WO1997042334A1 - Vecteur pour le transfert genique dans une plante, permettant la deletion eventuelle d'un gene marqueur - Google Patents

Vecteur pour le transfert genique dans une plante, permettant la deletion eventuelle d'un gene marqueur Download PDF

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WO1997042334A1
WO1997042334A1 PCT/JP1997/001569 JP9701569W WO9742334A1 WO 1997042334 A1 WO1997042334 A1 WO 1997042334A1 JP 9701569 W JP9701569 W JP 9701569W WO 9742334 A1 WO9742334 A1 WO 9742334A1
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gene
vector
plant
dna
inducing
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Koichi Sugita
Mikiko Uesugi
Etsuko Matsunaga
Hiroyasu Ebinuma
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Nippon Paper Industries Co., Ltd.
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    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits

Definitions

  • the present invention relates to a novel vector useful for obtaining a transformed plant by introducing a target gene into a plant by a genetic engineering technique.
  • Conventional technology
  • Transformation of microorganisms and cultured cells using genetic engineering technology is currently applied to the production of bioactive substances useful as pharmaceuticals, and has made a great contribution to the actual industry.
  • the application of genetic engineering technology to the actual industry has been somewhat delayed due to the longer life cycle of plant cells compared to microbes, etc.
  • a target gene into a target plant and create a transgenic plant (1) Introduce a target gene into a plant cell (including cases where it is introduced into chromosomes, nuclei, etc.).
  • a marker gene is usually used to select a target gene-transfected tissue. That is, this is introduced into a plant cell together with the target gene, and the characteristic properties of the transfected cell, and furthermore, the tissue generated from this cell, indicated by the expression of the marker ⁇ gene, are used as an indicator of the target gene transfer. Is common. Therefore, at present, almost all plants transformed by genetic engineering techniques have been introduced and expressed in addition to the target gene. However, only a small portion of the transgene products of genes used as markers have been confirmed to be safe for the human body.
  • the expression of the marker gene poses a major obstacle at the level of researchers aiming at plant breeding.
  • the gene must be transfected again using the same marker gene. Can not do. Since this target gene already exists in the target plant, even if it is introduced again into the same plant together with a new target gene, a new target gene is introduced.
  • the marker gene is always expressed in the plant, and it can no longer be used as an indicator for the purpose and gene transfer. Therefore, the number of gene transfer that can be repeated for a plant is naturally limited by how many different genes can be used for that plant. There are not many types of marker genes that can be used at present. Moreover, not all of these marker genes can be used in the target plants.
  • the target gene into plant cells.
  • Japanese Patent Application No. 7-311 3 4 3 2 Japanese Patent Application No. 7-311 3 4 3 2).
  • This includes a morphological abnormality-inducing gene and a detachable DNA element as a target gene and a marker gene, and the morphological abnormality-inducing gene behaves in a manner similar to this detachable DNA element.
  • the target gene is located at a position where it does not unite with the DNA factor having the elimination ability.
  • the removal of the marker gene could not be arbitrarily controlled. Therefore, when the ability of the DNA factor having the detaching ability is high, the marker gene is detached very quickly. For example, immediately after the marker gene is introduced into a plant cell together with the target gene, the marker gene is removed before its expression. In some cases, even if a tissue consisting of cells into which only the target gene has been obtained can be obtained, no change in the morphology of the transgenic tissue due to the function of the marker-one gene will occur. After all, it becomes impossible to select such an organization.
  • the removal of the marker gene can be arbitrarily controlled, the generation of cells into which only the target gene has been introduced, and the generation of plant tissue consisting of such cells can be synchronized or adjusted appropriately. This makes it very convenient to actually produce a transgenic plant using such a vector.
  • an object of the present invention is to provide a gene which has a marker gene and which is introduced into a plant cell together with a target gene, after expression thereof, as necessary, in the presence of a functional chromosome.
  • An object of the present invention is to provide a vector for introducing a transmissive element to a vehicle. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to use a morphological abnormality-inducing gene as a marker gene, Under the control of a regulatory factor that induces expression of a functional DNA factor, the morphological abnormality-inducing gene is located at a position where it is integrated with the detachable DNA element, and the gene of interest is This can be achieved by constructing a vector so that the DNA element having the elimination ability exists at a position where the behavior is not united.
  • the morphological abnormality-inducing gene is a gene that causes unusual morphological differentiation in plant tissues, such as dwarfing, collapse of apical dominance, pigment change, apical carcinoma, hairy root, leaf waving, etc.
  • these morphological abnormality-inducing genes include the ptpt (isopenteny 1 transferase) gene (AC Smigock; D. 0wens, Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, 85: 5131, 1988), iaa M (tryptophan monooxygenase) gene (HJ Klee et al., GENES & DEVELOPMENT, 1:86, 1987), genei gene (H.
  • Savastanoi has the iaa L (indoleacetic acid-lysine synthetase) gene (A. Spena et al. N Mol. Gen. Genet., 227: 205, 1991), and various plants have also reported the presence of homeobox (gene), phytochrome (gene), and the like.
  • any of these genes can be used in the present invention.
  • the iPt gene causing the collapse of apical buds, the formation of hairy roots, and plants regenerated from hairy roots
  • the ro 1 gene group that causes the dwarfing of the leaf of the plant, such as undulation of the leaf, is preferable as a marker gene used in the present invention because it causes a characteristic morphological abnormality among various morphological abnormality-inducing genes.
  • these morphological abnormality-inducing genes can also be designed to be combined with each other to redifferentiate specific structures such as adventitious buds and adventitious roots into specific plants into which they have been introduced.
  • a combination of genes is used.
  • a morphological abnormality-inducing gene can be constructed and used in accordance with the conditions for producing the transgenic plant, such as the type of plant targeted for gene transfer.
  • the DNA element having a detachment ability refers to a DNA sequence capable of detaching itself from a chromosomal DNA or the like in which these elements exist and function.
  • a transposon present on the chromosome, and its structure, function, and behavior are almost completely known.
  • an enzyme transferase
  • two components a DNA sequence to which this transferase binds and acts, are required.
  • the transposon is detached from the chromosome where it exists, and usually translocates to a new position on DNA, but sometimes loses its function without a certain probability of transposition and loses its function. Therefore, in the present invention, such transposable transposition errors are used.
  • the transposon has such an autonomous transposon, that is, a transferase and a DNA binding sequence, and the transferase expressed from the inside of the transposon binds to the DNA sequence present in the terminal region.
  • an autonomous transposon that is, a transferase and a DNA binding sequence
  • the transferase expressed from the inside of the transposon binds to the DNA sequence present in the terminal region.
  • nonautonomous transposons there are also types called nonautonomous transposons.
  • This non-autonomous transposon is an autonomous transposon that, while retaining the DNA sequence at the end where the transferase binds and acts, has a mutation in the internal transferase gene and no expression of the transferase.
  • a non-autonomous transposon that cannot be detached from the chromosome but also a non-autonomous transposon when a transferase is supplied from an autonomous transposon or a transferase gene that exists independently of this. However, it will behave similarly to an autonomous transposon.
  • any of autonomous and non-autonomous transposons can be used. That is, when a non-autonomous transposon is used, a transposase gene obtained or synthesized from an autonomous transposon or the like may be inserted into the inside thereof in addition to the morphological abnormality-inducing gene.
  • the isolated autonomous transposon is isolated from maize.
  • Ac and Spm were analyzed and detailed analysis has been performed (A. Gieri and H. Saedler. Plant Mol. Biol. 19:39, 1992).
  • Ac can be obtained by cutting out the wX-m7 m locus in the maize chromosome with the restriction enzyme Sau3A (U. Behrens et al., Mo. Gen. Genet. , 194: 346, 1984), because it is the most analyzed autonomous transposon among plant transposons and its DNA sequence has already been elucidated (M. Mueller-Neumann et al., Mol. Gen.
  • Non-autonomous transposons include Ds and dSpm, each of which lacks the internal regions of Ac and Spm.
  • a DNA factor having an elimination ability which is present in plants other than plants
  • those derived from a site-specific recombination system are known.
  • This site-specific recombination system specifically binds to a recombination site having a characteristic DNA sequence (corresponding to a DNA element capable of leaving out according to the present invention) and this DNA sequence (recombination sequence).
  • the region sandwiched between them is released from the DNA molecule (plasmid, chromosome, etc.), and the direction in which this sequence faces is determined. When there are two locations facing each other, the behavior is that this region is inverted.
  • the former elimination action is utilized, but such elimination and reversal of the recombination site occurs as a result of so-called homologous recombination by a site-specific recombination system. This is the most different point from the mechanism using a transposon, which causes its detachment as a transposition process.
  • the gene encoding the recombinase does not necessarily need to be present on the same DNA molecule as the recombination site, and as long as it is present and expressed in the same cell as this recombination site. It is known that the detachment of 'can cause inversion (NLCraig Annu. Rev. Genet., 22:77, 1988).
  • site-specific recombination systems include Cre / 10x system, pSR1 system, FLP system, cer system, fim system, etc., isolated from microorganisms such as phage, bacteria (for example, Escherichia coli), and yeast. It is known (for review, NL Craig, Annu. Rev. Genet., 22:17, 1988), but its existence is not yet known in higher organisms. However, the site-specific recombination system isolated from these microorganisms has also been used as a vector for transfection of plants into CreZ10X-based plants derived from P1 phage and exerts its function even in plants.
  • the DNA factor having the elimination ability is placed under the control of an expression-inducing regulatory factor.
  • genes of all organisms from prokaryotes such as bacteria to eukaryotes such as yeasts, molds, higher plants, and mammals, have expression-inducible regulators in the upstream region of their structural genes. These, alone or in concert, function to regulate the expression of a gene or group of genes, for example, sometimes depending on the stage of differentiation and development of an individual, sometimes with heat,
  • the gene expression is turned on and off according to various environmental factors such as light and metal.
  • an expression-inducing regulatory factor having such a function is used, and a DNA element having an elimination ability is arranged in the downstream region to control the expression, that is, the elimination ability.
  • Glutathione-1 S-transferase I gene promoter Japanese Patent Laid-Open No. 5-268965
  • glutathione-1 S-transferase II (GST-II) gene promoter International Publication W093 / 01294) Gazette
  • T et reblesser fusion-type reflex mosaic virus 35S promoter C. Gatz et al., Mol. Gen.
  • Lac operator / repressor promoter (RJWilde et al., The EMBO Journal, 11: 1251, 1992), a1cR / ale A promoter (International Publication W094 / 03619), glucocorticoid promoter (Takashi Aoyama, protein nucleic acid enzyme) 41: 2559, 1996) and the like, and the hsp80 promoter (Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-276951) and the like, which respond to heat, and the ribulose 2-phosphate carboxylase small subunit, which respond to light.
  • Heredity ( ⁇ bc S) promoter (R. Fluhr et al., Proc.
  • the ⁇ bcS promoter is the most studied as an expression-inducing regulator of higher plants, and has been analyzed in detail by Chua et al. (For example, Matsuoka, Plant Cell Engineering Extra number, 3: 552, 1991). Therefore, although this regulatory factor was also used in Example 1 of the present invention, how the factor regulates gene expression by light has not yet been determined at present.
  • chemical-reactive promoters such as GST-II gene promoters, can control heat induction and heat induction because the induction of gene expression can be controlled relatively freely by the abundance of chemical substances. It has the advantage of being practically easier to use than heat or light responsive promoters, which must be regulated to control gene expression.
  • the place where the morphological abnormality-inducing gene is inserted is not limited as long as it is a place where DNA can be eliminated together with a DNA element having the ability to be eliminated.
  • a transposon when used as a detachable DNA element, the effect on transposon elimination upstream of the promoter region of the transferase gene and downstream of the terminal region to which the transferase binds is affected.
  • the recombination enzyme It can be inserted anywhere, as long as it does not inhibit the expression of the gene.
  • the vector of the present invention can be used in any plant into which a gene can be introduced by genetic engineering techniques, and the target gene that can be introduced into a plant by the vector of the present invention has an agriculturally excellent trait.
  • Genes that can be conferred and agriculturally excellent morphology are not always conferred, but various types can be selected depending on the purpose, such as genes required for studying gene expression mechanisms.
  • the promoter and terminator of the target gene can be used without any restriction as long as they function in plants.
  • such promoters include the 35S promoter of cauliflower mosaic virus (JTOdell et al., Nature (London), 313: 810, 1985), the promoter of nopaline synthase (WHR Langidge et al. , Plant Cell Rep., 4: 355, 1985), etc., and as a promoter, a polyadenylation signal of nopaline synthase (A. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1). : 561, 1982), polyadenylation signal of octobine synthase (J. Gielen et al., EMBO J., 3: 835, 1984) and the like.
  • the gene used in the present invention can be obtained by cloning cDNA or genomic DNA, and if its sequence is known in advance, it can be chemically synthesized. You can also get.
  • the vector of the present invention can be indirectly introduced into plant cells via viruses or bacteria that infect plants (see [Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Pla Mol. Biol., 42: 205). , 1991).
  • viruses or bacteria that infect plants see [Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Pla Mol. Biol., 42: 205). , 1991).
  • the virus for example, cariflor mosaic virus, diminivirus, tobacco mosaic virus, brom mosaic virus and the like can be used, and as the bacterium, Agrobacterium. ), Agrobacterium, Rhizogenes, etc. can be used.
  • the genus Agrobacterium is generally considered not to infect monocotyledonous plants, but only to dicotyledonous plants.
  • the vector of the present invention can also be directly introduced into plant cells by a physical or chemical method such as a microinjection method, an electroporation method, a polyethylene glycol method, a fusion method, or a high-speed ballistic penetration method. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 42: 205, 1991).
  • the direct transfer method using agrobacterium which is widely used for gene transfer, cannot be used.
  • the introduction method is effective.
  • the morphological abnormality-inducing gene used as the marker gene is abnormally expressed in the introduced plant cell in the physiological state of the cell, such as abnormal production of plant growth hormone, when the gene is expressed.
  • the direction of the proliferation and differentiation is disturbed, and various morphological abnormalities are caused in the tissue formed therefrom.
  • the abnormally shaped tissues that occur here such as disordered bud aggregates (polyblasts) and hairy roots whose dominant sprout dominates, are derived from cells into which these morphological abnormality-inducing genes have been introduced. Since this is the result of abnormal proliferation and differentiation, it consists only of cells having this gene.
  • step (1) by constructing a vector together with the target gene using this as a marker gene, introducing this vector into a plant cell, and culturing the cell, a macromolecule showing an abnormal morphology that arises can be visually observed. Only by selecting in step (1), it becomes possible to select a tissue consisting of only the cell into which the marker-transmitting gene, that is, the gene of interest has been introduced.
  • the morphological abnormality-inducing gene is used by incorporating it into a DNA element that is integrated with a detachable DNA element under the control of an expression-inducing regulator.
  • an appropriate stimulus such as heat, light, or a chemical substance depending on the expression-inducing regulator used is artificially applied to the plant cell.
  • a DNA element having a detachment ability can be expressed, and as a result, the morphological abnormality induction gene, which is a marker ⁇ gene, together with this DNA element, can be expressed from the DNA on which they were introduced and functioning. Detach with a certain probability and lose its function, while the target gene whose behavior is not united remains on the same DNA and keeps its function, that is, only the target gene is introduced so that it can be expressed Have been Cells can be obtained.
  • the loss of the function of the marker gene can be detected with the naked eye as a change in the morphology of the transfected tissue, as in the case of gene transfer.
  • a tissue consisting only of cells into which only the target gene has been introduced so that it can be expressed can be reliably and easily selected. That is, in order to obtain a tissue consisting only of such cells, first, the cells after the gene transfer treatment are cultured and abnormal cells such as polyblasts and hairy roots resulting from the expression of the morphological abnormality-inducing gene are obtained. The morphological tissue is selected with the naked eye and separated.
  • FIG. 1 is a diagram showing the steps up to the creation of pNPI201 in the scheme for creating pNPI206.
  • FIG. 2 is a diagram showing, from the pNP I 206 creation scheme, the steps from pNP I 201 to creation of pN PI 203.
  • FIG. 3 is a diagram showing the steps from creation of pNP I 203 to creation of pNP I 204 in the scheme for creating pNP I 206.
  • FIG. 4 is a diagram showing the steps from PNP I 204 to PNP I 206 in the pNP I 206 preparation scheme.
  • FIG. 5 is a restriction map of the T-DNA region in the structure of pNPI206.
  • FIG. 6 is a scheme for creating pNP I125.
  • FIG. 1 is a diagram showing the steps up to the creation of pNPI201 in the scheme for creating pNPI206.
  • FIG. 2 is a diagram showing, from the pNP I 206 creation scheme, the steps from pNP
  • FIG. 7 is a scheme for generating pNP I128.
  • FIG. 8 is a diagram showing the preparation up to pIPT2 of the pNP I123 preparation scheme.
  • FIG. 9 is a diagram showing the steps from preparation of pIPT2 to preparation of pIPT3 in the pNPI123 preparation scheme.
  • FIG. 10 is a diagram showing the steps from the preparation of pIPT3 to the preparation of pIPT4 in the pNP I123 creation scheme.
  • FIG. 11 is a diagram showing the steps from the PIPT4 to the production of pNPI123 in the pNPI123 production scheme.
  • FIG. 12 is a diagram showing, from the pNP I303 creation scheme, pNP I200 and pG1E7 to the creation of pNPI301.
  • FIG. 6 is a diagram showing up to the creation of PT8.
  • FIG. 14 is a diagram showing, from the pNP I303 creation scheme, pNPI301 and pI ⁇ 8 to the creation of pNPI302.
  • FIG. 15 is a diagram showing the steps from the creation of ⁇ ⁇ 302 to the creation of ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 303 in the pNP I 303 creation scheme.
  • a recombinase gene (hereinafter, referred to as an R gene) of a yeast site-specific recombination system (pSRl system) is used.
  • the Novaline synthase polyadenylation signal linked to it are cut out with restriction enzymes XbaI and EcoRI, and this is excised from baSG-EcoRI restriction of pHSG398 (purchased from Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • Plasmid pNPI200 was obtained by insertion between enzyme sites.
  • a plasmid containing the promoter (rbc S-3B) of the ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit gene was digested with the restriction enzyme Kpn I. After the protruding end generated by the cleavage was blunt-ended with T4 polymerase I (large submit), the 5 'phosphorylated SaII linker was inserted into the plasmid to generate plasmid pRBCS. ⁇ bcS-3B was excised from pRBCS with the restriction enzyme Sa1I and inserted into the pNPI200OSa1I restriction enzyme site to obtain the plasmid pNPI201.
  • This rbc S-3B is a photo-reactive promoter derived from Tomato (Lycopersicon esculentum VFNT LA1221). Tomato has five other similar promoters as rbcS expression-inducible regulators ( ⁇ bc S-1, —, —_, one, -3C). Analyzed by Sugita et al. (M. Sugita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 7104, 1987). Next, this pNP I201 was cut with restriction enzymes PstI and BamHI, and the protruding end was blunt-ended with T4 polymerase I (large subunit), and then religated. This was designated as PNP I202.
  • PNP I 202 From the PNP I 202, a fragment containing the rbc S-3B, R gene and the nopaline synthase polyadenylation signal was cut out with restriction enzymes EcoRI and HindIII, and this fragment was pUC119 (Takara Shuzo Co., Ltd. ), A plasmid PNP I203 was created between the EcoR I -Hind III restriction enzyme sites of the purchaser), and from this pNP I203, rbc S-3B, R The fragment containing the gene and the nopaline synthase polyadenylation signal was cut out with restriction enzymes EcoRI and HindIII, and the Ec0 of pNP I128 obtained in Japanese Patent Application No. 7-313432 was obtained. Plasmid pNPI204 was obtained by inserting between RI-HindIII restriction enzyme sites.
  • a fragment containing the mozaic virus 35S promoter (CaMV35S promoter) and the ipt gene linked thereto was obtained.
  • the vector of interest is the ipt gene linked to the CaMV35S promoter, the R gene linked to rbc S-3B, and the noparin synthase polyadenylation signal, and these
  • the recombination sequence Rs of the yeast site-specific recombination system at both ends of the yeast was excised with the restriction enzyme PstI, and the plasmid pBI122 for gene transfer into plants (from Toyobo Co., Ltd.) (Purchased) and introduced into the SseI restriction enzyme site, which was named plasmid pNPI206. When plants are infected with this plasmid-containing A.
  • ummefaciens the inside of the RB and LB sites, called the T-DNA region, in the structure, here, the npt II gene (neomycin kinase gene) )
  • npt II gene neomycin kinase gene
  • GUS gene S-galactosidase II gene
  • E. coli JM1 09 (pNP I 206) [Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology ), International Deposit Number: FERM BP-5518, original deposit based on the Budapest Treaty on April 24, 1996.
  • the scheme for creating pNP I206 is shown in Figs. 1-4, and the restriction enzyme map of its T-DNA region is shown in Fig. 5.
  • the scheme for creating pNP I 125 is shown in FIG. 6, the scheme for creating pNP I 128 is shown in FIG. 7, and the scheme for creating pNP I 123 is shown in FIGS.
  • 35 SP is the 35S promoter of cauliflower mosaic virus
  • NOS-P is the promoter of noparin synthase
  • T is the polyadenylation signal of noparin synthase.
  • the enclosed T is the polyadenylation signal of the ipt gene itself, and the shaded triangles indicate the recombination sequence Rs and its sequence direction.
  • this plasmid contains the ipt gene as a marker gene and the npt II gene and GUS gene as a model of the target gene in the T-DNA region, that is, the region to be integrated into the plant chromosome.
  • This ptpt gene is a member of the oncogenic gene maintained by the pathogenic A. mmefanens, and when it is introduced into plant cells, it overproduces a kind of plant hormone, cytokinin, which leads to the differentiation of the cells. The direction will be towards polyblast formation.
  • nPtII gene is a gene that contributes to kanamycin resistance
  • GUS gene is a plant that harbors a plant that metabolizes a special substrate to produce a blue pigment. This gene is widely used for the analysis of gene expression.
  • the L.4ME strain LBA 4404 (purchased from CL0NTECH) was transformed into 1 Oml of YEB liquid medium (beef extract 5 g / yeast extract 1 g / 1, peptide lg / l, sucrose 5 g / l, 2 mM Mg SO ⁇ , p H 7. 2 at 2 2 (hereinafter, if not otherwise indicated, to. a pH at 22 ° C) was inoculated into), OD 630 from 0.4 0.6 for Cultured at 28 to reach range.
  • YEB liquid medium beef extract 5 g / yeast extract 1 g / 1, peptide lg / l, sucrose 5 g / l, 2 mM Mg SO ⁇ , p H 7. 2 at 2 (hereinafter, if not otherwise indicated, to. a pH at 22 ° C) was inoculated into
  • OD 630 from 0.4 0.6 for Cultured at 28 to reach range.
  • the cells After centrifuging the culture at 690 xg at 4 ° C for 10 minutes to collect the cells, the cells were suspended in 20 ml of 1 OmM Tris-He 1 (pH 8.0) and re-cultured. The cells were collected by centrifugation at 00 xg for 4 and 10 minutes, and then the cells were suspended in 2001 YEB liquid medium, which was used as a bacterial liquid for introducing plasmid.
  • Plasmid pNP I206 was introduced into the agrobacterium by adding pNP I2066 prepared with 200 uI and I of this bacterial solution for introduction of plasmid into a 15 ml tube (Falcon). g, mix and cool the tube in ethanol previously cooled in liquid nitrogen for 30-40 minutes by immersion for 5 minutes, then place in a water bath at 29 for 25 minutes, then 750 ⁇ This was carried out by adding the YEB liquid medium 1 and shaking the culture at 29 ° C for 1 hour.
  • MS agar medium T. Murashige and F. skoog ⁇ Physiol. Plant., 15: 473, 1962, but add 0.8 wZv% of agar
  • the pNP I200 obtained in Example 1 was cleaved with PstI, and the protruding ends generated by the cleavage were blunt-ended with T4 bolimerase I (large subunit).
  • ZE NEC A a 27 kD GST-II subunit, which was cut out with the restriction enzyme Nde I and both protruding ends were blunted with T4 polymerase I (large subunit).
  • Insert the promoter of the gene (GST-II-27) (Tokuhyo Hei 6-511138, page 7, lower right corner, lines 15-17) and insert plasmid pNPI300. Created.
  • GST-II is one of GST isozymes involved in the detoxification of herbicides and is an enzyme present in corn and the like.
  • the GST-II-27 promoter regulates the gene expression of the 27 kD subunit of this GST-II subunit, and is used as a herbicide antidote, for example, 2, 2, 5-trimethyl-3-.
  • (Dichloroacetyl) Dramatically increases GST-II activity by inducing the expression of GST-II-127 in the presence of chemical substances such as 1,3-oxazolidine and its analogs, and thus resists herbicides. It is known in this corn and the like that the property is enhanced (Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-511385).
  • the target vector is the ipt gene linked to the CaMV35S promoter, the R gene linked to the GST-II-27 promoter and the nopaline synthase polyadenylation signal.
  • Rs is excised with the restriction enzyme SseI and inserted into the SseI restriction enzyme site of the plasmid pBI121 for gene transfer into plants.
  • Figures 12 to 15 show the scheme for creating pNP I303. In these figures, the symbols used are the same as those used in FIGS.
  • This plasmid pNP I303 was also introduced into E. coli JM109 strain, and this E. coli was transformed into E. c01i JM1 09 (PNP I 303) [Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Institute of Biotechnology and Industrial Technology ( ⁇ 305, Tsukuba, Higashi 1-3-chome, Ibaraki, Japan), International Deposit No .: FERM BP-5927, original deposit based on the Budapest Treaty on April 23, 1997 Attached.
  • plasmid pNPI303 was introduced into A. mmefaciens LBA 4404 strain, the A. mmefunens was infected to tobacco leaf pieces, and the infected leaves were infected with 50 mg / l of acetosilingone.
  • the cells were placed on a hormone-free MS agar medium and cultured in the light for 3 days. Then, the infected leaves were transplanted to a hormone-free MS agar medium containing only 500 mg / 1 of carbenicillin, and cultured with the same composition.
  • Table 2 shows the results after one month of culture with the addition of 2,2,5-trimethyl-13- (dichloroacetyl) -11,3-oxazolidin.
  • the normal body was detected with the naked eye, and the GUS activity test for confirming the expression of the GUS gene, which was used as a model of the target gene in this example, was performed according to the method of Jefferson et al. .
  • a gene When a gene is introduced and cultured in the presence of an appropriate chemical substance, it induces the expression of a DNA factor capable of detachment, and the detachment of the gene, and thus the morphological abnormality-inducing gene, which is a marker gene, is eliminated. It is understood that it promotes.
  • the marker / gene introduced together with the target gene is subjected to a specific stimulus such as heat, light, or a chemical substance after the introduction.
  • a specific stimulus such as heat, light, or a chemical substance after the introduction.
  • a morphological abnormality-inducing gene as the marker gene, it is possible to select a tissue consisting only of cells into which the marker gene has been introduced, that is, a tissue consisting only of cells into which the target gene has been introduced. After the marker gene has lost its function, selection of a tissue consisting only of cells into which only the target gene has been introduced so that it can be expressed can all be performed using the morphological change of the tissue as an index. Therefore, it is possible to reliably and easily select a tissue consisting only of cells in which only the target gene has been introduced into the chromosome, etc., and it is not necessary to add an antibiotic or the like for selection to the culture medium. There is no danger of causing a decrease in cell activity.
  • transgenic individuals consisting only of such cells that is, individuals that have been freed from the effects of the marker gene and that have been completely free from the dangers of their gene products, can also undergo the mating process. Can be obtained without going through.
  • detachment of the marker gene can be artificially regulated. Therefore, if such regulation is not possible, the removal of the marker gene will occur too quickly, and it will be rather difficult to obtain a tissue consisting only of cells that have been introduced so that only the target gene can be expressed.
  • a DNA factor having a very high detachability can also make use of the ability as the DNA factor having a detachability of the present invention.
  • the use of the vector of the present invention makes it possible to synchronize the generation of such cells, and the generation of plant tissue composed of such cells as necessary, or to adjust them appropriately, so that actually, However, it is very convenient for creating transgenic plants.
  • the ipt gene when used as a marker gene, a morphological abnormality-inducing gene, the cells into which it has been introduced will proliferate very actively in the absence of plant hormones and differentiate adventitious buds, etc.
  • the purpose is to generate a large number of tissues that can be generated at any time, if desired, by introducing cells into which only the gene has been introduced so that the cells can continue to be cultured with the marker gene at the previous stage retained. It can also be produced.

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Description

明 細 書 マーカー遺伝子を必要に応じて除去できる植物への遺伝子導入用ベクター 技 術 分 野
本発明は、 遺伝子工学的手法により目的遺伝子を植物に導入して形質転換植物 を得る際に有用な新規ベクターに関する。 従 来 技 術
遺伝子工学技術を利用した微生物、 培養細胞などの形質転換は、 現在、 医薬品 として有用な生理活性物質の生産等の目的に応用され、 実産業においても多大の 貢献をなしている。 植物育種の分野においては、 植物細胞のライフサイクルが微 生物等に比較して長いこと等の理由から、 遺伝子工学技術の実産業への応用はや や遅れているが、 この技術は、 目的とする遺伝子を直接、 育種の対象となる植物 に導入することを可能とするため、 （a ) 改変すべき形質のみが導入できる、 ( b ) 植物以外の種 （微生物等） の形質も植物に導入できる、 （c ) 育種期間の 大幅な短縮ができるなど、 交配を重ねて行う古典的な育種と比べて多くのメリッ トを有し、 その応用は、 植物育種の飛躍的進歩をもたらすものと期待され、 また この期待は現実のものとなりつつある。
具体的に、 目的遺伝子を対象植物に導入し、 遣伝子導入植物を作成するには ( 1 ) 目的遗伝子の植物細胞への導入 （染色体、 核等に導入される場合も含む。
) ( 2 ) 目的遣伝子が導入された細胞のみからなる植物組織の選抜、 （3 ) 選 抜された植物組織からの植物体の再生、 の 3段階を必ず経ることになる。 また、 このうち、 目的遺伝子導入組織の選抜にあたっては通常、 マーカー遺伝子を使用 する。 即ち、 これを目的遺伝子と共に植物細胞へ導入し、 その導入細胞、 ひいて はこの細胞から生ずる組織がマーカー遗伝子の発現によつて示す特徴的な性質を、 目的遺伝子導入の指標として用いるのが普通である。 従って、 遣伝子工学的手法 によって形質転換された植物は、 現在のところ殆ど例外なく、 目的遺伝子の他に マ一力一遺伝子が導入され、 発現している。 しかし、 このようにマーカーとして使用される遺伝子の遣伝子産物に関しては、 まだごく一部の遺伝子につき、 人体への安全性が確認されたのみである。 このた め、 たとえマ一カー遺伝子を用い、 有用な形質を導入したトマトゃジャガイモが 作出できたとしても、 このマーカー遺伝子が発現している限り、 これらを、 例え ば食用として供給することについては、 消費者の漠然とした不安感によるものも 含め、 多くの障害が予想される。
さらに、 遺伝子導入組織を選抜した後においては、 マ一カー遺伝子の発現は、 植物育種を目的とする研究者のレベルにおいても、 大きな障害を与える。 すなわ ち、 あるマーカー遺伝子を用いて作成された遺伝子導入植物に対して、 さらに別 の遺伝子を新たに導入しょうとする場合には、 二度と、 同一のマ一カー遺伝子を 用いて遺伝子導入を行うことができない。 すでに、 対象となる植物には、 このマ 一力一遺伝子が存在しているため、 再びこれを、 新たな目的遺伝子と共にその同 じ植物に導入しても、 新たな目的遗伝子が導入されようがされまいが、 その植物 においてはこのマーカ一遺伝子が常に発現し、 これを目的遗伝子導入の指標とす ることは、 もはやできないからである。 従って、 ある植物に対して遺伝子導入を 繰り返すことができる数は、 その植物に対して何種類の異なつたマ一力一遺伝子 を使用できるかによつて、 自ずから制約を受けることとなる。 し力、し、 現在実用 できるマーカー遺伝子の種類はさして多くない。 しかも、 これらのマーカー遗伝 子全てが、 対象となる植物に使用できるわけではないのである。
これらの問題を解決し、 マーカー遺伝子による影響から完全に解放された遺伝 子導入組織 ·植物を効率良く作成するため、 本発明者らは先に、 目的遗伝子を植 物細胞へ導入するための新規なベクタ一を開発した （特願平 7— 3 1 3 4 3 2 ) 。 これは、 目的遺伝子、 マ一カー遺伝子として形態異常誘導遗伝子、 及び脱離能を 有する D N A因子を含み、 かつ、 形態異常誘導遗伝子はこの脱離能を有する D N A因子と挙動を一つにする位置に存在し、 また目的遺伝子はこの脱離能を有する D N A因子とは挙動を一つにすることがない位置に存在する、 という構成を有す るものであり、 これを用いて植物細胞中へ遗伝子導入を行うと、 目的遺伝子と共 に導入されたマーカー遺伝子は、 その発現後に一定の確率で、 これが存在し、 機 能していた D N A上から脱離してその機能を失い、 しかもそのマーカー遣伝子の 機能の発現も消失も、 これが導入された植物細胞に由来する組織の形態変化とし て検出することができる。 即ち、 このマーカー遺伝子が発現している細胞から由 来して形成された組織は、 なにがしかの異常な形態を示し、 また、 その後かかる 組織から、 このマーカー遺伝子が脱離して機能を消失した細胞 （換言すれば目的 遺伝子のみが導入されている細胞） が生じた場合には、 正常な形態をした組織が、 この細胞に由来して再び出現するようになるのである。 それ故このベクターは、 目的遺伝子のみが導入されている細胞からなる植物組織、 さらには植物体を、 遺 伝子導入細胞の培養と、 培養して得られた組織の肉眼による選抜とを繰返すだけ で得ることを可能とする。
しかし、 本発明者らの開発したこのベクターにおいても、 マーカー遺伝子の脱 離を任意に制御することはできなかった。 そのため、 脱離能を有する D N A因子 の能力が高い場合には、 マーカー遺伝子が極めて速やかに脱離して、 例えば、 目 的遺伝子と共に植物細胞へ導人した直後、 その発現前にマーカ一遺伝子が脱離し てしまうことも起こり得たが、 こうなると、 目的遺伝子のみが導入されている細 胞からなる組織が得られたとしても、 マーカ一遺伝子の働きによる遺伝子導入組 織の形態変化は全く起こらず、 結局、 かかる組織を選抜することができなくなる。 また、 マーカー遣伝子の脱離が任意に制御できたならば、 目的遺伝子のみが導 入されている細胞の発生、 そしてかかる細胞からなる植物組織の発生を同期させ たり、 適宜調整することも可能となるので、 実際にこのようなベクタ一を使用し て遺伝子導入植物を作出等する上で、 非常に便利となる。
従って本発明の目的は、 マ一カー遺伝子を有し、 かつ、 目的遗伝子と共に植物 細胞へ導入されたこの遗伝子を、 その発現後に必要に応じて、 これが存在し、 機 能する染色体等の D N Aから除去してその機能を消失させることができ、 しかも かかるマーカー遺伝子の機能の発現 ·消失を、 その導入された植物細胞に由来す る組織の形態変化により検出することができる、 植物への遣伝子導入用べクタ一 を提供することにある。 発 明 の 開 示
本発明の目的は、 マーカー遺伝子として形態異常誘導遺伝子を用い、 また脱離 能を有する D N A因子を発現誘導型の調節因子の制御下において、 形態異常誘導 遗伝子がこの脱離能を有する DN A因子と挙動を一つにする位置に存在し、 かつ、 目的遺伝子がこの脱離能を有する DN A因子とは挙動を一つにすることのない位 置に存在するようべクタ一を構築することにより、 達成することができる。
以下、 本発明について詳細に説明する。
ここで形態異常誘導遺伝子とは、 植物の組織に、 矮化、 頂芽優勢の崩壊、 色素 の変化、 根頭癌腫、 毛状根、 葉の波打ち等の、 通常と異なる形態分化を引起こす 遺伝子を意味する。 例えば、 これらの形態異常誘導遺伝子としては、 すでに、 丄 p t ( i sopenteny 1 transferase) 遺伝子 (A. C. Smigock し. D.0wens、 Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, 85:5131、 1988) 、 i a a M (tryptophan monooxygenase) 遺伝子 （H. J. Klee et al.、 GENES & DEVELOPMENT, 1:86、 1987) 、 g e n e i遺伝子 （H. koerber et al. , EMBO Journal, 10:3983、 1991) 、 g e n e 6 b遗伝子 (P. J. J. Hooyaas et al.、 Plant Mol.Biol.、 11:791、 1988) 、 及び r o l A〜Dの r o l遺伝子群 (F.F.White et al.、 J. Bacteriol.、 164:33、 1985) 等、 それぞれ特異的な遗伝子が、 各種の植物に癌 腫、 奇形腫 （すなわち不定芽 ·不定根等の形成） を引起こす細菌である、 ァグロ パクテリゥム等に存在していることが報告されており、 また、 シユードモナス * シリンカェの亜種 (Pseudomonas syringae subsp. savastanoi) では i a a L ( indoleacetic acid - lysine synthetase ) 遺伝子 (A. Spena et al. N Mol. Gen. Genet.、 227:205、 1991) の存在が、 さらに種々の植物からもホメオボ ックス遗伝子ゃフィ トクローム遗伝子等の存在が報告されている。
これらの遣伝子は、 いずれも本発明において使用することができるが、 中でも 特に、 頂芽傻勢の崩壊を引き起こす i P t遺伝子や、 毛状根の形成、 及び毛状根 から再生した植物の矮化ゃ葉の波打ち等を引き起こす r o 1遺伝子群は、 種々の 形態異常誘導遺伝子の中でも特徴的な形態の異常を引き起こすことから、 本発明 に使用するマーカ一遗伝子として好ましい。
さらに、 これらの形態異常誘導遺伝子はまた、 互いに組み合わせることにより、 それが導入された特定の植物に、 不定芽 ·不定根等の特定の構造を再分化させる よう設計することも可能である。 本発明においては、 このような遺伝子の組み合 わせを利用し、 遗伝子導入のターゲッ トとなる植物の種類等、 遺伝子導入植物の 作成条件に応じて形態異常誘導遺伝子を構築し、 用いることもできる。
また、 脱離能を有する D N A因子とは、 これらが存在し、 機能する染色体 D N A等から、 それ自身が脱離し得る能力を有する D N A配列をいう。 植物ではこの ような因子として、 染色体上に存在するトランスポゾンと呼ばれるものが知られ ており、 その構造と働き、 そしてその挙動もほぼ判明している。 すなわち、 トラ ンスポゾンが機能するためには、 原則として、 その内部にある遣伝子から発現し、 それ自身の脱離及び転移を触媒する酵素 （転移酵素） と、 やはりその内部の末端 領域に存在し、 この転移酵素が結合し作用する D N A配列という、 2つの構成要 素が必要とされる。 これらの働きにより、 トランスポゾンはその存在する染色体 上から脱離し、 その後、 普通は D N A上の新たな位置に転移するが、 一定の確率 で転移できぬままその機能を失い、 消失等する場合も生ずるので、 本発明ではこ のようなトランスポゾンの転移ミスを利用する。
なお、 トランスポゾンには、 このような自律性トランスポゾン、 すなわち、 転 移酵素と D N A結合配列という 2つの要素を保持していて、 トランスポゾン内部 から発現する転移酵素が末端領域に存在する D N A配列に結合して作用すること により、 自律的にその存在する染色体上から脱離して転移しうるものの他、 非自 律性トランスポゾンと呼ばれるタイプもある。 この非自律性トランスポゾンとは、 転移酵素が結合し作用する末端の D N A配列は保持しているものの、 内部にある 転移酵素遺伝子に変異が生じており、 転移酵素の発現がないため、 自律的に染色 体上から脱離することができないものをいうが、 し力、し、 非自律性トランスポゾ ンも、 自律性トランスポゾンあるいはこれとは独立して存在する転移酵素遺伝子 から転移酵素が供給されると、 自律性トランスポゾンと同様の挙動を示すことと なる。
従って、 本発明においては、 自律性、 非自律性のいずれのトランスポゾンを使 用することもできる。 つまり、 非自律性のトランスポゾンを用いる場合には、 そ の内部に、 形態異常誘導遗伝子の他、 自律性トランスポゾン等から取得、 または 合成した転移酵素遺伝子を挿入して使用すればよい。
現在、 単離されている自律性トランスポゾンとしては、 トウモロコシより単離 された A c と S p mがあり、 詳細な解析がなされている （A.Gieri and H. Saedler. Plant Mol. Biol. 19:39、 1992) 。 とりわけ A cは、 トウモロコ シの染色体中、 w X— m 7遗伝子座を制限酵素 S a u 3 Aで切出すことにより得 ることができる (U. Behrens et al.、 Moし Gen. Genet.、 194:346、 1984) 、 植物 トランスポゾンの中では最も解析の進んでいる自律性トランスポゾンであり、 そ の DN Aシーケンスも既に解明されているので （M.Mueller-Neumann et al.、 Mol. Gen. Genet.、 198:19、 1984) 当業者が容易に取得可能なことから、 本発明に 使用する DNA因子として相応しい。 また、 非自律性トランスポゾンとしては、 それぞれ A c、 S pmの内部領域が欠損したものである、 D sや d S pmを始め
(H. -P. Doering and P. Starl ingerヽ Ann. Rev. Genet.、 20:175、 1986) 種々のも のが、 トウモロコシ以外にも、 キンギヨソゥ、 アサガオ等の多くの植物から単離 されている （例えば、 Y. Inagaki et al.、 Plant CelK 6:375、 1994) 。 ちなみ に、 これらのトランスポゾンは、 その由来する植物と異なる種類の植物の染色体 に導入された場合でも、 その能力を発揮して脱離し、 転移することが多くの例で 知られている （例えば、 B.Baker et al.、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:4844、 1986) o
さらに、 植物以外に存在する脱離能を有する DNA因子としては、 部位特異的 組換え系 (site-specific recombination system) に由来するもの力《知られてい る。 この部位特異的組換え系は、 特徴的な DNA配列を有する組換え部位 （本発 明の脱離能を有する DNA因子にあたる。 ） 、 及びこの DNA配列 （組換え配 列） に特異的に結合して、 その配列が 2以上存在したとき、 その配列間の組換え を触媒する酵素、 という 2つの要素からなっており、 そして、 この組換え配列が 同一 DN A分子上に、 同一方向を向いてある一定の間隔で 2か所存在している場 合には、 これに挟まれた領域がこの DN A分子 （プラスミ ド、 染色体等） 力、ら脱 離し、 またこの配列が対向する方向を向いて 2か所存在している場合には、 この 領域が反転する、 という挙動を示す。 本発明では、 この前者の脱離作用を利用す るが、 このような組換え部位の脱離 ·反転は、 部位特異的組換え系によるいわゆ る相同的組換えの結果として生ずるものであり、 これが、 転移の過程としてその 脱離を起こす、 トランスポゾンを用いた場合の機構ともっとも異なる点である。 なお組換え酵素をコードする遗伝子は、 必ず組換え部位と同一の DNA分子上に 存在する必要はなく、 これと同一細胞内に存在し、 発現していさえすれば、 この 組換え配列間の脱離 '反転を生ぜしめ得ることが知られている （N. L.Craig Annu. Rev. Genet. 、 22:77、 1988) 。
現在、 部位特異的組換え系はファージ、 細菌 （例えば大腸菌） 、 酵母等の微生 物から分離された C r e/ 1 0 x系、 p S R 1系、 F L P系、 c e r系、 f i m 系等が知られているが （総説として、 N. L. Craig、 Annu. Rev. Genet.、 22:17、 1988) 、 高等生物ではまだその存在を知られていない。 しかし、 これらの微生物 から分離された部位特異的組換え系も、 P 1ファージ由来の C r eZ 1 0 X系力 植物への遗伝子導入用ベクターに利用されて、 植物中でもその機能を発揮するな ど （国際公開 W093/01283号公報） 、 その由来する生物種と異なる生物種 （植物を 含む） に導入された場合でも、 そのそもそもの生物内における挙動と同一の挙動 をとるこ とが知られている。 ちなみに本発明の実施例では、 酵母 （ Zygosaccharomyces rouxi i) の部位特異的組換え系である p S R 1 系 （ H. Matsuzaki et al.、 J. Bacteriology, 172:610、 1990) を、 その組換え部位に 組換え酵素を挿入して利用したが、 この p SR l系もまた、 高等植物においてそ の本来の機能を発揮することがすでに報告されている （H. Onouchi et aし Nucleic Acid Res.、 19:6373、 1991) 。
本発明においては、 この脱離能を有する DNA因子を発現誘導型の調節因子の 制御下にね \ o
即ち、 細菌等の原核生物から酵母、 カビ、 高等植物、 哺乳類等の真核生物に至 る全ての生物の遗伝子には、 その構造遺伝子の上流領域に発現誘導型の調節因子 が存在し、 これらが単独で、 あるいは幾つかが協働して機能することにより、 あ る遺伝子または遺伝子群の発現を制御しており、 例えば、 時には個体の分化や発 育のステージに応じ、 時には熱、 光、 金属等の様々な環境要因に応じて、 遗伝子 発現のオン ·オフを行っている。 本発明ではこのような働きを有する発現誘導型 の調節因子を利用し、 この下流域に脱離能を有する DN A因子を配置して、 その 発現、 つまりは脱離能を制御するのである。
かかる発現誘導型の調節因子としては現在までに、 化学物質に反応するものと してグルタチオン一 S—トランスフェラ一ゼ I系遺伝子のプロモータ一 （特開平 5-268965号公報） 、 グルタチオン一 S— トランスフェラーゼ I I系 （GST— I I ) 遗伝子のプロモーター （国際公開 W093/01294号公報） 、 T e t リブレッサー 融合型力リフラヮ一モザイクウィルス 3 5 Sプロモータ一 （C. Gatz et al.、 Mol. Gen. Genet.、 227:229、 1991) 、 L a cオペレータ一/リプレッサー系プロ モーター （R. J.Wilde et al.、 The EMBO Journal, 11:1251、 1992) 、 a 1 c R /a l e A系プロモーター (国際公開 W094/03619号公報） 、 グルココルチコイ ド 系プロモータ一 （青山卓史、 蛋白質 核酸 酵素、 41:2559、 1996) 等が、 熱に 反応するものとして h s p 8 0プロモータ一 （特開平 5- 276951号公報） 等が、 そ して光に反応するものとしてリブロース 2 リン酸カルボキシラーゼ小サブュニッ ト遺伝子 （丄 b c S) のプロモーター （R. Fluhr et al.、 Proc. Natl. Acad. Sci. U SA、 83:2358、 1986) 、 フルク トースー 1、 6—ビスホスファターゼ遺伝子のプ 口モータ一 （特表平 7-501921号公報） 、 集光性クロロフィル a/b結合タンパク 質遗伝子のプロモータ一 （特開平 5-89号公報） 等が知られている。
このうち、 高等植物の発現誘導型調節因子として最も研究が進んでいるのは丄 b c Sのプロモーターであり、 C h u aらにより詳細な解析が行われている （例 えば、 松岡、 植物細胞工学臨時増刊、 3:552、 1991を参照） 。 それ故、 本発明の 実施例 1でもこの調節因子を使用したが、 この因子がいかにして光による遗伝子 発現調節を行うかは、 現状ではまだ確定していない。 一方、 GST— I I遗伝子 のプロモーターを代表とする化学物質反応性のプロモーターは、 遗伝子発現の誘 導を化学物質の存在量によつて比較的自由に制御できるため、 熱や光を調節して 遺伝子発現を制御しなければならない、 熱あるいは光反応性のプロモーターより も、 実用上、 使いやすいというメリッ トを有する。
なお本発明において、 形態異常誘導遗伝子を挿入する場所は、 脱離能を有する DN A因子と共に、 これが脱離し得る位置でありさえすればよい。 例えば、 脱離 能を有する DN A因子としてトランスポゾンを用いた場合には、 転移酵素遗伝子 のプロモーター領域より上流で、 この転移酵素が結合する末端領域よりは下流の、 トランスポゾンの脱離に影響を及ぼさない位置にこれを挿入することができる。 また p SR 1系を用いた場合には、 組換え配列に挟まれた領域内で、 組換え酵素 の発現を阻害しない位置でありさえすれば、 これをどこにでも挿入することがで きる。
本発明のベクターは、 遺伝子工学的手法により遺伝子導入が可能な、 いかなる 植物においても用いることができ、 また、 本発明のベクタ一により植物に導入で きる目的遺伝子は、 農業的に優れた形質を付与できる遺伝子、 農業的に優れた形 質を付与するとは限らないが、 遺伝子発現機構の研究に必要とされる遺伝子等、 目的に応じて種々選択することができる。
また、 かかる目的遺伝子のプロモーター、 ターミネータ一については、 植物に おいて機能するものでありさえすれば、 別に制限なく使用することができる。 例 えば、 このようなプロモーターとしては、 カリフラワーモザイクウィルスの 3 5 Sプロモーター （J.T.Odell et al.、 Nature (London) 、 313:810、 1985) 、 ノ パリン合成酵素のプロモーター （W.H. R. Lang idge et al.、 Plant Cell Rep.、 4:355、 1985) 等を、 またタ一ミネ一ターとしては、 ノパリン合成酵素のポリア デニル化シグナル (A. Depicker et al.、 J. Mol. Appl. Gen. , 1:561、 1982) 、 ォク トビン合成酵素のポリアデニル化シグナル （J.Gielen et al.、 EMBO J.、 3:835、 1984) 等を使用することができる。
さらに、 本発明において使用する遺伝子、 すなわち DNAは、 c DNAまたは ゲノム DN Aのクローニングにより得ることができる力く、 あらかじめそのシーケ ンスが明らかにされているものであれば、 これを化学合成して得ることもできる。 本発明のベクターは、 植物に感染するウィルスや細菌を介して、 植物細胞に間 接的に導入することができる （【.Potrykus、 Annu. Rev. Plant Physiol. Pla Mol. Biol. 、 42:205、 1991) 。 この場合、 例えば、 ウィルスとしては、 カリフ ラヮーモザイクウィルス、 ジヱミニウィルス、 タバコモザイクウィルス、 ブロム モザイクウィルス等が使用でき、 細菌としては、 ァグロパクテリゥム .ッメファ シエンス （以下、 A. ッメファンエンスと略す。 ） 、 ァグロパクテリゥ厶 . リゾ ジェネス等が使用できる。 なおァグロパクテリゥム属は、 一般に単子葉植物には 感染せず、 双子葉植物にのみ感染するとされているが、 最近では、 これらを単子 葉植物へ感染させて遺伝子導入を行った例も報告されている （例えば、 国際公開 W094/00977号公報) 。 本発明のベクタ一はまた、 マイクロインジェクション法、 エレク トロポレーシ ヨン法、 ポリエチレングリコール法、 融合法、 高速バリスティ ックベネトレーシ ョン法等の物理的 ·化学的手法によっても、 植物細胞に直接導入することができ る ( I. Potrykus. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.、 42 :205、 1991) 。 単子葉植物の多くゃァグロバクテリウムの感染しにくい双子葉植物に対しては、 遺伝子導入法として汎用されているァグロパクテリゥムを用いた間接導入法が使 用できないため、 これらの直接導入法が有効である。
〔作用〕
本発明において、 マ一カー遣伝子として用いた形態異常誘導遺伝子は、 これが 発現することにより、 その導入された植物細胞において、 植物成長ホルモンの異 常生産等、 その細胞内の生理状態に異常をもたらし、 結果としてその増殖 ·分化 の方向を狂わせ、 これに由来して形成される組織に様々な形態異常を引き起こす。 つまり、 ここで生じる異常な形態をした組織、 例えば項芽優勢の崩れた無秩序な 芽の集合体 （多芽体） や毛状根等は、 こうした形態異常誘導遺伝子が導入された 細胞に由来し、 これが異常な増殖 ·分化をした結果生じたものであるので、 この 遺伝子を有する細胞のみからなっている。 従って、 これをマーカ一遗伝子として 目的遗伝子と共にベクターを構築し、 このベクターを植物細胞に導入してこの細 胞を培養しさえすれば、 これから生じる異常な形態を示す組辙を肉眼で選抜する ことのみにより、 マーカ一遣伝子、 つまりは目的遺伝子が導入された細胞だけか らなる組織を選抜できることとなる。
さらに本発明では、 この形態異常誘導遗伝子を、 発現誘導型の調節因子の制御 下におかれた脱離能を有する D N A因子と挙動を一つにする位匱に組込んで用い る。 かかる構成を有するベクターを用いて植物に遺伝子を導入すれば、 導入後、 その植物細胞に熱、 光、 化学物質等、 使用した発現誘導型調節因子に応じた適当 な刺激を人為的に加えることで、 脱離能を有する D N A因子を発現させることが でき、 その結果、 マーカー遗伝子である形態異常誘導遣伝子はこの D N A因子と 共に、 それらが導入され機能していた D N A上から、 一定の確率で脱離してその 機能を失い、 一方、 これとは挙動を一つにしない目的遺伝子は同じ D N A上に残 留して機能を保持し続ける、 つまり、 目的遺伝子のみが発現可能に導入されてい る細胞が得られることになる。
しかもこのマーカー遺伝子、 つまり形態異常誘導遺伝子の機能の消失は、 遗伝 子導入の際と同様に、 遺伝子導入組織の形態の変化として肉眼で検出できること から、 マーカー遺伝子の機能の消失した細胞だけからなる組織、 換言すれば、 目 的遺伝子のみが発現可能に導入されている細胞だけからなる組織は、 確実 ·容易 に選抜できることとなる。 すなわち、 かかる細胞だけからなる組織を得るために は、 まず、 遺伝子導入処理後の細胞を培養して、 形態異常誘導遺伝子の発現によ り生じてくる多芽体、 毛状根等、 異常な形態を示す組織を肉眼で選抜し、 これを 分離する。 そして、 その分離した組織の培養中に、 必要に応じて、 使用した発現 誘導型調節因子に応じた適当な刺激を加えてやれば、 これらの形態異常を示す組 織から今度は正常な形態を示す組織が生じてくるので、 これをやはり肉眼で選抜 すればよい。 図面の簡単な説明
図 1は、 pNP I 206作成スキムのうち、 pNP I 20 1の作成までを示す 図である。 図 2は、 pNP I 206作成スキムのうち、 pNP I 20 1から pN P I 203の作成までを示す図である。 図 3は、 pNP I 206作成スキムのう ち、 pNP I 203から pNP I 204の作成までを示す図である。 図 4は、 p NP I 206作成スキムのうち、 PNP I 204から PNP I 206の作成まで を示す図である。 図 5は、 p NP I 206の構造のうち、 T— DNA領域の制限 酵素地図である。 図 6は、 pNP I 125の作成スキムである。 図 7は、 pNP I 128の作成スキムである。 図 8は、 pNP I 1 23作成スキムのうち、 p I PT 2の作成までを示す図である。 図 9は、 pNP I 123作成スキムのうち、 p I PT 2から p I PT 3の作成までを示す図である。 図 10は、 pNP I 12 3作成スキムのうち、 p I PT3から p I PT 4の作成までを示す図である。 図 1 1は、 pNP I 123作成スキムのうち、 P I PT4から pNP I 123の作 成までを示す図である。 図 12は、 pNP I 303作成スキムのうち、 pNP I 200及び pG 1 E 7から pNP I 301の作成までを示す図である。 図 13は、 pNP I 303作成スキムのうち、 pNP I 1 23及び pNP I 1 28から p I PT 8の作成までを示す図である。 図 1 4は、 pNP I 30 3作成スキムのうち、 pNP I 30 1及び p I ΡΤ 8から pNP I 3 0 2の作成までを示す図である。 図 1 5は、 pNP I 303作成スキムのうち、 ΡΝΡ Ι 3 02から ρΝΡ Ι 30 3の作成までを示す図である。 発明を実施するための最良の形態
〔実施例〕
以下に、 本発明を実施例に基づいて説明する。 なお、 以下の実施例において、 更に詳細な実験操作は、 特に述べる場合を除き、 モレキュラー . クローニング第 2版 (Sambrook et al.eds.、 Cold Spring Harbar Laboratory Press. New York, 1989) 、 又は製造業者の取扱い説明書に従い行われた。
[実施例 1 ]
I. ベクターの作成
特願平 7 - 3 1 3 43 2において得られた p NP I 1 2 5より、 酵母の部位特 異的組換え系 （p SR l系） の組換え酵素遺伝子 （以下、 R遺伝子とする。 ） と これに連結されたノバリン合成酵素ポリアデ二ル化シグナルを制限酵素 Xb a I 及び E c o R Iで切出し、 これを pHSG 3 9 8 (宝酒造 （株） より購入） の b a I -E c o R I制限酵素部位間に挿入してプラスミ ド p N P I 2 00を得た。 一方、 リブロース一 1、 5—ビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニッ ト遗伝 子のプロモーター (r b c S- 3 B) を含むプラスミ ド （名古屋大学 杉田護氏 より譲渡） を制限酵素 Kp n Iで切断し、 その切断により生じた突出末端を T 4 ポリメラ一ゼ I (大サブュニッ ト） にて平滑化した後、 ここに 5 ' リン酸化 S a 丄 I リンカ一を揷入してプラスミ ド pRBCSを作成し、 この pRBCSから丄 b c S- 3 Bを制限酵素 S a 1 Iで切出して p N P I 20 0 OS a 1 I制限酵素 部位に挿入し、 プラスミ ド pNP I 20 1を得た。
なお、 この r b c S— 3 Bは、 卜マ ト （Lycopersicon esculentum VFNT LA1221) に由来する光反応性のプロモータ一である。 トマトは r b c Sの発現誘 導型調節因子として、 この他に 5種類の同様のプロモーターを有しているが （丄 b c S - 1、 — 、 —_ 、 一 、 - 3 C) 、 その発現様式は杉田らにより解析 されている (M. Sugita et aし、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:7104、 1987) 。 次に、 この pNP I 2 0 1を制限酵素 P s t I及び B amH Iで切断し、 その 突出末端を T 4ポリメラ一ゼ I (大サブュニッ ト） にて平滑化した後、 再連結し て、 これをプラスミ ド PNP I 2 02とした。 この PNP I 2 0 2より、 r b c S - 3 B、 R遺伝子及びノパリン合成酵素ポリアデニル化シグナルを含む断片を 制限酵素 E c oR Iと H i n d I I Iで切出し、 これを pUC 1 1 9 (宝酒造 (株） より購人） の E c oR I -H i nd I I I制限酵素部位間に挿入して、 プ ラスミ ド PNP I 20 3を作成し、 さらにこの pNP I 203より、 再び r b c S - 3 B、 R遺伝子及びノパリン合成酵素ポリアデニル化シグナルを含む断片を 制限酵素 E c o R Iと H i n d I I Iで切出して、 特願平 7— 3 1 3 4 32にお いて得られた pNP I 1 2 8の E c 0 R I -H i n d I I I制限酵素部位間に揷 入することにより、 プラスミ ド pNP I 204を得た。
そしてこの PNP I 2 0 4の H i n d I I I制限酵素部位に、 やはり特願平 7 - 3 1 34 3 2において得られた pNP I 1 2 3より制限酵素 H i n d I I Iに て切出した、 力リフラワーモザィクウィルス 3 5 Sプロモーター （C aMV 3 5 Sプロモーター） とこれに連結された i p t遺伝子を含む断片を挿入して、 ブラ スミ ド PNP I 20 5を得た。
目的とするベクターは、 この PNP I 2 0 5から、 C aMV 3 5 Sプロモータ 一に連結された i p t遺伝子、 r b c S- 3 Bに連結された R遺伝子及びノパリ ン合成酵素ポリアデニル化シグナル、 そしてこれらの両端にある酵母の部位特異 的組換え系の組換え配列 R sを制限酵素 P s t Iで切出して、 植物への遺伝子導 入用ベクタープラスミ ド p B I 1 2 1 (東洋紡績 （株） より購入） の S s e I制 限酵素部位に揷入することにより得られ、 これをプラスミ ド pNP I 206と命 名した。 このプラスミ ドを有する A. ッメファシエンスを植物に感染させた場合、 その構造の内、 いわゆる T一 DNA領域と呼ばれる RBサイ 卜と LBサイ 卜の内 側、 ここでは n p t I I遺伝子 （ネオマイシンリン酸化酵素遺伝子） 部位から G US遣伝子 （/S—ガラク トシダーゼ遗伝子） 部位にかけての約 1 2. 5 k bの領 域が植物染色体に組込まれることになる。
なお、 このプラスミ ド p NP I 206は、 大腸菌 （Escherichia coli) JM 1 0 9株に導入し、 この大腸菌を E. c o l i JM1 09 (pNP I 206) 〔通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （〒 305 日本国茨城県つく ば巿東一丁目 1番 3号） 、 国際受託番号： FERM BP— 55 1 8、 平成 8年 ( 1 996年） 4月 24日にブタぺス ト条約に基づく原寄託〕 として、 国際寄託 に付した。
pNP I 206の作成スキムを図 1〜4に、 その T— DNA領域の制限酵素地 図を図 5に示す。 また、 pNP I 125の作成スキムは図 6、 pNP I 128の 作成スキムは図 7、 pNP I 1 23の作成スキムは図 8〜1 1に示した。 なお、 これらの図中、 35 S— Pはカリフラワーモザィクウイルスの 35 Sプロモータ 一、 NOS— Pはノパリ ン合成酵素のプロモータ一、 Tは同じくノパリ ン合成酵 素のポリアデニル化シグナル、 丸で囲つた Tは i p t遺伝子自身のポリアデニル 化シグナルであり、 網かけした三角形は組換え配列 R sとその配列方向を表して いる。
図 5より明らかなように、 このプラスミ ドは T一 DNA領域、 即ち植物染色体 に組込まれることになる領域内に、 マーカー遺伝子として i p t遺伝子を、 目的 遺伝子のモデルとして n p t I I遺伝子及び GU S這伝子を有している。 この丄 p t遺伝子は、 病原性 A. ッメファンエンスが保持する腫瘍化遺伝子の一員であ り、 これを植物細胞に導入すると、 植物ホルモンの一種であるサイ トカイニンの 過剰生産が起こり、 その細胞の分化の方向が多芽体形成に向かうことになる。 ま た、 n P t I I遗伝子はカナマイシン抵抗性に寄与する遗伝子として、 GUS遗 伝子はこれを有する細胞が特殊な基質を代謝して青色の色素を生産することから、 ともに植物における遺伝子発現の解析に汎用されている遗伝子である。
そして、 このプラスミ ドにおいて脱離能を有する DNA因子として機能するの は、 酵母の部位特異的組換え系である p SR 1系の組換え配列、 Rs間の領域で あり、 それ故、 i p t遺伝子は、 同一方向を向いたこの二つの組換え配列 R sに 挟まれた形で挿入されている。 しかし同時に、 R s間の脱離を触媒する酵素の遗 伝子である R遺伝子は発現誘導型の調節因子、 即ち光反応性プ口モータ -rb c S - 3 Bの下流域に連結されており、 そのためこのプロモーターの制御を受けて、 適当な光条件下でなければこれが発現しないように、 つまり R s間の脱離が起こ らないようになっている。
II. ァグロパクテリゥムへの pNP I 20 6の導入
A. ッメファシエンス L B A 4404 ( C L 0 N T E C H社より購入） 株を、 1 Om lの YEB液体培地 （ビーフエキス 5 g/し 酵母エキス 1 g/ 1、 ぺプ トン l g/ l、 ショ糖 5 g/ l、 2 mM Mg SO< 、 2 2 での p H 7. 2 (以下、 特に示さない場合は、 22°Cでの pHとする。 ） ） に接種し、 OD630 が 0. 4から 0. 6の範囲に至るまで、 28でで培養した。 培養液を 690 0 X g、 4°C、 1 0分間遠心して集菌した後、 菌体を 2 0m lの 1 OmM T r i s -He 1 (pH 8. 0) に懸濁して、 再度 6 9 00 x g、 4 、 1 0分間の遠心 で集菌し、 次いでこの菌体を 200 1の YEB液体培地に懸濁して、 これをプ ラスミ ド導入用菌液とした。
ァグロパクテリゥムへのプラスミ ド pNP I 20 6の導入は、 1 5m lチュー ブ （フアルコン社） 内で、 このプラスミ ド導入用菌液 200 u Iと Iで作成した p NP I 20 6 6 gを混合し、 これを、 あらかじめ液体窒素中で 30-40 分間冷却しておいたエタノールにチューブごと 5分間浸して冷却した後、 29で の水浴中に 2 5分間置き、 次いで、 7 50〃 1の YE B液体培地を加えて、 29 °Cで 1時間、 振盪培養することにより行った。
III. ァグロバタテリゥムからタバコへの p N P_I 2_ 0 6の導入
及び pNP I 2 0 6が導入されたタバコ細胞の培養と得られた組織の形態 温室内で生育させたタバコ (Ntcotiana tabacum cv. SRI) の成葉を、 1 v/ V %次亜塩素酸ナトリウ厶水溶液に 5分間浸漬して殺菌し、 滅菌水で 3回洗浄し た後、 中脈を取り除いて約 8 mm角の葉片となるように調製した。
このタバコ葉片を、 IIにおいて p NP I 20 6を導入した A. ッメファシェン ス LBA 44 04の菌液 （OD63。 = 0. 2 5、 Y E B液体培地にて一夜培養後、 滅菌水で希釈して菌体濃度を調整。 ） に約 1分間浸してこれに感染させ、 滅菌し た濾紙の上に置いて余分な菌液を除いてから、 ァセトシリンゴン 50 mg/ 1を 添加した植物ホルモンを含まない （ホルモンフ リー） M S寒天培地 （ T. Murashige and F. skoogヽ Physiol. Plant.、 15:473、 1962、 但し、 寒天 0. 8 wZv%を添加。 ） に、 葉の裏が上になるように置床して、 喑所で 3日間、 2 5 °C (以下、 特に記さない限り、 植物組織の培養温度は全て 2 5 °Cにて行った。 ） で培養した。 次いで、 これを、 カルペニシリ ン 5 0 0 m g Z 1のみを含むホルモ ンフリー M S寒天培地に移植し、 光量約？〜 1 0 μ mol s— 1 m—2で、 同組成の培 地に植え継ぎをしつつ培養したところ、 感染 3ヶ月後には多芽体 2 2 5系統を得 ることができたので、 内 1 2 6系統を 2分割して、 それぞれ、 光量約？〜 1 0 mo l S— ' 又は光量約 7 0 mo l s— 1 πΓ 2の条件下、 同組成の培地を用いてさ らに培養を続けた。
その結果、 光量約 7 0 n mol s— 1 m 2で培養した系統においては、 感染から約 6ヶ月後に 4 3系統の多芽体から、 肉眼で見て正常な形態をしたシュート （以下、 正常体という。 ） が発生したが、 光量約？〜 1 0 mol s—1 m 2で培養した系統 では、 同じ期間の経過後に 1 2系統が正常体を発生させたのみであった。
結果を表 1に示す。
表 1 . p N P I 2 0 6 形質転換タバコ培養組織における正常体の発生率と光条件
Figure imgf000019_0001
L 2 条件で 3 力 月培養後、 L 〗 または L 2 条件で 3 ヶ 月培養
* 1 光条件 L 2 ： 光量約 了 〜 1 0 mo I s~ ' m"2
L 1 ： 光量約 了 0 M mo I s— ' m~ 2
氺 2 (正常体を発生させた系統数 Z光条件を検討した多芽体の系統数） 100
この表より明らかなように、 本発明のベクタ一 pNP 1 206により遗伝子導 入したタバコ培養組織を、 低光量条件で培養した後、 高光量条件で培養した場合 には、 低光量条件で培養を続けた場合に対し、 正常体発生率が 4倍近く高く、 こ の pNP I 206により遗伝子導入された組織において、 マーカー遺伝子である 形態異常誘導遺伝子の挙動が、 脱離能を有する DNA因子の制御に用いた、 光反 応性プ口モータ一である r b c S— 3 Bにより制御され、 遗伝子導入組織を低光 童条件から高光量条件に移すことにより、 その脱離が促進されたことを示してい る o
[実施例 2 ]
I. ベクターの作成
実施例 1で得られた pNP I 200を P s t Iで切断し、 その切断により生じ た両突出末端を T 4ボリメラーゼ I (大サブユニッ ト） にて平滑化した後、 ここ に、 pG l E7 (ZE NEC A社より譲渡） から制限酵素 Nd e Iで切出し、 や はりその両突出末端を T 4ポリメラ一ゼ I (大サブユニッ ト） にて平滑化させた、 GST— I Iの 27 kDサブュニッ ト遗伝子 （G ST— I I— 27 ) のプロモー タ一 （特表平 6— 5 1 1 385号公報 第 7頁右下攔第 15〜 17行。 ） を挿入 して、 プラスミ ド pNP I 300を作成した。 続いて、 この p NP I 300から、 G ST- I 1— 27プロモーター、 R遗伝子及びノパリン合成酵素ポリアデニル 化シグナルを含む断片を制限酵素 E c 0 R Iで切出し、 これを PUC 1 8 (宝酒 造 （株） より購入） の E c 0 R I制限酵素部位に揷入して、 ブラスミ ド pNP I 30 1を得た。
なお、 GST— I Iとは、 除草剤解毒性に関与する GSTのァイソザィ厶のう ちの一つであって、 トウモロコシ等に存在する酵素である。 また、 GST— I I - 27プロモーターは、 この GST— I Iのサブュニッ トのうち、 27 kDサブ ユニッ トの遺伝子発現を制御しており、 除草剤解毒剤、 例えば 2、 2、 5—トリ メチルー 3— (ジクロロアセチル） 一1、 3—ォキサゾリジンや、 その類縁体等 の化学物質の存在下、 GST— I I一 27の発現を誘導することにより GST— I I活性を劇的に上昇させ、 除草剤に対する抵抗性を高めることが、 このトウモ ロコシなどにおいて知られている （特表平 6— 5 1 1 385号公報） 。 一方、 pNP I 1 23より、 CaMV35 Sプロモーターとこれに連結された i p t遺伝子を制限酵素 H i n d I I Iで切出し、 これを、 pNP I 128の H i nd I I I制限酵素部位に挿入して、 プラスミ ド p I PT 8を作成した。 そし て、 この p I PT 8の E c oR I制限酵素部位に、 pNP I 30 1より制限酵素 E c 0 R Iにて切出した、 GST— I I— 27プロモータ一、 R遺伝子及びノバ リン合成酵素ポリアデニル化シグナルを含む断片を挿入し、 プラスミ ド pNP I 302を得た。
目的とするベクタ一は、 この PNP I 302から、 CaMV35 Sプロモータ 一に連結された i p t遺伝子、 GST— I I— 27プロモーターに連結された R 遺伝子及びノパリン合成酵素ポリアデニル化シグナル、 そしてこれらの両端にあ る酵母の部位特異的組換え系の組換え配列 R sを制限酵素 S s e Iで切出し、 植 物への遺伝子導入用ベクタープラスミ ド pB I 1 2 1の S s e I制限酵素部位に 揷入することにより得られ、 これをプラスミ ド p NP I 303と命名した。 即ち、 この pNP I 303は、 R遺伝子の調節因子として、 pNP I 206で用いた丄 b c S - 3 Bに代え、 G S T— I 1 -27プロモーターを用いたものである。 図 1 2〜1 5に、 pNP I 303の作成スキムを示す。 これらの図中、 用いた記 号は図 1〜1 1で用いたものと同様である。
なお、 このプラスミ ド pNP I 303もまた、 大腸菌 JM1 09株に導入し、 この大腸菌を E. c 01 i JM1 09 (PNP I 303) 〔通商産業省工業技 術院生命工学工業技術研究所 （亍 305 日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3 号） 、 国際受託番号： FERM BP— 5927、 平成 9年 （1 997年） 4月 23日にブタペスト条約に基づく原寄託〕 として、 国際寄託に付した。
II. タバコへの p NP I 303の導入
及び pNP I 303が導入されたタバコの解析
実施例 1の II、 111と同様にして、 プラスミ ド p NP I 303を A. ッメファ シエンス L B A 4404株に導入し、 この A. ッメファンエンスをタバコ葉片に 感染させ、 感染葉をァセトシリ ンゴン 50 mg/ 1含有ホルモンフリ一 MS寒天 培地に置床して、 3日間明所で培養した。 次いで、 この感染葉を、 カルべニシリ ンのみを 500 mg/ 1含むホルモンフリ一MS寒天培地に移植し、 同組成の培 地に植継ぎつつ培養を続けたところ、 多芽体を得ることができたので、 培養開始 から 2ヶ月後、 得られた多芽体のうち 3 0系統を 4分割して、 そのそれぞれを、 2、 2、 5—卜リメチルー 3— (ジクロロアセチル） 一 1、 3—ォキサゾリジン 0、 1 0、 2 0、 3 O mg/ 1を添加した、 カルべニシリン 5 0 O mg/ 1含有 ホルモンフリ一 MS寒天培地に置床し、 正常体の発生頻度を検討した。
この 2、 2、 5—トリメチル一 3— (ジクロロアセチル） 一 1、 3—ォキサゾ リジン添加培養 1 ヶ月後の結果を表 2に示す。 なお、 正常体の検出は肉眼により 行い、 また、 本実施例において目的遺伝子のモデルとして用いた、 GUS遺伝子 の発現を確かめるための GU S活性試験は、 Jeffersonらの方法に準拠して行つ た。
表 2 . PNPI303形質転換タ バコ培養耝橡における正常体の発生率
2, 2, 5-トリ ル- 3- ( ク noァ tチ JV)-1.3-ォキサ '/リジン添加濃度
Figure imgf000023_0001
2, 2.5 リメチ A-3- (ジク ODァセチ - 1.3 -才 ゾリ ン添加培養 1 ケ 月
* 1 正常体を発生させた系統の数
* 2 正常体と して生 じた シ ュ ー ト の数
* 3 正常体と して生 じた シ ュ ー ト のう ち、 G U S 活性を示 した個体数
表 2より明らかなように、 2、 2、 5—トリメチルー 3— (ジクロロアセチ ル） 一 1、 3—ォキサゾリジン無添加の場合には、 全く正常体が発生しなかった のに対して、 これを 1 OmgZ 1添加することにより正常体が発生し、 その発生 頻度は 2 Omg/ l添加で更に上昇した。 従って、 この場合においても、 脱離能 を有する DN A因子の制御に用いた、 化学物質反応性のプロモーターである G S T- I I - 27プロモーターは適正に機能し、 pNP I 303により植物組織に 遗伝子を導入してこれを適当な化学物質の存在下で培養すると、 脱離能を有する DNA因子の発現を誘導し、 その脱離、 ひいてはマーカー遗伝子である形態異常 誘導遺伝子の脱離を促すことがわかる。
一方、 正常体として生じたシュートのうち、 約半数は GUS活性の発現、 即ち、 目的遺伝子の存在と発現が確認されたものの、 残りの半数では G US活性を検出 することができなかっ 。 この理由については、 まだ明らかではないが、 例えば、 この pNP I 3 ϋ c DNA領域が、 タバコの染色体中に隣接して幾つか導 入されたとすると、 T一 DNA内の組換え配列 R s間ではなく、 互いに異なる T _DN Aに存在する組換え配列の間で相同的組換えが起こって、 この配列に挟ま れた領域が脱離することも考えられる。 このため、 脱離能を有する DNA因子と ともに脱離する領域に、 i p t遗伝子のみならず、 GUS遗伝子が結果的に含ま れることも起こり得る力 このような場合には、 本実施例のように、 多芽体から 得られた正常体であっても、 G US活性を示さないものが出現するであろう。 なお、 GUS活性を示した正常体のうち 1個については、 PCRを用い、 DN A分析を行って、 GUS遺伝子の存在と、 マーカー遗伝子である i p t遗伝子及 び脱離能を有する DN A因子の脱離を、 DN Aレベルにおいても確認した。 産業上の利用可能性
本発明のベクタ一を用いて植物細胞へ遺伝子導入を行うと、 目的遗伝子と共に 導入したマーカー遗伝子は、 導入後、 この細胞に熱、 光、 化学物質等の特定の刺 激が与えられることにより、 一定の確率で、 これが存在し機能していた DNA上 から脱離してその機能を失い、 目的遺伝子のみが、 同じ DN A上に発現可能に導 人されている細胞が得られる。 このため、 このベクターは、 導入しょうとする目 的遺伝子に関する部分を変更するのみで、 マーカ一遗伝子を始めとする他の構成 に何らの変更をも加えることなく、 ある一つの植物体へ遺伝子の多重導入を行う ために、 何度でも無制限に繰り返して用いることができる。
しかも、 マーカー遣伝子として形態異常誘導遺伝子を用いたことにより、 マー カー遣伝子が導入された細胞だけからなる組織、 即ち、 目的遺伝子が導入された 細胞だけからなる組織の選抜も、 そのマーカー遺伝子が機能を失った後の、 目的 遺伝子のみが発現可能に導入されている細胞だけからなる組織の選抜も、 すべて その組織の形態変化を指標として行うことができる。 従って、 目的遺伝子のみが 染色体等に導入されている細胞だけからなる組織を、 確実 *容易に選抜でき、 選 抜のための抗生物質等を培地中に添加する必要もないので、 選抜中に植物細胞の 活性低下を招くおそれもない。 このため遺伝子の多重導入は効率良く行え、 また、 かかる細胞だけからなる遺伝子導入個体、 すなわちマーカ一遺伝子の影響が排除 され、 その遺伝子産物がもたらす危惧から完全に解放された個体も、 交配過程を 経ることなく得ることができる。
さらに、 本発明のベクタ一においては、 マーカー遺伝子の脱離を人為的に調節 することができる。 従って、 このような調節ができないような場合には、 マーカ 一遺伝子の脱離があまりにも速やかに起こるため、 目的遺伝子のみ発現可能に導 入されている細胞だけからなる組織の取得が却って困難となる、 非常に脱離能に 優れた D N A因子も、 本発明の脱離能を有する D N A因子としてその能力を生か すことができる。 また、 そうでなくとも、 本発明のベクターを用いると、 かかる 細胞の発生、 そしてかかる細胞からなる植物組織の発生を必要に応じて同期させ たり、 適宜調整したりすることができるので、 実際に、 遺伝子導入植物を作成す る上では非常に便利となる。 例えば、 マーカー遺伝子である形態異常誘導遺伝子 として i p t遺伝子を用いた場合には、 これが導入された細胞はその働きにより、 植物ホルモン無添加の条件で極めて活発に増殖し、 不定芽等を分化するので、 目 的遗伝子のみが発現可能に導入されている細胞を望めばいつでも発生させること ができる組織を、 あえてその前段階のマーカー遗伝子を保持した状態で培養を続 けることにより大量に生産する、 ということもできるようになるのである。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 目的遺伝子をマーカー遺伝子と共に植物細胞中へ導入するためのベクターで あって、 マーカー遗伝子が、 その発現後に必要に応じて、 これが存在し、 機能す る DNAから除去されてその機能を消失し、 かつ、 マーカ一遣伝子の発現、 及び その機能の消失が、 その導入された植物細胞に由来する組織の形態変化により検 出可能である、 植物への遺伝子導入用ベクター。
2. 目的遺伝子、 マーカ一遗伝子として形態異常誘導遗伝子、 及び発現誘導型の 調節因子の制御下におかれた脱離能を有する DN A因子を含み、 かつ、 形態異常 誘導遺伝子はこの脱離能を有する D N A因子と挙動を一つにする位置に存在し、 また目的遺伝子はこの脱離能を有する DN A因子とは挙動を一つにすることがな い位置に存在する、 植物への遺伝子導入用べクタ一。
3. 形態異常誘導遺伝子が脱離能を有する DN A因子の内部に存在する、 請求の 範囲第 2項に記載の植物への遺伝子導入用ベクター。
4. 脱離能を有する DNA因子を制御する発現誘導型の調節因子が、 リブロース 2 リン酸カルボキシラーゼの小サブュニッ ト遺伝子 ( r b c S) のプロモータ一 である、 請求の範囲第 2項または第 3項に記載の植物への遗伝子導入用ベクター。
5. 脱離能を有する DN A因子を制御する発現誘導型の調節因子が、 グルタチォ ン一 S—トランスフェラ一ゼ I I系 （GST— I I ) 遗伝子のプロモータである、 請求の範囲第 2項または第 3項に記載の植物への遗伝子導入用べク夕一。
6. 脱離能を有する DNA因子が部位特異的組換え系に由来するものである、 請 求の範囲第 2項、 第 3項、 第 4項または第 5項に記載の植物への遗伝子導入用べ クタ一。
7. 形態異常誘導遺伝子がァグロバクテリウム属細菌の保持する形態異常誘導遗 伝子である、 請求の範囲第 2項、 第 3項、 第 4項、 第 5項または第 6項に記載の 植物への遺伝子導入用ベクター。
8. 形態異常誘導遺伝子がサイ トカイニン合成遺伝子である、 請求の範囲第 2項、 第 3項、 第 4項、 第 5項、 第 6項または第 7項に記載の植物への遗伝子導入用べ クタ一。
9. サイ トカイニン合成遺伝子がァグロバクテリゥム ' ッメフ ァシエンス （ Agrobacter i urn tumefac i ens) の T — D N A上に存在する i p t ( isopentenyl transferase) 遺伝子である、 請求の範囲第 8項に記載の植物への遗 伝子導入用ベクター。
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