WO1996026290A1 - Milieu d'examen microbiologique et procede d'examen microbiologique a l'aide de ce milieu - Google Patents

Milieu d'examen microbiologique et procede d'examen microbiologique a l'aide de ce milieu Download PDF

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Toshihiro Sato
Yasukazu Nakakita
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Sapporo Breweries Limited
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
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    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
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    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/045—Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism testing medium and a microorganism testing method using the medium, and more particularly to a medium used in a microorganism testing using an ATP-luciferase method.
  • the present invention can be effectively used for a microorganism test with a small number of bacteria, for example, a microorganism test in a bead, more specifically, a microbial test in a raw stuffed bean.
  • Adenosin triphosphate is present collectively in living cells. This ATP is used as a coenzyme to carry out a run-enzyme-luciferase reaction, and the small amount of light generated in proportion to the ATP content is detected by a high-sensitivity detector. As a result, the ATP-luciferase method for confirming the presence of microorganisms has attracted attention as a rapid test method for microorganisms.
  • the conventional medium emits light, so that the components of the medium emit light. Even if you use It could not be applied to low-bacteria counts, such as microbiological tests in stuffed beads.
  • the ATP degrading ability may vary depending on the medium components, and may not be sufficiently degraded. Therefore, it is not always effective for all media components.
  • the present invention solves such conventional drawbacks, and is a medium used in a microbial test using the ATP-luciferase method.
  • the purpose is to provide a culture medium that does not cause measurement disturbances and a microbiological test method using the culture medium that is simple, accurate, and highly reliable. It is assumed that:
  • the present invention effectively eliminates free ATP, which is an obstacle to measurement. And reduce the emission level of the cook ground, allowing microbial testing of several cells in the test sample, e.g. on a membrane filter.
  • the distinction between bright spots and back ground caused by microorganisms was clarified, and the reliability of the inspection was ensured. It is also intended to provide biological testing methods. Disclosure of the invention
  • the present invention firstly provides a microorganism testing medium obtained by treating a medium component containing adenosine triphosphate (ATP) with an acid phosphate. It is provided.
  • a medium component containing adenosine triphosphate (ATP) adenosine triphosphate (ATP)
  • the present invention secondly performs a microbial test by the ATP-luciferase method, and uses the first microbial test of the present invention as a microbial test medium.
  • Another object of the present invention is to provide a microorganism testing method characterized by using a culture medium.
  • FIG. 1 is a graph showing the amounts of luminescence of various yeast excres in Example 1 after enzyme treatment.
  • FIG. 2 shows the amounts of luminescence of the various media in Example 3.
  • the acid phosphate used in the first aspect of the present invention is a phosphine.
  • the conditions for treating a medium component containing ATP with acid phosphatase include: a substrate containing ATP, such as an enzyme extrude;
  • the reaction is preferably performed at a temperature of about 35 to 37 e C for 30 to 45 minutes.
  • the medium component used in the present invention is composed of a commonly used medium component, and contains a large amount of ATP before being treated with acidic phosphatase. It contains high amounts.
  • Examples of such a medium include, for example, a medium composition for aerobic general bacterial tests, in addition to yeast ex- cess containing a large amount of ATP, peptone and glucose. , M g S 0 4 ⁇ 7 H 2 0, L one Li down Gore acid, Ma Le DOO one scan, K 2 ⁇ ⁇ 0 4, Ru include media containing etc. agar.
  • Table 1 shows an example of the composition of such a commonly used medium for aerobic single-bacteria test (referred to as ⁇ medium).
  • Table 1 shows an example of the composition of such a commonly used medium for aerobic single-bacteria test (referred to as ⁇ medium).
  • Table 1 Composition of medium A (g ZL) Bae Bed tons 5 Ma: NetBackup one scan 1 0 Group for a course 5 K 2 HP 04 3
  • examples of medium compositions that have been often used for the detection of anaerobic bacteria such as lactic acid bacteria include, in addition to yeast extract containing a large amount of ATP, peptone, T ween 8 0, Sanna door Li cormorant-time, Group courses, L one Li down Gore-acid, K 2 ⁇ ⁇ 0 *, L one sheet scan te fin HC 1, Ma Le door over vinegar, etc. agar A medium containing.
  • Table 2 shows an example of the composition of a medium (referred to as B medium) that has been conventionally used for the detection of anaerobic bacteria such as lactic acid bacteria.
  • the yeast extract which is a component of the medium A shown in Table 1 above, contains a large amount of ATP, and thus is treated under the above-described processing conditions.
  • ATP is almost completely degraded, and a medium (Ae medium) in which the yeast extract containing no ATP is replaced with the above yeast extract is prepared.
  • Yeast excrete which is a component of the B medium shown in Table 2 above, also contains a large amount of ATP, so it decomposes ATP almost completely under the above processing conditions and does not contain ATP.
  • Be medium a medium in which the yeast extract is replaced with the above yeast extract
  • the second aspect of the present invention relates to a method for testing microorganisms, and in conducting a microorganism test by the ATP-run-ferase method,
  • the present invention is characterized in that the medium for testing microorganisms according to the first aspect of the present invention is used as a medium for testing substances.
  • the ATP is used as a coenzyme to carry out the luciferase luciferase reaction, and the ATP-run ferrase method is performed in proportion to the ATP content.
  • This method is a known method for detecting the presence of microorganisms by detecting a very small amount of generated light with a high-sensitivity detector.
  • the first medium of the present invention when performing a microbial test by such an ATP-luciferase method, is used as a microorganism test medium. Use microbial testing medium.
  • composition of the medium can be changed within a range that can be easily modified by those skilled in the art, and antibiotics such as cycloheximide can be used. It is also possible to add substances such as nitric acid or isophosphoric acid in Hops.
  • the first medium for testing microorganisms of the present invention is treated with acidic phosphatase while using a medium component containing ATP such as yeast ex.
  • a medium component containing ATP such as yeast ex.
  • ATP derived from the yeast extract and the like is almost completely degraded. Therefore, in microbiological tests using the ATP-luciferase method, the luminescence of substances other than microorganisms No risk of measurement failure.
  • the second microorganism test method of the present invention free ATP, which is an obstacle to the measurement, is effectively removed, and a medium having a low background level of luminescence is used.
  • ATP-leuciferase method of microorganisms captured on membrane membrane In the inspection by the method, the distinction between the bright spot and the knock ground caused by microorganisms is clarified, and it is possible to provide a method for examining microorganisms that ensures the reliability of the inspection. It is possible.
  • Example 1 enzyme treatment
  • a 10% solution of a 5% solution of a commercially available yeast extract was prepared and adjusted to pH 4.5 with L-ligonic acid. 3 7 acidic after heating 2 0 minutes hand off O scan off ⁇ motor 4 an peptidase 1 X 1 0 -. 3 U were added, Tsu rows 3 0 minutes reaction at 3 7 ° C. ATP in the reaction solution was measured by Luminometer Yuichi (manufactured by Nihon General) to confirm the completion of the reaction. After the completion of the reaction, a membrane (pore size: 0.22111) was passed through to remove fine particles in the solution, and the yeast extract of Hatcho Fri-cho was added to 100 ⁇ l. m 1 was obtained.
  • the method of adding the medium to the medium is as follows.
  • the whole amount (10 O ml) is preliminarily weighed for 2 L (liters) of medium components (without yeast excretion) (as described above).
  • a medium and B medium) add 1.9 L (litre) of water, adjust the pH to the specified pH, add agar, auto-crap, add Ae medium and Be A medium was obtained.
  • Example 3 The whole amount (10 O ml) is preliminarily weighed for 2 L (liters) of medium components (without yeast excretion) (as described above).
  • a medium and B medium add 1.9 L (litre) of water, adjust the pH to the specified pH, add agar, auto-crap, add Ae medium and Be A medium was obtained.
  • FIG. 2 shows the luminescence of various media. From FIG. 2, it can be seen that the A e medium and the B e medium prepared in Example 2 clearly emit less light than the conventionally used A and B mediums. In addition, according to the Ae medium and the Be medium prepared in Example 2, all the bright spots derived from the medium, which make it difficult to discriminate from the bacteria that often occurred in the conventional medium, were completely eliminated. It did not grow.
  • Example 4 Comparparison of growth rate of aerobic bacteria
  • differences in the degree of bacterial growth were evaluated.
  • the results are shown in Table 3.
  • ⁇ indicates normal growth, and ⁇ indicates good growth.
  • Aerobic bacterium 5 (F1 avobacteri urn) ⁇ ⁇ Aerobic bacterium 6 (Flavobacterium ⁇ ) ⁇ ⁇ Aerobic bacterium 7 (F1 avobacter erium um) ⁇ ® Aerobic bacterium 8 (F1 avobac ter ium ⁇ ) ⁇ ⁇ Aerobic bacterium 9 (genus F1 avobac ter ium) ⁇ ⁇
  • Example 4 In the same manner as in Example 4, the ⁇ medium and the Be medium were each fixed to a plate, and the anaerobic bacteria that appeared at the beer factory and were subcultured were respectively 10 cells. 1 cell Lumpur by or have to anaerobic culture, by comparing the number and large can of raw Ji was co- Russian knee, was to evaluate the differences in the growth of the bacteria. The results are shown in Table 4. However, ⁇ indicates normal growth, and ⁇ indicates good growth. As is clear from Table 4, the B medium and the Be medium showed almost no growth of the anaerobic bacteria. Table 4.
  • the first microbial test medium of the present invention is obtained by treating the medium with acidic phosphatase while using a normal medium component containing ATP such as yeast extract.
  • ATP derived from this yeast extract and the like is almost completely degraded, and the medium does not substantially contain free ATP which may interfere with measurement. Therefore, according to the first microorganism test medium of the present invention, in the microorganism test using the ATP-luciferase method, the luminescence derived from the medium is stably suppressed to an extremely low level. Therefore, there is no danger of causing a measurement failure due to luminescence of substances other than microorganisms.
  • ATP of microorganisms trapped on membrane filter-Inspection by Luciferase method clearly distinguishes bright spots from microorganisms and back ground. As a result, there was no possibility of misidentifying microorganisms and other contaminants, and the reliability of the test could be ensured.
  • the first culture medium for microbial testing of the present invention appears in a beer factory, etc., and has a higher growth rate of subcultured aerobic bacteria / anaerobic bacteria than a conventionally used culture medium. There is almost no difference in
  • the luminescence level of the background during measurement is extremely low, and one microliter of microbial power is contained in one liter of sample. It is now possible to perform very precise and highly reliable microbiological examinations, such as discriminating whether or not cells are present.
  • the luminescence level of the back ground can be suppressed very efficiently as compared with the case where the ablation treatment is performed. And can be.
  • the second microorganism test method of the present invention since the first microorganism test medium of the present invention is used, the method is simple, very precise, and has high reliability. Microbial testing methods and What is it. Industrial applicability
  • the present invention can be effectively used for a microorganism test with a small number of bacteria, for example, a microorganism test in a bead, more specifically, a microbial test in a raw stuffed bean. .

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Description

明 糸田 書
微生物検査用培地 と該培地を用 いた微生物検査方法 技術分野
本発明は、 微生物検査用培地 と該培地を用 いた微生物検 査方法に関 し、 詳 し く は A T P — ル シ フ ェ ラ ーゼ法を使用 した微生物検査において使用 さ れ る培地であ っ て、 微生物 以外の物質の発光に よ る測定障害を引 き 起 こ す こ と のない 培地 と、 該培地を用 いた、 簡単で しか も精密で高度の信頼 度を備えた微生物検査方法 と に関する。
本発明は、 例えば ビー ル中の微生物検査、 よ り 具体的に は ビ ン詰め生 ビー ル中の微生物検査な どの よ う な、 少ない 菌数の微生物検査に有効に利用す る こ とができ る。 背景技術
ア デ ノ シ ン 三 リ ン酸 （ A T P ) は生 き た細胞に特異的に ま と ま っ て存在す る。 こ の A T P を補酵素 と してル ン フ エ リ ン — ル シ フ ヱ ラ ーゼ反応を行わ しめ、 A T P 含量に比例 して発生す る微少な光量を高感度検出器で検出す る こ と に よ っ て、 微生物の存在を確認す る と い う A T P — ル シ フ エ ラ ーゼ法が、 微生物の迅速検査法 と して注目 さ れてい る。
と こ ろで、 こ の A T P — ル シ フ ェ ラ ーゼ法を用 いた微生 物検査において は、 従来の培地では、 培地成分そ の も のが 発光す る ため、 メ ンブラ ン濂過法を用 いて も、 例えば ビ ン 詰め生 ビー ル中の微生物検査の よ う な、 少な い菌数の徹生 物検査に は適用す る こ とができ なか っ た。
そ こ で、 こ の解決法 と して、 ル ン フ ェ ラ 一 ゼ処理の前に メ ン ブ ラ ン を洗浄す る こ とで遊離 A T P を取 り 除 く 方法が 提案 さ れてい る （特開平 2 — 1 6 3 0 9 8 号公報） 。
しか しなが ら、 こ の方法は作業に手間がかかる こ とか ら サ ン プルの大量処理には問題があ っ た。
ま た、 遊離 A T P を取 り 除 く 他の一つの方法 と して、 ァ ビラ ー ゼ （ A T P 分解酵素） に よ る培地成分の処理方法が 知 られてい る （ Neth. Mi lk Dai ry J. 43, 347. 1989 ：)。
しか しなが ら、 ア ビラ 一ゼの場合、 培地成分に よ っ て A T P 分解能力 にバ ラ ツ キがあ り 、 充分に分解でき ない場合 があ る。 従 っ て、 全ての培地成分に対 して有効であ る と は 限 らな い。
そ れ故、 遊離 A T P に起因す る 発光を充分に抑え、 バ ッ ク グラ ウ ン ドの発光 レ ベルが低 く 、 かつ、 菌 と誤認す る よ う な発光が起 こ ら ない培地が要望さ れていた。
本発明 は、 こ の よ う な従来の欠点を解消 し、 A T P — ル シ フ ェ ラ ーゼ法を使用 した微生物検査において使用 さ れ る 培地であ っ て、 微生物以外の物質の発光に よ る測定障害を 引 き 起 こ す こ と のな い培地 と、 該培地を用 いた、 簡単で し か も精密で高度の信頼度を備えた微生物検査方法 と を提供 す る こ と を 目 的 とす る も のであ る。
即 ち、 本発明は、 測定の障害 と な る遊離 A T P を効果的 に除去 し、 く ッ ク グラ ウ ン ドの発光 レ ベルを低 く して、 供 試サ ン プル中数セ ルの微生物検査を可能に し、 例えば メ ン ブラ ン フ ィ ル タ 一上に捕捉 した微生物の A T P — ル シ フ エ ラ ーゼ法に よ る検査では、 微生物に よ る 輝点 とバ ッ ク グラ ゥ ン ド と の区別を明確に し、 検査の信頼性を確保 した微生 物検査方法を提供す る こ と を も 目 的 とす る も のであ る。 発明の開示
即 ち、 本発明 は第一に、 ア デノ シ ン三 リ ン酸 （ A T P ) を含有 してい る培地成分を酸性フ ォ ス フ ァ 夕 一ゼで処理 し てな る 微生物検査用培地を提供す る も のであ る。
さ ら に、 本発明は第二に、 A T P — ル シ フ ヱ ラ ー ゼ法に よ り 微生物検査を行 う にあた り 、 微生物検査用培地 と して 前記本発明の第一の微生物検査用培地を用 いる こ と を特徴 とす る 微生物検査方法を提供する も のであ る。 図面の簡単な説明
図 1 は、 実施例 1 にお け る 各種酵母エキ ス の酵素処理後 の発光量を示す グラ フ であ る。
図 2 は、 実施例 3 にお け る 各種培地の発光量を示す も の であ る。 発明を実施する ための最良の形態
本発明の第一で用 い る酸性フ ォ ス フ ァ タ 一ゼは、 ホ ス ホ モ ノ エス テ ラ ー ゼの一つであ り 、 A M P , G M P , T M P A D P， G D P 等のモ ノ ヌ ク レ オチ ド、 ジ ヌ ク レ オチ ドや その他の リ ン酸エステルを加水分解す る酵素 と して知 られ てい る。
本発明の第一において、 A T P を含有 してい る培地成分 を酸性フ ォ ス フ ァ タ ーゼで処理する際の条件 と しては、 酵 母エキ ス等、 A T P を含有する基質を A T P 含量に よ り 、 0 . 5 %カヽ ら 8 . 0 %、 通常は 5 . 0 %程度の溶液 と し、 該溶液 1 0 0 m l に対 して、 酸性フ ォ ス フ ァ タ ーゼを、 1 . 2 X 1 0 — 3 U〜 8 . 2 x l O -3 U、 好ま し く は 4 . 1 X 1 0 -3 U程度加え、 2 5 〜 4 5 て程度の温度で、 5 分間 〜 1 時間、 好 ま し く は 3 5 〜 3 7 eC程度の温度で、 3 0 〜 4 5 分間反応さ せればよ い。
本発明で用 い られ る培地成分は、 通常使用 さ れている培 地成分か らな る も のであ っ て、 酸性フ ォ ス フ ァ タ一ゼで処 理す る前に は A T P を多 く 含有 してい る も のであ る。
こ の よ う な培地 と して、 例えば、 好気性一般細菌検査用 培地組成の一例を挙げれば、 A T P を多量に含有 してい る 酵母エ キ ス の他に、 ペプ ト ン、 グル コ ー ス、 M g S 0 4 · 7 H 2 0、 L 一 リ ン ゴ酸、 マ ル ト 一 ス、 K 2 Η Ρ 0 4 、 寒 天な どを含む培地が挙げ られ る。
こ の よ う な通常 よ く 使われ る 好気性一股細菌検査用培地 ( Α培地 とする。 ） の組成の一例を示す と、 表 1 の通 り で あ る。 表 1 . A培地の組成 （ g Z L ) ぺ ブ ト ン 5 マ ル ト 一 ス 1 0 グル コ一ス 5 K 2 H P 04 3
M g S 0 4 · 7 H 2 0 1 酵母エキス 4 ぃ リ ン ゴ酸 2 寒天 1 0
p H 5 . 6
ま た、 乳酸菌等の嫌気性細菌の検出 に、 従来か ら よ く 用 い られて き た培地組成の一例を挙げる と、 A T P を多量に 含有 してい る酵母エキスの他に、 ペプ ト ン、 T w e e n 8 0 、 酸ナ ト リ ウ ム、 グル コ ー ス、 L 一 リ ン ゴ酸、 K 2 Η Ρ 0 * 、 L 一 シ ス テ ィ ン H C 1 、 マ ル ト ー ス 、 寒天な どを含む培地が挙 げ られ る。
こ の よ う な乳酸菌等の嫌気性細菌検出 に従来か ら よ く 用 い られて き た培地 （ B培地 とす る。 ） の組成の一例を示す と、 表 2 の通 り であ る。
表 2 . B 培地の組成 （ g Z L ) ぺブ ト ン 5 K 2 H P 0 * 2
T e e n 8 0 0 . 5 L 一 シ ス テ ィ ン 0 . 2 酢酸ナ ト リ ウ ム H 2 0 6 マ ノレ ト ー ス 1 5 グル コ ー ス酸 1 5 酵母エキス 4
L ー リ ン ゴ酸 2 寒天 1 0
p H 5 . 6
以上の如 き A T P を含有 してい る培地成分を酸性 フ ォ ス フ ァ タ一ゼで処理する こ と に よ り 、 A T P をほぼ完全に分 解さ せ、 目 的 とする微生物検査用培地を得る こ と がで き る すなわち、 上記表 1 に示す A培地の成分であ る酵母ェキ ス は、 多量の A T P を含有す る ため、 上記の処理条件にて
A T P をほ ぼ完全に分解 し、 A T P を含 ま な い酵母エキ ス を上記酵母エキス と置換 した培地 （ A e 培地 とする。 ） を 調製す る。 ま た、 上記表 2 に示す B 培地の成分であ る酵母 エキ ス は、 同様に多量の A T P を含有する ため、 上記の処 理条件にて A T P をほぼ完全に分解 し、 A T P を含 ま な い 酵母ェキスを上記酵母エキス と 置換 した培地 （ B e 培地 と する。 ） を調製す る
次に、 本発明の第二は微生物検査方法に関 し、 A T P — ル ン フ エ ラ ー ゼ法に よ り 微生物検査を行 う にあた り 、 徹生 物検査用培地 と して前記本発明の第一の微生物検査用培地 を用 い る こ と を特徴 とす る も のであ る。
前記 した よ う に、 A T P — ル ン フ ェ ラ ーゼ法は、 A T P を補酵素 と してル シ フ ヱ リ ン ー ル シ フ ヱ ラ ーゼ反応を行わ しめ、 A T P 含量に比例 して発生する微少な光量を高感度 検出器で検出す る こ と に よ っ て、 微生物の存在を確認す る 方法であ り っ て、 公知の方法であ る。
本発明の第二では、 こ の よ う な A T P — ル シ フ ヱ ラ ー ゼ 法に よ り 微生物検査を行 う にあた り 、 微生物検査用培地 と して、 前記本発明の第一の微生物検査用培地を用 いる。
な お、 培地成分 と しては、 当業者が容易 に改変 し う る範 囲内で、 組成を変更す る こ と は可能であ り 、 ま た、 シ ク ロ へキ シ ミ ドな どの抗生物質、 ホ ッ プの ひ 一 酸やイ ソ ひ 一 酸 な どを添加す る こ と も可能であ る。
前記 した よ う に、 従来の培地では、 培地成分その も のが 発光す る ため、 メ ン ブラ ン據過法を用 いて も 、 例え ば ビ ン 詰め生 ビー ル中の微生物検査の よ う な、 少ない菌数の微生 物検査に は適用す る こ と ができ なか っ た。
しか しなが ら、 前記本発明の第一の微生物検査用培地は 酵母エキ スな ど A T P を含有 している培地成分を用 いなが ら も、 酸性フ ォ ス フ ァ タ ー ゼで処理する こ と に よ り 、 こ の 酵母エキスな どに由来する A T P をほぼ完全に分解 さ せ た も のであ る。 従 っ て、 A T P — ル シ フ ェ ラ ーゼ法を使用 した微生物検査において、 微生物以外の物質の発光に よ る 測定障害を引 き 起 こ すおそれがない。
それ故、 本発明の第二の微生物検査方法に よ れば、 測定 の障害 と な る遊離 A T P が効果的に除去さ れ、 バ ッ ク グ ラ ゥ ン ドの発光 レ ベルの低い培地を用 いてい る ため、 供試サ ン プル中数セ ルの微生物検査が可能にな り 、 例えば メ ン ブ ラ ン フ イ ノレ タ ー上に捕捉 した微生物の A T P — ル シ フ ェ ラ ー ゼ法に よ る検査では、 微生物に よ る 輝点 とノく ッ ク グ ラ ウ ン ド と の区別が明確にな り 、 検査の信頼性を確保 した微生 物検査方法を提供す る こ と が可能であ る。
以下、 実施例に よ り 本発明を さ ら に詳細に説明する が、 本発明は こ れ ら の実施例に よ っ て何 ら限定さ れる も のでは ない。 実施例 1 (酵素処理）
5 %濃度の各種酵母エキス 1 0 O m l ( A , B , C , D E ， F の 6 種類） を、 K 2 Η Ρ 0 * で ρ Η 6 . 5 に調整 し た も の と、 L 一 リ ン ゴ酸で ρ Η 4 . 5 に調整 した も の と を 用意 し、 前者にア ビラ ー ゼ 2 U を添加 し、 後者に酸性 フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ 4 . 1 X 1 0 —3U を添加 し、 それぞれ 3 7 eC で 3 0 分間反応さ せた。
反応終了後に、 マ イ ク ロ ノく ィ ア ルノくィ ォマ ステス ト キ ッ ト （ルーマ ッ ク 社製） と ル ミ ノ メ ー タ ー （ 日 本ゼネ ラ ル社 製） で発光量を刺定 した。 その結果を図 1 に示す。 なお、 併せて無処理の も のを示 した。 R L U は、 相対的な発光量 ( Relative Light Unit) を示 してい る。 図 1 か ら は、 酸 性 フ ォ ス フ ァ タ ー ゼに よ る 処理が極めて効果的であ る こ と が分かる。 実施例 2 (培地の調製）
市販酵母エ キ ス の 5 %溶液を 1 0 O m l 作製 し、 L ー リ ン ゴ酸で p H 4 . 5 に調整 した。 3 7 てで 2 0 分間加熱後 酸性 フ ォ ス フ ァ タ 一 ゼを 4 . 1 X 1 0 -3U添加 し、 3 7 °C で 3 0 分間反応を行 っ た。 反応液中の A T P をル ミ ノ メ ー 夕 一 （ 日 本ゼネ ラ ル社製） で測定 し、 反応の終了 を確認 し た。 反応終了後、 溶液中の微粒子を取 り 除 く ために メ ン ブ ラ ン （ ボ ア サ イ ズ 0 . 2 2 111 ) 滤過を行ぃ、 八 丁 フ リ 一 の酵母エキスを 1 0 0 m 1 得た。
培地への添加方法は、 全量 （ 1 0 O m l ) を、 予め計量 しておいた 2 L ( リ ツ ト ル） 分の培地成分 （酵母エキ ス を 含 ま な い も の ） （前記 した如 き A培地及び B培地） に添加 し、 水 1 . 9 L ( リ ッ ト ノレ ） を加え、 所定の p Hに調整後 寒天を加えオ ー ト ク レ ー プ し、 A e 培地及び B e 培地を得 た。 実施例 3
プ レ ー ト に固定 した各種培地 （従来使用 していた A培地 B培地、 及び実施例 2 で作製 した A e 培地 と B e 培地） 上 に 、 メ ン ブ ラ ン it紙を載せ、 培地成分を しみ込 ま せ、 A T p — ル シ フ ヱ ラ ーゼ法に よ り フ ィ ノレ タ ーか ら発生する一定 面積当 た り の発光量を測定 した。 図 2 に、 各種培地の発光 量を示す。 図 2 か ら は、 実施例 2 で作製 した A e 培地 と、 B e 培地は、 従来使用 していた A培地、 B 培地に比べて明 らかに発光量が少な い こ と が分かる。 ま た、 実施例 2 で作 製 した A e 培地 と B e 培地に よれば、 従来の培地で しば し ば生 じて いた菌 と の判別を困難にす る培地由来の輝点が全 く 生 じな く な っ た。 実施例 4 (好気性菌の増殖度の比較）
前記 A培地 と A e 培地 と をそれぞれブ レ ー ト に固定 し、 そ れぞれに ビー ル工場で出現 し、 継代さ れてい る 好気性菌 を 1 0 1 セ ルずつ ま いて好気培養 し、 生 じた コ ロ ニー の数 と大 き さ を比較 して、 菌の増殖度の違いを評価 した。 その 結果を表 3 に示す。 但 し、 〇は生育並、 ◎は生育良好な こ と を示す。 表 3 か ら明 らかな よ う に、 A培地 と A e 培地 と には、 好気性菌の増殖度にはほ と ん ど差がな い こ とが分か つ た。
表 3 . 好気性菌の増 ¾度の比較 菌株 A培地 A e 培地 ビー ル酵母 〇 〇 好気性菌 1 (Baci l lus 属） ◎ ◎ 好気性菌 2 (Baci 1 lus 厲） ◎ ◎ 好気性菌 3 (Bac i 11 us 厲） ◎ ◎ 好気性菌 4 (Baci l lus , )
好気性菌 5 (F 1 avobac t er i urn 属） ◎ ◎ 好気性菌 6 (Flavobacterium 厲） 〇 〇 好気性菌 7 (F 1 a vobac t er i um 厲） ◎ ® 好気性菌 8 (F 1 avobac t er i um 厲） 〇 〇 好気性菌 9 (F 1 avobac t er i um 属） ◎ ◎
実施例 5 (嫌気性菌の増殖度の比較）
実施例 4 と 同様に して、 前記 Β 培地 と B e 培地 と をそれ ぞれ プ レ ー ト に固定 し、 それぞれに ビー ル工場で出現 し、 継代 さ れてい る嫌気性菌を 1 0 1 セ ルずつ ま いて嫌気培養 し、 生 じた コ ロ ニー の数 と大 き さ を比較 して、 菌の増殖度 の違いを評価 した。 その結果を表 4 に示す。 但 し、 〇は生 育並、 ◎は生育良好な こ と を示す。 表 4 か ら明 らかな よ う に、 B 培地 と B e 培地 と に は、 嫌気性菌の増殖度にはほ と ん ど差がな い こ とが分か っ た 表 4 . 嫌気性菌の増殖度の比較 菌株 B 培地 B e 培地 ビー ル酵母 〇 〇 嫌気性菌 1 (Lactobaci 1 1 us厲） 〇 ◎ 嫌気性菌 2 (lactobaci 1 1 us属） ◎ ◎ 嫌気性菌 3 (Lactobaci 1 1 us厲） 〇 〇 嫌気性菌 4 (し ac t obac i 1 1 us厲） ◎ ◎ 嫌気性菌 5 (Lac t oba c i 1 1 us属） 〇 〇 嫌気性菌 6 (Lac t obac i 1 1 us属） 〇 〇 嫌気性菌 7 (し ac t obac i 1 1 us属） ◎ ◎ 嫌気性菌 8 (し ac t obac i 1 1 u s ) ◎ ◎ 嫌気性菌 9 (し ac t obac i 1 1 u s厲 ) ◎ ◎
本発明の第一の微生物検査用培地は、 酵母エキスな ど A T P を含有 してい る通常の培地成分を用 いなが ら も、 酸性 フ ォ ス フ ァ タ ーゼで処理す る こ と に よ り 、 こ の酵母エキス な どに由来す る A T P を、 ほぼ完全に分解さ せた も のであ り 、 培地中 に測定の障害 と な る遊離 A T P をほ とん ど含 ま ない。 従 っ て、 本発明の第一の微生物検査用培地に よれば、 A T P — ル シ フ ェ ラ 一 ゼ法を使用 した微生物検査において、 培地由来の発光が安定 して極めて低 レ ベルに抑え られてお り 、 微生物以外の物質の発光に よ る測定障害を引 き起 こ す おそれがない。 メ ン ブラ ン フ ィ ル タ ー上に捕捉 した微生物 の A T P — ル シ フ ヱ ラ 一ゼ法に よ る検査では、 微生物に よ る 輝点 とバ ッ ク グラ ウ ン ド と の区別が明確にな り 、 微生物 と それ以外の夾雑物 と を誤認す る おそれがな く 、 検査の信 頼性を確保す る こ と が可能 と な っ た。
なお、 本発明の第一の微生物検査用培地は、 従来使用 さ れてい る培地 と比べて、 ビー ル工場な どで出現 し、 継代 さ れてい る 好気性菌ゃ嫌気性菌の増殖度において、 ほ と ん ど 差がな い。
本発明の第一の微生物検査用培地に よれば、 測定時のバ ッ ク グラ ウ ン ドの発光 レ ベルが極めて低 く 抑え られてお り 試料 1 リ ッ ト ル中 に微生物力 1 セ ルか 0 セ ル存在す る かを 判別す る よ う な、 非常に精密で高度の信頼度を有す る微生 物検査が可能にな つ た。
本発明の第一の微生物検査用培地に よ れば、 ア ビラ ー ゼ 処理を行 っ た場合 よ り も 、 非常に効率良 く バ ッ ク グ ラ ウ ン ドの発光 レ ベルを抑え る こ と ができ る。
ま た、 本発明の第二の微生物検査方法に よ れば、 本発明 の第一の微生物検査用培地を用 いた も のであ る ため、 簡単 で、 しか も 精密で高度の信頼度を備えた微生物検査方法 と な っ て い る 。 産業上の利用可能性
本発明は、 例えば ビー ル中の微生物検査、 よ り 具体的に は ビ ン詰め生 ビー ル中の微生物検査な どの よ う な、 少ない 菌数の微生物検査に有効に利用する こ とができ る。

Claims

請 求 の 範 囲
(1) ア デ ノ シ ン三 リ ン酸 （ A T P ) を含有 してい る培地成 分を酸性フ ォ ス フ ァ ク ー ゼで処理 してな る微生物検査用培 地。
(2) A T P を含有す る 基質を A T P 含量に よ り 、 0 . 5 % か ら 8 . 0 %の溶液 と し、 該溶液 1 0 0 m l に対 し、 酸性 フ ォ ス フ ァ タ ー ゼを、 1 . 2 X 1 0 -3U〜 8 . 2 x 1 0 - 3 U加え、 2 5 〜 4 5 で程度の温度で、 5 分間〜 1 時間反応 さ せ る こ と に よ り 得 られ る ク レ ー ム 1 記載の培地。
(3) A T P — ル シ フ ヱ ラ ー ゼ法に よ り 微生物検査を行 う に あた り 、 微生物検査用培地 と して ク レ ー ム 1 記載の微生物 検査用培地を用 い る こ と を特徴 とす る 微生物検査方法。
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