JP4127846B2 - 微生物検出法及び微生物検出キット - Google Patents

Description

本発明は、食品や臨床試料中に含まれる微生物の検出法、同方法に用いる試料の作製法、及び微生物検出キットに関する。さらに詳しくは、食品や臨床試料中に含まれる微生物の生菌、損傷菌及び死菌の判別も可能な検出法及び微生物検出キットに関する。

食品や臨床試料、又は環境中の一般生菌数の測定には、従来、平板培養法が用いられてきた。しかし、平板培養法は結果が得られるまでに２日間程度の時間を要する。さらに、一般に使用されている培地での培養による細菌検査では、環境中や人為的なストレスにより損傷した菌体（特に狭義では、前者をＶＮＣ（Viable-but-Non Culturable）菌、後者を損傷菌（Injured cell）として表現することがある。）等の検出が困難であり、迅速かつ確実性のある生菌数測定法の開発が切望されていた。

フローサイトメトリー（Flow cytometry：ＦＣＭ）は、検体をフローセル中に一定の流速で流して、レーザー光束中を通過させ、細胞、あるいはその他の微粒子から発した散乱光および蛍光を測定する手法であり、シングルセルレベルでの微生物の検出が可能なため、近年、分子生物学、細胞生物学の分野だけでなく、環境中、乳製品や飲料、臨床検体等からの微生物の検出に利用されている（例えば、特許文献１又は２、非特許文献１〜５）。

しかし、これらの方法で使用されているＦＣＭ装置（フローサイトメーター）は非常に高価で大型な上、操作にも熟練を要する。また、多種多様な細菌が非損傷菌、損傷菌、及び死菌として混在している食品分野における実際の応用には、経済性、安全性、簡易性や、微生物の生菌・死菌の判別に関する確実性及び現実性の面では、未だ改良・改善すべき問題が残されていた。

例えば、特許文献１では、イオンキレート化剤、蛋白質分解酵素、界面活性剤、及び細菌学的に特異的な蛍光色素を用いて液体サンプルから全ての細菌を検出する方法について開示されている。ＥＤＴＡに代表されるイオンキレート化剤は通常、１〜５ｍＭの濃度で使用する必要があり、それを超えると細胞壁に損傷のない生きた細菌の細胞壁及び細胞膜をも崩壊させてしまう可能性があるが、当該特許文献１の方法では、好ましいイオンキレート化剤濃度がおよそ６〜１７ｍＭであって、死菌及び生菌も溶菌させてしまうという問題が生じていた。また、検出限界についても１０⁴ｃｆｕ／ｍｌ前後であり、液体サンプル中で生きた細菌のみ存在する状態で、生菌数が少ない場合（１０³ｃｆｕ／ｍｌ以下）では、上記検出限界まで増菌させる必要があるため、必ずしも迅速な方法ではなかった。

特許文献２では、体液試料をプロテアーゼ、リパーゼ、及びヌクレアーゼで処理し、ホウ酸ナトリウム・ＥＤＴＡ・ホルムアルデヒド・非イオン性界面活性剤（Triton X-100等）からなる緩衝溶液中で、臭化エチジウム染色により、白血球、血小板、赤血球を溶解させ、細菌のみを臭化エチジウムにより染色し、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー法などにより検出、定量する方法が開示されているが、体液試料をプロテアーゼ、リパーゼ及びヌクレアーゼ処理したとしても、溶解しなかった白血球や血小板が存在し、それらに生きた細菌が吸着し複合体を形成するという点、及び、生菌と死菌共に染色されて、体液中の細菌に関して生死の識別が困難となる点が示唆されている。さらに、特許文献２には、当該方法は、１０個／ｍｌ（試料）程度の低い濃度で、約２時間以下の時間、しばしば４５分以内で細菌を検出する方法であると記載されているが、実際には、体液中に最低でも１０⁴ｃｆｕ／ｍｌ以上の細菌が存在しなければ検出できない例が開示されており、牛乳中等に関する微量の微生物の検出には適していなかった。

非特許文献１では、ＳＹＴＯ６３は、生菌及び死菌の細胞壁、並びに細胞膜を透過し、またＴＯ−ＰＲＯ３は、死菌の細胞壁及び細胞膜のみ透過する特徴を利用して、生菌と死菌の識別をフローサイトメトリーにより試みられた技術が開示されている。そして、滅菌水に生菌と死菌を懸濁させ、その環境下において生死の識別を試みた例が開示されている。しかしながら、死菌は１５分煮沸させたものであり、実際の食品における死菌より高度に細胞壁や細胞膜を損傷させており、惣菜など一部の限られた食品の死菌にのみ相当する技術であって、牛乳等や最近の食品において実施される、食品由来のタンパク質を変性させずに細菌のみ死滅させる超高温瞬間殺菌についての条件については検討されていない。

非特許文献２では、ＵＨＴ（超高温瞬間加熱殺菌）牛乳にプロテアーゼＫを作用させ、カゼインミセルを消化し、冷却遠心処理により脂肪を除去することにより、牛乳中から細菌を検出し、総菌数（生菌・死菌を含めたもの）を測定する方法、及び生乳において、上記プロテアーゼＫの他に、非イオン性界面活性剤である０．１％ Triton X-100を添加し、生乳中から細菌を検出し、総菌数（生菌・死菌数）を測定する方法が開示されている。しかしながら、非特許文献２の方法では、ＵＨＴ牛乳にプロテアーゼＫを作用させても、カゼインミセルは完全には消化されず、細菌と同程度の大きさを有する不完全消化物が多数存在してしまい、これにＳＹＴＯ ＢＣやＳＹＴＯ９等の蛍光核染色剤を作用させると強い非特異吸着が生じるため、生菌との識別が困難であった。また、夾雑牛乳成分の一つとされるウシ白血球、乳腺上皮細胞等の体細胞の細胞膜は損傷が軽度であり、そのままＳＹＴＯ ＢＣやＳＹＴＯ９及びヨウ化プロピジウム染色した場合、ヨウ化プロピジウムは透過せず、その結果、核内ＤＮＡにより緑の蛍光を発し、前記体細胞と生菌との識別が困難であるという問題点を有していた。

非特許文献３では、ヨーグルト及びヨーグルトスターターからの乳酸菌の生菌数測定法に関し、前記特許文献１の方法からプロテアーゼ処理を除いた方法が開示されており、非イオン性界面活性剤及びキレート剤の併用法として記載されている。そして、発明の特徴としては、夾雑成分の体細胞を破壊し、且つ、脂肪球の分離を効果的に行える方法であると記載されている。しかしながら、前記処理による試料には乳由来の夾雑成分が多数存在し、その夾雑成分のため生きた乳酸菌の検出限界が悪く、ヨーグルトやヨーグルトスターターにおいて１０⁵ｃｆｕ／ｍｌ程度であって、非イオン性界面活性剤とキレート剤の濃度を調整し、体細胞のみを破壊し、生きた細菌の細胞壁及び細胞膜は損傷させないという、極めて微妙な条件設定が必要であって、簡便で高感度かつ生菌・死菌判別の検出法には相応しいものではなかった。

エチジウムモノアザイド（Ethidium monoazide：ＥＭＡ。8-azido-3-amino-6-phenyl-5-ethylphenanthradinium chloride）は、一般的には抗癌剤としての効果が知られているが、哺乳類由来の細胞内に存在するトポイソメラーゼII（II型トポイソメラーゼ）に対する阻害剤である（例えば、非特許文献５）。ＥＭＡは、核内ＤＮＡに無秩序にインターカレートした後、可視光照射により、インターカレートしたＥＭＡのみがナイトレンに変換され核内ＤＮＡに共有結合する。例えば、癌細胞はトポイソメラーゼによりＤＮＡ鎖のねじれの度合いを調節したり、ＤＮＡ鎖の複製や遺伝子発現（ＤＮＡの転写）を行うために、ＤＮＡ鎖の巻き戻しを行うが、その際、巻き戻しは核内ＤＮＡの該当箇所を切断し、再結合させることによって実現する。ここで、ＥＭＡの働きとしては、その再結合の際、ＥＭＡ由来のナイトレンによる共有結合の作用によって、前記トポイソメラーゼIIによるＤＮＡ再結合を阻害し、その結果、核内ＤＮＡの断片化が促進される。なお、ＤＮＡ鎖にインターカレートせずに、フリーな状態で存在するＥＭＡは、可視光によりヒドロキシルアミンに変換されるが、これはトポイソメラーゼIIの活性を阻害しない。

また、このようなトポイソメラーゼIIの活性を阻害する物質として、前記エチジウムモノアザイド以外には、アムサクリン（Amsacrine）、ドキソルビシン（Doxorubicin）、エリプチシン（Ellipticine）、エトポシド（Etoposide）、ミトキサントロン（Mitoxantrone）、サイントピン（Saintopin）等が知られており、さらに、トポイソメラーゼIIと同様の活性を有するトポイソメラーゼIの活性を阻害する物質としてカンプトセシン（Camptothecin）、トポテカン（Topotecan）等が知られている（例えば、非特許文献６）。また、細菌の分野においては上記酵素と同様の活性を有する細菌のＤＮＡジャイレースの活性を阻害するものとしては、シプロフロキサシン（Ciprofloxacin）、オフロキサシン（Ofloxacin）、エノキサシン（Enoxacin）、ペフロキサシン（Pefloxacin）、フレロキサシン（Fleroxacin）、ノルフロキサシン（Norfloxacin）、ナリジクス酸（Nalidixic acid）、オキソリン酸（Oxolinic acid）、ピロミド酸（Piromidic acid）等が知られている（例えば、非特許文献７）。

しかしながら、これらトポイソメラーゼI阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、及び細菌のＤＮＡジャイレース阻害剤が、微生物の生菌・死菌の判別を行う検査法において、迅速かつ高感度で検出することを目的として、微生物を含有する食品や臨床試料等のサンプルの前処理に使用することは、従来より一切報告されていなかった。

生菌を検出するための他の方法として、呼吸活性やエステラーゼ活性を簡易且つ迅速に検出する自動システムが提案されている（特許文献３）。しかし、この方法では、検出を対象の細菌が呼吸活性やエステラーゼ活性を精確に測定できる場合に限られる。

また、生菌以外の微生物の状態には、損傷菌、ＶＮＣ（Viable-but-Non Culturable）菌及び死菌があるが、これらを、エステラーゼがあれば緑の蛍光を発するcFDA（カルボキシフルオレッセイン ジアセテート）とヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いたフローサイトメトリーにより検出する方法が開示されている（非特許文献８）。しかし、この方法も、細胞壁の損傷が比較的進行した損傷菌の場合のみ、生菌、損傷菌及び死菌を明確に識別できるものである。したがって、低温殺菌（ＬＴＬＴ）による損傷度が低い損傷菌の場合、高温短時間殺菌（ＨＴＳＴ）による損傷度が低い損傷菌の場合、または環境中のストレスによる損傷度が低い損傷菌の場合においては、この方法では生菌と損傷菌は識別できない。
特表平９−５１０１０５号公報 特公平６−５５１５７号公報 特開２００２−２８１９９８号公報 防菌防黴、第３１巻、第７号、２００３年、第３５７〜３６３頁 アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology）、第６６巻、第３号、２０００年、第１２２８〜１２３２頁 アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology）、第６８巻、第６号、２００２年、第２９３４〜２９４２頁 アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology）、第６０巻、第１２号、１９９４年、第４２５５〜４２６２頁 バイオケミストリー（Biochemistry）、第３６巻、第５０号、１９９７年、第１５８８４〜１５８９１頁 ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）、第２７０巻、第３７号、１９９５年、第２１４２９〜２１４３２頁 ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メデイスン（The New England Journal of Medicine）、第３２４巻、第６号、１９９１年、第３８４〜３９４頁 アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology）第６８巻、２００２年、第５２０９〜５２１６頁

本発明の目的は、食品工場や臨床の現場において、自主検査に応用可能な、経済性に優れたフローサイトメトリーによる簡易かつ迅速な食品及び臨床試料の生菌の検出が可能な微生物検出法、及び同方法に用いる試料の作製法を提供することである。また、本発明の他の目的は、前記生菌、損傷菌、及び死菌の判別が可能なキットを提供することである。

本発明者らは、前記背景、及び食品や臨床試料中に含まれる微生物について、簡便かつ微生物の生菌の検出、特に生菌、損傷菌、及び死菌の判別に関する確実性及び現実性の面を兼ね備えた検査方法について鋭意検討していたところ、食品や臨床試料中に含まれる死菌を含めた各種夾雑成分を特定し、それらを試料の前処理工程で効果的に除去するために、リパーゼ、プロテアーゼ、及びＤＮＡインターカレート剤であるエチジウムモノアザイド等で、微生物を含む食品や臨床試料を前処理し、試料を蛍光染色して、フローサイトメーターにて測定することにより、試料中に含まれる微生物が微量であっても高感度に生菌および死菌を判別して検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、被検試料中の微生物の生菌をフローサイトメトリーにより検出するための測定用試料を作製する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。
ａ）被検試料を、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、又は脂肪を分解する活性を有する酵素で処理する工程、及び
ｂ）前記被検試料を、トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理する工程。

また本発明は、被検試料中の微生物の生菌をフローサイトメトリーにより検出する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。
ａ）被検試料を、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、又は脂肪を分解する活性を有する酵素で処理する工程、
ｂ）前記被検試料をトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理する工程、
ｃ）前記ａ）及びｂ）の工程で処理された被検試料を核染色剤で処理する工程、及び
ｄ）前記核染色剤で処理した被検試料中の微生物をフローサイトメトリーにより検出する工程。

前記本発明の、被検試料中の微生物の生菌をフローサイトメトリーにより検出するための測定用試料を作製する方法、及び被検試料中の微生物の生菌をフローサイトメトリーにより検出する方法は、前記ａ）の工程の後にｂ）の工程を行うことを好ましい態様としている。

また、前記方法は、前記被検試料が、乳、乳製品、乳若しくは乳製品を原料とする食品、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料又は胸水試料のいずれかであることを好ましい態様としている。

また、前記方法は、前記微生物が細菌であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記酵素が脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素から選ばれることを好ましい態様としている。

また、前記方法は、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、アムサクリン（Amsacrine）、カンプトセシン（Camptothecin）、ドキソルビシン（Doxorubicin）、エリプチシン（Ellipticine）、エトポシド（Etoposide）、ミトキサントロン（Mitoxantrone）、サイントピン（Saintopin）、トポテカン（Topotecan）、及びＣＰ−１１５，９５３から選択されることを好ましい態様としている。

また、前記方法は、前記ＤＮＡジャイレース阻害剤が、シプロフロキサシン（Ciprofloxacin）、オフロキサシン（Ofloxacin）、エノキサシン（Enoxacin）、ペフロキサシン（Pefloxacin）、フレロキサシン（Fleroxacin）、ノルフロキサシン（Norfloxacin）、ナリジクス酸（Nalidixic acid）、オキソリン酸（Oxolinic acid）、及びピロミド酸（Piromidic acid）から選択されることを好ましい態様としている。

また前記方法は、前記トポイソメラーゼ阻害剤がエチジウムモノアザイドであり、エチジウムモノアザイドを添加した被検試料に可視光を照射する工程を含むことを好ましい態様としている。

また、前記方法は、さらに、ｃ）前記ａ）及びｂ）の工程で処理された被検試料を核染色剤で処理する工程、を含むことを好ましい態様としている。

また、前記方法は、前記核染色剤が、生菌と死菌の細胞壁を透過し得る第１の染色剤と、第１の染色剤に比べて、生菌よりも死菌の細胞壁をより透過しやすい第２の染色剤とを含むことを好ましい態様としている。

また前記方法は、前記核染色剤が、ヨウ化プロピジウム及びＳＹＴＯ９であることを好ましい態様としている。

本発明はまた、被検試料中の微生物の生菌をフローサイトメトリーにより検出するための測定用試料を作製するためのキットであって、下記の要素を含むキットを提供する：
脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素から選ばれる酵素、
トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤、並びに
核染色剤。

前記キットは、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、アムサクリン（Amsacrine）、カンプトセシン（Camptothecin）、ドキソルビシン（Doxorubicin）、エリプチシン（Ellipticine）、エトポシド（Etoposide）、ミトキサントロン（Mitoxantrone）、サイントピン（Saintopin）、トポテカン（Topotecan）、及びＣＰ−１１５，９５３から選択されることを好ましい態様としている。

また、前記キットは、前記ＤＮＡジャイレース阻害剤が、シプロフロキサシン（Ciprofloxacin）、オフロキサシン（Ofloxacin）、エノキサシン（Enoxacin）、ペフロキサシン（Pefloxacin）、フレロキサシン（Fleroxacin）、ノルフロキサシン（Norfloxacin）、ナリジクス酸（Nalidixic acid）、オキソリン酸（Oxolinic acid）、及びピロミド酸（Piromidic acid）から選択されることを好ましい態様としている。

また、前記キットは、前記トポイソメラーゼ阻害剤がエチジウムモノアザイドであることを好ましい態様としている。

本発明により、フローサイトメトリーによる簡易かつ迅速な食品及び臨床試料の生菌、損傷菌、及び死菌の判別が可能となる。本発明の方法及びキットは、自主検査に応用可能であり、経済性にも優れている。

ＬＰ処理群−大腸菌懸濁液（生菌、損傷菌）及びＬＰ処理群−表皮ブドウ球菌懸濁液（生菌、損傷菌）、並びに未処理群−大腸菌懸濁液（生菌、損傷菌）及び未処理群−表皮ブドウ球菌懸濁液（生菌、損傷菌）のそれぞれについてのＳＹＴＯ９／ＰＩ染色後のＦＣＭ測定結果を表す。 ＬＰ処理済大腸菌（生菌）接種ＵＨＴホモ牛乳、及び菌を接種していないＬＰ処理済ＵＨＴホモ牛乳についてのＳＹＴＯ９／ＰＩ染色後のＦＣＭ測定結果を表す。 ＬＰ処理済大腸菌（生菌、及び損傷菌）接種ＬＴＬＴノンホモ牛乳、ＬＰ処理済表皮ブドウ球菌（生菌、及び損傷菌）接種ＬＴＬＴノンホモ牛乳、及び菌を接種していないＬＰ処理済ＬＴＬＴノンホモ牛乳についてのＳＹＴＯ９／ＰＩ染色後のＦＣＭ測定結果を表す。 ＬＰ処理及びＥＭＡ処理を行った、大腸菌（生菌、及び損傷菌）懸濁液、及び表皮ブドウ球菌（生菌、及び損傷菌）懸濁液についてのＳＹＴＯ９／ＰＩ染色後のＦＣＭ測定結果を表す。 ＬＰ処理及びＥＭＡ処理を行った、大腸菌（生菌）接種ＵＨＴホモ牛乳、表皮ブドウ球菌（生菌）接種ＵＨＴホモ牛乳、及び菌を接種していないＵＨＴホモ牛乳についてのＳＹＴＯ９／ＰＩ染色後のＦＣＭ測定結果を表す。 ＬＰ処理及びＥＭＡ処理を行った大腸菌（生菌及び損傷菌）接種ＬＴＬＴノンホモ牛乳についてのＳＹＴＯ９／ＰＩ染色後のＦＣＭ測定結果を表す。 ＬＰ処理及びＥＭＡ処理を行った表皮ブドウ球菌（生菌及び損傷菌）接種ＬＴＬＴノンホモ牛乳についてのＳＹＴＯ９／ＰＩ染色後のＦＣＭ測定結果を表す。 ＬＰ処理、及びａ）アムサクリン処理、ｂ）エリプチシン処理、ｃ）カンプトセシン処理、又はｄ）シプロフロキサシン処理を行った、大腸菌（生菌）接種ＵＨＴホモ牛乳、及び表皮ブドウ球菌（生菌）接種ＵＨＴホモ牛乳についてのＳＹＴＯ９／ＰＩ染色後のＦＣＭ測定結果を表す。 生理食塩水を入れたマイクロチューブの沸騰水への浸漬時間と液温との関係を示す。 大腸菌、クレブシェラ、シトロバクター、サルモネラ(生菌、損傷菌)のＥＭＡ未処理(Ｎ)又はＥＭＡ処理後（Ｅ）に抽出精製した染色体DNAの電気泳動写真。 大腸菌（損傷菌、死菌）のＥＭＡ未処理(Ｎ)又はＥＭＡ処理後（Ｅ）に抽出精製した染色体DNAの電気泳動写真。 表皮ブドウ球菌（生菌、損傷菌、死菌）のＥＭＡ未処理(Ｎ)又はＥＭＡ処理後（Ｅ）に抽出精製した染色体DNAの電気泳動写真。 大腸菌の生菌、損傷菌、及び死菌のＥＭＡ処理前後のＦＣＭ測定結果を示す。 表皮ブドウ球菌の生菌、損傷菌、及び死菌のＥＭＡ処理前後のＦＣＭ測定結果を示す。 結核菌の生菌、イソニコチン酸ヒドラジド・リファンピシン処理された損傷菌、及び死菌のＥＭＡ処理前後のＦＣＭによる試験結果を示す。 リステリアの生菌、アンピシリン・ゲンタマイシン処理された損傷菌、及び死菌のＥＭＡ処理前後のＦＣＭ測定結果を示す。 大腸菌、表皮ブドウ球菌、結核菌、リステリアのＡＴＰ法による生菌、損傷菌、及び死菌の分類分けと、本発明の方法による識別との対応を示す。 大腸菌、表皮ブドウ球菌、結核菌、リステリアのエステラーゼ法による生菌、損傷菌、及び死菌の分類分けと、本発明の方法による識別との対応を示す。 ヒト血液中のリステリアのＥＭＡ処理又は未処理後のＦＣＭ測定結果を示す図。

次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。

本発明のフローサイトメトリー（以下、「ＦＣＭ」と略記することがある）測定用試料の作製法は、被検試料中の微生物の生菌をＦＣＭにより検出するための測定用試料を作製する方法であって、以下の工程を含む方法である。
ａ）被検試料を、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、又は脂肪を分解する活性を有する酵素で処理する工程、及び
ｂ）前記被検試料を、トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理する工程。

また、本発明の被検試料中の微生物の生菌を検出する方法は、前記ＦＣＭ測定用試料の作製法によって得られる試料を用いて、前記生菌を検出する方法であって、上記工程ａ）及びｂ）に加えて、さらに下記工程を含む。
ｃ）前記ａ）及びｂ）の工程で処理された被検試料を核染色剤で処理する工程、及び
ｄ）前記核染色剤で処理した被検試料中の微生物をフローサイトメトリーにより検出する工程。

本明細書において、「被検試料」とは、その中に存在する微生物の生菌を検出する対象であり、微生物をＦＣＭにより検出することが可能なものであれば特に制限されないが、例えば、乳、乳製品、乳若しくは乳製品を原料とする食品、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料又は胸水試料等が挙げられる。特に、乳、乳製品、乳若しくは乳製品を原料とする食品が好ましい。本発明においては、被検試料は、前記のような製品又は生体試料そのものであってもよく、これを希釈もしくは濃縮したもの、又は本発明の方法による処理以外の前処理をしたものであってもよい。前記前処理としては、加熱処理、濾過、抗生物質処理等が挙げられる。

「微生物」は、本発明の方法により検出される対象であり、ＦＣＭにより検出することが可能であって、かつ、トポイソメラーゼ阻害剤もしくはＤＮＡジャイレース阻害剤、又はエチジウムモノアザイドの微生物に対する作用が生菌、損傷菌、及び死菌とで異なるものであれば、特に制限されないが、好ましくは細菌、糸状菌、酵母等が挙げられる。細菌としては、グラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれもが含まれる。グラム陽性菌としては、ブドウ球菌（スタフィロコッカス・エピダーミディス（Staphylococcus epidermidis））等のスタフィロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、リステリア属細菌、バチルス属細菌、マイコバクテリウム属細菌等が挙げられる。また、グラム陰性菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌に代表される腸内細菌群、サルモネラ属細菌、ビブリオ属細菌、シュードモナス属細菌等が挙げられる。

本発明において「生菌」（live cell）とは、一般に好適な培養条件によって培養した際に増殖が可能であって、当該細菌が有する代謝活性を示す状態（Viable-and-Culturable state）、かつ好適な条件では増殖が可能な細菌であり、細胞壁の損傷はほとんど無い細菌をいう。なお、ここでいう代謝活性とはＡＴＰ活性やエステラーゼ活性を例示することができる。

「損傷菌」（Injured cell or Viable-but-Non Culturable cell）とは、人為的ストレス又は環境的ストレスにより損傷を受けているために、好適な培養条件によって培養した場合であっても、増殖は困難であるが、当該細菌が有する代謝活性は、生菌と比較すると低下しているものの死菌と比較すると有意に活性を有する状態（Injured、又はViable-but-Non Culturable state［ＶＮＣ］）の細菌である。尚、狭義では、損傷を受けたストレスによりＶＮＣと損傷菌は区別されることがあるが、本願発明では、生菌又は死菌との対比において、狭義のＶＮＣと損傷菌とを併せて損傷菌と称することがある。

特に、食品衛生検査や臨床検査において、穏和な加熱処理や抗生物質投与により、損傷菌の状態を呈した細菌の検出が注目されており、本発明においては、生菌の検出のみならず、生菌や死菌の識別、生菌や損傷菌の識別に至るあらゆる状態の判別も可能な微生物の検出方法を提供するものである。

「死菌」（Dead cell）とは、好適な培養条件によって培養した場合であっても増殖は不可能であって、代謝活性を示さない状態（Dead）の細菌である。また、細胞壁の構造は維持されているものの、細胞壁自体は高度に損傷を受けており、弱透過性のヨウ化プロピジウム等の核染色剤が細胞壁を透過する状態である。

尚、生菌、損傷菌及び死菌の菌数単位は、通常、いずれも細胞数（cells）／ｍｌで表される。生菌の細胞数は、好適な平板培地上で好適な条件で培養したときのコロニー形成数（ｃｆｕ／ｍｌ（colony formating units / ml））で近似させることができる。また、死菌の標準試料は、例えば、生菌懸濁液を加熱処理、例えば沸騰水中で加熱処理することにより調製することができるが、その場合は、死菌の細胞数は、加熱処理する前の生菌懸濁液のｃｆｕ／ｍｌで近似させることができる。尚、死菌を調製するための沸騰水中での加熱時間は、微生物の種類により異なるが、例えば実施例に記載された細菌では、１２分程度で死菌を調製することができる。また、損傷菌は、死菌の調製におけるよりも短時間沸騰水中で加熱処理することにより調製することができる。例えば実施例に記載された細菌では５０秒程度で損傷菌を調製することができる。この場合は、損傷菌の細胞数は、加熱処理する前の生菌懸濁液のｃｆｕ／ｍｌで近似させることができる。さらに、損傷菌の標準試料は、抗生物質処理によっても調製することができるが、その場合は、損傷菌の細胞数は、生菌懸濁液を抗生物質で処理した後、抗生物質を除去し、可視光（波長６００ｎｍ）の透過度、すなわち濁度を測定し、生菌数濃度が予め判っている生菌懸濁液の濁度と比較することにより、好適な平板培地上で好適な条件で培養したときのコロニー形成数（ｃｆｕ／ｍｌ）で近似させることができる。

「タンパク質コロイド粒子」とは、被検試料中に含まれ、タンパク質を構成成分として含み、核染色剤により非特異的に染色されるコロイド状の粒子であり、例えば、カゼインミセルが挙げられる。
以下、本発明の方法を工程毎に説明する。

（１）ステップａ）
このステップでは、被検試料を、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、又は脂肪を分解する活性を有する酵素で処理する。

ＦＣＭにより細菌を検出するには、一般に細菌が最低１００ｃｆｕ程度検出器を通過する必要があるといわれている。しかし、乳等の被検試料中の生菌をＦＣＭにより検出する場合、ＦＳＣ（Forward Scattered Light）−ＳＳＣ（Side Scattered Light）上のゲート（細菌ゲート）内に細菌だけでなく体細胞、脂肪球及びカゼインミセルなどの夾雑成分が大量混入するため、１００ｃｆｕ程度の細菌が検出器を通過しても検出できないことがある。したがって、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、及び脂肪等は、酵素処理によって除去又は低減させることが好ましい。

前記被検試料中に存在する微生物以外の細胞としては、被検試料が乳、乳製品、乳又は乳製品を原料とする食品である場合には、ウシ白血球及び乳腺上皮細胞等が挙げられる。また、被検試料が血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料又は胸水試料等の生体試料の場合には、赤血球、白血球（顆粒球、好中球、好塩基球、単球、リンパ球等）、及び血小板等が挙げられる。

前記酵素としては、前記夾雑物を分解することができ、かつ、検出対象の微生物の生菌を損傷しないものであれば特に制限されないが、例えば、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素が挙げられる。前記酵素は、１種類の酵素を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上の酵素を併用してもよいが、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素の両方を用いることが好ましい。

脂質分解酵素としては、リパーゼ、フォスファターゼ等が、タンパク質分解酵素としてはプロテイナーゼＫ、プロナーゼ等が挙げられる。

これらの酵素による処理の条件は、特に制限されず、適宜設定することが可能であるが、例えば、リパーゼについては、終濃度１０〜５０Ｕ／ｍｌで、２５〜３７℃で３０分以上、プロテイナーゼＫについては、終濃度１０〜５０Ｕ／ｍｌで、２５〜３７℃で３０分以上の条件が挙げられる。

脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素による処理は、（i）脂質分解酵素、（ii）タンパク質分解酵素の順に行うことが好ましく、また同時に添加して処理を行ってもよい。これらの酵素による処理の後は、被検試料中に酵素を存在させておいてもよいが、遠心分離等によって菌体から酵素を分離することが好ましい。

（２）ステップｂ）
このステップでは、被検試料を、トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理する。ステップｂ）は、ステップａ）の後に行うことが好ましい。

本発明に用いるトポイソメラーゼ阻害剤及びＤＮＡジャイレース阻害剤とは、それぞれトポイソメラーゼ及びＤＮＡジャイレースによるＤＮＡを切断する活性は阻害せず、ＤＮＡの再結合を阻害するもの、又はＤＮＡを切断する速度を促進するものをいう。好ましくは、トポイソメラーゼ阻害剤及びＤＮＡジャイレース阻害剤は、微生物の染色体ＤＮＡに共有結合するか、染色体ＤＮＡにインターカレートし、可視光照射により染色体ＤＮＡに共有結合するもの、単に染色体ＤＮＡにインターカレートするもの、又はトポイソメラーゼもしくはＤＮＡジャイレースと複合体形成するものである。

トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤は、両方を用いた方が好ましいが、一方のみを用いてもよい。
前記トポイソメラーゼ阻害剤及びＤＮＡジャイレース阻害剤は、生菌と、損傷菌、死菌及びウシ白血球等の体細胞、白血球、血小板等に対する作用が異なるものであることが好ましく、より具体的には、生菌の細胞壁よりも、損傷菌、及び死菌の細胞壁、又はウシ白血球等の体細胞、白血球、血小板等の細胞膜に対して透過性が高いものであることが好ましい。

前記トポイソメラーゼ阻害剤としては、アムサクリン（Amsacrine）、カンプトセシン（Camptothecin）、ドキソルビシン（Doxorubicin）、エリプチシン（Ellipticine）、エトポシド（Etoposide）、ミトキサントロン（Mitoxantrone）、サイントピン（Saintopin）、トポテカン（Topotecan）、及びＣＰ−１１５，９５３等が挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤は、１種類を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上を併用してもよい。

前記ＤＮＡジャイレース阻害剤としては、シプロフロキサシン（Ciprofloxacin）、オフロキサシン（Ofloxacin）、エノキサシン（Enoxacin）、ペフロキサシン（Pefloxacin）、フレロキサシン（Fleroxacin）、ノルフロキサシン（Norfloxacin）、ナリジクス酸（Nalidixic acid）、オキソリン酸（Oxolinic acid）、及びピロミド酸（Piromidic acid）等が挙げられる。ＤＮＡジャイレース阻害剤は、１種類を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上を併用してもよい。

トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤による処理の条件は、適宜設定することが可能であり、例えば、検出対象の微生物の生菌、損傷菌、及び死菌の懸濁液に、種々の濃度のトポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤を加えて、種々の時間置いた後、遠心分離等によって菌体を分離し、核染色剤で染色した後ＦＣＭで分析することによって、生菌と、損傷菌、及び死菌を区別しやすい条件を決定することができる。さらに、検出対象の微生物の生菌、及びウシ白血球等の体細胞又は血小板（損傷細胞を含む生細胞）等の懸濁液に、種々の濃度のトポイソメラーゼ阻害剤を加えて、所定時間放置した後、遠心分離等によって菌体及び前記各種細胞を分離し、核染色剤で染色した後、ＦＣＭで分析することによって、生菌と各種細胞を区別しやすい条件を決定することができる。このような条件として、具体的には、アムサクリンでは終濃度１〜１００μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、５分〜４８時間、エリプチシンでは終濃度０．０５〜５μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、１０分〜４８時間、カンプトセシンでは終濃度１〜１００μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、１０分〜４８時間、シプロフロキサシンでは終濃度０．４〜４０μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、１０分〜４８時間、エトポシドでは終濃度１〜１００μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、５分〜４８時間、ミトキサントロンでは終濃度０．１〜１０μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、１０分〜４８時間が挙げられる。被検試料を所定条件で処理した後に、希釈及び／又は遠心分離等による除去によって、処理を停止することが好ましい。

上記トポイソメラーゼ阻害剤及びＤＮＡジャイレース阻害剤は、生菌の細胞壁よりも、損傷菌、及び死菌の細胞壁の方が透過しやすい。したがって、前記に示す作用時間内であれば生菌の細胞壁は実質的に透過せず、損傷菌、及び死菌や損傷細胞を含む生細胞状態の体細胞の細胞膜は、細胞壁を含まない細胞膜のみであるので透過すると考えられる。その結果、トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤は、体細胞、損傷菌、及び死菌の細胞内に進入し、続いて、染色体ＤＮＡと無秩序に共有結合し、もしくはインターカレートし、もしくはトポイソメラーゼと複合体を形成し、さらに、体細胞内のトポイソメラーゼII又はトポイソメラーゼI、損傷菌の菌体内のトポイソメラーゼIV、もしくはトポイソメラーゼI、III、又は、ＤＮＡジャイレースによるＤＮＡ再結合を阻害すること、又はＤＮＡ切断速度を促進することにより、染色体ＤＮＡが断片化されると推定される。

生菌よりも損傷菌の染色体ＤＮＡが優先的に断片化されると、生菌、損傷菌及び死菌の細胞壁を透過する核染色剤、例えばＳＹＴＯ９で染色した場合、損傷菌では生菌よりも染色強度が抑制され、その結果、ＦＣＭによる検出において、生菌と、損傷菌を区別することが可能になると考えられる。

本発明の他の好ましい態様は、前記トポイソメラーゼ阻害剤がエチジウムモノアザイドであり、エチジウムモノアザイドを添加した被検試料に可視光を照射する工程を含む。エチジウムモノアザイド（ＥＭＡ）は、微生物の生菌の細胞壁よりも損傷菌の細胞壁を透過しやすい。したがって、ＥＭＡは生菌の細胞壁は実質的に透過せず、損傷菌の細胞壁や損傷細胞を含む生細胞の体細胞の細胞膜は細胞壁ではないために透過すると考えられる。尚、血液中の白血球、血小板が生細胞の場合、ＥＭＡは滅菌水や低張な塩溶液下で前記細胞の細胞膜をより透過する。ＥＭＡは、体細胞、及び損傷菌の細胞内に進入して核内ＤＮＡに無秩序にインターカレートした後、可視光照射によりインターカレートしたＥＭＡのみがナイトレンに変換され、核内ＤＮＡに共有結合する。そして、体細胞内のトポイソメラーゼII、損傷菌の菌体内のトポイソメラーゼIV、又は、ＤＮＡジャイレースによるＤＮＡ再結合を阻害することにより、染色体ＤＮＡが断片化されると推定される。

ＥＭＡによる処理の条件は、適宜設定することが可能であり、例えば、検出対象の微生物の生菌及び損傷菌の懸濁液に、種々の濃度のＥＭＡを加えて、種々の時間置いた後、可視光を照射して、必要に応じて遠心分離等によって菌体を分離し、核染色剤で染色した後ＦＣＭで分析することによって、生菌と、損傷菌を区別しやすい条件を決定することができる。
また、可視光照射の条件も、照射時間を変えて上記の実験を行うことにより、好ましい条件を決定することがでる。具体的には、ＥＭＡによる処理は終濃度０．５〜１００μｇ／ｍｌ、４〜１０℃、５分〜４８時間が好ましい。また、ＥＭＡ処理は、遮光下で行うことが好ましい。可視光としては、５００〜７００ｎｍの成分を含む可視光が好ましい。また、可視光照射の条件として具体的には、被検試料から１０〜５０ｃｍの距離から１００〜７５０Ｗの可視光を５分〜２時間照射する条件が挙げられる。可視光照射は、低温下で、例えば試料を氷冷して行うことが好ましい。

（３）ステップｃ）
この工程では、前記ａ）及びｂ）の工程で処理された被検試料を核染色剤で処理する。核染色剤は、少なくとも、生菌と、損傷菌、及び死菌の細胞壁を透過し得る第１の染色剤を含む。「生菌と死菌の細胞壁を透過し得る」とは、生菌と、損傷菌、及び死菌の細胞壁に対する透過性が実質的に同じである場合、及び、前記透過性が異なっていても、後述の第２の染色剤に比べて、生菌と死菌の細胞壁に対する透過性の差が小さい場合を含む。第１の染色剤として具体的には、例えばＳＹＴＯ９が挙げられる。

また、前記核染色剤はさらに、第１の染色剤に比べて、生菌及び損傷菌よりも死菌の細胞壁をより透過しやすい第２の染色剤を含むことが好ましい。第２の染色剤は、言換えれば、生菌と死菌を染め分けることが可能な染色剤である。第２の染色剤としては、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）が挙げられる。これらの核染色剤は、細胞内に進入すると、染色体ＤＮＡにインターカレートし、レーザー光を照射すると励起状態になり蛍光を発する。例えば、ＤＮＡにインターカレートしたＳＹＴＯ９及びＰＩは、λ４８８ｎｍのレーザー光を照射するとそれぞれ励起状態になり、ＳＹＴＯ９はλ５１８ｎｍを中心とする緑色の蛍光を発し、ＰＩはλ６１７ｎｍを中心とする赤色の蛍光を発する。

染色剤による染色において、生菌と、死菌及び被検試料中に存在する微生物以外の体細胞とで明確に差があれば、そのような染色剤を用いることによって生菌を判別することがある程度可能である。しかしながら、物理的に損傷した死菌の細胞内に進入し得る染色剤であっても、損傷が軽度な損傷菌場合には、それらの細胞内に進入せず、生菌と染色における差が少ないことがある。そのような場合、第２の染色剤のみでは生菌と損傷菌を明確に区別することは困難である。

一方、前記ステップｂ）の処理を行うことによって、損傷菌の染色体ＤＮＡが断片化され、染色剤により染色されにくくなるため、第１の染色剤による染色によって、生菌と損傷菌等を区別することが可能となる。さらに、第２の染色剤を用いることによって、ＦＣＭによる細胞の検出を二次元的に行うことが可能となる。したがって、本発明においては、第１の染色剤による染色のみでも生菌の検出は可能であるが、さらに第２の染色剤を用いることによって、生菌と死菌の識別が可能となり、検出精度が高まるため、第１の染色剤と第２の染色剤の両方を用いることが好ましい。

第１の染色剤と第２の染色剤による染色は、同時に行ってもよいし、別々に行ってもよい。

染色剤による染色の条件は特に制限されず、通常微生物の染色体ＤＮＡの染色に用いられる条件を適用することができるが、具体的には例えば、終濃度として、ＳＹＴＯ９の場合は４．０〜６．０μＭ、及びＰＩの場合２５．０〜３５．０μＭとなるように菌体懸濁液に染色剤を加えて、１５〜２５℃で１０〜２０分反応させることが好ましい。

（４）ステップｄ）
この工程では、前記ｃ）の工程で核染色剤で処理した被検試料中の微生物を、ＦＣＭにより検出する。ＦＣＭによる微生物の検出原理は以下のとおりである。

微生物等の粒子を一列に並べ、順番にアルゴンレーザー光（λ４８８ｎｍ）を照射すると、レーザー光の軸に対して１．５°〜１９°の小さい角度で散乱する。これは前方散乱光（Forward Scattered Light：ＦＳＣ）と呼ばれ、その散乱度は粒子の大きさにほぼ比例する。また、同時にレーザー光の軸に対して約９０°の角度で散乱する光は側方散乱光（Side Scattered Light：ＳＳＣ）と呼ばれ、ＤＮＡ構造も含めた粒子の内部構造の複雑さを反映していると言われている。従って、ｘ−ｙプロットとしてＦＳＣ−ＳＳＣプロットを作成すると、横軸は粒子の大きさを意味し、縦軸は粒子の内部構造の複雑さを意味する。

細菌を前記第１の核染色剤及び第２の核染色剤で染色し、レーザー光を照射すれば、個々の細胞はＦＳＣ−ＳＳＣプロット上のある特定領域に位置する。そのプロット上の特定領域をＦＣＭ分析ソフト（例えば、Cell Quest Ver. 3.1; Becton Dickinson, Sydney, Australia）を用いて四方で囲み（ゲート）、細菌領域の粒子のみを選択的に拾い上げ、その拾い上げた粒子のみに焦点を当てて、生菌と死菌のドットプロットを作成することができる（図１〜８参照）。
ＦＣＭの測定は以下の条件が好ましい。すなわち、励起光は、１５ｍＷのアルゴンレーザー光（波長λ＝４８８ｎｍ）を用い、前方散乱光ＦＳＣ（＜１５°）、及び側方散乱光（＞１５°）、及び３種類の蛍光シグナルＦＬ１〜３をそれぞれ測定することが好ましい。尚、蛍光シグナルＦＬ１〜３を測定するために、緑の蛍光（ＦＬ１）には５１５〜５４５ｎｍ、特に５３０ｎｍの帯域フィルター（band pass filter）を使用することが好ましく、黄橙色の蛍光（ＦＬ２）には５６４〜６０６ｎｍ、特に５８５ｎｍの帯域フィルターを使用することが好ましく、赤色の蛍光（ＦＬ３）には６５５〜８００ｎｍ、特に６７０ｎｍの長波長帯域フィルターを使用することが好ましい。
さらに、ＦＣＭ測定の各検出器の設定は、FSC：E02、SSC：376、FL1：709、FL2：736、FL3：811（全て対数gain使用）、％ Compensationの設定は、FL1-FL2：0.0、FL2-FL1：0.0、FL2-FL3：0.0、FL3-FL2：0.0、ＦＳＣシグナル１５０をThreshold（境界値）、ＦＣＭ試験溶液の送液速度は、low flow rate：１２μｌ／ｍｉｎ、ＦＳＣ−ＳＳＣプロット上のゲート内への取り込み細胞数（粒子数）を5,000,000、測定時間は３０秒、にそれぞれ設定して測定することが好ましい。

例えば、好ましい条件においては、生菌及び損傷菌はＳＹＴＯ９／ＰＩプロット上でＳＹＴＯ９陽性・ＰＩ陰性（ＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−））の領域にプロットされ、死菌は主としてＳＹＴＯ９陽性・ＰＩ陽性（ＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（＋））の領域にプロットされる。ＳＹＴＯ９の陽性、陰性の境界、及びＰＩの陽性、陰性の境界は、ＳＹＴＯ９の場合は蛍光強度１０³であって、ＰＩの場合は蛍光強度２×１０²である。尚、ゲートの設定は、ＦＳＣ：１０²〜２×１０³、ＳＳＣ：１０〜２×１０²とすることが好ましい。

ＦＣＭによる分析は、市販されているＦＣＭ装置を用いて行うことができる。また、ＦＣＭの条件は特に制限されず、通常細菌等の微生物の検出、分離に用いられる条件を本発明に適用することができる。

本発明において、「生菌の検出」とは、被検試料中の生菌の有無の判別、及び生菌の量の決定のいずれをも含む。また、「生菌の検出」には、生菌と、損傷菌及び／又は死菌とを区別し、生菌、損傷菌及び死菌のそれぞれの有無を判別することを含む。生菌の量とは、絶対的な量に限られず、対照試料に対する相対的な量であってもよい。

＜３＞本発明のキット
本発明の第１のキットは、前記第１のＦＣＭ測定用試料を作製するためのキットであって、酵素を構成する要素として、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素から選ばれる酵素、トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤、及び核染色剤を含む。

また、本発明の第２のキットは、前記第２のＦＣＭ測定用試料を作製するためのキットであって、酵素を構成する要素として、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素から選ばれる酵素、エチジウムモノアザイド、及び核染色剤を含む。

上記キットにおいて、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素から選ばれる酵素、トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤、及び核染色剤は、本発明の方法で説明したものと同様である。

本発明のキットは、上記の各要素の他、希釈液、本発明の方法を記載した説明書等を含めることもできる。

次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［試験試料］
以下の実施例及び対照例においては、微生物として大腸菌（Escherichia coli）DH5α（以下、「大腸菌」と略記することがある）、及び表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）ＫＤ株（以下、「表皮ブドウ球菌」と略記することがある）を用いて、以下の処理を行った試験試料を使用して試験を行った。

（１）生菌、損傷菌の生理食塩水懸濁液を、フローサイトメーターで検出した（「未処理群」と記す）。
（２）生菌、損傷菌の生理食塩水懸濁液を、リパーゼ及びプロテイナーゼＫ処理した後にフローサイトメーターで検出した（「ＬＰ処理群」と記す）。以上（１）、（２）の試料について対照例１に結果を示す。
（３）生菌、損傷菌を牛乳（超高温瞬間加熱殺菌（１３０℃、２秒）：（「ＵＨＴ」と記す）、低温保持殺菌（６３℃、３０分）：（「ＬＴＬＴ」と記す））に懸濁して、これをリパーゼ及びプロテイナーゼＫ処理した後にフローサイトメーターで検出した（「Ｍ−ＬＰ処理群」と記す）。また、牛乳をリパーゼ及びプロテイナーゼＫ処理したものについてもフローサイトメーターで検出した。結果を対照例２、対照例３に示す。
（４）前記（２）の試料にエチジウム・モノ・アザイド（ＥＭＡ）処理を追加したものをフローサイトメーターで検出した（「ＬＰＥ処理群」と記す）。結果を実施例１に示す。（５）前記（３）の試料にＥＭＡ処理を追加したものをフローサイトメーターで検出した（「Ｍ−ＬＰＥ処理群」と記す）。結果を実施例２及び実施例３に示す。
（６）前記（５）の試料において、ＥＭＡ処理を、トポイソメラーゼ阻害剤による処理、又はＤＮＡジャイレース阻害剤による処理に置換したものをフローサイトメーターで検出した（「Ｍ−ＬＰＤ処理群」と記す）。結果を実施例４に示す。

［対照例１］生理食塩水に懸濁した大腸菌及び表皮ブドウ球菌の生菌及び損傷菌（ＬＰ処理又は未処理）のフローサイトメーターによる検出

（１）試料の調製
１−１．生菌及び損傷菌の懸濁液の調製
１−１−１．大腸菌懸濁液
大腸菌DH5αをＬブロスに接種し、１０℃で１２時間静置培養し、続いて４℃で３，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を生理食塩水（大塚製薬社製。以下同様。）に懸濁し、遠心分離して再度菌体を回収し、さらに１回同様の操作を繰り返して菌体を洗浄した。

洗浄した菌体を生理食塩水に懸濁し、適宜希釈してＬ寒天培地に０．１ｍｌ塗抹し、培養することにより、生菌数を測定した。前記菌体懸濁液を最終的に４×１０⁶ｃｆｕ／ｍｌに調製して生菌懸濁液とした。

前記生菌懸濁液１ｍｌを２ｍｌ容マイクロチューブに入れ、１００℃の沸騰水に５０秒間浸積し、これを損傷菌懸濁液とした。これとは別に、再度損傷菌懸濁液を調製し、そのうちの０．１ｍｌをＬ寒天培地に塗抹してコロニーを形成しないことを確認した。

１−１−２．表皮ブドウ球菌懸濁液
表皮ブドウ球菌ＫＤ株をＬブロスに接種し、３７℃で１８時間静置培養し、続いて４℃で３，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離して菌体を回収した。回収した菌を生理食塩水（大塚製薬社製）に懸濁し、遠心分離して再度菌体を回収し、さらに１回同様の操作を繰り返して菌体を洗浄した。洗浄した菌体を生理食塩水に懸濁し、適宜希釈してＬ寒天培地に０．１ｍｌ塗抹し、培養することにより、生菌数を測定した。前記菌体懸濁液を最終的に４×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌに調製して生菌懸濁液とした。

前記生菌懸濁液１ｍｌを２ｍｌ容マイクロチューブに入れ、１００℃の沸騰水に５０秒間浸積し、これを損傷菌懸濁液とした。これとは別に、再度損傷菌懸濁液を調製し、そのうちの０．１ｍｌをＬ寒天培地に塗抹してコロニーを形成しないことを確認した。

１−２．生菌及び損傷菌の懸濁液のリパーゼ処理及びプロテイナーゼＫ処理
前記１−１−１及び１−１−２で調製した大腸菌懸濁液（生菌、損傷菌）及び表皮ブドウ球菌懸濁液（生菌、損傷菌）について、それぞれ１ｍｌを２ｍｌ容マイクロチューブに入れ、生理食塩水により１８９Ｕ／ｍｌに調製されたリパーゼ（E.C.3.1.1.3、シグマ社製）溶液１００μｌを添加し、３７℃で３０分間保温してリパーゼ処理した。

リパーゼ処理した各々の菌体懸濁液に、１２５０Ｕ／ｍｌプロテイナーゼＫ（E.C.3.4.21.64、シグマ社製）溶液２０μｌを添加し、３７℃で３０分間保温してプロテイナーゼＫ処理した。
リパーゼ処理及びプロテイナーゼＫ処理（以下、「ＬＰ処理」と記載することがある。）の後、４℃で１４，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離して菌体を回収し、回収した菌体を生理食塩水に懸濁して、それぞれＬＰ処理群−大腸菌懸濁液（生菌、損傷菌）及びＬＰ処理群−表皮ブドウ球菌懸濁液（生菌、損傷菌）を調製した。

なお、上記の方法において、リパーゼの代わりに生理食塩水１００μｌを添加し、プロテイナーゼＫの代わりに生理食塩水２０μｌを添加して、同様の処理を行ったものを、それぞれ未処理群−大腸菌懸濁液（生菌、損傷菌）及び未処理群−表皮ブドウ球菌懸濁液（生菌、損傷菌）とした。

（２）ＦＣＭ試験方法
ＬＰ処理群−大腸菌懸濁液（生菌、損傷菌）及びＬＰ処理群−表皮ブドウ球菌懸濁液（生菌、損傷菌）、並びに未処理群−大腸菌懸濁液（生菌、損傷菌）及び未処理群−表皮ブドウ球菌懸濁液（生菌、損傷菌）のそれぞれについて、各懸濁液３００μｌを分取し、ＳＹＴＯ９／ＰＩ蛍光染色試薬（LIVE/DEAD BacLight^TM Bacterial Viability kit、モレキュラープローブス社製：ＳＹＴＯ９／ＰＩ＝１／１混合液）を０．９μｌ添加し、遮光下、室温で１５分間反応させて各試料を調製した。これらの試料について、ＦＣＭ測定装置FACSCalibur（ベクトン・ディッキンソン社製）により測定を行った。

ここで、測定条件は以下のとおりである。励起光は、１５ｍＷのアルゴンレーザー光（波長λ＝４８８ｎｍ）を用い、ＦＣＭ試料送液用シース液は、ベクトンディッキンソン社製を使用した。また、前方散乱光ＦＳＣ（＜１５°）、及び側方散乱光ＳＳＣ（＞１５°）、及び３種類の蛍光シグナルＦＬ１〜３をそれぞれ測定した。尚、蛍光シグナルＦＬ１〜３を測定するために、緑の蛍光（ＦＬ１）には５３０ｎｍの帯域フィルター（band pass filter）（５１５〜５４５ｎｍ）を使用し、黄橙色の蛍光（ＦＬ２）には５８５ｎｍの帯域フィルター（５６４〜６０６ｎｍ）を使用し、赤色の蛍光（ＦＬ３）には６７０ｎｍの長波長帯域フィルター（６５５〜８００ｎｍ）を使用した。

さらに、ＦＣＭ測定の各検出器の設定は、FSC：E02、SSC：376、FL1：709、FL2：736、FL3：811（全て対数gain使用）、％ Compensationの設定は、FL1-FL2：0.0、FL2-FL1：0.0、FL2-FL3：0.0、FL3-FL2：0.0、ＦＳＣシグナル１５０をThreshold（境界値）、ＦＣＭ試験溶液の送液速度は、low flow rate：１２μｌ／ｍｉｎ、ＦＳＣ−ＳＳＣプロット上のゲート内への取り込み細胞数（粒子数）を5,000,000、測定時間は３０秒、にそれぞれ設定して測定を行った。

（３）試験結果
本試験の結果を図１に示す。
ＳＹＴＯ９は細胞壁透過性が高く生菌及び死菌の細胞壁を透過するが、ＰＩは細胞壁透過性が低く、物理的に損傷を受けた死菌の細胞壁のみ透過する。従って、本来、生菌はＳＹＴＯ９／ＰＩプロット上でＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）の領域にプロットされ、死菌はＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（＋）の領域にプロットされるはずである。実際に、未処理群−大腸菌懸濁液（生菌、損傷菌）及び未処理群−表皮ブドウ球菌懸濁液（生菌、損傷菌）の結果を比較すると、生菌だけでなく損傷菌に対してもＰＩが透過しておらず生菌と損傷菌を明確に識別することができなかった。したがって、超高温瞬間殺菌（市販牛乳）に近い１００℃の沸騰水中５０秒浸積による細菌の細胞壁は、その損傷の程度が軽度と推察される。また、生菌と損傷菌のＳＹＴＯ９染色による蛍光強度に若干違いがあるが、これは損傷菌の染色体ＤＮＡが熱により一部分解を受け、ＳＹＴＯ９の染色体ＤＮＡに対するインターカレート効率が低下したものと推察される。
ＬＰ処理を施しても、特に大腸菌の場合、生菌と損傷菌を明確に識別することができなかった。未処理群−大腸菌懸濁液（生菌）とＬＰ処理群−大腸菌懸濁液（生菌）の比較から、ＬＰ処理を施すことにより、生きた大腸菌のＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）領域のプロットが一部ＳＹＴＯ９（−）・ＰＩ（−）領域に移行し、生菌の検出効率を減少させている。このような現象は、表皮ブドウ球菌の場合より顕著である。しかし、ＦＣＭにより牛乳から生菌と損傷菌をそれぞれ個別に検出する場合、その夾雑成分であるウシ白血球や乳腺上皮細胞に代表される体細胞、カゼインミセル、脂肪を除去する必要があり、ＬＰ処理は避けられないと考えられた。

［対照例２］超高温瞬間加熱殺菌ホモ牛乳に懸濁した大腸菌の生菌（ＬＰ処理）のフローサイトメーターによる検出

（１）試料の調製
対照例１と同様の方法で調製した１．１×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌懸濁液（生菌）１ｍｌに、市販の均質化処理済み（ホモ）牛乳（超高温瞬間加熱殺菌（１３０℃、２秒）、以下、「ＵＨＴホモ牛乳」と記載することがある。）９ｍｌを添加して１０倍希釈し、さらに同様の希釈法により順次希釈を行って、それぞれ１．１×１０²〜１．１×１０⁶ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌（生菌）接種ＵＨＴホモ牛乳を調製した。なお、前記のＵＨＴホモ牛乳は、寒天培地上で３７℃、４８時間、および２５℃、７２時間培養してコロニーが形成されないことを確認したものを使用した。

次いで、各希釈率の大腸菌（生菌）接種ＵＨＴホモ牛乳、及び大腸菌を接種していないＵＨＴホモ牛乳について、対照例１と同様のリパーゼ処理及びプロテイナーゼＫ処理（ＬＰ処理）を行った。すなわち、大腸菌（生菌）接種ＵＨＴホモ牛乳、及び大腸菌を接種していないＵＨＴホモ牛乳それぞれ１ｍｌずつを２ｍｌ容マイクロチューブに入れ、生理食塩水により１８９Ｕ／ｍｌに調製されたリパーゼ（E.C.3.1.1.3、シグマ社製）溶液１００μｌを添加し、３７℃で３０分間保温してリパーゼ処理した。

リパーゼ処理した各々の試料に、１２５０Ｕ／ｍｌプロテイナーゼＫ（E.C.3.4.21.64、シグマ社製）溶液２０μｌを添加し、３７℃で３０分間保温してプロテイナーゼＫ処理した。
リパーゼ処理及びプロテイナーゼＫ処理の後、８８０μｌの生理食塩水を加え、４℃で１４，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離を行った。上層に存在する脂肪層を綿棒により完全に除去し、さらに中間層に存在する水層も除去した。残った下層に２ｍｌの生理食塩水を加え、４℃で１４，０００×ｇ、１０分間冷却遠心処理して洗浄して、ペレットを回収し、これに生理食塩水３００μｌを加えた。

（２）試験方法
前記で調製した、各ＬＰ処理済大腸菌（生菌）接種ＵＨＴホモ牛乳、及びＬＰ処理済ＵＨＴホモ牛乳について、各試料３００μｌを分取し、ＳＹＴＯ９／ＰＩ蛍光染色試薬を０．９μｌ添加し、遮光下、室温で１５分間反応させて各試料を調製した。これらの試料について、ＦＣＭ測定装置FACSCalibur（ベクトン・ディッキンソン社製）により測定を行った。尚、検出条件は、測定時間を５分としたこと以外は対照例１と同一の条件であった。

（３）試験結果
本試験の結果は図２に示す。
大腸菌（生菌）接種濃度に応じＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）領域のプロット数が変化しているが、大腸菌（生菌）を接種していないＬＰ処理済ＵＨＴホモ牛乳においても本領域に多数のプロットが存在し、大腸菌（生菌）との識別が困難であった。これら夾雑成分としては、体細胞又は牛乳中に元来含まれていた熱による損傷菌が考えられるが、超高温瞬間殺菌では、前者は細胞膜、後者は細胞壁の損傷が軽度なため、ＳＹＴＯ９は透過したが、ＰＩは透過しなかったと考えられる。参考として、ＬＰ処理済大腸菌（生菌）接種ＵＨＴホモ牛乳の各ＳＹＴＯ ９（＋）・ＰＩ（−）領域のプロット数から大腸菌（生菌）を接種していないＬＰ処理済ＵＨＴホモ牛乳の本領域のプロット数を減じた結果を表１に示した。それによると、本試験条件では１．１×１０⁴ｃｆｕ／ｍｌが大腸菌（生菌）の検出限界と考えられる。

［対照例３］低温保持殺菌（ＬＴＬＴ）ノンホモ牛乳に懸濁した大腸菌及び表皮ブドウ球菌における、生菌及び損傷菌（ＬＰ処理）のフローサイトメーターによる検出
（１）試料の調製
対照例１と同様の方法で調製した１．５×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌懸濁液（生菌、及び損傷菌）１ｍｌに、市販の均質化処理を行っていない（ノンホモ）牛乳（低温保持殺菌（６３℃、３０分）、以下、「ＬＴＬＴノンホモ牛乳」と記載することがある。）９ｍｌを添加して１０倍希釈し、さらに同様の希釈法により順次希釈を行って、それぞれ１．５×１０²〜１．５×１０⁶ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌（生菌、及び損傷菌）接種ＬＴＬＴノンホモ牛乳を調製した。なお、前記のＬＴＬＴノンホモ牛乳は、寒天培地上で３７℃、４８時間、および２５℃、７２時間培養してコロニーが形成されないことを確認したものを使用した。

また、対照例１と同様の方法で調製した１．８×１０⁸ｃｆｕ／ｍｌの表皮ブドウ球菌懸濁液（生菌、及び損傷菌）１ｍｌに、ＬＴＬＴノンホモ牛乳９ｍｌを添加して１０倍希釈し、さらに同様の希釈法により順次希釈を行って、それぞれ１．８×１０²〜１．８×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌの表皮ブドウ球菌（生菌、及び損傷菌）接種ＬＴＬＴノンホモ牛乳を調製した。

次いで、各希釈率の大腸菌（生菌、及び損傷菌）接種ＬＴＬＴノンホモ牛乳、各希釈率の表皮ブドウ球菌（生菌、及び損傷菌）接種ＬＴＬＴノンホモ牛乳、及び菌を接種していないＬＴＬＴノンホモ牛乳について、対照例１と同様のリパーゼ処理及びプロテイナーゼＫ処理（ＬＰ処理）を行った。すなわち、大腸菌（生菌、及び損傷菌）接種ＬＴＬＴノンホモ牛乳、表皮ブドウ球菌（生菌、及び損傷菌）接種ＬＴＬＴノンホモ牛乳、及び菌を接種していないＬＴＬＴノンホモ牛乳それぞれ１ｍｌずつを２ｍｌ容マイクロチューブに入れ、生理食塩水により１８９Ｕ／ｍｌに調製されたリパーゼ（E.C.3.1.1.3、シグマ社製）溶液１００μｌを添加し、３７℃で３０分間保温してリパーゼ処理した。
リパーゼ処理した各々の試料に１２５０Ｕ／ｍｌプロテイナーゼＫ（E.C.3.4.21.64、シグマ社製）溶液２０μｌを添加し、３７℃で３０分間保温してプロテイナーゼＫ処理した。

リパーゼ処理及びプロテイナーゼＫ処理の後、８８０μｌの生理食塩水を加え、４℃で１４，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離した。上層に存在する脂肪層を綿棒により完全に除去し、さらに中間層に存在する水層も除去した。残った下層に２ｍｌの生理食塩水を加え、４℃で１４，０００×ｇ、１０分間冷却遠心処理して洗浄して、ペレットを回収し、これに生理食塩水３００μｌを加えた。

（２）試験方法
前記で調製した、各ＬＰ処理済大腸菌（生菌、及び損傷菌）接種ＬＴＬＴノンホモ牛乳、各ＬＰ処理済表皮ブドウ球菌（生菌、及び損傷菌）接種ＬＴＬＴノンホモ牛乳、及びＬＰ処理済・菌を接種していないＬＴＬＴノンホモ牛乳について、各試料３００μｌを分取し、ＳＹＴＯ９／ＰＩ蛍光染色試薬を０．９μｌ添加し、遮光下、室温で１５分間反応させて各試料を調製した。これらの試料について、ＦＣＭ測定装置FACSCalibur（ベクトン・ディッキンソン社製）により測定を行った。尚、検出条件は、測定時間を５分としたこと以外は対照例１と同一の条件にて行った。

（３）試験結果
本試験の結果を図３に示す。
菌を接種していないＬＰ処理ＬＴＬＴノンホモ牛乳のＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）領域に多数のプロットが存在し、大腸菌（生菌）及び表皮ブドウ球菌（生菌）の検出限界を劣らせている。大腸菌（損傷菌）及び表皮ブドウ球菌（損傷菌）は、菌を接種していないＬＰ処理ＬＴＬＴノンホモ牛乳由来のプロットに隠れた。

ＬＴＬＴノンホモ牛乳中には、元来損傷菌や死菌が１０³〜１０⁵ｃｆｕ／ｍｌの濃度で含まれているので、本対照例３で新たに接種した損傷菌のプロットが隠される可能性は高いし、また、前記対照例１の図１に示した結果により、大腸菌及び表皮ブドウ球菌（損傷菌）懸濁液のＬＰ処理後のプロットの位置を考慮しても、ＬＰ処理ＬＴＬＴノンホモ牛乳由来のプロットに隠された可能性は十分高いと考えられる。

各ＬＰ処理済大腸菌（生菌）接種ＬＴＬＴノンホモ牛乳、及びＬＰ処理済ＬＴＬＴノンホモ牛乳について、ＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）プロット領域におけるＳＹＴＯ９強度≧７×１０³のプロット数を表２に示した。本試験条件では、ＬＴＬＴノンホモ牛乳におけるＬＰ処理法の大腸菌（生菌）の検出限界は、１．５×１０⁵ｃｆｕ／ｍｌと考えられる。

また、各ＬＰ処理済表皮ブドウ球菌（生菌）接種ＬＴＬＴノンホモ牛乳、及びＬＰ処理済ＬＴＬＴノンホモ牛乳について、ＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）プロット領域におけるＳＹＴＯ９強度≧７×１０³のプロット数を表３に示した。本試験条件では、ＬＴＬＴノンホモ牛乳におけるＬＰ処理法の表皮ブドウ球菌（生菌）の検出限界は、１．８×１０⁶ｃｆｕ／ｍｌと考えられる。

［実施例１］エチジウム・モノ・アザイド（ＥＭＡ）処理した大腸菌懸濁液及び表皮ブドウ球菌懸濁液（ＬＰ処理）のフローサイトメーターによる検出
（１）試料の調製
対照例１と同様の方法で調製した大腸菌懸濁液（生菌及び損傷菌：４×１０⁶ｃｆｕ／ｍｌ）、及び表皮ブドウ球菌（生菌及び損傷菌：４×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌ）を、それぞれ２ｍｌ容のマイクロチューブに１ｍｌずつ添加し、対照例１と同様にリパーゼ処理及びプロテイナーゼＫ処理（ＬＰ処理）をした後、４℃で１４，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離を行った。上層の水層を除去した後、下層（沈殿物）の菌体にそれぞれ生理食塩水１ｍｌを添加して懸濁した。

１０００μｇ／ｍｌとなるようにエチジウムモノアザイド（以下、「ＥＭＡ」と略記することがある。シグマ社製、カタログ番号：Ｅ２０２８）を滅菌水に溶解し、０．４５μｍのマイクロフィルターにより濾過したＥＭＡ水溶液を、前記ＬＰ処理後の菌体懸濁液に１０μｌ添加し、遮光下で、４℃、３０分間放置した。その後、懸濁液を氷上に置き、懸濁液から２０ｃｍの距離に設置した５００Ｗの可視光線（FLOOD PRF：１００Ｖ ５００Ｗ、岩崎電気社製）を１０分間照射した。以上のＥＭＡ溶液を添加し、可視光線を照射する工程を、「ＥＭＡ処理」と略記することがある。次いで、生理食塩水を９９０μｌ添加し、４℃で１４，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離を行った。上層の水層を除去した後、下層のペレットに３００μｌの生理食塩水を添加し、次いで、ＳＹＴＯ９／ＰＩ蛍光染色試薬を０．９μｌ添加して、遮光下、室温で１５分間反応させて、各試料を調製した。

（２）試験方法
前記で調製した各試料について、対照例１と同様の方法にてＦＣＭにより測定（測定時間：３０秒）を行った。

（３）試験結果
本試験の結果を図４に示す。
前記図１に示したように、ＬＰ処理のみでは大腸菌の生菌と損傷菌を明確に識別することはできなかった。しかしながら、本試験の結果から明らかなように、ＬＰ処理後にＥＭＡ処理を行うことによって、大腸菌の生菌と損傷菌を明確に識別することが可能となった。尚、表皮ブドウ球菌についても同様である。これは、細胞壁透過性の低いＥＭＡが、生菌の細胞壁は透過せず、軽度ながら損傷を受けた損傷菌の細胞壁は透過したものと考えられる。

損傷菌を透過したＥＭＡは、損傷菌の菌体内の染色体ＤＮＡに無秩序にインターカレートした後、可視光照射によりナイトレンに変換され、染色体ＤＮＡに共有結合する。瞬間殺菌では、損傷菌の菌体内でＤＮＡジャイレース、又はトポイソメラーゼの活性が残存しているため、代謝時の遺伝子の転写のためにＤＮＡ鎖の巻き戻しが行われ、染色体ＤＮＡの切断、再結合が起る。その再結合の際、ＥＭＡ由来のナイトレンのＤＮＡへの共有結合により、上記酵素によるＤＮＡ再結合を阻害し、その結果、染色体ＤＮＡの断片化が促進される。断片化した染色体ＤＮＡを有する損傷菌にＳＹＴＯ９を作用させた場合、その蛍光強度がＥＭＡ作用前と比較して明らかに低下するが、それはＤＮＡが断片化しているためＳＹＴＯ９によるＤＮＡへのインターカレート効率が低下したからであると考えられる。しかし、ＥＭＡは生菌の細胞壁には透過できないので、染色体ＤＮＡには影響を与えない。従って、ＥＭＡ処理を施しても生菌の場合、ＳＹＴＯ９による蛍光強度は変化しないと考えられる。

［実施例２］エチジウム・モノ・アザイド（ＥＭＡ）処理した、ＵＨＴホモ牛乳に懸濁した大腸菌及び表皮ブドウ球菌の生菌（ＬＰ処理）のフローサイトメーターによる検出
（１）試料の調製
対照例１と同様の方法で調製した６×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌懸濁液（生菌）１ｍｌに、対照例２で使用したＵＨＴホモ牛乳９ｍｌを添加して１０倍希釈し、さらに同様の希釈法により順次希釈を行って、それぞれ６×１０¹〜６×１０⁵ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌（生菌）接種ＵＨＴホモ牛乳を調製した。

また、対照例１と同様の方法で調製した１．９×１０⁸ｃｆｕ／ｍｌの表皮ブドウ球菌懸濁液（生菌）１ｍｌに、ＵＨＴホモ牛乳９ｍｌを添加して１０倍希釈し、さらに同様の希釈法により順次希釈を行って、それぞれ１．９×１０²〜１．９×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌの表皮ブドウ球菌（生菌）接種ＵＨＴホモ牛乳を調製した。さらにこれとは別に、菌を接種していないＵＨＴホモ牛乳を用意した。

大腸菌（生菌）接種ＵＨＴホモ牛乳、表皮ブドウ球菌（生菌）接種ＵＨＴホモ牛乳、及び菌を接種していないＵＨＴホモ牛乳を、それぞれ２ｍｌ容のマイクロチューブに１ｍｌずつ添加し、対照例１と同様にリパーゼ処理及びプロテイナーゼＫ処理（ＬＰ処理）をした後、８８０μｌの生理食塩水を添加して、４℃で１４，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離を行った。上層の脂肪層を綿棒により除去した後、中間層の水層も除去した。次いで、下層（沈殿物）の菌体に生理食塩水１ｍｌを添加して懸濁した。実施例１で使用した１０００μｇ／ｍｌ ＥＭＡ水溶液を、前記ＬＰ処理後の菌体懸濁液及び菌を接種していないＵＨＴホモ牛乳に１０μｌ添加し、遮光下で、４℃、５分間放置した後、氷上で５００Ｗの可視光線（FLOOD PRF：１００Ｖ５００Ｗ、岩崎電気社製）を５分間照射した（ＥＭＡ処理）。次いで、生理食塩水を９９０μｌ添加し、４℃で１４，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離を行った。上層の水層を除去した後、下層のペレットに３００μｌの生理食塩水を添加し、次いで、ＳＹＴＯ９／ＰＩ蛍光染色試薬を０．９μｌ添加して、遮光下、室温で１５分間反応させて各試料を調製した。

（２）試験方法
前記で調製した各試料について、対照例１と同様の方法にてＦＣＭにより測定（測定時間：５分）を行った。

（３）試験結果
本試験の結果を図５に示す。前記対照例２で示したとおり、図２においては、ＬＰ処理法によるＵＨＴホモ牛乳から、生きた大腸菌を検出する際、大腸菌（生菌）の存在を示すＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）領域に、多数の体細胞や損傷菌の夾雑成分の混在があり、その結果、検出限界は１．１×１０⁴ｃｆｕ／ｍｌと高い値であった。

しかしながら、本試験の結果から明らかなように、大腸菌を接種していないＬＰ処理、ＥＭＡ処理ＵＨＴホモ牛乳によるＳＹＴＯ９／ＰＩプロットにおいて、ＳＹＴＯ９強度が１×１０¹〜５×１０¹に抑制され、生菌の存在を示すＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）領域には、ほとんどプロットされなかった。

また、大腸菌（生菌）の接種濃度に応じてＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）領域のプロット数が変化した。接種濃度に応じた本領域のプロット数を表４に示した。本試験条件では、ＵＨＴホモ牛乳におけるＬＰ処理及びＥＭＡ処理法（ＬＰＥ処理法）による大腸菌（生菌）の検出限界は、６．０×１０²ｃｆｕ／ｍｌと考えられる。

更に、前記のＬＰ処理及びＥＭＡ処理に用いた試料の量を１ｍｌから１０ｍｌに変更し、前記と同様の手法によりＬＰ処理及びＥＭＡ処理（リパーゼ、プロテイナーゼＫ、ＥＭＡの各濃度は同一）を施し、フローサイトメーターにより測定を行った。ＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）領域のプロット数を計測した結果を表５に示した。本試験条件では、ＵＨＴホモ牛乳における大腸菌（生菌）の検出限界は６．０×１０¹ｃｆｕ／ｍｌと考えられる。この結果を、前記対照例２に記載されたＬＰ処理法の検出限界１．１×１０⁴ｃｆｕ／ｍｌと比較すると、１／（１．８×１０²）程度の低濃度まで大腸菌（生菌）の検出限界が向上した。

表皮ブドウ球菌について、ＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）領域のプロット数を計測した結果を表６に示した。それによれば、ＵＨＴホモ牛乳中の表皮ブドウ球菌（生菌）の検出限界は１．９×１０⁴ｃｆｕ／ｍｌとなった。大腸菌よりも検出限界の数値が高い原因としては、ＬＰ処理の途中において形成される脂肪層に、表皮ブドウ球菌は極めて吸着する傾向があること、及び、前記図１の結果が示す通り、表皮ブドウ球菌（生菌）は未処理の場合、大半がＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）領域の生菌領域にプロットされるのと比較して、ＬＰ処理を施した場合、ＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）領域の生菌領域のプロット数が激減することであると考えられる。

［実施例３］エチジウム・モノ・アザイド（ＥＭＡ）処理した、ＬＴＬＴノンホモ牛乳に懸濁した大腸菌及び表皮ブドウ球菌の生菌及び損傷菌（ＬＰ処理）のフローサイトメーターによる検出
（１）試料の調製
対照例１と同様の方法で調製した１．５×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌懸濁液（生菌及び損傷菌）１ｍｌに、対照例２で使用したＬＴＬＴノンホモ牛乳９ｍｌを添加して１０倍希釈し、さらに同様の希釈法により順次希釈を行って、それぞれ１．５×１０²〜１．５×１０⁶ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌（生菌及び損傷菌）接種ＬＴＬＴノンホモ牛乳を調製した。

また、対照例１と同様の方法で調製した１．８×１０⁸ｃｆｕ／ｍｌの表皮ブドウ球菌懸濁液（生菌及び損傷菌）１ｍｌに、前記対照例２で使用したＬＴＬＴノンホモ牛乳９ｍｌを添加して１０倍希釈し、さらに同様の希釈法により順次希釈を行って、それぞれ１．８×１０²〜１．８×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌの表皮ブドウ球菌（生菌及び損傷菌）接種ＬＴＬＴノンホモ牛乳を調製した。さらにこれとは別に、菌を接種していないＬＴＬＴノンホモ牛乳を用意した。

大腸菌（生菌及び損傷菌）接種ＬＴＬＴノンホモ牛乳、表皮ブドウ球菌（生菌及び損傷菌）接種ＬＴＬＴノンホモ牛乳、及び菌を接種していないＬＴＬＴノンホモ牛乳について、前記実施例２と同様のリパーゼ処理及びプロテイナーゼＫ処理（ＬＰ処理）、並びにＥＭＡ処理を行った。次いで、生理食塩水を９９０μｌ添加し、４℃で１４，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離を行った。上層の水層を除去した後、下層のペレットに３００μｌの生理食塩水を添加し、次いで、ＳＹＴＯ９／ＰＩ蛍光染色試薬を０．９μｌ添加して、遮光下、室温で１５分間反応させて各試料を調製した。

（２）試験方法
前記で調製した各試料について、対照例１と同様の方法にてＦＣＭにより測定（測定時間：５分）を行った。

（３）試験結果
本試験の結果を図６、図７に示す。前記対照例３で示したとおり、図３においては、ＬＰ処理法によるＬＴＬＴノンホモ牛乳から、生きた大腸菌及び表皮ブドウ球菌を検出する際、大腸菌（生菌）及び表皮ブドウ球菌（生菌）の存在を示すＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）領域に、多数の体細胞や損傷菌の夾雑成分の混在があり、その結果、大腸菌の検出限界は１．５×１０⁵ｃｆｕ／ｍｌであり、表皮ブドウ球菌の検出限界は１．８×１０⁶ｃｆｕ／ｍｌであって、ともに高い値であった。

しかしながら、本試験の結果から明らかなとおり、菌を接種していないＬＰ処理、及びＥＭＡ処理（ＬＰＥ処理）ＬＴＬＴノンホモ牛乳によるＳＹＴＯ９／ＰＩプロットにおいて、ＳＹＴＯ９強度が、５×１０²以下に抑制され、生菌の存在を示すＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）領域にはプロットされなかった。

また、大腸菌（生菌）の接種濃度に応じてＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）領域のプロット数が変化した。接種濃度に応じた本領域のプロット数を表７に示した。本試験条件では、ＬＴＬＴノンホモ牛乳におけるＬＰ処理及びＥＭＡ処理法（ＬＰＥ処理法）による大腸菌（生菌）の検出限界は１．５×１０⁴ｃｆｕ／ｍｌと考えられる。また、大腸菌（損傷菌）を１．５×１０⁶ｃｆｕ／ｍｌの濃度で接種したＬＴＬＴノンホモ牛乳に、ＬＰＥ処理を施し、生菌の存在を示唆するＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）領域のプロット数を検討した結果、ほとんど存在しなかった。従って、ＬＰＥ処理法は、大腸菌の生菌と損傷菌を明確に識別した。

表皮ブドウ球菌について、ＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）領域のプロット数を計測した結果を表８に示した。それによれば、ＵＨＴホモ牛乳中の表皮ブドウ球菌（生菌）の検出限界は１．８×１０⁵ｃｆｕ／ｍｌとなった。表皮ブドウ球菌の検出限界が大腸菌のそれと比較して高かった要因は、実施例２と同様と考えられる。

［実施例４］各種トポイソメラーゼ阻害剤、及びＤＮＡジャイレース阻害剤の効果の検討
前記実施例１又は２で使用したエチジウムモノアザイドと活性が類似する他のトポイソメラーゼ阻害剤に属する化合物（アムサクリン、エリプチシン、カンプトセシン）、又はＤＮＡジャイレース阻害剤に属する化合物（シプロフロキサシン）を用いて、市販の牛乳に懸濁した大腸菌（生菌）及び表皮ブドウ球菌（生菌）に処理を行った場合について、フローサイトメーターによる検出の検討を行った。

（１）試料の調製
対照例１と同様の方法で調製した７．５×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌懸濁液（生菌）１ｍｌに、ＵＨＴホモ牛乳９ｍｌを添加して１０倍希釈し、７．５×１０⁶ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌（生菌）接種ＵＨＴホモ牛乳を調製した。

また、対照例１と同様の方法で調製した２．０×１０⁸ｃｆｕ／ｍｌの表皮ブドウ球菌懸濁液（生菌）１ｍｌに、ＵＨＴホモ牛乳９ｍｌを添加して１０倍希釈し、２．０×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌの表皮ブドウ球菌（生菌）接種ＵＨＴホモ牛乳を調製した。これとは別に、菌を接種していないＵＨＴホモ牛乳を用意した。

大腸菌（生菌）接種ＵＨＴホモ牛乳、表皮ブドウ球菌（生菌）接種ＵＨＴホモ牛乳、及び菌を接種していないＵＨＴホモ牛乳を、それぞれ２ｍｌ容のマイクロチューブに１ｍｌずつ添加し、対照例１と同様にリパーゼ処理及びプロテイナーゼＫ処理（ＬＰ処理）をした後、８８０μｌの生理食塩水を添加して、４℃で１４，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離を行った。上層の脂肪層を綿棒により除去した後、中間層の水層も除去した。次いで、下層（沈殿物）の菌体にそれぞれ滅菌水１ｍｌを添加して、各ＬＰ処理済懸濁液を調製した。

これら各ＬＰ処理済懸濁液に対して、ａ）アムサクリン、ｂ）エリプチシン、ｃ）カンプトセシン、ｄ）シプロフロキサシンの各溶液による処理を行い、ＳＹＴＯ９／ＰＩ蛍光染色試薬を添加してＦＣＭ測定用の各試料を調製した。具体的には以下のａ）〜ｄ）に示すとおりである。

ａ）アムサクリン処理
前記の各ＬＰ処理済懸濁液に、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に１ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したアムサクリン（シグマ社製、カタログ番号：A9809）溶液を１０μｌ添加して、３７℃で１０分間放置した。次いで、滅菌水を添加して全量を２ｍｌとし、４℃で１４，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離を行い、上層の水層を除去した後、下層のペレットに３００μｌの生理食塩水を添加し、次いで、ＳＹＴＯ９／ＰＩ蛍光染色試薬を０．９μｌ添加して、遮光下、室温で１５分間反応させて試料を調製した。

ｂ）エリプチシン処理
前記の各ＬＰ処理済懸濁液に、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に０．１ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したエリプチシン（シグマ社製、カタログ番号：E3380）溶液を５μｌ添加して、３７℃で３０分間放置した。次いで、滅菌水を添加して全量を２ｍｌとし、４℃で１４，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離を行い、上層の水層を除去した後、下層のペレットに３００μｌの生理食塩水を添加し、次いで、ＳＹＴＯ９／ＰＩ蛍光染色試薬を０．９μｌ添加して、遮光下、室温で１５分間反応させて試料を調製した。

ｃ）カンプトセシン処理
前記の各ＬＰ処理済懸濁液に、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に１ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したカンプトセシン（シグマ社製、カタログ番号：C9911）溶液を１０μｌ添加して、３７℃で３０分間放置した。次いで、滅菌水を添加して全量を２ｍｌとし、４℃で１４，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離を行い、上層の水層を除去した後、下層のペレットに３００μｌの生理食塩水を添加し、次いで、ＳＹＴＯ９／ＰＩ蛍光染色試薬を０．９μｌ添加して、遮光下、室温で１５分間反応させて試料を調製した。

ｄ）シプロフロキサシン処理
前記の各ＬＰ処理済懸濁液それぞれに、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に０．５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したシプロフロキサシン（フルカ社製、カタログ番号：17850）溶液を８μｌ添加して、３７℃で３０分間放置した。次いで、滅菌水を添加して全量を２ｍｌとし、４℃で１４，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離を行い、上層の水層を除去した後、下層のペレットに３００μｌの生理食塩水を添加し、次いで、ＳＹＴＯ９／ＰＩ蛍光染色試薬を０．９μｌ添加して、遮光下、室温で１５分間反応させて試料を調製した。

（２）試験方法
前記で調製した各試料について、対照例１と同様の方法にてＦＣＭにより測定（測定時間：５分）を行った。

（３）試験結果
本試験の結果を図８に示す。

ＬＰ処理のみを施した場合、大腸菌（生菌）とＵＨＴホモ牛乳由来の夾雑成分（体細胞、損傷菌、カゼインミセルのＬＰ処理不完全分解物）のプロットが、一部重なる形で隣接しており（牛乳の種類やメーカーにより、菌を接種していないＬＰ処理ＵＨＴホモ牛乳の夾雑成分によるＳＹＴＯ９強度は１０³を大幅に越える場合があり、その場合、生菌と夾雑成分のプロットは相当数重なる）、大腸菌（生菌）を明確に識別できなかった。しかし、ＬＰ処理後、ａ）アムサクリン、ｂ）エリプチシン、ｃ）カンプトセシン、又はｄ）シプロフロキサシンの各溶液による処理を行うことによって、大腸菌（生菌）と夾雑成分のプロットが明確に分離され、その結果、大腸菌（生菌）の検出が容易になった。また、表皮ブドウ球菌においても同様の効果があった。

アムサクリン及びカンプトセシンは本実施例３の濃度において、前記の作用時間（それぞれ１０分及び３０分）内であれば、大腸菌や表皮ブドウ球菌（生菌）の細胞壁を透過しないが、瞬間殺菌により死細胞になっている体細胞の細胞膜や損傷菌の細胞壁は、透過した可能性が高い。体細胞内及び損傷菌の菌体内に進入した上記二薬剤は、染色体ＤＮＡと無秩序に共有結合し、体細胞内のトポイソメラーゼII又はトポイソメラーゼI、損傷菌の菌体内のトポイソメラーゼIV、トポイソメラーゼI、もしくはトポイソメラーゼIII、又は、ＤＮＡジャイレースによるＤＮＡ再結合を阻害することにより、染色体ＤＮＡを断片化し、その結果ＳＹＴＯ９の蛍光強度は低下するが、生菌の染色体ＤＮＡには影響を与えずＳＹＴＯ９強度は低下しないため、両者のプロットが明確に分離されたのだと考える。

エリプチシン、シプロフロキサシンも本実施例３の濃度において、前記の作用時間（３０分）内であれば、上記と同様、生菌の細胞壁を透過しないが、体細胞の細胞膜及び損傷菌の細胞壁は透過した可能性が高い。エリプチシンは体細胞内のトポイソメラーゼII、及び損傷菌の菌体内のＤＮＡジャイレース、又は、トポイソメラーゼIVの働きを利用しているものと考えられるが、これらの酵素によるＤＮＡ再結合を阻害するものではなく、これらの酵素によるＤＮＡ鎖切断を促進することにより、染色体ＤＮＡを断片化しているものと考えられる。尚、シプロフロキサシンは、損傷菌の菌体内のＤＮＡジャイレースによるＤＮＡ鎖再結合を阻害し、また体細胞内のトポイソメラーゼIIによるＤＮＡ鎖再結合についても阻害している可能性が高いと考えられる。

〔実施例５〕
グラム陰性細菌4種（大腸菌ＤＨ５α、クレブシェラ、シトロバクター、及びサルモネラ菌感）、グラム陽性細菌（表皮ブドウ球菌）を試験材料とし、ＥＭＡ処理とその処理後の染色体ＤＮＡ電気泳動像による生菌、損傷菌、及び死菌の識別

（１）試料の調製
１−１）４種のグラム陰性細菌（生菌、損傷菌、及び死菌）の懸濁液の調製
大腸菌ＤＨ５α、クレブシェラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）JCM 1665（以下「クレブシェラ」と略記することがある）、シトロバクター・コーセリ（Citrobacter koseri）JCM 1658（以下「シトロバクター」と略記することがある）、サルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteritidis）IID 604（ 以下「サルモネラ」と略記することがある）をBHIブロスにより37℃で培養し、対数増殖後期の培養液４０ｍｌを４℃で８，０００×g、１５分間冷却遠心分離し、上清を除去後、生理食塩水４０ｍｌを入れよく攪拌後、同様の冷却遠心を行い、上清を除去後１０ｍｌの生理食塩水を加え、生菌懸濁液とした。これらの生菌懸濁液の生菌数は、大腸菌：3.2×10⁸ｃｆｕ／ｍｌ、クレブシェラ：４．８×１０⁸ｃｆｕ／ｍｌ、シトロバクター：６．７×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌ、サルモネラ：１．９×１０⁸ｃｆｕ／ｍｌであった。又、各生菌懸濁液１ｍｌを１．５ｍｌマイクロチューブに入れ、沸騰水に５０秒浸積後氷水により急冷して、損傷菌懸濁液を調製した。又、大腸菌に関しては別途、生菌懸濁液１ｍｌを沸騰水に１２分浸積後氷水により急冷し、死菌懸濁液を調製した。損傷菌及び死菌懸濁液ともＬ寒天培地によりコロニーを形成しないことを確認した。

１−２）グラム陽性細菌（生菌、損傷菌、及び死菌）の懸濁液の調製
表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis ＫＤ株）をＢＨＩブロスにより３７℃で培養し、対数増殖期の培養液４０ｍｌを４℃で８，０００×g、１５分間冷却遠心分離し、上清を除去後、生理食塩水４０ｍｌを入れよく攪拌後、同様の冷却遠心を行い、上清を除去後１０ｍｌの生理食塩水を加え、生菌懸濁液とした。この生菌懸濁液の生菌数は、１．９×１０^８ｃｆｕ／ｍｌであった。又、生菌懸濁液１ｍｌを１．５ｍｌマイクロチューブに入れ、沸騰水に５０秒浸積後氷水により急冷し、損傷菌懸濁液を調製した。また、別途、生菌懸濁液１ｍｌを沸騰水に１２分浸積後氷水により急冷し、死菌懸濁液を調製した。損傷菌及び死菌懸濁液ともＬ寒天培地によりコロニーを形成しないことを確認した。

尚、沸騰水への浸積時間―液温プロットを作製するために、予め室温にて１．５ｍｌマイクロチューブに１ｍｌの生理食塩水を入れ蓋を完全に閉め、蓋上部に僅かな穴をあけそこへ熱伝対式温度センサー（TX10; Yokogawa M£C社製）を入れた後、沸騰水にマイクロチューブをほぼ完全に浸積し、液温を経時的に測定した。

（２）試験方法
２−１）エチジウムモノアザイド処理及び可視光照射工程
前記グラム陰性細菌（生菌、損傷菌、及び死菌）、グラム陽性細菌（生菌、損傷菌、及び死菌）の各懸濁液１ｍｌに対し、実施例３と同様にしてＥＭＡ処理を行った。尚、各懸濁液にＥＭＡ溶液を添加した後、可視光照射するまで、グラム陰性菌については遮光下で４℃、３０分放置し、グラム陽性菌については遮光下で４℃、５分間放置した。別途、前記グラム陰性細菌（生菌、損傷菌、及び死菌）及びグラム陽性細菌（生菌、損傷菌、及び死菌）の各１ｍｌに対し、ＥＭＡ溶液に代えて１０μｌの滅菌水を加え、以下ＥＭＡ処理と同様の処理を施した（ＥＭＡ未処理）。

２−２）ＤＮＡ抽出工程
前記グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌の生菌、損傷菌、及び死菌（ＥＭＡ未処理及び処理）の入った各マイクロチューブを４℃で１５，０００×g、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去した。各マイクロチューブに１ｍｌの生理食塩水を加えよく攪拌後、２ｍｌマイクロチューブに全量移し、４℃で１５，０００×g、１０分間冷却遠心分離し上清を除去し、菌体ペレットを得た。

グラム陽性細菌に関しては下記の方法によりＤＮＡを抽出した。各菌体ペレットに０．５ｍｌの５ｍＭ ＥＤＴＡを加え、予め１０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液により５ｍｇ／ｍｌに調製されたアクロモペプチダーゼ溶液（和光純薬社製、カタログ番号：014-09661）２０μｌを加え、５０℃で３０分間放置した。その後、０．５ｍｌの１０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ８．０）を加え、２０μlの１２５０Ｕ／ｍｌプロテイナーゼＫ（シグマ社製、カタログ番号：E.C.3.4.21.64）を加え、さらに予め滅菌水により１０％（ｗ／ｖ）に調製されたＳＤＳ溶液４００μｌ加え、５０℃で一夜間処理した。

各処理液を２本の２ｍｌ用マイクロチューブに半量ずつ分けて入れ、０．５ｍｌの飽和フェノールを加え、１５分間穏やかに混合した後、０．５ｍｌのクロロホルムを加え、５分間穏やかに混合した。４℃で６，０００×g、１０分間冷却遠心分離し、上層の水層を新しく用意した２ｍｌ容マイクロチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を７０μｌ、９９．５％冷エタノールを１．２１ｍｌ加え、穏やかに混合した。４℃で１５，０００×g、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去後、０．４ｍｌの７０％冷エタノールで洗浄した（以上の操作を「フェノール／クロロホルム抽出」と略記することがある）。ペレットに０．５ｍｌのＴＥバッファー（10mM Tris-HCl、1mM EDTA・2Na）を入れ４℃で一夜間放置してＤＮＡを溶解した。

上記ＤＮＡ溶液に、予め滅菌水により１０ｍｇ／ｍｌに調製したＲＮａｓｅ（シグマ社製、カタログ番号：EC 3.1.27.5）溶液５μｌを加え、３７℃で１時間インキュベーションした。フェノール／クロロホルム（１／１）を０．２５ｍｌ加え、１０分間穏やかに混合しクロロホルム０．２５ｍｌを更に加え、５分間穏やかに混合した。４℃で６，０００×g、１０分間冷却遠心分離し、上層の水層を新しい２ｍｌ容マイクロチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を５０μｌ、９９．５％冷エタノール１ｍｌを加え、穏やかに混合した。４℃で15,000×g、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去後、０．４ｍｌの７０％冷エタノールで洗浄しペレットを乾燥させた（以上の操作を「ＲＮａｓｅ」処理と略記することがある）。乾燥させたペレットに１２５μｌのＴＥバッファーを加え４℃一夜間放置することによりＤＮＡを溶解させた。精製ＤＮＡ溶液の濃度をＵＶ２６０ｎｍの吸光値ＯＤ₂₆₀（DNA 50μg/mlをOD=1、セル長1cm）により、又、精製ＤＮＡの純度をＯＤ₂₆₀／ＯＤ₂₈₀により評価した。

グラム陰性細菌に関しては下記の方法によりＤＮＡを抽出した。０．５ｍｌの１０ｍＭTris-HCl（ｐＨ８．０）を前記菌体ペレットに加え、１０μｌの１２５０Ｕ／ｍｌプロテイナーゼＫ（シグマ社製、カタログ番号：E.C. 3.4.21.64）を加え、予め滅菌水により１０％（ｗ／ｖ）に調製されたＳＤＳ溶液２００μｌ加え、５０℃で一夜間処理した。以下、前記グラム陽性細菌のＤＮＡ抽出工程と同様にしてＤＮＡ抽出を行った。

２−３）抽出ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動
Seakem GTGアガロース（FMC社製、カタログ番号：50070）とＴＡＥバッファー（Tris 4.84g/L; 酢酸1.142ml/L; EDTA・2Na 0.149g/L）により０．８％アガロースゲルを作製し、マーカーとしてλ-EcoT14I digest（宝酒造社製、Code:3401）及び100bp DNA Ladder（宝酒造社製、Code:3407A）を用い、各グラム陰性細菌、グラム陽性細菌に関してそれぞれ、生菌懸濁液・ＥＭＡ未処理、生菌懸濁液・ＥＭＡ処理、損傷菌懸濁液・ＥＭＡ未処理、損傷菌懸濁液・ＥＭＡ処理の順番でおよそ1μｇをウェルに注入し、１００Ｖで電気泳動を行い、ブロムフェノールブルー（ＢＰＢ）がゲルを９割程度泳動した時点で電気泳動を終了させた。別途、大腸菌と表皮ブドウ球菌に関しては、死菌懸濁液・ＥＭＡ未処理、死菌懸濁液・ＥＭＡ処理も同様の電気泳動を行なった。

１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド水溶液に電気泳動させたゲルを２０分間浸積し、ミリＱ水で2回洗浄後、ＵＶトランスイルミネーター（２５４ｎｍ）により染色体ＤＮＡの切断の度合いを観察した。

（３）試験結果
沸騰水への浸積時間と液温の関係を図９に示した。少なくとも沸騰水に５０秒浸積による熱処理は、高温短時間殺菌（ＨＴＳＴ殺菌）（72℃〜75℃、15秒〜16秒）よりやや強い殺菌処理に相当することを確認した。従って、前記熱処理は、食品の変性を抑制する目的の殺菌、すなわち、低温保持殺菌（ＬＴＬＴ殺菌）、超高温瞬間殺菌（ＵＨＴ殺菌）と同じ程度の熱処理に相当することを確認した。従って、前記（１）試料の調製の項に記載の方法によって調製した損傷菌は、これら食品の成分の変性を抑制する目的で殺菌された食品中の細菌と生化学的酵素学的に同等であり、物理的損傷も同等である。前記（１）試料の調製の項に記載の方法によって調製した死菌に関しては、図９によれば液温が１００℃に到達してから１０分保持され、しかも１００℃に到達するまでにも２分加熱されているので、死菌の菌体内の酵素は大半が失活しており、細胞壁の損傷も染色体ＤＮＡが一部菌体外に流出する程、損傷が激しい。

次に、各グラム陰性細菌の生菌と損傷菌の識別を図１０に、大腸菌の損傷菌と死菌の識別を図１１に、グラム陽性細菌（表皮ブドウ球菌）の生菌、損傷菌、及び死菌の識別結果を図１２に示す。図１０のλ-EcoT14I digestマーカー19329bpの僅か下に位置する染色体ＤＮＡ由来の極めて長いバンド（ＬＬバンド）に焦点を当てて、そのバンドが存在する場合を（＋）、存在しない場合を（−）とし、ＥＭＡ未処理・ＥＭＡ処理の順でそのバンドの結果を記載すると、４種のグラム陰性細菌に関して、生菌は（＋）・（＋）パターン、損傷菌は（＋）・（−）パターンとなった。また、図１１の大腸菌の損傷菌と死菌のそれぞれのパターンは、前者が（＋）・（−）パターン、後者が（−）・（−）となった。従って、ＥＭＡにより生菌、損傷菌、及び死菌の一斉識別が可能となった。図１２も同様に、グラム陽性細菌の表皮ブドウ球菌についても、生菌、損傷菌、及び死菌の識別が可能であることを示している。

ＥＭＡは哺乳動物細胞のトポイソメラーゼII阻害剤として、特に分裂速度の速いヒト腫瘍細胞のトポイソメラーゼIIに作用し、その酵素のＤＮＡ切断―リライゲーションという働きの内でリライゲーションをＥＭＡは阻害するため、結果として癌細胞の染色体ＤＮＡが至る所で切断され死に至らしめる抗癌剤として期待されている。ＥＭＡは本来細胞膜透過性が弱く、細菌学分野への適用に当たっては、特表２００３−５３０１１８号公報において記載されているように、細菌の生菌細胞壁は透過できず損傷した死菌の細胞壁は透過して死菌の染色体ＤＮＡにクロスリンクするという所謂ＤＮＡクロスリンク剤として位置付けられているだけである。本実施例においても図１０に示す通り、生菌の場合、ＥＭＡを３０分作用させたことにより染色体ＤＮＡが特別切断を受けるという現象はなく、損傷菌にＥＭＡを同時間作用させることにより損傷菌染色体ＤＮＡが明らかに激しい切断が生じたことから、ＥＭＡは生菌の細胞壁はそれ程透過せず、損傷菌の細胞壁は大部分が透過したということが示唆されている。特筆すべきことは、ＥＭＡは本来、哺乳動物細胞のトポイソメラーゼIIのリライゲーションによる働きを阻害し結果として染色体ＤＮＡが至るところで切断することになり哺乳動物細胞を死に至らしめるが、本実施例においては、ＥＭＡは生菌には影響を与えず、損傷菌体内の活性を残存しているバクテリアＤＮＡジャイレース、及び／又はバクテリア・トポイソメラーゼIVの働きを阻害し、損傷菌の染色体ＤＮＡを至る所で切断したと解釈できるところである。

〔実施例６〕
ＥＭＡ処理した大腸菌及び表皮ブドウ球菌の生菌、損傷菌、死菌のＦＣＭによる一斉識別
（１）試料の調製
１−１）大腸菌（生菌、損傷菌、及び死菌）の懸濁液の調製
前記実施例５の（１）試料の調製、１−１）に従い、大腸菌の生菌、損傷菌、及び死菌の調製を行なった（生菌数：４×１０^６ｃｆｕ／ｍｌ；損傷菌：４×１０^６ｃｆｕ／ｍｌ；死菌：４×１０^６ｃｆｕ／ｍｌ）。

１−２）表皮ブドウ球菌（生菌、損傷菌、及び死菌）の懸濁液の調製
実施例５、（１）試料の調製、１−２）に従い、表皮ブドウ球菌の生菌、損傷菌、及び死菌の調製を行なった（生菌数：４×１０^７ｃｆｕ／ｍｌ；損傷菌：４×１０^７ｃｆｕ／ｍｌ；死菌：４×１０^７ｃｆｕ／ｍｌ）。

（２）試験方法
２−１）エチジウムモノアザイド処理及び可視光照射工程
１０００μｇ／ｍｌのＥＭＡ水溶液を、前記大腸菌の生菌、損傷菌懸濁液、及び死菌懸濁液のそれぞれ１ｍｌに対し１０μｌずつ添加し、遮光下で、４℃、３０分間放置した。その後、懸濁液を氷上に置き、懸濁液から２０ｃｍの距離に設置した５００Ｗの可視光線（FLOOD PRF:100V 500W、岩崎電気社製）を１０分間照射した。表皮ブドウ球菌の生菌、損傷菌、及び死菌についても同様の処理を行なった。

２−２）核染色及びＦＣＭ測定
前記各ＥＭＡ処理液を４℃で１５，０００×ｇ、１５分間冷却遠心分離し、上清を除去後、生理食塩水１ｍｌを加えてよく攪拌し同様の冷却遠心を行ない上清を除去し、１ｍｌの生理食塩水を加えた。ＳＹＴＯ９／ＰＩ蛍光染色試薬（LIVE/DEAD BacLight^TMBacterial Viability kit、モレキュラープローブス社製：ＳＹＴＯ９／ＰＩ＝１／１混合液）を３μｌ添加し、遮光下、室温で１５分間反応させて各試験溶液を調製し、ＦＣＭ測定装置FACSCalibur（ベクトン・デイッキンソン社製）により測定を行なった。測定条件は対照例１と同様である。

（３）試験結果
大腸菌の生菌、損傷菌、及び死菌のＥＭＡ処理前後のＦＣＭによる各試験結果を図１３に、表皮ブドウ球菌のそれら結果を図１４に示す。

ＳＹＴＯ９による染色強度の境界値を強度１０^３に設定し、それを超えるとＳＹＴＯ９（＋）、それを下回るとＳＹＴＯ９（−）とし、ＰＩによる染色強度の境界値を強度２×１０^２に設定し、それを超えるとＰＩ（＋）、それを下回るとＰＩ（−）と表記すれば、大腸菌の生菌の主たる分布はＥＭＡ処理前でＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）であり、損傷菌の主たる分布もＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）であり、死菌の主たる分布はＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（＋）であった。すなわち、ＥＭＡ無処理の状態であれば、生菌と損傷菌とは識別が不可能であるが、損傷菌と死菌は無処理の段階においても識別は可能であった。さらに、ＥＭＡ処理を行なうと、生菌の主たる分布はＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）と変化せず、損傷菌の主たる分布はＳＹＴＯ９（−）・ＰＩ（−）とＳＹＴＯ９の強度が大幅に低下し分布が大きく左にシフトするので、生菌と損傷菌は明確に識別可能である。無処理の場合、生菌、損傷菌、及び死菌の一斉識別は不可能であるが、EMA処理により死菌の主たる分布がＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（＋）からＳＹＴＯ９（−）・ＰＩ（＋）に変化するものの、ＥＭＡ処理後の生菌、損傷菌、及び死菌の主たる分布が重なることはなく、それらの一斉識別が可能となった。

損傷菌の場合、損傷菌体内の酵素活性は残存しており且つ代謝活性もあるので、ＥＭＡが損傷菌の細胞壁を透過し損傷菌染色体ＤＮＡにクロスリンクすることにより損傷菌体内のバクテリアＤＮＡジャイレースによるリライゲーションの働きを阻害し、結果として染色体ＤＮＡが至る所で切断された状態が保持され高度に断片化し、それは特にＳＹＴＯ９のインターカレート数の低減に繋がるため染色強度が低下する。死菌の場合、代謝機能は停止しており遺伝子の転写も行われていないが、バクテリアＤＮＡジャイレース、バクテリア・トポイソメラーゼIVは耐熱性があるため活性が一部残存し、上記酵素は独自で機能していることが示唆されている。そのため、ＥＭＡ処理を行なうとＳＹＴＯ９の染色強度の大幅な低減が認められると推定される。

〔実施例７〕
マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis H37RA；以下、「結核菌」と略記することがある）及びリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes JCM 2873；以下、「リステリア」と略記することがある）生菌、損傷菌、死菌のＦＣＭによる一斉識別

（１）試料の調製
１−１）結核菌（生菌、損傷菌、及び死菌）の懸濁液の調製
結核菌を小川培地の寒天斜面に塗抹し、３７℃、３週間（酸素２０％；炭酸ガス５％環境下）培養後、０．０５％ツイーン８０含有ソートン液体培地に接種し上記好気条件下、３７℃、３週間培養した。培養液を０．０５％ツイーン８０含有生理食塩水により段階希釈を行ない、Middlebrookの７Ｈ１０寒天平板培地により培養し、７．７×１０^８ｃｆｕ／ｍｌの生菌数を確認した。その培養液２ｍｌを新しく調製した２００ｍｌの０．０５％ツイーン８０含有ソートン液体培地に接種し、１５０ｍｇ／ｍｌ（滅菌水に溶解）リファンピシン溶液２００μｌ（終濃度１４８．５μｇ／ｍｌ）を添加し更に１０ｍｇ／ｍｌ（滅菌水に溶解）イソニコチン酸ヒドラジド１００μｌ（終濃度５μｇ／ｍｌ）を添加し、上記好気条件下、３７℃、３ヶ月培養した。培養１ヶ月経過時点で結核菌の生菌数測定を７Ｈ１０培地により行なったがコロニーは形成されないことを確認した。

前記３ヶ月培養液約２００ｍｌを４℃で８，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上清を完全に除去後、０．０５％ツイーン８０含有生理食塩水２００ｍｌを加え攪拌後、再度同様の冷却遠心分離を行ない完全に上清を除去した。更に１回洗浄操作を行ない、上清がリファンピシン由来の茶色を呈していないことを確認した。冷却遠心分離後のペレットに２０ｍｌの０．０５％ツイーン８０含有生理食塩水を加え結核菌損傷菌懸濁溶液を調製した。

上記結核菌損傷菌懸濁液中の菌数の測定は以下の方法に従った。すなわち、上記７．７×１０^８ｃｆｕ／ｍｌの結核菌の培養液（生菌）１ｍｌを採取し、４℃で、１５，０００ｒｐｍ、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去後、０．０５％ツイーン８０含有生理食塩水１ｍｌを加え攪拌後、同様の冷却遠心分離を行ない上清を完全に除去した。ペレットに１ｍｌの０．０５％ツイーン８０含有生理食塩水１ｍｌを加えた（結核菌生菌懸濁溶液：５．２×１０^８ｃｆｕ／ｍｌ）。更に、０．０５％ツイーン８０含有生理食塩水により１／１０、１／１００、１／１０００、１／１００００倍希釈液を作製し、それらの可視光線６００ｎｍによる吸光度ＯＤ_{６００ｎｍ}測定を行なった。結核菌の生菌数濃度とＯＤ値をプロットして検量線を作成し、上記結核菌損傷菌懸濁液のＯＤ値から、損傷菌の濃度を算出した（結核菌損傷菌懸濁溶液の損傷菌数：６×１０^７ｃｆｕ／ｍｌ）。

新たに調製した結核菌生菌懸濁溶液を損傷菌懸濁溶液のＯＤ値と同じになるように０．０５％ツイーン８０含有生理食塩水により希釈を行なった。

また、損傷菌数と同濃度の結核菌生菌懸濁液を沸騰水に１２分間浸積することにより、結核菌死菌懸濁溶液を調製した。抗結核剤の長期投与により結核菌が損傷状態では無く死菌状態になることは抗結核剤の作用機序からして不可能、又は、不確かなため、加熱処理により死菌を調製した。

１−２）リステリア（生菌、損傷菌、及び死菌）の懸濁液の調製
リステリアをＬブロスに接種して３０℃、４８時間培養を行なった（３×１０^８ｃｆｕ／ｍｌ）。その培養液３ｍｌを３００ｍｌのＬブロスに接種し、１００ｍｇ／ｍｌ（滅菌水に溶解）アンピシリン溶液１．５ｍｌ及び１００ｍｇ／ｍｌ（滅菌水に溶解）ゲンタマイシン溶液６００μｌ添加し（それぞれ終濃度５００μｇ／ｍｌ及び２００μｇ／ｍｌ）、３０℃、３週間培養した。培養後、Ｌ寒天培地によりコロニーを形成しないことを確認した。その約２００ｍｌの培養液を４℃で、８０００×ｇ、１５分間冷却遠心分離し、上清を完全に除去した。ペレットに３００ｍｌの生理食塩水を加え攪拌後、同様の冷却遠心分離を行ない上清を完全に除去後、ペレットに対して３ｍｌの生理食塩水を加えリステリア損傷菌懸濁溶液を調製した。結核菌損傷菌数の測定と同様の手法により、リステリア損傷菌懸濁溶液の損傷菌数を測定した（２×１０^８／ｍｌ）。

別途、実施例６、（１）試料の調製、１−１に従いリステリア生菌懸濁液を調製後、リステリア損傷菌溶液のＯＤ値と同じＯＤ値になるよう生理食塩水で希釈した。

また、損傷菌濃度と同濃度のリステリア生菌懸濁液を沸騰水に１２分間浸積することにより、リステリア死菌懸濁溶液を調製した。

（２）試験方法
２−１）エチジウムモノアザイド処理及び可視光照射工程
１０００μｇ／ｍｌのＥＭＡ水溶液を、前記結核菌の生菌懸濁液、損傷菌懸濁液、死菌懸濁液、リステリアの生菌懸濁液、損傷菌懸濁液、及び死菌懸濁液のそれぞれ１ｍｌに対し結核菌に関しては３０μl添加し（終濃度およそ３０μｇ／ｍｌ）、リステリアに関しては１０μｌ添加した（終濃度およそ１０μｇ／ｍｌ）。結核菌に関しては遮光下で４℃、２．５時間、リステリアに関しては４℃、５分間放置した。その後、懸濁液を氷上に置き、懸濁液から２０ｃｍの距離に設置した５００Ｗの可視光線（FLOOD PRF: 100V 500W、岩崎電気社製）を５分間照射した。

２−２）核染色及びフローサイトメトリー測定
前記各ＥＭＡ処理液を４℃で１５，０００×ｇ、１５分間の冷却遠心分離し、上清を除去後、結核菌に関しては０．０５％ツイーン８０含有生理食塩水１ｍｌ、リステリアに関しては生理食塩水１ｍｌを加えてよく攪拌し同様の冷却遠心処理を行ない上清を除去し、結核菌に関しては０．０５％ツイーン８０含有ソートン液体培地１ｍｌを、リステリアに関しては１ｍｌの生理食塩水を加えた。結核菌に関しては、３７℃、２４時間培養を行なった後、４℃で１５，０００×ｇ、１５分間冷却遠心分離し上清を除去後、１ｍｌの０．０５％ツイーン８０含有生理食塩水１ｍｌを加えた。

各処理液１ｍｌにＳＹＴＯ９／ＰＩ蛍光染色試薬（LIVE/DEAD BacLight^TM Bacterial Viability kit、モレキュラープローブス社製：ＳＹＴＯ９／ＰＩ＝１／１混合液）を３μｌ添加し、遮光下、室温で１５分間反応させて各試験溶液を調製し、ＦＣＭ測定装置FACSCalibur（ベクトン・デイッキンソン社製）により測定を行なった。尚、測定条件は対照例１と同様であった。

（３）試験結果
結核菌の生菌、イソニコチン酸ヒドラジド・リファンピシン処理された損傷菌、及び死菌のＥＭＡ処理前後のＦＣＭによる各試験結果を図１５に、リステリアの生菌、アンピシリン・ゲンタマイシン処理された損傷菌、及び死菌のＥＭＡ処理前後の各試験結果を図１６に示す。

実施例６の（３）試験結果と同様に、ＳＹＴＯ９による染色強度の境界値を強度１０^３に設定し、それを超えるとＳＹＴＯ９（＋）、それを下回るとＳＹＴＯ９（−）とし、ＰＩによる染色強度の境界値を強度２×１０^２に設定し、それを超えるとＰＩ（＋）、それを下回るとＰＩ（−）と表記した。ＥＭＡ処理により結核菌の生菌とイソニコチン酸ヒドラジド・リファンピシン処理された結核菌損傷菌の識別が可能なことは図１５より明らかである。死菌に関しては、ＥＭＡ添加前に、すでに生菌及び損傷菌の識別がＳＹＴＯ９／ＰＩにより行われており、さらに、死菌も主たる分布がＥＭＡ処理によりＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（＋）からＳＹＴＯ９（±）・ＰＩ（±）にシフトするものの、ＥＭＡ処理された生菌と損傷菌の主たる分布とは重ならないので、生菌、損傷菌、及び死菌の一斉識別が可能となる。結核菌損傷菌のＳＹＴＯ９強度はＥＭＡ処理により大幅に左にシフトし、ＥＭＡ処理によりＳＹＴＯ９（＋）・ＰＩ（−）がＳＹＴＯ９（−）・ＰＩ（−）になる。リファンピシンは細菌のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットに結合し、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ上のプロモーターに結合するのを阻害する。その結果、転写反応の開始が抑制される。既にプロモーターに結合したＲＮＡポリメラーゼには作用しないので、転写反応途中のものは阻害を受けない。従って、リファンピシン添加前に産生されていた結核菌生菌体内のバクテリアＤＮＡジャイレース、バクテリア・トポイソメラーゼIV等の各種酵素はリファンピシン添加によりコロニー形成能力を消失した損傷菌状態になっても、活性は残存されたままでありリファンピシン作用機序より細胞壁も保たれたままである。イソニコチン酸ヒドラジドは細胞壁のミコール酸合成を阻害するが、これも既に形成されている細胞壁には大きな影響を及ぼさず、分裂途中で細胞が破壊されるまでには至らない。この状態でＥＭＡを添加することにより、バクテリアＤＮＡジャイレース、及び／又はバクテリア・トポイソメラーゼIVのリライゲーションが阻害され、結果として染色体ＤＮＡに至る所で切断現象が生ずることになり、ＤＮＡが断片化する。そのためＳＹＴＯ９のインターカレート効率が低下し損傷菌の染色強度が大幅に左にシフトすると考えられる。死菌の場合は実施例６の死菌と同様の作用機序によりＳＹＴＯ９の染色強度が明らかに低下している。尚、リステリアの生菌、損傷菌、及び死菌も結核菌と同様の現象を呈している。

［対照例４］
従来法による生菌、損傷菌、及び死菌の調製及びそれらの識別
（１）試料の調製と試験方法
１−１）食品衛生検査適用
大腸菌（２．６×１０^３〜２．６×１０^８ｃｆｕ／ｍｌ）及び表皮ブドウ球菌（６．７×１０^２〜６．７×１０^７ｃｆｕ／ｍｌ）の生菌生理食塩懸濁液（Ａ）を調製し、沸騰水に５０秒浸積後急冷したもの（Ｂ）、及び沸騰水に１２分浸積後急冷したもの（Ｃ）を作製した。これら（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）に対し、ＡＴＰ法及びエステラーゼ活性測定法により、同一の菌濃度において、生菌、損傷菌、又は、死菌と分類分けを行なった。そして、実施例５及び６において本発明の方法により生菌、損傷菌、又は死菌と判断された各種細菌の状態が、ＡＴＰ法（キッコーマンＡＴＰ測定用試薬キット・ルシフェール２５０プラス及びキッコーマンＡＴＰ消去用試薬キット・ルシフェールＡＴＰ消去試薬、キッコーマン株式会社製）及びエステラーゼ法（アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー２００２、６８：５２０９−５２１６）によりどの分類分けに相当するかを検討した。

１−２）臨床検査適用
結核菌生菌０．０５％ツイーン含有生理食塩水懸濁液（Ｄ１：５．３×１０^３〜５．３×１０^８ｃｆｕ／ｍｌ）及びリステリア生菌生理食塩懸濁液（Ｅ１：３．１×１０^４〜３．１×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ）を調製した。これらの生菌懸濁液を用いて、３ヶ月間イソニコチン酸ヒドラジド（ＩＮＨ：終濃度５μｇ／ｍｌ）・リファンピシン（ＲＥＦ：１５０μｇ／ｍｌ）処理した結核菌（Ｄ２）、３ヶ月間ストレプトマイシン（ＳＭ：３００μｇ／ｍｌ）・カナマイシン（ＫＭ：３００μｇ／ｍｌ）処理した結核菌（Ｄ３）、３ヶ月間ＲＥＦ（１５０μｇ／ｍｌ）・ＳＭ（３００μｇ／ｍｌ）処理した結核菌（Ｄ４）、３週間ゲンタマイシン（２００μｇ／ｍｌ）・アンピシリン（５００μｇ／ｍｌ）処理したリステリア菌（Ｅ２）を調製した。Ｄ１及びＥ１を沸騰水に１２分間浸積することにより死菌を調製し、上記全ての試料に対し、同一菌濃度においてＡＴＰ法及びエステラーゼ活性測定法により生菌、損傷菌、又は、死菌と分類分けを行ない、実施例６において本発明の方法により生菌、損傷菌、又は死菌と判断された各種細菌の状態がＡＴＰ法及びエステラーゼ法によりどの分類分けに相当するのかを検討した。

（２）試験結果及び考察
結果を図１７及び１８に示す。本発明の方法とＡＴＰ法との識別能の比較において、結核菌とリステリアに関しては完全に一致したが、大腸菌と表皮ブドウ球菌に関しては、ＡＴＰ法において死菌と見なされた状態のものが本発明の方法により損傷菌と死菌に分けられる結果となった。従って、損傷菌と死菌の微妙な識別を本発明の方法の方が高感度に行なえると考えられる。

また、エステラーゼ法では、大腸菌の場合、生菌のエステラーゼ活性が検出限界以下となり、１００℃、１２分間沸騰水に浸積した科学的に死菌と判断される状態のものからエステラーゼが検出限界以上となったため、測定自身に問題があると考えられる。それ以外の細菌を用いての本発明の方法とエステラーゼ法の識別能の比較については、リステリアについては双方間でほぼ一致したが、表皮ブドウ球菌及び結核菌においては、エステラーゼ法において死菌と見なされた状態のものが本発明の方法により損傷菌と死菌の二つの状態に分類されることが分かった。従って、損傷菌と死菌の微妙な識別には本発明の方法が好適であると考えられる。

〔実施例８〕
臨床検体からの生菌の検出
（１）試料の調製と試験方法
健康なヒト血液（Ａ型）をヘパリン採血し、この血液でリステリアの生菌懸濁液１．８×１０^８ｃｆｕ／ｍｌを１０倍希釈した。更に、前記血液を用いて段階希釈を行ない１．８×１０^３〜８×１０^７ｃｆｕ／ｍｌのリステリア菌（生菌）接種血液を調製した。

リステリア（生菌）未接種血液、各リステリア（生菌）接種血液１ｍｌを採取し、１０μlの１０００μｇ／ｍｌＥＭＡ水溶液を加え４℃により５分間遮光下で保持した。その後、５００Ｗの可視光を氷上で５分間照射した。そこへ７５０μｌの生理食塩水を加え、１８９Ｕ／ｍｌリパーゼ溶液２００μｌ、及び１００００Ｕ／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼ溶液１０μｌを加え、３０℃で３０分間保持した。その後、１２５０Ｕ／ｍｌプロテイナーゼＫ ４０μｌを加え、３０℃で３０分間保持した。予め２ｍｌのフィコールパックを充填した１５ｍｌ容ポリプロピレンチューブに上記ＥＭＡ処理血液の全量を丁寧に重層後、室温にて１００×ｇ、５分間遠心分離した。上清１ｍｌを採取し、４℃で１４０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去した。２００μｌの生理食塩水を加えＳＹＴＯ９／ＰＩ＝１／１の核染色剤０．６μｌを加え遮光下、室温にて１５分間放置した。その後、４℃で１４０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し上清を除去後、生理食塩水１ｍｌを加え同様の冷却遠心分離を行ない、上清を除去後生理食塩水２００μｌを加え、ＦＣＭ試験用試料とした。

尚、上記方法（「ＥＭＡ−ＬＮＰ−ＦＰ法」と記載する）からＥＭＡ処理を省いた操作（「ＬＮＰ−ＦＰ法」と記載する）を同時に実施し、ＦＣＭ試験用試料を調製した。

（２）試験結果
結果を、図１９に示す。ＥＭＡ−ＬＮＰ−ＦＰ法、及びＬＮＰ−ＦＰ法において、ＳＹＴＯ９（＋）強度２×１０^３以上、かつＰＩ（−）の各プロットが、リステリア（生菌）の接種濃度に比例しており、血液中のリステリア菌（生菌）の検出限界は１．８×１０^４ｃｆｕ／ｍｌと考えられた。また、ＥＭＡ処理によりＳＹＴＯ９（−）・ＰＩ（−）の夾雑成分のプロットは左にシフトしないことから、単球・リンパ球等の単核球、及び顆粒球という白血球細胞ではないと考えられる。白血球細胞は細胞壁を有さず細胞膜しかないため、損傷を受けていなくてもＥＭＡは透過する。更に、透過したＥＭＡは白血球細胞内のトポイソメラーゼIIによる染色体ＤＮＡの切断−再結合のうち再結合（リライゲーション）を阻害することにより、染色体ＤＮＡは至る所で切断されその状態が保持されるため、ＳＹＴＯ９の染色体ＤＮＡへのインターカレート効率は激減しその結果プロットは左に大きくシフトする。しかし、本試験ではその現象は見られていない。

また、染色体ＤＮＡを有さない赤血球は血液細胞の中で一番比重が高いため、フィコールパックを用いた低速遠心でも上清には混入するとは考えられず、事実、分離した赤血球をＳＹＴＯ９／ＰＩ染色しても本実施例のような夾雑プロットにはならない。更に、試料をリパーゼ、ヌクレアーゼ、プロテイナーゼＫ処理しているので、血液中に僅かに残存する脂肪、補体も夾雑成分として考えられない。

以上より、前記夾雑成分は、赤血球がリステリアに一部食されたか、又は、赤血球の一部が溶血したことによる細胞膜の分解破片と考えられる。本実施例においては、ＥＭＡ処理を行わなくても生菌の検出はある程度可能であった。しかしながら、単球、リンパ球等の単核球は、細菌と大きさ、内部構造の複雑さが近寄っており、それらが細菌（生菌）と同程度のＳＹＴＯ９・ＰＩ強度となることがあるため、それが混入すれば生菌と誤判断される。従って、ＥＭＡ処理を実施しておくことは、正確性の観点から見ればより好ましい。また、例えば、肝機能障害を起こしている敗血症患者由来の血液には、生菌の他に、抗生物質による損傷菌が大量に存在しているため、前記ＥＭＡ処理は同様の観点から必要である。

Claims (24)

1. 被検試料中の微生物の生菌、損傷菌及び死菌をフローサイトメトリーにより検出するための測定用試料を作製する方法であって、以下の工程を含む方法：
   ａ）被検試料を、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、又は脂肪を分解する活性を有する酵素で処理する工程、
   ｂ）前記被検試料を、アムサクリン（Amsacrine）、カンプトセシン（Camptothecin）、エリプチシン（Ellipticine）、シプロフロキサシン（Ciprofloxacin）から選択されるいずれかで処理する工程、及び
   ｃ）前記ａ）及びｂ）の工程で処理された被検試料を核染色剤で処理する工程。
2. 前記ａ）の工程の後にｂ）の工程を行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記被検試料が、乳、乳製品、乳若しくは乳製品を原料とする食品、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料又は胸水試料のいずれかである請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記微生物が細菌である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記酵素が、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素から選ばれる請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記核染色剤が、生菌、損傷菌、及び死菌の細胞壁を透過し得るＳＹＴＯ９と、ＳＹＴＯ９に比べて、生菌及び損傷菌よりも死菌の細胞壁をより透過しやすいヨウ化プロピジウムとを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 被検試料中の微生物の生菌、損傷菌及び死菌をフローサイトメトリーにより検出するための測定用試料を作製する方法であって、以下の工程を含む方法：
   ａ）被検試料を、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、又は脂肪を分解する活性を有する酵素で処理する工程、
   ｂ）前記被検試料をエチジウムモノアザイドで処理する工程、
   ｃ）エチジウムモノアザイドで処理した被検試料に可視光を照射する工程、及び
   ｄ）前記ａ）〜ｃ）の工程で処理された被検試料を、生菌、損傷菌、及び死菌の細胞壁を透過し得るＳＹＴＯ９と、ＳＹＴＯ９に比べて、生菌及び損傷菌よりも死菌の細胞壁をより透過しやすいヨウ化プロピジウムで処理する工程。
8. 前記ａ）の工程の後にｂ）の工程を行うことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. 前記被検試料が、乳、乳製品、乳若しくは乳製品を原料とする食品、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料又は胸水試料のいずれかである請求項７又は８に記載の方法。
10. 前記微生物が細菌である請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記酵素が、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素から選ばれる請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 被検試料中の微生物の生菌、損傷菌及び死菌をフローサイトメトリーにより検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
    ａ）被検試料を、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、又は脂肪を分解する活性を有する酵素で処理する工程、
    ｂ）前記被検試料をアムサクリン（Amsacrine）、カンプトセシン（Camptothecin）、エリプチシン（Ellipticine）、シプロフロキサシン（Ciprofloxacin）から選択されるいずれかで処理する工程、
    ｃ）前記ａ）及びｂ）の工程で処理された被検試料を核染色剤で処理する工程、及び
    ｄ）前記核染色剤で処理した被検試料中の微生物をフローサイトメトリーにより検出する工程。
13. 前記ａ）の工程の後にｂ）の工程を行うことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
14. 前記被検試料が、乳、乳製品、乳若しくは乳製品を原料とする食品、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料又は胸水試料のいずれかである請求項１２又は１３に記載の方法。
15. 前記微生物が細菌である請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記酵素が、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素から選ばれる請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記核染色剤が、生菌、損傷菌、及び死菌の細胞壁を透過し得るＳＹＴＯ９と、ＳＹＴＯ９に比べて、生菌及び損傷菌よりも死菌の細胞壁をより透過しやすいヨウ化プロピジウムとを含む、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 被検試料中の微生物の生菌、損傷菌及び死菌をフローサイトメトリーにより検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
    ａ）被検試料を、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、又は脂肪を分解する活性を有する酵素で処理する工程、
    ｂ）前記被検試料をエチジウムモノアザイドで処理する工程、
    ｃ）エチジウムモノアザイドで処理した被検試料に可視光を照射する工程、
    ｄ）前記ａ）〜ｃ）の工程で処理された被検試料を、生菌、損傷菌、及び死菌の細胞壁を透過し得るＳＹＴＯ９と、ＳＹＴＯ９に比べて、生菌及び損傷菌よりも死菌の細胞壁をより透過しやすいヨウ化プロピジウムで処理する工程、及び
    ｅ）前記核染色剤で処理した被検試料中の微生物をフローサイトメトリーにより検出する工程。
19. 前記ａ）の工程の後にｂ）の工程を行うことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
20. 前記被検試料が、乳、乳製品、乳若しくは乳製品を原料とする食品、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料又は胸水試料のいずれかである請求項１８又は１９に記載の方法。
21. 前記微生物が細菌である請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記酵素が、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素から選ばれる請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 被検試料中の微生物の生菌、損傷菌、及び死菌をフローサイトメトリーにより検出するための測定用試料を作製するためのキットであって、下記の要素を含むキット：
    脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素から選ばれる酵素、
    アムサクリン（Amsacrine）、カンプトセシン（Camptothecin）、エリプチシン（Ellipticine）、シプロフロキサシン（Ciprofloxacin）から選択されるいずれか、並びに
    核染色剤。
24. 被検試料中の微生物の生菌、損傷菌、及び死菌をフローサイトメトリーにより検出するための測定用試料を作製するためのキットであって、下記の要素を含むキット：
    脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素から選ばれる酵素、
    エチジウムモノアザイド、並びに
    ＳＹＴＯ９及びヨウ化プロピジウム。