DE10046894A1 - Mehrkomponentenzusammensetzung zur enzymatischen Oxidation von Verbindungen und Verfahren zu ihrer Anwendung - Google Patents

Abstract

Mehrkomponentenzusammensetzung, welche zur Oxidation eines Substrats bei alkalischen pH-Werten unter Einsatz eines enzymatischen Oxidationskatalysators und eines Elektronenakzeptors geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Oxidationskatalysator CotA, als Elektronenakzeptor O¶2¶ und als Substrat eine von CotA oxidierbare Verbindung enthält.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Mehrkomponentenzusam­ mensetzung zur enzymatischen Oxidation von Verbindungen bei al­ kalischen pH-Werten und Verfahren zu ihrer Anwendung.

Oxidasen, wie Laccasen (EC 1.10.3.2) oder Tyrosinasen (EC 1.10.3.2) bilden eine Gruppe von kupferhaltigen Oxidasen, die ein breites Substratspektrum aufweisen und sauerstoffabhängig eine Vielzahl von phenolischen und nichtphenolischen Verbindun­ gen oxidieren. Die systematische Unterteilung dieser Oxidasen geschieht hauptsächlich über das unterschiedliche Substratspek­ trum und ist nicht eindeutig, da zum Beispiel von Fernandez et al. ((1999) Pigment Cell research, Vol. 12, p. 331 - 339) eine Oxi­ dase beschrieben ist, die Substrate oxidieren kann, die entwe­ der für Laccasen oder Tyrosinasen als charakteristisch gelten. Zusammenfassend werden solche sauerstoffabhängigen Oxidasen, die phenolische Substrate oxidieren können, auch als Poly­ phenoloxidasen bezeichnet.

Technisch werden solche Polyphenoloxidasen eingesetzt zur di­ rekten, sauerstoffabhängigen Oxidation von Substraten oder als Oxidationskatalysator in sogenannten Mehrkomponentensystemen, wo sie zunächst sauerstoffabhängig einen definierten Mediator oxidieren, welcher dann seinerseits das eigentlich zu oxidie­ rende Zielmolekül oxidiert. Durch den Einsatz solcher Mediato­ ren kann das breite Substratspektrum von Polyphenoloxidasen nochmals stark erweitert werden.

Der technische Einsatz von Polyphenoloxidasen zur direkten Oxi­ dation ist beschrieben. Beispiele dafür sind der Einsatz zur Gelierung von phenolyschen Polymeren (WO 96/03440), zur Er­ höhung der Lagerfähigkeit von Bier (WO 95/21240), zur Ent­ fernung von Sauerstoff aus Öl oder ölhaltigen Produkten (WO 96/35768), zur Herstellung von auf Lignozellulose basierenden Produkten (WO 97/17492), als Bestandteil eines Waschpulvers (WO 97/43383) oder zur Entfärbung von Farbstoffen (Rodriguez et al. (1999), Current Microbiology, Vol. 38, p. 27 - 32).

Es sind zwei Gruppen von Polyphenoloxidasen beschrieben, die in mediatorabhängigen, enzymatischen Oxidationsverfahren eingesetzt werden können: Laccasen (Boubonnais & Paice (1990), FEBS LETTERS, Vol. 267 (1), p. 99 - 102, WO 94/29510) und Tyrosinasen (WO 94/29510).

Als Mediatoren, die den Elektronentransfer vom zu oxidierenden Substrat auf die Oxidasen vermitteln, sind eine Reihe unter­ schiedlicher Verbindungen beschrieben. Bei geeigneten Mediato­ ren handelt es sich besonders um phenolische Verbindungen oder nichtphenolische Aromaten oder um Verbindungen, die eine N-O- Gruppe aufweisen. Typische Mediatoren sind beispielsweise in WO 94/29510, WO 94/12621, WO 97/06244, WO 96/10079, WO 99/54545 oder WO 95/01426 beschrieben.

Es ist bekannt, diese mediatorabhängigen, enzymatischen Oxida­ tionsverfahren mit Oxidasen und Sauerstoff zum Beispiel zur Kohleverflüssigung (WO 94/29510), zur Zellstoffbleiche (WO 94/29510), zur organischen Synthese (Potthast et al. (1995), J. Org. Chem., Vol. 60, p. 4320 - 4321) als Bleichsystem in Wasch­ mitteln und Geschirrspülmitteln (WO 97/06244), zur Jeansbleiche (WO 96/12846), zur Verhinderung eines Farbtransfers bei der Wä­ sche (WO 98/23716) oder zum Abbau polyzyklischer, aromatischer Kohlenwasserstoffe (Johannes et al. (1996), Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 46, p. 313 - 317) zu verwenden.

In den beschriebenen Anwendungen werden als Oxidasen bevorzugt Laccasen eingesetzt, die aus Weißfäulepilzen, wie Trametes, Polyporus oder Phanarochaeta und anderen Basidomyceten gewonnen werden. Diese Enzyme sind meistens bei sauren pH-Werten zwi­ schen 3,5 und 6,5 optimal aktiv (Paice et al. (1995), Journal of pulp and paper science, Vol., 21 (8), J280 - J284). Phenoloxida­ sen, die bei pH-Werten unter, bzw. bei pH 7,0 optimal aktiv sind, werden teilweise auch von Bakterien produziert (Givaudan et al. (1993), FEMS Microbiology Letters 108, p. 205 - 210; WO 97/2825; Claus & Filip (1997), Microbiol. Res., Vol. (152), p. 209 - 216). Daneben wurden einige Polyphenoloxidasen aus Pilzen be­ schrieben, die auch bei alkalischen pH-Werten aktiv sind (WO 97/08325, EP 0 852 260 A1, WO 00/05349).

Alle bekannten Oxidasen aus Pilzen, die bei alkalischen pH-Wer­ ten aktiv sind, besitzen jedoch einen oder mehrere Nachteile, die einem technischen Einsatz bei alkalischen pH-Werten entge­ genstehen:
Die spezifischen Aktivitäten sind relativ gering, so daß große Mengen Enzym zur Oxidation eingesetzt werden müssen.

Die Redoxpotentiale sind relativ gering, so daß auch deshalb große Mengen Enzym zur Oxidation eingesetzt werden müssen. Für die natürlichen Produzenten der Enzyme stehen keine ge­ eigneten, gentechnischen Methoden zur Konstrukten von rekombi­ nanten Hochleistungsproduktionssystemen zur Verfügung. Hetero­ loge Produktionssysteme liefern häufig nicht die für einen technischen Einsatz benötigten, hohen Ausbeuten.

Phenoloxidasen aus Pilzen sind glykosyliert. Das Glykosy­ lierungsmuster und damit teilweise auch die Enzymeigenschaften, wie Stabilität, Adsorptionsverhalten und ähnliches, verändert sich bei rekombinanten Produktionsystemen teilweise.

Kupferhaltige Oxidasen aus Pilzen können bisher nicht in akti­ ver Form in bakteriellen Produktionssystemen, die den Vorteil einer kurzen Fermentationszeit besitzen, produziert werden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, eine Mehrkomponen­ tenzusammensetzung zur Verfügung zu stellen, welche zur Oxida­ tion eines Substrats bei einem alkalischen pH-Wert (< pH 7,0) unter Einsatz eines enzymatischen Oxidationskatalysators und eines Elektronenakzeptors geeignet ist, ohne mit den beschriebe­ nen Nachteilen behaftet zu sein.

Die Aufgabe wird gelöst durch eine Mehrkomponentenzusammen­ setzung, welche als Oxidationskatalysator CotA, als Elektronen­ akzeptor O₂ und als Substrat eine von CotA oxidierbare Verbin­ dung enthält.

CotA ist im Gegensatz zu den extrazellulär vorliegenden Phe­ noloxidasen mit pH-Optimum um pH 7,0 aus Bacillus (WO 97/28257) ein in Bacillus in der Hülle der Endospore lokalisiertes Protein, das zur Bildung von pigmentierten Endosporen notwendig ist (Donovan et al. (1987), Journal of Molecular Biology, Vol. 196, p. 1 - 10). Der Mechanismus der Pigmentbildung durch CotA ist nicht bekannt; eine enzymatische Aktivität wurde für CotA bisher nicht nachgewiesen.

Die vollständige Nukleotidsequenz des Gens für CotA aus Bacillus subtilis und die entsprechende Proteinsequenz ist be­ kannt. Sie wurde 1996 von Borriss et al. ((1996), Microbiology, Vol. (142), p. 3027 - 3031) veröffentlicht.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß CotA eine Phenol­ oxidaseaktivität aufweist und ein breites Spektrum von Substra­ ten sauerstoffabhängig oxidieren kann. Das pH-Optimum der Oxi­ daseaktivität liegt für Substrate, wie N-OH-Acetanilid (NHA, Me­ diator) oder Syringaldazin (direktes Substrat) zwischen 7,5 und 8,5 und damit wesentlich höher als das pH-Optimum der bisher bekannten, bakteriellen Poly­ phenoloxidasen, und auch höher als das pH-Optimum der extrazellulären Phenoloxidasen aus Bacillus (WO 97/28257).

Während diese Oxidasen über pH 8,0 weniger als 10% ihrer Maxi­ malaktivität aufweisen (WO 97/28257), besitzt CotA auch bei pH 8,5 (Syringaldazin) bzw. bei pH 9,5 (NHA) noch ca. 50% seiner maximalen Aktivität (vgl. Fig. 1). CotA läßt sich daher ausgezeichnet als Oxidase in einem Verfahren zur Oxidation von Substraten bei alkalischen pH-Werten verwenden.

Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung von CotA zur Oxidation von Substraten bei alkalischen pH-Werten.

Als Substrate sind alle Verbindungen geeignet, die von CotA oxidiert werden können. Dabei kann es sich direkt um ein eigentlich zu oxidierendes Zielmolekül handeln, oder es kann sich um einen von CotA oxidierbaren Mediator handeln.

Unter einem Mediator ist eine Verbindung zu verstehen, die von CotA direkt oxidiert werden kann und deren oxidierte Form ein eigentlich zu oxidierendes Zielmolekül oxidieren kann.

Bevorzugt handelt es sich beim direkt von CotA oxidierbaren Zielmolekül um eine phenolische Verbindung, um eine aromatische Verbindung, die eine Alkoxygruppe enthält, oder um ein aromati­ sches Amin.

Bevorzugt handelt es sich beim Mediator um eine phenolische Verbindung oder einen nichtphenolischen Aromaten oder um eine Verbindung, die eine N-O-Gruppe aufweist. Solche Verbindungen sind zum Beispiel in WO 94/29510, WO 94/12621, WO 97/06244, WO 96/10079, WO 99/54545 oder WO 95/01426 beschrieben.

Geeignete Mediatoren sind zum Beispiel Phenothiazin-10-Propion­ säure, 10-Methylphenothiazin, Acetosyringon, Syringaldehyd, ABTS oder N-OH-haltige Mediatoren, wie 1-Hydroxybenzotriazol, Violursäure oder Nitrosonaphtholsulfonsäure.

Bevorzugt handelt es sich um die in WO 94/29510 als Mediator beschriebenen Verbindungen.

Besonders bevorzugt handelt es sich beim Mediator um N-OH-Acet­ anilid.

Die erfindungsgemäße Mehrkomponentenzusammensetzung zur Oxida­ tion einer Zielsubstanz unter Beteiligung eines Mediators eignet sich für alle Anwendungen, wie sie für mediatorabhängige, enzymatische Oxidationsverfahren mit Oxidasen und Sauerstoff bekannt sind.

Eine erfindungsgemäße Mehrkomponentenzusammensetzung kann zum Beispiel verwendet werden:

• - zur Zellstoffbleiche bei der Zellstoffherstellung,
• - zur Indigobleiche bei der Herstellung von gebleichten Jeans,
• - als Oxidationssystem in einer Waschmittelzusammensetzung oder in einem Geschirrspülmittel,
• - zur organischen Synthese,
• - zum Abbau polyzyklischer, aromatischer Kohlenwasserstoffe oder
• - zur Kohleverflüssigung.

Die erfindungsgemäße Mehrkomponentenzusammensetzung weist fol­ gende Vorteile gegenüber bekannten Systemen auf:

Es besitzt eine maximale Aktivität im alkalischen pH-Bereich:
Im Gegensatz zu den bekannten, bakteriellen Phenoloxidasen be­ sitzt CotA eine optimale Oxidaseaktivität im alkalischen pH-Bereich (Fig. 1) und ist auch bei pH 9,5 mit NHA als Substrat noch zu mehr als 50% aktiv.

Im Gegensatz zu Polyphenoloxidasen aus Pilzen kann CotA einfach in heterologen, bakteriellen Wirtsstämmen in aktiver Form produ­ ziert werden. Durch das schnellere Wachstum der Bakterien kön­ nen bei vergleichbarer Produktionsleistung (g/l) höhere Raum/Zeit-Ausbeuten und damit geringere Herstellkosten er­ zielt werden.

Die Erfindung betrifft ferner Verfahren, die unter Einsatz einer erfindungsgemäßen Mehrkomponentenzusammensetzung ablaufen. Ein solches Verfahren, bei dem ein Substrat bei einem alkalischen pH-Wert unter Einsatz eines enzymatischen Oxidationska­ talysators und eines Elektronenakzeptors oxidiert wird, ist da­ durch gekennzeichnet, daß als Oxidationskatalysator CotA und als Elektronenakzeptor O₂ eingesetzt werden und das Substrat eine von CotA oxidierbare Verbindung ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann in rein wäßriger Mischung oder in einer lösungsmittelhaltigen, wäßrigen Mischung durchge­ führt werden. In einer lösungsmittelhaltigen Mischung liegt der Anteil des Lösungsmittels bevorzugt zwischen 0,1% und 75% (w/v). Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren bei einem Lösungsmittelgehalt zwischen 5% und 25% eingesetzt. Geeignete Lösungsmittel sind zum Beispiel wassermischbare Lö­ sungsmittel, wie Ethanol, Methanol, Isopropanol, 1,4-Dioxan und Aceton, aber auch schlecht wassermischbare Lösungsmittel, wie zum Beispiel 2-Butanol.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei einem beliebigen pH-Wert, bei dem die CotA-abhängige Oxidation des Substrates möglich ist, durchgeführt werden. Bevorzugt wird das Verfahren bei einem pH-Wert zwischen pH 7,0 und 10,5 durchgeführt. Beson­ ders bevorzugt wird das Verfahren bei einem pH-Wert zwischen 7,5 und 9,0 durchgeführt.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich sowohl zur Oxidation eines Substrats, das in einer wasserhaltigen Mischung löslich ist, als auch zur Oxidation eines in einer wasserhaltigen Mischung unlöslichen Substrats, welches in Form einer wäßrigen Emulsion oder Suspension eingesetzt wird. Das zu oxidierende Substrat kann in einer Konzentration zwischen 0,001% und 50% (w/v) eingesetzt werden. Vorzugsweise wird das zu oxidierende Substrat in einer Konzentration zwischen 0,01% und 25% einge­ setzt.

Wird in einem erfindungsgemäßen Verfahren ein Mediator verwen­ det, wird dieser bevorzugt in einer Konzentration bis zu 10% (w/v) eingesetzt. Besonders bevorzugt wird der Mediator in ei­ ner Konzentration von 0,001% bis 2% eingesetzt; insbesondere bevorzugt sind Verfahren, bei denen der Mediator in einer Kon­ zentration von 0,01% bis 1% eingesetzt wird.

Im erfindungsgemäßen Verfahren dient Sauerstoff als Elektronen­ akzeptor. Der Sauerstoff wird dem Ansatz zugegeben oder zum Beispiel durch Elektrolyse im Verfahren erzeugt. Bevorzugt wird im Verfahren gasförmiger Sauerstoff eingesetzt. Besonders bevorzugt wird im erfindungsgemäßen Verfahren Luft als Sauer­ stoffquelle eingesetzt. Der Sauerstoffpartialdruck im erfin­ dungsgemäßen Verfahren kann bevorzugt zwischen 0,01 bar und 100 bar betragen. Besonders bevorzugt beträgt der Sauerstoff­ partialdruck 0,1 bar bis 10 bar. Insbesondere bevorzugt beträgt der Sauerstoff zwischen 0,15 und 2 bar.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei allen Temperaturen, bei denen die CotA-abhängige Oxidation des zu oxidierende Substra­ tes möglich ist, durchgeführt werden. Bevorzugt wird das Ver­ fahren bei Temperaturen zwischen 25°C und 80°C durchgeführt. Besonders bevorzugt wird das Verfahren bei Temperaturen zwi­ schen 40°C und 65°C durchgeführt.

Das erfindungsgemäßes Verfahren kann zum Beispiel für folgende Zwecke eingesetzt werden:

• - Zur Bleiche von gefärbten Verbindungen durch direkte Oxida­ tion mit CotA (zum Beispiel zur Abwasserbehandlung bei Tex­ tilfärbereien oder Zellstoffmühlen).
• - Zur Verminderung des Transfers von Textilfarbstoffen von einer Textilie zur nächsten, wenn die beiden Textilien zusammen gewaschen werden durch die Oxidation der diffundierenden Farbstoffe.
• - Zur Inaktivierung von Mikroorganismen oder Viren durch die Behandlung mit CotA in Gegenwart von Sauerstoff.
• - Zur Entfernung von Sauerstoff aus Öl oder ölhaltigen Verbin­ dungen durch Zusatz von CotA und gegebenenfalls eine von CotA oxidierbare Verbindung.
• - Zur Herstellung von ligninhaltigen Preßspanplatten durch die Bildung von vernetzbaren Radikalen durch die Oxidation von phenolischen Komponenten im Holz.
• - Als oxidative Komponente in einer Waschmittelzusammensetzung zur Oxidation von oxidierbaren Verunreinigungen.
• - Zur gezielten, organischen Synthese durch Oxidation einer Aus­ gangsverbindung.

Es ist dem Fachmann ein leichtes, die genannten, jeweils bekannten Verfahren unter Nutzung der in der vorliegenden Anmeldung genannten Komponenten und Verfahrensbedingungen so zu modifizieren, daß das modifizierte Verfahren die Vorteile, die das erfindungsgemäße Verfahren bietet, nutzt. Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen Mehrkomponentenzusammensetzung für die genannten Zwecke.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung sind unter CotA auch Deri­ vate von CotA zu verstehen. Unter einem Derivat von CotA ist dabei eine Oxidase zu verstehen, die mittels dem Fachmann ver­ trauten Verfahren durch gerichtete oder ungerichtete Mutagenese aus CotA abgeleitet werden kann, und deren Aminosäuresequenz zu mehr als 60% homolog ist zu der Aminosäuresequenz von CotA, und die eine sauerstoffabhängige Oxidase-Aktivität aufweist. Der Homologiewert zwischen CotA und CotA-Derivaten kann ermittelt werden mit der Programmroutine 'gap' im Computerprogramm 'Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin' oder einer gleichwertigen Analysesoftware. Zur Ermittlung der Homologie wird CotA und die zu vergleichende Aminosäuresequenz mit den Standardparametern der Programmroutine 'gap' (gap creation penalty = 12; gap extension penalty = 4) analysiert. Die Programmroutine liefert als Resultat einen prozentualen Homologiewert (percent similarity) zwischen den beiden Aminosäuresequenzen.

Bei Derivaten von CotA kann es sich um Enzyme handeln, die durch Deletionen, Insertionen oder Punktmutationen aus CotA ab­ geleitet werden können. Derivate von CotA sind auch solche Oxi­ dasen, bei denen der für die Oxidaseaktivität relevante Teil von CotA mit anderen Peptiden oder Proteinen fusioniert ist.

Eine für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Oxidase CotA oder ein entsprechendes cotA-Gen zur Herstellung eines rekombi­ nanten Produktionssystems kann aus beliebigen Bacillus-Stämmen gewonnen werden. Bevorzugt wird CotA aus solchen Bacillus-Stäm­ men gewonnen, die pigmentierte Endosporen bilden. Besonders bevorzugt wird CotA aus Bacillus subtilis gewonnen. Ein besonders bevorzugter Bacillus-subtilis-Stamm zur Gewinnung von CotA ist Bacillus subtilis LK5 (DSM 13487).

Bevorzugt wird CotA aus rekombinanten Produktionsstämmen gewon­ nen. Unter rekombinanten Produktionsstämmen sind solche Stämme zu verstehen, bei denen für CotA kodierende Gene mit dem Fach­ mann bekannten Methoden eingebracht worden sind. Bei den rekom­ binanten Produktionsstämmen kann es sich um homologe Pro­ duktionsstämme handeln, d. h. um Produktionsstämme, die natürli­ cherweise bereits mindestens eine Kopie des zu exprimierenden cotA-Gens enthalten, oder es kann sich um heterologe Pro­ duktionsstämme handeln. Unter heterologen Produktionsstämmen sind solche Stämme zu verstehen, deren Genom vor dem gentechni­ schen Einbringen von mind. einer Kopie eines cotA-Gens dieses Gen nicht enthalten haben. Bevorzugt werden als Produktions­ stämme homologe, rekombinante Produktionsstämme verwendet, d. h. Bacillus-Stämme, die zusätzlich zu dem/den na­ türlicherweise vorhandenen cotA-Gen(en) noch mindestens eine durch gentechnische Verfahren eingebrachte Kopie des cotA-Gens enthalten. Besonders bevorzugt werden als Produktionsstämme solche Stämme von Bakterien oder Pilzen verwendet, die natürlicherweise kein cotA-Gen enthalten, und die das entsprechende Gen zur Produktion von CotA durch bekannte, gentechnische Verfahren erhalten haben. Besonders bevorzugt werden E.-coli-K12-Stämme, wie zum Beispiel E. coli W3110 (ATCC 27325) als Wirtsstämme zur Herstellung von Produktionsstämmen für rekombinantes CotA verwendet.

Bei rekombinanten Produktionsstämmen können eingebrachte cotA-Gene extrachromosomal oder chromosomal kodiert sein. Bei homologen, rekombinanten Produktionsstämmen liegen die zusätzlichen cotA-Gene bevorzugt chromosomal vor. Bei heterologen, rekombinanten Produktionsstämmen liegen die cotA- Gene bevorzugt extrachromosomal, zum Beispiel plasmidkodiert, vor.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Er­ findung.

Beispiele Beispiel 1 Gewinnung von CotA aus Bacillus subtilis LK5

Bacillus subtilis LK5 wurde für 72 h bei 30°C in 100 ml Flüssigmedium (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt) angezogen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (10000 rpm, 10 min) gewon­ nen. Das Zellpellet wurde in 1 ml 20 mN Tris/Cl pH 7,5 aufge­ nommen. Anschließend wurden die Zellen mit einer French Press (1000 psi) lysiert. Das Lysat aus der French press wurde mit 1,5 ml 20 mM Tris/Cl pH 7,5 verdünnt. Unter ständigem Rühren bei 4°C wurden dem Ansatz insgesamt 0,63 g pulverförmiges Ammoniumsulfat zugesetzt. Nachdem sich das Ammoniumsulfat voll­ ständig gelöst hatte, wurde der Ansatz für 10 min bei 10000 rpm bei 4°C zentrifugiert. Das dabei gebildete Pellet wurde verwor­ fen; der Überstand wurde bei 4°C mit weiteren 0,16 g Ammonium­ sulfat versetzt und für 30 min bei 4°C gerührt. Anschließend wurde der Ansatz erneut für 10 min bei 10000 rpm zentrifugiert. Das dabei erhaltene Pellet enthielt einen wesentlichen Anteil des von Bacillus LK5 gebildeten CotA. Es wurde in 0,2 ml 20 mM Tris/Cl pH 7,5 aufgenommen und mittels PD-10-Chromatographie­ säulen (Pharmacia) entsalzt. Dazu wurden die Säulen mit 35 ml 20 mM Tris/Cl pH 7,5 equilibriert. Dann wurde die CotA-Lösung auf die Säulen aufgebracht. Anschließend wurde CotA mit 3,5 ml 20 mM Tris/Cl pH 7,5 eluiert. Die so gewonnene CotA-Präparation wurde für die folgenden Versuche verwendet.

Beispiel 2 Konstruktion eines rekombinanten E.-coli-Produktionssystems für CotA aus Bacillus subtilis LK5

Zur Konstruktion eines Expressionsvektors, der in E.-coli- Stämmen die Expression einer aktiven Form von CotA ermöglicht, wurde das cotA-Gen aus chromosamler DNS von Bacillus subtilis LK5 mittels PCR amplifiziert und dabei mit einer geeigneten Ri­ bosomenbindestelle, einem Regulationselement, das die Initiation der Translation in E. coli bewirkt, versehen. Das Amplifikationsprodukt, bestehend aus dem cotA-Gen und einer in E. coli funktionellen Ribosomenbindestelle wurde unter die Kon­ trolle des lac-Promoters des lacZ-Gens in den Vektor pUC19 (New England Biolabs GmbH, Schwalbach/Taunus) kloniert. Der daraus resultierende Vektor pCOT100 (Fig. 2) trägt das cotA-Strukturgen unter der Kontrolle von Transkriptions- und Translations­ signalen, die in beliebigen E.-coli-Stämmen die Expression von aktivem CotA ermöglichen. Im Folgenden wird die Konstruktion entsprechender E.-coli-Stämme beschrieben:

PCR-Amplifikation einer Genfusion, bestehend aus dem cotA- Strukturgen und einer in E. coli funktionellen Ribosomenbinde­ stelle.

Das cotA-Strukturgen wurde aus chromosomaler DNS von Bacillus subtilis LK5 mittels FCR amplifiziert. Die im nativen cotA-Gen nicht vorhandenen, singulären Restriktionsschnittstellen vor und nach dem cotA-Strukturgen zur Klonierung in pUC19 und eine in E. coli funktionelle Ribosomenbindestelle wurden über die zur Amplifikation verwendeten Primeroligonukleotide eingebracht:

cotafw: (SEQ. ID. NO: 1)

cotarev: (SEQ. ID. No: 2)

Die PCR-Amplifikation des cotA-Gens aus Bacillus subtilis LK5 wurde in 30 Zyklen in Gegenwart von 200 µM Deoxynukleotidtri­ phosphaten (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), je 1 µM der beiden Oligonukleotide, 100 ng chromosomaler DNS aus Bacillus subtilis LK5 als Matrize für cotA, 1/10 10fach Reaktionspuffer (100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 200 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20 mM MgSO₄, 1% Triton X-100 und 1 mg/ml BSA) und 2,5 Einheiten einer hitzesta­ bilen, rekombinanten Pfu-DNS-Polymerase (Stratagene) in einem Thermocycler (Gene-ATAQ-Controler, Pharmacia) bei folgenden Zykluszeiten und Zyklustemperaturen durchgeführt: 94°C für 1 min, 58°C für 1 min und 72°C für 3 min.

Das Amplifizierungsprodukt wurde mit BamHI und HindIII (beide von Boehringer Mannheim GmbH) unter den vom Hersteller angege­ benen Bedingungen hydrolysiert, über ein 0,8%-Agarosegel auf­ getrennt und mit Hilfe der Geneclean-Methode (Geneclean, Kit BIO101, La Jolla, California) nach den Angaben des Herstellers aus dem Agarosegel isoliert. Bis zur weiteren Verwendung wurde das Fragment bei 4°C gelagert.

Konstruktion von Plasmid pCOT100

Als Basisplasmid zur Konstruktion von Plasmid pCOT100 wurde das kommerziell verfügbare Plasmid pUC19 (New England Biolabs) ver­ wendet. Etwa 1 µg des Plasmids pUC19 wurde mit den Restrik­ tionsenzymen BamHI und HindIII (beide von Boehringer Mannheim GmbH) gespalten. Die gespaltene DNS wurde anschließend durch eine Agarosegelelektrophorese, wie oben beschrieben, gereinigt. Das in Beispiel 2, Abschnitt A beschriebene HindIII/BamHI- Fragment mit dem Gen für CotA wurde mit dem mit HindIII/BamHI gespaltenen Plasmid pUC19 in äquimolaren Mengen gemischt und mit 1 U T4 DNS-Ligase und 2 µl 10fach Ligasepuffer (beide von Boehringer Mannheim GmbH) versetzt und mit sterilem, doppelt destilliertem H₂O auf ein Gesamtvolumen von 20 µl aufgefüllt. Der Ansatz wurde bei 4°C über Nacht inkubiert und zur Transfor­ mation von Zellen von Escherichia coli W3110 (ATCG 27325), die mit bekannten Verfahren (Maniatis, Molecular Cloning, A Labora­ tory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory (1982), N. Y.) kompe­ tent für die Aufnahme von DNS gemacht wurden, verwendet. E.- coli-Zellen, die das CotA-Produktionsplasmid pCOT100 dabei aufgenommen hatten, wurden durch Selektion auf ampicillinhaltigen Nährböden identifiziert. Für die in Beispiel 3 beschriebene Produktion von aktivem CotA wurde ein plasmidhaltiger Klon, der als E. coli W3110 pCOT100 bezeichnet wurde, ausgewählt.

Beispiel 3 Gewinnung von aktivem CotA mit E. coli W3110 pCOT100

E. coli W3110 pCOT100 wurde für 72 h bei 30°C in 100 ml modifi­ ziertem LB-Flüssigmedium (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 1% Laktose, 0,3% Glukose, 100 µg/ml Ampicillin) ange­ zogen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (10000 rpm, 10 min) gewonnen. Das Zellpellet wurde in 1 ml 20 mM Tris/Cl pH 7,5 aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen mit einer French press (1000 psi) lysiert. Das Lysat aus der French press wurde mit 1,5 ml 20 mM Tris/Cl pH 7,5 verdünnt. Unter ständigem Rühren bei 4°C wurden dem Ansatz insgesamt 0,63 g pulverförmi­ ges Ammoniumsulfat zugesetzt. Nachdem sich das Ammoniumsulfat vollständig gelöst hatte, wurde der Ansatz für 10 min bei 10000 rpm bei 4°C zentrifugiert. Das dabei gebildete Pellet wurde verworfen; der Überstand wurde bei 4°C mit weiteren 0,16 g Am­ moniumsulfat versetzt und für 30 min bei 4°C gerührt. An­ schließend wurde der Ansatz erneut für 10 min bei 10000 rpm zentrifugiert. Das dabei erhaltene Pellet enthielt einen we­ sentlichen Anteil des von E. coli W3110 pCOT100 gebildeten CotA. Es wurde in 0,2 ml 20 ml Tris/Cl pH 7,5 aufgenommen und mittels PD-10-Chromatographiesäulen (Pharmacia) entsalzt. Dazu wurden die Säulen mit 35 ml 20 mM Tris/Cl pH 7,5 equilibriert. Dann wurde die CotA-Lösung auf die Säulen aufge­ bracht. Anschließend wurde CotA mit 3,5 ml 20 mM Tris/Cl pH 7,5 eluiert. Die so gewonnene CotA-Präparation wurde für die fol­ genden Versuche verwendet.

Beispiel 4 pH-Abhängigkeit von CotA

Die pH-Abhängigkeit der Oxidation der Substrate Syringalazin und N-OH-Acetanilid (NHA) durch CotA wurde für CotA gewonnen aus Bacillus (Beispiel 1) und für CotA gewonnen aus rekombinan­ tem E. coli (Beispiel 3) bestimmt.

Zur Bestimmung der pH-Abhängigkeit der Oxidation von Syring­ aldazin durch CotA wurden jeweils 3 ml einer 100 mM Puffer­ lösung (Citrat/Phosphat bei pH 4 - 7; Tris/Cl bei pH 7 - 10; Borsäure/NaOH bei pH 9 - 12) mit 75 µl der CotA-Präparationen (wie in Beispiel 1 und 3 beschrieben) und 225 µl Syringaldazin­ lösung (0,28 mM) versetzt. Nach 120 Sekunden Inkubation bei 50°C wurde die Extinktion bei 530 nm gemessen. In Fig. 1A sind die relativen Aktivitäten von CotA aus Bacillus und aus E. coli bei verschiedenen pH-Werten dargestellt.

Zur Bestimmung der pH-Abhängigkeit der Oxidation von NHA durch CotA wurden jeweils 425 µl einer 100 mM Pufferlösung (Citrat/Phosphat bei pH 4 - 7; Tris/Cl bei pH 7 - 10; Bor­ säure/NaOH bei pH 9 - 12) mit 50 µl der CotA-Präparationen (wie in Beispiel 1 und 3 beschrieben) und 25 µl wässriger NHA-Lösung (50 µM) versetzt. Nach 6 Stunden Inkubation bei 35°C wurde die Reaktion durch Zugabe von 1,5 ml 50 mM H2SO4 gestoppt. Durch HPLC wurde der im Ansatz verbliebene Anteil an nicht umge­ setztem NHA quantitativ bestimmt.

In Fig. 1B sind die relativen Aktivitäten der Oxidation von NHA durch CotA aus Bacillus und aus E. coli bei verschiedenen pH- Werten dargestellt.

Aus Fig. 1A und 1B geht hervor, daß sich die CotA-Enzyme aus Bacillus und E. coli bezüglich ihrer pH-Abhängigkeit nicht we­ sentlich unterscheiden. Das Optimum der Aktivität der Syring­ aldazinoxidation (Aktivität < = 90%) liegt zwischen pH 6,0 und pH 8,0. Zwischen pH 5,5 und pH 8,5 ist CotA gegenüber Syring­ aldazin zu mehr als 50% aktiv. Das pH-Optimum der CotA-Aktivi­ tät gegenüber NHA (Aktivität < = 90%) liegt zwischen pH 7,5 und pH 9,0. Zwischen pH 6,5 und pH 9,5 ist CotA gegenüber NHA zu mehr als 50% aktiv.

Beispiel 5 Substratspektrum von CotA

Zur Charakterisierung von CotA wurde getestet, welche bekannten Substrate von Polyphenoloxidasen von CotA direkt oxidiert wer­ den können. Dazu wurden jeweils 200 µM der in Tabelle 1 zusam­ mengefassten Substrate mit den in Beispiel 1 und 3 erhaltenen CotA-Fraktionen (je 10 µl) bei pH 7,0 (100 mM Tris/Cl) und 30°C in 2 ml Reaktionsvolumen umgesetzt. Mit einer Sauerstoffelek­ trode wurde der Sauerstoffverbrauch der Reaktionen ermittelt. Als Negativkontrolle wurden die gleichen Ansätze mit einer Pro­ teinfraktion aus E. coli W3110 pUC19, welche analog der CotA- Fraktion, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt wurde, getestet. In Tabelle 1 ist für alle getesteten Verbindungen dargestellt, ob bei der Reaktion mit CotA, bzw. dem Kontrollextrakt eine Sauerstoffabnahme im Ansatz auftrat (mit ' + ' gekennzeichnet). Bei den Verbindungen, bei denen nur im CotA-Ansatz ein Sauerstoffverbrauch meßbar war, handelt es sich um Substrate von CotA. Bei den mit *) markierten Substraten handelt es sich um Verbindungen, die bekannterweise als Re­ doxmediatoren wirken können.

Tabelle 1

Substratspektrum von CotA

Aus Tabelle 1 geht hervor, daß das rekombinante Genprodukt CotA aus E. coli W3110 pCOT100 das gleiche Substratspektrum auf­ weist, wie das aus Bacillus subtilis LKS gewonnene CotA. Dieses Beispiel zeigt das sehr breite Substratspektrum von CotA. Für Phenoloxidasen typischen Substrate können von CotA direkt oxi­ diert werden. Die in Tabelle 1 dargestellten Verbindungen ste­ hen nur exemplarisch für typische Substrate von Polyphenol­ oxidasen. CotA kann darüber hinaus auch zur Oxidation beliebi­ ger, weiterer, direkt oxidierbarer Verbindungen eingesetzt wer­ den. Daneben können von CotA auch die für Laccase-Mediator- Systeme bekannten Mediatoren, wie zum Beispiel ABTS, Violur­ säure, N-Hydroxyycetanilid oder Phenothiazinpropionsäure von CotA direkt oxidiert werden. Diese Verbindungen stehen nur exemplarisch als Beispiele für Mediatoren, die von CotA akti­ viert werden können. CotA kann darüber hinaus auch zur Oxidation beliebiger, weiterer Mediatoren eingesetzt werden. CotA kann damit auch eingesetzt werden zur indirekten Oxidation von solchen Verbindungen, die selbst kein Substrat von CotA sind, die aber von durch CotA oxidierten Mediatoren oxidiert werden können.

Beispiel 6 Delignifizierung von Zellstoff mit CotA und verschiedenen Mediatoren

Mit Sauerstoff delignifizierter Softwood-Kraftzellstoff mit einem Ligningehalt von Kappa 17,4 wurde gewaschen, mit H₂O auf eine Stoffdichte von 10% gebracht und mit jeweils 5 mg Media­ tor (N-hydroxyacetanilid, Violursäure, Nitrosonaphtholsulfon­ säure, Phenothiazin-10-Propionsäure) pro g Zellstoff ver­ setzt. Durch die Zugabe von 1 N NaOH wurde ein pH-Wert von pH 8,0 eingestellt. Die Suspension wurde für 60 sec mit einem ge­ eigneten Rührer homogenisiert. Anschließend wurden in Parallel­ ansätzen jeweils 0,5 ml der CotA-Präparation aus E. coli W3110 pCOT100 (Beispiel 3) pro g Zellstoff zugegeben. Jeweils ein Parallelansatz pro Mediator mit Zugabe einer entsprechend prä­ parierten Kontrollfraktion aus E. coli W3110 pUC19 diente als Kontrolle. Die Ansätze wurden nochmals für 60 sec homogenisiert und in einen temperierbaren, begasbaren Stahlautoklaven einge­ bracht. Die Autoklaven wurden verschlossen; es wurde ein Sauer­ stoffdruck von 3 bar angelegt, und die Autoklaven wurden für 4 h bei 45°C inkubiert. Anschließend wurde der Reaktionsansatz entleert. Der Zellstoff wurde mit 10 Volumen fließendem, 50°C warmem Wasser gewaschen; anschließend wurden aus den Zellstoff­ proben mit einer 70°C warmen, wäßrigen NaOH-Lösung Ligninbruch­ stücke alkalisch extrahiert. Zur Extraktion wurden pro kg Zell­ stoff 20 g NaOH verwendet. Nach der Extraktion wurde der Zell­ stoff erneut mit 10 Volumen fließendem, 50°C warmem Wasser ge­ waschen. Abschließend wurde der Ligningehalt der Zellstoffpro­ ben über den sogenannten Kappa-Wert gemäß der standardisierten Testmethode SCAN-C 1:77 des 'Scandinavian Pulp and Paper Board' bestimmt:

Die Tabelle 2 gibt prozentual die in den Ansätzen erreichte De­ lignifizierung wieder:

Tabelle 2

Delignifizierung von Zellstoff mit CotA aus E. coli

Im Vergleich zur Kontrollprobe konnte bei Verwendung des er­ findungsgemäßen Oxidationsverfahren mit CotA eine signifikante, zusätzliche Delignifizierung zwischen 7,3 und 18% erreicht werden. Die Wirkung von CotA war dabei nicht auf einzelne Me­ diatoren beschränkt.

Beispiel 7 Jeansbleiche mit CotA und den Mediatoren Violursäure und NHA

Quadratisch zugeschnittene Stücke gefärbten Jeansstoffs (9 g/­ 160 cm²) wurden in einem geschlossenen 500-ml-Becher in einem Gesamtflüssigkeitsvolumen von 11,5 ml bei 45°C zusammen mit ei­ ner CotA-Präparation aus E. coli W3110 pCOT100, bzw. einer Kontrollpräparation aus E. coli W3110 pUC19 wie in Beispiel 3 beschrieben und jeweils einer Mediatorsubstanz (331 µmol), in­ kubiert. Der pH-Wert der Ansätze betrug 8,0 (100 mM Tris/Cl). Pro Gramm Stoff wurden 0,2 ml der Enzympräparationen (CotA bzw. Kontrolle) zugegeben. Nach 4 Stunden Inkubation wurden die Stoffstücke unter fließendem Wasser ausgewaschen, bis das Waschwasser farblos war. Die Stoffstücke wurden in einem Blattrockner getrocknet, anschließend gepreßt und mit einem ge­ eigneten Spektralphotometer optisch bewertet.

Der Grad der Ausbleichung wurde mit einem Spektralphotometer CM 3700d (Minolta) entsprechend der Herstellerangaben bestimmt. Gemessen wurde ohne Glanz und ohne UV. Die Helligkeit der Pro­ ben wurde als prozentualer Wert der Totalreflexion im Ver­ gleich zu einem Weissestandard (R 457) ermittelt. L* ist das Maß für die Helligkeit (weiß = 100; schwarz = 0).

Die Werte der behandelten Stoffe wurde mit den Werten unbe­ handelter Referenzstoffe verglichen. Die Veränderung der Helligkeit (ΔL*) der Proben im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen wurde mit der Software PP2000 (Opticontrol) berech­ net.

Tabelle 3

Jeansbleiche mit CotA aus E. coli

Eine Veränderung des Helligkeitswertes (ΔL*) von 5 ist bereits mit dem Auge sichtbar, d. h. mit beiden Mediatoren konnte in Ge­ genwart von CotA eine signifikante Bleichwirkung erreicht wer­ den.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (14)

1. Mehrkomponentenzusammensetzung, welche zur Oxidation eines Substrats bei alkalischen pH-Werten unter Einsatz eines enzymatischen Oxidationskatalysators und eines Elektronenakzeptors geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Oxidationskatalysator CotA, als Elektronenakzeptor O₂ und als Substrat eine von CotA oxidierbare Verbindung enthält.

2. Mehrkomponentensystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die von CotA oxidierbare Verbindung entweder ein direkt zu oxidierendes Zielmolekül oder ein von CotA oxidierbarer Mediator ist.

3. Mehrkomponentensystem nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem direkt von CotA oxidierbaren Zielmolekül um eine phenolische Verbindung, um eine aromatische Verbindung, die eine Alkoxygruppe enthält, oder um ein aromatisches Amin handelt.

4. Mehrkomponentensystem nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mediator um eine phenolische Verbindung, einen nichtphenolischen Aromaten oder um eine Verbindung, die eine N-O-Gruppe aufweist, handelt.

5. Verfahren, bei dem ein Substrat bei einem alkalischen pH-Wert unter Einsatz eines enzymatischen Oxidationskatalysators und eines Elektronenakzeptors oxidiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Oxidationskatalysator CotA und als Elektronenakzeptor O₂ eingesetzt werden und das Substrat eine von CotA oxidierbare Verbindung ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer wäßrigen Mischung abläuft.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer lösungsmittelhaltigen, wäßrigen Mischung abläuft, wobei der Anteil des Lösungsmittels zwischen 0,1% und 75% liegt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es bei einem pH-Wert zwischen pH 7,0 und 10,5 durchgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat in einer Konzentration zwischen 0,001% und 50% eingesetzt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß dem Ansatz Sauerstoff zugegeben wird oder im Verfahren erzeugt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein Sauerstoffpartialdruck zwischen 0,01 bar und 100 bar herrscht.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es bei einer Temperatur zwischen 25°C und 80°C durchgeführt wird.

13. Verwendung von CotA zur Oxidation von Substraten bei alkalischen pH-Werten.

14. Verwendung einer Mehrkomponentenzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4:

• - zur Zellstoffbleiche bei der Zellstoffherstellung,
• - zur Indigobleiche bei der Herstellung von gebleichten Jeans,
• - als Oxidationssystem in einer Waschmittelzusammensetzung oder in einem Geschirrspülmittel,
• - zur organischen Synthese,
• - zum Abbau polyzyklischer, aromatischer Kohlenwasserstoffe

oder

• - zur Kohleverflüssigung.