WO1996009071A1 - Konjugat aus einem wirkstoff und einem nicht als körperfremd angesehenen, nativen protein - Google Patents

Konjugat aus einem wirkstoff und einem nicht als körperfremd angesehenen, nativen protein Download PDF

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WO1996009071A1
WO1996009071A1 PCT/DE1995/001323 DE9501323W WO9609071A1 WO 1996009071 A1 WO1996009071 A1 WO 1996009071A1 DE 9501323 W DE9501323 W DE 9501323W WO 9609071 A1 WO9609071 A1 WO 9609071A1
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linker
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protein
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PCT/DE1995/001323
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Hansjörg SINN
Hans-Hermann Schrenk
Wolfgang Maier-Borst
Gerd Stehle
Andreas Wunder
Dirk Hoff-Biederbeck
Dieter Ludwig Heene
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Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
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Definitions

  • the invention relates to a conjugate of an active ingredient and a native protein not regarded as foreign to the body, a method for producing such a conjugate and the use thereof.
  • a conjugate above also has a very high activity if a linker which can be cleaved in a cell is present between the active substance and the native protein which is not regarded as foreign to the body.
  • Such a conjugate is the subject of the present invention.
  • active ingredient includes compounds of any kind that can be used to treat a disease. These are, for example, connections to the therapy of tumor, infectious and / or autoimmune diseases. Examples of such compounds are chemotherapeutic agents, such as antibiotics, for example tetracyclines, and antimetaboiites, for example methotrexate, sulfonamides and nucleosides, which inhibit their replication or transcription after incorporation into a nucleic acid.
  • chemotherapeutic agents such as antibiotics, for example tetracyclines, and antimetaboiites, for example methotrexate, sulfonamides and nucleosides, which inhibit their replication or transcription after incorporation into a nucleic acid.
  • Preferred compounds of the above type are those which have an acid group, such as -CO 2 H, -SO 3 H, -PO 3 H 2 or -AsO 3 H 2 .
  • Particularly preferred compounds are 4- and 2-aminobenzoic acid, 4- and 2-aminophenyl
  • 2-aminophenylphosphonic acid 4- and 2-aminophenylarsonic acid and derivatives thereof.
  • Further preferred compounds are deoxyuridine (UDR), deoxycytidine (CDR), cytosine arabinoside (AraC), 5-fluorouracil (5-FU), 5-fluorodeesoxyuridine (5-FUDR), azidothymidine (AZT).
  • photoactive substances such as porphyrins, chlorines and bacteriochlorins, which are used for photodynamic therapy can be used.
  • the above compounds are present individually or in groups in a conjugate according to the invention. They are shown as educts, which means that they are present in a conjugate according to the invention in a derivatized form (see below, Examples 1-7 and Figures 1-3).
  • an above active ingredient is linked to a protein via a linker.
  • This protein is not considered foreign by the body. It is also native, i.e. unmodified, form before. Furthermore, the protein has a molecular weight
  • MG of up to 90,000, preferably it is albumin, in particular human serum albumin, or transferrin.
  • a protruding linker is fissile in a cell.
  • the term "cell” includes single cells and cell assemblies. Examples of the former are endogenous, not in one
  • a linker of the above type is known to the person skilled in the art. He also knows about factors, e.g. Enzymes that cause certain chemical bonds to break down in cells. This enables him to construct additional linkers that can be split in a cell. Such a linker favorably comprises an azo group. This is preferably split. It is particularly favorable if the linker has the following structure:
  • R is an organic group, preferably an aromatic, and particularly preferably phenylene or a derivative thereof, and Y is a group selected from C ⁇ 0), S (O) 2 , P (O) OH and As (O) OH is.
  • the above structure of a preferred linker corresponds to that which the linker has in a conjugate according to the invention.
  • the structure, at least when R is phenylene or a derivative thereof, comprises an active compound which is particularly suitable for the therapy of tumor, infection and autoimmune diseases.
  • the linker-bound protein can display its full activity (see below, Examples 3 to 7 and Figures 2 and 3).
  • FIGS. 1-3 Preferred conjugates of the present invention are shown in FIGS. 1-3.
  • a method for producing a conjugate as above In such a process, conventional chemical reactions, such as diazotization of an amino group and activation of an acid group, are used individually or combined. Reference is made to the preparation of the conjugates in Examples 1-7 and Figures 1-3.
  • Conjugates according to the invention are distinguished by the fact that they specifically accumulate active substances in certain cells of the body and allow them to fully develop their activity there. This is achieved by the combination of a protein, e.g. Albumin, and a linker cleavable in a cell. Certain cells in the body, in particular tumor cells, cells of inflammatory tissue and microorganisms, preferentially take up albumin and cleave the linker-active substance conjugate due to their enzymes, whereby the active substance (s) is (are) released and their (their) activity can fully unfold.
  • a protein e.g. Albumin
  • Conjugates according to the invention are therefore ideally suited for therapeutic purposes, in particular for the therapy of tumor, infection and autoimmune diseases.
  • conjugates according to the invention may be markings (for example radioactive markings) in conjugates according to the invention, as a result of which the conjugates also for diagnostic Purposes and therapy migration, if necessary can be used simultaneously for therapy.
  • markings for example radioactive markings
  • Group-containing linker is present, as well as the release of aminocytidine,
  • Figure 4 shows the growth inhibition of tumor cells by administering conjugates according to the invention.
  • Example 1 Preparation of a conjugate according to the invention from human
  • 4-aminophenylsulfonic acid (173 mg, 1 mmol) was dissolved in 5 ml of 2N HC. The solution was cooled in an ice bath and 600 ⁇ l of an ice-cooled 2.5 M NaNO 2 solution (1.5 mmol) were added with constant stirring Portions of 0.1 ml were added. After about 10 minutes, the excess nitrite was removed by adding urea. 4-Diazoniumphenylsulfonic acid (4-DAPS) was obtained.
  • the purity of the conjugate according to the invention was determined by means of HPLC (precolumn: Zorbax Diol 20 / ./(50x4mm), column 1: Zorbax GF 450, column 2: Zorbax GF 250, eluent: 0.2 M Na citrate, pH 7, 5, flow: 1 ml / min) checked.
  • Example 2 Preparation of a conjugate according to the invention from human
  • Example 3 Preparation of a conjugate according to the invention from cytidine, a linker containing an azo group and human serum malbumin (cytidine-4-DAPS-HSA)
  • the 4-DAPS was prepared as described in Example 1.
  • HSI N-hydroxysuccinimide
  • Example 4 Preparation of a conjugate according to the invention from UDR, a linker containing an azo group and human serum albumin (UDR-4-DAPS-HSA)
  • the conjugate according to the invention was prepared as described in Example 3, using UDR instead of cytidine.
  • UDR-4-DAPS-HSA was obtained.
  • Example 5 Preparation of a conjugate according to the invention from AraC, a linker containing an azo group and human serum albumin (AraC-4-DAPS-HSA)
  • the conjugate according to the invention was prepared as described in Example 3, using AraC instead of cytidine.
  • AraC-4-DAPS-HSA was obtained.
  • Example 6 Preparation of a conjugate according to the invention from CDR, a linker containing an azo group and human serum albumin (CDR-4-DAPS-HSA)
  • the conjugate according to the invention was prepared as described in Example, CDR being used instead of cytidine. CDR-4 DAPS-HSA was obtained.
  • Example 7 Preparation of a conjugate according to the invention from 7-chlorte tracyciin, a linker containing an azo group and human serum ibumin
  • Example 8 Preparation of a conjugate from tetracycline, a linker containing an azo group and human serum albumin
  • the conjugate was prepared as described in Example 7, using tetracycline instead of 7-chlorotetracycline.
  • the structure of the conjugate is shown in Fig. 3.
  • Example 9 Growth inhibition of tumor cells by administration of conjugates according to the invention
  • each of the conjugates according to the invention reduces the proliferation of tumor cells compared to the control.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Konjugat aus einem Wirkstoff und einem nicht als körperfremd angesehenen, nativen Protein, das sich dadurch auszeichnet, daß zwischen dem Wirkstoff und dem Protein ein in einer Zelle spaltbarer Linker vorliegt. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Konjugats und die Verwendung desselben.

Description

Konjugat aus einem Wirkstoff und einem nicht als körperfremd angesehenen, nativen Protein
Die Erfindung betrifft ein Konjugat aus einem Wirkstoff und einem nicht als körper¬ fremd angesehenen, nativen Protein, Verfahren zur Herstellung eines solchen Konjugates sowie dessen Verwendung.
Seit langem ist es ein großes Bedürfnis, Arzneimittel gezielt an bestimmte Orte im
Körper zu bringen und sie dort ihre Aktivität entfalten zu lassen. Ersteres ist durch ein vorstehendes Konjugat erreicht (vgl. DE - 41 22 210). Mit diesem kann eine tumoraktive Verbindung im Tumor angereichert werden.
Überraschenderweise hat sich nun gezeigt, daß ein vorstehendes Konjugat auch eine sehr hohe Aktivität aufweist, wenn zwischen dem Wirkstoff und dem nicht ais körperfremd angesehenen, nativen Protein ein in einer Zelle spaltbarer Linker vorliegt.
Ein derartiges Konjugat ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Der vorstehende Ausdruck "Wirkstoff" umfaßt Verbindungen jeglicher Art, die zur Therapie einer Erkrankung verwendet werden können. Dies sind z.B. Verbindungen zur Therapie von Tumor-, Infektions- und/oder Autoimmunerkrankungen. Beispiele solcher Verbindungen sind Chemotherapeutika, wie Antibiotika, z.B. Tetracycline, und Antimetaboiiten, z.B. Methotrexat, Sulfonamide und Nukleoside, die nach Einbau in eine Nukleinsäure deren Replikation bzw. Transkription inhibieren. Bevorzugte Verbindungen vorstehender Art sind solche, die eine Säuregruppe, wie -CO2H, -SO3H, -PO3H2 oder -AsO3H2, aufweisen. Besonders bevorzugte Verbindun- gen sind 4- und 2-Aminobenzoesäure, 4- und 2-Aminophenylsulfonsäure, 4- und
2-Aminophenylphosphonsäure, 4- und 2-Aminophenylarsonsäure sowie Derivate davon. Weiter bevorzugte Verbindungen sind Desoxyuridin (UDR), Desoxycytidin (CDR), Cytosinarabinosid (AraC), 5-Fluoruracil (5-FU), 5-Fluordesoxyuridin(5- FUDR), Azidothymidin (AZT).
Weitere Beispiele von Verbindungen als Wirkstoff sind photoaktive Substanzen, wie Porphyrine, Chlorine und Bakteriochlorine, die zur photodynamischen Therapie verwendet werden können.
Vorstehende Verbindungen liegen einzeln oder zu mehreren in einem erfindungs¬ gemäßen Konjugat vor. Sie sind als Edukte dargestellt, was bedeutet, daß sie in einem erfindungsgemäßen Konjugat in derivatisierter Form vorliegen (vgl. nach¬ stehend, Beispiele 1-7 und Figuren 1-3).
Ein vorstehender Wirkstoff ist über einen Linker an ein Protein gebunden. Dieses Protein wird vom Körper nicht als fremd angesehen. Auch liegt es in nativer, d.h. nicht-modifizierter, Form vor. Desweiteren hat das Protein ein Molekulargewicht
(MG) von bis zu 90000, vorzugweise ist es Albumin, insbesondere humanes Serumalbumin, oder Transferrin.
Ein vorstehender Linker ist in einer Zelle spaltbar. Der Ausdruck "Zelle" umfaßt Einzelzellen und Zellverbände. Beispiele ersterer sind körpereigene, nicht in einem
Verband vorliegende Zellen, z.B. Blutzellen und Virus-befallene Zellen, und körper¬ fremde Zellen, z.B. Mikroorganismen, wie Bakterien, Pilze und Protozoen. Zellver¬ bände umfassen Gewebe, Organe und Tumoren.
Ein Linker vorstehender Art ist dem Fachmann bekannt. Auch weiß er um Fakto¬ ren, z.B. Enzyme, die in Zellen die Spaltung bestimmter chemischer Bindungen bedingen. Somit ist er in der Lage, weitere Linker zu konstruieren, die in einer Zelle spaltbar sind. Günstigerweise umfaßt ein solcher Linker eine Azo-Gruppe. Diese wird bevorzugt gespalten. Besonders günstig ist es, wenn der Linker folgende Struktur aufweist:
,γ-R-N = N-
worin R eine organische Gruppe, vorzugsweise eine aromatische, und besonders bevor¬ zugt Phenylen oder ein Derivat davon ist, und Y eine aus C{0), S(O)2, P(O)OH und As(O)OH ausgewählte Gruppe ist. Vorstehende Struktur eines bevorzugten Linkers entspricht jener, die der Linker in einem erfindungsgemäßen Konjugat aufweist. Ferner umfaßt die Struktur, zu¬ mindest wenn R Phenylen oder ein Derivat davon ist, eine aktive Verbindung, die sich besonders für die Therapie von Tumor-, Infektions- und Autoimmunerkrankun- gen eignet. Nach Spaltung des Linkers und gegebenenfalls Abbau des noch am
Linker gebundenen Proteins kann die Verbindung ihre volle Aktivität entfalten (vgl. nachstehend, Beispiele 3 bis 7 und Figuren 2 und 3).
Bevorzugte Konjugate der vorliegenden Erfindung sind in den Figuren 1 -3 angege- ben.
Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zur Herstellung eines vorstehenden Konjugats bereitgestellt. In einem solchen Verfahren werden übliche Umsetzungen der Chemie, wie Diazotierung einer Aminogruppe und Aktivierung einer Säure- gruppe einzeln eingesetzt oder kombiniert. Es wird auf die Herstellung der Kon¬ jugate in den Beispielen 1 -7 und Figuren 1 -3 verwiesen.
Erfindungsgemäße Konjugate zeichnen sich dadurch aus, daß sie Wirkstoffe gezielt in bestimmten Zellen des Körpers anreichern und ihnen dort erlauben, ihre Aktivität voll zu entfalten. Dies wird durch die Kombination aus einem Protein, z.B. Albumin, und einem in einer Zelle spaltbaren Linker erreicht. Bestimmte Zellen im Körper, insbesondere Tumorzellen, Zellen entzündlicher Gewebe und Mikroorganismen, nehmen bevorzugt Albumin auf und spalten aufgrund ihrer Enzyme das Linker- Wirkstoff-Konjugat, wodurch der bzw. die Wirkstoff(e) freigesetzt wird (werden) und seine (ihre) Aktivität voll entfalten kann( können).
Erfindungsgemäße Konjugate eignen sich somit bestens für therapeutische Zwek- ke, insbesondere zur Therapie von Tumor-, Infektions- und Autoimmunerkrankun¬ gen.
Desweiteren können in erfindungsgemäßen Konjugaten Markierungen (z.B. radio¬ aktive Markierungen) vorliegen, wodurch die Konjugate auch für diagnostische Zwecke und Therapieüberwanderung, gegebenenfalls gleichzeitig zur Therapie eingesetzt werden können.
Kurze Beschreibung der Zeichnung.
Fig. 1 zeigt die Anbindung von 4-Aminophenylsulfonsäure oder 4-Amino phenylphosphonsäure an Albumin, wobei eine Azogruppe als Linke vorliegt,
Fig. 2 zeigt die Anbindung von Cytidin an Albumin, wobei ein eine Azo
Gruppe enthaltender Linker vorliegt, sowie die Freisetzung von Ami nocytidin,
Fig. 3 zeigt die Anbindung von Tetracyclin an Albumin, wobei ein eine Azo Gruppe enthaltender Linker vorliegt, und
Fig. 4 zeigt die Wachstumsinhibition von Tumorzellen durch Verabreichun erfindungsgemäßer Konjugate.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 : Herstellung eines erfindungsgemäßen Konjugats aus humane
Serumalbumin und 4-Aminophenylsulfonsäure, wobei ein Azogruppe als Linker vorliegt
Die Herstellung des Konjugats und seine Struktur sind in Fig. 1 gezeigt.
1. Diazotierung von 4-Aminophenylsulfonsäure:
4-Aminophenylsuifonsäure (173 mg, 1 mMol) wurden in 5 ml 2 N HC gelöst. Die Lösung wurde im Eisbad abgekühlt und unter ständigem Rühre wurden 600 μ\ einer eisgekühlten 2,5 M NaNO2-Lösung (1 ,5 mMol) i Portionen ä 0, 1 ml zugegeben. Nach etwa 10 min wurde der Überschuß an Nitrit durch Zugabe von Harnstoff beseitigt. Es wurde 4-Diazoniumphenyl- sulfonsäure (4-DAPS) erhalten.
2. Kopplung von 4-DAPS an humanes Serumalbumin (HSA):
Zu einer Lösung von 2 g HSA in 30 ml 0,17 M Bic wurde die unter 1. erhal¬ tene 4-DAPS-Lösung in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 langsam unter pH-Kontrolle und ständigem Rühren zugegeben, so daß der pH-Wert stets über 7,5 blieb. Schon während der Zugabe von 4-DAPS begann sich die
Lösung rot zu färben, wobei die Färbung mit fortschreitender Reaktions¬ dauer ständig zunahm. Die Abtrennung von Verunreinigungen, wie über¬ schüssiger Harnstoff oder Salze, erfolgte durch Ultrafiltration über eine YM 30 Membran in einer Amicon Druckfiltrationszelle. Es wurde ein Konjugat aus 4-Aminophenylsulfonsäure und HSA erhalten, wobei eine Azogruppe als
Linker vorliegt.
Die Reinheit des erfindungsgemäßen Konjugats wurde mittels HPLC (Vor¬ säule: Zorbax Diol 20 /./(50x4mm), Säule 1 : Zorbax GF 450, Säule 2: Zorbax GF 250, Laufmittel: 0,2 M Na-citrat, pH 7,5, Fluß: 1 ml/min) überprüft.
Beispiel 2: Herstellung eines erfindungsgemäßen Konjugats aus humanem
Serumalbumin und 4-Aminophenylphosphonsäure, wobei eine Azogruppe als Linker vorliegt
Die Herstellung des Konjugats und seine Struktur sind in Fig. 1 gezeigt.
Die Herstellung erfolgte, wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei anstatt 4-Aminophe- nylsulfonsäure die 4-Aminophenylphosphonsäure verwendet wurde. Beispiel 3: Herstellung eines erfindungsgemäßen Konjugats aus Cytidin einen eine Azogruppe enthaltenden Linker und humanem Seru malbumin (Cytidin-4-DAPS-HSA)
Die Herstellung des Konjugats und seine Struktur sind in Fig. 2 gezeigt.
Das 4-DAPS wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
1. Kopplung von 4-DAPS an Cytidin:
2,6 mMol Cytidin (etwa 600 mg) wurden in 6 ml 2 N NaOH gelöst un unter Rühren wurde die 4-DAPS-Lösung portionsweise (je 1 ml) zugegeben Die zunächst farblose Cytidin-Lösung nimmt schon während der Zugabe vo 4-DAPS eine zunehmend intensiv rote Färbung an. Nach Vervollständigun der Reaktion wurde die tiefrote Lösung mit 1 N HCI auf einen pH-Wert vo etwa 2 eingestellt und anschließend lyophiiisiert. Der nach dem Lyophilisie ren erhaltene trockene Rückstand wird anschließend in einem Gemisch vo 8 ml Methanol und 2 ml DMF gelöst und durch Filtration vom unlösliche Bodenkörper abgetrennt. Es wurde 5(4-Diazophenylsulfonsäure)-cytidin (5(
DAPS)-Cytidin) erhalten.
Die Reinheit des Produkts wurde mittels Dünnschichtchromatographi (Platten mit Fluoreszenz-Indikator, Laufmittel: Etac/MeOH 1 /1 ) überprüft.
Aktivierung von 5(4-DAPS)-Cytidin zum entsprechenden HSI-Ester:
Ein Aliquot der Lösung des 5(4-DAPS)-Cytidin wurde im selben Lösungs mittel (4 Teile Methanol und 1 Teil DMF) mit der doppelten molaren Meng Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und der 7 bis 10-fachen molaren Menge a
N-Hydroxysuccinimid (HSI) versetzt. Nach einer Reaktionszeit von etwa 1 ist die Aktivierung des 5(4-DAPS)-Cytidin zum entsprechenden HSI-Est beendet. Er kann direkt zur Kopplung an HSA eingesetzt werden.
3. Kopplung des HSI-Esters von 5(4-DAPS)-Cytidin an HSA:
Zu einer Lösung von 2 g HSA in 30 ml 0,17 M Bic wurde der HSI-Ester von
5(4-DAPS)-Cytidin langsam unter ständigem Rühren zugegeben. Schon während der Zugabe des HSI-Esters von 5(4-DAPS)-Cytidin fällt DCC aus. Die Trübung von DCC und DC-Harnstoff wurde mitteis Filtration abgetrennt. Die Abtrennung anderer Verunreinigungen, wie Methanol, DMF und HSI, erfolgte anschließend über eine YM 30 Membran in einer Amicon Druck¬ filtrationszelle. Es wurde Cytidin-4-DAPS-HSA erhalten.
Die Reinheit des erfindungsgemäßen Konjugats wurde mittels HPLC (vgl. Beispiel 1 ) überprüft.
Beispiel 4: Herstellung eines erfindungsgemäßen Konjugats aus UDR, einem eine Azogruppe enthaltenden Linker und humanem Serumalbumin (UDR-4-DAPS-HSA)
Die Herstellung des erfindungsgemäßen Konjugats erfolgte, wie in Beispiel 3 be¬ schrieben, wobei anstelle von Cytidin UDR verwendet wurde. Es wurde UDR-4- DAPS-HSA erhalten.
Beispiel 5: Herstellung eines erfindungsgemäßen Konjugats aus AraC, einem eine Azogruppe enthaltenden Linker und humanem Serumalbumin (AraC-4-DAPS-HSA)
Die Herstellung des erfindungsgemäßen Konjugats erfolgte, wie in Beispiel 3 be¬ schrieben, wobei anstelle von Cytidin AraC verwendet wurde. Es wurde AraC-4- DAPS-HSA erhalten. Beispiel 6: Herstellung eines erfindungsgemäßen Konjugats aus CDR einem eine Azogruppe enthaltenden Linker und humane Serumalbumin (CDR-4-DAPS-HSA)
Die Herstellung des erfindungsgemäßen Konjugats erfolgte, wie in Beispiel beschrieben, wobei anstelle von Cytidin CDR verwendet wurde. Es wurde CDR-4 DAPS-HSA erhalten.
Beispiel 7: Herstellung eines erfindungsgemäßen Konjugats aus 7-Chlorte tracyciin, einem eine Azogruppe enthaltenden Linker und hu manem Serumaibumin
Die Herstellung des Konjugats und seine Struktur sind in Fig. 3 gezeigt.
4-DAPS wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
1. Kopplung von 4-DAPS an 7-Chlortetracyclin:
718,5 mg (1 ,5 mM) von 7-Chlortetracyclin (MG 478,9) wurden in 20 ml 1 N NaOH gelöst und unter ständigem Rühren die 4-DAPS-Lösung portions weise (je 1 ml) zugegeben. Die zuerst gelb gefärbt 7-Chlortetracyclin-Lösun nahm während der Zugabe von 4-DAPS eine zunehmend intensiv rot Färbung an. Nach einer Reaktionszeit von etwa 24 h wurde die tief rot
Lösung mit 1 N HCI auf einen pH-Wert von etwa 2 eingestellt und lyophili siert. Der trockne Rückstand wurde anschließend in einem Gemisch von ml MeOH und 2 ml DMF gelöst und durch Filtration vom unlöslichen Boden körper abgetrennt. Es wurde 7-Chlor-9(4-diazophenylsulfonsäure)-tetracycl (4-DAPS-Chlortetracyclin) erhalten.
2. Aktivierung des 4-DAPS-Chlortetracyclins zur Proteinkopplung: Ein Aliquot der Lösung des 4-DAPS-Tetracyclins wurde im selben Lösungs¬ mittel (4 Teile MeOH und 1 Teil DMF), ohne vorherige Abtrennung des überschüssigen 7-Chlortetracyclins mit der doppelten molaren Menge an DCC (bezogen auf die eingesetzte Menge an Phenylsulfonsäure) und der 7 - 10-fachen molaren Menge an HSI versetzt. Nach einer Reaktionszeit von etwa 2 h ist die Aktivierung des 4-DAPS-Chlortetracyclins zum entsprechen¬ den HSI-Ester beendet. Der so erhaltene Ester kann direkt zur Proteinkopp¬ lung eingesetzt werden.
3. Kopplung des HSI-Esters von 4-DAPS-Chlortetracyclin an HSA:
Zu einer Lösung von 2g HSA in 30 ml 0,17 M Bic gibt man die äquimolare Menge an HSI-Ester von 4-DAPS-Chlortetracyclin langsam und unter ständi¬ gem Rühren. Schon während der Zugabe des HSI-Esters fällt der Überschuß an DCC aus. Die Trübung von DCC und DC-Harnstoff wurde vor der Druck¬ filtration mittels Filtration abgetrennt. Die Abtrennung anderer Verunreini¬ gungen, wie MeOH, DMF und HSI, erfolgte über eine YM 30 Membran in einer Amicon Druckfiltrationszelle. Es wurde 7-Chlor-9(4-diazophenylsulfon- säure)-tetracyclin-HSA erhalten.
Die Reinheit des so erhaltenen Konjugats wurde mittels HPLC (vgl. Beispiel 1 ) bestimmt.
Beispiel 8: Hersteilung eines Konjugats aus Tetracyclin, einem eine Azo¬ gruppe enthaltenden Linker und humanem Serumalbumin
Die Herstellung des Konjugats erfolgte wie in Beispiel 7 beschrieben, wobei anstatt 7-Chlortetracyclin Tetracyclin verwendet wurde. Die Struktur des Konjugats ist in Fig. 3 gezeigt. Beispiel 9: Wachstumsinhibition von Tumorzellen durch Verabreichun erfindungsgemäßer Konjugate
Die Konjugate UDR-4-DAPS-HSA (vgl. Beispiel 4), AraC-4-DAPS-HSA (vgl. Bei spiel 5) und CDR-4-DAPS-HSA (vgl. Beispiel 6) sowie als Kontrolle HSA allein wurden jeweils mit Walker-256-Zellen unter üblichen Bedingungen inkubiert. Nach 24, 48 bzw. 72 h wurde in üblicher Weise die Zellzahl pro ml bestimmt.
Wie aus Fig. 4 zu ersehen ist, vermindert jedes der erfindungsgemäßen Konjugat im Vergleich zur Kontrolle die Proliferation von Tumorzellen.

Claims

Patentansprüche
1. Konjugat aus einem Wirkstoff und einem nicht als körperfremd angese¬ henen, nativen Protein, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem Wirkstoff und dem Protein ein in einer Zelle spaltbarer Linker vorliegt.
2. Konjugat nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff eine zur Therapie von Tumor-, Infektions- und/oder Autoimmunerkran¬ kungen verwendbare Verbindung ist.
3. Konjugat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Chemotherapeutikum und/oder eine photoaktive Verbindung ist.
4. Konjugat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Chemo¬ therapeutikum ein Antibiotikum ist.
5. Konjugat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Chemo¬ therapeutikum ein Antimetabolit ist.
6. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 -5, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Wirkstoffe vorliegen.
7. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 -6, dadurch gekennzeichnet, daß der Linker eine Azo-Gruppe umfaßt.
8. Konjugat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Linker folgende Struktur aufweist:
-γ.R-N = N- worin
R eine aromatische Verbindung ist, und
Y eine aus C(O), S(O)2, P(O)OH und As(O)OH ausgewählte Gruppe ist.
9. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 -8, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Albumin ist.
10. Konjugat nach Anspruch 1 , nämlich das Konjugat von Fig. 1.
1 1 . Konjugat nach Anspruch 1 , nämlich das Konjugat von Fig. 2.
12. Konjugat nach Anspruch 1 , nämlich das Konjugat von Fig. 3.
13. Verfahren zur Herstellung des Konjugates nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Anbinden des Wirkstoffs über den Linker an das Protein eine Diazotierung von Aminogruppen und/oder eine Aktivie¬ rung von Säuregruppen umfaßt.
14. Verwendung des Konjugates nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Therapie von Tumor-, Infektions- und/oder Autoimmunerkrankungen.
GEÄNDERTE ANSPRUCHE
[bein Internationalen Büro am 7 März 1996 (07.03.96) eingegangen ; ursprungl icher Anspruch 1 geändert ; ursprungl icher AnsDruche 7 gestrichen ursprungl iche Ansprüche 8-14 umnumerj sn al s Anspruchs 7-13 ; weitere Ansprüche unverändert (2 selten) "
1. Konjugat aus einem Wirkstoff und einem nicht als körperfremd angese- henen, nativen Protein, wobei zwischen dem Wirkstoff und dem Pro¬ tein ein in einer Zelle spaltbarer Linker vorliegt, dadurch gekennzeich¬ net, daß der Linker eine Azo-Gruppe umfaßt.
2. Konjugat nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff eine zur Therapie von Tumor-, Infektions- und/oder Autoimmunerkran¬ kungen verwendbare Verbindung ist.
3. Konjugat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Chemotherapeutikum und/oder eine photoaktive Verbindung ist.
4. Konjugat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Chemo¬ therapeutikum ein Antibiotikum ist.
5. Konjugat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Chemo- therapeutikum ein Antimetabolit ist.
6. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 -5, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Wirkstoffe vorliegen.
7. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 -6, dadurch gekennzeichnet, daß der Linker folgende Struktur aufweist:
-Y-R-N = N- worin
R eine aromatische Verbindung ist, und
Y eine aus C(O), S(O)2, P(O)OH und As(O)OH ausgewählte Gruppe ist.
8. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 -7, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Albumin ist.
9. Konjugat nach Anspruch 1 , nämlich das Konjugat von Fig. 1.
10. Konjugat nach Anspruch 1 , nämlich das Konjugat von Fig. 2.
1 1 . Konjugat nach Anspruch 1 , nämlich das Konjugat von Fig. 3.
12. Verfahren zur Herstellung des Konjugates nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das Anbinden des Wirkstoffs über den Linker an das Protein eine Diazotierung von Aminogruppen und/oder eine Aktivie¬ rung von Säuregruppen umfaßt.
13. Verwendung des Konjugates nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 zur Therapie von Tumor-, Infektions- und/oder Autoimmunerkrankungen.
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