WO1997007207A1

WO1997007207A1 - Co-precipitant et procede d'extraction d'acides nucleiques

Info

Publication number: WO1997007207A1
Application number: PCT/JP1996/002263
Authority: WO
Inventors: Mitsugu Usui; Mari Yamaguchi; Motohito Kaneshima; Akiji Aoki
Original assignee: Sanko Junyaku Co., Ltd.
Priority date: 1995-08-21
Filing date: 1996-08-09
Publication date: 1997-02-27
Also published as: EP0792932A4; DE69632904D1; EP0792932B1; EP0792932A1; DE69632904T2; JP3108105B2; US6815541B1

Description

明細書

共沈荊及び核酸の抽出方法技術分野

本発明は、血液、尿、髄液、痰、精液、細胞、組織、生検標本等の生物材料及び Z又は被験試料からの核酸抽出の過程におけるアルコール処理による核酸の回収操作において、核酸と同じ挙動を示し、遠心分離操作により目視可能な沈殿物として沈殿し、高い回収率で再現性よく核酸を回収するために使用する共沈剤及びその共沈剤を用いた核酸の抽出方法に関する。背景技術

最近核酸プローブを用いた研究や診断が急速に進歩し、検体処理の簡略化及び核酸以外の不純物を取り除き高純度に核酸を精製することが重要となっている。たとえば、核酸ハイブリダィゼーシヨンを行う場合、 DNA 試料の精製が不十分だと DNA に蛋白が結合したり、また炭水化物を含んでいると制限酵素による DNA の消化を阻害するため、制限酵素の塩基配列を認識することができず、満足の行く成績を得ることができない。また、 BNA 試料を用いた核酸ハイブリダィゼーシヨンを行う場合も、 RNA 試料の精製が不十分であると核酸ハイブリダィゼーションで満足の行く成績を得ることができない。核酸ハイブリダイゼーションを行う場合または制限酵素による DNA の消化を行う場合には、あらかじめ DM を充分に精製することが大切である。

非放射性標識法によるプローブの検出の場合、不純物が混入した試料を用いると試薬に用いた抗体やアビジンが非特異的に不純物に結合し、判定を誤ってしまうことがある。

精製 DNA または UNA を調製するには通常基本的に 4つの操作を行う必要がある。すなわち、 ①細胞の溶解、 ②除蛋白と脱炭水化物、 ③分離濃縮、 ④洗浄精製の

4つの操作である。 ①細胞の溶解にはリゾチーム、ァクロモぺプチダーゼなどの細胞壁溶解酵素やプロティンナーゼ K等の蛋白分解酵素を用いたり、アル力リや

S D S等の界面活性剤を用いて細胞を破壊する。また結核菌やぶどう球菌等強固な細胞壁を持つ微生物の場合、ビーズや超音波を用いて物理的に破壊させたりする。場合によってはこれに併用して細胞壁溶解酵素や蛋白分解酵素を作用させたり、アル力リゃ界面活性剤添加を組合わせて行う。

②の除蛋白と脱炭水化物については従来よりフヱノール · クロ口ホルム法による抽出が最も多く使用されている。しかしこのフヱノール · クロ口ホルム法は毒性が強いうえ時間と手間がかかるため大変扱いにくいという問題があった。

即ち、このフエノール ' クロ口ホルム法においては、 DNA は水性液体層（上層 ) に、変性蛋白質は水性液体層と有機液体層（下層）との中間層に綿状の白い層をつくるので、その白い層を吸い込まないように DNA 層を注意深く口の広いビぺットを用いて静かに吸い取り、新しいマイクロチューブに移すというような面倒な作業を必要とする。この操作には、時間がかかりかつ熟練を必要とするから DN A 回収の再現性に悪影響を及ぼし、しかも大量処理が困難であった。

②の後に③分離濃縮操作においては、核酸を舍む水性液体から 1 0 0 %のィソプロビルアルコール又は 1 0 0 %のエタノール等で核酸（DNA または RNA ) を沈殿させて分離濃縮するが、従来の分離濃縮操作では、核酸を舍む水性液体の塩濃度が高いため、この段階でイソプロビルアルコール（終濃度が 5 0 % ) 又はエタノール（終濃度が 7 0 % ) 等を加えても、核酸の沈殿物が無色透明であるため確認できず、この段階で核酸沈殿物を捨ててしまうことがあり、十分に核酸を回収することができなかった。核酸の抽出効率と抽出の正確度は、第一に、この分離濃縮操作時の核酸と共沈剤をいかにもれなく回収するかに依存する。

④洗浄精製においては、通常 7 0 %エタノールを用いて、分離濃縮された核酸から不純物を取り除き精製する。

これまでに抽出法を簡便に効率よく行うためにフヱノール · クロ口ホルム法の改良が試みられているが、フェノールの危険性を避けるためにフェノール ' クロ口ホルムを用いない方法も開発されている。

たとえば、リンパ球に感染する H I V— 1、 E Bウィルスを検査するために、血液サンプルから DNA を抽出する場合、へパリン採血した血液をトリトン X— 1 0 0で処理、遠心後沈殿物にグァニジンィソチオシァネートを加えた後ィソプロバノールを加え DNA を折出、エタノール洗浄を行う方法があり、この方法では 2 時間以内に DMA を抽出することができる。

この方法はたいへん簡単ではあるが、対象試料が血液に限られ必ずしも一般的ではない。

さらに、迅速に核酸を抽出分離するための核酸抽出カラムを用いた方法もあるが、高価であるため処理コストがかかるという問題があり、一般には使いにくいという問題がある。

最近安価にかつ迅速に核酸を抽出する方法として CTAB (臭化セチルトリメチルアンモニゥム）等の陽イオン界面活性剤の DNA 結合性を利用した方法が報告されている（特開平 2— 3 1 6 9 6号公報）。

この方法は細胞破壊の前処理後、 CTABを加え有機溶剤中で核酸と CTABの複合体を形成させた後、高塩濃度の水溶液に溶解して DNA と CTABを解離し、エタノールまたはイソプロバノールで DNA を回収する方法である。この方法は危険性の高いフユノールは使わないものの実際には遠心、洗浄も多く操作も面倒である。

上記の問題点を解決し、核酸を簡便、迅速かつ高純度に抽出 '精製する傾斜（デカンテーシヨン）又は転倒分取可能な方法として、生物材料から核酸を溶出するための前処理を行ったのち、この前処理した生物材料にチキソトロビック増粘剤を舍む非親水性の高比重有機液体と水性液体を加えて混合し、遠心分離後、上層と下層の境界面に非流動性の凝集層を形成し、上層の核酸を分離抽出するようにした核酸の抽出方法、いわゆる凝集分配法は既に提案されている（特開平 4一 2 2 0 7 3 8号公報）。

—方、近年、ボリメラーゼチエインリアクション（Po l ymerase cha in reactio n以下、 PCR と略称する）とリバーストランスクリプションボリメラーゼチヱインリァクション ( Reverse transcri p t i on Po l ymerase chai n reaction以 f、 T - PCRと略称する）の開発により極めて微量の核酸を短時間に増幅し検出することが可能となった。この PCR や RT- PCRによる核酸の検出では、まず目的の遺伝子を増幅し、その増幅 DNA をァガロースゲル電気泳動法やハイブリダィゼーシヨン法などを用いて検出するが、確実に検出できるか否かは被験試料からの核酸の抽出とそれに続く cDNA合成と PCR に用いられるプライマーに大きく依存している。ことに微量な核酸の抽出においては、保存状況による被験試料成分の質的変化や病気の進展にともなう核酸の量的変化に影響されることなく、高純度でしかも高回収率に抽出できる方法でなければならない。

現在、核酸の抽出にはグァニジンチオシァネートとフヱノール及びク口口ホルムを組み合わせた方法（AGPC法と呼ばれる）が広く用いられているが、微量な核酸の抽出において特に留意すべき点は、タンパク質を除いた後のィソプロビルァルコールやエタノール等によるアルコール沈殿操作における確実な核酸の回収である。

—般的に被験試料中の核酸が微量な時は、アルコールによる沈殿操作時に各種生物由来のリボソーム RNA やトランスファーを共沈剤として添加するが、目的の核酸が RNA の場合は、抽出した RNA を逆転写反応により DNA に変換してから PCR による増幅反応を行うために、共沈剤が逆転写反応を阻害してしまう問題点がある。また、グリコーゲン等を共沈剤として添加した場合、抽出した核酸との親和性が低くまた沈殿物は目視不能又は確認が困難なために微量な核酸の抽出には問題がある。

本発明は、上記の従来技術の問題点に鑑みて発明されたもので、イソプロビルアルコールゃエタノール等のァルコール沈殿による核酸を舍む水性液体からの核酸の分離濃縮操作の過程において、核酸と親和性を有し、逆転写反応と競合せず、 PCR 反応を阻害しないで、テクニカルエラーを最小限に抑えるべく、白い沈殿物または青い沈殿物として目視を可能にすると同時に核酸の回収率を確実にする共沈剤及びその共沈剤を用いた核酸の抽出方法を提供するものである。発明の開示

上記課題を解决するために、本発明の共沈剤は、生物材料及び又は被験試料から遠心分離操作によって核酸を抽出する過程において、核酸と同じ挙動を示し、各種アルコールによる分離濃縮処理時に白色又は青色の目視可能な沈殿物として沈殿する性質を有する。上記アルコールとしてはイソプロビルアルコール又はエタノールなどが用いられる。マイクロチューブ等の遠心分離管を用いる遠心分離操作においては、上記沈殿物は遠心分離管の底に付着する。本発明の共沈剤として使用する物質は、デンプンゃデンプンの構成成分であるアミロース、アミ口べクチン、またはこれらの誘導体を使用し、アルコール沈殿における微量な核酸を白い沈殿物または青い沈殿物として目視を可能にするようにしたものである。即ち、本発明の共沈剤として用いられる物質は、長鎖ダルコース結合多糖類、色素修飾長鎖グルコース結合多糖類又はこれらの誘導体が好適である。

本発明で用いられる共沈剤の長鎖グルコース結合多糖類の具体例としては、デンプンやデンプンの誘導体である、ソリュブルスターチ（Soluble Starch), コーンスターチ（Corn Starch)，ボテトスターチ（Potato Starch),ボテトソリュブルスターチ（Potato soluble Starch) ,ホイールスターチ（Wheal Starch), スターチアズール（Starch Azure)等を挙げることができる。

• または、デンプンの構成成分やその誘導体である、コーンアミ口べクチン（Cor n Amylopectin) , ポテトアミロぺクチン（Potato Amy lopectin) , アミロぺクチンアンスラニレート（Amylopectin Anthrani late) , ァミロぺクチンァズ一ル（Amylo pectin Azure)，ィンソリュブルコ一ンアミロぺクチン (Insoluble Cone Amylopec tin) , ソリュブルポテトアミ σぺクチン（Soluble Potato Amylopectin) , コーンアミロース（Cone Amylose) , ポテトアミロース（Potato Amy lose) , アミ口一スァズール（Amyiose Azure) などを用いることが好ましい。

色素修飾長鎖グルコース結合多糖類の修飾される色素として好適な色素にァズールがあげられる。ァズール（Azure) としては、レマゾ一ルブリリアントブル一アール（Remazol Brilliant Blue R) , レマゾールブリリアントブル一アールーディーキシラン（Remazol Brilliant Blue -_D- Xylan), レマゾールブリリアントバイオレツト 5アール（Remazol Brilliant Violet 5R)などを用いることができる。

共沈剤を溶解する適当な水溶液には、蒸留水、または、 T. E緩衝液（一般的には 5 O mMのトリスヒドロキシメチルァミノエタン—塩酸緩衝液 PH8.0 · 20mMの EDTA) 等の緩衝液や塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カルシウム，塩化マグネシゥム，酢酸ナトリウム. 塩化アンモニゥム. 酢酸アンモニゥム，硫酸アンモニゥム等の無機塩およびその混合物があり、通常、約 0.1M〜10.0M の範囲の濃度で使用する。本発明で用いられる共沈剤の濃度は 0.5 〜100 g/rak 好ましくは 5 〜50 g/mlである。

本発明の核酸の抽出方法の第 1の態様は、生物材料及び/又は被験試料から核酸を溶出するための前処理を行ったのち、この前処理した生物材料及び又は被験試料の蛋白質の除去処理を行い、核酸を舍む水性液体を分離し、分離した当該核酸を舍む水性液体にィソプロピルアルコール又はエタノール等のアルコ—ルを加えて混和し遠心分離して核酸を分離濃縮せしめるにあたり、核酸とともに沈殿する共沈剤として上記共沈剤を用いるものである。

上記方法における除蛋白処理としては、フヱノールによる相分離抽出、力オト口ビック剤による蛋白質の可溶化、陽ィォン界面活性剤による核酸複合体の形成、ガラスフィルターによる核酸の捕捉又は磁気ビーズによる核酸の捕捉を用いることができる。

また、本発明の核酸の抽出方法の第 2の態様は、生物材料及び/又は被験試料から核酸を溶出するための前処理を行つたのち、この前処理した生物材料及び又は被験試料にチキソト口ビック增粘剤を舍む非親水性の高比重有機液体と水性液体を加えて混合し、遠心分離後、上層と下層の境界面に非流動性凝集層を形成させることにより核酸を含有する上層を容易に分離し、分離した当該核酸を含む水性液体にィソプロピルアルコール又はエタノール等のアルコールを加え、混和し遠心分離して核酸を分離濃縮せしめるにあたり、核酸とともに沈殿する共沈剤として上記共沈剤を用いるものである。この核酸の抽出方法は、一般に凝集分配法と呼ばれる。

本発明でいう生物材料及び/又は被験弑料とは、血液、尿、髄液、痰、精液、細胞、組織、生検標本、酵母、真菌、細菌、ウィルス、培養細胞等を指称するものである。

本発明方法において上層と下層の境界面で凝集層を形成させるチキソトロビック增粘剤としては、蛋白質等の汚染物質と結合性がありかつ高比重有機液体に分散性のある増粘剤が用いられる。

本発明で用いられるチキソトロピック增粘剤としては、ベントナイト有機誘導体を用いるのが好ましい。ベントナイト有機誘導体には、スメクタイト粘土の有機誘導体、ヘクトライト粘土の有機誘導体、モンモリナイト粘土の有機変性体、精製したスメクタイト拈土、特殊処理スメクタイト粘土、精製有機鉱物粘土等を用いることができる。本発明のチキソトロビック增粘剤として用いられるスメクタイト拈土の有機誘導体としては、 BENT0NE 27 (ェヌ ' エル ' ィンダストリィズ ' ィンコーポレーテッド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）、 BENT0NE 34 (ェヌ ' エル ' ィンダストリィズ . ィンコーポレーテッド製、チクソトローブ及びゲル化剤の商品名）、 BENT0NE 38 (ェヌ ' エル · ィンダストリィズ ' ィンコーポレーテツド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）、 BENTONE SD- 1 (ェヌ 'エル 'ィンダストリィズ · ィンコーポレーテツド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）、 BENTONE SD-2 (ェヌ 'エル ' インダストリィズ ' インコーポレーテッド製、チクソトローブ及びゲル化剤の商品名）、 BENTONE SD-3 (ェヌ ·エル · ィンダストリィズ · ィンコーポレーテツド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）等を好適に举げることができる。

また、本発明のチキソトロビック增粘剤として用いられるモンモリナイト粘土の有機変性体としては BENTONE 128 (ェヌ · エル ' ィンダストリィズ ' インコーボレーテッド製、チクソトロ一プ及びゲル化剤の商品名）、 BNT0NE 500 (ェヌ • エル · ィンダストリィズ ' ィンコーポレーテ 'ンド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）、精製したスメクタイト粘土としては MACAL0I D、特殊処理スメクタィト粘土としては、 BENTONE EW (ェヌ · エル · ィンダストリィズ ' ィンコーポレーテツド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）、精製有機鉱物粘土としては BENTONE LT (ェヌ 'エル ' ィンダストリィズ ' ィンコーポレーテッド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）等を好適に挙げることができる。

また、本発明のチキソトロビック増粘剤として用いられるスメクタイトの有機誘導体としては、 BENTONE 34 (ェヌ · エル · ィンダストリィズ ' ィンコーポレーテツド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）、 BENTONE SD-3 (ェヌ · エル • ィンダストリィズ ' ィンコーポレ一テッド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）、 BENTONE LT (ェヌ · エル · ィンダストリィズ ' ィンコーポレーテツド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）、 BENTONE EW (ェヌ ' エル ' ィンダストリイズ ' インコーポレーテッド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）、 MACAL0ID等を好適に挙げることができる。

しかし、本発明で用いられるチキソトロビック增粘剤は、本発明における非流動性の凝集層を形成するものであれば使用可能であり、上記した增粘剤に限定されるものでない。

本発明でいう高比重有機液体とは、水に難溶性又は不溶性の密度 (gem- ³) として 1. 05以上の有機液体が適当である。

高比重有機液体として好適に用いられるものには、四塩化炭素、二硫化炭素等の無機化合物、クロ口ホルム、 1 , 2 —ジクロロェタン、 1 , 2 —ジブロモェタン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、クロ口ベンゼン、ブロモベンゼン、 0 ージクロロベンゼン等のハロゲン化合物、 2, 2, 2 — トリフルォロエタノール、フヱノール等のアルコール、フルフラール等のアルデヒド、炭酸プロピレン、リン酸トリェチル等の酸誘導体、ニトロメタン、ニトロベンゼン等のニトロ化合物、スルホラン等の硫黄化合物がある。

また、上記の高比重有機液体の安定剤として添加する適当なアルコールとしては、メタノール、エタノール、 1 一プロパノール、 2 —プロパノール、イソアミルァノレコール、 1 —ブタノール、 2 —ブタノール、イソブチルアルコール、シク口へキサノール、エチレングリコール、 2 —メトキシェタノール、 2 —エトキシエタノール等を使用する。

核酸を上層に溶出するための水性液体としては、水または塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，酢酸ナトリウム，塩化アンモ二ゥム，酢酸アンモニゥム，硫酸アンモニゥム等の無機塩および塩酸ジメチルァミン，塩酸トリメチルァミン等の有機塩を水溶液として用い、通常、約 0. 1M〜10 .0M の範囲の濃度で使用するのが好ましい。この時核酸の回収率を高くするために、この水溶液に 0. 01〜10% の適当な陰イオン界面活性剤または非イオン性界面活性剤を加えてもよい。高比重有機液体層と水性液体層との比は約 1 : 5 から 5 : 1 であり、これらの層は混和されたのち遠心分離によって形成された境界面の凝集層によって、下層の高比重有機液体層と上層の水性液体層とに分配させられ、傾斜（デカンテーション）で水性溶媒層（上層）が取り出される。本発明の共沈剤は、核酸の抽出操作におけるどの段階でも単独あるいは他の共沈剤といっしょに添加することができる。例えば、 ①核酸抽出前の生物材料中に直接添加するか、又は、生物材料を破壊（細胞の溶解）して核酸を溶出するときに添加する、 ②タンパク質の除去操作のときに添加する、 ③核酸の分離濃縮操作のときに添加する、 ④核酸の洗浄精製操作のときに添加するのいずれの段階においても添加可能である。

上記した生物材料の破壊は、生物材料をキレート剤を含む緩衝液（PH5 〜9)中で前処理したのち、細胞膜または細胞壁等を破壊するために通常は約 0. 1%〜10.0 % (W/V)の範囲の濃度の陰ィォン界面活性剤や非ィォン性界面活性剤等の膜溶解剤と約 1M〜5Mのグァ二ジンチオシネートまたは約 1M〜5Mの塩酸グァ二ジン等のタンパク変性剤で処理することをいう。場合によっては細胞膜や細胞壁等を破壊するための酵素によって処理してもよい。

上記した細胞膜や細胞壁等を破壊するための酵素として好適に用いられるものは、約 1 mg/m l から 50mg/m l の濃度のリゾチーム、ァクロモぺプチダーゼ、リゾスタフィン、リチカーセ、ムタノリシン等の膜溶解剤によって、もしくは約 10 g /m l から 20mg/m l の濃度のタンパク変性剤、たとえばプロテアーゼ K 、プロナーゼ、ペプシン、パバイン等がある。

上記したような前処理を行うと、生物材料は上記したキレート剤、膜溶解剤、タンパク変性剤等を含む水溶液に溶解し、この水溶液中には核酸と各種の生物物質が可溶化する。

次に、蛋白質の除去操作は、大きく分けてフニノールやチキソトロピック增粘剤を用いる相分配法と蛋白質を可溶化する方法の 2つがある。

前者のフヱノールでは、水飽和フユノールまたは緩衝液飽和フヱノールを用いて、フユノールの蛋白質変性作用と水溶液と 2層に分離する性質を利用して蛋白質を除去する。

—方、チキソトロピック増粘剤によるタンパク質の除去操作は、チキソトロピック增粘剤を舍む高比重有機液体、または高比重有機液体の混合物、もしくはこれらの高比重有機液体とアルコールの混合物と核酸を上層に抽出するための水性液体を可瑢化した生物材料中に加えて混合したのち遠心分離する。この時、蛋白質等の污染物質と結合したチキソトロビック增粘剤は、遠心分離による遠心力と高比重有機液体の浮力により中間層（境界面）に集められる。

その結果、チキソトロビック増粘剤の濃度が高くなり増粘効果に伴った粘性の変化によって非流動凝集層が形成され、傾斜（デカンテーシヨン）により蛋白質を除去する。後者では、 1価の陰イオンでイオン半径の大きなヨウ素イオン（I - ) やトリフルォロ酢酸ィオン（CF₃C00 - ) 等のカオトロビックィォンを用いて、蛋白質などの疎水性分子の水溶性を増加させてその疎水結合を弱めることにより蛋白質を除去する。

上記した③のアルコールによる核酸の分離濃縮操作は、例えば、核酸を舍む水溶液に等量の 1 0 0 %ィソプロバノール（終濃度が 5 0 % ) 、又は 2倍量の 1 0 0 %エタノール（終濃度が 7 0 % ) を加えて核酸を分離濃縮させればよい。

上記した④のアルコールによる核酸の洗浄精製操作は、 7 0 %エタノールを加えて核酸を洗浄精製させればよい。

本発明は、 C型肝炎、肝臓ガン等の発症原因とされるウィルスの核酸である H C V— R N Aの抽出において、特に有用である。図面の簡単な説明

図 1は、本発明方法による転倒分取においての核酸を舍む水性液体層の分離の手順を示すもので、マイクロチューブにおける上層と下層の分離状態を示す図面である。

図 2は、本発明方法による転倒分取によっての核酸を舍む水性液体層の分離の手順を示すもので、マイクロチューブにおける上層と下層の界面に非流動性の凝集層が形成された状態を示す図面である。

図 3は、本発明方法による転倒分取によっての核酸を舍む水性液体層の分離の手順を示すもので、転倒分取操作によって上層を新しいマイクロチューブに移す状態を示す図面である。

図 4は、本発明方法による核酸を舍む水性液体の分離濃縮の手順を示すもので、核酸を舍む水性液体にアルコールを添加した状態を示す図面である。

図 5は、本発明方法による核酸を舍む水性液体の分離濃縮の手順を示すもので、共沈剤と核酸との沈殿物の生成状態を示す図面である。

図 6は、本発明方法による核酸を含む水性液体の分離濃縮の手順を示すもので、図 5の状態から混和液体を廃棄した状態を示す図面である。発明を実施するための最良の形態

以下に、本発明の実施例を挙げて説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されるものでないことは勿論である _β

〔実施例 1〕

C型肝炎ウィルスの 5'- 非翻訳（noncoding) 領域をクローニングして合成した HCV- NA を 10¹ コビ一〜 10⁴ コピー/ 100〃 I となるように調製したものを 100 μ 1 と共沈剤として ΙΟ ί/g のアミロぺクチンァズール（Amylopectin Azure) 〔シグマ社製品番号 A 4 6 4 0 (SIGMA Product Number A 4 6 4 0 ) 〕を 1.5ml の滅菌済マイクロチューブに加え、セバジーン— RV (三光純薬（株）製核酸抽出試薬〕の試薬 I (共沈剤としてグリコーゲンを舍む）を 300 μ 加えて均一に混合した後、 300 μ \ のセパジーン一 RV 〔三光純薬（株）製核酸抽出試薬〕の試薬 IIと 600 μ \ のセバジーン一 RV 〔三光純薬（株）製核酸抽出試薬〕の試薬 III を添加して上下に 10分間激しく振盪混和する。 0 て（氷水中）で 15分間放置した後、 12 .OOOrprn で 15分間（4 て）遠心分離を行ない、 HCV-RNA を舍む上層（水層）をデカンテーシヨンにより別のマイクロチューブに移す。上層（水層）と等量の 1 0 0 %イソプロピルアルコールを加え転倒混和後、 -20 てで 45分間放置した HCV-RN A を折出させ、 12，000r_Pm で 15分間（4 て）の遠心分離を行い、上清を除去し、マイクロチューブの底に付着しているペレツト（HCV- RNA は青い共沈物として目視で確認できる）に 70% エタノールを加え混和する。さらに 12,000r_Pm で 10分間 (4 て）遠心分離した後、上清を除去する（HCV-RNA は青い共沈物として目視で確認できる）。次に約 5 分間減圧乾燥して滅菌再蒸留水に溶解し、この溶解液について cDNA合成反応を行った後、 2段階（Two step) PCR法を行った。増幅された PCR 産物は 2%ァガロースゲル電気泳動後、ェチジゥムブ口マイドにて染色し、バンドの有無により抽出効率を確認し、その結果を表 2に示した。

上記の cDNA合成反応は、 HCR- UNA 抽出画分に予め調整したマスターミックス（ Master Mix. ) 〔滅菌蒸留水 3.75 1 , 5 Xファーストストランドバッファー（Π rst strand buffer) 2 1, 2.5mM ディェヌティビーミックスチヤ一（dNTPmixt ure) 2/ 1, 0.1エムディティティ（MDTT) 1, lOpraol アンチセンスプライマ一 (Antisens primer) 0.5 μ I) を加え、 70'Cで 1 分間， 55'Cで 1 分間反応させた後、急冷し、アールェヌェ一エスィン（RNasin) (ブロメガ（Promega) 社製〕 0.5 μ ΐ, ェムェムエルヴィリバーストランスクリプターゼ（MMLVreverse transcriptase) 〔ビ一アールエル（BRL) 社製〕 0.25/ 1 を加え、 37てで 30分間および 95Ϊで 5 分間の逆転写反応を行った。

上記の 2段階（Two step) PCR法は、合成した cDNA全量（10 1)に、 10X反応緩衝液（reaction buffer) 2.5 し 2.5mM ディェヌティビーミックスチヤ一（ dNTPmixture) 2 1 ,滅菌蒸留水 10.2 1， lOpmol センスプライマ一（sensprim er) 0.25 1, 5U/ μ I タク DNAボリメラ一ゼ（Taq DNA polymerase) 〔宝酒造（株）製〕 0.05 1 を加え、 94'Cで 1 分間， 55 'Cで 1 分間， 72'Cで 1 分間， 30サイクルでファースト（1st) PCR を行った。次に、 10X反応緩衝液（reaction buf fer) 5 〃1, 2.5mM ディェヌティビーミックスチヤ一（dNTPmixture) 1〃1，滅菌蒸留水 41.9 1,内側の lOpmol ブライマー（Primer) 〔センスプライマー（sensp rimer) 'アンチセンスプライマ一 (antisensprimer) ] 各 0.5 μ 1, 51 〃 1 タク DNAポリメラーゼ（Taq DNA Polymerase) 0.1// 1 にファースト（1st) PCR 産物 1 u l を加え、 94てで 1 分間， 55てで 1 分間， 72てで 1 分間， 30サイクルでセカンド（2nd) PCR を行った。 PCR に使用したプライマーは、 HCV-RNA の 5' - 非翻訳領域に設定したプライマーを使用した。

この時の実施例における HCV-RM の抽出の操作性においては、イソプロピルァルコールによる沈殿操作から HCV-RNA を青い共沈物として目視で確認できた。また、表 1に示すごとく、回収率においても、確実に 1 0¹コビーの合成 H C V- RNAを抽出することができた。

〔比較例 1〕

本発明の共沈剤（アミロぺクチンァズール）を添加しないこと以外は、実施例 1と同様の実験を行い、その結果を表 1に示した。本比較例では、イソプロピルアルコールによる核酸の分離濃縮操作において、核酸の目視はできなかった。表 1 合成 HCV-RNAの血清希釈による抽出限界試験

合成 HC V— RNAのコピー数

¹》 + ：ァガロースゲル電気泳動でバンドが確鎵されたサンブル。〔実施例 2〕

上記した実施例 1で使用した 1. 5 m 1のマイクロチューブを 2. 2m lのマィク πチューブに変えて、 600〃 Iの 1 0 0 %イソプロピルアルコールの代わりに、 1 20 0〃 1の 1 00 %のエタノールを加えて、実施例 1と同様に同じ合成 H C V-RNAを用いて HC V-RNAの抽出を行った。

この時の実施例における H C V— R N Aの抽出の操作性においては、 1 0 0% のエタノールによる沈殿操作から H C V— R NAを青い共沈物として目視で確認できた。また、回収率においても、確実に 1 0 'コビーの合成 H C V— RNAを抽出することができた（表 2 ) 。

表 2 合成 H CV-R N Aの血清希釈による油出限界轼験

合成 HCV— RNAのコビー数

°+：ァガロースゲル電泳動でバンドが確 ISされたサンプル。〔実施例 3〕

HCV 陰性の新鮮なヒト正常血清を用いて、 C型肝炎患者血清を 10' 倍〜 10⁷ 倍まで希釈して調製した 100 μ 1 の被験試料を 1.5ml の滅菌済マイクロチューブに加え、セバジーン一 R V 〔三光純薬（株）製核酸抽出試薬〕の試薬 I (共沈剤としてグリコーゲンを含む）を 300 u 1加えて均一に混和した後、 300 μ ΐ のセパジーン一 R V 〔三光純薬（株）製核酸抽出試薬〕の試薬 IIと 600 μ \ のセバジ一ンー R V 〔三光純薬（株）製核酸抽出試薬〕の試薬 ΠΙ を添加して上下に 10分間激しく振盪混和する。 0 'C (氷水中）で 15分間放置した後、 12,000rpm で 15分間 (4 *C) 遠心分離を行ない、 HCV-RNA を舍む上層（水層）をデカンチーションにより別のマイクロチューブに移す。上層（水層）に共沈剤として 30〃g のアミ口ぺクチンァズール（Amylopectin Azure) 〔シグマ社製品番号 A 4 6 4 0 (SIGMA Product Number A 4 6 4 0 ) 〕と 600 μ 1 のイソプロピルアルコールを加え転倒混和後、 -20 ·(：で 45分間放置して HCV-RNA を折出させ、 12,000rpm で 15分間（て）の遠心分離を行い、上清を除去し、マイクロチューブの底に付着しているペレット（HCV-RNA は青い共沈物として目視で確認できる）に 70% エタノールを加え混和する。さらに 12,000r_PIn で 10分間（4 て）遠心分離した後、上清を除去する（HCV-RJiA は青い共沈物として目視で確認できる）。次に約 5 分間減圧乾燥して滅菌再蒸留水に溶解し、この溶解液について実施例 1と同様に cDNA合成反応を行った後、 2段階（Two step) PCR法を行った。増幅された PCR 産物は 2¾ァガロースゲル電気泳動後、ェチジゥムブ口マイドにて染色し、バンドの有無により抽出効率を確認した。

この時の実施例におけるの抽出の操作性においては、イソプビルアルコールによる沈殿操作からを青い共沈物として目視で確認できた。また、回収率においても、確実に 1 0⁵倍希釈の患者血清からHC V— RNAを抽出することができた（表 3 ) 。

表 3

C型肝炎患者希釈血清による抽出限界轼駿

H C V 患者血清の希釈倍数

1> ァガ口" -スゲル電気泳動でパンドが確越されたサンプル。

ァガロースゲル電気泳動でバンドが確靱できなかったサンプル _β

〔実施例 4〕

上記した実施例 1で使用した 1. 5 m 1のマイクロチューブを 2. 2m lのマィク口チューブに変えて、 600 lの 1 0 0%イソプロピルアルコールの代わりに、 1 20 0〃 1の 1 00%エタノールを加えて、実施例 1と同様に同じ HC V患者血清を用いて HC V— RNAの抽出を行った。

この時の実施例における HCV—RN Aの抽出の操作性においては、 1 0 0% のエタノールによる沈殿操作から H C V— R N Aを青い共沈物として目視で確涊できた。また、回収率においても、確実に 1 0⁵倍希釈の患者血清から H CV— RN Aを抽出することができた（表 4 ) 。表 4

H C V 患者血清の希釈倍数

«>+ ：ァガロースゲル電気泳勦でバンドが確越されたサンプル。

"一：ァガロースゲル鴛気泳勅でバンドが確艇できなかったサンプル。

〔実施例 5 〕

従来公知の AGPC法に本発明の共沈剤を加えて実験を行った。 HCV 陰性の新鮮なヒト正常血清を用いて、 C型肝炎患者血清を 10' 倍〜 10⁷ 倍まで希釈して調製した 100 μ ΐ の被験試料を 1.5ml の滅菌済マイクロチューブに加えた後、 200 μ ϊ の溶解液（4Μグァニジンチオシァネート， 2-メルカブトエタノール）と共沈剤として 5 μ \ の酵母由来 iRNA ( 4mgAU)を加えて溶解する。次いで、 200 μ \ の水飽和フヱノール， Π 1 の 2Μ酢酸ナトリウム， 40 1 のクロロホルム ' イソアミルアルコール（49:1) を加えよく混和し、 4 -C, 15分間放置した。放置後、 12,0 OOrpra で 15分間（4 て）遠心分離を行ない、 HCV-βΝΑ を舍む上層（水層）を別のマイクロチューブに移す。上層（水層）に等量の 1 0 0 %イソプロビルアルコールを加え転倒混和後、 -20 てで一晩放置して HCV-RNA を圻出させ、 12,000r_Pm で 15分間（4 -C ) の遠心分離を行い、上清を除去し、マイクロチューブの底に付着しているペレツトに共沈剤として 30〃g のァミロぺクチンァズール（Amylopectin Azure) 〔シグマ社製品番号 A 4 6 4 0 (SIGMA Product Number A 4 6 4 0 ) 〕と 70% エタノールを加え混和する。さらに 12,000rpm で 10分間（4 'Ο 遠心分離した後、上清を除去する（HCV-RNA は青い共沈物として目視で確認できる）。次に約 5 分間减圧乾燥（室温）して滅菌再蒸留水に溶解し、この溶解液について実施例 1と同様に cDNA合成反応と 2段階 (Two step) PCR法を行い、増幅された PC R 産物を 2%ァガロースゲル電気泳動で確認した。

この時の実施例における HCV-RNA の抽出の操作性においては、イソプビルアルコールによる沈殿操作から HCV-RNA を青い共沈物として目視で確認できた。また、回収率においても、比較例 2の AGPC法と比較して同等もしくは同等以上の成績であった（表 5 ) 。

〔比較例 2〕

本発明の共沈剤（アミロぺクチンァズール）を添加しないこと以外は、実施例 5と同様の条件で実験を行い、その結果を表 5に示した。本比較例における沈殿物は目視不能であった。

表 5

C型肝炎患者希釈血清による抽出限界拭験

H C V 患者血清の希釈倍数

° + ：ァガロースゲル電気泳動でバンドが確趣されたサンブル。

2⁾ - ：ァガロースゲル電気泳動でバンドが確越できなかったサンプル。

〔実施例 6〕

ァミロぺクチンァズールの代わりにァミ口べクチンを用いた以外は実施例 5 と同様の実験を行った。 1 0 0 %ィソプロビルアルコールによる分離濃縮において H C V— R N Aを白い共沈物として確認できた。また、回収率においても実施例 5と同様であった，

続いて、添付図面に基づいて本発明方法の操作を説明する。

図 1は、生物材料の破壊と同時に蛋白質の汚染物質が変性して、核酸および核酸以外の不純物が分散している水溶液体 1 1と、生物材料中の汚染物質等と結合性がありかつ相分配抽出において上層と下層の境界面で非流動性凝集層を形成して傾斜（デカンテーシヨン）又は転倒による核酸の分離を可能ならしめるためのチキソトロビック增粘剤を舍む高比重有機液体、または高比重有機液休の混合物

、もしくはこれらの高比重有機液体とアルコールの混合物 1 2とをマイク αチューブ Τ 1に分離した状態を示した図面である。

図 2は、 DNA を舍む水性液体の上層 1 3と、遠心分離による遠心力と高比重有機液体の浮力により、蛋白質等と結合したチキソトロビック增粘剤が中間層（境界面）に集められ、チキソトロビック増粘剤の濃度が高くなり、その増粘効果に伴う粘性の変化により形成された非流動性凝集層 1 4 と、蛋白質等の污染物質を含む高比重有機液体、または高比重有機液体の混合物、もしくはこれらの高比重有機液体液体とアルコールの混合物の下層 1 5とに分離した状態を示す図面である。

図 3はデカンテーションで新しいマイクロチューブ Τ 2に DNA を舍む水性液体の上層 1 3を移した状態を示す図面である，

図 4はマイクロチューブ Τ 2に移した核酸（DNA) を舍む水性液体 1 3にアルコール 1 6を加えた状態を示す図面である。図 4において両者を混和して混和液体 1 8とし、さらに遠心分離すると、図 5に示すごとく、有色の沈殿物（共沈剤+ 核酸） 1 7がマイクロチューブ Τ 2の底に付着する。図 6は混和液体 1 8を廃棄し、有色沈殿物 1 7のみをマイクロチューブ Τ 2内に残した状態を示す図面である。本発明の共沈剤は図 1〜図 5のどの段階で添加してもよい。産業上の利用可能性

被検試料中に微量にしか存在しない HCV-RNA を確実に回収するために、本発明においては、各抽出操作のどの段階でも共沈剤を添加することにより、イソプロビルアルコール沈殿時やエタノール沈殿時に、 HCV- RNA の存在を青い沈殿物として確実に目視確認できるため、抽出操作時に発生するテクニカルエラ一を最小限に抑える効果がある。

本発明はセパジーン一 R V 〔三光純薬（株）製核酸抽出試薬〕での使用に限定したものでないことは勿論であるが、対照に用いた AGPC法や他の抽出法においてもイソプロビルアルコール沈殿時やエタノール沈殿時に、 HCV-RNA の存在を青い沈殿物として確実に目視確認使用することが可能である。本発明による共沈剤は、各抽出段階の HCV-RNA の回収操作において、 HCV-RNA と同じ挙動を示すために、 HCV- RNA の回収率が向上する。

本発明による共沈剤は、逆転写反応や PCR 反応と競合しなく、及び又はそれらの反応を阻害しないために、これらの反応による検出感度に影響を与えない。本発明方法によれば、上層と下層の境界面に非流動凝集層が形成されるため境界面が明瞭になり、なお、かつ傾斜（デカンテーシヨン）によって上層の拡散を舍む水性液体層を容易に分離できる。

Claims

請求の範囲

1 . 生物材料及び/又は被験試料から遠心分離操作によって核酸を抽出する過程において、核酸と同じ挙動を示し、アルコールによる分離濃縮処理時に白色又は有色の目視可能な沈殿物として沈殿する性質を有することを特徴とする共沈剤。

2 . 長鎮グルコース結合多糖類、色素修飾長鎖グルコース結合多糖類又はこれらの誘導体の 1種又は 2種以上であることを特徴とする請求項 1記載の共沈剤。

3 . ソリュブルスターチ、コーンスターチ、ポテトスターチ、ポテトソリュブルスターチ、ホイ一ルスターチ、スターチァズール、コーンアミロぺクチン、ポテトアミ口べクチン、アミロぺクチンアンスラニレート、アミロぺクチンァズール

、インソリュブルコーンアミロぺクチン、ソリュブルポテトアミロぺクチン、コーンアミロース、ポテトアミロース、アミロースァズールの 1種又は 2種以上であることを特徴とする請求項 1記載の共沈剤。

4 , 上記アルコールがィソブロピルアルコール又はエタノールであることを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の共沈剤。

5 . 生物材料及びノ又は被験試料から核酸を溶出するための前処理を行ったのち、この前処理した生物材料及び/又は被験試料の蛋白質の除去処理を行い、核酸を舍む水性液体を分離し、分離した当該核酸を含む水性液体にアルコールを加えて混和し遠心分離して核酸を分離濃縮せしめるにあたり、核酸と共に沈殿する共沈剤として請求項 1〜4のいずれか 1項記載の共沈剤を用いることを特徴とする核酸の抽出方法。

6 . 上記除蛋白処理が、フヱノールによる相分離抽出、カオトロビック剤による蛋白質の可溶化、陽イオン界面活性剤による核酸複合体の形成、ガラスフィルタ —による核酸の浦捉又は磁気ビーズによる核酸の捕捉であることを特徴とする請求項 5記載の核酸の抽出方法。

7 . 生物材料及びノ又は被験試料から核酸を溶出するための前処理を行ったのち、この前処理した生物材料及びノ又は被験試料にチキソトロピック增粘剤を舍む非親水性の高比重有機液体と水性液体を加えて混合し、遠心分離後、上層と下層の境界面に非流動性凝集層を形成させることにより核酸を舍有する上層を容易に分離し、分離した当該核酸を舍む水性液体にアルコールを加えて混和し遠心分離して核酸を分離濃縮せしめるにあたり、核酸と共に沈殿する共沈剤として請求項

1〜 4のいずれか 1項記載の共沈剤を用いることを特徴とする核酸の抽出方法。

8 . 上記アルコールがィソプロビルアルコール又はエタノールであることを特徴とする請求項 5〜 7のいずれか 1項記載の核酸の抽出方法。

9 . 前記核酸が H C V— R N Aであることを特徴とする請求項 5〜 8のいずれか 1項記載の核酸の抽出方法。

1 0 . 前記共沈剤の濃度が 0.5 〜100 g/mlであることを特徴とする請求項 5〜 9のいずれか 1項記載の核酸の抽出方法。