WO1996000788A1 - Transgene pflanzen mit erhöhtem gehalt an sekundärstoffen - Google Patents

Transgene pflanzen mit erhöhtem gehalt an sekundärstoffen Download PDF

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    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

Definitions

  • This invention relates to transgenic plants with at least one heterologous DNA sequence which have an increased content of certain secondary substances, processes for their production and their use in forest, pasture, meadow, ornamental plant or crop plant cultivation.
  • Plant secondary substances play an important role in plant defense against pathogens, predators or parasites (see, for example, Rhodes, Plant Molecular Biology 24 (1994), 1-20; Chasan, Plant Cell 6 (1994) 3-9). To date, however, no methods have been known for significantly increasing the content of secondary substances over a longer period of time and thereby achieving increased pathogen resistance and / or increased resistance to predators or parasites. At present, crop protection is mainly based on the treatment of plants with various crop protection agents, the toxicology and ecological effects of which are problematic in many cases.
  • the invention is therefore based on the object of providing a plant which is pathogen-resistant and / or resistant to predators or parasites in order to at least partially restrict the use of crop protection agents and thus to improve crop protection from a toxicological and ecological point of view.
  • transgenic plant with at least one heterologous DNA sequence which codes for at least one polypeptide with enzymatic activity, in which the polypeptide is expressed, is present in enzymatically active form and has at least one second dosed in a concentration which is generated enzymatically against plant pests, in particular antiviral and / or bactericidal and / or fungicidal and / or insecticidal and / or as a repellent.
  • plant pests includes nematodes, insects and plant pathogens such as viruses, fungi and bacteria.
  • transgenic plant or “plant” encompasses the whole plant as such as well as its parts, such as root, stem, leaf, organ-specific tissue or cells, their reproductive material, in particular seeds, and their seedlings.
  • Gymnospermae Monocotyledoneae and Dicotyledoneae, in particular useful plants, such as cereals, for example rye, maize, wheat, corn, barley, rice, oats and millet, starch bulbs and roots, for example potato, batate and cassava;
  • Sugar plants for example sugar cane and sugar beet, legumes, for example beans, peas and chickpeas
  • Oil and fat fruits for example soybean, peanut, sunflower, olive tree, rapeseed and coconut
  • Vegetables for example tomato, cabbage, onion, cucumber, carrot and lettuce
  • Fruit for example grapes, citrus fruits, banana, apple, pear, peach and pineapple, - nut-like fruits, for example walnut, hazelnut, almond and cashew nut
  • luxury plants for example tobacco, coffee, tea, cocoa
  • Types for vegetable fibers for example cotton, jute and flax
  • Types of forest use for example spruce, oak and poplar
  • Orn s
  • heterologous DNA sequence means a DNA sequence that comes from a source other than the wild type of the transgenic plant according to the invention.
  • Suitable sources are prokaryotic, for example Escherichia coli, or of eukaryotic origin, including archaebacteria.
  • the coding region of the heterologous DNA sequence can contain coding ("exons") and non-coding ("introns") sections. Furthermore, the heterologous DNA sequence can contain regulatory sections such as promoters, enhancers and termination sequences.
  • promoter means in particular a nucleotide sequence located upstream from the starting point of the transcription, which contains all the regulatory regions required for the transcription, including the sequence for the 5 ′′ untranslated (“eader sequence” ) contains the mRNA coding region, the leader sequence comprising the ribosomal binding site and initiating the start of translation at the AUG start codon.
  • promoters which are suitable for use in the DNA constructs according to the invention include promoters which originate from viruses, fungi, bacteria, mammals and plants and which are active or can be activated in plant cells. The promoter can express the desired DNA constitutively or differentially.
  • promoters which regulate DNA expression differentially are promoters which can be induced by disease carriers such as thrips or fungi, for example the so-called “wound-inducible" promoters.
  • the promoter used should increase the expression of the heterologous DNA sequence in such a way that ultimately a biologically effective concentration of secondary substances is generated in the plant or in the corresponding parts or cells of the plant.
  • Particularly preferred promoters are the cauliflower mosaic virus 35S (CaMV 35S) promoter and derivatives thereof, and a “wound-inducible” promoter that can be induced by injury or injury to a disease carrier such as thrips.
  • suitable promoters include promoters of the napalin synthase and octopine synthase systems and the like.
  • Termination sequence means a nucleic acid sequence at the end of a transcription unit, which indicates the completion of the translation. Termination sequences are, in particular, 3 'untranslated sequences which contain a polyadenylation signal which initiates an addition of polyadenylate sequences to the 3' end of a primary transcript. Termination sequences active in plant cells are known in the prior art. They can be isolated from bacteria, fungi, viruses, mammals or plants. Examples of suitable termination sequences to be used in particular in the constructs according to the invention include the napalin synthase termination sequence from A. tumefaciens, the 35S termination sequence from CaMV and the zein termination sequence from Zea mays.
  • a heterologous DNA sequence which contains no introns is preferred.
  • this term encompasses chimeric DNA sequences as well as synthetic or semi-synthetic DNA sequences.
  • the DNA sequence contains the ubiC gene from Escherichia coli; see. FIG. 1.
  • the present invention further comprises nucleic acid sequences which are similar to the DNA sequence shown in FIG. 1 and which code for polypeptides which according to the present invention can generate at least one secondary substance, in particular phenol derivatives, enzymatically.
  • the term “similar” means a nucleic acid sequence that is complementary to a test sequence, this test sequence being capable of hybridization with the DNA sequence shown in FIG. 1.
  • the present invention comprises parts of the DNA sequence shown in FIG. 1 and the similar nucleic acid sequences defined above.
  • polypeptide with enzymatic activity means a polypeptide derived from the heterologous one defined above DNA sequence is encoded, whereby the encoding sequence can be degenerate according to the genetic code. Thus, if necessary, the coding sequence can be degenerated according to known methods in such a way that it is better expressed in a plant.
  • the primary transcript can be translated directly or can be "spliced" into a translatable mRNA.
  • the primary translation product can be modified post-translationally to form the enzymatically active polypeptide, for example by splitting off a signal sequence, by enzymatically cleaving the inactive "precursor” for conversion into the enzymatically active form or by modifying the side chains of the Polypeptide, for example by phosphorylation or glycosylation.
  • the present invention further comprises polypeptides which are similar to the primary sequence shown in FIG. 2, in this context the term "similar” means polypeptides with the same enzymatic function as the polypeptide shown in FIG. 2 and with a primary sequence which is at least has a different amino acid in comparison with the primary sequence shown in FIG. 1. Furthermore, the present invention includes portions of the polypeptide shown in Figure 2 and the similar polypeptides defined above.
  • these polypeptides enzymatically generate secondary substances, which are preferably also present in small amounts in the wild type (“plant-specific secondary substances”).
  • plant-specific secondary substances The synthesis of the secondary substances in plants, provided that they also occur in the wild type, is preferably no longer subject to the cellular control mechanisms of the plant, ie it preferably proceeds via a biosynthetic pathway which naturally does not occur in plants.
  • These secondary substances accumulate Surprisingly, in the transgenic plant according to the invention in a biologically effective concentration, the accumulation occurring either through anabolic or catabolic subsequent reactions or through deposition in certain cell compartments.
  • the concentration of the secondary substances enriched in the transgenic plant according to the invention shows a clear anti-viral and / or bactericidal and / or fungicidal and / or insecticidal and / or froth-inhibiting effect.
  • This biologically active concentration of the secondary substances (unit: ⁇ g secondary substance / g fresh weight of the plant), in particular in the parts of the plant to be protected (organs, tissues) or cells, is preferably at least 10 times, more preferably at least 50 times, on most preferably at least 100 times, based on the concentration of these substances in the wild-type plants, in particular in the corresponding parts or cells of the wild-type plants.
  • secondary substance encompasses the constituents of plants which belong to the secondary metabolism, as well as their derivatives, either by subsequent reactions in the plant cell, for example hydroxylation, methylation, glycosylation, etherification, esterification or polymerization, or by the above defined polypeptide are generated directly enzymatically.
  • the secondary substance (or its derivative) produced according to the invention can per se have the biological effect defined above or its derivative (s) generated by subsequent reactions.
  • secondary substances examples include alkaloids, isoprenoids, phenol derivatives, phenylpropanes, quinones, coumarins, lignin and flavoidoids.
  • Phenol derivatives such as salicylic acid, in particular p-hydroxybenzoic acid and their derivatives, are preferred.
  • the present invention further relates to a method for producing the transgenic plant according to the invention, in which a plant cell, optionally in protoplasmic form, is transformed by stable integration of the heterologous DNA sequence into the genetic material and the transformed plant cell is regenerated to the transgenic plant.
  • the Ti plasmid or a binary plasmid system in Agrobacterium tumefaciens can be used as a vector for the stable integration of the heterologous DNA sequence into the genetic material of the transgenic plant according to the invention.
  • the heterologous DNA sequence z. B. also by the Ri plasmid of Agrobacterium rhi - zogenes, by direct gene transfer by means of polyethylene glycol, by electroporation or by particle bombardment into the genetic material of the transgenic plant.
  • the present invention further relates to a vector which is used to introduce the DNA construct according to the invention or the heterologous DNA sequence into plants, preferably for the stable integration of the DNA construct or the heterologous DNA sequence into the genetic Material from plant cells is capable.
  • Another object of the present invention relates to the use of the transgenic plant according to the invention as a pathogen-resistant and / or plant resistant in the forest, pasture, meadow, ornamental plant and crop plant crops and / or resistant to predators and / or parasites.
  • resistant means in particular a marked reduction in sensitivity to the infestation of plants by pests.
  • pathogens examples include the tobacco mosaic virus and the cauliflower mosaic virus, the bacteria Erwinia amylovora, P ⁇ eudomona ⁇ ⁇ yringae, Corynebacterium michiganen ⁇ e and Xanthomona ⁇ campe ⁇ tris, the fungi Phytophtora infe ⁇ tan ⁇ , Clavicep ⁇ tilurium, and Botulinum purpureaea boturi be performed.
  • predators and parasites nematodes, aphids, beetles and caterpillars are listed.
  • the present invention further relates to the use of the heterologous DNA sequence defined above for the production of the transgenic plant according to the invention.
  • Fig. 3 is a schematic representation of the construction of the transformation vectors pROK-ubiC and pROK-TPO-ubiC with the uJ iC gene from E ⁇ cherichia coli.
  • PHB phenol derivative p-hydroxybenzoic acid
  • chorismate is metabolized in a single step by the enzyme chorismate pyruvate lyase to PHB and pyruvate.
  • the ubiC gene coding for this enzyme was cloned from Echerichia coli (Siebert et al., FEBS Letters 307 (1992), 347-350); see. 1 and 2.
  • the ubiC gene contained in pUBIC (Siebert et al., Microbiology 140 (1994), 897-904) is cleaved with EcöRI and Sall, the ends are filled in with Klenow enzyme and into the binary plant expression vector pROKl (Bevan et al., EMBO J. 4 (1985), 1921-1926), which had previously been linearized with BamHI and the ends of which were also filled in with Klenow enzyme.
  • This vector enables selection of transgenic plants using a kanamycin resistance gene, the ubiC gene being under the control of a 35S CaMV promoter.
  • the transformation vector produced in this way is referred to as pROK-ubiC; see. Fig. 3.
  • a modified u iC gene is produced in such a way that it maintains the reading frame at the 5 'end with a plastid transit peptide (Sugita et al., Mol. Gen. Genet. 209 (1987), 247-256) , which originates from the small subunit of the ribulose bisphosphate carboxylase, is fused via the cleavage site Kpnl, the construct pTPO-ubiC being obtained.
  • the fusion gene TPubiC contained in pTPO-ubiC is then cloned as described above into the vector pROKl to obtain the transformation vector pROK-TPO-ubiC; see. Fig. 3.
  • sucrose 1 mg of 6-benzylaminopurine, 0.1 mg naphthylacetic acid, 100 mg inositol, 10 mg thiamine, 1 mg pyridoxine, 1 mg nicotinic acid and 7 g agarose
  • sucrose 1 mg of 6-benzylaminopurine, 0.1 mg naphthylacetic acid, 100 mg inositol, 10 mg thiamine, 1 mg pyridoxine, 1 mg nicotinic acid and 7 g agarose
  • the selection against agrobacteria and untransformed leaf parts is carried out by transferring the leaf pieces to SHI Cef2 5o, ⁇ anioo " Med: LUin (composition like the SHI medium with additional 250 mg / 1 cefotaxime and 100 mg / 1 kanamycin).
  • the regenerated shoots which have formed at the interfaces are separated off and put into PM c ef i 25 , ⁇ a nioo ⁇ Me ⁇ : ium (composition like the corresponding SHI medium, but without the addition of naphthylacetic acid - acid, 6-benzylaminopurine, inositol, thiamine, pyridoxine and nicotinic acid) in 450 ml mason jars for rooting. With a size of approx. 10 cm, the plants are carefully removed from the agar medium at the roots and placed in sterilized soil.
  • Leaf material of the transgenic plants obtained under point (2) is ground under liquid nitrogen.
  • the powdered leaf material is suspended in 0.75 M sodium acetate solution pH 4.0 and extracted with ethyl acetate.
  • the organic phase is removed, taken to dryness evaporates, taken up in methanol / water / formic acid (30: 69.3: 0.7) and examined by HPLC chromatography.
  • the powdered plant material is hydrolyzed in 1 M HCl at 80 ° C for one hour, extracted with ethyl acetate and analyzed as described above.
  • PHB e.g. esters, glucosides
  • transformed plants show a free PHB content increased by a factor of 50 (2.3 ⁇ g / g fresh weight) and a bound PHB content increased by a factor of 1150.
  • the PHB is approximately 50% glucosidically bound in the transgenic plants.
  • Their PHB glucoside content is approximately 0.3 mg / g fresh weight.
  • phenolic substances are further enriched.
  • TMV tobacco mosaic virus
  • a suspension of the virus with diatomaceous earth is applied to the leaves of transgenic and wild-type tobacco plants (Kultivar Petite Havanna SRI) with light pressure using a brush.
  • the leaves of the tobacco plants are milled after about 10 days and the extract, as described above, is applied to leaves of the tobacco cultivar Nicotiana tabacu cv. Xanthi applied. After about three days, the local lesions which appear in these plants are observed.
  • the transgenic tobacco plants according to the invention which contain the ubiC gene from Escherichia coli, show a significantly increased pathogen resistance in comparison with wild-type plants and do not form any new ingredients with unknown effects and toxicology, but instead surprisingly, they contain an increased amount of p-hydroxybenzoic acid (a substance which occurs naturally in all organisms and has known properties) and their derivatives, in particular p-hydroxybenzoic acid glucoside, which are responsible for the pathogen resistance.
  • p-hydroxybenzoic acid a substance which occurs naturally in all organisms and has known properties
  • their derivatives in particular p-hydroxybenzoic acid glucoside

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Abstract

Diese Erfindung betrifft transgene Pflanzen mit mindestens einer heterologen DNA-Sequenz, die einen erhöhten Gehalt an Sekundärstoffen aufweisen, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung im Wald-, Weide-, Wiesen-, Zierpflanzen- oder Nutzpflanzenbau. Insbesondere kodiert die heterologe DNA-Sequenz für ein Polypeptid mit enzymatischer Aktivität, das mindestens einen Sekundärstoff in einer antiviral und/oder bakterizid und/oder fungizid und/oder insektizid und/oder als Repellent wirkenden Konzentration enzymatisch erzeugt.

Description

Transgene Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an SekundärStoffen
Diese Erfindung betrifft transgene Pflanzen mit mindestens ei¬ ner heterologen DNA-Sequenz, die einen erhöhten Gehalt an be¬ stimmten Sekundärstoffen aufweisen, Verfahren zu deren Her¬ stellung sowie deren Verwendung im Wald-, Weide-, Wiesen-, Zierpflanzen- oder Nutzpflanzenbau.
Pflanzliche Sekundärstoffe spielen bei der pflanzlichen Abwehr gegen Pathogene, Freßfeinde oder Parasiten eine wichtige Rolle (siehe z. B. Rhodes, Plant Molecular Biology 24 (1994), 1-20; Chasan, Plant Cell 6 (1994) 3-9) . Bisher sind jedoch keine Verfahren bekannt, den Gehalt an Sekundärstoffen über einen längeren Zeitraum deutlich zu steigern und dadurch eine er¬ höhte Pathogenresistenz und/oder eine erhöhte Resistenz gegen Freßfeinde oder Parasiten zu erreichen. Gegenwärtig beruht der Pflanzenschutz überwiegend auf der Behandlung von Pflanzen mit verschiedenen Pflanzenschutzmitteln, deren Toxikologie und ökologische Auswirkungen in vielen Fällen problematisch sind.
Somit liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine per εe pathogenresistente und/oder gegen Freßfeinde oder Parasiten resistente Pflanze bereitzustellen, um die Verwendung von Pflanzenschutzmitteln zumindest teilweise einzuschränken und somit den Pflanzenschutz vom toxikologischen und ökologischen Standpunkt zu verbessern.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung einer transgenen Pflanze mit mindestens einer heterologen DNA- Sequenz, die für mindestens ein Polypeptid mit enzymatischer Aktivität kodiert, worin das Polypeptid exprimiert wird, in enzymatisch aktiver Form vorliegt und mindestens einen Sekun- därstoff in einer gegen pflanzliche Schädlinge, insbesondere antiviral und/oder bakterizid und/oder fungizid und/oder in- sektizid und/oder als Repellent wirkenden Konzentration enzy- matisch erzeugt, gelöst.
Der Begriff "pflanzliche Schädlinge" umfaßt Nematoden, Insek¬ ten und pflanzliche Pathogene wie Viren, Pilze und Bakterien. Der Begriff "transgene Pflanze" bzw. "Pflanze" umfaßt die ganze Pflanze als solche sowie deren Teile, wie Wurzel, Sten¬ gel, Blatt, organspezifisches Gewebe oder Zellen, deren ver¬ mehrungsfähiges Material, insbesondere Samen, und deren Keim¬ linge.
Ferner umfaßt dieser Begriff Gymnospermae, Monocotyledoneae und Dicotyledoneae, insbesondere Nutzpflanzen, wie Getreide, beispielsweise Roggen, Mais, Weizen, Mais, Gerste, Reis, Hafer und Hirse,* Stärkeknollen und -wurzeln, beispielsweise Kartof¬ fel, Batate und Maniok; Zuckerpflanzen, beispielsweise Zucker¬ rohr und Zuckerrübe,* Hülsenfrüchte, beispielsweise Bohnen, Erbsen und Kichererbsen; Öl- und Fettfruchte, beispielsweise Sojabohne, Erdnuß, Sonnenblume, Ölbaum, Raps und Kokosnuß; Ge¬ müse, beispielsweise Tomate, Kohl, Zwiebel, Gurke, Karotte und Salat; Obst, beispielsweise Trauben, Citrusfrüchte, Banane, Apfel, Birne, Pfirsich und Ananas,- nußartigen Früchte, bei¬ spielsweise Walnuß, Haselnuß, Mandel und Cashew-Nuß; Genußmit¬ telpflanzen, beispielsweise Tabak, Kaffee, Tee, Kakao; Arten für pflanzliche Fasern, beispielsweise Baumwolle, Jute und Flachs; Arten forstlicher Nutzung, beispielsweise Fichte, Ei¬ che und Pappel; Zierpflanzen wie Impatiens, Begonia, Petunia, Pelargonium, Viola, Cyclamen, Verbena, Vinca, Tagetes, Pri- mula, Saintpaulia, Amaranthus, Ageratum, Anthirrhinum, Aquile- gia, Crysanthemum, Cineraria, , Dahlia, Datura, Delphinium, Gerbera, Gladiolus, Gloxinia, Hippeastrum, Mesembryanthemum, Salpiglossis und Zin; und Pflanzenarten zur Gewinnung von Rohmaterialien, beispielsweise Hevea brasiliensis (Kautschuk) und Jojoba. Der Begriff "heterologe DNA-Sequenz" bedeutet eine DNA-Se¬ quenz, die aus einer anderen Quelle als dem Wildtyp der erfin¬ dungsgemäßen transgenen Pflanze stammt. Geeignete Quellen sind prokaryontisehen, beispielsweise Escherichia coli , oder euka- ryontischen Ursprungs, einschließlich Archaebakterien. Bevor¬ zugt ist eine nicht-pflanzliche Quelle, insbesondere eine Quelle prokaryontisehen Ursprungs.
Der kodierende Bereich der heterologen DNA-Sequenz kann kodie¬ rende ("Exons") und nicht-kodierende ("Introns") Abschnitte enthalten. Ferner kann die heterologe DNA-Sequenz regulatori¬ sche Abschnitte, wie Promotoren, Enhancer und Terminationsse- quenzen, enthalten.
Der Begriff "Promotor" bedeutet insbesondere eine stromauf¬ wärts von der Startstelle der Transkription liegende Nukleo- tidsequenz, die alle für die Transkription erforderlichen re¬ gulatorischen Bereiche, einschließlich dem für die 5'' -nicht- translatierte Sequenz (" eader-Sequenz") der mRNA kodierenden Bereich, enthält, wobei die Leader-Sequenz die ribosomale Bin¬ dungsstelle umfaßt und den Start der Translation am AUG-Start- codon initiiert. Beispiele für Promotoren, die zur Verwendung in den erfindungsgemäßen DNA-Konstrukten geeignet sind, bein¬ halten Promotoren, die aus Viren, Pilzen, Bakterien, Säugern und Pflanzen stammen, und die in Pflanzenzellen aktiv sind oder aktiviert werden können. Der Promotor kann die gewünschte DNA konstitutiv oder differentiell exprimieren. Beispiele für Promotoren, welche die DNA-Expression differentiell regulie¬ ren, sind durch Krankheitsträger, wie Thrips oder Pilze, indu¬ zierbare Promotoren, beispielsweise die sog. "wundinduzierbaren" Promotoren. Selbstverständlich soll der verwendete Promotor die Expression der heterologen DNA-Sequenz derart erhöhen, daß letztendlich eine biologisch wirksame Kon¬ zentration von Sekundärstoffen in der Pflanze bzw. in den ent¬ sprechenden Pflanzenteilen oder -zellen erzeugt wird. Beson¬ ders bevorzugte Promotoren sind der Blumenkohl-Mosaik-Virus 35S (CaMV 35S) -Promotor und Derivate davon, und ein durch Ver¬ letzung bzw. Verwundung durch einen Krankheitsträger wie Thrips induzierbarer ("wundinduzierbarer") Promotor. Beispiele weiterer geeigneter Promotoren schließen Promotoren des No- palinsynthase- und Octopinsynthase-Systems und dergleichen ein.
Der Begriff "Terminationssequenz" bedeuted eine Nukleinsäure- sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit, welche die Been¬ digung der Translation anzeigt. Terminationssequenzen sind insbesondere 3 ' -nicht-translatierte Sequenzen, die ein Polya- denylierungssignal enthalten, das eine Addition von Polya- denylatsequenzen an das 3 ' -Ende eines Primärtranskriptes in¬ itiiert. In Pflanzenzellen aktive Terminationssequenzen sind im Stand der Technik bekannt. Sie können aus Bakterien, Pil¬ zen, Viren, Säugern oder Pflanzen isoliert werden. Beispiele für insbesondere in den erfindungsgemäßen Konstrukten zu ver¬ wendende geeignete Terminationssequenzen beinhalten die No- palinsynthase-Terminationssequenz aus A. tumefaciens, die 35S- Terminationssequenz aus CaMV und die Zein-Terminationssequenz aus Zea mays .
Bevorzugt ist eine heterologe DNA-Sequenz, die keine Introns enthält.
Darüberhinaus umfaßt dieser Begriff Chimäre DNA-Sequenzen so¬ wie synthetische oder halbsynthetische DNA-Sequenzen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die DNA-Sequenz das ubiC-Gen aus Escherichia coli ; vgl. Fig. 1. Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner Nukleinsäuresequenzen, die zur in Fig. l gezeigten DNA-Sequenz ähnlich sind und die für Polypeptide kodieren, die gemäß vorliegender Erfindung mindestens einen Sekundärstoff, insbesodere Phenolderivate, enzymatisch erzeugen können. Der Begriff "ähnlich" bedeutet eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Testsequenz komplemen¬ tär ist, wobei diese Testsequenz zur Hybridisierung mit der in Fig. l gezeigten DNA-Sequenz befähigt ist. Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung Teile der in Fig. 1 gezeigten DNA-Se¬ quenz und der vorstehend definierten ähnlichen Nukleinsäurese¬ quenzen.
Der Begriff "Polypeptid mit enzymatischer Aktivität" bedeutet ein Polypeptid, das von der vorstehend definierten heterologen DNA-Sequenz kodiert wird, wobei die kodierende Sequenz ent¬ sprechend dem genetischen Code degeneriert sein kann. So kann gegebenenfalls die kodierende Sequenz nach bekannten Methoden derart degeneriert werden, daß sie in einer Pflanze besser ex¬ primiert wird.
Das Primärtranskript kann direkt translatiert werden oder durch "Spleißen" zu einer translatierbaren mRNA erzeugt wer¬ den. Ferner kann das primäre Translationsprodukt zur Bildung des enzymatisch aktiven Polypeptids post-translational modifi¬ ziert werden, beispielsweise durch Abspaltung einer Signalse¬ quenz, durch enzymatische Spaltung des inaktiven "Precursors" zur Überführung in die enzymatisch aktive Form oder durch Mo¬ difizierung der Seitenketten des Polypeptids, beispielsweise durch Phosphorylierung oder Glykosylierung.
Bevorzugte Beispiele dieser Polypeptide sind das Enzym Choris- mat-Pyruvat-Lyase aus Escherichia coli , dessen Primärsequenz in Fig. 2 dargestellt ist, und das Enzym Isochorismat-Pyruvat- Lyase (= Salicylat-Synthase) .
Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner Polypeptide, die zu der in Fig. 2 gezeigten Primärsequenz ähnlich sind, in diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "ähnlich" Polypeptide mit gleicher enzymatischer Funktion wie das in Fig. 2 gezeigte Po¬ lypeptid und mit einer Primärsequenz, die mindestens eine un¬ terschiedliche Aminosäure im Vergleich mit der in Fig. 1 ge¬ zeigten Primärsequenz aufweist. Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung Teile des in Fig. 2 gezeigten Polypeptids und der vorstehend definierten ähnlichen Polypeptide.
Erfindungsgemäß erzeugen diese Polypeptide unter Verwendung von in der transgenen Pflanze vorhandenen Substraten enzyma¬ tisch Sekundärstoffe, die vorzugsweise auch im Wildtyp in ge¬ ringen Mengen vorkommen ("pflanzeneigene Sekundärstoffe") . Die Synthese der Sekundärstoffe in Pflanzen, sofern sie auch im Wildtyp vorkommen, unterliegt vorzugsweise nicht mehr den zel¬ lulären Kontrollmechanismen der Pflanze, d.h. sie verläuft vorzugsweise über einen Biosyntheseweg, der in Pflanzen natür¬ licherweise nicht vorkommt. Diese Sekundärstoffe reichern sich überraschenderweise in der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze in einer biologisch wirksamen Konzentration an, wobei die Anreicherung entweder durch anabole oder katabole Folgere¬ aktionen oder durch Ablagerung in bestimmte Zellkompartimente zustande kommt.
Die Konzentration der in der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze angereicherten Sekundärstoffe zeigt eine deutliche an- tivirale und/oder bakterizide und/oder fungizide und/oder in- sektizide und/oder fraßhemmende Wirkung. Vorzugsweise beträgt diese biologisch wirksame Konzentration der Sekundärstoffe (Einheit: μg Sekundärstoff/g Frischgewicht der Pflanze), ins¬ besondere in den zu schützenden Pflanzenteilen (Organe, Ge¬ webe) oder -zellen, mindestens das lOfache, mehr bevorzugt mindestens das 50fache, am meisten bevorzugt mindestens das lOOfache, bezogen auf die Konzentration dieser Stoffe in den Wildtyp-Pflanzen, insbesondere in den entsprechenden Teilen oder Zellen der Wildtyp-Pflanzen.
Der Begriff "Sekundärstoff" umfaßt Inhaltsstoffe von Pflanzen, die dem Sekundärstoffwechsel angehören, sowie deren Derivate, die entweder durch Folgereaktionen in der Pflanzenzelle, bei¬ spielsweise Hydroxylierung, Methylierung, Glykosylierung, Ver- etherung, Veresterung oder Polymerisierung, oder von dem vor¬ stehend definierten Polypeptid direkt enzymatisch erzeugt wer¬ den. Somit kann entweder der erfindungsgemäß erzeugte Sekun¬ därstoff (oder dessen Derivat) per εe die vorstehend defi¬ nierte biologische Wirkung aufweisen oder dessen durch Folge¬ reaktionen erzeugte(n) Derivat (e).
Beispiele für Sekundärstoffe sind Alkaloide, Isoprenoide, Phe¬ nolderivate, Phenylpropane, Chinone, Cumarine, Lignin und Fla- vonoide. Bevorzugt sind Phenolderivate wie Salicylsäure, ins¬ besondere p-Hydroxybenzoesäure und ihre Derivate.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze, worin eine Pflanzenzelle, gegebenenfalls in Protopla- stenform, durch stabile Integration der heterologen DNA-Se¬ quenz in das genetische Material transformiert wird und die transformierte Pflanzenzelle zur transgenen Pflanze re¬ generiert wird.
Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen sind im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise kann das Ti-Plasmid oder ein binäres Plasmidsystem in Agrobacterium tumefaciens als Vektor zur stabilen Integration der heterologen DNA-Sequenz in das genetische Material der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze verwendet werden. Weiterhin kann die heterologe DNA- Sequenz z. B. auch durch das Ri-Plasmid von Agrobacterium rhi - zogenes, durch direkten Gentransfer mittels Polyethylenglykol, durch Elektroporation oder durch Partikelbeschuß in das gene¬ tische Material der transgenen Pflanze eingeführt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, der zum Einführen des erfindungsgemäßen DNA-Kon- struktes bzw. der heterologen DNA-Sequenz in Pflanzen, vor¬ zugsweise zur stabilen Integration des DNA-Konstruktes bzw. der heterologen DNA-Sequenz in das genetische Material von Pflanzenzellen, befähigt ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze als pathogenresistente und/oder gegen Freßfeinde und/oder Parasi¬ ten resistente Pflanze im Wald, Weide-, Wiesen-, Zierpflanzen- und Nutzpflanzenbau.
Der Begriff "resistent" bedeuted insbesondere eine markante Herabsetzung der Empfindlichkeit für den Befall von Pflanzen durch Schädlinge.
Als Beispiele für Pathogene können als Viren das Tabak-Mosaik- Virus und das Blumenkohl-Mosaik-Virus, als Bakterien Erwinia amylovora, Pεeudomonaε εyringae, Corynebacterium michiganenεe und Xanthomonaε campeεtris, als Pilze Phytophtora infeεtanε, Clavicepε purpurea, Botrytiε cinerea und Uεtilago maydiε auf¬ geführt werden. Als Freßfeinde und Parasiten können insbeson- dere Nematoden, Blattläuse, Käfer und Schmetterlingsraupen aufgeführt werden.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der vorstehend definierten heterologen DNA-Sequenz zur Herstellung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze.
Die Figuren zeigen:
Fig. l (vgl. SEQ ID Nr. 1) zeigt die kodierende 495 bp lange Nukleinsäuresequenz des ubiC-Gens aus Escherichia coli .
Fig. 2 (vgl. SEQ ID Nr. 2) zeigt die 165 aa lange Aminosäure¬ sequenz der Chorismat-Pyruvat-Lyase aus Escherichia coli .
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion der Transformationsvektoren pROK-ubiC und pROK-TPO-ubiC mit dem uJ iC-Gen aus Eεcherichia coli .
Das nachstehende Beispiel erläutert die Erfindung:
Das Phenolderivat p-Hydroxybenzoesäure (PHB) ist sowohl in Bakterien als auch in höheren Pflanzen ein Schlüsselmetabolit in der Biosynthese von Ubichinon, einem Elektronenüberträger in der Atmungskette (Pennock und Threlfall (1983) , In: Biosyn- thesis of Isoprenoid Compounds (Porter und Spurgeon, Hrsg.) Vol. 2, 191-203) . In beiden Organismengruppen entsteht PHB aus Chorismat, jedoch auf völlig unterschiedlichen Wegen. In Pflanzen wird Chorismat zunächst im Laufe der aromatischen Aminosäure-Biosynthese über Prephenat in Phenylalanin umgewan¬ delt und dann über Zimtsäure und p-Cumarsäure zu PHB umgesetzt (Heide et al. , Phytochemistry 28 (1989), 2643-2645) . Dagegen wird in Bakterien das Chorismat in einem einzigen Schritt durch das Enzym Chorismat-Pyruvat-Lyase zu PHB und Pyruvat verstoffwechselt. Das für dieses Enzym kodierende Gen ubiC wurde aus Eεcherichia coli kloniert (Siebert et al . , FEBS Let¬ ters 307 (1992), 347-350) ; vgl. Fig. 1 und 2.
(1) Konstruktion des Transformationsvektors mit dem uJbiC-Gen aus Eεcherichia coli
Zur Konstruktion eines Transformationsvektors wird das in pUBIC (Siebert et al . , Microbiology 140 (1994) , 897-904) enthaltene ubiC-Gen mit EcöRI und Sall gespalten, die En¬ den mit Klenow-Enzym aufgefüllt und in den binären Pflan¬ zenexpressionsvektor pROKl (Bevan et al., EMBO J. 4 (1985) , 1921-1926) kloniert, der zuvor mit BamHI lineari- siert wurde und dessen Enden ebenfalls mit Klenow-Enzym aufgefüllt wurden. Dieser Vektor ermöglicht eine Selektion transgener Pflanzen mittels eines Kanamycin-Resistenzgens, wobei das ubiC-Gen unter der Kontrolle eines 35S-CaMV-Pro- motors steht. Der so hergestellte Transformationsvektor wird als pROK-ubiC bezeichnet; vgl. Fig. 3.
Ein modifiziertes u iC-Gen wird so hergestellt, daß es un¬ ter Wahrung des Leserahmens am 5 '-Ende mit einem pla- stidären Transitpeptid (Sugita et al., Mol. Gen. Genet. 209 (1987) , 247-256) , das von der kleinen Untereinheit der Ribulose-bisphosphat-carboxylase stammt, über die Spalt- stelle Kpnl fusioniert wird, wobei das Konstrukt pTPO-ubiC erhalten wird. Das in pTPO-ubiC enthaltene Fusionsgen TPubiC wird dann wie oben beschrieben in den Vektor pROKl zum Erhalt des Transformationsvektors pROK-TPO-ubiC klo¬ niert; vgl. Fig. 3.
(2) Transformation von Tabakpflanzen
Zur Transformation von Tabakpflanzen (Kultivar Petite Ha¬ vanna SRI)- werden Blätter von steril kultiviertem Tabak in ca. 0,5 x 0,5 cm große Stücke geschnitten und für minde¬ stens eine Minute in eine Kultur von Agrobacterium tumefa - cienε (LBA4404 mit jeweils unter Punkt (1) beschriebenen Transformationsvektoren) getaucht, die zuvor kurz abzen- trifugiert und in gleichem Volumen sterilem Leitungswasser resuspendiert worden ist. Die Blattstücke werden mit der Unterseite nach oben auf SHI-Medium (in einem Liter 4,6 g Salze nach Murashige und Skoog (Physiol. Plant. 15, (1962) 473-497), 30 g Saccharose, l mg 6-Benzylaminopurin, 0,1 mg Naphtylessigsaure, 100 mg Inositol, 10 mg Thiamin, l mg Pyridoxin, l mg Nicotinsäure und 7 g Agarose) in Petri- schalen ausgelegt und bei 25 °C für drei Tage mit den Agrobakterien cokultiviert. Dabei ist darauf zu achten, daß die Lichtmenge nicht zu groß ist (Streulicht, ca. 1000 bis 3000 Lux) .
Die Selektion gegen Agrobakterien und untransformier e Blatteile erfolgt durch Umlegen der Blattstücke auf SHICef25o,κanioo"Med:LUin (Zusammensetzung wie das SHI-Medium mit zusätzlich 250 mg/1 Cefotaxim und 100 mg/1 Kanamycin) .
Nach 4 bis 6 Wochen werden die regenerierten Sprosse, die an den Schnittstellen entstanden sind, abgetrennt und in PMcefi25,κanioo~Me<:ium (Zusammensetzung wie das entspre¬ chende SHI-Medium, aber ohne Zusatz von Naphthylessig- säure, 6-Benzylaminopurin, Inositol, Thiamin, Pyridoxin und Nicotinsäure) in 450 ml Weckgläsern zur Bewurzelung gesteckt. Bei einer Größe von ca. 10 cm werden die Pflan¬ zen vorsichtig an den Wurzeln vom Agarmedium befreit und in sterilisierte Erde gesetzt.
(3) Analyse der transgenen Tabakpflanzen auf PHB-Gehalt
Blattmaterial der unter Punkt (2) erhaltenen transgenen Pflanzen wird unter flüssigem Stickstoff gemδrsert. Für die Extraktion der frei in den Pflanzen vorliegenden PHB wird das gepulverte Blattmaterial in 0,75 M Natriumacetat- Lδsung pH 4,0 suspendiert und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wird abgenommen, zur Trockene einge- dampft, in Methanol/Wasser/Ameisensäure (30 : 69,3 : 0,7) aufgenommen und HPLC-chromatographisch untersucht.
Zur Bestimmung der gebundenen PHB (z.B. Ester, Glucoside) wird das gepulverte Pflanzenmaterial in l M HCl eine Stunde bei 80°C hydrolysiert, mit Ethylacetat extrahiert und wie oben beschrieben analysiert.
Transformierte Pflanzen zeigen im Vergleich zur Wildtyp- Pflanze einen um den Faktor 50 erhöhten Gehalt an freier PHB (2,3 μg/g Frischgewicht) sowie einen um den Faktor 1150 erhöhten Gehalt an gebundener PHB. Die PHB liegt in den transgenen Pflanzen zu ca. 50 % glucosidisch gebunden vor. Ihr Gehalt an PHB-Glucosid beträgt ca. 0,3 mg/g Frischgewicht. Zudem werden weiter phenolische Substanzen angereichert.
(4) Biologische Wirkung der erhöhten Konzentration bestimmter Sekundärstoffe in den transgenen Tabakpflanzen auf Tabak- Mosaik-Virus (TMV)
Zum Test auf TMV-Resistenz wird eine Suspension des Virus mit Kieselgur unter leichtem Druck mit einem Pinsel auf die Blätter von transgenen und Wildtyp-Tabakpflanzen (Kultivar Petite Havanna SRI) aufgetragen.
Da sich in den Petite Havanna-Pflanzen das Virus syste¬ misch ausbreitet und keine lokalen Läsionen bildet, werden nach ca. 10 Tagen die Blätter der Tabakpflanzen gemδrsert und der Extrakt wie vorstehend beschrieben auf Blätter des Tabakkultivars Nicotiana tabacu cv. Xanthi aufgetragen. Nach ca. drei Tagen werden die bei diesen Pflanzen aufge¬ tretenen lokalen Läsionen beobachtet.
Als Ergebnis zeigt sich, (i) daß sich in den untransfor- mierten Kontrollpflanzen von N. tabacum cv. Petite Havanna ein hoher TMV-Titer etablieren kann, (ii) daß die TMV-ver- mehrung in transgenen mit pROK-TPO-ubiC transformierten Pflanzen deutlich vermindert wird und (iii) daß in trans¬ genen mit pROK-ubiC transformierten Pflanzen im wesentli¬ chen kein TMV nachweisbar ist.
Zusammengefaßt kann festgestellt werden, daß die erfindungsge¬ mäßen transgenen Tabakpflanzen, die das ubiC-Gen aus Escheri ¬ chia coli enthalten, eine deutlich erhöhte Pathogenresistenz im Vergleich mit Wildtyp-Pflanzen zeigen und keine neuen In¬ haltsstoffe mit unbekannter Wirkung und Toxikologie bilden, sondern sie enthalten überraschenderweise eine erhöhte Menge an p-Hydroxybenzoesäure (eine in allen Organismen natürlich vorkommende Substanz mit bekannten Eigenschaften) und deren Derivate, insbesondere p-Hydroxybenzoesäureglucosid, die für die Pathogenresistenz verantwortlich sind.

Claims

Patentansprüche
1. Transgene Pflanze mit mindestens einer heterologen DNA- Sequenz, die für mindestens ein Polypeptid mit enzymatischer Aktivität kodiert, worin das Polypeptid exprimiert wird, in enzymatisch aktiver Form vorliegt und mindestens einen Sekun¬ därstoff in einer antiviral und/oder bakterizid und/oder fun- gizid und/oder insektizid und/oder als Repellent wirkenden Konzentration enzymatisch erzeugt.
2. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, wobei die heterologe DNA-Sequenz aus Bakterien stammt.
3. Transgene Pflanze nach Anspruch l oder 2, wobei die heterologe DNA-Sequenz aus Escherichia coli stammt.
4. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wo¬ bei die heterologe DNA-Sequenz die folgende Sequenz enthält:
ATGTCACACCCCGCGTTAACGCAACTGCGTGCGCTGCGCTATTGTAAAGAGATCCCTGCCCT GGATCCGCAACTGCTCGACTGGCTGTTGCTGGAGGATTCCATGACAAAACGTTTTGAACAGC AGGGAAAAACGGTAAGCGTGACGATGATCCGCGAAGGGTTTGTCGAGCAGAATGAAATCCCC GAAGAACTGCCGCTGCTGCCGAAAGAGTCTCGTTACTGGTTACGTGAAATTTTGTTATGTGC CGATGGTGAACCGTGGCTTGCCGGTCGTACCGTCGTTCCTGTGTCAACGTTAAGCGGGCCGG AGCTGGCGTTACAAAAATTGGGTAAAACGCCGTTAGGACGCTATCTGTTCACATCATCGACA TTAACCCGGGACTTTATTGAGATAGGCCGTGATGCCGGGCTGTGGGGGCGACGTTCCCGCCT GCGATTAAGCGGTAAACCGCTGTTGCTAACAGAACTGTTTTTACCGGCGTCACCGTTGTAC
5. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wo¬ bei das Polypeptid das Enzym Chorismat-Pyruvat-Lyase oder das Enzym Isochorismat-Pyruvat-Lyase (= Salicylat-Synthase) ist.
6. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche l bis 5, wo¬ bei der Sekundärstoff ein pflanzeneigener Stoff ist.
7. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche l bis 6, wo¬ bei der Sekundärstoff ein Phenolderivat ist. 96/0
- 14 -
8. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche l bis 7, wo¬ bei der Sekundärstoff p-Hydroxybenzoesäure und/oder deren De¬ rivat (e) ist.
9. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche l bis 8, wo¬ bei die Konzentration des Sekundärstoffs mindestens das lOfache bezogen auf die Konzentration des Sekundärstoffs im Wildtyp beträgt.
10. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze nach einem der Anspruch 1 bis 9, worin eine Pflanzenzelle durch stabile Integration der heterologen DNA-Sequenz in das geneti¬ sche Material transformiert wird und die transformierte Pflan¬ zenzelle zur transgenen Pflanze regeneriert wird.
11. Verwendung der transgenen Pflanze nach einem der Ansprü¬ che l bis 9 als pathogenresistente und/oder gegen Freßfeinde und/oder Parasiten resistente Pflanze im Wald-, Weide-, Wie¬ sen-, Zierpflanzen- oder Nutzpflanzenbau.
12. Verwendung einer heterologen DNA-Sequenz, die für minde¬ stens ein Polypeptid mit enzymatischer Aktivität kodiert, zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit mindestens einem durch das Polypeptid erzeugten pflanzeneigenen Sekundärstoff in einer antiviral und/oder bakterizid und/oder fungizid und/oder insektizid und/oder als Repellent wirkenden Konzen¬ tration.
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