WO1997021804A1 - Nouvelle protease analogue a la thermolysine et son utilisation - Google Patents

Nouvelle protease analogue a la thermolysine et son utilisation Download PDF

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WO1997021804A1
WO1997021804A1 PCT/JP1996/003617 JP9603617W WO9721804A1 WO 1997021804 A1 WO1997021804 A1 WO 1997021804A1 JP 9603617 W JP9603617 W JP 9603617W WO 9721804 A1 WO9721804 A1 WO 9721804A1
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residue
amino acid
thermolysin
protease
methyl ester
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PCT/JP1996/003617
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Satoshi Hanzawa
Seigo Ohe
Toshio Miyake
Shun-Ichi Kidokoro
Kimiko Endo
Akiyoshi Wada
Original Assignee
Sagami Chemical Research Center
Holland Sweetener Company V.O.F.
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
    • C07K5/06121—Asp- or Asn-amino acid the second amino acid being aromatic or cycloaliphatic
    • C07K5/0613—Aspartame
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24027—Thermolysin (3.4.24.27)

Definitions

  • the present invention relates to N-benzyloxycarbonylaspartic acid (hereinafter abbreviated as Z-Asp) in an aqueous medium, where Z-Asp is Z-L-Asp or Z-Asp Enzymatic reaction using thermolysin-like protease for the coupling of semi-form) and phenylalanine methyl ester (hereinafter abbreviated as PM, this PM means L-PM or racemic PM)
  • the present invention relates to an improved method of synthesizing benzyloxycarbonyl ⁇ -L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester (hereinafter abbreviated as ⁇ - ⁇ ).
  • the invention also relates to novel highly stabilized thermolysin-like proteases.
  • A-L-aspartyl-L-phenylalanine It is a precursor for the synthesis of methyl ester (hereinafter abbreviated as A ⁇ ).
  • Enzymatic reaction of benzyloxycarbonyl- ⁇ -L-as-carbyl-L-phenic acid was carried out by enzymatic reaction using sa-molysin-like protease for force coupling of N-benzyloxycarbonylaspartate and phenylalanine methyl ester in an aqueous medium.
  • a method for synthesizing ulualanine methyl ester by an enzymatic reaction is disclosed in
  • thermolysin in E. coli is quite high, it has been found that the activity of the enzyme at the end of the reaction is significantly lower than at the start of the reaction, and this decrease increases the amount of enzyme used and increases costs. I will.
  • thermolysin is the first metalloprotease found in the culture of Bacillus thermoproteolyticus (Endo, S. (1962) Jana-Loub. Fermentation Tech.-(J. Fermentation Tech.), 40, 346-353) o Its amino acid sequence (Titani, K. et al., (1972) (Nature New Biology-(Nature New Biol.), 238, 35-37; ⁇ - ⁇ - 0418625; Miki, ⁇ . (1994), J. Molobumorekiura -Biology- (J. Mol.
  • the glutamic acid residue at position 144 and the histidine at position 231 as well as the zinc ion contained in the molecule of thermolysin are important for the expression of protease activity in thermolysin. It was pointed out that Hereinafter, these amino acid residues at the 14th and 23rd positions will be abbreviated as catalyst residues for the protease reaction.
  • thermolysin A protease having an amino acid sequence similar to that of samorilisin and having catalytic activity similar to that of thermolysin has been reported in the literature (eg, Imanaka, et al., (1986) Nature, 324_, 695- 697). Was. Studies relating to the introduction of mutations at specific locations in the amino acid sequence of thermolysin have also been described in the literature (Kubo, M. et al. (1992) Abright 'and Environmental Microbiol., Appl, Environ. 58, 3779-3787) and patent applications (EP-A -0.616.033). In that patent application, it has been shown that mutagenesis at positions 144, 150, 187 and 227 improves enzyme activity.
  • thermolysin-like protease a protease having an activity value of 1.2 to 10 times higher than that of wild type thermolysin in terms of Z-APM synthesis activity value is abbreviated as "thermolysin-like protease”.
  • the term “samoricin-like protease” refers to a protease whose amino acid sequence matches the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • a protease in which one or three or more amino acid residues are replaced by another amino acid residue in the acid sequence, or A force at which one or more amino acid residues have been inserted, or a metal plate having an amino acid sequence with one or more amino acid residues missing. is there.
  • thermolysin and thermolysin in which mutations are introduced in such a manner are very stable in a buffer solution near neutrality and are very active at such pH.
  • the stability of thermolysin and "samoricin-like proteases” is reduced in weak acids with a pH in the range of about 4.5-6; thermolysin may be completely inactivated at pH below 4.
  • ⁇ -Asp benzyloquincarbonyl-1- ⁇ -aspartic acid
  • Prior art Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-171871
  • 144th mouth isine residue 150th aspartic acid residue
  • 187th glutamic acid residue 227th glutamic acid residue.
  • the substitution of at least one amino acid residue of the asparagine residue with another amino acid residue improved the enzymatic activity for Z_APM degradation and Z-APM synthesis.
  • the strength of this protease, especially for the synthesis of Z-APM at pH 7 or lower and Z-AspZPM molar ratio of 0.8 to 7 No consideration has been given to the stability in the event of a failure.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-131170 discloses the stabilization of a metalloprotease by adding an N-protected amino acid.
  • An object of the present invention is to improve the stability of the conventional thermolysin-like protease, particularly in the pH range of about 4.5 to 6.0, by solving the above-mentioned problems.
  • the synthesized samolysin-like protease was used in the coupling reaction between Z-Asp and L-PM to synthesize benzyloxycarbonyl-a-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester. Improve the efficiency of this synthesis method It is to provide a method. Disclosure of the invention
  • thermolysin-like protease The inventors have reported in the literature (Vriend.G. And Eijsink, V. (1993), J. Computer-Aided Molecular Design, 7, 367-396; Holmes, MA and Mattews, BW, (1982), J. Mol. Biol. 160, 623-639), and as a result of detailed analysis of the three-dimensional structure of thermolysin, if a void exists in the center of the enzyme molecule, and if this void can be filled, They found that it was possible to improve the stability of thermolysin-like protease.
  • thermolysin-like protease had a 144th leucine residue, a 149th threonine residue, a 240th alanine residue, and a 270th alanine residue.
  • the volume of vacancies at the electron density surrounded by the alanine residue at position 288 is determined by making one or more of the amino acid residues more hydrophobic than the amino acid residue. By substituting with amino acid residues having large sex or bulk, or by affecting amino acid residues surrounding electron density vacancies (performing amino acid substitution in the surrounding area), the vacancies are reduced.
  • thermolysin-like protease has a low pH and a high Z-Asp concentration.
  • the other protease It has been found that the stability is excellent, and the present invention has been completed.
  • the present invention relates to a method for synthesizing Z-APM by an enzymatic reaction using a thermolysin-like protease in a coupling reaction between Z-Asp and PM in an aqueous medium.
  • the volume of vacancies at the electron density surrounded by the 8th alanine residue is reduced by one or more amino acid residues, which are more hydrophobic and bulkier than the amino acid residue.
  • thermolysin-like protease Z—A by enzymatic reaction characterized by using The PM synthesis method, in particular, the amino acid residue to be substituted is preferably an amino acid residue selected from the group consisting of histidine, iso- mouth, leucine, phenylalanine, threonine, tyrosine, and valine. It is particularly preferred to use a novel thermolysin-like protease characterized in that the group is replaced by a phenylalanine residue or a tyrosine residue.
  • Table 1 shows the size of amino acid residues in bulk (unit: cm 3 / mo 1, literature (Zamyatn in, AA (1984) Annual Review Bio Bioengineering (Ann. Rev.) B ophys. B ioeng.), 13, 145-165)) and the magnitude of hydrophobicity ( ⁇ value, literature (Fauchere, JL and Bliss force (PI i ska), V. (1983)--D Bianja -Value from the chemistry (Eur. ⁇ Med Chem.), 18, 369-375).
  • an amino acid residue that is larger than the original amino acid residue may be selected and replaced.
  • a tyrosine residue And phenylalanine residues are suitable, and xylanalanine residues are preferred because of their large bulk and hydrophobicity.
  • xylanalanine residues are preferred because of their large bulk and hydrophobicity.
  • iso-isocyanate in addition to tyrosine and phenylalanine residues, iso-isocyanate, histidine and valine are also suitable. In particular, other than histidine, not only bulkiness is large but also hydrophobicity is preferred.
  • the conditions for synthesizing the Z—APM are as follows: the pH of the aqueous medium is 4.3 to 8.0, and the molar ratio of the Z—AspZPM is 0.8 to 1.7 (usually 1: 2). ), Characterized in that the charged concentration of Z-Asp is 0.2 mol / kg or more, and the conventional thermolysin-like protease described in JP-A-6-181 761 can be used. It also relates to the methods used for the synthesis of Z-APM in new and unlikely reaction systems.
  • the recombinant phage M 13 TZBa-Sp was transformed into type III, and the primers were amplified by PCR reaction using a mutagenesis primer and a reverse primer.
  • a mutant is obtained by digesting with restriction enzymes SphI and BamHI, substituting the SphI-BamHI fragment of plasmid PUBTZ2, and transforming E. coli.
  • Recombinant phage Ml 3 TZBa—Sp was used as type II, and a forward mutagenesis primer and an Ml 3 reverse mutagenesis primer were used to amplify between both primers by PCR reaction (PCR 1).
  • M13TZBa-Sp is used as type I, and a reverse reaction mutagenesis primer and M13 forward mutagenesis primer are used to amplify the region between both primers by PCR reaction (PCR2).
  • PCR2 PCR reaction
  • both DNA fragments were subjected to PCR using the mutagenized DNA fragments and the M13 forward mutation-directed primer and M13 reverse mutation-directed primer. Extend the fragment (PC R3).
  • the resulting mutagenized DNA fragment is digested with the restriction enzymes Sphi and BamHI, replaced with the Sphl-BamHI fragment of plasmid "PUBTZ 2," and transformed into Escherichia coli to transform the mutant.
  • Figure 4 shows this construction method.
  • Figure 1 shows the process for constructing plasmid pUCTZ 55 from plasmid pMK1. It is.
  • FIG. 2 is a flow chart for constructing M13 phage M13TZBa-Sp from plasmid pUCTZ55.
  • FIG. 3 is a process chart for introducing a mutation into the nprM gene cloned on the plasmid pUBTZ2 using M13TZBa-Sp.
  • FIG. 4 is a diagram showing a mutation introduction method by the PCR method.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of examining the stability of a thermolysin-like protease in which the 144th leucine residue was substituted with another amino acid residue.
  • Figure 6 shows the plasmid pUBTZ 2 (L144F) obtained by cloning the nprM gene in which the 144th leucine residue was replaced with a phenylalanine residue and the plasmid pUBTZ 2 (Clone of the double mutant enzyme). It is a process diagram for constructing a plasmid (L144F—D150WN227H) from D150WN227H).
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of measuring the stability of thermolysin-like protease.
  • protease encoded by the nprM gene is referred to as a wild-type enzyme. That is, a method of replacing the 144th leucine residue of the wild-type enzyme with a phenylalanine residue or a tyrosine residue will be described.
  • the digestion was carried out at 37 ° C for 2 hours using 5 units of I.
  • a DNA fragment of about 3.7 kb was separated from this sample by 1% agarose gel electrophoresis, and purified using a Bio101 Gene Clean DNA purification kit.
  • reaction solution 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5, 10 mM magnesium chloride, 10 mM sodium chloride, ImM DTT
  • the reaction was performed at C for 2 hours.
  • PstI-BamHI fragment of the nprM gene of pMK1 and the digested product of PstI-BamHI of pUC9 were reacted using a DNA ligation kit manufactured by Takara Shuzo.
  • E. coli JM109 was transformed according to a conventional method to obtain a recombinant plasmid (pUCTZTZ55) having a PstI-BamHI fragment of the nrM gene (FIG. 1).
  • plasmid pUCTZ55 was added to a reaction mixture (50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5, 10 mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride, ImM DTT) in 20 microliters of Sphl. And 5 units each of BamHI were added, and the mixture was digested at 37 ° C for 2 hours. A DNA fragment of about 730 kb was separated from this sample by 1% agarose gel electrophoresis, and purified using a Bio101 Gene Clean DNA purification kit.
  • ljtzg of the phage vector M13mp19 was transferred to a 20 microliter reaction solution (50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5, 10 mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride, ImM DTT). Then, 5 units each of Sphl and BamHI were added, and the mixture was digested at 37 ° C for 2 hours.
  • the ShI and BamHI fragments of the nprM gene thus obtained and the degradation product of M13m19 SphI and BamHI were used using a DNA ligation kit manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. A ligation reaction was performed. This reaction mixture was transformed into Escherichia coli JM109 by an ordinary method to obtain a recombinant phage (Ml3TZBa-Sp) containing the SphI-BamHI fragment of the nprM gene ( Figure 2 ) . From the obtained recombinant phage (M13TZBa-Sp), single-stranded DNA was prepared by a usual method and used for introducing amino acid substitution.
  • Oligonucleotides for the introduction of amino acid substitution used for the substitution of the 144th leucine residue with phenylalanine are shown below and in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the oligonucleotide for introducing an amino acid substitution used for substitution with tyrosine is shown below and in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • oligonucleotides were prepared using an Applied Biosystems, Inc., Model 380B DNA synthesizer. Hereinafter, these are referred to as reverse synthesis primers. 5 g of the prepared single-stranded DNA was added to a PCR reaction solution (67 mM Tris (pH 8.8), 16.6 mM ammonium sulfate, 6.7 mM magnesium chloride, 1 OmM 2— Mercaptoethanol, 0.2 mM d ATP.
  • a PCR reaction solution 67 mM Tris (pH 8.8), 16.6 mM ammonium sulfate, 6.7 mM magnesium chloride, 1 OmM 2— Mercaptoethanol, 0.2 mM d ATP.
  • a 20 microliter reaction solution containing half of the DNA obtained in this manner (50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5, 1 Om magnesium chloride, 100 mM sodium chloride 1 mM DTT ), And 5 units each of BamHI and Sphl were added and reacted at 37 ° C for 2 hours. In this way, about 70 bp fragment of the mutated np pM gene was obtained.
  • a shuttle vector pUBTZ2 Japanese Patent Laid-Open No. 184363/1993 capable of transforming both hosts of Bacillus subtilis and capable of expressing the nprM gene in both hosts was obtained from BamHI, A 7.4 kb fragment treated with SphI was obtained. The 7.4 kb fragment and the 730 bp fragment into which the mutation has been introduced are reacted using a DNA ligase kit manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd., and transformed into Escherichia coli JM109 according to a conventional method. PUBTZ 2 (L144F) and pUBTZ2 (L144Y) were obtained (FIG. 3).
  • the obtained supernatant was treated with phenol according to a conventional method, precipitated with ethanol, dried under reduced pressure, and then diluted with 0.2 milliliter of TE (10 mM tris-monohydrochloride buffer (pH 7.5), This was dissolved in 1 m EDTA) to obtain a plasmid.
  • TE tris-monohydrochloride buffer
  • the plasmid thus prepared was transformed into Bacillus subtilis MT-2 strain according to a conventional method, applied to an agar medium containing 1% casein and 20 gZ milliliter of kanamycin, and colonies forming 140 halos were formed. Selected.
  • the target enzymes L144F and L144 ⁇ were obtained as follows from the strain having the enzyme gene thus obtained. That is, Bacillus subtilis 2 1 strain / pUBTZ 2 (L144F) or Bacillus subtilis ⁇ —2 strain / pUBTZ 2 (L144F) or Bacillus subtilis ⁇ —2 strain / pUBTZ 2 (L144F) or Bacillus subtilis ⁇ —2 strain / pUBTZ 2 (L
  • the obtained solution was left at 4 ° C for 16 hours, and the enzyme was completely precipitated.
  • the precipitate containing the enzyme was collected by centrifugation at 8,000 rpm for 20 minutes.
  • Buffer A (1 OmM Tris-HCl pH 9, 10 mM calcium chloride, 0.3 M ammonium sulfate) in which the precipitate has been dissolved 100 Milliliters to 20 Milliliters of butyltoyopearl
  • the buffer (BU OmM Tris-HCl pH 9, 1 OmM calcium chloride) through the column to adsorb the enzyme. Flowed away.
  • the eluate containing the enzyme was collected, salted out with 60% saturated ammonium sulfate, and the precipitate was aged at 4 ° C overnight.
  • the precipitate was centrifuged at 100 rpm for 10 minutes at 100 rpm, and the precipitate thus obtained was buffered with buffer C (1 OmM Tris-HCl 7.0, 10 mM calcium chloride, 10 mM OmM sodium chloride) dissolved in 3 milliliters, using a gel filtration column (TSK Gel G 2000 SW2 1.5 x 600 mm) and its buffer as eluent. 4F and L144Y purified enzymes were obtained.
  • thermolysin-like protease in which the fourth leucine residue was substituted with an amino acid residue other than a phenylalanine residue and a tyrosine residue was produced, and its stability was examined in comparison with Example 2. did.
  • These proteases were produced in the same manner as in Example 1 except that random primers described below and represented by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing were used, and the stability of the protease was examined in Example 2. The same operation was performed.
  • Proteases in which the fourth and fourth leucine residues were substituted with amino acid residues other than furanalanine and tyrosine residues were identified by determining the base sequence of the plasmid.
  • Double mutant protease with high activity for Z-APM degradation and Z-APM synthesis (aspartic acid residue at position 150 is replaced with tryptophan residue, asparagine residue at position 227) was substituted with a histidine residue, and D 150 WN 2 27 H) was used as a starting material for the production of highly stable enzymes.
  • Plasmid was extracted from the transformed B. subtilis MT—2Zp UBTZ 2 (D150W—N227H) according to a conventional method, and a 20 microliter reaction solution (50%) containing 1 g of the plasmid was extracted.
  • mM Tris-HCl buffer pH 7.5, 10 mM magnesium chloride was digested with 5 units of A at I and 5 units of Sph I at 37 ° C for 2 hours, and further reacted at 70 ° C for 5 minutes. This sample was electrophoresed on a 1% agarose gel to obtain a DNA fragment of about 150 bp of D150WN227H containing a double mutation.
  • 1 ⁇ 3 is calculated using 5 units of 83 t I and 5 units of Sph I 37. C. Digested for 2 hours and reacted at 70 ° C for 5 minutes. This sample was electrophoresed on a 1% agarose gel to obtain a DNA fragment of about 7.6 kp containing the L144F mutation.
  • Bacillus subtilis MT—2 / p UBTZ 2 (L144FD150WN227H) was prepared in the same manner as in Example 1, and the transformant B. subtilis MT—2Zp UBTZ 2 (L 144 YD 15 OW-N 227 H) was also created.
  • buffer D 10 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.5 M guanidine hydrochloride, 1 OmM calcium chloride. Purification was performed according to the method described in Example 1 except that was used.
  • the two solutions were mixed to initiate the enzyme coupling reaction.
  • the solution after mixing had the composition shown in Table 2 below.
  • the enzymatic reaction was performed in a glass reaction vessel having a diameter of about 13 cm and kept at 40 ° C.
  • the reactor was equipped with a variable speed stirrer having blades 11 cm long at a depth of 2 cm from the liquid level, 0.5 cm from the bottom.
  • the stirring speed was adjusted to 150 rotations for 1 minute for 50 minutes after the start of the reaction, and thereafter to 300 rotations for 1 minute.
  • the pH of the reaction mixture was continuously measured during the reaction, and adjusted to 5.3 by adding 16% hydrochloric acid when the pH reached 5.3 or higher. After a certain time, a sample was taken out of the reaction vessel and analyzed for the concentration of Z-Asp, L-PM and the remaining enzyme by the following HPLC operation.
  • Z—Asp and L-PM were quantified on an HPLC system using a G2000 SW XL (TSK—GEL) column at 25 ° C. at a flow rate of one milliliter.
  • TSK—GEL G2000 SW XL
  • Detection of the eluted components was performed at 254 nm.
  • Residual enzyme concentration was also determined using an HP LC system using a Phenyl-5 PW RP (TSK-GEL) column at a flow rate of 1.2 milliliters Z and a temperature of 25 ° C. did.
  • the eluted enzyme was detected by absorption at 280 nm.
  • Table 3 shows the relationship between the conversion rate from Z—Asp to Z—APM and the residual rate of the enzyme.
  • Example 4 Using the wild-type enzyme and D150WN227H obtained in Example 3, the same operation as in Example 4 was performed using solutions having slightly different compositions shown in Table 4 below. Was.
  • the triple mutant enzyme (L144F—D150W-N227H) of the present invention is a conventional wild-type enzyme and double mutant enzyme (D15 0 W—N 2 27 H).
  • this thermolysin-like protease has a molar ratio of 0.8-1.7 (usually 2) between the starting substance Z-Asp and L-PM and the reaction mixture.
  • thermolysin-like proteases such as those with a pH of 4.3 to 3.8 (usually 7).
  • Such effects exhibit excellent effects in that the reaction can be continued for a long time and the amount of enzyme recovered after the reaction is improved.
  • Glu Ala lie Ser Asp lie Phe Gly Thr Leu Val Glu Phe Tyr Ala
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA) Array
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)

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Description

明 細 書
新規なサーモライシン様プロテアーゼ及びその用途 技術分野
本発明は、 水溶性媒体中で N—ベンジルォキシカルボ二ルァスパラギン酸 （以 降、 Z— A s p、 と略記し、 この Z— A s pは Z— L— A s p又は Z— A s ρラ セミ体を意味する） 及びフヱニルァラニンメチルエステル （以降、 P Mと略記し、 この P Mは L一 P M又は P Mラセミ体を意味する） のカツプリングにサーモリシ ン様プロテアーゼを使用して、 酵素反応によりべンジルォキシカルボ二ルー α— Lーァスバルチルー L—フエ二ルァラニンメチルエステル （以降、 Ζ— Α Ρ Μに 略記する） を合成する改善された方法に関連する。
この発明は高度に安定化された新規なサーモリシン様プロテア一ゼにも関連す る。
Ζ— Α Ρ Μは砂糖の約 2 0 0倍の甘味度を有し、 苦味が残らない等の優れた嗜 好性を有する重要な人工甘味料である a— L—ァスパルチル— L—フヱニルァラ ニンメチルエステル （以降、 A Ρ Μと略記する） の合成の前駆体である。 背景技術
水溶性媒体中で N—ベンジルォキシカルボ二ルァスパラギン酸及びフヱニルァ ラニンメチルエステルの力ップリングにサ一モリシン様プロテアーゼを使用して、 酵素反応によりベンジルォキシカルボニル— α— L—ァスバルチルー L—フエ二 ルァラニンメチルエステルを酵素反応により合成する方法は、 特開平 8 — 1 9 6
2 9 2に記載されている。 このプロセスにおいては、 Ζ— A s pと L— Ρ Μがほ ぼ等モル使用され、 反応系の p Hが 4 . 5〜6 . 0の範囲であり、 高濃度の塩が 必要であり、 反応中のサーモリシンの活性はかなり高いが、 反応開始時と比較し て、 反応終了時における酵素の活性低下は著しいことが分かっており、 この低下 は酵素の使用量が大きくなり、 コストアップに繫がってしまう。
ここで、 本発明をさらに理解するために、 サーモリシン及びその安定性に関す る情報を以下に示す。 サ一モリ シンはバチルス ·サ一モプロテオリチカス （Bacillus thermoproteo- lyticus ) の培養液中に最初に発見された金属プロテア一ゼである （エンド (Endo )， S. (1962) ジャナ -ルォブフェルメンテイシ 3ン テク ジ -(J. Fermentation Tech. ), 40, 346-353 ) o そのアミノ酸配列 （チタ二 (Titani),K.ら， (1972) ( ネイチ" ニュ- バイオロジ- (Nature New Biol. ), 238 , 35-37; ΕΡ-Α- 0418625; ミキ（Miki), Υ. (1994), ジャ-ナルォブモレキユラ -バイオロジ-（J. Mol. Biol. ) 160_, 623-639)や三次元構造 (ヴリエンド (Vriend), G. (199 3)，ジャ-ナルォブコンビユ-夕--エイデイト' モレキユラ-デザイン（J. Computer- Aided Molecular Design), 7_, 367-396 ； ホルメス（Holmes), M. A. and マンユ-ズ （Mat tews), B. W. , (1982), ジ t-ナ ルォブモレキユラ -パイれジ-（J. Mol. Biol. ) _260, 623- 639)及び触媒機構 ( ケスタ -(Kester), R. , . , and マシュ-ズ (Mat tews) B.W., (1982) ジャ-ナルォブバイオロジカルケミストリ- (J. Biol. Chem . ) 252, 7704-7710)が記載されている。
これらの記載によると、 サーモリシンの分子中に含まれる亜鉛イオンと同様に 1 4 3番目のグルタミ ン酸残基及び 2 3 1番目のヒスチジン力く、 サーモリ シンに おけるプロテアーゼ活性の発現に対して重要であることが指摘された。 これ以後、 これらの 1 4 3番目及び 2 3 1番目のァミノ酸残基をプロテア一ゼ反応に対する 触媒残基と略記する。
サ一モリシンと同様のァミノ酸配列を有し、 サーモリシンと同じ様な触媒活性 を有するプロテアーゼが文献 （例えば、 イマナカ（Imanaka)，ら， （1986) Nature, 32 4_, 695- 697)に報告された。 サーモリシンのァミノ酸配列の特定の場所に変異を 導入することに関する研究も文献 (クボ (Kubo), M.ら（1992)アブライト'アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジ-（Appl, Environ. Microbiol.), 58， 3779-3787) 及び特許出願 (EP-A -0.616.033) に報告されている。 その特許出願において、 1 4 4番目、 1 5 0番 目、 1 8 7番目及び 2 2 7番目への変異導入は、 酵素活性を向上することが示さ れている。 これ以降、 野性型サーモリシンの Z— A PM合成活性値の 1. 2〜1 0倍活性値が高いプロテアーゼを "サーモリ シン様プロテアーゼ" と略記する。 この様に、 ここで言う "サ一モリシン様プロテア一ゼ" とは、 アミノ酸配列が 配列表の配列番号 1に示すァミノ酸配列と一致するプロテアーゼか、 又は、 配列 表の配列番号 1に示すァミノ酸配列において、 一^ 3又はそれ以上のァミノ酸残基 が他のアミノ酸残基により置換されているプロテアーゼ、 又は、 一か所もしくは それ以上の場所に、 一残基もしくはそれ以上のアミノ酸残基が挿入されている力、、 もしくは、 一つ以上のアミノ酸残基が脱落しているァミノ酸配列を有する金属プ 口テア一ゼである。
野性型サ一モリシンや、 その様にして変異を導入したサーモリシンは、 中性付 近の緩衝液では非常に安定であり、 その様な pHでは非常に活性が高い。 サーモ リシン及び "サ一モリ シン様プロテア一ゼ" の安定性は、 pHが約 4. 5〜6の 範囲の弱酸中では減少する ；サーモリシンは pHが 4以下では完全に失活するこ とが知られている。
さらに、 サ一モリシンの安定性は、 ベンジルォキンカルボニル一 α—ァスパラ ギン酸 （以降、 Ζ— A s pと略記する。 ） の濃度により変化することが知られて おり （特開平 8— 1 3 1 1 7 0) 、 その中で、 サ一モリシンは、 30倍以上のモ ル比で Z— A s pを存在させると安定化し、 また、 この効果は Z— APMの合成 のための力ップリング反応に有利であるかもしれないと記載されている。 しかし ながら、 この特許においては、 長時間に亘る Z— APMの合成の間のサーモリシ ンの安定性や、 非常に低い活性触媒の濃度における Z APMカツプリング生成 反応については全く記述されていない。
また、 本発明者等の最近の検討により、 pH二 4. 5〜6の範囲では、 その力 ップリング反応において、 この酵素の安定性が十分でなく、 0. 3モル/リツ 卜 ル以上の Z— A s p濃度でも、 このカツプリング反応は効率的に実施できないこ とが明らかとなった。
一方、 文献 (ti-HNakanis i) ら（1990) アブライト'マイクロバイオロジ- パイォテクノロジ- (Appl. Microbiol. Biotechnol. )32, 633- 636)によると、 Z— A s pの存在はかえつて サーモリシンの安定性に悪影響を及ぼすことが示されている。―
他方、 サ一モリシンと反対に、 pH二 7付近で Z— APMの不安定であり、 p H= 4. 5〜6の弱酸中でより安定である。
pH = 7付近での Z— APMの不安定性と pH = 4. 5 ~ 6付近でのサ一モリ シンの不安定性は、 サーモリシンを使用する Z— A PMの合成を効率良く進める のに大きな障害となっている。 pH= 7付近でサ一モリシンを使用して Z— A s pと PMとのカツプリング反応により Z— APMを合成する場合は、 生成した Z 一 A PMと出発原料の PMが分解し、 サーモリシンが安定である力 Z-APM の回収率が低下するという問題がある。 また、 pH= 4. 5〜6付近でこの反応 を実施すると、 サーモリ シンが活性低下するという傾向があり、 原料および生成 物は安定であるが Z— A PMの効率的合成は困難である。
従って、 pH= 4. 5〜 6付近でのサ一モリシンの安定性を改善すれば、 Z— A P Mをこの p H領域で効率的に合成することができる。
先行文献としての （特開平 6— 1 8 1 7 6 1 ) には、 1 4 4番目口イシン残基、 1 5 0番目ァスパラギン酸残基、 1 8 7番目のグルタミン酸残基及び 2 2 7番目 のァスパラギン残基の少なくとも 1つのァミノ酸残基が他のァミノ酸残基と置換 することにより、 Z_AP M分解及び Z— A P M合成に対する酵素活性が改善さ れたことが開示されている。 ここでは、 Z— A s p/PMのモル比が約 0. 5で あり、 pH= 7付近で Z— APMが分解又は合成がされた。 し力、しな力〈ら、 この プロテア一ゼの安定性、 特に、 pH= 7以下で、 Z— A s pZPMのモル比が 0. 8〜し 7での Z— A PMの合成に使用された場合の安定性については、 全く検 討されていない。
他の先行文献として既述の特開平 8— 1 3 1 1 7 0には、 N—保護ァミノ酸の 添加による金属プロテアーゼの安定化について開示されている。 ここでは、 Z— A s pZPMのモル比が約 0. 5であり、 pH= 6付近で Z— APMが分解又は 合成がされた。 しかしながら、 この文献においても、 このプロテアーゼの安定性、 特に、 pH= 6以下で、 Z— A s pZPMのモル比が 0. 8~ 1. 7での Z - A PMの合成に使用された場合の安定性については、 全く検討されていない。
従って、 酵素の活性低下を少なくするプロセスの改善の必要性が存在していた。 さらに、 基質のモル比及び PH領域に関してより柔軟な反応条件が期待されてい る。
本発明の目的は、 上述の様な課題を解決し、 従来のサーモライシン様プロテア —ゼの安定性、 特に、 約 4. 5〜6. 0の pH領域での安定性を向上させ、 この 安定化されたサ一モライシン様プロテアーゼを Z— A s pと L— PMとのカップ リング反応に使用して、 ベンジルォキシカルボ二ルー a一 Lーァスパルチル— L 一フヱニルァラニンメチルエステルを合成して、 この合成方法の効率を向上する 方法を提供することにある。 発明の開示
発明者等は、 文献 (Vriend.G. and Eijsink, V. (1993), J. Computer- Aided M olecular Design, 7, 367-396; Holmes, M. A. and Mat tews, B.W., (1982), J. M ol.Biol. 160, 623-639) に明かにされているサ一モリシンの立体構造を詳細に解 析した結果、 酵素分子中央部に空隙が存在し、 この空隙を埋めることが出来れば、 サーモリシン様プロテア一ゼの安定性を向上させることが可能であることを突き 止めた。 さらに、 詳細に検討した結果、 そのサーモリシン様プロテアーゼにおい て、 1 4 4番目のロイシン残基、 1 4 9番目のスレオニン残基、 2 4 0番目のァ ラニン残墓、 2 7 0番目のァラニン残基、 2 8 8番目のァラニン残基により囲ま れている電子密度における空孔の容積を、 それらの残基の一つ又はそれ以上のァ ミノ酸残基を、 そのァミノ酸残基よりも疎水性又はかさの大きいァミノ酸残基に より置換することにより、 又は、 電子密度の空孔を囲むアミノ酸残基に影響を与 える （その周辺の部位のアミノ酸置換を行う） ことにより、 その空孔の少なくと も一部を埋めて、 その空孔の容積を減少させることが可能であること、 及び、 こ の様なサーモリシン様プロテア一ゼは、 低 pHや Z— A s pの濃度が高い状態に おいて、 他のプロテアーゼよりも安定性が優れていることを見出だし、 本発明を 完成するに至った。
即ち、 本発明は、 水溶性媒体中で、 Z— A s pと PMとのカップリング反応に サ一モリシン様プロテア一ゼを使用する酵素反応による Z— A PMの合成方法に おいて、 配列表 1のアミノ酸配列を有するサーモリシン中に存在し、 少なくとも 1 4 4番目のロイシン残基、 1 4 9番目のスレオニン残基、 2 4 0番目のァラニ ン残基、 2 7 0番目のァラニン残基、 2 8 8番目のァラニン残基により囲まれて いる電子密度における空孔の容積を、 それらの残基の一つ又はそれ以上のアミノ 酸残基を、 そのァミノ酸残基よりも疎水性及び嵩の大きいァミノ酸残基により置 換することにより、 又は、 電子密度の空孔を囲むアミノ酸残基に影響することに より、 その空孔の少なくとも一部を埋めて、 その空孔の容積を減少させる新規な サーモリシン様プロテア一ゼを使用することを特徴とする酵素反応による Z— A P M合成方法、 特に、 置換するアミノ酸残基としては、 ヒスチジン、 イソ口イシ ン、 ロイシン、 フヱニルァラニン、 スレオニン、 チロシン及びバリンの群から選 ばれるアミノ酸残基が好ましく、 さらに、 1 4 4番目のロイシン残基がフヱニル ァラニン残基又はチロシン残基で置換されることを特徴とする新規なサーモライ シン様プロテアーゼを使用することが特に好ましい。
以下の表 1に、 アミノ酸残基のかさの大きさ （単位： c m 3 /m o 1， 文献 （ ザミアトニン（Zamyatn i n), A. A. ( 1984) ァニュアル レビュ- ォブ バイオ ジカルバイオェンジニァリング (Ann. Rev . B i ophys. B i oeng. ), 13, 145- 165)からの値） 及び疎水性の大きさ （ττ値， 文献 (ファゥケレ（Fauchere), J. L. 及びブリス力（P I i ska), V. (1983) ョ -Dビアンジャ -ナルォブメディ力ルケミス トリ- (Eur.丄 Med Chem. ), 18, 369-375) からの値） を示す。
表 1
Figure imgf000008_0001
この表からも明らかな様に、 もとのアミノ酸残基よりもかさの大きなァミノ酸 残基を選んで置換すればよく、 例えば、 1 4 4番目のロイシン残基に対しては、 チロシン残基及びフヱニルァラニン残基が適当であり、 フ X二ルァラニン残基の 方が、 かさが大きいばかりでなく、 疎水性も大きく好ましい。 1 4 9番目のスレ ォニン残基に対しては、 チロシン残基及びフヱニルァラニン残基の他に、 イソ口 イシン、 ヒスチジン及びバリンも適当となる。 特に、 ヒスチジン以外はかさが大 きいばかりでなく、 疎水性も大きく好ましい。 また、 この Z— A PMの合成条件として、 その水溶性媒体の p H= 4. 3〜8 . 0、 Z— A s pZPMのモル比が 0. 8〜1. 7 (通常は 1 ： 2) の範囲、 Z 一 A s pの仕込み濃度が 0. 2モル/ k g以上であることも特徴とし、 特開平 6 - 1 8 1 76 1に記載されている従来のサ一モライシン様プロテアーゼは使用で きない様な新規な反応系での Z— A PMの合成に使用する方法にも関する。
アミノ酸残基を置換する方法としては、 特開平 6— 1 8 1 7 6 1にも記述され ている M 1 3ファージ変異生成方法 （ヴアンデャ-ル (Vandeyar) \1ら， （1988) ジ-ン (Ge ne), 65, 129)がある。 この方法は、 最初に、 プラスミ ド p U C T Z 55より S— p h^I - B amH I断片を取り出し、 制限酵素 S p h Iと^ jimH Iで消化した M 1 3 mp 1 9に組み換えることにより、 組み換え体ファージ Ml 3 TZ B a - S Pを作製する。 この組み換え体ファージ M 1 3 TZ B a— S pを铸型とし、 変異 導入プライマ一と逆方向プライマーを用いて PC R反応にて両プライマー間を增 幅し、 得られる変異導入 DN A断片を制限酵素 S p h Iと B amH Iにて消化し、 プラスミ ド PUBTZ 2の S ph l -B amH I断片と置き換え、 大腸菌に形質 転換することにより変異体が得られる方法である。
組み換え体ファージ Ml 3 TZBa— S pを铸型とし、 順方向変異導入プライマ 一と Ml 3逆方向変異導入プライマ一を用い、 P CR反応にて両プライマー間を 増幅する （P CR 1 ) 。 これとは別に M 1 3 TZB a-S pを铸型とし、 逆方向 変異導入プライマーと Ml 3順方向変異導入プライマ一を用い、 PCR反応にて 両プライマー間を増幅する （PCR2) 。 反応液中のプライマ一を除去した後、 変異導入された両 DN A断片と M 1 3順方向変異導人プライマ一及び M 1 3逆方 向変異導入プライマ一を用い、 PCR反応にて両 DNA断片を伸長させる （PC R3) 。 得られる変異導入された DNA断片を制限酵素 S p h iと B amH Iに て消化し、 プラスミ 卜" PUBTZ 2の Sp h l— B amH I断片と置き換え、 大 腸菌に形質転換することにより変異体が得られる。 この構築方法を図 4に示す。
図面の簡単な説明
図 1は、 プラスミ ド p MK 1からブラスミ ド p U C T Z 55を構築する工程図 である。
図 2は、 プラスミ ド pUCTZ 5 5から M l 3ファージ M l 3 TZ B a -S p を構築する工程図である。
図 3は、 M l 3 TZ B a— S pを用いてプラスミ ド p U B T Z 2上にクローン された n p rM遺伝子に変異を導入する工程図である。
図 4は、 P CR法による変異導入方法を示す図である。
図 5は、 1 4 4番目のロイシン残基を他のアミノ酸残基で置換したサ一モリシ ン様プロテアーゼの安定性を検討した結果を示す図である。
符号の説明
S ： セリ ン、 Q ： グルタミ ン、 C ： システィン、 W： トリプトファン、 E ： グ ルタ ミ ン酸、 A ： ァラニン、 L ： ロイシン、 N ： ァスパラギン、 H ： ヒスチジン、 T ： スレオニン、 F ： フエ二ルァラニン、 Y ： チロシン
図 6は、 1 4 4番目のロイシン残基をフヱニルァラニン残基に置換した n p r M遺伝子をクローニングしたプラスミ ド pUBTZ 2 (L 1 4 4 F) と二重変異 体酵素をクローニングしたプラスミ ド pUBTZ 2 (D 1 5 0 W-N 2 2 7 H) からプラスミ ド （L 1 4 4 F— D 1 5 0 W-N 2 2 7 H) を構築する工程図であ る。
図 7は、 サーモリシン様プロテアーゼの安定性を測定した結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下の実施例及び比較例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれら の実施例により何等制限されるものではない。
実施例 1
前述したサーモリシンと同一のァミノ酸配列を有するプロテアーゼの遺伝子 n p rMを用いた表記プロテア一ゼの製造方法について説明する。 なお、 以下、 n p rM遺伝子にコードされたプロテアーゼを野性型酵素と呼ぶ。 即ち、 野性型 酵素の 1 4 4番目のロイシン残基をフヱニルァラニン残基またはチロシン残基に 置換する方法を述べる。
n rMを含むプラスミ ド pMK 1の 1 gを 2 0マイクロリツ トルの反応液 7
( 50 mM トリス一塩酸緩衝液 pH7. 5、 1 0 mM 塩化マグネシウム、 1 0 0 mM 塩化ナトリウム、 1 mM DTT) に於いて、 B amH I、 P s t
Iの各 5ュニッ 卜により 37 °Cで 2時間分解させた。 このサンプルから 1 %ァガ ロースゲル電気泳動で約 3. 7 k bの DNA断片を分離し、 バイオ 1 0 1社ジー ンクリーン DN A精製キッ トを用いて精製した。
一方、 プラスミ ドベクター pUC 9の 1〃 gを含む 20マイクロリツ トルの反 応液 （50mM トリス—塩酸緩衝液 pH7. 5、 1 0 mM 塩化マグネシゥ ム、 l O OmM 塩化ナトリウム、 ImM DTT) に於いて、 P s t I— B a mH Iの各 5ユニッ トによって 37。Cで 2時間反応させた。
このようにして得られた pMK 1の n p r M遺伝子の P s t I— B amH I断 片と pUC 9の P s t I -B amH Iの消化物を宝酒造社製 D N Aライゲーショ ンキッ トを用いて反応させ、 常法にしたがって大腸菌 JM 1 09に形質転換し、 n r M遺伝子の P s t I一 B amH I断片を持つ組換え体ブラスミ ド （ p U C TZ 55) を得た （図 1 ) 。
さらにプラスミ ド pUCTZ 55の 1 gを 20マイクロリツ トルの反応液 （ 50 mM 卜リス—塩酸緩衝液 pH7. 5、 1 0 mM 塩化マグネシウム、 1 00 mM 塩化ナトリウム、 I mM DTT) において、 S ph l及び B amH Iの各 5ュニッ トを加えて 37 °Cで 2時間分解させた。 このサンプルから 1 %ァ ガロースゲル電気泳動で約 730 k bの DNA断片を分離し、 バイオ 1 0 1社ジ ーンクリーン DN A精製キッ トを用いて精製した。
一方、 ファージベクター M 1 3mp l 9の l jtzgを、 20マイクロリ ツ トルの 反応液 （50mM トリスー塩酸緩衝液 pH7. 5、 1 0 m 塩化マグネシ ゥム、 1 00mM 塩化ナトリウム、 I mM DTT) に於いて、 S p h l及び B amH Iの各 5ュニッ トを加えて 37 °Cで 2時間分解させた。
このようにして得られた n p rM遺伝子の S h I及び B amH I断片と、 M 1 3 m 1 9の S p h I及び B amH Iの分解物とを宝酒造社製 D N Aライゲー シヨンキッ トを用いて連結反応を行った。 この反応混合物を、 通常の方法で大腸 菌 JM1 09に形質転換し、 n p rM遺伝子の S p h I - B amH I断片を含む 組換え体ファージ （Ml 3 TZ B a -S p) を得た （図 2 ) 。 得られた組換え体ファージ （M l 3 TZ B a - S p) から、 通常の方法で、 1 本鎖 DNAを調製し、 アミノ酸置換の導入に用いた。
第 1 4 4番目のロイシン残基のフヱ二ルァラニンへの置換に使用されたァミノ 酸置換導入用ォリゴヌクレオチドを以下及び配列表の配列番号 2に示した。
配列番号 2 ：
5 ' -TAC CGCATGCGTGAACTCATGTG- 3 '
S p h I P h e
また、 チロシンへの置換に使用されたアミノ酸置換導入用オリゴヌクレオチド を以下及び配列表の配列番号 3に示した。
配列番号 3 ：
5 ' -TAC CGCATGCGTGTACTCATGTG- 3 '
S p h I Ty r
これらのオリゴヌクレオチドはアプライ ドバイオシステムズ社製 3 8 0 B型 D N A合成装置を用いて作成した。 以下これらを逆方向合成プライマ一と呼ぶ。 調製した一本鎖 DN A O. 5 gを P CR反応溶液 （6 7 mM トリス （p H 8. 8) 、 1 6. 6 mM 硫酸アンモニゥ厶、 6. 7 mM 塩化マグネシウム、 1 O mM 2—メルカプトエタノール、 0. 2mM d ATP. 0. 2 mM d GTP、 0. 2 mM dTTP、 0. 2 mM d CTP、 1 順方向 M 1 3 ユニバーサルプライマー、 1 M 逆方向合成プライマ一） に溶かして、 1ュニ ッ 卜の T t h DNAポリメラーゼを加えて、 ミネラルオイルを一滴重層し、 変 性を 9 3 で 1分、 ァニールを 4 5 で 1分、 伸長を Ί で 4 5秒とし、 遺伝 子の増幅反応を 3 0サイクル繰り返した。 反応終了後、 水層を回収し、 常法に従 つてフヱノール抽出、 エタノール沈殿を行い、 増幅された DNAを回収した。 このようにして得られた DNAの半分量を含む 2 0マイクロリツ トルの反応液 （ 5 0 mM トリス—塩酸緩衝液 PH 7. 5、 1 O m 塩化マグネシウム、 1 0 0 mM 塩化ナトリウム 1 mM DTT) に B amH I、 S p h l各 5ュニ ッ トを加えて 3 7 °Cで 2時間反応させた。 このようにして変異の導入された n p 丄 M遺伝子の約 7 3 0 b p断片を得た。
—方、 三宅らによって既に構築されいるシャ トルベクター、 即ち、 大腸菌及び 枯草菌の両方の宿主で形質転換が可能であり、 双方の宿主に於いて n p r M遺伝 子を発現できるすることができるシャ トルベクター pUBTZ 2 (特開平 5— 1 84 363 ) を B amH I、 S p h Iで処理した 7. 4 k b断片を得た。 この 7 . 4 k b断片と変異の導入された 730 b p断片とを宝酒造社製 DNAライゲ一 シヨンキッ トを用いて反応させ、 常法に従って大腸菌 JM1 09に形質転換し、 変異の導入された組換体プラスミ ド pUBTZ 2 (L 1 44 F) および pUBT Z 2 (L 1 4 4 Y) を得た （図 3 ) 。
形質転換体大腸菌の生えている寒天培地上にアルカリ溶液 （0. 2 N 水酸化 ナトリウム、 0. 2% SDS) 3 ミ リリッ トルを加えて溶菌させ、 1 ミ リリツ トルを回収した。 この回収した溶液に 1 ミリリッ トルの 5 M—酢酸カリウムを加 えて氷中に 1 0分間放置したのち、 8 000 r pmで 20分間遠心分離して、 沈 殿物を除去した。 得られた上澄みを常法に従ってフ ノール処理、 エタノール沈 殿し、 減圧下で乾燥した後、 0. 2ミ リリッ トルの TE ( 1 0 mM 卜リス一塩 酸緩衝液 （pH 7. 5) , 1 m E D T A) に溶解し、 プラスミ ドを得た。 こ うして調製したプラスミ ドを常法に従って枯草菌 MT— 2株に形質転換し、 1 % カゼィンおよび 20 gZミリリッ トルのカナマイシンを含む寒天培地に塗布し 、 1 40個のハローを形成するコロニーを選択した。
これらのコロニーを、 それぞれ 20 gZミリリッ トルのカナマイシンを含む LB培地 3ミリ リッ トル中、 37°Cで一夜培養し、 培養液から常法に従ってブラ スミ ド pUBTZ 2を抽出し、 B amH I、 S p h Iで処理を行い、 730 b ρ の DNA断片を回収した。 回収した DNA断片の塩基配列をアプライ ドバイオシ ステムズ社 （現在は、 パーキンエルマ一社） 製 DN Aシーケンサー 37 3 Aで分 析し、 1 44番目のアミノ酸残基がフヱニルァラニン残基である遺伝子 n p r M (L 1 44 F) またはチロシン残基である遺伝子 n p r M (L 1 4 4 Y) を有す るコロニーを選択した。
このようにして得られる酵素遺伝子を有する菌株から目的の酵素 L 1 4 4 F及 び L 1 44 Υを以下の様に得られた。 即ち、 本発明の遺伝子を有する枯草菌 ΜΤ 一 2株/ pUBTZ 2 (L 1 4 4 F) 又は枯草菌 ΜΤ— 2株/ pUBTZ 2 (L
1 44 Y) を、 5〃 g/ミ リリツ トルの濃度でカナマイシンを含む 5 ミ リ リッ ト ルの LB培地に接種し、 培養種として 3 7 °Cで 8時間培養した。 その培養種を食 塩以外は LB培地の 2倍の成分を有する 2 L培地に接種して、 菌株を 3 7°Cで 2 0時間培養した。 培養時における培養種の量は、 6 6 0 nmでの培養液の吸光度 が 0. 0 2の値となる量とした。 培養後、 培養液は、 8 0 0 0 r pmにて 2 0分 間遠心分離し、 培養液の上澄を得てから、 その上澄に 6 0%飽和になるように硫 安を加えた。 得られた溶液は、 4°Cで 1 6時間放置し、 当該酵素は完全に沈殿し た。 酵素を含有する沈殿は 8， 0 0 0 r pmにて 2 0分間遠心分離により回収し た。 その沈殿を溶解した緩衝液 A (1 OmM 卜リス—塩酸 pH 9、 1 0 mM 塩化カルシウム、 0. 3M 硫酸アン乇ニゥム） 1 0 0 ミ リ リ ッ トルを 2 0 ミ リリッ トルのブチルトヨパールのカラムに、 酵素を吸着させるために通し、 緩衝 液 B U OmM 卜リス—塩酸 pH 9、 1 OmM 塩化カルシウム） を酵素 と不純物を別々に溶離させるために、 1. 5 ミ リリツ トル Z分の流速で流した。 当該酵素を含有する溶離液を集め、 6 0 %飽和硫安にて塩析し、 その沈殿を 4°C で一夜放置して熟成した。 この沈殿を、 1 0, ϋ 0 0 r pmで 1 0分間遠心分離 し、 このようにして得られた沈殿を緩衝液 C (1 OmM トリスー塩酸 H 7 . 0、 1 0 mM 塩化カルシウム、 1 0 OmM 塩化ナトリウム） 3 ミ リリッ ト ルに溶解し、 ゲル濾過カラム （TSK G e l G 2 0 0 0 SW2 1. 5 x 6 0 0 mm) 及び溶離液としてその緩衝液を使用して、 L 1 4 4 F及び L 1 4 4 Y の精製酵素を得た。
実施例 2
(新規プ口テァ一ゼの安定性の評価）
精製した L 1 4 4 F又は L 1 4 4 Yを 0. 81^の∑—八 5 と 1 0 mMの塩化 カルシウムを含む 0. 1 Mの酢酸ナトリウムの緩衝液 （pH 5. 0) に溶解し、
1 6時間 4 0°Cに保持した後にその溶液中に残存する酵素量を高速液体クロマ卜 グラフィーにより定量した。 TSKゲル フエ二ルー 5 PW RP (4. 6 mm
I. D. 7. 5 cm) を高速液体クロマトグラフィーのカラムとして使用し、 溶離は、 ァセトニトリルを含有する 1 0 mM酢酸力リウ厶を溶離液として使用し 、 し 2 ミ リリツ トル Z分の流速で実施した。 酵素の検出は、 2 8 0 nmでの光 吸収により実施した。 溶液の培養後の酵素の残存率は図 5に示されている。 L 1 4 4 Y酵素と L 1 4 4 F酵素は両方共、 サーモリ シン様のァミノ酸配列と同じ配 列を有する野性型酵素の約 2倍の高い残存率を示し、 本発明の両方の酵素は高い 安定性を有することが明らかとなつた。
比較例 1
1 4 4番目のロイシン残基をフヱニルァラニン残基及びチロシン残基以外のァ ミノ酸残基に置換したサ一モリ シン様プロテアーゼを製造し、 実施例 2と比較し て、 それらの安定性を検討した。 以下及び配列表の配列番号 4に示す塩基配列で 記載されるランダムプライマーを使用する以外は、 実施例 1と同様な操作でこれ らのプロテアーゼを製造し、 プロテアーゼの安定性の検討を実施例 2と同様の操 作で実施した。
配列番号 4 ：
5 -TACCGCATGCGT (C or C)(G, T, C or A)(G,T or A)CTCATGTG - 3 '
Sph 1 144番目のアミノ酸残基
1 4 4番目のロイシン残基をフ 二ルァラニン残基及びチロシン残基以外のァ ミノ酸残基に置換したプロテア一ゼはプラスミ ドの塩基配列の決定により同定し た。
それらの安定性の結果は図 4に示されている。 L I 4 4 T (ロイシン残基がス レオニン残基に置換されている。 ） 及び L 1 4 4 H (ロイシン残基がヒスチジン 残基に置換されている。 ） は、 両方とも野性型酵素よりも安定性が高いが、 L 1 4 4 F又は L 1 4 4 Yの安定性よりも低いことが明らかとなった。 L 1 4 4 Sは 野性型酵素の安定性以下であつた。
実施例 3
Z— A PM分解及び Z - A PM合成に対して高い活性を有する二重変異体プロ テアーゼ （ 1 5 0番目のァスパラギン酸残基をトリプトファン残基に置換し、 2 2 7番目のァスパラギン残基をヒシチジン残基で置換した D 1 5 0 W-N 2 2 7 H) を高安定性酵素の製造の出発原料として使用した。
形質転換体枯草菌 MT— 2Zp UBTZ 2 (D 1 5 0W— N 2 2 7 H) から、 常法に従ってプラスミ ドを抽出し、 この 1 gを含む 2 0マイクロリツ トルの反 応液 （5 0 mM ト リス—塩酸緩衝液 p H 7. 5、 1 0 mM 塩化マグネシゥ ム、 l O OmM 塩化ナトリウム、 1 mM DTT) を A a t I及び S p h Iの 各 5ユニッ トにより 37 °Cで 2時間消化させ、 さらに 70°Cで 5分間反応させた 。 このサンプルを 1 %ァガロースゲルによる電気泳動により二重の変異を含む D 1 50 W-N 227 Hの約 5 30 b pの DNA断片を得た。
一方、 実施例 1にて作成した L 1 4 4 Fの変異を含むプラスミ ド pUBTZ 2
1〃3を八3 t I及び Sph Iの各 5ュニッ トにより 37。Cで 2時間消化させ、 さらに 70°Cで 5分間反応させた。 このサンプルを 1 %ァガロースゲルによる電 気泳動により L 1 44 Fの変異を含む約 7. 6 k pの DNA断片を得た。
プラスミ ド PUBTZ 2 (L 1 44 F) からこの様にして得られた約 7. 6 k bの DNA断片及びプラスミ ド PUBTZ 2 (D 1 50 W-N 22 7 H) からこ の様にして得られた約 530 b pの DN A断片を宝酒造社製ライゲーションキッ 卜を使用して連結させ、 この反応混合物を常法に従って、 大腸菌 JM1 03に形 質転換し、 変異の導入された形質転換体 JM 1 03ZpUBTZ 2を得た。 置換 したアミノ酸残基は、 プラスミ ドのヌクレオチド配列の同定によって確認した。 図 6に組換えブラスミ ド pUBTZ 2 (L 1 4 4 F-D 1 50W-N 227 H) の構築方法を示す。
このプラスミ ド DN Aを使用して実施例 1と同様に形質転換体枯草菌 MT— 2 /p UBTZ 2 (L 1 44 F-D 1 50 W-N 227 H) を作成し、 形質転換体 枯草菌 MT— 2Zp UBTZ 2 (L 1 44 Y-D 1 5 OW-N 227 H) も作成 した。
この形質転換体枯草菌からの二種類の変異体酵素 L 1 44 F-D 1 5 OW-N
227 H及び L 1 44 Y-D 1 5 OW-N 227 Hの精製は、 緩衝液 Bの代わり に緩衝液 D (1 0mM トリス—塩酸 pH 8. 5、 0. 5 M 塩酸グァニジン、 1 OmM 塩化カルシウム） を使用した以外は、 実施例 1に示した方法に従って 精製した。
以上のようにして作成した酵素の安定性を実施例 2と同様に評価したところ、 L 1 44 F-D 1 5 0W-N2 27 H及び L 1 44 Y— D 1 50W— N2 27 H は両方共、 野性型酵素や元の D 1 50 W-N 227 Hに比べて、 高い安定性を示 した。 安定性の評価結果を図 7に示した。 実施例 4
実施例 3の方法で作成した L 1 4 4 F-D 1 5 0 W-N 2 2 7 Hを使用して実 際の Z— A PM合成を実施した。 L— PM ( 1 8 9 g ; 7 1 2. 6 mmo l ) 及 び Z— A s p ( 1 1 3 g ： 6 3 3. 3 mmo 1 ) を水に溶解して懸濁液を製造し た。 溶液の pHを 2 2 %の水酸化ナトリウム溶液で 5. 3に調整し、 1 5 5 gの 塩化ナトリウムを添加した。 この調製した溶液は透明であった。 同時に酵素液を 2. 5 gの酵素と 3. 3 6 gの C a C 1 2を水に添加して調製した。
この両方の溶液を混合して、 酵素カップリング反応を開始した。 この混合後の 溶液は以下の表 2に示される組成となった。
表 2
Figure imgf000017_0001
酵素反応は約 1 3 cmの直径を有し、 4 0 Cに保温されたガラス製反応容器中 で実施された。 この反応器には、 底部から 0. 5 cmの所で、 液面から 2 cmの 深さに長さ 1 1 cmの羽根を有する可変速度式の攪拌機が設置された。 攪拌速度 は反応開始後 5 0分間は 1分間 1 5 0回転に調節され、 それ以降は 1分間 3 0 0 回転に調節された。 反応混合物の p Hは反応中連続的に測定され、 pHが 5. 3 以上になったら 1 6 %の塩酸を添加して、 5. 3に調整された。 ある時間の後、 サンプルを反応容器から取り出し、 以下の HP L C操作により Z— A s p， L一 PM及び残存している酵素の濃度を分析した。
Z— A s pと L一 PMを、 G 2 0 0 0 SW XL (TSK— GE L) カラムを 使用する H P L Cシステムにより、 1 ミ リリッ トルノ分の流速、 2 5°Cで定量し た。 溶離液として、 pH= 5. 6の 0. 1 5 M酢酸緩衝液を含む 7 0 / 3 0のァ セトニトリル/水混合液を使用した。 溶離成分の検出は 2 5 4 nmで実施した。 残存している酵素の濃度もまた、 Ph e n y l— 5 PW RP (TSK-GE L) カラムを使用する HP L Cシステムにより、 1. 2 ミ リ リ ッ トル Z分の流速、 2 5°Cで定量した。 この分折においては、 溶離液 A (pH= 6の酢酸カルシウム 緩衝液を含有する 5/9 5のァセトニトリル Z水混合液） 及び溶離液 B (pH = 6の酢酸カルシウム緩衝液を含有する 60/4 0のァセトニトリルノ水混合液） から成る傾斜溶離液を使用した。 以下の様な傾斜を使用した： 0〜4分、 AZB = 9 0/1 0, 4〜 1 0分、 6分間で AZB= 9 0ノ 1 0から 4 0 6 0に変化 させた。 溶離した酵素は 2 8 0 nmの吸収で検知した。
Z— A s pからの Z— AP Mへの転換率と酵素残存率の関係を表 3に示す。 表 3
Figure imgf000018_0001
比較例 2〜 3
野生型酵素及び実施例 3で得られた D 1 5 0 W-N 2 2 7 Hを使用し、 以下の 表 4に示される若干異なる組成の溶液を使用して実施例 4と同様の操作を実施し た。
表 4
Figure imgf000019_0001
得られた結果を以下の表 5に示す c
表 5
Figure imgf000019_0002
この表から明らかな様に、 本発明の三重変異体酵素 （L 1 4 4 F— D 1 5 0W -N 2 2 7 H) は、 従来の野性型酵素、 二重変異体酵素 （D 1 5 0 W— N 2 2 7 H) と比較して安定性が優れていることが明らかとなった。 産業上の利用可能性
本発明の新規なサ一モリシン様プロテアーゼは、 野性型サーモリシゃ他の変異 導入サーモリシン様プロテア一ゼ （例えば、 1 5 0番目のァスパラギン酸残基を トリブトフアン残基に置換し、 2 2 7番目のァスパラギン残基をヒスチジン残基 に置換したサ一モリシン様プロテア一ゼ） よりも安定性に優れ、 特に、 p H= 5 付近での溶液中でも安定である。 また、 このサーモリシン様プロテアーゼは、 出 発物質 Z— A s pと L一 PMのモル比が 0. 8 ~ 1. 7 (通常は 2 ) 及び反応液 の pHが 4. 3〜3. 8 (通常は 7) のような従来のサ一モリシン様プロテア一 ゼでは使用不可能な新しい Z— A P M合成系でも使用が可能である。 このような 効果により、 反応を長時間継続できることや反応後の酵素の回収量が向上するこ となどの点で優れた効果が発揮される。
尚、 本発明における配列表は以下のように示される。
配列表 配列番号： 1
配列の長さ ： 3 1 6
配列の型：アミ ノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：蛋白質
起源：バチルス属
配列
He Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly 1 5 10 15
Asp Gin Lys Asn He Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu
20 25 30
Gin Asp Asn Thr Arg Gly Asn Gly lie Phe Thr Tyr Asp Ala Lys
35 40 ― 45
Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn
50 55 60
Gin Phe Phe Ala Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr
65 70 75
Tyr Ala Gly Val Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg
80 85 90
Leu Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Ala Ala lie Arg Ser Ser Val His
95 100 105
Tyr Ser Gin Gly Tyr Asn Asn Ala Phe Trp Asn Gly Ser Gin Met
110 115 120
Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gin Thr Phe lie Pro Leu Ser Gly
125 130 135
Gly lie Asp Val Val Ala His Glu Leu Thr His Ala Val Thr Asp
140 145 150 Tyr Thr Ala Gly Leu lie Tyr Gin Asn Glu Ser Gly Ala lie Asn
155 160 165
Glu Ala lie Ser Asp lie Phe Gly Thr Leu Val Glu Phe Tyr Ala
170 175 180
Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu lie Gly Glu Asp Val Tyr Thr Pro
185 190 195
Gly lie Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro Ala Lys
200 205 210
Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr Gin
215 220 225
Asp Asn Gly Gly Val His lie Asn Ser Gly lie lie Asn Lys Ala
230 235 240
Ala Tyr Leu He Ser Gin Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val
245 250 255
Val Gly lie Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys He Phe Tyr Arg Ala
260 265 270
Leu Thr Gin Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gin Leu Arg
275 280 285
Ala Ala Ala Val Gin Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser
290 295 300
Gin Glu Val Ala Ser Val Lys Gin Ala Phe Asp Ala Val Gly Val
305 310 315
Lys 配列番号： 2
配列の長さ ： 2 3
配列の型：核酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列
TACCGCATGC GTGAACTCAT GTG 23 配列番号： 3
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
TACCGCATGC GTGTACTCAT GTG 23 配列番号： 4
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
TACCGCATGC GTSNDCTCAT GTG 23

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 水溶性媒体中で、 N—ベンジルォキシカルボ二ルァスパラギン酸及びフエ 二ルァラニンメチルエステルとの力ップリングにサ—モリシン様プロテアーゼを 使用する酵素反応によるべンジルォキシカルボニル一 α— L—ァスバルチルー L —フヱ二ルァラニンメチルエステルの合成方法において、 配列表の配列番号 1の ァミノ酸配列を有するサーモリシン中に存在し、 少なくとも 1 4 4番目の口イシ ン残基、 1 4 9番目のスレオニン残基、 2 4 0番目のァラニン残基、 2 7 0番目 のァラニン残基、 2 8 8番目のァラニン残基により囲まれている電子密度におけ る空孔の容積を、 それらの残基の一つ又はそれ以上のアミノ酸残基を、 そのアミ ノ酸残基よりも疎水性及びかさの大きいァミノ酸残基により置換することにより、 又は、 電子密度の空孔を囲むアミノ酸残基に影響を与えることにより、 その空孔 の少なくとも一部を埋めて、 その空孔の容積が減少していることを特徴とする新 規なサ一モライシン様プロテア一ゼを使用することを特徴とする酵素反応による ベンジルォキシカルボニル一 a - L—ァスパルチル一 L —フェニルァラニンメチ ルエステルの合成方法。
2 . 請求項 1に記載の合成方法において、 電子密度における空孔の容積が、 1 4 4番目、 1 4 9番目、 2 4 0番目、 2 7 0番目及び 2 8 8番目のアミノ酸残基 を、 その残基よりも大きなモル容積を有し、 ヒスチジン、 イソロイシン、 口イシ ン、 フヱニルァラニン、 スレオニン、 チロシン及びバリンの群から選ばれるアミ ノ酸残基に置換することにより、 その空孔の容積が減少していることを特徴とす る酵素反応によるべンジルォキシカルボニル一 a— L—ァスバルチルー L—フエ ニルァラニンメチルエステルの合成方法。
3 . 請求項 2に記載の合成方法において、 1 4 4番目のロイシン残基がフヱニ ルァラニン残基又はチロシン残基で置換していることを特徴とする酵素反応によ るべンジルォキシカルボニル一 α— L—ァスバルチルー L —フヱニルァラニンメ チルエステルの合成方法。
4 . 請求項 1 ~ 3のいずれかに記載の合成方法において、 1 5 0番目のァスパ ラギン酸残基、 1 8 7番目のグルタミン酸残基及び 2 2 7番目のァスパラギン残 基の少なくとも一^ 3を他のァミノ酸で置換していることを特徴とする酵素反応に よるベンジルォキンカルボニル一 a - Lーァスパルチル一 L—フヱ二ルァラニン メチルエステルの合成方法。
5 . 請求項 1 ~ 4のいずれかに記載の合成方法において、 酵素カップリング反 応を p Hが 4 . 3〜8 . 0の範囲にあることを特徴とする酵素反応によるべンジ ルォキシカルボニル一 - Lーァスバルチルー L一フヱニルァラニンメチルエス テルの合成方法。
6 . .請求項 5に記載の合成方法において、 N—べンジルォキシカルボ二ルー L ーァスパラギン酸及び L一フヱニルァラニンメチルエステルを酵素力ップリ ング の基質として使用することを特徴とする酵素反応によるべンジルォキシカルボ二 ルー a一 Lーァスバルチルー Lーフヱ二ルァラニンメチルエステルの合成方法。
7 . 請求項 6に記載の合成方法において、 L—ァスパルチル— L—フヱニルァ ラニンメチルエステルに対する N—べンジルォキシカルボニル一 Lーァスパラギ ン酸のモル比が 0 . 8〜1 . 7の範囲にあることを特徴とする酵素反応によるべ ンジルォキシカルボ二ルー a一 Lーァスバルチルー L一フヱニルァラニンメチル エステルの合成方法。
8 . 請求項 〜 7のいずれかに記載の合成方法において、 N—べンジルォキシ カルボ二ルー Lーァスパラギン酸の濃度が 0 . 2モル Z k g以上であることを特 徴とする酵素反応によるべンジルォキシカルボニル— α— L—ァスバルチルー L 一フヱニルァラニンメチルエステルの合成方法。
9 . 配列表の配列番号 1のァミノ酸配列を有するサ一モリシン中に存在し、 少 なく とも 1 4 4番目のロイシン残基、 1 4 9番目のスレオニン残基、 2 4 0番目 のァラニン残基、 2 7 0番目のァラニン残基、 2 8 8番目のァラニン残基により 囲まれている電子密度における空孔の容積を、 それらの残基の一つ又はそれ以上 のァミノ酸残基が、 そのァミノ酸残基よりも疎水性及びかさの大きいァミノ酸残 基により置換していることにより、 又は、 電子密度の空孔を囲むアミノ酸残基に 影響を与えることにより、 その空孔の少なくとも一部が埋められ、 その空孔の容 積が減少していることを特徴とする新規なサーモライシン様プロテアーゼ。
1 0 . 請求項 9に記載の新規なサ一モライシン様プロテアーゼにおいて、 電子 密度における空孔の容積が、 1 4 4番目、 1 4 9番目、 2 4 0番目、 2 7 0番目 及び 2 8 8番目のアミノ酸残基を、 その残基よりも大きなモル容積を有し、 ヒス チジン、 イソロイシン、 ロイシン、 フエ二ルァラニン、 スレオニン、 チロシン及 びバリンの群から選ばれるアミノ酸残基に置換することにより、 その空孔の容積 が減少していることを特徴とする新規なサーモライシン様プロテアーゼ。
1 1 . 請求項 9に記載の新規なサーモライシン様プロテアーゼにおいて、 1 4 4番目のロイシン残基がチロシン残基で置換していることを特徴とする新規なサ 一モライシン様プロテアーゼ。
1 2 . 請求項 9に記載の新規なサーモライシン様プロテア一ゼにおいて、 1 5 0番目のァスパラギン酸残基、 1 8 7番目のグルタミン酸残基及び 2 2 7番目の ァスパラギン残基の少なくとも一つが他のァミノ酸で置換していることを特徴と する新規なサーモライシン様プロテアーゼ。
1 3 . 明細書及び実施例に実質的に記載されている酵素反応によるベンジルォ キシカルボニル一 α - Lーァスパルチル一 L—フエ二ルァラニンメチルエステル の合成方法及び高度に安定化されたサーモライシン様プロテアーゼ。
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