WO1997000948A1

WO1997000948A1 - Oxydase, micro-organismes la produisant et ses utilisations

Info

Publication number: WO1997000948A1
Application number: PCT/JP1996/001594
Authority: WO
Inventors: Takashi Echigo; Ritsuko Ohno; Shiro Fukuyama
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 1995-06-23
Filing date: 1996-06-12
Publication date: 1997-01-09
Also published as: AU1192797A; EP0852260A1

Description

明細書酸化酵素、その酵素を生産する微生物及びその酵素の用途技術分野本発明はアル力リ側に至適反応 p Hを有する新規なォキシダーゼ及びその用途に関する。更に詳しく言えば、微生物が生産する p H 8以上のアルカリ側に至適反応 p Hを有する新規なポリフヱノールォキシダ一ゼ、そのォキシダーゼを生産する微生物、そのォキシダーゼの製造方法、及び着色物質やポリフノール含有物の酸化処理、洗浄等の分野における前記ォキシダーゼの利用方法に関するものである。背景技術

従来、ポリフノール酸化作用を有する微生物由来の酵素として、担子菌類、不完全菌類等の糸状蘭が生産するポリフ Xノールォキシダ一ゼやラッカーゼが知られている。し力、し、従来のポリフヱノール酸化酵素は酸性から中性域に至適反応 P Hを有するものであり、アル力リ側、特に p H 8以上のアル力リ側で活性が著しく低いため、実際の用途が限られていた。

例えば、ポリフヱノール酸化酵素の漂白への利用については、 W091 - 05839、 EP91610032s DE4008894 特開昭 64-60693号などに記載されている。しかしながら、洗濯などの洗浄操作は、通常アルカリ p H域で行われ、特に過酸化水素存在下での酸化漂白を同時に行う場合には過酸化水素の漂白作用を促進するためにもアル力リ P Hでの洗浄操作が望ましい。従って、こうした用途にポリフヱノールォキシダーゼを用いる場合、酸性 p Hに至適反応 p Hを有する従来の酵素では実質的に利用は困難であつ /

ポリフエノールを構造部分に有する天然物として、フラボノィド系、キサントン系、メラニン系などの植物色素やリグニンが知られており、ポリフヱノ一ルォキシダーゼはこれらの天然物に対する酸化作用を有する。また、毒性が問題になっているジクロロフエノール、トリクロロフヱノールをもポリフヱノールォキシダーゼは反応基質にできる。それ故に、これらの天然物や非天然物を含有する排水処理においてもポリフユノールォキシダーゼは有用である。しかし従来の酵素では酸性 p Hから中性 P Hに至適反応 p Hを有するためアル力リ p H域での利用は実質的に困難であり、このことがポリフヱノールォキシダーゼの産業上の利用範囲を狭くする要因となっていた。

—方、動植物由来のポリフエノールォキシダーゼの中には、 p H 8以上の高 p Hに至適 p Hを有するものが知られている（Comp. Biochem. Physiol. , 1992, 102B, 4, 891-896 ： Zhongguo Nongye Huaxue Huizhi, 1991, 29, 2, 177-185 ： Agric. Biol. Chem. , 1991, 55, 1， 13-17) 。しかしながら、これらのポリフエノールォキシダーゼを動植物の組織から安定かつ安価に生産することは困難であり、産業上の利用に供するためには微生物由来のアル力リ側に至適反応 p Hを有するポリフヱノールォキシダーゼが望まれていた。発明の開示

本発明の課題は、 P H 8以上のアル力リ側に至適反応 p Hを有するポリフユノールォキシダーゼを生産する微生物を探索し、その微生物が生産するォキシダーゼを提供し、アルカリ p H域でのポリフエノール類の実用的な酵素的酸化を達成して、ポリフユノールォキシダーゼの利用分野の拡大に寄与することにある。図面の簡単な説明

図 1は本発明の SD 3001株由来のポリフエノールォキシダ一ゼの p Hプロファイルを示す図である。

図 2は S D 3001株由来のポリフエノ一ルォキシダ一ゼの温度プロファイルを示す図である。

図 3は SD 3001株由来のポリフエノールォキシダーゼの温度安定性を示すグラフである。

図 4は S D 3001株由来のポリフヱノールォキシダ一ゼの p H安定性を示すグラフである。

図 5は SD 3001株培養液由来の各フラクシヨンの 280 nmの吸光度及び活性値のパターンを示す図である。

図 6は SD 3001株培養液由来のフラクシヨン No. 59の吸光度を示すグラフである。

図 7は G F C分析（H P L C) における S D 3001株培養液由来のフラクション No. 59の溶出パターンを示す図である。

図 8は SD 3001株由来のポリフエノールォキシダーゼと市販のポリフヱノールォキシダーゼとの混合物の p Hプロフアイルを示す図である。

図 9は本発明の S D 3002株由来のポリフヱノ一ルォキシダーゼの pHプロファイルである。

図 10は SD 3002株由来のポリフエノ一ルォキシダ一ゼの温度プ口フアイルである。

図 11は SD 3002株由来のポリフエノールォキシダーゼの温度安定性を示すグラフである。図 12は SD3002株由来のポリフエノールォキシダーゼの p H安定性を示すグラフである。

図 13は SD 3002株培養液由来の各フラクシヨンの 280 nmの吸光度及び活性値のパターンである。

図 14は SD 3002株由来のポリフエノールォキシダーゼと市販のポリフヱノールォキシダーゼとの混合物の p Hプロファイルである。発明の詳細な説明

本発明者らはポリフヱノ—ル物質の酸化をアル力リ p H域において触媒する酵素を菌体外に生産する微生物を求めて広範な微生物について鋭意探索を行った。その探索は極めて困難であつたが、ついに不完全菌類であるミロセシウム ( yrothecium) 属に属する菌株が p H 8以上のァルカリ側に至適反応 p Hを有する目的の酵素を菌体外に生産することを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち本発明は以下のものを提供するものである。

1) 微生物由来の p H 8以上のアル力リ側に至適反応 p Hを有するポリフヱノールォキシダーゼ。

2) ミロセシウム (Myrothecium) 属細菌由来の前記 1) 記載のポリフエノールォキシダーゼ。

3 ) 下記の性質を有する前記 1) または 2) 記載のポリフノ一ルォキシダ一ゼ。

(1) 作用

ポリフヱノールを酸化する。

(2) 至適反応 p H

PH8. 5〜9付近に至適反応 ρΗを有する。

(3) 至適反応温度約 6 crcに至適反応温度を有する。

(4) 分子量

ゲルろ過クロマトグラフィー分析により測定した分子量が約

62, 000である。

(5) 等電点電気泳動により測定した等電点は 4.5±0.5 である。

4 ) ミロセシウム · ヴェノレカリア (Myrothecium verrucaria) 力ヽら得ることのできる前記 1) 〜3) 記載のポリフヱノ一ルォキシダーゼ。

5 ) ミロセシウム · ヴェノレカリア (Myrothecium verrucaria) S D 3 001 (受託番号 FEBM P- 14955) から得ることのできる前記 1 ) 〜 3 ) 記載のポリフエノールォキシダーゼ。

6) 下記の性質を有する前記 1) または 2) 記載のポリフユノールォキシダーセ。

(1) 作用

ポリフノールを酸化する。

(2) 至適反応 p H

P H 9付近に至適反応 p Hを有する。

(3) 至適反応温度

70°C付近に至適反応温度を有する。

(4) 分子量

60, 000である。

(5) 等電点電気泳動により測定した等電点は 4.1±0.5 である。

7 ) ミロセシウム · 口リダ厶 (Myrothecium roridum) から得ることのできる前記 1) 、 2) または 6) 記載のポリフヱノ一ルォキシダーゼ。 8) ミロセシウム · 口リダム（Myrothecium roridum) S D 3 0 0 2 (受託番号 FE P- 15255) から得ることのできる前記 1 ) 、 2) または 6 ) 記載のポリフヱノールォキシグーゼ。

9) 前記 1) 乃至 8) のいずれかに記載のポリフエノールォキシダーゼを作用させることを特徴とする、フヱノール化合物、アルコキシル基含有芳香族化合物、ハロゲン化フニノール化合物、または芳香族ァミン化合物の処理方法。

1 0) 前記 1) 乃至 8) のいずれかに記載のポリフユノールォキシダーゼを作用させることを特徴とする着色物質の処理方法。

1 1) 前記 1) 乃至 8) のいずれかに記載のポリフヱノールォキシダーゼを作用させることを特徴とする微生物またはゥィルスの処理方法。 12) 前記 1) 乃至 8) のいずれかに記載のポリフヱノールォキシダーゼを作用させることを特徴とする紙、パルプ、または繊維の処理方法。 13) 洗浄剤、洗剤、または界面活性剤と共に用いることを特徴とする前記 1) 乃至 8) のいずれかに記載のポリフユノールォキシダ一ゼの使用方法。

14) ペルォキシダーゼ作用を有する物質と共に用いることを特徴とする前記 1 ) 乃至 8) のいずれかに記載のポリフノールォキシダーゼの使用方法。

1 5) 酸化剤として空気、酸素、オゾン、過酸化水素、過酸化水素前駆体、過酸前駆体または過酸を単独でまたは複数組み合わせて、前記 1) 乃至 8) のいずれかに記載のポリフヱノールォキシダーゼと共に用いることを特徴とするポリフヱノールォキシダーゼの使用方法。

1 6) ォキシダーゼをその基質と共に用いることを特徴とする前記 1) 乃至 8) のいずれかの項に記載のポリフヱノ一ルォキシダーゼの使用方法。

1 7) ミロセシウム（ityrothecium) 属に属する細菌を培養することを特徴とする前記 1) 乃至 8) のいずれかの項に記載のポリフエノールォキシダーゼの製造方法。

1 8) ミロセシウム（Myrothecium) 属細菌がミ口セシウム · ヴエルカリア (Myrothecium verrucaria) である前記 1 7 ) 記載のポリフヱノ ―ルォキシダ一ゼの製造方法。

1 9) ミロセシウム (Myrothecium) 属細菌がミ口セシウム · ヴエルカリア (Myrothecium verrucaria) S D 3 0 0 1 (受託番号 FEBM P-14955) またはその変異株である前記 1 7) 記載のポリフヱノ一ルォキシダーゼの製造方法。

2 0) ミロセシウム (Myrothecium) 属菌類がミロセシウム . 口リダム (Myrothecium roridum) である前記 1 7 ) 記載のポリフヱノ一ルォキシダ一ゼの製造方法。

2 1) ミロセシウム (Myrothecium) 属菌類がミロセシウム · 口リダム (Myrothecium roridum) S D 3002 (受託番号 FERM P-15255) またはその変異株である前記 1 7) 記載のポリフヱノールォキシダ一ゼの製造方法。

22) ミロセシウム · ヴェルカリァ (Myrothecium verrucaria) S D 3 00 1 (受託番号 FEM P-14955) 。

23) ミロセシウム · ロリダム（ yrothecium roridum) S D 3 0 0 2 (受託番号 FERM P-15255) 。

24) 前記 1) 乃至 8) のいずれかに記載のポリフヱノ一ルォキシダーゼを含むことを特徴とする洗剤組成物。

[生産菌]

本発明のポリフエノ一ルォキシダ一ゼを得るために用いるミロセシゥム属に属する菌株にはミ口セシウム · 口リダム（Myrothecium roridum) 、ミロセシウム - ヴェゾレカリア (Myrothecium verrucaria) 、ミロセシゥム · プレス卜二 (Myrothecium prestonii) 、ミロセシウム ♦ ロイコトリカム（Myrothecium leucotrichum) が挙げられる力、好ましくはミ口セシウム · ヴェノレカリア (Myrothecium verrucaria) _Λ ミロセシウム • 口リダム（Myrot ecium roridum) 、特に好ましくはミ口セシウム · ヴエルカリア S D 3 0 0 1 (Myrothecium verrucaria SD3001) あるいはミロセウム ·ロリダム S D 3 0 0 2 (Myrothecium roridum SD 3002) を用いる。

なお、ミロセシウム * ヴエルカリア S D 3 0 0 1 ( Myrothecium verrucaria SD3001) は 1995年 5月 2 9日に日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1番 3号所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に FERM P-14955として寄託され、 1996年 4月 2 4日に FERM BP- 5520として国際寄託に移管されている。また、ミロセシウム · ロリダム S D 3 0 0 2 (Myrothecium roridum SD3002) は 1995年 1 0月 2 6日に日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に FEM P-15255 として寄託され、 1996年 4月 2 4日に FERM BP-5523として国際寄託に移管されている。

本発明のポリフエノールォキシダ一ゼを生産するミ口セシウム (Myrothecium) に属する代表的な菌株について、マルトエキス寒天培地上での集落の色調、形状及び分生子、分生子形成構造等の形態を観察した観察の結果を下記に示す。

項目性状

集落表面の色白色〜黄白色，黒色の分生子座を認める集落裏面の色白色〜黄白色

集落表面の組織やや羊毛状

菌糸無色，滑面，幅 1.5〜 3/ m

フィアラィド円柱形， 3〜 6本輪生

大きさ 10〜15x 1.5〜 2 / D1

分生子紡錘形〜レモン形

大きさ 6〜8 X 2〜 3.5jum

—部は先端に扇形の付属糸を形成本菌株は、分生子の一部が先端に扇形の付属糸を形成することからミ口セシウム《ヴェノレカリア S D 3 0 0 1 (Mvrothecium verrucaria SD3001) と命名された。

本発明のポリフヱノールォキシダーゼを生産するミ口セシウム (Mvrothecium) に属する他の代表的な菌株について、ポテトキヤロット寒天培地（P C A) 上で、 25°Cにて 1 4日間培養したときの集落の色調、形状及び分生子、分生子形成構造等の形態観察の結果を下記に示す。

項目性状

生育速度集落の直径 54〜56卿

無色，滑面，幅 1.5〜 3 m

フィアラィド円柱形， 3〜 6本輪生

大きさ 12〜16x 1.5〜 2.5t m

分生子桿状〜細い楕円形，両端は丸いが基部は裁断状

大きさ 5.5〜7.5 X 1.5〜 2 m

上記の観察結果から、本菌株はミ口セシウム · ロリダム S D 30 02 (Myrothecium roridum SD3002) と命名された ₀

[酵素の調製]

本発明のポリフヱノールォキシダーゼは、前記のミ口セシウム (Myrothecium) 属に属する菌株及びその変異株を培養して得られる他、遺伝子操作菌を利用して調製することも可能である。すなわち、そのポリフヱノールォキシダ一ゼをコ一ドする DN A配列と宿主生物での酵素発現機能を有する適当なプロモータ一、及びオペレーター、夕一ミネ一ター DN A配列と共に、宿主生物中でベクターを複製するための複製開始点を有する DN Aベクターに挿入された発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞、もしくは該ポリフヱノ一ルォキシダーゼをコ一ドする DN A配列と宿主生物での酵素発現機能を有する適当なプロモーター、及びオペレーター、ターミネータ一 DN A配列と共に、宿主細胞 DNA にィンテグレーシヨンせしめることで形質転換された宿主細胞を、ポリフヱノールォキシダーゼの発現できる条件のもとに培養し、さらにポリフヱノールォキシダーゼを培地から回収する方法によっても生産される。

0 また、本発明のポリフエノールォキシダーゼは、前記ポリフエノールォキシダーゼをコ一ドする D N A配列等をもとに得られるポリフヱノールォキシダーゼのァミノ酸配列に関する知見をもとに、従来の酸性側に至適反応 P Hを有するポリフヱノールォキシダーゼの D N Aを改変するプロティン ·エンジニアリングの手法によって生産されるものであってもよい。

本発明のポリフヱノ一ルォキシダーゼをコ一ドする D N A断片の取得のためには、例えば本発明の菌株からの c D N Aまたはゲノムライブラリィを分離源とし、本発明のポリフヱノ一ルォキシダーゼのァミノ酸配列もしくは既知のポリフヱノ一ルォキシダーゼのァミノ酸配列に基づいて合成されたォリゴヌクレオチドをプローブとして目的の D N A断片を特定するか、または酵素活性を発現するクローンを選択するか、または該ポリフエノールォキシダーゼに対する抗体と反応する蛋白質を生産するクローンを選択するといつた常法によって行うことができる。

本発明のポリフヱノールォキシダーゼを得るための培養は、通常用いられる合成培地や有機炭素源及び有機窒素源を含む栄養培地が使用可能である。また、 C u ²⁺イオンを金属塩として 0. 001 m Mから 1 O m M、好ましくは O. Olm Mから 1 m Mの濃度で添加することが望ましい。培養温度は 1 0〜 3 5 °C、好ましくは 2 0〜 3 0 °Cである。また、適当な培養時間は 2 0時間から 1 5 0時間、好ましくは 4 0時間から 1 0 0時間である。分泌されたポリフヱノ一ルォキシダ一ゼは培地中から周知の方法で回収出来る。この回収手順には、遠心分離もしくはろ過、膜分離により培地から細胞を分離し、例えばイオン交換クロマトグラフィ一等によるクロマトグラフィーを行うという一連の手順によることができる。また、限外ろ過膜を用いる膜濃縮も有効である。

[酵素の性質] ( 1 ) ミロセシウム - ヴェノレカリア CMyrothecium verrucaria^) S D 3 001由来の酵素

本発明のポリフエノールォキシダーゼの代表例であるミロセシウム · ヴェルカリァ (Myrothecium verrucaria S D 3001由来の酵素は、ゲルろ過ク口マトグラフィ一分析により測定した分子量が約 62， 000であり、等電点電気泳動により測定した等電点は 4.5±0.5 である。

本酵素は 5〜 1 1の広い p H範囲でポ " フエノールの酸化反応を行えるが、好ましい反応 p Hは？〜 1 0、より好ましくい反応 p Hは 8〜 9.5 であり、 p H8.5 〜 9付近に至適 p Hがあり、アルカリ側での酸化反応を触媒するという特長を有する（図 1) 。また、至適温度は約 60 °Cである（図 2) 。さらには、様々な一定温度で 30分間の加熱処理を施した後の活性は、例えば 60でにおいてはほぼ 1 00%の残存活性を示す（図 3 ) 。さらには、様々な p Hのバッファ一中で 3 0 °C、 3 0分間の処理を施した後の残存活性は、広範囲の p Hにおいて安定性を示す（図 4 ) 。これらの結果は、ミロセシウム · ヴヱルカリア CMyrothecium verrucaria) S D 300 1由来の酵素力中性力ヽらァノレ力リ性の広範囲の p H域で、中低温の様々な溶液中での酸化反応を行なうことを保証する。

(2) ミロセシウム · ロリダム（Myrothecium roridum) S D 3 0 0 2 由来の酵素

本発明の他のポリフヱノールォキシダーゼの代表例であるミ口セシゥム · 口リダム（Myrot_hecium roridum) S D 3 0 0 2由来の酵素は、ゲルろ過クロマトグラフィ一分析により測定した分子量が約 60， 000であり、等電点電気泳動により測定した等電点は 4.1±0.5 である。

本酵素は 6〜1 2の広い p H範囲でポリフユノールの酸化反応を行えるが、好ましい反応 p Hは 8〜1 1、より好ましい反応 p Hは 8.5 〜

2 10であり、 p H 9付近に至適 p Hがあり、アルカリ側での酸化反応を触媒するという特長を有する（図 9) 。また、 pH8.7 で 10分間の反応を行った場合の至適温度は 70°C付近にある（図 10) 。さらには、 70°Cで様々な時間の加熱処理を施した後の活性は、例えば 30分間の処理ではほぼ 50%の残存活性を示す（図 11) 。また、様々な p Hのバッファ一中で 30°C、 30分間の処理を施した後の残存活性は、図 1 2に示すように広範囲の p Hにおいて安定性を示す。これらの結果は、ミロセシウム · ロリダム（Myrothecium roridum) S D 3002由来の酵素が中性からアル力リ性の広範囲の p H域で、中低温の様々な溶液中での酸化反応を行なうことを保証するものである。

本発明のポリフ Xノ一ルォキシダ一ゼは、従来の酸性側に至適反応 p Hを有する酵素と共に組み合わせて用いることも可能である。つまり、従来知られている酸性側に至適反応 P Hを有するポリフノールォキシダーゼと本発明のポリフヱノールォキシダーゼを組み合わせて用いることにより、酸性からアルカリ性の広範囲の p H域においてポリフヱノールォキシダーゼ反応を行うことが可能となる。このような目的で酵素を混合して用いる場合の、酸性側に至適反応 P Hを有するポリフヱノールォキシダ一ゼの活性量と本発明のポリフヱノ一ルォキシダ一ゼの活性量の混合比率は、好ましくは 1 ： 10〜； L 0 ： 1、より好ましくは 1 ： 3 〜3 ： 1である。このようにして広範囲の pH域においてポリフヱノールォキシダーゼ反応を達成することを可能にする点からも本発明のポリフエノールォキシダーゼは有用である。

[酵素活性測定方法]

本発明において、ポリオキシダ一ゼのポリフヱノール酸化活性の活性測定は 20°Cにおいて 20 p pmのシリンガルダジン（syringaldazine) と l O OmMの T r i s— HC 1ノッファ一溶液（p H 8.7) を含む水

3 溶液中で反応を行い、 5 2 5 n mの吸光度を測定することで行う。そして、 1分間に 1〃m o 1のシリンガルダジンを酸化する活性量を 1ュニット（以下、 Uと略す。）と定義した。

[用途]

アル力リ P Hに至適反応域を有する新規な本発明のポリフエノールォキシダーゼの用途としては、例えば、漂白への適用が可能である。

ポリフヱノール酸化酵素の漂白への利用については、 WO91-05839、 DE4008894. 特開昭 64- 60693号などに記載されているが、洗濯などの洗浄操作は通常アルカリ p Hで行われ、特に過酸化水素存在下での酸化漂白を同時に行う場合には過酸化水素の漂白作用を促進するためにもアルカリ p Hでの洗浄操作が望ましい。し力、し、酸性 p Hに至適反応 p Hを有する従来のポリフヱノールォキシダーゼではこうした用途への実質的な利用は困難であった。本発明のポリフエノールォキシダーゼは、こうしたアル力リ洗浄、アル力リ漂白分野へのポリフヱノールォキシダーゼの用途を開くものとして有用である。

過酸化水素による酸化漂白は、洗浄、洗濯において現在広く利用されている。しかしながら、過酸化水素は 6 0 °C以下の低温でその漂白力が十分ではない。これを改善するために、過酸前駆体が過酸化水素と共に用いられているが、 4 0 °C以下の低温での漂白力は十分ではなく、より効果の高い漂白系が求められている。そのため、様々な酵素的漂白促進方法が従来より提案されている。本発明によるポリフヱノ一ルォキシダーゼを、ペルォキシダーゼ、リグニンペルォキシダーゼ、マンガンペルォキシダーゼ等のペルォキシダーゼ作用を有する物質の内の 1つもしくは複数と共存させることにより、アル力リ P Hでの酸化漂白を促進することができ、本発明のポリフヱノールォキシダ一ゼの有用性は明かであ酸化漂白に広く用いられている過酸化水素は高価な酸化剤であり、そして、洗浄剤にしばしば用いられている過酸化水素前駆体や過酸前駆体、過酸はさらに高価な酸化剤である。また、ォキシダーゼとその基質を用いることで過酸化水素を酵素的に生成させることも可能であるが、こうした過酸化水素発生系もまた高価な酸化剤と考えることができる。本発明によるポリフエノールォキシダーゼを、従来から酸化漂白のために用いられている酸化剤である空気、酸素、オゾン、過酸化水素、過酸化水素前駆体、過酸前駆体、または過酸を、単独で、または複数組み合わせて用いることで、酸化漂白を促進することができる。従って、酸化剤を有効に用いて酸化漂白を達成できる本発明のポリフノ一ルォキシダ一ゼの有用性は明かである。

酸化剤のうち、過酸化水素前駆体は水に溶解してパーヒドロキシルイオンを生成するものである。このような物質には、 1水和物もしくは 4 水和物のパーボレート（過硼酸塩）、パーカーボネート（過炭酸塩）、過ホウ砂、過ピロリン酸ナトリゥム、過安息香酸、尿素一過酸化水素反応物、メラミンー過酸化水素反応物、クェン酸過水和物などがあり、特にパーボレート、パーカーボネートが好ましい。またさらには、過酸化水素前駆体としてォキシダーゼ及びその基質による過酸化水素発生系を用いることもできる。このようなォキシダ一ゼの例は、グルコースォキシダーゼ、アルコールォキシダ一ゼ、グリセロールォキシダーゼ、アミンォキシダ一ゼ、アミノ酸ォキシダーゼ、 D—アミノ酸ォキシダ一ゼ、ァリールアルコールォキシダ一ゼ、アルデヒドォキシダーゼ、ガラクト —スォキシダーゼ、ソルボースォキシダ一ゼ、ウレ一トォキシダ一ゼ、キサンチンォキシダーゼ、コレステロールォキシダーゼなどがあり、特に好ましくはグルコースォキシダ一ゼ、アルコールォキシダ一ゼである。また過酸前駆体は、反応性ァシル基を有する有機化合物もしくはカル

5 ボン酸エステル、カルボン酸無水物、酢酸塩であり、このような物質には TAE D (tetra acetyl ethyl ene Qiamineソ _N AMD (tetra ace tyl methylene diamine) TAGU (tetra acetyl glycoluril) D A D H T (diacetyl dioxohexahydro triazine) S NO B S (sodium nonanoy 1 oxybenz ene sulfonate) I S 0 N 0 B S (sodium isononan oyloxybenzene sulfonate) ヽク酸無水物、安息香酸無水物、フタノレ酸無水物、 P A G (glucose pentaacetate) 、キシローステ卜ラァセテ一卜があり、特に TAED S NO B Sが好ましい。

さらに、過酸としては、例えば D PDDA (diperoxydodecanedioic acid) D P I P A (diperoxyisophthalic acid) MMP PH (magn esium monoperoxyphthalate hexahydrate) N A P A A (nonylamidop eroxyadipic acid) が挙げられる ₀

本発明のポリフヱノールォキシダーゼは、様々な洗浄剤、洗剤、または界面活性剤と共に用いることができる。これにより、本発明のポリフュノールォキシダーゼを配合した洗浄剤または洗剤組成物が提供される。このような洗浄剤または洗剤組成物の代表例としては、洗浄剤または洗剤組成物重量当たり 1 0 5 0重量％の界面活性剤、 0 50重量％のビルダー、 1 5 0重量％のアルカリ剤あるいは無機電解質、 0.1 1 0重量％の再汚染防止剤、酵素、漂白剤、蛍光染料、ケーキング防止剤及び酸化防止剤からなる群より選ばれる少なくとも 1種以上の配合成分からなる洗浄剤または洗剤組成物が挙げられる。

界面活性剤としては石験、例えば直鎖または分岐アルキルあるいはァルケニル硫酸塩、アミド硫酸塩、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基を有し、エチレンォキサイド、プロピレンォキサイド及びブチレンォキサイドのうちの単独あるいは複数成分が付加したアルキルまたはアルケニルテル硫酸塩のような脂肪族硫酸化物、アルキルス

6 ルホン酸塩、アミドスルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩、 α— ォレフィン、ビニリデン型ォレフィン及び内部ォレフィンの各スルホン酸塩のような脂肪族スルホン酸塩、直鎖または分岐鎖のアルキルべンゼンスルホン酸塩のような芳香族スルホン酸塩、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基を有し、エチレンオキサイド、プロピレンォキサイド及びプチレンォキサイドのうちの単独あるいは複数成分が付加したアルキルまたはアルケニルエーテルカルボン酸塩またはアミド、一スルホ脂肪酸塩またはエステル、アミノ酸型界面活性剤、アルキルまたはアルケニル酸性リン酸エステル、アルキルまたはアルケニルリン酸塩のごときリン酸エステル系界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、ベタイン型両性界面活性剤、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基を有し、エチレンオキサイド、プロピレンォキサイド及びプチレンォキサイドのうちの単独あるいは複数成分が付加したアルキルまたはアルケニルエーテルあるいはアルコール、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基を有し、エチレンオキサイド、プロピレンォキサイド及びプチレンォキサイドのうちの単独あるいは複数成分が付加したポリォキシェチレンアルキルフェニルエーテル、高級脂肪酸アルカノールアミドまたはそのアルキレンォキサイド付加物、ショ糖脂肪酸エステル、脂肪酸グリセリンモノエステル、アルキルまたはアルケニルアミンォキサイド、テトラアルキルアンモニゥム塩型カチオン界面活性剤など洗剤組成物として通常配合される界面活性剤であればいずれも使用可能である。また、陰イオン性界面活性剤の場合の対イオンとしてはナトリウムイオンまたはカリウムイオンであることが好ましい。これらの界面活性剤は、単独または 2種以上の混合物として使用される。

ビルダ一及びアル力リ剤あるいは無機電解質としてはオルソリン酸塩、ピロリン酸塩、トリポリ酸塩、メタリン酸塩、へキサメタリン酸塩、フ

7 イチン酸塩などのリン酸塩、エタンー 1， 1—ジホスホン酸及びその誘導体、エタンヒドロキシー 1， 1， 2— トリホスホン酸、エタンー 1 , 2—ジカルボキシ一 1 , 2—ジホスホン酸、メタンヒドロキシホスホン酸などのホスホン酸塩、 2—ホスホノブタン一 1， 2—ジカルボン酸、 1 一ホスホノブタン一 2， 3， 4一トリカルボン酸、 α—メチルホスホノコハク酸などのホスホノカルボン酸塩、ァスパラギン酸、グルタミン酸などのァミノ酸塩、二トリ口三酢酸塩、エチレンジァミン四酢酸塩、ジエチレントリアミン五酢酸塩などのァミノポリ酢酸塩、ポリァクリル酸、ポリイタコン酸、ポリマレイン酸、無水マレイン酸共重合体、カルボキシメチルセルロース塩などの高分子電解質、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールなどの非解離高分子、ジグリコール酸、ォキシジコハク酸、カルボキシメチルォキシコハク酸、ダルコン酸、クェン酸、乳酸、酒石酸、ショ糖、ラクトースなどのカルボキシメチル化物、ペンタエリスリトールのカルボキシメチル化物、ダルコン酸のカルボキシメチル化物、ベンゼンポリカルボン酸、シユウ酸、リンゴ酸、ォキシジコハク酸、ダルコン酸などの有機酸塩、ゼォライトなどのアルミノケィ酸塩、炭酸塩、セスキ炭酸塩、硫酸塩、メタケイ酸塩などの無機塩をアルカリ金属塩として用いることができ、またデンプン、尿素などの有機物質及び塩化ナトリウム、ベントナイトなどの無機化合物を用いることができ、更には有機アルカリ剤としてトリエタノールァミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、トリイソプロパノールアミンなどを用いることができる。

本発明の洗剤組成物は、前述のごとく、界面活性剤、本発明のポリフヱノールォキシダ一ゼ等を構成成分として含むが、その必要に応じて両性界面活性剤、例えばパーボレート、パ一カルボネートなどの漂白剤、色素、ビルダー、例えばポリェチレングリコール、ポリビニルアルコー

8 ル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどの再汚染防止剤、ケーキング防止剤、酸化防止剤、例えば他のォキシダーゼやべルォキシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼなどのその他の酵素を必要に応じて含ませることができる。

洗剤組成物に本発明のポリフユノ一ルォキシダ一ゼ等の酵素を配合するには如何なる方法で行ってもよいが、微粉末状の酵素を配合することは、洗剤取扱い時の発塵による洗剤使用者や洗剤工業における作業者の安全衛生上好ましいことではなく、溶液状態あるいは予め発塵性を抑えた形状に賦形しておくことが好ましい。

この賦形は、通常よく用いられるマルメ造粒、押し出し造粒、流動造粒、遠心流動造粒やその他の方法のいずれによるものであってもよいが、本発明の洗剤組成物に配合する酵素の形状は特にこれらの方法で賦形されたものに限定されるものではない。

脱リグニン、漂白を目的として、パルプ工程の一部において本発明の菌株を接種して本発明のポリフエノールォキシダーゼを生産せしめるか、もしくは直接本発明の酵素標品を添加して、チップゃ粗砕パルプ等に作用させるバイオパルビング、バイオ漂白が有用な用途分野として挙げられる。この場合も、従来の酸性側に至適反応 p Hを有するポリフニノールォキシダーゼと比べて、アル力リ側に至適反応 p Hを有する本発明のポリフヱノ一ルォキシダ一ゼの方が p H調整のために使用する薬液の量を削減することができるのでコスト ·ダウンが可能である。

ポリフヱノールを構造部分に有する天然物として、フラボノィド系、キサントン系、メラニン系などの植物色素やリグニンが知られており、ポリフヱノ一ルォキシダ一ゼはこれらの天然物に対する酸化作用を有する。また、毒性が問題になっているジクロロフヱノール、トリクロロフェノール等の A O X (有機塩基）をもポリフヱノールォキシダーゼは反応基質にできる。それ故に、例えばこれらの天然物や非天然物を含有する排水処理においても本発明のポリフエノールォキシダーゼは有用であ 4) o

また、本発明のポリフエノ一ルォキシダ一ゼを用いるバイオセンサーは、本酵素の特性を反映して、中性からアルカリ性域の p Hを有する様々な水溶液、有機溶媒中の芳香族化合物をモニターするために用いることができ有用である。

また、本発明のポリフエノールォキシダーゼにより発生するフヱノキシラジカルの反応性を利用して、中性〜アル力リ性の p H域において効率よく微生物やウィルスの殺菌や不活性化を行うことも可能である。つまり、ポリフヱノールォキシダーゼの基質自体の殺菌性に加えて、酵素的に発生するフエノキシラジカルによってより強力な殺菌性を与えることが可能である。しかも、殺菌処理物がそののち人体に接触もしくは摂取される場合、もしくは環境中に放出される場合には、ポリフエノールォキシダーゼの基質は酸化によって毒性の軽減された物質に変わっているため、必要な時点での殺菌性とその後の安全性の双方を達成できるので、有用性が高い。

また、ポリフヱノールォキシダーゼにより発生するフエノキシラジカルゃキノン類を利用してポリマー合成を行う場合も、適用できる反応の拡大が期待でき、本発明のポリフユノールォキシダーゼは有用である。

さらには、カテコール類等の易酸化性のポリフヱノールを含む物質群を酸化する場合、アル力リ p Hでの自動酸化反応と酵素触媒的なポリフェノールの酸化反応を同時に進行させることができるアル力リ p Hでのポリフヱノ一ルォキシダーゼの使用は、効率の良い酸化処理のために極めて有効である。発明を実施するための最良の形態以下に本発明について代表的な例を示し、さらに具体的に説明する。ただし、これらは単なる例示であり、本発明はこれらのみに限られるものではない。実施例 1 ：ミロセシウム · ヴヱルカリア（Myrothecium verrucaria) S D 30 01株の培養及び濃縮

2リッ夕一容のフラスコを培養装置に用い、 0.5 %グルコース及び 0. 1 % (NH₄ ) ₂ S O_/| . 1.34%N a H P O _| · 12 H₂ 0. 0.3 % KH₂ P〇₄、 0.1 %N a C 0.1 %ペプトン、 0.01%酵母エキス、 0.1 mM C u S 0₄ を含む 400 m lの培地に 2 N-N a OHを加えて p Hを 8としたものに、ミロセシウム * ヴヱルカリァ（Myrothecium verrucaria) S D 3.001 (受託番号 FERM P - 14955) を接種し、 27°C、 3曰間の振とう培養を行った。培養後、 4 °Cでの遠心分離により除菌された培養ブロスを得た。これをさらに限外ろ過膜で濃縮、精製して、分子量 10, 000〜： 100, 000 の分画範囲に精製、濃縮された粗精製濃縮水溶液 (20 U/m 1 ) を得た。実施例 2 ：粗精製

1.34%N a₀ H PO^ · 12 H₂ 0、 0.3 %KH₂ P 0₄、 0.1 %N a C 1によって平衡化した D E A E— C e l l u l o f i n e A— 8 00m (生化学工業（株））カラム（¾620 mm, 50 c c) の上部に、実施例 1記載の除菌後の培養ブロスをカラム上部の空隙にアプライし、通液開始と同時に 1フラクション 1 5m lで溶出液の回収を開始した。 345 m lの培養ブロスをアプライした後、平衡化に使用したものと同組成の緩衝液によるカラム洗浄と、 N a C 1濃度を 0.15Mに上昇させる

2 ステップワイズにより溶出を行った。各フラクションの 280 nmの吸光度とポリフエノールォキシダーゼ活性値のパターンを図 5に示した。フラクションの内、 N o. 1〜55は 0.1 %N a C 1で溶出を行ったもので、 No. 56〜 75は 0.15MN a C 1で溶出を行ったものである。酵素活性はフラクション N 0. 59と 60において強く検出された。フラクシヨン No. 59と 60の詳細を表 1に示す。

フラクション 280 nmでの活性精製倍率

No. 吸光度 (unit/ml)

59 3.32 32.4 1 12

60 4.17 15.1 42 なお、フラクション No. 59の吸光度を 380 nmから 700 nm の範囲で測定した結果、 600 nm近辺での吸収極大が認められた（図 6) o 実施例 3 ：基質特異性

実施例 2記載のフラクション No. 59の粗精製ポリフエノールォキシダーゼを用いてポリフエノ一ル化合物酸化反応の基質特異性を調べた。室温（20°C) において、 0.05m Mの基質と l O OmMの T r i s -H C 1バッファー溶液（pH 8.7) における酵素添加、無添加での酸素消費速度の差を測定することで行った。結果を表 2に示す。表 2 基質酸化反応

4—ァニシジン + + +

0—フエ二レンジァミン + + +

シリンガルダジン + + +

シリンギン酸 + + +

フェルラ酸 + + 実施例 4 ：分子量

分子量測定は、 G F C (ゲルろ過クロマトグラフィー）を用いて行つた。すなわち、 1.34%N a ₂ H P 0₄ · 1 2 H₂ 0、 0.3 %K H₂ P 0₄、 l %N a C lによつて流速 1.0 m 1 /m i nで平衡化した G F C カラム（Shodex PROTEIN KW- 802.5, 2連）と UV検出器（2 8 0 nm) を用いる H P L Cにより、実施例 2記載のフラクション N o. 59の粗精製ポリフエノールォキシダーゼの分析及び分取と活性測定を行ったところ、ポリフエノールォキシダ一ゼ活性ピークは分子量 62, 000であつた。 . 分子量マーカ一蛋白質は、ォリェンタル工業（株）の MW— M a r k e r (H P L C) を用いた。なお、上記 G F C分析（H P L C) におけるフラクション N o. 5 9の溶出パターンを図 7に示した。実施例 5 ：紅茶汚染布の漂白処理

0.1 %Tw e e n 8 0、 0.02%の活性化ゼォライト粉末を含む 5 0 m M 炭酸ナトリウムバッファ— （p H9.0 ) 1 0m 1 に 5 X 5 cmの紅茶汚染布を浸漬し、さらにここに、予め実施例 2記載のフラクシヨン N o. 5 9の粗精製ポリフヱノールォキシダ一ゼを他の漂白剤と組み合わせて調製した配合物を添加し、これを 30°Cで 4 0分間振とうすることで洗浄、漂白処理を行った。その後、水洗、風乾し、色彩色差計（CR -200, MINOLTA 製）によって XY Z表色系（C I E (国際照明委員会）標準表色）に基づく Y， y, X値を測定し、さらに次式

Z = (1 - X - y ) Y/y

によって Z値を算出した。そして、処理前後の Z値の差（Δ Ζ値）によつて、白色度の上昇を評価した。結果を表 3に示す。

なお紅茶汚染布は、市販の紅茶 1 60 g (ホテルレストラン . プレンド ·セイロン，日本紅茶（株））を 5 リットルの沸騰水に入れ、 5分間煮沸後、ろ過により紅茶を取り除き、ろ液を 5分間沸騰させたあと木綿白布を入れ再び 5分間煮沸し、布を取り出し乾燥後、イオン交換水により十分に水洗し、再乾燥したものを用いた。表 3 添加物 △ z値添加物なし 0.2 l UZral粗精製酵素液

200ρρπ!過酸化水素 4, 8

1 UZml粗精製酵素液 + 200ppm過酸化水素 6.5

200ρρπιノヽ。一力—ボネ一卜 · Na塩 2.8

1 UZinl粗精製酵素液 + 200ρρπιパーカーボネー卜 · Na塩 6

200ρρπιパーカーボネー卜 ' Na塩 + 50ppm TAED 6.1

1 U/ral粗精製酵素液 + 200ppraパ—カーボネート * Na塩 + 50ppra TAED 8.1

200ppraパ一カーボネ一卜 ' Na塩 + 50ppni SNOBS 7.2

1 U/ral粗精製酵素液 + 200ρρπパ—力—ボネー卜 * Na塩 + 50ppm SNOBS 8.7 実施例 6 ： 5 リッター培養槽での培養及び濃縮、粗精製

0.5 %グルコース及び 0.1 %N a N0₃、 1.34%N a ₂ H P 0. · 1 2 H₂ 0、 0.3 %KU₂ P〇₄、 0. l %N a C l、 0.2 %ペプトン、 2 0 p p m酵母エキス、 0.01%Mg S O₄ * 7 H₂ O、 0.1 mM C u S 0₄ からなる 3 リツターの培地に 1 0%N a 0 Hを加えて p Hを 8としたものを含む 5 リッタ一培養槽にミロセシウム ·ヴヱルカリア（Myroth ecium verrucaria) S D 3 0 0 1 (受託番号 FE P- 14955) を接種し、 2 8°C、 3日間の振とう培養を行った。培養後、 4°Cでの遠心分離により除蘭された培養ブロス 2.5 リツターを得た。

次に、この培養ブロスの一部を、ミニタン · フィルタ一バケツト (CAT. NO.： PTGC0MP04, ミリポア社製）を用いるミニタン限外ろ過システム（ミリポア社製）によって、分子量 10, 000以上の画分として濃縮した。これをさらに、 D E AE— C e l l u l o f i n e A— 8 0 0m カラムクロマトグラフィ一に供し、溶出した活性画分を再び、上記のミ二タン限外ろ過システムによって、分子量 10, 000以上の画分として再濃縮した。さらにこの再濃縮液を 2 O O p pmNH₄ H C Ο_π に対して透析後、凍結乾燥に供し、粗精製物を凍結乾燥品として得た。凍結乾燥品のポリフエノールォキシダ一ゼ活性は 1 0 U Zm gであった。実施例 7 ：酵素含有洗剤による汚染布の処理

25重量％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（L A S) 及び 5重量％のポリオキシエチレンラウリルエーテル、 1 5重量％のトリボリリン酸ナトリウム、 6重量％のゲイ酸ナトリウム、 1重量％の力ルポキシメチルセルロースナトリウム、 4 8重量％のN a ₂ S 0₄ からなる指標洗剤 1 0グラムに、実施例 6記載の凍結乾燥品を 0.1 グラム添加したものを酵素配合洗剤とし、凍結乾燥品を添加していないものを酵素非配合洗剤とした。

また、木綿白布（5 c m X 5 c m) の中央に 1 0 0 p p mエバンスプルー（和光純薬工業（株）） 0.2 m 1を加えることで汚染布を調製した。次に、 5 0 0 m 1容ビーカーに汚染布 1枚と水 1 Om 1を加えた後、さらに酵素配合洗剤または酵素非配合洗剤を 1 Om g添加し、 12分間振とうすることで洗浄処理を行った。処理後の汚染布は、水洗、風乾し、実施例 5と同様に色彩色差計（CR-200, MINOLTA 製）によって Z値を算出したところ、酵素配合洗剤は、酵素非配合洗剤に比べ、 6ポイントの白色度向上を示した。実施例 8 ：粗精製パルプの漂白処理

5 0 0 m l容のビーカ一を培養装置に用い、 0.3 %グルコース及び 0.05% (NH^ ) ₂ S 0₄、 1.34%N aり H P 0₄ · 1 2 H。 0、 0.3 %KH₂ 0₄ . 0.1 %N a C 0.02%ぺプトン、 50 p pm酵母ェキス、 0.02mM C u S 0₄、 8%広葉樹未漂白クラフトパルプ（L UK P) (カッパ一価 1 8) を含む 5 Om 1の培地に 2 N-N a OHを加えて p Hを 8.5 としたものにミロセシウム · ヴエルカリア（Myrothecium verrucaria) S D 3001 (受託番号 FERM P-14955) を接種し、 27°C、 4日間の静置培養を行った後に力ッパー価を測定したところ 5ポイントのカッパ一価の向上を認めた。実施例 9 ：ミロセシウム ·ヴエルカリア（Mv_rothecium verrucaria) S D 3001由来酵素と従来のポリフヱノ一ルォキシダ一ゼとの混合試薬として市販されているポリフヱノールォキシダーゼ（Bigidoporu s zonal is 由来、 Takara (株）） 0.1 U/m 1溶液と、本発明のポリつエノ—ルォキシダーゼの 0.2 UZm 1溶液を等容量混合したものを用いて様々な p Hで活性測定を行つたところ、図 8に示したように pH5〜 11の広範囲の pHにおいて酸化反応が進行した。実施例 10 ：ミロセシウム · ロリダム (Myrothecium roridum) S D 3 002株の培養及び濃縮

2リッ夕一容のフラスコを培養装置に用い、 1%グルコース及び 0.2 ^NH^ C 1、 1.34%N a ₂ H P 0 ^ · 12 H₂ 0、 0.3 %KH。 P 0 _t、 0.1 %N a C 0.2 %ペプトン、 0.05%Mg S〇₄ · 7H₂ 0、 0.02mMC u S 0₄ を含む 550 m lの培地に 2 N— N a OHを加えて pHを 8としたものに、ミロセシウム · ロリダム（Myrothecium roridu m) S D 3002 (受託番号 FERM P- 15255) を接種し、 2 7。C、 90時間の振とう培養を行った。培養後、 4°Cでの遠心分離により除菌された培養ブロスを得た。これをさらに限外ろ過膜で濃縮、精製して、分子量 10, 000〜100,000 の分画範囲に精製、濃縮された粗精製濃縮水溶液 (0.4 U/m 1 ) を得た。実施例 11 ：粗精製

1.34%N a₀ H P 0₄ · 12 H₂ ◦、 0.3 %KH₂ P〇₄ 、 0.1 % N a C 1によって平衡化した D E A E— C e 1 1 u 1 o f i n e A— 800 m (生化学工業（株））カラム（026 mm, 90 c c) の上部に、実施例 10記載と同様の方法で得た除菌後の培養ブロスをカラム上部の空隙にァプラィし、通液開始と同時に 1フラクション 16 m 1で溶出液の回収を開始した。 480 m lの培養ブロスをアプライした後、平衡化に使用したものと同組成の緩衝液による力ラム洗浄と、 N a C 1濃度を 0.12Mに上昇させるステップワイズにより溶出を行った。各フラクシヨンの 280 n mの吸光度とポリフエノ一ルォキシダ一ゼ活性値のパターンを図 13に示した。フラクションのうち、 N o. 1〜70は0.1 %N a C 1で溶出を行ったもので、 N 0. 71〜10 (Hi0.12M N a C 1で溶出を行ったものである。酵素活性はフラクシヨン No. 80〜 84において強く検出された。実施例 12 ：基質特異性

実施例 1 1記載のフラクシヨン No. 82の粗精製ポリフヱノールォキシダーゼを用いてポリフエノール化合物酸化反応の基質特異性を調べた。室温（20°C) において、 0.05m Mの基質と 1 0 OmMの T r i s 一 HC lバッファー溶液（pH 8.7) における酵素添加、無添加での酸素消費速度の差を測定することで行つた。結果を表 4に示した。表 4 酸化反応

シリンガルダジン + +

4一ァニシジン +

o—フエ二レンジァン +

フユルラ酸実施例 13 ：分子量

分子量測定は、 GF C (ゲルろ過クロマトグラフィー）を用いて行つた。すなわち、 1.34%N a ₂ H P O , 1 2H_o O、 0.3 %KH。 P

2

0 、 1 %N a C 1によって流速 1.0 m 1 /m i nで平銜化した G F C カラム（Shodex PROTEIN -802.5, 2連）と U V検出器（ 280 n m) を用いる H P L Cにより、実施例 1 1記載のフラクシヨン No. 82の粗精製ポリフエノールォキシダーゼの分析及び分取と活性測定を行ったところ、ポリフノールォキシダ一ゼ活性ピークは分子量 60, 000であつた。なお、分子量マ一カー蛋白質として、オリエンタル工業（株）の M W— M a r k e r (H P L C) を使用した。実施例 14 ： 5リッターフラスコでの培養及び粗精製

1 %グルコース及び 0.2 %NH_A C l、 1.34%N a₉ H P〇₄ · 1 2 H₂ 0、 0.3 %KH₂ P 0₄ 、 0.1 %N a C 1、 0.2 %ペプトン、 0.05 %Mg S 0₄ · 7 H₉ 0、 0.02mM C u S〇₄ からなる 1 リツターの培地に 2 N— N a OHを加えて p Hを 8としたものを含む 5 リッ夕一容のフラスコ 2器に、それぞれミロセシウム ' ロリダム (Myrothecium roridum) S D 3 0 0 2 (受託番号 FERM P- 15255) を接種し、 2 8°C、 3日間の振とう培養を行った。培養後、 4°Cでの遠心分離により除菌された培養ブロス 1.6 リツ夕一を得た。

次に、この培養プロスの一部を、ミニタン ' フィルターパケット（CA

T. NO.： PTGC0 P04, ミリポア社製）を用いるミニタン限外ろ過システム (ミリポア社製）によって、分子量 10, 000以上の画分として濃縮した。これをさらに、 D E A E— C e 1 l u l o f i n e A— 8 0 0mカラムクロマトグラフィ一に供し、溶出した活性画分を再び、上記のミニ夕ン限外ろ過システムによって、分子量 10,000以上の画分として再濃縮した。さらにこの再濃縮液を 2 00 p pmNH₄ HC〇₃ に対して透析後、凍結乾燥に供し、粗精製物を凍結乾燥品として得た。凍結乾燥品のポリフエノ一ルォキシダ一ゼ活性は 5 U/m gであった。実施例 1 5 ：酵素含有洗剤による汚染布の処理

25重量％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（LA S) 、 5重量％のポリオキシェチレンラウリルエーテル、 1 5重量％のトリポリリン酸ナトリウム、 6重量％のケィ酸ナトリウム、 1重量％のカルボキシメチルセルロースナトリウム、及び 48重量％のN a ₂ S 0₄ からなる指標洗剤 1グラムに、実施例 1 4記載の凍結乾燥品を 0.01グラム添加したものを酵素配合洗剤とし、凍結乾燥品を添加していないものを酵素非配合洗剤とした。

また、木綿白布（5 cmx 5 c m) の中央に 1 0 0 p pmエバンスブルー（和光純薬工業（株）） 0.2 m 1を加えることで汚染布を調製した。次に、 5 0 0m 1容ビーカーに汚染布 1枚と水 1 Om 1を加えた後、さらに酵素配合洗剤または酵素非配合洗剤を 1 O m g添加し、 1 2分間振とうすることで洗浄処理を行った。処理後の汚染布は、水洗、風乾し、色彩色差計（CB- 200, MINOLTA 製）によって Y， y, x値（前記と同じ意味を表わす）、を測定し、さらに次式

Z= (1 - X - y) Y/y

によって処理前後の Z値の差（Δ Ζ値）を算出したところ、酵素配合洗剤は、酵素非配合洗剤に比べ、 3ポイントの白色度向上を示した。実施例 1 6 ：ミロセシウム · ロリダム (Myrothecium roridum) S D 3 0 02由来酵素と従来のポリフエノールォキシダーゼとの混合

試薬として市販されているポリフユノールォキシダーゼ（Bigidoporu s zona lis 由来、 TaKaRa (株）） 0.1 Ό/m 1溶液と、本発明のポリフエノールォキシダーゼの 0.2 U/m 1溶液を等容量混合したものを用いて様々な p Hで活性測定を行つたところ、図 1 4に示したように p H 5〜1 1の広範囲の p Hにおいて酸化反応が速やかに進行した。実施例 1 7 ：等電点の測定実施例 1 4記載の凍結乾燥品について、ロトフォア · システム（B I 0— R A D社製）を用いる等電点電気泳動により等電点を測定した。バッファーにはフアルマライト（p H 2. 5〜5) ( S i g m a社から入手）を使用した。

その結果、ミロセシウム · ロリダム（Myrothecium roridum) S D 3

0 0 2 (受託番号 FERM P-15255) 由来のポリフエノールォキシダ一ゼの等電点は 4. 1 ± 0. 5 であった。また、実施例 6に記載の凍結乾燥品について同様の方法により測定したミ口セシウム · ヴヱルカリア（Mvrothec ium verrucaria) S D 3 0 0 1 (受託番号 FERM P-14955) 由来のポリフエノールォキシダ一ゼの等電点は 4. 5 ± 0. 5 であった。産業上の利用可能性

以上詳細に説明した通り、本発明により p H 8以上のアル力リ側に至適反応 p Hを有するポリフユノールォキシダーゼが提供され、これを用いることによりアルカリ P H域での酵素的酸化を達成し、ポリフエノール物質や着色物質の酸化処理や、洗浄、漂白といったポリフユノールォキシダーゼの利用分野が拡大される。

また、本発明のポリフヱノ一ルォキシダ一ゼの製造方法により、本発明のポリフエノールォキシダ一ゼを効率良く製造できる。

また、本発明のミロセシウム · ヴェルカリァ（Myrothecium verrucar ia) S D 3 0 0 1及びミロセシウム ' ロリダム（Myrothecium roridum) S D 3 0 0 2は本発明のポリフヱノ一ルォキシダ一ゼの製造に有効であり、更にパルプの漂白処理に直接使用しても高い効果が得られる。

また、本発明のポリフヱノ一ルォキシダーゼを用いることにより、有効な着色物質の処理、紙、パルプもしくは繊維の処理、漂白処理、洗浄処理、または、微生物もしくはウィルスの殺菌や不活性化処理等の方法

3 00948

PCT/JP96/01594

が提供される ,

Claims

請求の範囲 1) 微生物由来の p H 8以上のアル力リ側に至適反応 p Hを有するポリフヱノールォキシダーゼ。 2) ミロセシウム (Myrothecium) 属細菌由来の請求の範囲第 1項記載のポリフエノールォキシダーゼ。 3) 下記の性質を有する請求の範囲第 1項または第 2項記載のポリフェノールォキシダーゼ。 (1) 作用ポリフヱノ一ルを酸化する。 (2) 至適反応 p H P H 8. 5〜9付近に至適反応 p Hを有する。 (3) 至適反応温度約 60°Cに至適反応温度を有する。 (4) 分子量ゲルろ過クロマトグラフィー分析により測定した分子量が約62, 000である。 (5) 等電点電気泳動により測定した等電点は 4.5±0.5 である。 4 ) ミロセシウム * ヴエルカリア (Myrothecium verrucaria) から得ることのできる請求の範囲第 1項、第 2項または第 3項記載のポリフエノールォキシダーゼ。 5 ) ミロセシウム · ヴェノレカリア (Myrothecium verrucaria) S D 3 001 (受託番号 FEEJI P- 14955) から得ることのできる請求の範囲第 1 項、第 2項または第 3項記載のポリフエノールォキシダーゼ。 6) 下記の性質を有する請求の範囲第 1項または第 2項記載のポリフエノールォキシダ一ゼ。

( 1 ) 作用ポリフヱノールを酸化する。

(2) 至適反応 p H

P H 9付近に至適反応 p Hを有する。

(3) 至適反応温度

70°C付近に至適反応温度を有する。

(4) 分子量

ゲルろ過クロマトグラフィー分析により測定した分子量が約 60, 000である 0

7 ) ミロセシウム · ロリダム（Myrothecium roridum) から得ることのできる請求の範囲第 1項、第 2項または第 6項記載のポリフユノールォキシダーゼ。

8) ミロセシウム · ロリダム（Myrothecium roridum) S D 3 0 0 2 (受託番号 FERii P- 15255) から得ることのできる請求の範囲第 1項、第 2項または第 6項記載のポリフヱノ一ルォキシダーゼ。

9) 請求の範囲第 1項乃至第 8項のいずれかの項に記載のポリフノ —ルォキシダーゼを作用させることを特徴とする、フエノ一ル化合物、アルコキシル基含有芳香族化合物、ハロゲン化フ Xノール化合物、または芳香族ァミン化合物の処理方法。

1 0) 請求の範囲第 1項乃至第 8項のいずれかの項に記載のポリフユノールォキシダーゼを作用させることを特徵とする着色物質の処理方法。

1 1) 請求の範囲第 1項乃至第 8項のいずれかの項に記載のポリフユノール才キシダーゼを作用させることを特徴とする微生物またはウィルスの処理方法。

12) 請求の範囲第 1項乃至第 8項のいずれの項に記載のポリフヱノ —ルォキシダーゼを作用させることを特徴とする紙、パルプ、または繊維の処理方法。

1 3 ) 洗浄剤、洗剤、または界面活性剤と共に用いることを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 8項のいずれかの項に記載のポリフエノールォキシダ一ゼの使用方法。

1 4 ) ペルォキシダーゼ作用を有する物質と共に用いることを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 8項のいずれかの項に記載のポリフユノールォキシダーゼの使用方法。

1 5 ) 酸化剤として空気、酸素、オゾン、過酸化水素、過酸化水素前駆体、過酸前駆体または過酸を単独でまたは複数組み合わせて、請求の範囲第 1項乃至第 8項のいずれかの項に記載のポリフヱノ一ルォキシダーゼと共に用いることを特徵とするポリフヱノールォキシダーゼの使用方法。

1 6 ) ォキシダ一ゼをその基質と共に用いることを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 8項のいずれかの項に記載のポリフヱノールォキシダーゼの使用方法。

1 7 ) ミロセシウム（Myrothecium) 属に属する細菌を培養することを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 8項のいずれかの項に記載のポリフヱノールォキシダーゼの製造方法。

1 8 ) ミロセシウム（Myrothecium) 属細菌がミ口セシウム · ヴヱルカリア (Myrothecium verrucaria) である請求の範囲第 1 7項記載のポリフヱノ一ルォキシダ一ゼの製造方法。

1 9 ) ミロセシウム（My^ theci_um) 属細菌がミ口セシウム · ヴエルカリア (Myrothecium verrucaria) S D 3 0 0 1 (受託番号 FERM P-149 55) またはその変異株である請求の範囲第 1 7項記載のポリフエノールォキシダーゼの製造方法。

2 0 ) ミロセシウム（Myrothecium) 属菌類がミロセシウム · 口リ々" ム (Myrothecium roridum) である請求の範囲第 1 7項記載のポリフエノールォキシダーゼの製造方法。

2 1 ) ミロセシウム（Myrothe ium) 属菌類がミロセシウム . 口リダ厶 (Myrothecium roridum) S D 3 0 0 2 (受託番号 FERM P-15255) またはその変異株である請求の範囲第 1 7項記載のポリフヱノールォキシダーゼの製造方法。

2 2 ) ミロセシウム ·ヴエルカリア（Myrothecium verrucaria^ S D

3 0 0 1 (受託番号 FEM P- 14955) 。

2 3 ) ミロセシウム · ロリダム (Myrothecium roridum) S D 3 0 0 2 (受託番号 FERM P-15255) 。

2 4 ) 請求の範囲第 1項乃至第 8項のいずれかの項に記載のポリフエノ一ルォキシダ一ゼを含むことを特徴とする洗剤組成物。