pUC-Vβtl/GUS) enthält somit eine Translationsfusion deβ Vβtl-Promotorβ mit dem GUS-Gen, in der die erβten fünf STS-Codons im Leserahmen über eine BamHI-Schnittsteile mit dem GUS-Gen verbunden sind. Der Sequenzbereich deβ Fusionsübergangs sowie die Sequenz deβ Vβtl-Promotorβ wurden mit Hilfe der enzymatiβchen Kettenab¬ bruch-Methode (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467) unter Verwendung deβ T7-Sequencing-Kit von Pharmacia (Freiburg) auf ihre Richtigkeit überprüft. Die Klonierung der 5' -Deletionsmutanten in dem binären Vektor pPCV002 (Koncz and Schell (1986) Mol. Gen. Genet. 204, 383-396) wird im folgenden erläutert. Dabei wurden in den meiβten Fällen pUC18-Subklone alβ Zwischenvektoren verwendet, da daβ kleinere pUC-Plaβmid im Vergleich zu den relativ großen binären Vektoren leichter zu handhaben ist.
Die Plaβmidbezeichnungen ergeben eich aus der ungefähren Länge des jeweiligen Promotorfragments, gerechnet vom Tranβkriptions- βtart, der eich 73 Basenpaare entfernt vom Startkodon befindet (Hain et al. (1993) supra; Fischer (1994) supra) . Die für die schrittweiβe Verkürzung deβ Vβtl-Promotor verwendeten Reβtrik- tionsschnittstellen sind auch in Abbildung 1 Schematisch ange¬ geben.
- pl500GUS: Daβ Hindlll/EcoRI-Fragment, daβ den vollständigen STS-Promotor zusammen mit dem GUS-Gen enthält, wurde aus dem oben beschriebenen Plasmid pUC-Vstl/GUS isoliert und zwischen die Restriktionsschnittstellen Hindlll und EcoRI in den Polylinker von pPCV002 eingefügt. - pl060GUS: Ein 1130 Bp-Promotorfragment wurde über die Restriktionsschnittstellen BamHI und Sspl auβ pUC-Vβtl/GUS iβoliert und in BamHI/HincII-linearisierten pUClβ kloniert (-> pUC1130) . Anschließend wurde daβ GUS-Gen alβ BamHI/EcoRI- Fragment auβ pUC-Vβtl/GUS iβoliert und zwiβchen die BamHI- und die EcoRI-Schnittstelle von pUC1130 kloniert. Schließlich wurde die Fusion über einen HindiII/EcoRI-Doppelverdau iβoliert und über die gleichen Schnittβtellen in den Polylinker von pPCV002 eingefügt. - p930GTJS: Das 1,0 kb-Promotorfragment wurde über die
Restriktionβenzyme BamHI und HincII aus pUC-Vstl/GUS isoliert und über die gleichen Restriktionsschnittstellen in den Polylinker von pUClβ eingefügt (-> pUClOOO) . Danach erfolgte die Klonierung analog zu pl060GUS. - p740GUS: Daβ ca. 1,6 kb lange H^dlll/BamHI-Promotorfragment wurde aus dem Plasmid pUC-Vβtl/GUS iβoliert und mit dem Reβtriktionβenzym Dral verdaut. Das reβultierende 810 Bp. lange BamHI/Dral-Fragment wurde anschließend über die Restriktionβ- schnittβtellen BamHI und HincII in pUClθ kloniert (-> pUC810) . Anschließend wurde daβ GUS-Gen alβ BamHI/EcoRI- Fragment auβ pUC-Vβtl/GUS iβoliert und zwiβchen die BamHI- und die EcoRI- Schnittstelle von pUC810 kloniert. Schließlich wurde die Fusion über einen Hindlll/EcoRI-Doppelverdau iβoliert und über die gleichen Schnittβtellen in den Polylinker von pPCV002 eingefügt.
- p550QUS: pUC-Vβtl/GUS wurde mit dem Reβtriktionβenzym AfIII verdaut und die überhängenden 5' -Enden mit Klenow-Enzym (von Boehringer Mannheim; dNTPs ebenfalls von Boehringer Mannheim) nach Herβtellerangaben aufgefüllt. Anschließend wurde mit dem Reβtriktionβenzym BamHI nachgeschnitten und daβ entstandene 620 Bp-Promotorfragment in BamHI/HincII-lineariβierten pUClβ ligiert (-> pUC620) . Danach wurde die Klonierung wie u.a. für pl060GUS fortgeführt.
- p500GUS: Ein 570 Bp. langeβ Promotorfragment wurde über einen BamHI/HaelII-Doppelverdau auβ pUC-Vβtl/GUS iβoliert und in
BamHI/HincII-linearisierten pUC19-Vektor ligiert (-> pUC570) . Danach erfolgte die weitere Klonierung wie zur Herstellung von u.a. pl060GUS. - p430GUS: Daβ oben beβchriebene Plaβmid pUClOOO wurde unter Verwendung des Restriktionβenzyms SnaBI linearisiert und mit HincII nachverdaut. Anschließend wurde der linearisierte Vektor religiert, wodurch die 500 Baβenpaare deβ Promotorβ zwischen -930 und -430 deletiert wurden (-> pUC500) . Die weitere Klonierung verlief wie für pUC1060GUS.
- p280GTJS: pUC-Vstl/GUS wurde mit dem Restriktionsenzym Banll verdaut, die überhängenden Enden mit Klenow-Enzym aufgefüllt und der linearisierte Vektor mit dem Restriktionβenzym BamHI nachverdaut. Nach der Isolierung deβ 350 Bp. langen blunt end/BamHI-Promotorfraqmenteβ wurde die Klonierung in Analogie zu pl060GUS fortgeführt.
- pl40GUS: Der oben beβchriebene pUC-Subklon pUC620 wurde mit den Restriktionsenzymen Neil und Pβtl verdaut und der linearisierte Vektor anschließend gereinigt und religiert. Dies resultierte in der Deletion der PromotorSequenzen von -550 bis -140 (-> pUC210) . Anβchließend wurde daβ GUS-Gen als BamHI/EcoRI- Fragment aus pUC-Vβtl/GUS iβoliert und zwiβchen die BamHI- und die EcoRI-Schnitteteile von pUC1130 kloniert. Schließlich wurde die Fuβion über einen Hindlll/EeoRI-
Doppelverdau iβoliert und über die gleichen Schnittβtellen in den Polylinker von pPCV002 eingefügt.
- p40GUS: Daβ 110 Bp-Promotorfragment wurde zusammen mit dem GUS-Gen durch einen Nhel/EcoRI-Doppelverdau auβ pUC-Vstl/GUS isoliert und das Fragment anschließend in Xbal/EcoRI- lineariβierten pPCV002 kloniert.
- pΔGUS: Daβ Konstrukt pl500GUS wurde mit dem Restriktionβenzym BamHI verdaut und der gereinigt Vektor anβchließend religiert. Durch die BamHI-Schnitteteile, die der Vektor pPCV002 natürlicherweise in seiner multiplen Klonierungββtelle neben der Hindlll-Schnitteteile enthält (Koncz and Schell (1986) βupra) wurde auf dieβe Weiβe daβ gesamte Promotorfragmant eliminiert.
- p35SGUS: Die Fuβion deβ 35S RNA Promotors aus Cauliflower Mosaic Virus mit dem GUS-Gen, die als positive Kontrolle diente, wurde als Hindlll-Fragment aus dem Expressionsvektor pRT99GUS (Töpfer jet al. (1988) Nucleic Acids Research 16., 8725) isoliert und in die multiple Klonierungsstelle von pPCV002 eingefügt. Beiβpiel 2 :
Pflanzenmaterial, Pflanzentransfoπnation und Regeneration 5 transgener Pflanzen
NicotJana tabacum cv. Petit Havana SRI (Maliga et al. (1973) Nature New Biol. 244, 29-30) wurde alβ sterile Sproßkultur auf hormonfreiem 1/2 LS-Medium (Linβmaier and Skoog (1965) Physiol.
10 Plant i8_, 100-127) mit 1% Saccharose bei 26°C, 3000 Lux und einer 16-βtündigen Photoperiode kultiviert. In Abβtänden von 6-8 Wochen wurden Sproßabschnitte auf frischeβ LS-Medium umge¬ setzt. Für die Tranβformation von Blattβcheiben mit Aqrobac- terium tumefaciens (Horβch et al. (1985) Science 227. 1229-
15 1231) wurden 2-3 cm lange Blätter von βterilen Sproßkulturen in Scheiben von 1 cm Durchmesser gestanzt und mit einer Suspenβion von Agrobakterien (ca. 109 Zellen/ml YEB-Medium) , die eineβ der oben genannten Plaβmidkonβtrukte enthielten, für 5 min. inku¬ biert. Die infizierten Blattstücke wurden auf hormonfreies LS-
20 Medium für 2-3 Tage bei 26°C gehalten. Während dieser Zeit überwuchsen die Bakterien die Blattsegmente, die anschließend in flüssigem LS-Medium ohne Hormone gewaschen und auf LS-Medium mit Kanamycin (75 μg/ml; Sigma, München) , Cefotaxim (500 μl/ml; Hoechst, Frankfurt) und Benzylaminopurin (BAP, 0,5 mg/1;
25 Duchefa, Haarlem, Niederlande) gelegt wurden. Nach 2-3 Wochen waren transformierte Sprosse sichtbar, die auf hormonfreiem LS- Medium mit 75 μg/ml Kanamycin und 100 μg/ml Cefotaxim bewurzelt wurden.
30 Die für die Transformation der Tabakblattstücke eingesetzten Agrobakterienkulturen wurden wie folgt hergestellt. Zunächst wurden die oben beβchriebenen pPCVO02-Derivate in den E^. coli Mobiliβierungββtamm S17-1 (Simon et al. (1983) Bio/Technology 1, 784-790) eingebracht. Dabei erfolgten die Herstellung
35 kompetenter S17-1 E^. coli-Zellen sowie die Transformation der kompetenten Zellen mit den entsprechenden Plasmiden nach Taketo (1988) Biochem. Biophys. Acta 941, 318-324 bzw. Hanahan (1983) J. Mol. Biol. 166. 557-580. Anβchließend wurden der E_j_ coli- Stamm S17-1, den jeweiligen binären Vektor enthaltend, und der Aqrobacterium turnefacJens-Stamm GV3101 C58C1 Rifr pMP90RK (Koncz and Schell (1986) supra) in entsprechenden Medien bis zur OD5β0 = 1,0 angezüchtet. Für die Anzucht der E± coli- Bakterien wurde herkömmlicheβ YT-Medium (Miller (1972) Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Bacto-Tryptone 0,8% (w/v) , Yeaβt-Extract 0,5% (w/v) , NaCl 0,5% (w/v) , pH 7,0) bei 37 °C und für die Anzucht der A^. tumefaciens-Bakterien wurde YEB-Medium (Beef-Extract 0,5% (w/v), Yeast-Extract 0,1% (w/v), Bacto-Peptone 0,5% (w/v), Saccharose 0,5% (w/v), MgS04 2 mM, pH 7,2) bei 28 °C eingesetzt. Für die anschließende Konjugation wurden die Bakterien bei 1500 x g für 5 min. abzentrifugiert und zweimal in frisch angesetzter 10 mM MgS04- Löβung gewaβchen. Anβchließend wurden Donor (E^. coli) und Akzeptor (Aj. tumefaciens) im Verhältnis 1:1 gemischt und auf eine YEB-Agarplatte getropft. Nach 16-stündiger Inkubation bei 28 °C wurde der Bakterientropfen mit 10 mM MgS04-Lösung abgespült und 10'2-, 103- und 10*-Verdünnungen auf YEB- Selektionβplatten auβplattiert. Auβ einer Einzelkultur wurde bei 28 °C eine für die Tranβformation von N^. tabacum verwendete Agrobakterienkultur gezüchtet.
Die tranβgenen Tabaksprosβe, die jeweils eine der oben beβchriebenen Vstl-Promotor/GUS-Fusionen enthielten, wurden βteril über Sproßkultur vermehrt, teilweiβe in Erde überführt und im Gewächshaus unter normalen Bedingungen (22 °C, 60% relative Luftfeuchtigkeit, ca. 15.000 Lux) bis zur Blüte kultiviert. Die Blüten wurden durch Pergamenttüten vor Fremd¬ bestäubung geschützt und reife Samenkapseln mit Samen der Fl- Generation nach 4-6 Wochen geerntet. Für biologische Teβts im Gewächshaus wurde der Samen der Fl-Generation auf LS-Medium mit 75 μg/ml Kanamycin ausgelegt. Dies erfolgte unter sterilen Bedingungen direkt aus der Kapsel oder nach Oberflächen- Sterilisation (1. kurzes Waβchen mit sterilem Wasser; 2. 2 min. Inkubation in 70% Ethanol; 3. 10 min. Inkubation in 3% NaOCl (13% aktives Chlor); 4. dreimaliges Waschen mit Wasser; 5. Trocknung im Laminarström der Sicherheitswerkbank). Nach ca. 2- wöchiger Kultivierung auf LS-Medium mit 75 μg/ml Kanamycin bei 25-26 °C, 2000-3000 Lux und 60% Luftfeuchte waren kanamycin- reβiβtente Tabakkeimlinge und kanamycinβenβitive Tabakkeimlinge eindeutig zu unterscheiden. Reβiβtente Keimlinge zeigten im Gegensatz zu βenβitiven Keimlingen auβgeprägtes Primärwurzel- Wachstum. Außerdem waren nur hier nach 2 Wochen neben den Kotyledonen auch die Primärblätter zu erkennen. In diesem
"Vierblattstadium" wurden die resiβtenten Fl-Kβimlinge in Erde überführt, abgehärtet und unter geeigneten Bedingungen weiterkultiviert.
Beispiel 3:
Pflanzenanzucht, Ozonbehandlung und Blatternte
Für die anschließende Ozonbehandlung wurden transgene, kana- mycinreβiβtente Tabakkeimlinge zunächst von Agarplatten in Blumentöpfe mit einem 2:1-Gemisch von Standardsubstrat (Typ T / Frühstorfer / Lauterbach) mit Perlit überführt und für 3 Wochen in einer Klimakammer mit einem 12 h-Tag/Nacht-Zyklus, 15.000 Lux, 25 °C-Tagestemperatur, 20 °C-Nachttemperatur, 65-70% Luftfeuchte und gefilterter Luft inkubiert.
Die Tabakpflanzen wurden anschließend einem einzigen Ozonpulβ für 10 h ausgesetzt und dann in Schadstoff-freier, gefilterter Luft für 2-14 h inkubiert. Sämtliche Begasungsexperimente wurden in geβchloββenen Plexiglaβ-Boxen, die in die Klimakammer gestellt wurden, unter den angegebenen Klimabedingungen durchgeführt. Die Ozon-Behandlungen begannen immer um 9.00 Uhr morgens über den Tageszyklus hinweg. Das Ozon wurde durch elektriβche Entladung in trockenem Sauerstoff gewonnen. Die Dosierung und Analysen wurden unter Computer-Kontrolle durchgeführt (Langebartels et al. (1991) Plant Physiol. 95, 882-889) . Die Tabakblätter einer Pflanzen wurden von der Spitze der Pflanze aus nach unten gezählt und in die Blattnummern 1-10 klaββifiziert, wobei das 1. Blatt eine Größe von mindestenβ 8 cm aufwieβ. Die Tabakblätter (klassifiziert von 1-10) wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach Beginn der Ozonbehandlung einzeln in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert. Beispiel 4 :
jS-Glucuronidaβe-Aktivitätsteβt
Die fluorometrische Analyse der GUS-Enyzmaktivität wurde streng nach Jefferson (1987) supra bzw. Jefferson et al. (1987) EMBO J. 6, 3901-3907 unter Verwendung von 4-Methyl-umbelliferyl- glucuronid (MUG, Sigma, München) durchgeführt. Die Konzentra¬ tion des Produktes 4-Methylumbelliferon (MU) wurde mit einem Fluoreβzenzphotometer (Perkin Eimer LS-2 B Filterfluorimeter) in einer Quarz-Durchflußküvette gemessen. Die GUS-Aktivität in Pflanzenextrakten wurde in pmol MU x mg"1 x min"1 berechnet. Die Proteinkonzentration in den Tabakblattextrakten wurde nach Bradford (1976) Analyt. Biochem. 12_, 248-254 bestimmt.
In parallel durchgeführten Experimente mit Ozon-behandelten Weinpflanzen und anschließenden Northern Blot Analysen konnte gezeigt werden, daß eine Begasung mit 0,2 μl/1 und 0,4 μl/1 Ozon in einer beträchtlichen Induktion der STS-Genexpression auf mRNA-Ebene resultiert. Auβ diesem Grund sollten STS-Gene auβ Weinrebe besonders gut für die Identifizierung Ozon- reβponβiver DNA-Elemente geeignet sein. Es sei an dieser Stelle erwähnt, daß bislang solche Gene, die eine signifikante, zuverlässig meßbare Ozon-Induktion in Ozon-behandelten Pflanzen im Vergleich zu unbehandleten Pflanzen erkennen lasβen, nicht zur Verfügung stehen.
Um den Einfluß von Ozon auf Promotorebene analysieren zu können, wurden Fl-Tabakpflanzen (11 Wochen alt) der stabil transformierten Tabaklinie, die die das Vstl-Promotor/GUS- Fusionβkonβtrukt mit der vollständigen Promotorregion (plSOOGUS) enthält, in Ozonbegasungsexperimenten eingesetzt. GUS-Enzymaktivitäten wurden fluorometrisch in Rohextrakten von Blättern, die zu verschiedenen Zeitpunkten während einer 10- βtündigen Ozonbegaβung mit verβchiedenen Ozonkonzentrationen (0,1 μl/1 Ozon, 0,2μl/l Ozon bzw. 0,4 μl/1 Ozon) und einer 14- βtündigen Postinkubationsphase in Schadstofffreier Luft geerntet wurden, bestimmt. Die in Abbildung 2 dargestellten Ergebnisse zeigen einen raschen durch Ozon induzierten Anstieg der GUS-Aktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die nur in βchadβtofffreier Luft gehalten wurden. Danach verurβachte die Behandlung mit 0,1 μl/1 Ozon eine 11-fache Induktion und die Behandlung mit 0,2 bzw. 0,4 μl/1 Ozon sogar eine bis zu 25- fache Induktion der durch den STS-Promotor kontrollierten Expreββion deβ GUS-Gene 12 h nach Beginn der Ozon-Behandlung.
Für die Identifizierung von eis.-regulatorischen Sequenzen, die für die beobachtete starke Ozoninduktion des STS-Promotors verantwortlich sind, wurden die transgene Tabaklinien, die die oben beβchriebenen 5' -Deletionen deβ Vβtl-Promotorβ in Fuβion mit dem bakteriellen GUS-Reportergen enthalten, alβ unabhängige FO-Pflanzen in Ozonbegasungsexperimenten analysiert. Die Primärregnerate wurden für mehrere Monate in Sterilkultur kultiviert und über Sproßkultur vermehrt. Ebenso wurden Fl- Tabakpflanzen (11 Wochen alt) dieser stabilen Transformanten auf Ozon-induzierte GUS-Expresβion untersucht.
Die tranβgenen Tabakpflanzen wurden für 10 h mit 0,1 μl/1 Ozon behandelt und anβchließend für weitere 2 h in βchadβtofffreier Luft inkubiert. Die GUS-Aktivität wurde in Rohextrakten von mittelalten Blättern bestimmt und mit der Enzymaktivität in unbehandelten Kontrollpflanzen verglichen. Die Ergebnisse der fluorometrischen Analyse der GUS-Enzymaktivitäten sind in Tabelle 1 dargestellt. Während die GUS-Aktivität mit zunehmen¬ der Verkürzung der Promotorregion von -1500 auf -430 sowohl in Ozon-behandelten Testpflanzen alβ auch in unbehandelten Kontrollpflanzen in einer leichten Abnahme der Ozon-Induktion resultiert (Induktionβfaktor sinkt von ca. 12 (-1500) auf ca. 10 (-430)), bewirkt die zusätzliche Deletion des Promotor¬ bereichs zwischen -430 und -280 eine drastische Reduktion der GUS-Expression in Ozon-behandelten Testpflanzen. Während Pflanzen, in denen das GUS-Gens unter Kontrolle des -430-5'- Deletionspromotors steht, eine 10-fache Ozon-Induktion gegenüber den Kontrollpflanzen zeigen, ist in Pflanzen, in die Expression des GUS-Gens durch den kürzeren -280-5' -Deletions- promotor kontrolliert wird, lediglich eine maximal 2-fache Induktion der GUS-Expresβion durch Ozon zu beobachten. Demzufolge enthält der Promotorbereich deβ Vstl-Gens aus Weinrebe, der die Basenpaare -430 bis -280 umfaßt cis-aktive Elemente, die für eine auβgeprägte Ozon-induzierte Expression des STS-Gens essentiell sind.
Diese Ergebnisse wurden in Pflanzenzellen, die die obigen
Konstrukte enthalten und in pflanzlichen Zellkulturen gezüchtet wurden, bestätigt.
ABBILDUNGEN und TABELLEN
Abbildung 1: Restriktionskarte der Vstl-Promotor/GUS-Translationβfuβion in dem Plaβmid pUC-Vstl/GUS. Das Plasmid enthält eine Translationsfusion des Vstl-Promotors aus der Weinrebe mit dem GUS-Gen auβ E^ coli. Die für die Klonierung der 5'- Deletionβmutanten benutzten Restriktionβschnittstellen sind eingezeichnet, nos ter = Terminationssignal des Nopalinβynthaβegens aus Aqrobacterium tumefaciens.
Abbildung 2:
Kinetik der durch den Vstl-Promotor kontrollierten Induktion der GUS-Expression in tranβgenen Fl-Tabakpflanzen, die eine Tranβlationsfuβion deβ GUS-Gens mit dem vollständigen Vstl- Promσtor auβ Weinrebe enthalten (pl500GUS) , durch verschiedene Ozonkσnzentrationen.
Die GUS-Aktivitäten wurden fluorometrisch in Rohextrakten von Tabakblättern (Blatt-Nr. 4) nach Jefferson (1987), supra. bestimmt. Die verschiedenen Erntezeitpunkte ergeben sich aus der Abbildung. Nach der 10-βtündigen Ozonbehandlung erfolgte eine 14-stündige Poβtinkubation der Tabakpflanzen in βchad¬ βtofffreier Luft. Kontrollpflanzen wurden nur in βchadβtoff- freier Luft (ohne Ozonbegasung) gehalten, n = 3 oder 4; Mittel¬ werte ± Standardfehler; sämtliche Teste wurden alβ Doppelver- βuche durchgeführt.
Tabelle 1: GUS-Enzymaktivitäten wurden fluorometrisch in Proteinextrakten von mittelalten Blättern von Ozon-behandelten (+) und unbehan¬ delten (-) unabhängigen Tabakträneformanten bestimmt. Die transgenen Tabaklinien enthalten verβchiedene 5' -Deletionen deβ Vstl-Promotors in Fusion mit dem bakteriellen GUS- Reportergen. FO-Transformanten und Fl-Pflanzen (11 Wochen alt) wurden für 10 h mit 100 nl/1 Ozon begast und anschließend für 2 h in βchadβtofffreier Luft poβtinkubiert. Mittelwerte ± Stan¬ dardfehler; sämtliche Analysen wurden als Doppelversuche durchgeführt.
ERSAΓZBLAΓΓ (REGEL 26)
Figure imgf000035_0001
Tabelle 1
FJSAΓZBLÄΓT (REGEL 26) Tabelle 1 :
GUS-Enzymaktivitäten wurden fluorometriβch in Proteinextrakten von mittelalten Blättern von Ozon-behandelten (+) und unbehan- delten (-) unabhängigen Tabaktransformanten bestimmt.
Die tranβgenen Tabaklinien enthalten verschiedene 5' -Deletionen deβ Vβtl-Promotorβ in Fuβion mit dem bakteriellen GUS- Reportergen. F0-Tranβformanten und Fl-Pflanzen (11 Wochen alt) wurden für 10 h mit 100 nl/1 Ozon begast und anβchließend für 2 h in Schadstofffreier Luft postinkubiert. Mittelwerte ± Stan¬ dardfehler; sämtliche Analysen wurden als Doppelverβuche durchgeführt.
Figure imgf000036_0001
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: GSF - Forschungszentrum fuer Umwelt und
Gesundheit GmbH
(B) STRASSE: Ingolstaedter Landstr. 1
(C) ORT: Oberschleissheim
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 85764
(A) NAME: Bayer AG
(B) STRASSE: Bayerwerk
(C) ORT: Leverkusen
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 51368
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Ozon-Induzierte Genexpression in Pflanzen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 3
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRAEGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LAENGE: 161 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKUELS: Genom-DNA
<xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCC ACTTGACTTT TGAAAAGGAG 60
GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAA CCTTCGTAAT GTTÄATGAAA TCAAAGTCAC 120
TCAATGTCCG AATTTCAAAC CTCANCAACC CAATAGCCAA T 161 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LAENGΞ: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKUELS: Sonstige Nucleinsaeure
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2: CCCCAAGCTT CCCCGGATCA CATTTCTATG AGT 33
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LAENGE: 34 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKUELS: Sonstige Nucleinsaeure
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3: CGCGGATCCT CAATTGAAGC CATTGATCCT AGCT 34

Claims

ANSPRÜCHE
1. Die pflanzliche DNA-Sequenz:
ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCC ACTTGACTTT TGAAAAGGAG GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAA CCTTCGTAAT GTTÄATGAAA TCAAAGTCAC TCAATGTCCG AATTTCAAAC CTCANCAACC CAATAGCCAA T.
2. DNA-Sequenz gemäß Anβpruch 1, die aus Weinrebe (Vitis vinifera) stammt.
3. DNA-Sequenz gemäß Anβpruch 1 oder 2, die in dem
Stilbenβynthaβe-Gen Vstl natürlicherweise enthalten iβt und den Baβenpaaren -270 biβ -430 entspricht.
4. Promoterregion des Stilbensynthasegens Vstl aus Weinrebe, der mindestenβ die DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 fehlt.
5. Promoterregion gemäß Anspruch 4, die nur den Sequenzbereich vom Tranβlationββtart biβ Baβenpaar -270 umfaßt.
6. Promoterregion gemäß Anspruch 4 oder 5, die noch eine Pathogen-induzierte Genexpression in Pflanzenzellen vermittelt.
7. Chimäre Nukleinsäuremoleküle, in die die DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder mindeβtenβ ein Fragment davon eingeführt wurde.
8. Chimäre Nukleinβäuremolelüle gemäß Anspruch 7, die eine Ozon-induzierbare Expression der in ihnen enthaltenen kodierenden Regionen in Pflanzen ermöglichen.
9. Vektoren, welche die DNA-Sequenz, eine Promoterregion oder ein chimäreβ Nukleinsäuremolekül gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, oder Teile davon enthalten.
10. Transgene Pflanzen, die die DNA-Sequenz, eine Promoterregion oder ein chimäres Nukleinsäuremoleküle gemäß einem der vorangehenden Ansprüche oder eine davon abgeleitete DNA-Sequenz enthalten, sowie Teile dieser Pflanzen und deren Veπnβhrungsmaterial, wie Protoplaβten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen, Knollen oder Stecklinge, usw., sowie die Nachkommen dieser Pflanzen.
11. Transgene Pflanzen, die aufgrund des Fehlenβ der (im natürlichen Zustand vorhandenen) DNA-Sequenz
ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCC ACTTGACTTT TGAAAAGGAG GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAA CCTTCGTAAT GTTÄATGAAA TCAAAGTCAC TCAATGTCCG AATTTCAAAC CTCANCAACC CAATAGCCAA T oder aufgrund deβ Fehlens mindeβtenβ eineβ Fragmenteβ davon keine Ozon-induzierbare Expreββion deβ natürlicherweise Ozon- induzierbaren Gene mehr aufweisen.
12. Pflanzen gemäß Anβpruch 11, in denen die Ozon- induzierbare Expression von Krankheitsresistenzgenen stark reduziert ist.
13. Pflanzen gemäß Anspruch 11 oder 12, in denen die Ozon-induzierbare Expression von Stilbenβynthaβegenen, insbesondere deβ Vstl-Gens aus Weinrebe stark reduziert ist.
14. Pflanzen gemäß Anspruch 10, in denen aufgrund der Einführung der DNA-Sequenz gemäß Anβpruch 1 oder mindestens eineβ Fragmentes davon eine Ozon-induzierbare Genexpression eines natürlicherweise nicht über dieβe DNA-Sequenz verfügenden Gens stattfinden kann.
15. Pflanzen gemäß Anβpruch 14, in denen Ozon- induzierbare Expression von solchen Genen stattfinden kann, deren Genprodukte in Pflanzenzellen in der Lage βind, reaktive Sauerstoffspezies zu entgiften.
16. Pflanzen gemäß Anβpruch 14 oder 15, in denen Ozon- induzierbare Expression von Katalase- oder Superoxiddismutase- Genen stattfinden kann.
17. Pflanzen gemäß Anspruch 14, in denen Ozon- induzierbare Expreββion von Reportergenen βtattfinden kann.
18. Dikotyle Pflanzen gemäß einem der Ansprüche 10 bis 17, insbesondere Nutzpflanzen, wie Sojabohne, Raps, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Baumwolle, Tabak, sowie Zierpflanzen oder Bäume.
19. Monokotyle Pflanzen gemäß einem der Ansprüche 10 biβ 17, insbesondere Getreide wie Hafer, Weizen, Roggen, Gerste, Reis, Hirse oder Mais.
20. Transgene Pflanzenzellen, einschließlich Proto¬ plaβten, die die DNA-Sequenz, eine Promoterregion oder ein chimäreβ Nukleinsäuremoleküle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 oder eine davon abgeleitete DNA-Sequenz enthalten.
21. Pflanzenzellen, einschließlich Protoplasten, die aufgrund deβ Fehlenβ der (im natürlichen Zuβtand vorhandenen) DNA-Sequenz ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TσGAAATTAA TACATTTTCC ACTTGACTTT TGAAAAGGAG GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAA CCTTCGTAAT GTTÄATGAAA TCAAAGTCAC TCAATGTCCG AATTTCAAAC CTCANCAACC CAATAGCCAA T oder aufgrund deβ Fehlens mindestens eines Fragmentes davon keine Ozon-induzierbare Expreββion deβ natürlicherweiβe Ozon- induzierbaren Gene mehr aufweisen.
22. Pflanzenzellen gemäß Anβpruch 20, in denen aufgrund der Einführung der DNA-Sequenz gemäß Anβpruch 1 oder mindeβtenβ eineβ Fragmentes davon eine Ozon-induzierbare Genexpression eines natürlicherweise nicht über diese DNA-Sequenz verfügenden Gens βtattfinden kann.
23. Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, in denen die Ozon-induzierbare Expreββion von natürlicherweise Ozon-induzierbaren Abwehrgenen durch Deletion der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder mindestens eineβ Fragmenteβ davon in dem Abwehrgen, daβ dieβe DNA-Sequenz oder eine davon abgeleitete DNA-Sequenz natürlicherweiβe enthält, βtark reduziert bzw. ausgeschaltet wird.
24. Verfahren gemäß Anβpruch 23, in denen die Ozon- induzierbare Expreββion von Stilbenβynthaβegenen stark reduziert bzw. ausgeschaltet wird.
25. Verfahren gemäß Anβpruch 23 oder 24, in denen die Ozon-induzierbare Expression deβ Vstl-Gens aus Weinrebe stark reduziert bzw. ausgeschaltet wird.
26. Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, in denen ein oder mehrere Gene, deren Expreββion natürlicherweise nicht oder nicht wesentlich durch Ozon induziert wird, aufgrund der Einführung der DNA-Sequenz gemäß Anβpruch 1 oder mindeβtenβ eineβ Fragmentes davon durch Ozon induzierbar sind.
27. Verfahren gemäß Anspruch 26, in denen ein oder mehrere Katalaβe- und/oder Superoxiddiβmutaβe-Gene durch Ozon induzierbar βind.
28. Verfahren gemäß Anβpruch 26, in denen ein oder mehrere Reportergene durch Ozon induzierbar βind.
29. Verfahren zur Beseitigung der Ozon-Induzierbarkeit von natürlicherweise Ozon-induzierbaren Abwehrgenen, die die DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder eine davon abgeleitete DNA- Sequenz natürlicherweise enthalten, durch Deletion oder Inaktivierung der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder mindeβtenβ eineβ Fragmenteβ davon.
30. Verfahren gemäß Anβpruch 29, in dem daβ Gen ein Stilbenβynthase-Gen iβt.
31. Verfahren gemäß Anβpruch 29 oder 30, in dem daβ Gen das Vβtl-Gen aus Weinrebe ist.
32. Verfahren zur Erzeugung von Ozon-induzierbarer
5 Merkmalβauβprägung in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen durch Einfügen der DNA-Sequenz gemäß Anβpruch 1 oder mindeβtenβ eineβ Fragmenteβ davon in βolche Gene, die natürlicherweiβe nicht oder nicht wesentlich durch Ozon induzierbar βind.
10 33. Verwendung der DNA-Sequenz gemäß Anβpruch 1 oder eineβ Fragmenteβ davon zur Auffindung Ozon-reβponβiver Sequenzbereiche in pflanzlichen Genen.
34. Verwendung der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 15 eines Fragments davon zur Erzeugung ozon-induzierbarer
Merkmalβauβprägung in tranβgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen.
35. Verwendung der DNA-Sequenz gemäß Anβpruch 1 oder eines Fragments davon zur Erzeugung von Pflanzen gemäß Anspruch
20 17, die als Biomonitoren zur quantitativen und/oder qualitati¬ ven Bestimmung von Ozon-Konzentrationen eingesetzt werden können.
36. Verwendung der Promotorregion gemäß einem der
25 Ansprüche 4 bis 6 zur Erzeugung erhöhter pathogen- aber nicht ozon-induzierbarer Krankheitβresiβtenz in transgenen Pflanzen.
30
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