WO1997024444A1

WO1997024444A1 - Nouvelle adn polymerase

Info

Publication number: WO1997024444A1
Application number: PCT/JP1996/003869
Authority: WO
Inventors: Takashi Uemori; Yoshizumi Ishino; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date: 1995-12-27
Filing date: 1996-12-26
Publication date: 1997-07-10
Also published as: EP0870832A1; EP0870832A4; CA2241170A1; AU1209897A; CN1137266C; JP3761197B2; US6395526B1; AU717156B2; KR19990076834A; CN1209170A; KR100443780B1; CN1552869A

Description

明細書新規 D NAボリメラーゼ技術分野

本発明は遺伝子工学用試薬として有用な DN Aボリメラ一ゼ及びその製造方法、さらにそれをコードする遺伝子に関する。背景技術

DNAボリメラ一ゼは遺伝子工学用試薬として有用な酵素であり、 D NA塩基配列決定法、標識化、部位特異的変異導入法などに広く利用されている。また最近ではボリメラ一ゼチヱーンリアクション（P C R) 法の開発により、耐熱性 D NAボリメラーゼが注目を集め、 P C R法に適した種々の DNAボリメラーゼが開発され、商品化されている。

現在知られている DNAボリメラーゼはそのァミノ酸配列の共通性から大きく 4つのフアミリーに分類することができ、中でもフアミリー A (ポル I型酵素）とファミリー B 型酵素）が大多数を占めている。それぞれのファミリーに属する D NAボリメラ一ゼは概ね類似した生化学的特性を有している力詳細に比較すると個々の酵素によって基質特異性、基質アナログの取込み、ブライマー伸長性の強さ及び速度、 DNA合成の様式、ェキソヌクレア一ゼ活性の付随、温度、 p Hなどの至適反応条件、また阻害剤に対する感受性などについて異なる性質を有している。したがってこれまで実験操作に応じてそれぞれ現存する中で最も適した性質を有する DNAボリメラーゼが選ばれ利用されている。発明の開示

本発明の目的は、上記のどのファミリ一にも属さず、現存する DNAボリメラ一ゼが有しなレ、生化学的特性をもつた新規な D N Aボリメラ一ゼを提供することにある。例えばプライマー伸長活性と 3' →5' ェキソヌクレアーゼ活性は相反する性質とされており、現存する DNAボリメラーゼでブライマ一伸長活性の強い酵素は合成の忠実性にとって重要な校正機能である 3' →5' ェキソヌクレアーゼ活性を有しない。また校正機能が優れているものはブライマー伸長活性が弱レ、。したがって、強い 3' →5' ェキソヌクレアーゼ活性を有しながらプライマ —伸長活性が強い DNAボリメラ一ゼの開発は、試験管内での DNA合成に大ぃに役立つものである。

本発明の他の目的は、このような新規な D N Aポリメラーゼの製造方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、本発明の DNAボリメラ一ゼをコ一ドする遺伝子を提供することにある。

本発明者らは鋭意研究の結果、超好熱性古細菌であるピロコッカスフリオサスから新規の DN Aボリメラーゼ遗伝子を見出し、これをクローニングすることによって 2種の新規夕ンパク質が共存により活性を示す新規 D N Aボリメラーゼ活性を持つことを明らかにした。更にこれらの遗伝子を導入した形質転換体を作製してこの複合型 DNAボリメラーゼを大量生産することに成功し、本発明を完成した。

即ち、本発明の要旨は、

( 1 ) 以下の性質を有することを特徴とする DNAボリメラーゼ、

① 一本鎖の祷型 DNAにプライマーがァニ一リングした複合体を基質としてボリメラーゼ活性を測定した場合に、活性化 DNAを基質とした場合に比べて高い活性を示す。

② 3' —5' ェキソヌクレア一ゼ活性を有する。

③ λ— DNAを铸型としたボリメラーゼチェーンリアクション（PCR) 反応を以下の条件で行った場合、約 20キロ塩基対の DN Α断片を増幅することが可能である。

PCRの条件：

(a) 反応液組成： 1 OmM トリスー塩酸 (pH9. 2) 、 3. 5mM g C 1₂ 75mM KC 1、 4 0 0 d ATP, dCTP, d GTP, dT TP、 0. 0 1 % ゥシ血淸アルブミン、 0. 1 % トリトン X— 1 0 0、 5.

0 n g/5 0 1 ス一DNA、 1 0 pmole/5 0 μ.1 ブライマー λ ΐ (配列表の配列番号 8) 、およびプライマー λ 1 1 (配列表の配列番号 9) 、 3. 7単位/ "50 1 DN Αポリメラ一ゼを含む。

(b) 反応条件： 9 8°C、 1 0秒〜68て、 1 0分を 1サイクルとした 30サイクルの PCR反応を行う。

(2) Ta qDNAボリメラーゼと比較して DN A合成時の誤りの頻度が低いことを特徵とする前記（ 1 ) 記載の DNAボリメラーゼ、

(3) ゲルろ過法による分子量が約 220キロダルトン、あるいは約 3 8 5キ口ダルトンである前記（ 1 ) 又は（2) 記載の DNAボリメラーゼ、

(4) 2種の DNAポリメラーゼ構成タンパク（第 1の DNAボリメラーゼ構成タンパクおよび第 2の DN Aボリメラーゼ構成タンパク）の共存により活性を示すことを特徴とする前記（ 1 ) 〜（3) いずれか記載の DNAボリメラーゼ、

(5) 第 1の DN Aポリメラ一ゼ構成タンパクおよび第 2の DN Aボリメラーゼ構成タンパクの SDS— PAGEによる分子量が、それぞれ約 9 0, 0 0 0ダルトン、約 1 4 0, 000ダルトンであることを特徴とする前記（4) 記載の D NAポリメラーゼ、

(6) 前記（4) 又は（5) に記載の DNAボリメラーゼを構成する第 1の D NAポリメラーゼ構成タンパクが、配列表の配列番号 1に示されるァミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、揷入、付加、又は匱換した実質的に同等の活性を有する機能的同等物であることを特徴とする前記（4) 又は（5)記載の DNAボリメラーゼ、

(7) 前記（4) 又は（5) に記載の DNAボリメラ一ゼを構成する第 2の D NAボリメラーゼ構成タンパクが、配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、揷入、付加、又は置換した実質的に同等の活性を有する機能的同等物であることを特徵とする前記（4) 又は（5) 記載の DN Aボリメラーゼ、

(8) 前記（4) 又は（5) に記載の DNAボリメラーゼを構成する第 1の D NAボリメラーゼ構成タンパクが、配列表の配列番号 1に示されるァミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、挿入、付加、又は置換した実質的に同等の活性を有する機能的同等物であり、かつ前記

(4) 又は（5) に記載の DNAボリメラ一ゼを構成する第 2の DNAポリメラ —ゼ構成タンパクが、配列表の配列番号 3に示されるァミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、揷入、付加、又は置換した実質的に同等の活性を有する機能的同等物であることを特徴とする前記（ 4) 又は（5) 記載の DNAボリメラーゼ、

(9) 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該ァミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、挿入、付加、又は置換した実質的に同等の活性を有する機能的同等物としてのアミノ酸配列からなる、前記（4) 又は（5) に記載の DNAボリメラ一ゼを構成する第 1の DNAボリメラ一ゼ構成タンパク、

(1 0) 配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、挿入、付加、又は置換した実質的に同等の活性を有する機能的同等物としてのアミノ酸配列からなる、前記（4 ) 又は（5) に記載の DNAボリメラーゼを構成する第 2の DNAポリメラ一ゼ構成タンパク、

(1 1) 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部を含むか、あるいは配列番号 1のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、挿入、付加または置換されたアミノ酸配列からなり、かつ第 1 の DNAボリメラーゼ構成タンパクとしての機能を有するタンパクをコードすることを特徴とする、前記（9) に記載の第 1の DN Aボリメラ一ゼ構成タンパクをコ一ドする塩基配列を含む DNA、

(1 2) 配列表の配列番号 2に示される塩基配列の全部又は一部を含むか、あるいはこの配列とストリンジントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなることを特徴とする、前記（9) に記載の第 1の DN Aボリメラ一ゼ構成夕ンバクをコ一ドする塩基配列を含む DNA、

( 1 3) 配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部を含むか、あるいは配列番号 3のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、挿入、付加または置換されたアミノ酸配列からなり、かつ第 2 の DNAボリメラ一ゼ構成タンパクとしての機能を有するタンパクをコードすることを特徴とする、前記（ 1 0) に記載の第 2の DNAボリメラーゼ構成タンパクをコ一ドする塩基配列を含む DNA、

(1 4) 配列表の配列番号 4に示される塩基配列の全部又は一部を含むか、あるいはこの配列とストリンジントな条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列からなることを特徴とする、前記（ 1 0) に記載の第 2の DNAボリメラーゼ構成タンパクをコードする塩基配列を含む DNA、

(1 5) 前記（1 1) 又は（1 2) に記載の第 1の DNAボリメラーゼ構成夕ンパクをコードする遺伝子と、前記（ 1 3)又は（ 1 4) に記載の第 2の DNA ポリメラーゼ構成タンパクをコ一ドする遺伝子の両方を含有する形質転換体を培養し、該培養物から DNAボリメラーゼを採取することを特徴とする DNAボリメラーゼの製造方法、並びに

(1 6) 前記（1 1) 又は（1 2) に記載の第 1の DN Aボリメラーゼ構成夕ンパクをコードする遺伝子を含有する形質転換体と、前記（1 3) 又は（1 4) に記載の第 2の DNAボリメラーゼ構成タンパクをコードする遗伝子を含有する形質転換体とをそれぞれ個別に培養し、該培養物中に含まれる DNAボリメラーゼ構成タンパクを混合して DN Aボリメラーゼを採取することを特徴とする DN Aボリメラーゼの製造方法、に関する。図面の簡単な説明

第 1図は、実施例 1で得られたコスミドクローン No. 264とコスミドクローン No. 49 1に挿入された DNA断片の制限酵素地図を示す図である。

第 2図は、プラスミド p FU 1 00 1に挿入された Xb a I -Xb a I DN A断片の制限酵素地図を示す図である。

第 3図は、本発明の DNAボリメラーゼの至適 pHを示す図である。

第 4図は、本発明の DNAボリメラーゼの熱安定性を示す図である。

第 5図は、本発明の DNAボリメラ一ゼの 3' →5' ェキソヌクレアーゼ活性を示す図である。

第 6図は、本発明の DN Aボリメラ一ゼのプライマー伸長活性を示すォートラジォグラムの図である。発明を実施するための最良の形態

( 1 ) 本発明の DNAポリメラーゼおよびその構成タンパク

本発明の DNAボリメラーゼの一例は、以下の性質を有するものである。

① 一本鎖の铸型 DNAにプライマーがァニーリングした複合体を基質としてボリメラーゼ活性を測定した場合に、活性化 DNA (DNase I 処理仔牛胸腺 DN A) を基質とした場合に比べて高い活性を示す。

② 3' →5' ェキソヌクレアーゼ活性を有する。

③ 至適 ρΗ ·· 6. 5〜7. 0 (リン酸カリウム緩衝液中、 75^eC) 。

④ 80°C、 30分の熱処理後に約 80%の残存活性を示す。 ⑤ また、ス一DNAを铸型としたポリメラーゼチェーンリアクション（P CR) 反応を行った場合、他の酵素の添加なしに約 20キロ塩基対の DNA断片を増幅することが可能である。 PCRの条件は次のとおりである。

(ィ） PCR反応液組成： 1 OmMトリス—塩酸（pH 9. 2) , 3. 5mM MgC 12 , 75mM KC 1 , 4 00 /zM dATP, dCTP, dGTP , dTTP， 0. 0 1 %ゥシ血淸アルブミン（BSA) , 0. 1 %トリトン X— 1 00 (Triton X-100) 、 5. 0 n g/5 0 1 λ -DNA. 1 0 pinole/ 5 0 1 ブライマ一ス 1 (配列表の配列番号 8) 、およびプライマー λ 1 1 (配列表の配列番号 9) 、 3. 7単位/ ^/5 0 1 DNAボリメラーゼを含む。ここで、 DNAポリメラーゼの 1単位は、次のようにして決定される。活性を測定しようとする試料を含む反応液 [2 OmMトリスー塩酸（ρΗ 7. 7) ， 1 5 mM MgC 12 , 2mM 2—メルカプトエタノール， 0. 2mg/m l活性化 D NA, 4 0 Μ dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 6 0 nM [ ³H] dTTP (アマシャム社製） ] 5 0 1を調製し、 75てで 1 5分間反応させ、そのうちの 4 0 1を DEペーパー（ヮットマン社製）にスボットし、 5 %Na 2 HPO4 で洗浄を 5回行った後に DEペーパー上に残存する放射活性を液体シンチレ一シヨンカウンターで測定し、 30分間あたりに 1 0 nmo 1の [ ³H] d T M Pを基質 D N Aに取り込む酵素量を酵素 1単位とする。

(口） PCR反応条件： 98'C、 1 0秒〜 68て、 1 0分を 1サイクルとした 30サイクルの PC R反応を行なう。

⑥ 本発明の DNAボリメラーゼは、ブライマー伸長活性、 DNA合成の正確性のいずれもが Ta qDNAボリメラーゼと比較して優れている。即ち、本発明の DNAポリメラーゼの DN A合成反応の伸長性、例えば PC R法において増幅できる DNAの鎖長や、その反応の正確性（DNA合成時に起こる誤りの頻度が低いこと）は、ともに代表的な酎熱性 DNAポリメラーゼである Ta qDNAボリメラーゼ（例えば宝酒造社製の TaKaRa Taq) に比べ優れている。本発明の DN Aボリメラーゼの分子量は、ゲルろ過法により約 220キロダルトン、あるいは約 385キロダルトンであり、 SDS— PAGE上では約 90, 0 0 0ダルトン、約 1 40, 000ダルトンに相当する 2本のバンドで示され、 2種のタンパクより構成される酵素である。本発明では約 9 0, 0 0 0ダルトンのもの（後述の ORF 3に相当する）を第 1の DNAボリメラーゼ構成タンパクと呼び、約 1 4 0, 000ダルトンのもの（後述の ORF 4に相当する）を第 2 の DNAボリメラーゼ構成タンパクと呼ぶ。本発明の DNAポリメラーゼは、第 1の DNAポリメラーゼ構成タンパクと第 2の DNAボリメラーゼ構成タンパクとが、 1 ： 1又は 1 ： 2のモル比で非共有結合的に複合体を形成しているものと推定される。

本発明の DNAポリメラーゼを構成する第 1の DN Aポリメラ一ゼ構成タンパクは、配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいはこれと実質的に同等の活性を有する機能的同等物であってもよい。また、第 2の DNA ボリメラーゼ構成タンパクは、配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいはこれと実質的に同等の活性を有する機能的同等物であってもよい。

ここで本明細書に記載の「機能的同等物」とは、以下のようなものをいう。天然に存在するタンパクにはそれをコードする遺伝子の多形や変異の他、生成後のタンパクの生体内および精製中の修飾反応などによってそのァミノ酸配列中にァミノ酸の欠失、挿入、付加、置換等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないタンパクと実質的に同等の生理学的活性、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に差異があってもその機能ゃ活性については大きな違いが認められないものを機能的同等物と呼ぶ。ここで変異したアミノ酸の数は、実質的に同等の生理学的活性、生物学的活性を示すものであるかぎり特に限定されるものではないが、 1以上、例えば 1又は数個、より具体的には 1〜約 1 0個の変異（欠失、揷入、付加、換等）などが例示される。人為的にタンパクのアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。たとえば、大腸菌で発現されたタンパクの N末端に存在するメチォニン残基は多くの場合メチォニンァミノぺプチダーゼの作用により除去されるとされているが、夕ンパクの種類によつてはその除去が完全には行われず、メチォ二ン残基を持つもの、持たないものの両方が生成される。しかしこのメチォニン残基の有無はタンパクの活性には影響を与えない場合が多い。また、ヒトインタ一ロイキン 2 ( I L— 2) のアミノ酸配列中のあるシスティン残基をセリンに置換したボリぺブチドがインタ一ロイキン 2活性を保持することが知られている [サイエンス（Scie nce)、第 224巻、 1 43 1頁（1 984) ]。

さらに、遺伝子工学的にタンパクの生産を行う際には融合夕ンパクとして発現させることがしばしば行われる。たとえば目的タンパクの発現量を増加させるために N末端に他のタンパク由来の N末端べプチド鎖を付加したり、目的タンパクの N末端、あるいは C末端に適当なペプチド鎖を付加して発現させ、このべプチド鎖に親和性を持つ担体を使用することにより目的タンパクの精製を容易にすることなどが行われている。したがって本発明の DNAボリメラーゼとは一部異なつたァミノ酸配列を有する DNAボリメラ一ゼであっても、それが本発明の DN Aボリメラーゼと本質的に同等の活性を示す限りにおいて、該酵素は「機能的同等物」として本発明の範囲内に属するものである。

(2) 本発明の DNAボリメラーゼの遗伝子

本発明の DNAボリメラーゼを構成する第 1の DNAポリメラ一ゼ構成タンパクをコードする DNAとしては、配列表の配列番号 1に示されるァミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部を含む DNA、例えば、配列表の配列番号 2 に示される塩基配列の全部又は一部を含む DNAが挙げられる。即ち、配列番号 1に示されるァミノ酸配列をコードする塩基配列の一部を含む D N A、例えば、配列表の配列番号 2に示される塩基配列の一部を含む DNAであっても、第 1の DNAボリメラーゼ構成タンパクとしての機能を有するタンパクをコードする塩基配列は本発明の範囲内である。また、配列番号 1のアミノ酸配列において、 1 以上の例えば 1又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加または置換などされたァミノ酸配列からなり、かつ第 1の DNAボリメラーゼ構成タンパクとしての機能を有するタンパクをコードする DNAも挙げられる。また、さらにこれらの配列とストリンジヱントな条件下でハイブリダィズ可能で、かつ第 1の D N Aボリメラーゼ構成夕ンパクとしての機能を有するタンパクをコ一ドする塩基配列も本発明の範囲内である。また、第 2の DNAポリメラ一ゼ構成タンパクをコードする DNAとしては、配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部を含む DNA、例えば、配列表の配列番号 4に示される塩基配列の全部又は一部を含む DNAが挙げられる。即ち、配列番号 3に示されるァミノ酸配列をコードする塩基配列の一部を含む DNA、例えば、配列表の配列番号 4に示される塩基配列の一部を含む DN Aであっても、第 2の DNAボリメラーゼ構成タンパクとしての機能を有するタンパクをコードする塩基配列は本発明の範囲内である。また、配列番号 3のアミノ酸配列において、 1以上の例えば 1 又は数個のァミノ酸が欠失、挿入、付加または匱換などされたァミノ酸配列からなり、かつ第 2の DN Aポリメラーゼ構成夕ンパクとしての機能を有する夕ンパクをコードする DNAも挙げられる。また、さらにこれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダィズ可能で、かつ第 2の D N Aボリメラ一ゼ構成夕ンパクとしての機能を有するタンパクをコ一ドする塩基配列も本発明の範囲内であここで、「第 1の DNAボリメラーゼ構成夕ンパクとしての機能を有する夕ンパク J 、あるいは「第 2の DNAボリメラーゼ構成タンパクとしての機能を有するタンパク J とは、これらの 2種のタンパク質が共存した場合、前記の①〜⑥に示された各種の理化学的性質を有する DNAボリメラーゼ活性を与える性質を有するタンパクをいう。

ここで、「ストリンジヱン卜な条件下でハイブリダィズ可能」とは、プローブとともに 0. 5%SDS、 0. 1 %ゥシ血清アルブミン（BS A) 、 0. i %ポリビニルピロリドン、 0. 1 %フイコール 400、 0. 0 1%変性サケ精子0 Aを含む 6 xSSC U xSSCは 0. 1 5M NaC l、 0. 0 1 5Mクェン酸ナトリウム、 pH 7. 0を示す）中、 50^eCにて 1 2〜20時間インキュベートした後に、プローブとハイプリダイズしていることをいう。

ここで本明細書に記載の「ァミノ酸配列をコードする塩基配列を含む D N A J なる用語について説明する。遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（3つの塩基の組み合わせ）はアミノ酸の種類ごとに 1〜 6種類づつが存在することが知られている。したがってあるアミノ酸配列をコードする DNAは、そのアミノ酸配列にもよるが多数存在することができる。遺伝子は自然界において必ずしも安定に存在しているものではなく、その塩基配列に変異が起こることはまれではない。遺伝子上の塩基配列に変異が起こってもそこにコードされたァミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる遺伝子が生じたといえる。したがってある特定のァミノ酸配列をコ一ドする遺伝子が単雜されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遠伝子ができていく可能性は否定できない。

さらに、同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子を人為的に作製することは種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。たとえば ¾伝子ェ学的なタンパクの生産において、目的のタンパクをコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合にはタンパクの発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているァミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的タンパクの高発現を図ることが行われている（例えば、特公平 7— 1 0 2 1 4 6号公報）。このように特定のアミノ酸配列をコードする多種類の *伝子は、人為的に作製可能なことは言うまでもなく、自然界においても生成されうるものである。したがって本発明中に開示された塩基配列と同一の塩基配列を有する遗伝子ではなくても、それが本発明中に開示されたァミノ酸配列をコードする限り該遗伝子は本発明に包含されるものである。

( 3 ) 本発明の D NAボリメラーゼの製造方法

本発明者らは、超好熱性古紬菌であるピロコッカスフリオサスから新規の D N Aボリメラーゼ遺伝子を見出し、これをクローニングすることによって該遗伝子上に 2種のタンパク質が共存により活性を示す新規な D N Aボリメラーゼがコ —ドされていることを明らかにした。本発明では、これらの遺伝子を導入した形質転換体を作製して本発明の D N Aボリメラーゼを大量生産することが可能である。この場合、前記のような第 1の D NAボリメラーゼ構成タンパクをコードする遣伝子と、第 2の D NAボリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子の両方を含有する形質転換体を培養し、培養物から D N Aボリメラーゼを採取する方法でもよく、また、第 1の D N Aボリメラーゼ構成タンパクをコードする遗伝子を含有する形質転換体と、第 2の D N Aボリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子を含有する形質転換体とをそれぞれ個別に培養し、培養物中に含まれる D N Aボリメラ一ゼ構成タンパクを混合することにより D N Aボリメラーゼを採取する方法であってもよい。

ここで、「第 1の D N Aボリメラーゼ構成タンパクをコードする遗伝子と、第 2の D N Aボリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子の両方を含有する形質転換体」とは、それぞれの遺伝子を含有する 2つの発現ベクターで同時形質転換されたものであってもよく、あるいは両方の遺伝子が 1つの発現べクタ一に組み込まれてそれぞれのタンパクが発現できるように調製された形質転換体であってもよい。 (4) 本発明の DNAポリメラ一ゼ遺伝子のクローニング、得られたクローンの解析、発現産物である DNAボリメラーゼの理化学性質、活性、 PCR法への適用などについて、以下に詳細に説明する。

本発明に使用する菌株としては、特に限定されるものではないが、例えば、ピロコッカス属に属する菌株としてピロコッカスフリオサス（Pyrococcus furio sus)DSM 3638株が挙げられ、該菌株はドイツチェザムルンクフォンミクロオルガニスメンゥントツェルクルチェゥレン Gmb Hより入手可能である。本発明者らは該菌株を適当な増殖培地で培養し、培養物の粗抽出液を調製してボリアクリルアミドゲル電気泳動を行った場合に、ゲル内で DNAボリメラーゼ活性を示すタンパク質のバンドが数種類存在することを発見した事から、それそれに対応する遠伝子が存在すると考えられた。即ち、新規 DNAボリメラーゼ遺伝子及びその産物は次に例示する工程によりクローニングすることができる

① ピロコッカスフリオサスから DNAを抽出する、

② ①の DNAを適当な制限酵素で消化し、プラスミド、コスミドなどをべクタ —として DNAライブラリ一を作製する、

③ ②で調製したライブラリーを大腸菌に導入し、外来遣伝子を発現させることにより各クローンの粗抽出液を集めたプロテインライブラリーを作製する、 ④ ③で調製したプロテインライブラリーを用いて DNAボリメラーゼ活性を測定し、活性を有する粗抽出液を与えた大腸菌クローンから外来 D N Aを取り出す

⑤ 取り出したプラスミドまたはコスミド中に含まれているピロコッカスフリォサス DNA断片を解析し、 DNAボリメラーゼ活性を示すタンパク質がコードされている領域を絞っていく、

⑥ DNAボリメラ一ゼ活性を示すタンパク質がコードされていると考えられる領域の塩基配列を決定し、タンパク質の一次構造を推定する、

⑦ ⑥で推定したタンパク質が大腸菌中でより発現しゃすい型になるように発現用プラスミドを構築し、産生されたタンパク質を精製して性質を解析する。

上記 DNA供与体であるピロコッカスフリオサス DSM 3638は超好熱性古細菌であり、 95'Cで嫌気培養する。增¾した菌体を破砕して DNAを抽出、精製する方法、また得られた D N Aを制限酵素で切断する方法等は公知の方法を用いる事ができ、当該方法の詳钿は 1 982年コールドスプリングハーバ一ラボラトリー発行、 T. マニアテイス（T.Maniatis) ほか著、モレキュラークロ —ニング，ァラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual) 第 75〜1 78頁に記載されている。

DNAライブラリーを作製するにあたっては、例えば、トリプルへリツクスコスミドベクター（ストラタジーン社製）を使用することができる。ピロコッカスフリオサスの DNAを Sau 3A I (宝酒造社製）で部分消化し、密度勾配遠心分雜を行って得られる長鎖の DNA断片を該ベクターの BamH Iサイトにラィゲ一シヨンし、イン · ビトロ 'ノ、'ッケージングを行う。こうして作製された D NAライブラリーより得られた形質転換体をそれぞれ個別に培養し、集菌後、超音波処理により菌体を破砕し、熱処理を行って宿主大腸菌の有する DN Aボリメラ一ゼを失活させた後、遠心分離を行つて耐熱性タンパクを含む上清を得ることができる。該上清はコスミドプロテインライブラリーと命名され、その一部を用いて DNAボリメラ一ゼ活性を測定することによりピロコッカスフリオサス由来の DNAボリメラ一ゼを発現するクローンを得ることができる。 DNAボリメラーゼ活性の測定法は公知の方法を用いることができ、当該方法はハーパーァンド口一社発行、 D. R. デービス（D. R. Davis)編集の DNAボリメラーゼフロムェシエリヒアコリ（DNA polymerase from Escherichia coli) 第 263〜276頁（(：. C. リチャードソン著）に記載されている。

ピロコッカスフリォサスの DN Aボリメラ一ゼ遺伝子としてはすでにそのうちの一種類を本発明者らがクローニングし、その構造を明らかにしており、ヌクレイツクァシッズリサーチ（Nucleic Acids Research) 第 21巻 259— 2 65頁（ 1 993 ) に記載されている。該遣伝子による翻訳產物は 775ァミノ酸からなる分子量約 90， 000ダルトンのボリペプチドであり、そのアミノ酸配列中には明らかにな型 DNAボリメラ一ゼの保存配列が含まれている。また実際にこの遗伝子産物の示す D N Aボリメラーゼ活性はな型 D N Aボリメラーゼの特異的阻害剤であるァフィディコリンによって阻害されるという性質を有するものであり、本発明の DNAポリメラーゼとは異なる。したがって、得られた耐熱性 D N Aボリメラ一ゼ活性を示すクローンの中から上記の既存の遺伝子を除去するには各クローンの含有するコスミドを分解し、上記の遺伝子をプローブとしてハイプリダイゼーシヨンを行い、ハイプリダイズしないクローンを選択すればよレ、。こうして得られた新規な DN Aポリメラーゼ遺伝子を含有するクローンより分解されるコスミドについてその挿入 DNA断片の制限酵素地図を作製することができる。次に、得られた制限酵素地図をもとに該 DN A断片を種々の領域に分断し、それぞれをプラスミドベクターにサブクロ一ニングし、大腸菌に導入して発現される酎熱性 D N Aボリメラーゼ活性を測定することによって該 DNA断片上の DNAボリメラーゼ遺伝子の位匿を調べることができる。こうして DNAボリメラ一ゼ遣伝子が含まれる約 1 0キロ塩基対の Xba I -Xb a I DNA断片を得ることができる。

該 DNA断片が組み込まれたプラスミドを有する組換え大腸菌は、その粗抽出液中に 90°C20分間処理後も十分量の DNA合成活性を有し、該 DNA断片が組み込まれていないブラスミドはこのような活性を有しないことより、該 DNA 断片上に耐熱性ボリメラーゼ産生情報が存在し、かつ大腸菌内で該情報を有する遣伝子が発現していると結論される。該 DNA断片が pTV l 1 8 Nベクター（宝酒造社製）に組み込まれたブラスミドはブラスミド pFU 1 00 1と命名され、また、該プラスミドで形質転換された大腸菌 JM1 09は Escherichia coli JM109 /pFUlOOl と命名、表示され、平成 7年 8月 1 1 日（原寄託日）より、ブ夕ペスト条約のもと、日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号（郵便番号 3 05 ) の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 F E R M BP- 55 79として寄託されている。

プラスミド pFU l 00 1に挿入された DNA断片の塩基配列は通常の方法、たとえばジデォキン法によって決定することができる。さらに、得られた塩基配列を解析することにより、その塩基配列中のタンパクをコードしうる領域、ォ一ブンリーディングフレーム（ORF) を推定することができる。

プラスミド p FU 1 00 1に揷入された約 1 0キロ塩基対の Xb a I -Xb a I DNA断片の塩基配列のうち 84 50塩基対分の配列を配列表の配列番号 5に示す。該塩基配列中には 6ケの連続した OR Fが存在しており、 5' 側より順に ORF 1 , ORF 2, ORF 3, ORF 4. ORF 5, ORF 6と命名されている。図 2に上記 Xb a I -Xb a I断片の制限酵素地図、および該断片上に存在する OR Fの位 Sを示す（図中左側より OR F 1〜ORF 6)。

上記の 6つの ORFのどれにもこれまでに知られている DNAボリメラーゼのどれかと相同性を示す配列は見られない。しかしながら ORF 1と ORF 2中にはサッカロミセスセレビシァェ（Saccharomyces cerevisiae) で発見されている CDC 6タンパク質、またシゾサッカロミセスボンべ（Schizosaccharomyce s pombe)で発見されている CDC 1 8タンパク質と相同性のある配列が存在している。 CDC 6, CDC 1 8は酵母菌において細胞周期の DNA合成期（S期）への移行に必要なタンパク質で DN A複製開始を調節するタンパク質ではないかと予想されている。また OR F 6は酵母の DNA障害の修復及び体細胞分裂期、減数分裂期の組換えに働くことが知られている RAD 5 1タンパク質とその減数分裂期特異的ホモログである Dm c 1タンパク質と相同性がある配列を有している。 RAD 5 1タンパク質をコードする遺伝子も細胞周期の G 1期から S期に移行するところでその発現が誘導されることが知られている。他の ORF 3, OR F 4, ORF 5については相同性のある配列を有する既知のタンパク質は発見されない。

酎熱性 D Aボリメラーゼの活性が上記のどの 0 R Fに由来するかを、各種領域を欠失させた DNA断片を揷入した組換えプラスミドを作製し、該ブラスミドで形質転換した形質転換体の耐熱性ボリメラーゼ活性を測定することにより、調ベることができる。上記の約 1 0キロ塩基対の Xba I -Xb a I DNA断片より ORF 1, ORF 2を欠いたもの、あるいは ORF 5, 0RF 6を欠いたものを揷入した組換えプラスミドで形質転換された形質転換体は酎熱性 DN Aボリメラーゼ活性を保持しているが、 0RF3、あるいは ORF 4が欠けたものでは活性が失われる。このことから 0RF 3、あるいは〇RF 4に DNAボリメラ一ゼ活性がコ一ドされていることが予想される。

ORF 3, ORF 4のどちらに DNAボリメラーゼがコ一ドされているかは、それぞれの ORFを別々に挿入した組換えプラスミドを作製し、得られる形質転換体につレ、て耐熱性 D N Aボリメラーゼ活性の発現を調べることによつて調べることができる。意外にも、 0RF3、あるいは ORF 4を単独で含む形質転換体のどちらから得られた粗抽出液にもごくわずかの D N Aボリメラ一ゼ活性しか認められない。しかし両抽出液を混合した場合には ORF 3, 0RF4の両方を含む形質転換体と同様の耐熱性 D N Aボリメラ一ゼ活性が得られることから、本発明の新規 D N Aボリメラ一ゼはこの 2つの 0 R Fの翻訳産物の働きを必要とするものであることが示される。この 2種のタンパクが複合体を形成して DN Aボリメラ一ゼ活性を示すのか、あるいはその一方が他方を修飾して活性型の酵素に変換するのかは DNAボリメラーゼの分子 Sを測定することによって知ることができる。該 DNAボリメラーゼの分子量をゲル滤過法で測定した結果より、上記の 2種のタンパクが複合体を形成していることがわかる。

配列表の配列番号 2に 0 R F 3の塩基配列、配列番号 1に該塩基配列より推定される OR F 3由来の翻訳産物、すなわち第 1の DNAポリメラーゼ構成夕ンパクのアミノ酸配列をそれぞれ示す。また、配列表の配列番号 4に OR F 4の塩基配列、配列番号 3に該塩基配列より推定される OR F 4由来の翻訳産物、すなわち第 2の DNAボリメラーゼ構成タンパクのアミノ酸配列をそれぞれ示す。

本発明の DNAボリメラーゼは ORF 3および ORF 4を組み込まれた組換えプラスミドで形質転換された形質転換体、たとえば Escherichia coli JM109 / pFUlOOl を通常の培養条件、たとえば 1 00 zg/m 1のアンピシリンを含む L B培地（トリブトン 1 0 gZリツトル，酵母エキス 5 g/リットル， Na C 1 5 gZリットル， pH7. 2) 中で培養することにより、その菌体内に発現させることができる。該ボリメラーゼは上記の培養菌体より、たとえば超音波処理、熱処理、および陰イオン交換カラム（RESOURCE Q カラム，ファルマン了社製 ) 、へパリンセファロ一スカラム（HiTrap Heparin. フアルマシア社製）、ゲル滤過カラム（Superose 6HR, フアルマシア社製）などを用いたクロマトグラフィーを行うことにより、 SDS—ボリアクリルアミドゲル罨気泳動（SDS- P AGE) でほぼ 2種の DNAボリメラーゼ構成タンパクの 2本のバンドだけを示すまで精製することができる。また、上記のように ORF 3, ORF 4をそれぞれ単独で含む形質転換体を個別に培養した後、得られた培養菌体、それらの粗抽出液、あるいは精製された DNAボリメラーゼ構成タンパクを混合することによっても目的の DN Aボリメラーゼを得ることができる。 2種の DN Aボリメラーゼ構成夕ンパクを混合する場合には特別な操作は必要なく、それぞれの形質転換体の抽出液、またはそれらから精製された両タンパク質を適当量ずつ、単に混ぜ合わせるだけで活性を有する DN Aボリメラーゼを得ることができる。

このようにして得られた本発明の DNAボリメラ一ゼは、 SDS— PAGE上で約 9 0, 0 00ダルトン、約 1 40, 000ダルトンに相当する 2本のバンドを示し、これらはそれぞれ第 1および第 2の D N Aボリメラ一ゼ構成タンパクに対応する。

本発明の DNAポリメラーゼは、図 3に示されるようにリン酸カリウム緩衝液中、 75てにおいて pH 6. 5〜7. 0付近に至適 pHを示す。また、該 DNA ボリメラーゼの酵素活性を種々の温度で測定した場合には 75〜80^eCで高い活性を示すが、これより高い温度では活性測定の基質に用いる活性化 DN Aの二重鎖構造が破壊されるため、該酵素の活性にとつての正確な至適温度は測定されていない。該 DNAボリメラ一ゼは高い熱安定性を有しており、図 4に示されるように 80て、 30分間の熱処理の後も 80%以上の残存活性を保持している。この熱安定性は該酵素の PC R法での使用を可能にする。また、型 DNAボリメラーゼの特異的阻害剤として知られているァフィディコリン（aphidicolin)の影響を調べた場合、該 DNAボリメラーゼの活性は 2 mMのァフィディコリン存在下においても阻害を受けない。

精製された DNAボリメラーゼの生化学的特性を解析したところ、本発明の D NAボリメラ一ゼは試験管内で非常に優れたプライマー伸長活性を有している。表 1に示されるように一本鎖 DNAにブライマーがァニーリングした形の基質（ Ml 3 -HT Primer) を用いて DNAボリメラーゼ活性を測定した場合には、通常の活性測定に用いられる活性化 DNA (DNase I処理仔牛胸腺 DNA) に比べて高いヌクレオチド取り込み活性が得られる。上記の Ml 3 -HT Primer 基質を使用して他の DNAボリメラーゼとのブライマ一伸長能力の比較を行なうと、本発明の DNAボリメラーゼは既知のピロコッカスフリオサス由来 DNA ボリメラーゼ（P f u DNAボリメラーゼ，ストラタジーン社製）ゃサ一マスアクアティカス（Thermus aquaticus ) 由来の Ta q DNAポリメラ一ゼ（ TaKaRa Taq, 宝酒造社製）に比べて優れた伸長活性を示す。更にこの反応系中に競合基質となる活性化 D N Aを加えた場合には、上記の 2種の D N Aボリメラーゼのブライマー伸長活性が強く阻害されるのに対して本発明の DNAボリメラーゼはより軽度の阻害しか受けず、該酵素がブライマー伸長型の基質に高い親和性を持つことが示される（図 6)。表 1

また、本発明の DNAボリメラーゼを PC R法に使用した場合には極めて優れた性能を示す。 PCR法に繁用されるサーマスアクアティカス由来の DNAポリメラーゼは単独では 1 0キロ塩基対以上の DN A断片を増幅することは困難であり、他の DNAボリメラーゼと組み合わせることによってのみ 20キロ塩基対以上の DNA断片の増幅を行なうことができる [プロシーディングスォブザナショナルアカデミーォブサイエンスォブザ USA (Proceeding s of the National Academy of Science of the USA ) , 第 9 1巻，第 22 1 6 一 2220頁（ 1 994) ] 。また、 P f u DNAボリメラ一ゼを利用して増幅できる DN Aの鎖長は最大でも 3キロ塩基対程度までと言われている。これに対して本発明の DNAボリメラーゼを使用した場合には、他の酵素の添加なしに該酵素単独で 20キロ塩基対の D N A断片の増幅が可能である。

さらに本発明の DN Aボリメラーゼは 3' →5' ェキソヌクレアーゼ活性が付随しており、 DNAボリメラーゼ活性に対するェキソヌクレアーゼ活性の強さは、その活性が強いために DNA合成の正確性が非常に高いことが知られている P f u DNAボリメラーゼの活性比に匹敵する（図 5)。また、本発明の DNA ボリメラーゼについて測定された DN A合成反応中に起こる誤りの頻度は、 Ta qDNAポリメラーゼのものよりも低い。上記した種々の性質は本発明の DNA ポリメラーゼが P C R法などの遺伝子工学用試薬として非常に優れたものであることを示すものである。

また本発明により新規 D N Aボリメラーゼ遗伝子が発見されたことは、以下のような興味深い知見も提供する。本発明者らは新規 DNAボリメラーゼをコ一ドする OR F 3， 4の遺伝子を含む領域が細胞内でどの様に転写されるのかを知るため、ピロコッカスフリオサス細胞より調製した RNA画分をノザンプロット法、 RT— PCR法及びプライマー伸長法により分析すると、 ORF l〜ORF 6は一^ Dのメッセンジャー RNA (mRNA) として ORF 1のすぐ上流から転写されていることが確認される。この事から ORF 1, 2の細胞内での産生は 0 RF 3, 4と同じ制御を受けていると予想され、 ORF 1 , 2, 5, 6が酵母の DNA複製開始の調節に関与する CDC 6, CDC 1 8と配列上の相同性があることと考え合わせると本発明の新規 DN Aボリメラーゼは DN A複製にとって重要な DNAボリメラーゼである可能性が高い。更にピロコッカスフリオサスの属する古細菌の DN A複製系は真核細胞のそれに近いことが予想されるので真核生物ではこれまでにまだ発見されていない複製にとって重要な DNAボリメラ一ゼとして本発明の D N Aボリメラーゼに類似した酵素が存在する事も考えられる ο

さらに、本発明の DNAボリメラーゼに類似の耐熱性 DNAボリメラ一ゼは、ピロコッカスフリオサスと同じ超好熱性古細菌に属する細菌、たとえばピロコッカス（Pyrococcus)厲に厲するピロコッカスフリオサス以外の菌、ピロディクティゥム（Pyrodictiura)厲、サーモコッカス（Thermococcus)属、スタフイロサーマス（Staphylotherraus) 厲等に属する細菌においても生産されていることが期待される。これらの酵素が本発明の DNAボリメラーゼと同様に 2つの DNA ボリメラーゼ構成タンパクより構成されている場合には、これらの酵素の DNA ポリメラーゼ構成タンパクの一方と、もう一方の DNAボリメラーゼ構成タンパクに相当する本発明の DN Aボリメラーゼ構成夕ンパクとを組み合わせることによっても同様の DN Aボリメラーゼ活性が発現されることが期待される。

上記の超好熱性古細菌の生産する、本発明の DNAボリメラ一ゼに類似の耐熱性 DNAボリメラーゼはそのァミノ酸配列、およびそれをコ一ドする遗伝子の塩基配列に関して、本発明の DNAボリメラーゼのアミノ酸配列、およびそれをコ一ドする遺伝子の塩基配列との間に相同性が存在することが期待される。したがつて本発明により単離された遺伝子、もしくはその塩基配列の一部をプローブとしたハイプリダイゼーシヨンによって上記の好熱性古細菌より得られた DNA断片を適当な微生物に導入し、前記のコスミドプロテインライブラリーと同様の方法で調製した熱処理ライゼート中の D N Aボリメラーゼ活性を適当な方法で調べることにより、本発明の D N Aボリメラーゼの塩基配列と同一ではなし、が同様の酵素活性を持つ本酵素類似の耐熱性 DN Aボリメラーゼ遗伝子を得ることができる。

上記のハイプリダイゼーシヨンは以下の条件で行うことができる。すなわち、 DNAを固定したメンブレンを 0. 5%SDS、 0. 1 %ゥシ血清アルブミン、 0. 1 %ボリビニルピロリドン、 0. 1 %フイコール 4 00、 0. 0 1 %変性サケ精子 DNAを含む 6 xSSC ( 1 XSSCは 0. 1 5 MN a C 1， 0. 0 1 5 Mクェン酸ナトリウム、 pH7. 0を示す）中で、 5 O'Cにて 1 2〜20時間、プローブとともにインキュベートする。インキュベート終了後、 0. 5 %SDS を含む 2 XSSC中、 37てでの洗浄から始めて、 SSC濃度は 0. l xまでの範囲で、また、温度は 5 O'Cまでの範囲で変化させ、固定された DNA由来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようになるまで洗浄する。

さらに、本発明により単離された遺伝子、もしくはその塩基配列の一部をブライマ一に用い、上記の好熱性古紬菌より得られた DNAを铸型とした遺伝子増幅反応で得られた DNA断片、あるいは該断片をプローブとしたハイプリダイゼーシヨンによつて上記の好熱性古細菌より得られた D N A断片を適当な微生物に導入し、上記と同様に DNAボリメラーゼ活性を調べることにより、本発明の DN Aポリメラーゼの活性と同一ではないが、同様の活性を持つ、本酵素類似の耐熱性 DNAボリメラーゼ遗伝子を得ることができる。以下に本発明の実施例を示すが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。なお、実施例中の％は重量％を意味する。

実施例 1

( 1) ピロコッカスフリオサスのゲノム DNAの調製

ピロコッカスフリオサス DSM 3638の培養は以下のとおりに行った。トリプトン 1 %、酵母エキス 0. 5%、可溶性デンプン 1 %、ジャマリン S · ソリッド（ジャマリンラボラトリ一社製） 3. 5 %、ジャマリン S · リキッド（ジャマリンラボラトリ一社製） 0. 5%、 MgSO₄ 0. 003 %、 NaC l 0. 00 1 %, F e S O4 - 7H₂ 0 0. 000 1 %、 CoSO* 0. 000 1 %、 C a C 1₂ - 7H₂ 0 0. 000 1 %、 Z n S 0₄ 0. 000 1 %、 C υ S0 · 5H₂ 0 0. l ppm、 KAl (S0₄ )₂ 0. 1 p pm> H₃ B 0₃ 0. 1 p pm, N a 2 Mo 0₄ - 2H₂ 0 0. 1 p pm. N i C 12 - 6 H₂ 0 0. 25 p pmの組成の培地を 2リットル容のメディウムボトルに入れ、 1 20'C、 20分間殺菌した後、窒素ガスを吹込み、溶存酵素を除去した後、これに上記菌株を接種して 95'C、 1 6時間静培養した。培養後、遠心分離によって菌体を集めた。

つぎに、集菌体を 25 %スクロースを含む 0. 05M卜リス一 HC 1 (pH8 . 0) 4mlに懸濁し、この懸濁液に 0. 8mlのリゾチーム [SmgZmし 0. 25Mトリスー HC 1 (pH 8. 0) ] 、 2mlの 0. 2M EDTAを加えて、 20てで 1時間保温した後、 24m 1の SET溶液 [ 1 5 OmM NaC K ImM EDTA、 20mMトリスー HC 1 (pH 8. 0) ] を加え、さらに、 5 %SDS 4m 1、プロティナーゼ K ( 1 Omg/m 1 ) 400 1を加え、 37て、 1時間反応させた。反応終了後、フノール—クロ口ホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、約 3. 2mgのゲノム DNAを調製した。

(2) コスミドプロティンライブラリ一の作製

ピロコッカスフリオサス DSM 3638のゲノム DNA 400 /gを Sau 3A 1で部分消化し、密度勾配超遠心法により、 35〜50 kbにサイズ分画した。つぎに、トリプルへリツクスコスミドベクタ一（ストラタジーン社製） 1 gを Xba I消化した後、アルカリフォスファタ一ゼ（宝酒造社製）を用いて脱リン酸化し、さらに、 BamH I消化して上記の分画された 35〜50 kbの D NA 1 40 gと混合してライゲ一シヨンを行い、ガイガーパック ·ゴールド（ストラタジーン社製）を用いたィン ' ビトロ 'パッケージング法によってピロコッカスフリオサスのゲノム DN Aのフラグメントをラムダファージ粒子中にパッケージングし、ライブラリーを調製した。ついで、得られたライブラリーの一部を用いてィー ·コリ DH5な MCRに形質導入し、得られた形質転換体のうち数個を選んでコスミド DNAを調製し、適当な大きさの挿入断片があることを確認したのち、改めて、上記のライブラリ一中から約 500個の形質転換体を選び、それぞれ別個に 1 00 gZm 1のアンピシリンを含む 1 50m lの LB培地

(トリプトン 1 0 gZリットル、酵母エキス 5 gZリットル、 NaC 1の 5 gZ リットル、 pH7. 2) 中で培養した。該培養物を遠心し、回収した菌体を 20 mMトリスー HC 1、 pH8. 0 1mlに懸渴し、 1 00てで 1 0分間熱処理した。铳いて超音波処理を行い、さらに、もう一度 1 00て、 1 0分間熱処理した。遠心後の上淸として得られるライゼートをコスミドプロテインライブラリーとした。 (3) DNAボリメラーゼ活性の測定

DNAボリメラーゼ活性測定には仔牛胸腺 DNA (ワージントン社製）を DN ase I処理によって活性化したもの（活性化 DNA) を基質として用いた。 DN Aの活性化および DNAボリメラ一ゼ活性の測定は、ハーパーアンドロー社発行、 D. R. デービス（D. R. Davis)編集の DNAボリメラーゼフロムェシヱリヒアコリ（DNA polymerase from Escherichia col i) 第 263— 276頁（(：. C. リチャードソン著）に記載の方法で行った。

酵素活性測定は以下の方法で行った。すなわち、活性を測定しょうとする試料を含む反応液 [2 OmMトリス—塩酸（pH7. 7) , 1 5mM MgC 1₂ . 2mM 2—メルカブトエタノール， 0. 2mgZm 1活性化 DNA, 40 M d ATP, dCTP, dGTP, dTTP, 60 nM [ ³H] dTTP (アマシャム社製） ] 50 1を調製し、 75でで 1 5分間反応させた。そのうちの 4 0 β 1を DEペーパー（ヮットマン社製）にスボットし、 5%Na₂ HP0₄ で洗浄を 5回行った後に D Eペーパー上に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。上記の酵素活性測定方法によって 30分間あたりに 1 Onmo lの [ ³H] d TMPを基質 DNAに取り込む酵素量を酵素 1単位とした。

(4) DNAポリメラーゼ遣伝子を含むコスミドクローンの選択

反応溶液として 2 OmMトリス—塩酸（pH7. 7) , 2mM MgC 1₂ , 2m 2—メルカプトエタノール， 0. 2mgZm 1活性化 DNA, 40〃M d ATP, dCTP, dGTP, dTTP, 60 nM [ ³H] dTTP (アマシャム社製）を用意し、この溶液 45 p.1に対してコスミドブロティンライブラリーの各抽出液より 1 1を 5クローンずつ、即ち 5 1を 1反応分として加え、 75でで 1 5分反応させた後、各 40〃】分を DEペーパーにスポットし、 5 %Na₂ HPO4 で洗浄を 5回行い、 DEペーパー上に残っている放射活性を液体シンチレ一シヨンカウンターで測定した。 5クローンを 1グループとした一次測定により活性が認められたグループは、続いて 5クローンを 1クローンずつに分け二次測定を行った。コスミド DNAライブラリ一中に既知の DNAポリメラ一ゼ遗伝子を含むものは予め該遗伝子をプローブとしたハイブリダィゼ一ジョンテストより、クローン No. 57, 1 54, 1 62, 363であることが分かつていることから、これら以外のクローンで DN A合成活性を含むクローンとして No. 4 1, 1 53, 264, 462, 49 1の 5クローンが発見された。

(5) 制限酵素地図の作製

上記の 5クローンについてコスミドを分離し、それぞれを BamH 1で分解してその泳動パターンを調べてみると互いに共通するバンドが何本か見られ、この 5クローンはオーバーラップしながらすこしずつずれた領域を組込んでいることが予想された。そこでクローン No. 264と 49 1の挿入 DNA断片について制限酵素地図を作製した。両クローンから調製したコスミドを各種制限酵素で切断した結果、適当な大きさの断片に切断された Kpn I, No t I, Ps t l, Sma I, Xb a I, Xh o I (いずれも宝酒造社製）についてそれぞれ切断位置を決定した結果、図 1に示すような地図が得られた。

(6) DNAボリメラーゼ遗伝子のサブクローニング

図 1に示した制限酵素地図をもとにクローン 264あるいは 49 1由来のコスミドより 1 0キロ塩基対前後の種々の DN A断片を切り出し、 pTV 1 1 8Nまたは pTV l 1 9Nベクタ一（宝酒造社製）にサブクローニングした。得られた組換えプラスミドによる形質転換体について耐熱性 DNAボリメラーゼ活性を測定した結果、約 1 0キロ塩基対の Xba I -Xb a I断片に強い耐熱性 DNAボリメラーゼを産生する遗伝子があることが判明した。そこで該 Xb a I -Xb a I断片が pTV 1 1 8Nベクターに組み込まれたものをプラスミド pFU 1 00 1と命名し、該プラスミドで形質転換された大腸菌 JM1 09を Escherichia c oli JM109 /pFUlOOl と命名した。実施例 2

新規 DNAボリメラーゼ遺伝子を含む DNA断片の塩基配列の決定

実施例 1で得られたプラスミド pFU l 00 1より DNAポリメラ一ゼ遗伝子を含む上記 Xb a I -Xb a I断片をもう一度 Xb a Iで切り出し、 DNAブランティングキット（宝酒造社製）を用いて平滑末端化した後、新たな pTV l 1 8Nベクターを Sma Iで開環したものと連結して欠損変異体作製用プラスミドを調製し、挿入断片の方向性によってそれぞれ p FU 1 002, p FU 1 003 と命名した。これらブラスミドを用いて挿入 DNA断片の両端から順次欠損変異体を作製した。作製には Henikoff の方法（ジーン（Gene) 第 28巻、第 35 1 — 359頁）を応用した Kilo-Sequence用 Deletion kit (宝酒造社製）を利用した。 3' 突出型、 5' 突出型制限酵素としてはそれぞれ P s t I， Xba lを利用した。得られた種々の欠損変異体を铸型として BcaBEST ジデォキシシークェンスキット（宝酒造社製）を用いたジデォキン法により挿入断片の塩基配列を決定した。

配列表の配列番号 5に得られた塩基配列のうち 8450塩基対分の配列を示す。該塩基配列を解析した結果、タンパクをコードしうる 6つのオープンリーディングフレーム（ORF) が見い出され、配列表の配列番号 5に示される塩基配列の塩基番号 1 23 - 61 4 (0RF 1) ， 61 1 - 1 38 1 (ORF 2) , 1 3 84 - 3222 (ORF 3 ) , 3225 - 70 1 3 (ORF 4 ) , 7068 - 7 697 (ORF 5 ) , 771 1 - 8385 (ORF 6) の位置にそれぞれ存在していた。図 2にプラスミド pFU 1 00 1に組み込まれた約 1 0キロ塩基対の X b a I -Xb a I DNA断片の制限酵素地図、および該断片上の上記の 0 R Fの位置を示す。また、上記の種々の欠損変異体を用いて耐熱性 DNAボリメラーゼ活性を測定したところ、上流から欠損させても下流から欠損させても ORF 3および ORF 4の領域まで欠損がおよぶと D N Aボリメラーゼ活性が失なわれることが示された。これより 0 R F 3および 0 R F 4の翻訳産物が D N Aボリメラーゼ活性の発現に重要であることが示された。配列表の配列番号 2に OR F 3の塩基配列、配列番号 1に該塩基配列から推定される OR F 3の翻訳産物のアミノ酸配列をそれぞれ示す。また、配列表の配列番号 4に OR F 4の塩基配列、配列番号 3に該塩基配列から推定される ORF 4の翻訳産物のアミノ酸配列をそれぞれ示す。実施例 3

精製 DNAボリメラーゼ摞品の調製

実施例 1で得られた Escherichia coli JM109 /pFUlOOl をアンビシリンが 1 00 g/m 1の濃度で存在する LB培地（トリプトン 1 0 gZリットル、酵母エキス 5 gZリットル、 N a C 1 5 リットル、 p H 7. 2 ) 5 0 0 m 1で培養した。培養液の溷度が 0. 6Α_β。。に達した時、誘導物質であるイソプロピルー /3— D—チォガラクトシド（ I PTG) を添加し、さらに 1 6時間培養を行つた。集菌後、菌体を 37m lのフニケーションバッファ一（5 OmMトリスー塩酸、 pH8. 0、 2mM 2—メルカプトエタノール、 1 0%グリセロール、 2. 4m PMSF (フエニルメタンスルフォニルフルオライド）に懸濁し、超音波破砕機にかけた。 1 2000 r pm、 1 0分の遠心分離により 4 2m 1の粗抽出液を上清として回収し、これを 80^eC、 1 5分間の熟処理にかけた。その後再度 1 20 0 0 r pm、 1 0分の遠心分雜を行って 3 3m lの熱処理酵素液を得た。次にこの溶液をバッファー A (5 OmMリン酸カリウム， pH 6. 5, 2 mM 2—メルカブトエタノール， 1 0%グリセロール） 8 00 m 1を外液として 2時間 X 4回透析した。透析後の酵素液 32m lをバッファー Aで平衡化した RESOURSE Qカラム（フアルマシア社製）に供し、 FPLCシステム（ファルマンァ社製）を用いてクロマトグラフィーを行った。展開は 0→50 OmMONa C 1直線濃度勾配により行った。 DNAボリメラ一ゼ活性は 34 OmM Na C 1 のところで溶出された。

活性のある画分を集めて得られた 1 0m lの酵素溶液を限外! «過により脱塩、濃縮し、バッファ一 A+ 1 5 OmM NaC lに溶解した 3. 5m lの酵素溶液とし、同じバッファ一で平衡化した Hi Trap Heparin カラム（フアルマシア社製 ) に供した。 FPLCシステムを用いて 1 50→6 5 OmM Na C 1直線濃度勾配により展開し、 4 0 OmM Na C 1のところに溶出された活性画分を得た。この画分 5m 1を限外滤過により脱塩、濃縮を繰り返し、 1 20 1の 5 Om Mリン酸カリウム、 pH6. 5、 2mM 2—メルカプトエタノール、 75mM

Na C 1溶液にまで濃縮した。この溶液を同じバッファ一で平衡化した Super ose 6ゲル濂過カラム（フアルマシア社製）に供し、同じバッファーで溶出を行つた結果、 DN Aボリメラーゼ活性は保持時間 34. 7分および 38. 3分の位置に溶出された。同一条件での分子量マーカーの溶出位置との比較の結果より、これらの活性はそれぞれ約 38 5キロダルトン、約 220キロダルトンの分子量を持つと予想された。これらの分子量は 0 R F 3の翻訳産物と 0 R F 4の翻訳産物とが 1 ： 2のモル比で複合体を形成した場合、および 1 ： 1のモル比で複合体を形成した場合に相当する。しかしながら高分子量になるほど分子量の測定誤差が大きくなることから、前者については 2種の翻訳産物が 2 ： 2のモル比で複合体を形成している可能性も否定できない。実施例 4

( 1 ) DNAボリメラーゼの生化学的特性

実施例 3で得られた、 ORF 3と ORF 4の翻訳産物、すなわち第 1の DNA ボリメラーゼ構成タンパクと第 2の DNAボリメラーゼ構成タンパクとが 1 ： 1 で複合体を形成した DNAボリメラーゼ標品について、まず至適 MgC l ₂ および KC 1濃度を求めた。反応系は 2 OmMトリスー塩酸， pH7. 7, 2mM 2—メルカプトエタノール， 0. ZmgZm 1活性化 DNA, A 0 uM d AT P, dGTP, dCTP, dTTPに 2mM M g C 1₂ の存在下で 0〜 200 mMの範囲で 2 OmMずつ KC 1濃度を上げていき、 DNAボリメラーゼ活性を測定した。その結果、 KC 1は 6 OmMのとき最大活性を示した。次に上記反応系に 6 OmMKC 1の存在下、今度は MgC 1₂ を 0. 5〜25mMまで 2. 5 mM毎に比較したところ 1 OmMで最大活性を示したが、 KC 1を含まない場合と比較してみるとその場合は 1 7. 5mMで最大活性を示した。

次に至適 pHを調べた。各種 pHのリン酸カリウム緩衝液を用い、 2 OmMリン酸カリウム， 1 5mM MgC 12 , 2mM 2—メルカプトエタノール， 0 . 2mg/m 1活性化 DNA, 40 M d ATP, dCTP, dGTP, dT TP, 60 n [ ³H] d TT Pからなる反応液を調製し、これを用いて 75てで DNAボリメラーゼ活性を測定した。図 3にその結果を示す。図中横軸は pH 、縱軸は高分子 DNAに取り込まれた放射活性を示す。図に示されるように本発明の DNAボリメラーゼは pH6. 5〜7. 0で最大活性を示した。リン酸カリゥ厶にかえてトリス一塩酸を用いた場合にはアル力リ側にいくほど活性が高く、測定に用いた最も高い PHである pH 8. 02で最大の活性を示した。

本発明の DN Aボリメラーゼの熱安定性を以下のようにして調べた。精製された DNAボリメラーゼを 2 OmMトリス-塩酸（pH7. 7) , 2mM 2—メルカプトエタノール， 1 0%グリセリン， 0. 1 %ゥシ血淸アルブミン溶液として調製し、種々の温度で 30分間保温した後、残存する DNAボリメラーゼ活性を測定した。図 4にその結果を示す。図中横軸は保温温度、縱軸は残存活性を示す。図に示されるように本酵素は 80で、 30分間の熱処理の後も 80%以上の残存活性を保持していた。

インヒビターの阻害様式を比較するため、型 D N Aボリメラーゼの特異的阻害剤であるァフィディコリン（aphidicolin)を用いてすでに知られているピロコッカスフリオサス由来のな型 DN Aボリメラーゼ（P f u DN Aボリメラーゼ、ストラタジーン社製）といつしょに阻害のされ方を比べた。 20mMトリスー塩酸. pH7， 7, 1 5mM MgC 1₂ , 2mM 2—メルカプトエタノール , 0. 2mgZm 1活性化 DNA, 40 u d ATP, dGTP, dCTP, dTTP存在下でァフイディコリンを 0〜2. OmMまで増やしていき、活性の変化を調べたところ、 P f u DNAボリメラーゼは 1. OmMで 20%まで活性が減少するのに対して本発明の新規 D N Aボリメラーゼは 2. 0 mMでも全く阻害されなかった。

(2) ブライマー伸長反応

次に本発明の DNAボリメラーゼの基質 DNAの形に対する選択性を比較するため、以下の様な铸型—プライマーについて調べた。通常の活性測定に用いられる活性化 DNAの他、活性化 DNAを 85て 5分間処理して熱変性させたもの

(熱変性 DNA)、 Ml 3ファージ一本鎖 DNA (M 1 3m 1 8 s s DNA, 宝酒造社製）に配列表の配列番号 6に示す配列の 45塩基の合成デォキシリポオリゴヌクレオチドをプライマーとしてァニーリングさせたもの（M 1 3 -HT Primer) 、同じく Ml 3ファージ一本鎖 DNAに配列表の配列番号 7に示す配列の 1 7塩基の合成リボオリゴヌクレオチドをプライマ一としてァニ一リングさせたもの（Ml 3—RNA Primer) 、ボリデォキシアデノシン（PolydA, フアルマシア社製）とオリゴデォキシチミジン（OligodT , フアルマシア社製）を 20

： 1のモル比で混合したもの（PolydA— OUgodT), ポリアデノシン（PolyA,ファルマシア社製）とオリゴデォキシチミジンを 20 ： 1のモル比で混合したもの（ PolyA 一 OligodT)を基質として調製した。

これらの基質を活性化 DNAのかわりに用いて DNAボリメラーゼ活性を測定し、活性化 DNAを基質に用いた場合に得られる活性を 1 00とした時の各基質での相対活性を表 1に示す。比較のために P f u DNAボリメラーゼ、サーマスアクアティカス由来の T a q DNAボリメラーゼ（TaKaRa Taq, 宝酒造社製）についても同様に調べた。表 1に示されるように本発明の新規 DNAボリメラーゼは他の DN Aボリメラーゼと比較すると活性化 DN Aを基質とした場合よりも Ml 3 -HT Primer を用いて得られる活性の方が高く、プライマ一伸長反応に対し特に高い適性を有していた。

さらにプライマー伸長活性について詳細な検討を行った。基質として Ml 3 - HT Primer を用い、プライマーの 5' —末端を [ァ一³² P] ATP (アマシャム社製）と T 4ボリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）によって標識したうえで使用した。終濃度 0. 05 g/ 1の上記基質と、活性化 DN Aを基質とした活性測定で 0. 05単位を示す量の各種 DN Aポリメラーゼを含む 1 0 1の反応液（20mM トリス—塩酸（pH7. 7) , 1 5mM MgC 1₂ , 2m 2—メルカプトエタノール， 270 /zM d ATP, dGTP, dCTP, dTTP) を調製し、 75てで 1, 2, 3, 4分間反応させた。反応終了後、 2 1の反応停止液（ 95 %ホルムアミド， 2 Om EDTA, 0, 05 %プロモフエノールブルー， 0. 05%キンレンシァノール）を加えて 95'C、 3分間の熱変性処理後、反応液のうち 2 1を 8 M尿素を含むボリアクリルアミドゲルを用いて鼋気泳動した後、オートラジオグラムを作製した。また、競合基質となる活性化 DN A存在下での伸長活性を調べるため、上記の反応液に終濃度 0. 4 H g/ 1の活性化 DNAを加えたものを準備し、上記同様に操作してオートラジォグラムを作製した。得られたオートラジオグラムを図 6に示す。

図中、 Po l, P f u, Ta qはそれぞれ本発明の DNAボリメラーゼ， P f u DNAボリメラーゼ， T a qDN Aボリメラーゼについて得られた結果を示し、 1、 2、 3、 4はそれぞれ反応時間（分）を示す。また、図中一、十の表示はそれぞれ活性化 DNA非存在下、および存在下で得られた結果を示す。さらに図中左端の G, A, T, Cで示されたレーンは上記と同じ基質を用いたジデォキシ法による鏆停止反応で得られた反応物を泳動したものであり、伸長産物の長さを推定するのに使用した。図に示されるように本発明の DN Aボリメラ一ゼは P f uDNAボリメラーゼ， Ta qDNAボリメラーゼに比べてより優れたプライマ一伸長活性を示した。また、活性化 DNA非存在下では比較的高いプライマー伸長活性を示す T a q D N Aボリメラーゼが大過剰量の活性化 D N Aの添加によつて顕著に阻害されるのに対し、本発明の D N Aボリメラ一ゼは活性化 D N Aによる阻害を受けにくいことが示された。このことから本発明の DNAボリメラーゼが、特に一本鎖の铸型 DNAにプライマーがひとつアニーリングした形のブライマー伸長型の基質に対して高い親和性を有していることが確かめられた。

(3) 付随するェキソヌクレアーゼ活性の有無

本発明の DNAボリメラーゼに付随するェキソヌクレアーゼ活性を以下のようにして調べた。 5' —3' ェキソヌクレアーゼ活性検出用基質として、 pUC l 1 9ベクター（宝酒造社製）を S s p I (宝酒造社製）で消化して得られる 38 6塩基対の DNA断片をァガロースゲル電気泳動で分雜した後、精製し、 [7 - ³²P] ATPとボリヌクレオチドキナーゼを用いて 5' —末端が³² Pで標識された DNA断片を調製した。また 3' —5' ェキソヌクレアーゼ活性検出用基質として pUC 1 1 9ベクターを S a υ 3 A Iで消化して得られる 34 1塩基対の D NA断片をァガロースゲル電気泳動で分離した後、精製し、 [ァ一³² P] CTP

(アマシャム社製）とクレノウフラグメント（宝酒造社製）を用いた fill-in 反応により 3' —末端が³² P標識された DNA断片を調製した。標識 DNAは N

1 CKカラム（ファルマンァ社製）でゲル ¾過して精製し、以下の反応に用いた。これらの標識 DNA 1 ngを含む反応液（2 OmMトリスー塩酸（pH7. 7 ) , 1 5mM MgC 12 , 2mM 2—メルカブトエタノール）に 0. 0 1 5 単位の DNAボリメラーゼを加えて 75'Cで 2. 5、 5、 7. 5分間反応させた後、エタノールを加えて DN Aを沈殿させた。上淸中に存在する放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定し、ェキソヌクレアーゼ活性による分解量を求めた。本発明の DNAボリメラーゼには 5' →3' ェキソヌクレアーゼ活性は認められなかったが強い 3' →5' ェキソヌクレア一ゼ活性を持つことが示された。 3' →5' ェキソヌクレアーゼ活性が強いことが知られている P f uDNA ポリメラ一ゼを用いて同様にして 3' →5' ェキソヌクレアーゼ活性を測定し、これらの結果を合わせて図 5に示す。

図中横軸は反応時間を、縦軸は反応液全体に含まれる放射活性に対する上清に遊離した放射活性の割合を示す。また図中白丸は本発明の DNAボリメラーゼ、黒丸は P f u DNAボリメラーゼについて得られた結果を示す。図に示されるように本発明の DNAボリメラ一ゼは 3' →5' ェキソヌクレア一ゼ活性が強いために DN A合成の忠実度が高いことが知られている P f u DNAボリメラーゼと同程度の 3' →5' ェキソヌクレアーゼ活性を有することが示された。

(4) DNA合成反応の正確性の比較

DNAボリメラーゼによる DNA合成反応の正確性を、 pUC l 1 8ベクター (宝酒造社製）の一部を一本鎖化したもの（ギャップ形成二本鎖プラスミド）を铸型として調べた。一本鎖 pUC 1 1 8は大腸菌 MV 1 1 84 (宝酒造社製）を宿主とし、ヘルパーファージ Ml 3K07 (宝酒造社製）を用いて、 1 989年コールドスプリングハーバーラボラトリ一発行、 T. マニアテイス（T. Ma niatis) ら編集、モレキュラークローニング：ァラボラトリーマニュアル第 2版 (Molecular Cloning ： Aし aboratoly Manual 2nd ed. ) 4. 44〜4. 48に記載の方法で調製した。また二本鎖 DNAは pUC 1 1 8ベクターを Pv υΐΐ (宝酒造社製）消化した後にァガロースゲル電気泳動を行い、約 2. 8キロ塩基対の D Ν Α断片を回収して調製した。

上記の一本鎖 DNA 1 gと、二本鎖 DNA2 zgとを混合して 1 80 1の滅菌蒸留水溶液とし、 70'C、 1 0分間保温した後、 20 1の 20 XSSCを加えてさらに 60て、 1 0分間静 Sした。エタノール沈殿を行って DNAを回収し、その一部をァガロースゲル電気泳動に供してギャップ形成二本鎖ブラスミドが得られていることを確認した。得られたギャップ形成二本鎖プラスミドのうち

、 1 1 0量を含む 30 a 1の反応液（ 1 0 mM トリス— HC 1、 pH 8. 5 、 5 OmM KC 1、 1 OmM MgC 1₂ 1 mM d ATP, dCTP, d GTP, dTTP) を調製し、これを 70^eCで 3分間保温した後、 0. 5単位の DNAボリメラーゼを加えて 70て、 1 0分間の DNA合成反応を行った。反応終了後、反応液のうち 1 0 a 1を用いて大腸菌 DH 5ひ（BRL社製）を形質転換し、 1 00〃 g/m 1のアンピシリン、 0. I mMの I PTG、 4 0 /z g/m 1の 5—ブロモー 4一クロロー 3—インドリルー — D—ガラクトシドを含む L Bプレート上で 37'C、 1 8時間培養した。プレート上に出現した白色、および青色のコロニーの数を調べ、 DNA合成時に誤りが起こっている白色コロニーの出現率を算出した。その結果、 DNAボリメラーゼとして Ta qDNAボリメラーゼを用いた場合の出現率（％) は、 3. 1 8%であったのに対し、本発明の D NAボリメラーゼを用いた場合には、出現率が 1. 6 1 %とそれよりも低い値を示した。

(5) PCRへの利用

本発明の DNAポリメラーゼの PCR反応における性能を Ta qDNAボリメラーゼと比較するために； I一 DNAを铸型とした PCR反応を行った。本発明の DNAポリメラ一ゼ用の反応液組成は 1 OmMトリスー塩酸（pH 9. 2) , 3 . 5m Mg C 12 , 75mM KC 1, 4 00 d ATP, dCTP, dGTP, dTTP, 0. 0 1 %ゥシ血清アルブミン（BS A) , 0. 1 %トリトン X— 1 0 0 (Triton X-100) とし、 T a q DNAポリメラーゼ用の反応液組成は 1 OmMトリス-塩酸（pH 8. 3) , 1. 5mM MgC 1₂ , 5 OmM

KC 1 , 4 0 0 M d ATP, dCTP, dGTP, dTTPとし、 5. 0 n g/5 0 z 1 λ— DNA (宝酒造社製） 1 0 pmoleZ5 0 1 プライマー λ 1、およびプライマー λ 1 1、 3. 7単位/ /50 1 DNAボリメラーゼを含む反応液 5 0 fi 1を調製した。プライマー λ 1、およびプライマー λ 1 1の塩基配列を配列表の配列番号 8、および配列番号 9にそれぞれ示す。上記の反応液について 9 8て、 1 0秒〜6 8て、 1 0分を 1サイクルとした 30サイクルの Ρ CR反応を行った後、反応液のうちの 5 1をァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブ口マイド染色によって増幅された DNA断片を確認した。この結果、 Ta qDNAボリメラーゼを用いたものでは DNA断片の増幅が認められないのに対し、本発明の DNAボリメラーゼでは約 20キロ塩基対の DNA断片の増幅が確認された。

次に、プライマーをプライマース 1、及びブライマー λ 1 0に変更して実験を行った。ブライマー λ 1 0の塩基配列を配列表の配列番号 1 0に示す。上記同様の反応液組成で 2. 5 n gのスー DNA, 1 0 pmoleのプライマー λ 1、及びプライマー λ 1 0、 3. 7単位の DNAボリメラーゼを含む 25 1の反応液を調製し、上記同様の反応条件で 5サイクル反応させた後、反応液のうちの 5 1をァガロースゲル鼋気泳動し、ェチジゥムブロマイド染色を行なうと、 Ta qDN Aボリメラーゼでは特異的な増幅が見られないのに対し、本発明の DNAボリメラーゼでは約 1 5キロ塩基対の DNA断片が増幅していることが示された。実施例 5

( 1 ) OR F 3翻訳産物のみを発現するためのプラスミドの構築

実施例 2に記載のブラスミド pFU 1 002 (該ブラスミドにはべクタ一上の

1 a cプロモーター下流に ORF l〜ORF 6が位置している）をもとにその揷入 DN A断片のうち OR F 3直後より下流部分を欠失させて作製した変異体ブラスミド 6— 8 2を铸型とし、プライマー M 4 (宝酒造社製）、および配列表の配列番号 1 1にその塩基配列を示すプライマー NO 3を用いた PCR反応を行った。なお PC R反応に使用する DN Aボリメラーゼには合成反応の正確性が高い P f u DN Aポリメラーゼ（ストラタジーン社製）を用いた。 l ngの铸型 DN A、 25 pmo 1ずつの両ブライマー、および 2. 5単位の P f u DNAボリメラーゼを含む 1 00 1の PC R反応液 [20 mM トリス- HCし pH8 . 2、 1 Om KC 1、 2 Om MgC 1₂ 、 6mM (NH₄ ) 2 S0₄ 、 0. 2mM d ATP, dCTP, dGTP, dTTP、 1 % トリトン X - 1 00、 0. 0 1 % BSA] を調製し、 94^eC、 0. 5分〜 55^eC、 0. 5分〜72て、 2分を 1サイクルとした 25サイクルの反応を行った。增幅された約 2キロ塩基対の DNA断片を Nc 0 I、 Sph I (ともに宝酒造社製）で消化した後、 pTV 1 1 8Nベクター（宝酒造社製）の Nc 0 I— Sph Iサイト間に組み込んだプラスミド pFU— ORF 3を作製した。該ブラスミドの挿入 DNA 断片は OR F 3のみを翻訳可能な伏態で含んでいる。一（ 2) OR F 4翻訳産物のみを発現するためのブラスミドの構築

上記のプラスミド pFU 1 002をもとにその挿入 DNA断片のうち ORF 4 中央部より下流部分を欠失させて作製した変異体プラスミド 6— 2を铸型とし、ブライマー M4、および配列表の配列番号 1 2にその塩基配列を示すブライマー NO 4を用いた PC R反応を行った。铸型 DN Aをプラスミド 6— 2に、またプライマ一 NO 3をプライマ一NO 4にそれぞれ変更した他は上記の実施例 5— ( 1 ) と同じ条件で反応を行った。増幅された DNA断片を Nc 0 I、 Nh e I ( 宝酒造社製）で消化して得られる約 1. 6キロ塩基対の DN A断片を、上記のプラスミド pFU l 002より単離される約 3. 3キロ塩基対の N he I— Sa 1 断片（ORF 4の後半部分を含む）とともに pET l 5 bベクター（ノバジェン社製）の Nc 0 I -Xh 0 Iサイト間に組み込んだブラスミド pFU— ORF 4 を作製した。該プラスミドの揷入 DNA断片は OR F 4のみを翻訳可能な伏態で含んでいる。 (3)_0RF 3、 ORF 4翻訳産物からの DNAボリメラーゼの再構成

上記のプラスミド pFU— ORF 3で形質転換された大腸菌 JM1 09、 Esch erichia coli JM 1 09/p FU-ORF 3、および上記のプラスミド p FU — ORF 4で形質転換された大腸菌 HMS 1 74、 Escherichia coli HMS 1 74/p FU-ORF 4をそれぞれ個別に培養し、菌体中に発現された両 0 R F の翻訳産物を精製した。形質転換体の培養、および粗抽出液の調製は実施例 3に記載の方法によった。また両翻訳産物の精製は RESOURCE Q、 HiTrap Heparin, Superose 6などのカラムを用い、 SDS— PAGE上で翻訳産物の挙動を確認することによって行った。こうして精製された両 ORFの翻訳産物はどちらも単独では D N Aボリメラ一ゼ活性を示さなかつたが、この 2つを混合した場合には酎熱性の D N Aボリメラ一ゼ活性が出現することが確認された。產業上の利用可能性

本発明により、高いブライマー伸長性と 3' →5' ェキソヌクレア一ゼ活性とを合わせ持つ新規な D N Aボリメラーゼが提供される。該酵素は P C R法への利用に適しており、遺伝子工学研究用試薬として有用である。また、本発明の DN Aボリメラーゼをコ一ドする遣伝子を用いた遺伝子工学的な該酵素の製造も可能となった。

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290 295 300

Glu Ala Phe Lys Val Leu Pro Asp Ala Val Val Ala Phe Lys Gly

305 310 315

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配列の長さ： 1263

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Met Glu Leu Pro Lys Glu He Glu Glu Tyr Phe Glu Met Leu Gin

5 10 15

Arg Glu l ie Asp Lys Ala Tyr Glu l ie Ala Lys Lys Ala Arg Ser

20 25 30

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50 55 60

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440 445 450

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455 460 465

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545 550 555

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560 565 570

Lys Lys l ie Glu l ie Ser Leu Asp Asp Leu Gly Ser Leu Lys Arg

575 580 585

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590 595 600

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620 625 630

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635 640 645

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650 655 660

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665 670 675

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1160 1165 1170

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1235 1240 1245 Glu Lys Pro Lys Lys Lys Lys Val l i e Ser Leu Asp Asp Phe Phe

1250 1255 1260

Ser Lys Arg

配列番号： 4

配列の長さ： 3789

配列の型：核酸

鎖の数： 2本鎖トポロジー：直鎖状

配列の種類： Genomic DNA

配列：

ATGGAGCTTC CAAAGGAAAT TGAGGAGTAT TTTGAGATGC TTCAAAGGGA AATTGACAAA 60 GCTTACGAGA TTGCTAAGAA GGCTAGGAGT CAGGGTAAAG ACCCCTCAAC CGATGTTGAG 120 ATTCCCCAGG CTACAGACAT GGCTGGAAGA GTTGAGAGCT TAGTTGGCCC TCCCGGAGTT 180

GCTCAGAGAA TTAGGGAGCT TTTAAAAGAG TATGATAAGG AAATTGTTGC TTTAAAGATA 240

GTTGATGAGA TAATTGAGGG CAAATTTGGT GATTTTGGAA GTAAAGAGAA GTACGCTGAA 300

CAGGCTGTAA GGACAGCCTT GGCAATATTA ACTGAGGGTA TTGTTTCTGC TCCACTTGAG 360

GGTATAGCTG ATGTTAAAAT CAAGCGAAAC ACCTGGGCTG ATAACTCTGA ATACCTCGCC 420

CTTTACTATG CTGGGCCAAT TAGGAGTTCT GGTGGAACTG CTCAAGCTCT CAGTGTACTT 480

GTTGGTGATT ACGTTAGGCG AAAGCTTGGC CTTGATAGGT TTAAGCCAAG TGGGAAGCAT 540

ATAGAGAGAA TGGTTGAGGA AGTTGACCTC TATCATAGAG CTGTTTCAAG GCTTCAATAT 600

CATCCCTCAC CTGATGAAGT GAGATTAGCA ATGAGGAATA TTCCCATAGA AATCACTGGT 660

GAAGCCACTG ACGATGTGGA GGTTTCCCAT AGAGATGTAG AGGGAGTTGA GACAAATCAG 720

CTGAGAGGAG GAGCGATCCT AGTTTTGGCG GAGGGTGTTC TCCAGAAGGC TAAAAAGCTC 780

GTGAAATACA TTGACAAGAT GGGGATTGAT GGATGGGAGT GGCTTAAAGA GTTTGTAGAG 840

GCTAAAGAAA AAGGTGAAGA AATCGAAGAG AGTGAAAGTA AAGCCGAGGA GTCAAAAGTT 900

GAAACAAGGG TGGAGGTAGA GAAGGGATTC TACTACAAGC TCTATGAGAA ATTTAGGGCT 960

GAGATTGCCC CAAGCGAAAA GTATGCAAAG GAAATAATTG GTGGGAGGCC GTTATTCGCT 1020

GGACCCTCGG AAAATGGGGG ATTTAGGCTT ACATATGGTA GAAGTAGGGT GAGTGGATTT 1080

GCAACATGGA GCATAAATCC AGCAACAATG GTTTTGGTTG ACGAGTTCTT GGCCATTGGA 1140

ACTCAAATGA AAACCGAGAG GCCTGGGAAA GGTGCAGTAG TGACTCCAGC AACAACCGCT 1200

GAAGGGCCGA TTGTTAAGCT AAAGGATGGG AGTGTTGTTA GGGTTGATGA TTACAACTTG 1260

GCCCTCAAAA TAAGGGATGA AGTCGAAGAG ATACTTTATT TGGGAGATGC AATCATAGCC 1320

TTTGGAGACT TTGTGGAGAA CAATCAAACT CTCCTTCCTG CAAACTATGT AGAGGAGTGG 1380 一 5 l — is/963d卜 6 OVA

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配列の長さ： 8450

配列の型：核酸

鎖の数： 2本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： Genomic DNA

配列：

CATAACTAAA TTATTACATT TAGTTATATG GATCGGGGAA AAATTAACAA CATGTGTTAT 60 GTTTCCTCTG GAAAATTGAT CTATAATAAT CTAGGAGCAC AATTTCCAAT GGAGGGTCAT 120 CAATGAACGA AGGTGAACAT CAAATAAAGC TTGACGAGCT ATTCGAAAAG TTGCTCCGAG 180 OAVfcvw98s/96l: 6 o o o o o o o o o o

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AGGGCCTGGGA GGGCA GGGACCAAATTATT CAGCAACAAC CGCTGGG CCGAAGATTGTT 4440A

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GGGATTGTAG GCGTTAATAT GGGTAGAATA GGGTGAGTGGTTTCC TGGGC AGAAAAATA 4320A

G AAAATAGCT AAAGGAAATA ATTGGTGGGA GGCCGTTCTTA CGTGGCCGGA 426ACC TAAATG0

G TAGAAAGGG ACCTTTATACGG AACTCATG AGAAATA GGCTG GCCCCTTTGAATTAAGCG 4200

AAGAAACGTA AGTGGAGAAA AGTAGCCGGGAAA AAGTCAA AGTGGTGTAAACA AGGGAGG 4140

AGGGGGAATT TGGGATGATG GGGATGCTTA AAGAGGT AGG GTTTAGCTAAAAAAAAGCJ 4080TG

TCCAGTTTTGT GGCGGAGGT GCGTTTCCAA AGGCAA GCTAAATC2GAAA TACTTGC 4AAA020-

TGGAGGTTTC CGGCATAAAT GTAGGGCAGAG TTGAGACAAA TAGC GTGAGAGAGGAGCG96A 30

AAGGGTAATT AGCGAATAGGTCCA TAAACAC TGGG AATATCGATTAAGCC ACTGCAGATG 3900

G AGAAGTTGA CCCTTATAT AGGCGT CGGCTCATCCCACCG84ATTTAAT ATAATCC TTATG 30

GGCGAAAGCTGTG8 TGCCTAT AGGAGC CGGGAA GCAATAGAG AGAATGGTTG 370TTTAAATGT

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配列の長さ： 45

配列の型：核酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D N A)

配列：

CCGGAACCGC CTCCCTCAGA GCCGCCACCC TCAGAACCGC CACCC 45 配列番号： 7

配列の長さ： 17

配列の型：核酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 R NA)

配列：

GUUUUCCCAG UCACGAC 17 配列番号： 8

配列の長さ： 23

配列の型：核酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D NA)

配列：

GATGAGTTCG TGTCCGTACA ACT 23 配列番号： 9

配列の長さ： 22

配列の型：核酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D NA)

配列：

ACAAAGCCAG CCGGAATATC TG 22 配列番号： 10

配列の長さ： 22

配列の型：核酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D N A)

配列： TACAATACGA TGCCCCGTTA AG 22 配列番号： 11

配列の長さ： 32

配列の型：核酸

鎮の数： 1本鏆

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D NA)

配列：

CAGAGGACGT TGATCCCATG GATGAATTTG TA 32 配列番号： 12

配列の長さ： 32

配列の型：核酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D NA)

配列：

TTTAGTGGGT GGTGCCCATG GAGCTTCCAA AG 32

Claims

請求の範囲

1. 以下の性質を有することを特徴とする D N Aポリメラーゼ。

① 一本鎖の铸型 DNAにブライマーがァニ一リングした複合体を基質としてボリメラ一ゼ活性を測定した場合に、活性化 DNAを基質とした場合に比べて高い活性を示す。

② 3' →5' ェキソヌクレアーゼ活性を有する。

PCRの条件：

(a) 反応液組成： 1 OmM トリスー塩酸（pH 9. 2) 、 3. 5 mM Mg C l ₂ 、 75mM KC 1、 4 00 M d ATP, d CTP, dGTP, dT TP、 0. 0 1 % ゥシ血清アルブミン、 0. 1 % トリトン X— 1 0 0、 5.

0 n g/5 0 1 λ -DNA. 1 0 pmole/5 0 1 プライマー； 1 (配列表の配列番号 8) 、およびブライマー λ 1 1 (配列表の配列番号 9) 、 3. 7単位 Ζ50 1 DNAボリメラーゼを含む。

(b) 反応条件： 9 8'C；、 1 0秒〜6 8 、 1 0分を 1サイクルとした 30サイクルの PCR反応を行う。

2. Ta qDNAボリメラーゼと比較して DNA合成時の誤りの頻度が低いことを特徴とする請求項 1記載の DNAポリメラーゼ。

3. ゲルろ過法による分子量が約 220キロダルトン、あるいは約 385キロダルトンである請求項 1又は 2記載の DN Aボリメラ一ゼ。

4. 2種の DNAボリメラ一ゼ構成タンパク（第 1の DNAボリメラーゼ構成タンパクおよび第 2の DN Aボリメラーゼ構成タンパク）の共存により活性を示すことを特徵とする請求項 1〜 3いずれか記載の D N Aポリメラーゼ。

5. 第 1の DNAボリメラーゼ構成タンパクおよび第 2の DNAボリメラーゼ構成タンパクの SDS— PAGEによる分子量が、それぞれ約 9 0, 00 0ダルトン、約 1 4 0, 000ダルトンであることを特徴とする請求項 4記載の DNA ボリメラーゼ。

6. 請求項 4又は 5に記載の D N Aポリメラ一ゼを構成する第 1の D N Aポリメラーゼ構成タンパク力、配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、挿入、付加、又は置換した実質的に同等の活性を有する機能的同等物であることを特徴とする請求項 4又は 5記載の DN Aボリメラ一ゼ。

7. 請求項 4又は 5に記載の DN Aボリメラーゼを構成する第 2の DN Aポリメラーゼ構成タンパク力配列表の配列番号 3に示されるァミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、挿入、付加、又は置換した実質的に同等の活性を有する機能的同等物であることを特徴とする請求項 4又は 5記載の DN Aボリメラ一ゼ。

8. 請求項 4又は 5に記載の DNAボリメラ一ゼを構成する第 1の DNAボリメラーゼ構成タンパクが、配列表の配列番号 1に示されるァミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、挿入、付加、又は置換した実質的に同等の活性を有する機能的同等物であり、かつ請求項 4又は 5に記載の D N Aボリメラーゼを構成する第 2の DNAボリメラーゼ構成タンパクが、配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、挿入、付加、又は置換した実質的に同等の活性を有する機能的同等物であることを特徴とする請求項 4又は 5記載の D N Aボリメラーゼ。

9 . 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、揷入、付加、又は匱換した実質的に同等の活性を有する機能的同等物としてのァミノ酸配列からなる、請求項 4又は 5に記載の D N Aボリメラーゼを構成する第 1の D N Aポリメラ一ゼ構成タンパり。

1 0 . 配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該ァミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、挿入、付加、又は置換した実質的に同等の活性を有する機能的同等物としてのァミノ酸配列からなる、請求項 4又は 5に記載の D N Aボリメラーゼを構成する第 2の D N Aボリメラ一ゼ構成夕ンパク。

1 1 . 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部を含むか、あるいは配列番号 1のアミノ酸配列において、 1以上のァミノ酸が欠失、揷入、付加または置換されたアミノ酸配列からなり、かつ第 1の D N Aボリメラーゼ構成タンパクとしての機能を有するタンパクをコードすることを特徴とする、請求項 9に記載の第 1の D N Aボリメラーゼ構成タンパクをコ ―ドする塩基配列を含む D N A。

1 2 . 配列表の配列番号 2に示される塩基配列の全部又は一部を含むか、あるいはこの配列とストリンジントな条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列からなることを特徴とする、請求項 9に記載の第 1の DNAボリメラーゼ構成タンパクをコ一ドする塩基配列を含む DNA。

1 3. 配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部を含むか、あるいは配列番号 3のアミノ酸配列において、 1以上のァミノ酸が欠失、挿入、付加または置換されたアミノ酸配列からなり、かつ第 2の DN Aボリメラーゼ構成タンパクとしての機能を有するタンパクをコ一ドすることを特徴とする、請求項 1 0に記載の第 2の DNAボリメラ一ゼ構成タンパクをコードする塩基配列を含む DNA。

1 4. 配列表の配列番号 4に示される塩基配列の全部又は一部を含むか、あるいはこの配列とストリンジントな条件下でハイブリダィズ可能な塩基配列からなることを特徴とする、請求項 1 0に記載の第 2の DNAボリメラーゼ構成タンパクをコードする塩基配列を含む DNA。

1 5. 請求項 1 1又は 1 2に記載の第 1の DN Aボリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子と、請求項 1 3又は 1 4に記載の第 2の DNAボリメラーゼ構成タンパクをコードする遣伝子の両方を含有する形質転換体を培養し、該培養物から DNAボリメラーゼを採取することを特徴とする DNAボリメラーゼの製造方法。

1 6. 請求項 1 1又は 1 2に記載の第 1の DNAボリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子を含有する形質転換体と、請求項 1 3又は 1 4に記載の第 2の D N Aボリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子を含有する形質転換体とをそれぞれ個別に培養し、該培養物中に含まれる DNAボリメラーゼ構成夕ンパクを混合して DN Aボリメラーゼを採取することを特徴とする DN Aボリメラーゼの製造方法 c