PT776160E

PT776160E - Uso de saponina para controlo de patogenos

Info

Publication number: PT776160E
Application number: PT95944559T
Authority: PT
Inventors: Ralph W Emerson; Bradford G Crandall
Original assignee: Proguard Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1995-12-29
Publication date: 2000-08-31
Also published as: ES2145943T3; JPH11507666A; US5639794A; BR9508560A; WO1996041528A1; CA2196973A1; DK0776160T3; NZ301472A; MX9701003A; EP0776160A1; EP0776160B1; ATE190194T1; DE69515487T2; DE69515487D1; CN1159739A; AU4690696A; GR3033610T3

Description

Τ'.ζΛ'ΜΗο -1 - DESCRIÇÃO "USO DE SAPONINA PARA CONTROLO DE PATÓGENOS"

INTRODUÇÃO

Campo da Invenção A invenção relaciona-se com o uso de saponina como um sinergista em métodos e preparações para controlar a colonização e/ ou o crescimento de patógenos de plantas ou animais sobre um material. A invenção é exemplificada pelo uso de composições compreendendo saponina em combinação com aldeído cinâmico, aldeído a-hexilcinâmico, e/ ou aldeído coniferílico para controlar o crescimento de fungos e insectos parasitas que colonizam as superfícies de partes de plantas e tecidos destas.'

Antecedentes da Invenção

Os pesticidas e fungicidas são normalmente concebidos para tratar ou livrar uma planta ou material hospedeiro de um organismo infestante. Os pesticidas e fungicidas geralmente usados são aplicados às superfícies de uma planta ou parte da planta que estão colonizadas pelos organismos. Os organismos colonizadores incluem insectos sugadores de seiva e fungos patogénicos; ambos os grupos são capazes de infligir sérios danos à planta hospedeira, incluindo a atrofia do crescimento da planta hospedeira e a diminuição da produtividade da planta, até matar a planta hospedeira. -2-

Os insectos patogénicos que infestam as plantas incluem aquelas espécies de insectos que são simbióticas com as bactérias, tais como afídeos, cigarrinhas, e mosca branca; o insecto hospedeiro não pode sobreviver sem os simbiontes. Como exemplo, os afídeos (homoptera) possuem bactérias simbióticas do género Buchnera em células chamadas micetócitos dentro do hemocelo. As bactérias são transmitidas directamente do afídeo materno para os seus descendentes e os afídeos aposimbióticos não ocorrem naturalmente. As bactérias podem fornecer lípidos que são necessários para a embriogénese do / insecto hospedeiro mas que estão ausentes ou em concentrações baixas na seiva floema em plantas infectadas pelos insectos.

Os patógenos das plantas também incluem a filoxera da uva (Daktulosphaira vitifoliaé), um insecto parecido corn os afídeos, e nemátodos. A filoxera é nativa dos Estados Unidos a leste das Montanhas Rochosas, onde habita em espécies selvagens nativas de uvas, que desenvolveram resistência à alimentação do insecto. A uva Europeia (Vitis vinifera), que é usada para produzir vinho, desenvolvèu-se na Ásia ocidental e não tem qualquer resistência à filoxera. Foi anunciada a existência de nemátodos de caule e bolbo (Ditylertchus dipsaci) em todas as principais regiões agrícolas da Califórnia. Esta larga distribuição provavelmente reflecte sua disseminação em material de plantação infestado tal como dentes de alho. Onde quer que tal material infestado cresça, o nemátodo pode ser introduzido. O Ditylertchus dipsaci pode ser encontrado parasitando uma vasta gama de plantas cultivadas e selvagens. Os nemátodos produzem galhas em tecidos infestados. Para além dos distúrbios causados à plantas pelas próprias galhas de nemátodos, o dano às plantas infectadas é aumentado por certos fungos parasíticos, que podem facilmente ligar-se aos tecidos enfraquecidos da raiz e às células hipertrófidas e não diferenciadas das galhas. Além disto, alguns fungos, por exemplo, Pythium, Fusarium, e Rhizoctonia, crescem e reproduzem-se muito mais rapidamente nas galhas do que em outras áreas da raiz, induzindo deste modo uma destruição prematura dos tecidos da*raiz.

Fungos que são patogénicos para plantas ocorrem na maioria dos grupos de fungos. Alguns, tais como ferrugens (Uredinales, Phragmidrium), míldio pulverulento (Eryciphacea, Sphaerotheca) e míldio plumoso (Peronosporacea) são parasitas obrigatórios associados com plantas hospedeiras específicas que elaboram nutrientes requeridos pelo patógeno. Além disto, fungos dos géneros Aspergillus, Alternaria, Fusarium e Penicillium podem contaminar colheitas de alimentos e seus produtos, todos estes fungos sendo conhecidos por produzir micotoxinas tais como aflatoxinas, fumonisinas, ácido fusárico, toxinas TA/AAL, zearalenona, e tricoteceno, ácido 5-butilpicolínico e derivados de piridina fitotóxica relacionados. Estas micotoxinas são altamente tóxicas para uma variedade de espécies incluindo plantas e seres humanos e podem ser encontradas em alimentos preparados comercialmente inclusive leite e produtos do leite, feijões, cereais, cocos, amendoins, batatas doces e rações animais preparadas comercialmenté.

Uma variedade de composições de pesticidas e fungicidas é usada para controlar patógenos de plantas. Por exemplo, aspersões de fungicidas protectoras num programa de 6 -7 dias são o meio de controlo típico, tanto para a ferrugem como para o míldio pulverulento quando as condições ambientais favorecem o desenvolvimento de doenças. Dois fungicidas sistémicos frequentemente usados são benomil e triforina. Os fungicidas mais antigos também incluem compostos inorgânicos tais como cobre e enxofre e os protectores orgânicos tais como thiram, captom, mameb, e clorotolonil. Estes compostos agem somente na superfície da planta e devem estar presentes no aparecimento do patógeno fúngico ou antes deste a fim de evitar a infecção. Estes fungicidas mais antigos são inibidores que actuam em muitas frentes, isto é, -4- -4-

afectam muitas actividades metabólicas num fungo.

Os fungicidas mais recentes tendem a ser sistémicos orgânicos altamente eficazes tais como benzimidazolas, inibidores da biosíntese do esterol, carboxanilidas, e fenilamidas que agem tanto intemamente como na superfície da planta. Em contraste com os protectores de superfície mais antigos, os fungicidas sistémicos são geralmente eficazes em dosagens muito mais baixas e podem curar infecções fúngicas estabelecidas, um factor crítico na gestão de doenças. Os ,) fungicidas sistémicos agem geralmente para alcançar um único alvo no fungo, interferindo com processos metabólicos específicos que são necessários para a produção de todo novo material de células necessário para o crescimento, manutenção, e virulência do organismo do fungo. Estas preparações são tipicamente eficazes apenas contra patógenos fúngicos. O uso disseminado de pesticidas, fungicidas e conservantes químicos tem resultado no desenvolvimento e evolução de patógenos resistentes. À medida que preocupações relativas ao meio ambiente e ao cuidado com a saúde continuam a aumentar, será necessário identificar e/ ou desenvolver novos pesticidas e fungicidas para satisfazer os padrões ambientais do futuro, particularmente aqueles que são produtos naturais para consumo por animais e t deste modo ter menos toxicidades animais e ambientais. E, portanto, de interesse desenvolver novos métodos e são necessárias formulações para controlar patógenos de plantas e animais e para diminuir o nível de metabólitos tóxicos presentes em produtos consumíveis e no ambiente em geral elaborados pelos patógenos. As saponinas são um tipo de esterol glicósido largamente distribuído em plantas. As saponinas têm actividades biológicas diversificadas encontrando uso em agentes utilizados como fungicidas, insecticidas, agentes anticancro, cosméticos, conservantes de alimentos e fertilizantes com promoção de crescimento e efeitos insecticidas. A saponina é também usada para remover -5- colesterol de produtos lácteos e como um suplemento alimentar para animais, tais como galinhas, a fim de reduzir os níveis de colesterol nos ovos e reduzir o odor do esterco. Apesar destes inúmeros e diversificados usos da saponina, o efeito combinado de saponina com outros agentes tendo actividades pesticidas e/ ou fungicidas permanece largamente inexplorado.

Literatura Relevante O uso de saponina de agave em composições para proteger seres humanos e outros animais contra insectos nocivos tais como mosquitos e carrapatos é descrito no Pedido de Patente Britânico no. 9203522. Um fertilizante com efeitos de promoção de crescimento e insecticidas que contem saponina, lenhina, fósforo, nitrogénio, potássio, e metais terrosos raros é revelado no Pedido de Patente Canadiano no. 90100605. Um conservante de alimentos contendo saponina de madeiras de aloés e um éster de ácido benzóico p-hidroxi é revelado no Pedido de Patente Japonês no. 61065802. O uso de composições contendo saponina de Yucca schidigera ou Y. Hedera helix contra moluscos não aquáticos tais como caracóis e lesmas é revelado na Patente U. S. No. 5,290,557. O efeito de saponina sobre ninfas de gafanhotos é revelado por Westcott et al. (1992) Ann. Entomol. Soc. Am. 85 (3) : 304-309. Um fármaco anti-fungico contendo extractos de saponina de espargos é revelado no Pedido de Patente Japonês no. 2157205. As propriedades antimicrobianas de agentes compreendendo um ou mais sumos prensados de uma variedade de plantas e/ ou extractos de solventes ou seus condensados em composições de ácido acético são reveladas no Pedido de Patente Japonês no. 91106370. A actividade antimicrobiana e contra insectos nocivos de uma saponina isolada a partir de polpa de fruta, tabaco, e semente é descrita por Okunji et al., (Int. J. Crude Drug Res., (1990) 28 (3) : 193 - 199), Gruenweller et al., (Phytochemistry (Oxf), (1990) 29 (8) : 2485 - 2490), e por Lalithat et al, (Int. Pest Control (1988) 30 (2) : 42 - 45), respectivamente. O uso de uma saponina de folhas de camélia para o controlo da antrose, germe de arroz, e mancha de folha de arroz helminthosporium é descrito no Pedido de Patente Japonês no. 61007290. As propriedades antimicrobianas das saponinas são também anunciadas no Pedido de Patente Alemão no. 3724595. A Patente U. S. No. 2,465,854 descreve uma composição insecticida contendo um derivado de aldeído cinâmico. O controlo de Verticillium usando cinamaldeído no substrato no qual crescem os cogumelos é revelado na Patente U. S. No. 5,149,715. A Patente U. S. No. 4,402,950 descreve a desactivação de vírus dentro de organismos animais e humanos vivos, pela aplicação de um terpeno que pode ser obtido a partir de plantas aromáticas pela aplicação de vapor. Os terpenos citados são: óleo de pimenta preta, óleo de pó de canela, óleo de cardamomo, acetato de linalilo, aldeído cinâmico, saffol, carvona, e cis/ trans citrao. A Patente U. S. No. 4,477,361 descreve um composto cinâmico contendo um surfactante antimicrobiano que é tomado essencial para a superfície que está a ser lavada.

As propriedades antibotulinianas de vários aldeídos aromáticos e alifáticos são reveladas em Bowles e Miller (J. Food Protection (1993) 56 : 788 -794). Foram anunciadas outras formulações que incluem aldeído cinâmico para proteger plantações contra o ataque de micróbios patogénicos. A este respeito ver as Patentes U. S. Nos. 4,978,686 e 5,149,715 e o Pedido de Patente Francês no. 2529755.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com formulações contendo sapo- -7- nina e métodos para o seu uso para controlar a colonização e/ ou o crescimento de r patógenos de plantas e animais sobre um material. E fornecido um método para controlar organismos patogénicos em plantas, bem como sementes e mudas e para fornecer sementes de plantas e mudas substancialmente livres de patógenos de plantas. O método inclui o passo de por em contacto uma ou mais partes ou tecidos de uma planta doente ou uma planta susceptível a ataques por patógenos com uma formulação contendo saponina numa quantidade suficiente para controlar o crescimento de organismos patogénicos alvo. São também fornecidos métodos e composições contendo saponina para controlar o nível de metabólitos tóxicos presentes numa variedade de produtos consumíveis que são ou colonizados ou capazes de ser colonizados por microorganismos produtores de toxinas. Estes métodos incluem os passos de por em contacto um produto consumível ou um precursor de tal produto com um agente redutor de toxina e/ ou antipatogénico contendo saponina que limita a colonização de um ou mais microorganismos que colonizam o material consumível ou precursor e que produz toxina(s), os mata ou os desloca A invenção encontra uso no tratamento de plantações agrícolas contra organismos patogénicos e no controlo do nível de metabólitos tóxicos presentes em produtos consumíveis derivados de materiais de plantas, bem como na diminuição da contaminação da cadeia alimentar por toxinas fúngicas e metabólitos tóxicos. As composições usadas podem incluir além da saponina, aldeídos aromáticos, tais como aldeído cinâmico, aldeído a-hexilcinâmico, e aldeído coniferílico. As formulações de saponina são também usadas para matar nemátodos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS São fornecidos métodos e formulações empregando saponina como sinergista em combinação com um produto natural, tal como um ou mais aldeídos aromáticos, para controlar substancialmente a colonização e/ ou crescimento de -8- patógenos de plantas e animais, tais como fungos, insectos, aracnídeos e moluscos não anfíbios/ não aquáticos, sobre materiais tais como plantas, partes de plantas e produtos agrícolas que são capazes de sustentar o crescimento ou então ser colonizados e infestados por patógenos. De preferência, a saponina age como um sinergista com o produto natural. As composições são aplicadas à planta quer seja antes da colheita quer seja a uma planta ou outro material depois da colheita e/ ou processamento. O mais preferencialmente, a composição é aplicada à planta, parte da planta ou tecido desta antes da colheita. A composição é de preferência biodegradável e o mais preferencialmente é fornecida como uma solução aquosa ou como uma emulsão num surfactante não-iónico anidro biodegradável solúvel na água, tal como Tween 80. A susceptibilidade de um patógeno específico à composição pode ser avaliada tanto in vitro como in vivo. Por "sinergista" deve entender-se um composto que aumenta o efeito de pelo menos um outro composto presente numa formulação pela qual a acção combinada é maior do que a soma de suas acções individuais, separadas. Por "produto natural" deve entender-se um composto orgânico de origem natural que seja único a um organismo,' ou comum a um pequeno número de organismos intimamente relacionados, e inclui metabólitos secundários de fungos e químicos produzidos por plantas. Como exemplo, um fungo e/ ou insecto colonizando a superfície de uma parte da planta tal como uma folha, raiz ou parte da flor, ou um tecido tal como xilema ou floema, é posto em contacto com um produto natural para matar, deslocar ou então retardar ou eliminar o crescimento do patógeno. Por "colonização" deve entender-se a associação de um microorganismo ou insecto com um material tal como uma parte da planta ou tecido desta do qual o patógeno retira nutrientes, tipicamente nutrientes essenciais tais como amino ácidos, particularmente metionina. Por "crescimento" deve entender-se uma mudança irreversível num o organismo acompanhada pela utilização de material, e resultando em aumento de volume, peso seco ou conteúdo de proteína e/ ou aumento na população ou colonização. Por "patógeno" deve entender-se um -9- organismo tal como fungo, bactéria, insecto, aracnídeo, verme e moluscos não-anfíbios/ não':aquáticos causando dano ou doença a um hospedeiro biológico. Por "material" deve entender-se qualquer substância capaz de sustentar a colonização e/ ou o crescimento de um patógeno alvo. O método para biocontrolar infestações de patógenos em plantas é usar uma formulação contendo uma ou mais saponinas em combinação com aldeídos aromáticos, particularmente usando compostos que ocorrem naturalmente tais como os aldeídos aromáticos, aldeído cinâmico, aldeído α-hexilcinâmico e aldeído coniferílico. Por "biocontrolo" deve entender-) se o controlo de patógenos de plantas através de actividade antipatogénica directa e/ ou resistência induzida da planta hospedeira a infestação por patógenos.

As composições e métodos da invenção em apreço oferecem várias vantagens sobre composições e métodos existentes. Pela identificação e exploração das propriedades antipatogénicas da saponina, a quantidade ou concentração eficazes de ou mais ingredientes da formulação podem ser modificadas ao mesmo tempo que se diminuem os efeitos fitotóxicos e se preserva ou realça o efeito antipatogénico da formulação, particularmente permitindo uma redução na concentração de um ou mais ingredientes numa dada formulação. Como exemplo, embora tenha sido relatado que um aldeído aromático, aldeído cinâmico, exibe propriedades antifúngicas, não foi anterior-mente usado em plantas em combinação com saponina. Uma única aplicação de uma emulsão de saponina contendo aldeído cinâmico é suficiente para uma protecção a longo prazo da planta hospedeira contra os organismos patogénicos, incluindo tanto a ferrugem como o míldio pulverulento, e é eficaz em concentrações mais baixas do que foi relatado anteriormente. As formulações da invenção em apreço são também eficazes contra insectos nocivos conhecidos por serem resistentes a tratamentos convencionais, inclusive insectos nocivos tais como tisanópteros e afídeo do melão. A fitotoxidade da formulação é também diminuída devido à menor concentração de aldeído que é usada, o menor número de aplicações requerido, e à unidade de esteróide da saponina. Deste modo são realizadas economias significativas de custos e de impacto ambiental. Além disto, o controlo a longo prazo de organismos patogénicos resulta numa planta mais saudável e num rendimento de produto melhorado da planta hospedeira em comparação com plantas não tratadas; as menores concentrações e a dose única de agentes antipatogénicos diminuem a possibilidade de dano para a planta ou sua plantação bem como diminuem a possibilidade de quaisquer efeitos colaterais adversos para os trabalhadores que aplicam o pesticida, ou para os animais, peixes ou aves que ingiram os tecidos de plantas tratadas ou partes destas.

As formulações em apreço também proporcionam controlo efectivo tanto de fungos como de insectos, eliminando a necessidade da aplicação de agentes múltiplos. Em situações específicas, tais como quando um insecto danifica uma parte da planta ou tecido desta e uma doença fúngica secundária se desenvolve, este aspecto da invenção é particularmente vantajoso. Outra vantagem é que a contaminação de produtos agrícolas consumíveis pode ser evitada ou diminuída de forma significativa até um nível seguro para consumo. Os produtos agrícolas podem ser tratados tanto antes como depois da colheita. Além do mais, tratando uma planta no campo com uma substância que mata ou desloca fungos produtores de micotoxinas, os níveis de contaminação por toxinas pode ser reduzido de forma significativa no material colhido.

As saponinas são uma classe de compostos, cada um consistindo em uma porção de sapogenina e uma unidade de açúcar. S. Budavari, ed., The Merck Index, 11a ed., Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., 1990, p. 1328. As saponinas para uso nas presentes formulações são um tipo de esterol glicósido largamente distribuído nas plantas, em que cada saponina consiste em uma sapogenina e pelo menos uma unidade de açúcar. A sapogenina compreende um esteróide ou um triterpeno e a unidade de açúcar pode compreender glicose, -11 - galactose, pentose, ou metilpentose. As saponinas mais preferidas para uso na presente invenção são derivadas de plantas de iuaca, com as mais preferidas sendo extractos de saponina da Yucca schidigera ou Y. valida. É conhecida uma variedade de saponinas relacionadas estruturalmente, sendo que a característica estrutural mais variável é o padrão de glicosilação. Id. As saponinas também podem conter modificações adicionais, tais como as sarasaponinas que são saponinas com um esteróide anexado, e a estrutura da saponina pode ser modificada por qualquer quantidade de meios enzimáticos, químicos e/ ou mecânicos conhecidos da técnica. As saponinas da Yucca schidigera contêm saponinas esteroidais, com as sapogeninas mais importantes sendo a sarsapogenina e tigogenina. A sarsaponina produz em hidrólise, sarsasapogenim (sarsasapogenim 5-beta, 20-betaF, 22-deltaF, 25-betaF; também conhecida como espirostano-3-beta-01 e parigenina), glicose e galactose. O sarsasapogenim tem uma fórmula molecular de C27H44O3. Nobel, Park S., Agaves, Oxford Univ. Press, Nova Iorque, 1994.

As saponinas para uso na presente invenção podem ser isoladas a partir de uma fonte natural, ser total ou parcialmente sintéticas, ou ser produzidas por técnicas recombinantes. Como exemplo, elas podem ser produzidas e/ ou isoladas de várias partes de plantas inclusive a fruta, folha, semente e/ ou raiz, usando meios conhecidos da técnica, de uma variedade de fontes inclusive as várias plantas conhecidas por produzi-las variando desde a iuaca, quilaia, agave, tabaco, alcaçuz, soja, ginseng e espargos até madeiras de aloés. As saponinas para uso na presente invenção são de preferencia não tóxicas para os seres humanos e animais superiores nas concentrações usadas. Mais preferencialmente a saponina para uso na presente invenção é de graduação alimentar não-tóxica, sendo a fonte as plantas de iuaca. Ainda mais preferidas são as saponinas da Yucca schidigera ou Y. valida e suas equivalentes. Tanto para controlo de fitotoxicidade como para segurança toxicológica, as saponinas preferidas são as - 12- da Yucca spp. e as saponinas preferidas que não ligam colesterol incluem as dos espargos. As~saponinas são geralmente preparadas por um processo de extracção de prensa a frio e o extracto de líquido resultante analisado por HPLC para verificação da concentração de saponina. A fibra da iuaca também pode ser usada; ela é tipicamente seca ao sol, aromatizada e calibrada por peneiramento.

Derivados destes compostos que produzem uma formulação tendo o desejado efeito antipatogénico e/ ou fitotóxico são considerados equivalentes da ) invenção. Dependendo da sua estrutura, uma dada saponina poder ter uma propriedade específica e encontrar uso nas presentes formulações. De um modo geral, as saponinas podem ser usadas numa variedade de formulações, por exemplo, como insecticidas, fungicidas, biocidas em geral, surfactantes, agentes emulsionantes, aromatizantes e formulações de suplemento alimentar. Estas actividades diversificadas são atribuíveis à formação química de uma saponina específica e em geral depende da fonte da qual a saponina é derivada. Por exemplo, saponinas derivadas de Camélia Japonesa controlam o crescimento de larvas de mosquito. Saponinas de outras fontes que não sejam de plantas de iuaca podem ser usadas como agentes activos em composições insecticidas. As J saponinas das plantas de iuaca são usadas para remover colesterol de produtos alimentícios e como um tratamento biocida e como agente anti-aglomeração/ emulsionante para resíduo de detrito e outros sistemas de biomassa. As sarasaponinas derivadas das plantas de agave, por exemplo, encontram uso como agentes humedecedores e com outros compostos para o tratamento de doenças fúngicas em seres humanos. E de especial interesse o uso das saponinas como sinergistas para aumentar o efeito de pelo menos um outro composto presente numa formulação para aplicação contra vários patógenos, microorganismos produtores de toxina ou seus metabólitos tóxicos pelos quais a acção combinada dos ingredientes da

-13- formulação é maior do que a soma das suas acções separadas individuais e/ ou variação de" actividade. O uso de um sinergista permite uma redução na concentração de um ou mais outros ingredientes numa dada formulação ao mesmo tempo que mantém a eficácia da formulação de modo substancial. A combinação de tal componente com outros ingredientes da formulação pode ser alcançada em um ou mais passos em qualquer etapa adequada de mistura e/ ou aplicação. É preferível seleccionar uma saponina que aumenta de maneira óptima o efeito redutor de toxina e antipatogénico da formulação. De um modo geral ) uma quantidade eficaz de saponina está na variação de cerca de 0,1 a 3 % e mais preferencialmente de cerca de 0,25 % v/v de solução aquosa a 10° brix de extracto de saponina. 10° brix é um termo técnico na química do açúcar. Os graus brix equivalem à percentagem em peso de açúcar na solução. Hawley, ed., The Condensed Chemical Dictionary, 10” Ed., Van Nostrand Reinhold, Nova Iorque, 1981, p. 149.

Uma saponina que proporciona a desejada actividade é mais preferencialmente seleccionada para combinação com pelo menos um dos vários aldeídos, principalmente aldeídos aromáticos que podem ser usados para matar directamente os patógenos fúngicos ou de insectos e/ ou para a indução da resistência sistémica da planta a vários patógenos fúngicos ou de insectos. Deste modo, estes agentes antipatogénicos compreendem de preferência pelo menos uma saponina como sinergista em combinação com pelo menos um aldeído aromático modulador do crescimento de patógenos numa quantidade suficiente para controlar o crescimento de um organismo patogénico alvo. Por "controlo de crescimento" deve entender-se matar o patógeno e/ ou atrasar ou deter a sua proliferação. Os patógenos incluem insectos, fungos e outros microorganismos que afectam de forma negativa as plantas que colonizam.

As formulações em apreço incluem preferencialmente, além de saponina, o composto modulador de crescimento do patógeno como mostrado na fórmula (1) ãbaixo.

em que R representa -CH2OH ou -CHO; n é um número inteiro de 0 a 3; e cada R’ independentemente representa OH ou um substituente orgânico contendo de 1 a 10 átomos de carbono e de 0 a 5 heteroátomos, em que o número total de carbono e heteroátomos em todos os substituentes de R’ do referido composto é não mais do que 15, e R4 representa hidrogénio ou um constituinte orgânico contendo de 1 a 10 átomos de carbono. Estes compostos de aldeído aromático incluem produtos naturais tais como aldeído cinâmico. São também de interesse os aldeídos alfa substituídos, tais como o aldeído a-hexilcinâmico (Hexyl Cinnamic Aldehyde, HCA), aldeído coniferílico e compostos intimamente relacionados.

Muitos dos aldeídos aromáticos e alifáticos que encontram uso na presente invenção, tais como bensaldeído, acetaldeído, cinamaldeído, piperonal, e vanilina são agentes aromatizantes sintéticos geralmente considerados seguros (Generally Regarded As Safe, GRAS) (21 CFR §172.515). O HCA esteve em uso público antes da década de 1950 e hoje é largamente usado em preparações para 0 consumidor (sabões, detergentes, cremes, loções, perfumes) (Monographs on fragrances raw materiais. Food Cosmet. Toxicol. 12 : supl., 915, 1974). Ao HCA foi concedido o status de GRAS (Generally Recognized As Safe) pela FEMA (Flavoring Extract Manufacturers’ Association, Associação dos Fabricantes de Extractos de Aromatizantes). Survey of flavoring ingredient usage leveis. No. - 15- 2569. Fd. Technol., Champaign, 19 : (parte 2) 155, 1965) em 1965 e é aprovado pelo FDA dos Estados Unidos para uso em alimentos (21 CFR121.1164). O Concelho da Europa (1970) (Concelho da Europa. Substâncias Aromatizantes Naturais e Artificiais. Acordo Parcial no Campo da Saúde Pública e Social. Estrasburgo, Lista A(l), Série 1, no. 129, p. 55, 1970) incluiu o HCA na lista de substâncias aromatizantes artificiais admissíveis a um nível de 1 ppm. Vários destes compostos foram reportados como tendo actividade inibidora contra a germinação de esporos de C. botulinum. Bowles e Miller, G. Food Protection /·) (1993)56:788-794.

Um composto preferido incluído nas formulações em apreço é mostrado na fórmula (2) abaixo:

) em que Ri representa -CHO, R2 representa -H, -OH ou um substituente inorgânico contendo de 1 a 10 átomos de carbono, R3 representa -H, um grupo metoxi ou substituente orgânico contendo de 1 a 10 átomos de carbono, e R4 representa um hidrogénio ou um substituente orgânico contendo de 1 a 10 átomos de carbono. Os aldeídos aromáticos são de especial interesse. Exemplos de aldeídos aromáticos de uso na presente invenção são aldeído cinâmico ((3) abaixo):

CHO (3) -16- e aldeído comferílico ((4) abaixo):

-16- CHjO

CHO (4)

Outros compostos de interesse incluem análogos do composto de fórmula (1) tais como compostos substituídos na posição alfa por um alquilo, tal como um grupo hexil, ou um grupo alquilo ramificado tal como um grupo amil. De um modo geral ò grupo na posição alfa é de C-5 a C-10. Tais compostos incluem alfa-hexilcinamaldeído e alfa-amilcinamaldeído. A estrutura química de aldeído alfa-hexilcinâmico (HCA) é mostrado em (5) (abaixo):

O nome do Chemical Abstract Service (CAS) para o HCA é 2-(fenilmetileno) octanal e o Número de Registro no CAS é [101-86-0]. O composto é também descrito pelo nome químico de 2-hexil-3-fenil-2-propenal. A fórmula do composto é Ci5H2oO e o peso molecular é 216,3. O HCA é um composto baixa a moderadamente volátil, tendo uma pressão de vapor de 70 x 10' 5 mm Hg a 25° C. Seu composto precursor, aldeído cinâmico, tem uma pressão de vapor aproximadamente 40 vezes maior (2970 x 10'5 mm Hg a 25° C.) - 17- - 17-

Os aldeídos aromáticos e alifáticos da invenção em apreço podem ser preparados através de vários métodos sintéticos conhecidos dos especialistas na matéria. Por exemplo, a este respeito ver, J. March, ed., Appendix B, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Síructure, 2a Ed., McGraw-Hill, Nova Iorque, 1977. O cinamaldeído pode ser preparado sinteticamente, por exemplo, pela oxidação de cinamil álcool (Traynelis et ai, J. Am. Chem. Soc. (1964) 86 : 298) ou por condensação de estireno com formilmetilanilina (Patente Brit. 504,125). Os aldeídos em apreço também podem ser obtidos por isolamento a partir de fontes naturais. Por exemplo, o cinamaldeído pode ser isolado a partir de fungos de madeira podre, Stereum subpileatum. Birkinshaw et al., Biochem. J. (1957) 66 : 188. O HCA pode ser sintetizado como descrito, por exemplo, na Patente U. S. No. 5,055,621. Numa escala de laboratório, o HCA pode ser sintetizado pela reacção de benzaldeído com octanal sob uma atmosfera de nitrogénio (condensação de aldol) (Personal Communication, Eric Walborsky, Firmenich Chemical Manufacturing Center, Port Newark, Nova Jérsia). A reacção é conduzida num frasco agitado carregado com metanol, 309 ppm de difenilamina, hidróxido de potássio e benzaldeído. A seguir à lenta adição de octanal, a mistura de reacção é trazida a um pH de 7,5 - 9,5 com ácido acético. A seguir à evaporação de metanol e lavagem da mistura de reacção com água, a fase orgânica é transferida para uma unidade de destilação. Aproximadamente de 20 -24 % da carga do frasco é removida como benzaldeído e "leves" ("lights"), com o destilado restante constituindo aldeído alfa-hexilcinâmico "fracção de coração" ("heart cut"). A "fracção de coração" é submetida a um fraccionamento adicional, no qual de 1 - 5 % (em peso) do material é removido em fracções "leves", dependendo da avaliação do odor. O produto final é um óleo amarelo claro tendo uma gravidade específica de 0,955 - 0,965 a 20° C, um índice de refracção de 1,548 - 1,562 a 20° C, um ponto de ebulição de 305° Cal atmosfera, e um ponto de fusão de 26° C. - 18- '0 HCA também pode ser obtido da Firmenich; este produto é composto principalmente do isómero (E)-cis (93,8 % máximo), e do isómero (Z)-trans (6 % máximo). Entre componentes menores está o produto da condensação do próprio aldol de octanal (1 - 1,5 % (Personal Communication, June Burkhardt, Firmenich, Plainsboro, Nova Jérsia). O produto comercial é estabilizado com a adição de 0,04 % de 2, 6-di-tert-butil- /j-cresol (hidroxitolueno butilado ou BHT), que serve como anti-oxidante (Technical Data Sheet, Hexylcinnamic aldehyde 907600, Revision 853, Firmenich Inc., Plainsboro, Nova Jérsia). O HCA pode ser isolado a partir de arroz onde foi reportado como ocorrendo naturalmente. (Givaudan-Roure índex, Givaudan-Roure Corporation, Clifton, Nova Jérsia, 1994, p. 89). A saponina em apreço e as composições de composto de aldeído podem ser usadas tanto sozinhas como em combinação com outras substâncias activas ou inactivas. Em alguns casos a eficácia da formulação pode ser aumentada pela adição de um ou mais componentes à formulação, isto é, um r composto que não seja a saponina ou um composto de fórmula (1). E preferível que o(s) componente(s) adicional(is) minimize(m) a fitotoxicidade de uma formulação específica ao mesmo tempo que aumenta(m) o efeito antipatogénico da formulação. É de particular interesse a adição de adjuvantes a uma formulação. Por "adjuvante” é deve entender-se uma substância adicionada a uma formulação para auxiliar a operação do ingrediente principal. Um adjuvante de aspersão realiza esta função na aplicação de um químico agrícola. Um adjuvante de aspersão eficaz pode ser formulado para conter um ou mais surfactantes, solventes ou co-solventes. Sistemas contendo surfactantes, água e componentes oleosos têm muitas outras possibilidades de formar fases ordenadas; o surfactante pode organizar-se em agregados de vários formatos para criar micelas, com uma fase de primeira ordem como uma das possibilidades. O surfactante também -19- pode aglomerar-se no interface entre as fase de interpenetração de óleo e água para criar uma microemulsão. Por exemplo, a formulação pode ser tomada essencial pela inclusão de um agente emulsionante tal como Tween 80. Outros detergentes que podem ser usados incluem detergentes aniónicos tais como aqueles que são descritos no Pedido de Patente U. S. No. 4,978,686. De um modo geral, os detergentes e outros agentes usados na formulação não se afastam das propriedades pesticidas dos aldeídos aromáticos mas sim, aumentam as propriedades essenciais da formulação (a este respeito, ver, por exemplo, o Pedido de Patente U. S. No. 4,477,361) e podem melhorar as propriedades pesticidas.

Componentes adicionais tais como uma formulação aquosa de um sal de um ácido poliprótico tal como bicarbonato de sódio, sulfato de sódio, fosfato de sódio ou bifosfato de sódio podem opcionalmente ser incluídos na formulação a fim de aumentar as propriedades antifungicas ou insecticidas da formulação. A emulsão resultante é diluída até alcançar uma concentração apropriada para uso.

As preparações mais eficazes para composições que incluem uma saponina e compostos de fórmula (1), (2), (3), (4) e/ ou (5) podem ser determinadas usando protocolos tais como os descritos nos Exemplos e outros métodos conhecidos dos especialistas na matéria. A optimização de cada formulação pode ser alcançada como desejado incluindo pelo menos um outro composto que não seja a saponina para aumentar o efeito de pelo menos um outro composto presente na formulação. Cada formulação é avaliada pelos seus efeitos sobre insectos nocivos específicos e/ ou hospedeiro planta usando saponina e qualquer dos compostos de fórmula (1) bem como outros componentes da formulação tais como Tween 80 e/ ou bicarbonato de sódio, com a combinação e a quantidade eficaz de cada componente adaptadas para uma aplicação específica -20- para minimizar a fitotoxicidade ao mesmo tempo que mantém ou aumenta o efeito antipatbgénico da formulação.

De particular interesse é a optimização da formulação para aumentar a média da resistência a doença contra uma larga variação de patógenos. A quantidade eficaz de cada componente pode ser determinada variando sistematicamente a quantidade daquele componente numa formulação de teste, tratando uma planta de interesse com a formulação de teste, e monitorando o nível de infestação de insectos nocivos em comparação com uma planta de controlo não tratada. Como exemplo, várias concentrações de saponina podem ser aplicadas como uma aspersão separada a uma planta em aplicações que empregam uma série de preparações contendo quantidades variáveis de um dado aldeído aromático e/ ou outro componente. Uma quantidade eficaz de um componente de teste pode ser identificada como a quantidade que controla o crescimento do patógeno no hospedeiro planta, reduzindo deste modo a taxa de doença da planta. A média da resistência a doença (MPDC) pode ser calculada para cada aplicação específicà. MPDC é definida pela fórmula: (MDIC-MDIT) MPDC = - x 100

MDIC e MDIC = % Média de incidência de doença em controlosnão tratados MDIT = % Média de incidência de doença no tratamento

De um modo geral, para controlo patogénico eficaz a percentagem média de controlo de doença (MPDC) é maior do que 60 %, preferencialmente pelo menos acerca de 70 %. Uma quantidade eficaz de uma saponina é tipicamente medida como cerca de um equivalente em actividade de um controlo de extracto de saponina de Y. schidigera compreendendo cerca de 0,05 % a 3 % -21 - v/v e preferencialmente cerca de 0,25 % v/v de solução aquosa de extracto de saponina a 1(P brix.

As preparações são também avaliadas para fitotoxicidade; é, portanto, importante que pelo menos uma avaliação da toxicidade das formulações seja em plantas vivas da variedade da hospedeira. A fitotoxicidade pode ser taxada como a seguir em ordem crescente de severidade de toxicidade: 0- plantas sem nenhum sintoma; 1- ligeiro acastanhamento do hipocótilo (nenhum outro sintoma); 2- alguma perda de vigor da planta, morte das folhas mais baixas, algum acastanhamento do sistema vascular; 3- perda de vigor da planta inteira, folhas morrendo, hipocótilo com sintomas externos e internos; 4-necrose do caule, planta morrendo. É preferível que a formulação usada tenha uma taxa de fitotoxicidade de 2 ou menos, mais preferencialmente de 1 ou menos. Como exemplo, são avaliados os efeitos de aldeído cinâmico numa variação de 0,1 ppm a 25.000 ppm sobre míldio pulverulento. A média de controlo de doença pode ser aumentada usando doses mais elevadas de aldeído cinâmico, e/ ou adicionando òutros compostos de fórmula (1), ou aumentando a substantividade da formulação pelo acréscimo de detergente, e outros semelhantes.

Uma quantidade moduladora de crescimento eficaz de um componente de teste pode ser identificada à medida que a quantidade que diminui a extensão à qual um insecto nocivo coloniza uma planta hospedeira, quer matando o insecto nocivo quer evitando a sua reprodução. Uma quantidade moduladora de crescimento eficaz de um ou mais compostos de fórmula (1), (2), (3), (4) ou (5) é geralmente de cerca de 0,01 g/1 a 25 g/1, mais preferencialmente de cerca de 1 g/1 a 20 g/1, e o mais preferencialmente de cerca de 5 g/1 a 10 g/1. Numa forma de realização preferida, a formulação inclui saponina e uma quantidade moduladora de crescimento eficaz de aldeído a-hexilcinâmico, -22- aldeído cinâmico e/ ou aldeído coniferílico numa fonnulação contendo Tween 80 como agente"emulsionante e opcionalmente bicarbonato de sódio. A formulação preferida é uma emulsão que contém saponina além de aldeído a-hexilcinâmico, aldeído cinâmico e/ ou aldeído coniferílico (0,5 % a 10 % em peso) e pode incluir o sal de um ácido aprótico (8 % a 12 % em peso) e água de equilíbrio. São preferidas as preparações com de 6 - 12 % de um ácido aprótico. Geralmente, a quantidade total de aldeído(s) presente(s) na formulação é de 5 % ou menos. A formulação preferida para o tratamento de míldio pulverulento, ferrugem e esporos, bem como afídeos é uma emulsão que contém aldeído a-hexilcinâmico, aldeído cinâmico e/ ou aldeído coniferílico (0,001 % a 10 % em peso), o sal de um ácido poliprótico (4 % a 12 % em peso), um agente emulsionante (1 % a 4 % em peso, e a água de equilíbrio. As formulações são eficazes sem o uso de antioxidantes diferentes das propriedades antioxidantes inerentes dos aldeídos específicos, por exemplo, aldeído coniferílico.

Outros compostos podem ser usados sozinhos ou em combinação com as composições, por exemplo H2O2 que é conhecido por matar fungos específicos tais como A. flavus em ambientes alcalinos. Um componente anticongelante tal como glicerol, propileno glicol, etileno glicol, e/ ou álcool isopropílico e uma goma ou material parecido com goma como goma de xantana, goma de acácia, gelatina, hidroxipropil metil celulose e outros semelhantes podem também ser incluídos tais como os descritos na Patente U. S. No. 5,290,557 desde que a quantidade usada não cause danos à planta e/ ou a qualquer colheita tal como frutas. Além disto, para uso antes da colheita, os compostos que induzem resistência da planta não-sistémica ou sistémica a vários fungos podem ser usados para controlar a colonização e/ ou crescimento de certos fungos sob condições em campo. A estabilidade da formulação pode ser avaliada por uma variedade -23- de métodos, incluindo testes acelerados nos quais uma formulação de interesse é exposta a téinperaturas elevadas durante um tempo marcado. Amostras das formulações são tomadas a intervalos regulares e analisadas quimicamente por métodos conhecidos pelos especialistas na matéria a fim de determinar a taxa e a natureza da degradação. Por exemplo, o HCA pode ser analisado por Cromatografia Gás-Líquido (Gas Liquid Chromatography, GLC), usando uma coluna capilar de polidimetilsiloxano não polar de 30 metros (por exemplo, HP-1, Hewlett Packard, ou SPB-1, Supelco) e um detector de ionização por chama. Usando hélio como gás portador (8 ml/ min.) e uma temperatura de coluna de aproximadamente 240° C, o isómero (E)-cis (componente principal) tem um tempo de retenção de aproximadamente 6,0 minutos e o isómero (Z)-trans (componente menor) tem um tempo de retenção de aproximadamente 6,3 minutos.

Para aplicações em que a formulação se destina a ser usada para preparar o solo ou outro substrato de crescimento para plantar as plantas hospedeiras susceptíveis a pátógenos específicos, para aplicar a um substrato de crescimento já infestado, ou a material colhido as preparações da invenção em apreço podem ser directamente adicionadas à região da raiz, ao substrato ou ao material colhido, ou podem ser ligadas a um suporte sólido ou encapsuladas num material de libertação programada. Onde um portador sólido é usado, devem ser evitados materiais que podem levar à oxidação dos aldeídos activos. Exemplos de sistemas de distribuição incluem amido-dextran, e outros semelhantes. Para exemplos de sistemas de distribuição, ver Yuan et al, Fundamental and Applied Toxicology (1993) 20 : 83 - 87. Ver também Kawada et al, (1994) 10 : 385 -389.

Além da saponina e dos compostos específicos das fórmulas (1), (2), (3), (4) e (5) como exposto acima, derivados de qualquer destes compostos que produzem um composto da fórmula identificada acima pela acção de um sistema biológico sobre o derivado são considerados equivalentes aos Compostos da invenção. Deste modo, a aplicação de compostos precursores a partes de plantas ou tecidos destas ou materiais colhidos seriam equivalentes à prática da presente invenção. A conversão biológica de compostos precursores em aldeídos aromáticos é descrita, por exemplo, no Pedido de Patente U. S. No. 5,149,715 e referências nele citadas. Ver também Casey e Dobb Enzyme Microb. Techol. (1992) 14 : 739 - 747. Exemplos de compostos precursores incluem aqueles em vias que se relacionam com a resistência adquirida e/ ou sistémica, a resistência das plantas aos patógenos das plantas tais como os que estão nas vias de amónia liase de amino ácido, e incluem feiilalanina (para produzir ácido cinâmico). Outros compostos precursores de interesse incluem os que estão nas vias biológicas para a produção de lenhinas e cumarinas, por exemplo tirosina para produzir ácido p-cumárico. Deste modo, precursores e derivados destes compostos que produzem uma formulação tendo o efeito antipatogénico e redutor de toxina desejado são considerados equivalentes da invenção. O método da presente invenção é levado a cabo introduzindo num organismo patogénico alvo uma quantidade suficiente de um agente antipotogénico para impedir o crescimento e/ ou a viabilidade do organismo patogénico alvo. Uma formulação contendo o agente antipotogénico é introduzida num tecido de planta ou parte desta, antes ou após a colheita. Os métodos de aplicação incluem aspergir, verter, imergir, injectar, e outros semelhantes, o ingrediente activo na forma de um líquido concentrado, solução, suspensão, pó e outros semelhantes. Por exemplo, a formulação é aspergida como uma formulação húmida ou seca sobre a superfície e/ ou lado inferior das folhas ou outro tecido da planta ou parte de uma planta infectada com um patógeno de planta, ou de uma planta susceptível à infestação com um patógeno de planta, preferencialmente até o ponto de escorrimento quando uma formulação húmida é -25- usada. As plantas podem ser aspergidas antes ou depois da infestação, de preferência antes da infestação. No entanto, a fim de minimizar os danos à planta hospedeira, quando viável, é preferível tratar plantas mais velhas, uma vez que as folhas verdes novas tendem a ser mais sensíveis à fitotoxicidade. Alternadamente, a formulação pode ser aplicada húmida ou seca, quer como parte de um programa de irrigação quer como uma aplicação separada, à região da raiz onde pode entrar em contacto com as raízes e organismos patogénicos associados que colonizam as raízes. Em alguns casos, formulações de libertação programada podem encontrar uso, particularmente para aplicações à zona das raízes, ou a materiais pós colheita. A quantidade da formulação que é aplicada quer à planta propriamente referida quer à região das raízes dependerá do grau de infestação e até certo ponto da formulação e do(s) composto(s) específico(s) usado(s) na formulação e é portanto e empiricamente determinada para produzir melhores resultados. O método de introduzir o(s) ingrediente(s) activo(s) da formulação no organismo alvo pode ser por ingestão directa pelo organismo nocivo a partir de uma superfície tratada da planta, ou por alimentação de um organismo nocivo numa superfície fornecedora de nutrientes de uma entidade hospedeira, que é colonizada pelo organismo nocivo alvo, cuja hospedeira contém ou possui em sua superfície o agente antipatogénico. A presença de um agente anti-patogénico sobre uma superfície fornecedora de nutrientes de uma planta hospedeira pode ser o resultado de contacto directo do agente antipatogénico com a parte da planta ou pode ser pela elaboração da planta hospedeira como resultado da indução de resistência sistémica como efeito secundário ao tratamento prévio da planta com o agente antipatogénico, ou como resultado de modificação genética da planta hospedeira.

Dependendo do organismo alvo, a saponina e/ ou aldeído a ser -26- usado podem ser microencapsulados ou ligados a um suporte sólido opcionalmente através de um ligador tal como um domínio de ligação derivado de uma polisacaridase onde o suporte sólido é um polisacárido tal como celulose, particularmente celulose microcristalina. A preparação dos domínios de ligação de celulose é descrita nas Patentes U. S. Nos. 5,340,731; 5,202,247 e 5,166,317. Domínios de ligação a partir de proteínas estruturadas também podem ser usados. A este respeito ver Shoseyev et al. (Pedido de PCT PCT/ U. S. 94/04132, WO-A-9424158. A saponina e/ ou aldeídos podem estar ligados aos domínios de ligação ou outro suporte sólido com ou sem uma ligação passível de ser clivada, usando métodos bem conhecidos dos especialistas na matéria. As formas sólidas ou microencapsuladas do ingrediente activo são particularmente úteis para o tratamento ou a prevenção de infestações de patógenos nascidos no solo. Técnicas químicas analíticas são usadas para determinar e optimizar a taxa de libertação do ingrediente activo da forma sólida ou microencapsulada. Para fins quantitativos, técnicas de cromatografia gasosa podem ser usadas a fim de determinar a quantidade de aldeído libertado. Por exemplo, amostras de produto encapsulado (peletizado) são misturadas com os tipos de solo seleccionados e testadas em diferentes períodos de tempo para medir a libertação. Gases voláteis libertados da formulação também podem ser analisados. A actividade e estabilidade de aplicações para irrigação foliar e por gotejamento das preparações ao longo do tempo podem também ser avaliadas usando a metodologia de Cromatografia Gasosa usando métodos conhecidos dos especialistas na matéria. Extracções de metanol ou álcool das formulações também podem ser preparadas para análise de HPLC.

Um ou mais componentes das presentes formulações podem ser produzidos na planta de interesse modulando a expressão de um ou mais genes que codificam uma ou mais enzimas ou uma via enzimática ou agregado -27- necessário para controlar o nível do composto de interesse na planta, parte da planta, célula da planta, tecido específico da planta e/ ou associados a uma etapa específica do crescimento da planta. A enzima pode estar numa via biosintética ou numa via de degradação e a regulação será para cima ou para baixo, respectivamente, para modular a expressão de tanto um gene de planta endógeno como um transgene fornecido à planta de forma exógena. Um gene de planta indígeno é aquele que é nativo à genoma da planta hospedeira. Um gene de planta endógeno é aquele que está presente na genoma to tipo selvagem da planta hospedeira de interesse. Pode ser um gene indígeno ou um gene que está presente como resultado da infecção da planta (por exemplo, um gene virai) ou então está naturalmente incorporado no genoma da planta. A planta hospedeira também pode ser modificada por meios recombinantes ou por métodos tradicionais de reprodução de plantas para introduzir um ou mais genes exógenos à planta hospedeira que codificam enzimas que controlam o nível do composto de interesse e como tal estão na via sintética para saponina ou um ou mais compostos de fórmula (1), (2), (3), (4) ou (5). Por modulação de expressão de gene deve entender-se controlo de produção de um produto de gene de interesse ao nível da transcrição, translação e/ ou pós translação. O nível do composto de interesse é controlado modulando a expressão de um ou mais genes endógenos ou transgenes que codificam uma ou mais enzimas necessárias para sintetizar o composto de interesse. Métodos para modular a expressão de genes em plantas são conhecidos da técnica. Variações em condições de crescimento ou aplicação endógena de compostos a plantas podem afectar a expressão do gene. Por exemplo, as preparações da presente invenção podem ser usadas para induzir resistência sistémica da planta através de modulação de expressão de gene endógeno. Ao nível molecular, a expressão de gene depende substancialmente das regiões de controlo da transcrição, translação e terminação que regulam a expressão de uma região codificadora de genes estruturais. Pela exploração dos sinais da planta que regulam estas regiões de controlo ou pela manipulação recombinante directa das regiões de controlo, a expressão de um gene que codifica uma enzima necessária para controlar o nível de saponina, por exemplo, pode ser modulada. Quando o transgene é exógeno a um hospedeiro planta, o transgene incluirá regiões de controlo que são seleccionadas e concebidas para alcançar o nível e momento desejados de expressão de gene. Como é apropriado, as regiões de controlo são homólogas (nativas) ou não homólogas (não nativas) ao gene de interesse. Por "homólogo" deve entender-se que a(s) região(ões) de controlo é(são) de uma região de controlo normalmente associada com o gene de interesse, ou substancialmente semelhante(s) a esta. Por "não homólogo" deve entender-se que a(s) região(ões) de controlo origina(m) a partir de uma fonte diferente de nucleótido ou sequência ou é(são) substancialmente diferente(s) da(s) região(ões) de controlo normalmente associada(s) com o gene de interesse. Por exemplo, se a sequência codificadora de enzima é não-homóloga na fonte em comparação com as regiões de controlo, a fim de ter expressão do gene numa célula de planta de interesse, regiões regulatórias de iniciação translacional ou transcripcional ou promotores funcionais nestas células de plantas são fornecidos ligados de forma operável à sequência de codificação. Os sinais de iniciação de transcrição e translação funcionais em células de plantas incluem os de genes que são indígenos ou endógenos a um hospedeiro planta ou a outras espécies de plantas, e dirigem expressão constitutiva ou selectiva num hospedeiro planta, e incluem sequências de vírus tais como CaMV que infectam plantas.

De especial interesse são as regiões de controlo de gene que regulam selectivamente a expressão de gene estrutural numa planta, parte de planta, célula de planta, tecido de planta específico e/ ou associado com uma etapa especial do crescimento da planta. São preferidas aquelas regiões de controlo que são conhecidas da técnica, e principalmente, regiões de controlo transcripcional ou promotores que podem ser usados para modular a expressão de um gene codificando uma enzima necessária para controlar o nível de saponina e/ ou um componente de fórmula (1), (2), (3), (4), (5) numa planta, parte da planta, célula da planta ou tecido de planta específico e/ ou estão associadas a uma etapa especial do crescimento da planta. Por exemplo, promotores que fornecem padrões de expressão diferenciais em frutas são descritos na Patente U. S. No. 4,943,674 e Patente U. S. No. 5,175,095; em semente na Patente U. S. No. 5,315,001; e em tecidos que se desenvolvem rapidamente e brotos macios na Patente U. S. No. 5,177,011.

Um método preferido para produzir um componente desejado das presentes formulações num hospedeiro planta é através de meios recombinantes de DNA, principalmente modificando o nível de saponina e/ ou de pelo menos um composto da fórmula (1), (2), (3), (4), (5) em tecidos de plantas de interesse através da construção de plantas transgénicas usando técnicas recombinantes conhecidas da técnica. Os métodos envolvem a transformação de uma célula de planta de interesse com uma cassette de expressão funcional numa célula de planta compreendendo como componentes ligados de forma operável na direcção 5’ e 3’ da transcrição, uma região regulatória de iniciação transcripcional e translacional, juntas na configuração 5’ a uma sequência de DNA codificando uma ou mais enzimas capazes de modular a produção e/ ou requeridas para produzir o composto de interesse, e regiões de terminações translacional e transcripcional. A expressão de uma enzima requerida para produzir o composto de interesse para um aumento na produção do composto como resultado de concentrações alteradas das enzimas envolvidas na biosíntese dos compostos. De especial interesse é o controlo selectivo da produção de saponina, aldeído cinâmico e/ ou de coniferil em tecidos de plantas tais como folhas, raízes, frutos e sementes. -30-

Para controlo selectivo da biosíntese de saponina num tecido de interesse, células de plantas são transformadas com uma cassette de expressão compreendendo o DNA codificando um gene estrutural para uma ou mais enzimas requeridas para sintetizar saponina e capaz de aumentar a quantidade deste composto no tecido de interesse. De forma semelhante, para biosíntese de aldeído cinâmico num tecido de interesse, células de plantas são transformadas com uma cassette de expressão compreendendo o DNA codificando um gene estrutural para uma ou mais enzimas requeridas para sintetizar aldeído cinâmico no tecido de interesse. São de particular interesse aqueles genes que codificam uma ou mais enzimas capazes de metabolizar um composto precursor requerido para a biosíntese do composto de interesse de saponina, aldeído cinâmico e/ ou aldeído coniferílico a partir de substrato normalmente encontrados numa célula de planta. De interesse mais particular é a expressão transgénica de pelo menos um composto da fórmula (1), (2), (3),(4),(5) e uma saponina. São preparadas construções de DNA para expressar um gene de interesse que fornecem a integração da cassette de expressão dentro da genoma de um hospedeiro planta. A integração pode ser alcançada usando sistemas de transformação conhecidos da técnica tais como Agrobacterium, electroporação ou transformação mediada por micro partícula de alta velocidade. Dependendo da aplicação, a saponina ou um dos outros compostos de interesse podem ser expressos preferencialmente num tecido de interesse e/ ou numa organela específica. A especificidade do tecido é alcançada pelo uso de regiões regulatórias transcripcionais tendo o perfil de expressão desejado. A translocação da enzima para uma organela especiífica é alcançada pelo uso de um peptídeo de translocação apropriado. Métodos para expressão específica de tecido e organela de construções de DNA foram descritas e são conhecidas da técnica.

Para verificar a regulação e expressão do gene de interesse, existem -31- várias técnicas para determinar se as sequências de DNA desejadas presentes na célula de planta são integradas dentro da genoma e se estão sendo transcritas. Técnicas tais como a de borrão de Northern podem ser empregues para detectar RNA mensageiro que codifica para a enzima desejada. A expressão pode ainda ser detectada por testes de avaliação da actividade enzimática ou por imunoanálise para avaliar o produto de proteína. Mais preferencialmente o nível do composto de interesse presente num hospedeiro planta é medido usando métodos conhecidos da técnica. Um fenótipo desejado, por exemplo, é o conteúdo aumentado de saponina e/ ou aldeído aromático num tecido de planta de interesse como medido pela expressão do gene de interesse e/ ou pelo nível de saponina presente no hospedeiro planta em comparação com uma planta de controlo.

Para a introdução de um ou mais compostos das presentes formulações no organismo alvo, um hospedeiro planta expressando um gene codificando uma enzima requerida para controlar o nível do composto de interesse resulta na exposição de um organismo alvo a pelo menos um componente da formulação antipatogénica. Numa outra forma de realização, a expressão selectiva do gene de interesse induz resistência sistémica do hospedeiro planta a ataques ou colonização de patógenos. Pelo menos um componente da formulação antipatogénica pode ser expresso pelo hospedeiro planta e opcionalmente outros componentes da formulação antipatogénica são aplicados de forma exógena ao hospedeiro planta de modo a que a combinação provoque o efeito antipatogénico desejado quando introduzida de forma directa ou indirecta no organismo alvo. Plantas transgénicas tendo uma capacidade aumentada para acumular saponinas, além de autoprotecção contra patógenos de plantas podem ser usadas como fonte de saponinas para extracção e subsequente uso como pesticida químico. -32- A acumulação de aldeídos aromáticos pode ser alcançada regulando para menos ã expressão de genes de plantas específicos que codificam enzimas que causam mais metabolismo dos aldeídos desejados ou desviam intermediários metabólicos dos aldeídos desejados. No caso do cinamaldeído, por exemplo, isto envolve regular para menos a expressão de 4-hidroxilase de cinamato (Cinnamate 4-Hydroxylase, CA4H) e dehidrogenase de álcool cinâmico (cinnamic alcohol dehydrogenase, CAD). A Ca4H normalmente desvia algum ácido cinâmico do cinamaldeído para produzir ácido /7-cumárico, por si só um intermediário metabólico. Reduzir a actividade da CA4H apenas, geralmente não é suficiente para causar a acumulação de cinamaldeído porque a CAD pode rapidamente converter o cinamaldeído em álcool cinamílico, que então se toma incorporado na lenhina ou se acumula como glicósidos. A redução simultânea das actividades tanto da Ca4H como da CAD resulta num fluxo metabólico aumentado de ácido cinâmico para cinamaldeído e a conversão diminuída do cinamaldeído em álcool cinamílico. Algum cinamaldeído fica incorporado na lenhina mas o cinamaldeído (quer livre quer como glicósidos) também se acumula para níveis acima do normal, principalmente nos momentos em que a biosíntese de ácido cinâmico é elevada. Isto ocorre quando o nível de actividade da fenilalanina amónia-liase (Phenylalanina Ammonia Lyase, PAL; o passo inicial e limitador de taxa em geral metabolismo fenilpropanóide, Hahlbrock e Scheel, (1989) Annu. Rev. Plant Physiol. PlantMol. Biol. 40 : 347 — 369) é alto, uma situação que ocorre naturalmente em plantas em resposta a uma grande variedade de estímulos incluindo a invasão por patógenos fúngicos e danos mecânicos associados a ferimentos e alimentação de insectos.

Uma quantidade de genes de plantas Ca4H e CAD foram clonados e as suas sequências estão disponíveis através do GenBank. Porções destes genes que incluem sequências de nucleótidos que são preservados entre espécies de plantas diferentes podem ser usadas directamente num vector de expressão de -33- -33-

planta (orientação no sentido ou contra o sentido) a fim de suprimir a expressão dos genes endógenos correspondentes (por exemplo, Pear et ai, (1993) Antisense Res. and Develop. 3 : 181 - 190, Napoli et ai, (1990) The Plant Cell 2 : 279 -289. Ver também a Patente U. S. No. 5,107,065). Mais preferencialmente, estas sequências de genes preservadas são usadas para isolar clones de cDNA de CA4H e CAD de um arquivo de cDNA da espécie da planta que se destina a ser modificada. Os clones de cDNA resultantes, ou porções destes, são então introduzidos num vector de expressão de planta (contra o sentido ou no sentido) e ) usados para transformar a(s) planta(s) de interesse. Construções de DNA de acordo com a invenção compreendem de preferência uma sequência de pelo menos 50 bases que é homóloga aos genes de Ca4H ou CAD endógénos.

Uma molécula de DNA recombinate é produzida ligando de forma operativa um vector a um segmento útil de DNA para formar um plasmídeo que pode ser usado para transformação de plantas. Um vector capaz de direccionar a expressão de RNA a partir de uma porção clonada de um gene é aqui referido como um "vector de expressão". Tais vectores de expressão contêm elementos de controlo de expressão incluindo um promotor. Vectores típicos úteis para ^ expressão de genes em plantas superiores são bem conhecidos da técnica e incluem vectores derivados do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens descrito por Rogers et ai, Methods in Enzymology (1987) 153 : 253 - 277. Um promotor comum que é usado para proporcionar expressão constitutiva forte de um gene introduzido é o vírus mosaico da couve-flor (Cauliflower Mosaic Virus, CaMV) promotor 35S (disponível através da Pharmacia, Piscataway, NJ). Tanto promotores constitutivos (tais como CaMV 35S) como promotores induziveis ou regulados de forma evolutiva (tais como o promotor de um gene PAL ou os genes endógenos de CA4H ou CAD) podem ser usados. O uso de um promotor constitutivo tende a afectar funções em todas as partes da planta, enquanto o uso de um promotor induzível ou regulado de forma evolutiva tem a vantagem de que -34- o RNA no sentido ou contra o sentido é produzido substancialmente apenas num tecido desejâdo e sob as condições em que é necessário. O uso de promotores regulados de forma evolutiva é preferido porque a regulação para menos da biosíntese de fenilpropanóide é conhecida como capaz de produzir efeitos colaterais indesejáveis no desenvolvimento de plantas transgénicas contendo um gene PAL heterólogo (Elkind et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sei. 87 : 9057 -9061.

Muitos métodos diferentes de transformação estão disponíveis para transformação de rotina de uma larga variedade de espécie de plantas. Um método que é particularmente eficiente para a transferência de DNA para plantas dicotiledóneas envolve o uso de Agrobacterium. Neste método o gene de interesse é inserido entre as fronteiras da região de T-DNA que foram entrançadas em um pequeno plasmídeo recombinate com um gene marcador seleccionável (por exemplo, codificando fosfotransferase II de neomicina ou acetiltransferase de fosfinotricina). O plasmídeo recombinante é então introduzido num Agrobacterium hospedeiro por transporte ou acasalamento triparental. A linhagem de Agrobacterium levando o(s) gene(s) de interesse é então usada para transformar tecido de planta fazendo uma co-cultura das bactérias com um tecido de planta apropriado (por exemplo, disco de folha). As células transformadas são seleccionadas em cultura de tecido usando o agente de selecção apropriado e as plantas são então regeneradas (ver Horsch et al. (1985) Science 227 : 1229 - 1231. Outros métodos que têm sido usados na transformação de células de plantas, e em particular as plantas de culturas mais recalcitrantes, incluem biolística e electroporação (para detalhes de protocolos, ver Sanford et al. (1993) Methods in Enzymology 217 : 483 - 509; e Potter (1993) Methods in Enzimology 217 : 461 — 478.

Uma vez que as plantas transgénicas tenham sido produzidas são -35- usados testes de enzima convencionais para Ca4H e CAD a fim de determinar o nível de supressão de actividade enzimática alcançada em transformantes. E possível que apenas uma pequena ffacção dos transformantes produzidos tenha uma actividade enzimática residual suficientemente baixa para causar a acumulação de aldeídos aromáticos sem também produzir algum efeito colateral indesejável no desenvolvimento da planta. Por esta razão, um método preferido para produzir os transformantes desejados tanto com Ca4H como CAD suprimidos é introduzir os dois genes separadamente dentro de transformantes diferentes e depois combiná-los por cruzamentos sexuais padrão. Isto permite um maior número de combinações de nível de supressão de gene para serem avaliadas ao mesmo tempo.

Uma alternativa à superprodução de saponina ou aldeídos aromáticos em plantas transgénicas é usar os genes da planta para conferir a um hospedeiro microbiano a capacidade de sintetizar aldeídos aromáticos e/ ou saponinas específicos. Os micróbios resultantes podem ser usados quer para produzir os aldeídos aromáticos num sistema de fermentação quer como um sistema de distribuição natural dos aldeídos aromáticos em preparações microbianas viáveis ou não viáveis. Leveduras, especialmente Saccharomyces cerevisiae, são organismos preferidos para este fim por que eles já foram concebidos para expressão de alto nível de PAL (Faulkener et al. (1994) Gene 143 : 13020) e foi demonstrado que uma planta de 4-hidroxilase de cinamato funciona em levedura (Urban et al. (1994) Eur. J. Biochem. 222 : 843 - 850. A expressão de PAL introduz a capacidade de produzir ácido cinâmico a partir de fenilalanina. Dois passos enzimáticos adicionais são necessários para produzir cinamaldeído a partir de fenilalanina. Nas plantas, estes passos são catalisados pelas enzimas cinamato: CoA ligase (CL) e cinamoilCoA reductase (CCoAR) mas como a 4-coumarateCoA ligase (4CL) pode também usar ácido cinâmico como substrato (Knobloch, e Hahlbrock (1977) Arch. Biochem. Biòphys. 184 : 237 - 248), pode ser usado 4CL em vez de CL. Mais de 20 genes PAL clonados e mais de 6 genes 4CL foram descritos de forma suficientemente detalhada (GenBank) para facilitar o seu uso na prática da presente invenção. Um gene para um CCoAR é obtido aplicando técnicas padrão de clonagem de genes para isolar um clone de cDNA usando como sonda a sequência derivada da sequência de amino ácido do términus N, ou fragmentos de peptídeos, da proteína purificada. O CCoAR foi purificado e parcialmente caracterizado a partir de cultura de feijões de soja (Wengenmayer et al. (1976) Eur. J. Biochem., 65 : 529 - 536; Luderitz e Grisebach (1981) Eur. J. Biochem. 119: 115 - 124), seiva de pinheiro cambial (Luderitz e Grisebach, supra) xilema de choupo (Sami et al. (1984) Eur. J. Biochem.Yi9 : 259 - 265) e xilema diferenciadora de Eucalyptus gunnii (Goffher et al. (1994) Plant Physiol. 106 : 625 - 632). O método de purificação preferido é o de Goffher et al.isupra) porque resulta numa banda de proteína única sobre gels de SDS-poliacrilamida que podem ser usada para sequenciamento de proteína. Para a expressão de aldeído α-hexilcinâmico, o gene que codifica para a enzima que catalisa a adição do grupo α-hexil para aldeído cinâmico também é inserida no hospedeiro microbiano ou planta. O gene pode ser clonado, por exemplo, a partir de plantas de arroz.

Os genes clonados são introduzidos em vectores de expressão padrão e usados para transformar um hospedeiro microbiano, de preferência levedura, através de técnicas de transformação padrão tais como electroporação (Becker e Guarante (1991) Methods in Enzymol. 194 : 182 - 187). Testes de enzimas padrão são usados para confirmar a expressão funcional dos genes concebidos e testes de aldeídos aromáticos são usados para seleccionar linhagens com produção máxima. Devido ao facto de que os aldeídos aromáticos têm propriedades antimicorbianas é preferido usar vectores de expressão que causarão -37- a expressão dos genes introduzidos só mais tarde no ciclo de crescimento ou em resposta a um indutor químico. Pode também ser desejável desenvolver o hospedeiro microbiano concebido num reactor de célula inteira imobilizado (por exemplo, Evans et al. (1987) Biotechnology and Bioengineering 30 : 1067 -1072) para evitar que os aldeídos se acumulem no meio de cultura.

As formulações e métodos em apreço são úteis para o tratamento de plantas que são colonizadas por organismos patogénicos. Estes incluem plantas florescentes, relvas, incluindo relvados ornamentais, relva arqueada, legumes, cereais e frutas incluindo tomate, batata, alcachofra, morangos, milho, grãos de cereais, cebola, pepino, alface, tabaco, e cítricos tais como laranja, limões, limas e toranja bem como pimentos e uvas, e árvore de frutas tais como pêssego, maçã e cereja, plantas ornamentais como rosas e árvores, particularmente as coníferas. Também incluídas estão as plantações destinadas para o consumo por peixes, aves e animais, incluindo seres humanos, directa ou indirectamente. Por "directamente ou indirectamente" deve entender-se que as culturas podem ser ingeridas, por exemplo, por seres humanos (consumo directo), ou que é o animal não humano ou ave que ingere o produto da cultura e é por sua vez ingerido por seres humanos (consumo indirecto). As culturas destinadas ao consumo incluem tabaco, rações para peixes, animais e aves, culturas destinadas a ser processadas para álcool ou produtos alimentares, tais como xarope de milho, e outros semelhantes.

Os organismos patogénicos alvo incluem fungos que colonizam uma planta ou parte de uma planta, particularmente uma superfície de uma parte de uma planta. O método e tempo óptimo para a aplicação das formulações é determinado pela parte específica da planta colonizada por um fungo e o tempo no ciclo de vida da planta no qual uma infestação específica ocorre ou tem tendência para ocorrer. Por exemplo, para tratar o míldio pulverulento, ferrugem -38- e outros patógenos que colonizam as folhas da planta hospedeira, as plantas hospedeiras são aspergidas até escorrer com uma formulação da invenção. A quantidade de composto(s) de fórmula (1) usado(s) irá variar dependendo em parte do patógeno alvo e da planta hospedeira e pode ser determinada empiricamente através da avaliação da sensibilidade do organismo alvo à formulação e os efeitos fitotóxicos dessa formulação ou da planta hospedeira. As plantas podem ser aspergidas antes ou depois da infestação, de preferência antes da infestação. No entanto, a fim de minimizar os danos para a planta hospedeira, onde for viável, é preferível tratar as plantas mais velhas uma vez que as folhas verdes jovens tendem a ser mais sensíveis à fitotoxicidade. Altemativamente, podem ser usadas culturas transgénicas, que expressam um ou mais componentes da formulação numa quantidade suficiente para inibir o desenvolvimento do patógeno e/ ou matar o patógeno. De preferência, o(s) componente(s) é(são) expresso(s) no tecido colonizado pelo patógeno, por exemplo as folhas.

De especial interesse é o tratamento de plantas afectadas por míldio pulverulento que é causado por organismos alvo da família fúngica Erysiphaceae. Por exemplo, as espécies seguintes causam míldio pulverulento nas plantas indicadas: Erysiphe cichoracearum: begónia, crisântemo, cosmos, abóbora, dália, linho, alface e zínia; E. graminis: cereais e relvas; E. polgoni: feijões, feijões de soja, trevos, e outros legumes, tubérculos, couve e outras crucíferas, pepino e cantalupo, espora dos jardins e hortênsia; Microsphaera alni: mirtilo, catalpa, ulmeiro, lilás, carvalho, rododendro, e ervilha de cheiro; Phyllactinia sp.: catalpa, ulmeiro, plátano e carvalho; Podosphaera leucotricha: maçã, pêra e marmelo; P. oxyacanthae: alperce, cereja, pêssego e ameixa; Spaelrotheca macularis: morangos; S. mors-uvae: groselha espinhosa e groselha; S. pannosa: pêssego e rosa; e Uncinula necator: uva, castanha da índia e tília.

Também de particular interesse é o tratamento de plantas afectadas -39- por ferrugem causada por Basidiomycetes, particularmente da ordem Uredinales. Há cerca de 4.000 espécies de fungos da ferrugem. Os fungos da ferrugem mais importantes e plantas afectadas incluem: Puccinia: ferrugem de numerosos hospedeiros tais como trigo e todos os outros grãos pequenos (P. graminis); ferrugem amarela ou de riscas: trigo, cevada e centeio (P. striiformis); ferrugem da folha ou ferrugem castanha: trigo e centeio (P. recôndita)’, ferrugem da folha ou ferrugem anã castanha da cevada (P. hordei)\ ferrugem coroada das aveias (P. coronata); ferrugem do milho (P. sorghi); ferrugem do milho do sul ou tropical (P. polisora); ferrugem do sorgo (P. purpurea); ferrugens da cana de açúcar (P. sacchari e P. kuehnii). A Puccinia também causa graves doenças de ferrugem em plantações tais como as do algodão (P. stakmanii), vegetais tais como os espargos (P. asparagi), e flores tais como o crisântemo (P. chrysantemi), malva rosa (P. malvacearum), e dente de leão (P. antirrhini). Gymnosporangium, causa a importante ferrugem da cedro-macieira (G. juniperi-virginianae) e ferrugem do cedro espinhoso (G. globosum). Hemileia, causa a devastadora ferrugem da folha do café (H. vastatrix). Phragmidium, causa ferrugem em rosas e ferrugem amarela nas framboesas.

Outras espécies fúngicas que causam ferrugem e são tratáveis usando as preparações em apreço incluem o Uromyces: legumes (feijão, feijão-fava e ervilha) (várias espécies de Uromyces) e cravos (U. caryophyllinus); o Cronartium: ferrugens severas de pinheiros, carvalhos, e outros hospedeiros, tais como a ferrugem de bolhas do pinheiro branco (C. ribicolo); ferrugem fusiforme dos pinheiros e carvalhos (C. quercuum f. sp. fusiforme); galha ocidental ou ferrugem dos carvalhos dos pântanos (C. quercuum f. sp. virginianae); ferrugem deo míldios do feto pinheiro-doce (C. comptoniae); ferrugem do pinheiro Comandra (C. comandrae); e ferrugem do cone do sul (C. strobilinum). Outros incluem a Melampsora, que causa a ferrugem do linho (M. lini)\ o Coleosporium que causa a ferrugem de bolhas das agulhas do pinheiro (C. asterinum); a Gymnoconia, que causa a ferrugem laranja das amoras e framboesas; a Phakopsora, que causa a potencialmente catastrófica ferrugem do feijão de soja (P. pahyrhizi)\ e a Tranzschelia, que causa a ferrugem do pêssego.

As formulações e métodos em apreço são também úteis para prevenir e tratar a infestação por organismos que colonizam outras partes das plantas, tais como as raízes e o fruto. Para fungos que afectam as raízes das plantas, tais como o Fusarium sp., Aspergillus, e Verticulum (incluindo V. alboatrium e V. dahlisè), as infestações são de preferência tratadas por aplicação foliar das preparações em apreço, com o ingrediente activo atingindo as raízes por translocação ou por indução de uma resistência sistémica adquirida (Systemic Acquired Resistance, SAR). Para tratar infestações de frutos tais como a mancha negra, as formulações em apreço são aplicadas durante e depois do desenvolvimento do fruto, de preferência directamente ao fruto em desenvolvimento. Outros organismos fúngicos alvo 1 incluem Phragmidium spi; Diplocaopan rosae; Sphaerotheca tannosa; Oibiapsis sicula; Phytophoya taraesitica; Puccinia spp; Alternaria sp; Susaiun spp; Botrytis cinera; Sclerotinia Homoeocarca\ a doença do Ulmeiro Holandês (Ceratocystis ulmi) e a perda de vigor do carvalho (C. fagacearum). Também incluídas estão as algas azuis-verdes (Cyanobacteria). De particular interesse é o tratamento dos fungos que produzem fumonisinas, ácido fusárico e/ ou os seus análogos estruturais.

As formulações em apreço são também úteis contra insectos, particularmente aqueles das ordens Orthoptera; Thysanoptera que inclui tisanópteros; e Homoptera que inclui afídeos, cigarrinhas, moscas brancas, r percevejos pálidos, cigarras e insectos com escamas. E uma teoria da invenção que os insectos que são susceptíveis a tratamento com as formulações em apreço são aqueles que albergam bactérias simbióticas nos seus intestinos. De acordo com isto, inSectos diferentes daqueles que estão mencionados que albergam material simbiótico podem também ser controlados com as formulações em apreço. Outros organismos alvo incluem aracnídeos, particularmente ácaros de aranhas (Arthropoda). Insectos alvo adicionais incluem aqueles das ordens Coleoptera tais como o verme da raiz do milho e o gorgulho da cápsula do algodão; Lepodoptera, que inclui a traça pequena.

De particular interesse é o tratamento da infestação de filoxera em uvas. A forma de raiz da filoxera de uva (Daktulosphaira vitifoliae Fitch) é um insecto da uva devastador. O dano causado à planta não é devido somente à alimentação da filoxera mas ao contrário é substancialmente devido à invasão de fungos secundários, organismos que não são controlados por insecticidas. Tipicamente, as filoxeras são encontradas tão profundas quanto as raízes da planta hospedeira, que pode ser de 8 pés ou mais. Deste modo, para o tratamento de infestação de filoxera em uvas, a formulação pode ser distribuída directamente às raízes da planta, tal como por injecção de líquido ou formulação sólida no solo circundante às raízes. Altemativamente, as formulações podem ser aplicadas à folhagem ou outra parte acessível da planta e translocada até a raiz através do sistema vascular da planta ou por indução de uma SAR. Como no caso de tratamento de míldio pulverulento e ferrugem, culturas transgénicas podem ser usadas para o tratamento de filoxera; o tecido preferido de expressão de componentes de fórmula (1) é a raiz.

Os compostos de fórmula (1) podem ser usados para o tratamento de filoxera em estágios diferentes de crescimento. Os compostos podem ser formulados ou aplicados diferencialmente para atingir estágios específicos do crescimento da filoxera tal como os estágios de ovo, ninfa e adulto. A eficácia de uma formulação específica e o protocolo de tratamento podem ser avaliados por -42- quaisquer meios, tais como a avaliação da mortalidade da filoxera, alimentação, e/ ou locais "de alimentação tomados vagos após tratamento sob condições de campo e/ ou laboratório, ou pela saúde melhorada das vinhas infestadas. Além disto, a eficácia de uma formulação específica e o protocolo de tratamento podem ser avaliados através de análises de fisiologia da vinha na metabolização, translocação e/ ou reacção ao tratamento com a formulação por métodos conhecidos da técnica. Outros factores que não sejam a dosagem testada normalmente, a formulação e o momento dos tratamentos também são considerados para determinar o envolvimento da fenologia da filoxera, fenologia da planta, saúde da planta, presença de uma união de enxerto ou cultivar (tanto do rebento como do rizoma).

Os métodos e formulações em apreço são também úteis para tratar infestações de prados de turfa. Certos agentes bióticos de doenças não infecciosas causam dano a prados de turfa por competição. Algas frequentemente causam dano a prados de turfa tomando e ocupando o espaço vazio que fica depois de a turfa ficar rala por doença infecciosa. Algas de relva azuis-verdes (espécie de Ajanobacteria) desenvolvem-se como uma escuma negra sobre a superfície de solos excessivamente húmidos. As algas reduzem a troca de gases entre o ar e o solo e também podem produzir clorose em plantas. A camada-negra é uma condição física que é principalmente associada aos relvados dos campos de golfe. Nota-se especialmente em turfas com elevado conteúdo de areia. Além disto, doenças fúngicas de prado de turfa podem ser tratadas usando as formulações em apreço. Sclorotinia "mancha de dólar", míldio Pythium e míldio Rhizoctonia são doenças devastadoras de várias espécies de prado de turfa, especialmente de relva arqueada. A eficácia das formulações para o tratamento de prados de turfa pode ser determinada variando os componentes da formulação, o regime de aplicação, o volume de aplicação e/ ou a taxa de aplicação. A avaliação pode ser conduzida sob condições de campo e/ ou laboratório, levando em consideração as condições -43- ambientais tais como humidade, temperatura, qualidade, quantidade e intensidade de luz, tipo' e fertilidade do solo, conteúdo de humidade, escoamento, e semelhantes. O efeito da actividade e persistência da formulação também pode ser determinado pela comparação de translocação de acrópeto e persistência com o corte diário da relva e remoção das folhas de relva. As formulações podem ser aplicadas a taxas de aplicação e concentrações variáveis, e regimes de aplicação a fím de obter um nível desejado de controlo de doença e fitotoxicidade. As formulações contendo saponina e as composições de fórmula (2) e (5) são preferidas para esta aplicação, com as fórmulas (3), (4) e (5) sendo mais preferidas.

De particular interesse é o uso das formulações em apreço para controlar Sclerotinia dollar spot {Sclerotinia homeocarpa). A Sclerotinia "mancha de dólar" é um doença alastrada, persistente e cara que ocorre na maioria das espécies de prados de turfa no mundo inteiro. As condições ambientais que favorecem a "mancha de dólar" incluem longos períodos com alta humidade e excessiva humectação. Baixa fertilidade de nitrogénio juntamente com estas condições ambientais aumentam a incidência da doença "mancha de dólar". Relvas de folhas finas que formam um hábito de crescimento denso e compacto estão especialmente em risco, fazendo da "mancha de dólar" a principal ameaça a campos de golfe intensamente usados. Também de interesse especial é o uso das formulações para controlar doenças causadas por espécies de Pythium. As doenças causadas pelas espécies de Pythium são frequentemente referidas como míldio Pythium, mancha de gordura, mancha de míldio, caruncho de coroa e caruncho de raiz. O Pythium também causa doença nos brotos. Todas os prados de turfa são susceptíveis a ataque por Phytium spp., incluindo as relvas arqueadas rastejantes, a relva mais popular para campos de golfe, e os novos tipos de relvas arqueadas que crescem no sul dos Estados Unidos. Biótipos resistentes de Pythium tipicamente não respondem a aplicação de fungicida tradicional. As -44- formulações contendo saponina tipicamente são aplicadas como uma aspersão na folhagem antes ou no primeiro aparecimento de condições que promovem o crescimento das espécies de Pythium. Em relação ao míldio Phythium isto ocorre quando o tempo está quente e húmido e as noites se mantêm quentes.

Um outro uso preferido dos métodos e composições da invenção é para controlar o míldio Rhizoctonia, geralmente referido como mancha castanha. O míldio Rhizoctonia é uma doença especialmente rápida e destrutiva quando as condições ambientais favorecem o seu crescimento. Deste modo as formulações a serem usadas de um modo geral deveriam ser aplicadas quando há tempo quente, húmido, altas taxas de fertilização de nitrogénio, denso crescimento de folhagem e/ ou rega frequente. O controlo do míldio Rhizoctonia em prados de turfa é difícil e os fungicidas tradicionais frequentemente falham para esta doença. O controlo do míldio Rhizoctonia em relva de Santo Agostinho usando as formulações em apreço é também de interesse.

De particular interesse, é a prevenção de tisanóptero, míldio pulverulento, mancha negra, botrite e infestação de flores ornamentais pelo afídeo do melão e outras plantas alvo destes insectos nocivos. As formulações em pauta são de particular uso na prevenção ou tratamento de infestações de rosa, árvores de natal (por exemplo, pinho), e árvores frutíferas e frutas. Por exemplo, as formulações são úteis para tratar os pêssegos contra cancro e as maçãs contra infestação de traça pequena, e as uvas contra infestação por enroladores de folhas, filoxera, cigarrinhas, botrite, tisanópteros, e míldio pulverulento. Formulações preferidas incluem saponina e os aldeídos aromáticos de fórmulas (2) e (5), com as fórmulas (3), (4) e (5) preferidas.

Um exemplo é o tratamento da infestação por afídeo do melão em algodão. A espécie mais importante é o afídeo do algodão ou do melão (Aphis gossypii Glover). Quase ao mesmo tempo que o algodão produz folhas, pequenos piolhos de planta, verde claro de corpo macio voam para elas e começam a reproduzir-se. Portanto, as formulações em apreço devem ser aplicadas ao algodão num estágio inicial do seu desenvolvimento. A aspersão na folhagem é preferida porque os afídeos alimentam-se acima do solo. A época mais importante para o tratamento é imediatamente antes e/ ou durante as estações frescas e húmidas, quando os afídeos podem tomar-se suficientemente abundantes para impedir o crescimento e deformar as plantas. A invenção em apreço é também útil para o tratamento e prevenção de míldio tardio. O míldio tardio afecta tomate, batata, beringela e outras plantas da família da batata e resulta da infestação por Phytophthora infestans. As formulações em apreço são aplicadas às plantas de preferência durante períodos húmidos de temperatura suave, que é quando a patogénese geralmente começa pela instalação de esporos sobre as superfícies de plantas. Do mesmo modo, o controlo do gorgulho do algodão (Anihonomus grandis Boheman) é também de interesse. O dano é causado pelos gorgulhos adultos e seus filhotes ou larvas. Os adultos furam as corolas e cápsulas mordendo nelas. A aplicação da formulação em apreço deve ser especialmente direccionada a esta porção (corolas e cápsulas) da planta.

As formulações contendo saponina são também úteis para controlar o tempo de polinização das plantas florescentes. Por exemplo, para evitar ou atrasar a polinização as formulações são aplicadas numa quantidade suficiente para repelir abelhas e outros insectos polinizadores. Ajustando a residualidade da formulação, a duração do tempo durante o qual a polinização é inibida pode ser controlada. Por outro lado, para plantas nas quais a polinização cruzada é requerida para fertilização, a aplicação da formulação durante este período deve ser evitada se o insecto polinizador é repelido ou morto pela formulação. Em particular, a*polinização por espécies de Vespidae, incluindo vespas sociais, vespas de ninho de papel, vespões e vespas americanas, são sensíveis às formulações em apreço. O tratamento de Dermaptera (Insecto fura-orelhas Europeu (Forticula aureculatia)) com compostos da invenção é também de interesse. O insecto fura-orelhas tem gostos de alimento extremamente amplo e se alimenta em muitos tipos de diversos materiais de planta, incluindo flores, legumes e frutas, tanto antes como depois de colhidos. Botões de flores, maçarocas (grãos) e mudas novas de legumes são particularmente vulneráveis. Portanto, as formulações em apreço são aplicadas, por exemplo, por aspersão foliar na planta em crescimento e/ ou partes de plantas colhidas procuradas pelo insecto fura-orelhas.

De particular interesse é o tratamento pós-colheita de flores colhidas usando as formulações da invenção em apreço para controlar o crescimento de microorganismos, tais como os encontrados em soluções de vasos. Formulações contendo saponina também podem aumentar a duração de flores colhidas, que depende em parte do controlo de microorganismos de solução em vaso, tais como bactérias e fungos, quando os caules estão em água, e em parte fornecendo uma fonte nutriente para as flores. O tratamento de flores colhidas pode ser feito por quaisquer meios apropriados para um fim específico, tal como a imersão do caule cortado numa formulação em apreço da invenção e/ ou a adição da formulação a uma solução de vaso ou por mergulhar a totalidade da flor colhida na formulação. Exemplos de organismos que podem ser controlados após a colheita incluem o míldio da flor por Botrytis causado por Botryíis cinerea Pers: Fr. em flores colhidas, especialmente em rosas crescidas -47- em estufa e muitas outras cultura de flores bem como uvas, bolor cinzento causado por B. cinerea, e apodrecimento retardatário em flores bem como frutas tais como framboesas, morangos, maçãs, pêras causado por B. cinerea, Rhizopus, e Penicillium expansum. As formulações que contêm saponina em combinação com compostos de fórmula (2) e (5) são preferidas. Em particular, uma formulação que inclui saponina, cinamaldeído e/ ou α-hexil cinamaldeído, e Tween 80 é preferida. A eficácia das formulações para a promoção ou preservação da vida de flores decapitadas pode ser avaliada monitorando a perda de vigor das flores, folhas ou caule, rehidratação, crescimento bacteriano e contaminação do caule, e controlo pós-colheita de calagem microbiana e fisiológica.

Os compostos em apreço da invenção podem ser usados para atingir os três estágios de vida da traça pequena (Cydia pomonella), adultos, ovos e larvas neo-natas, antes que elas entrem na fruta. Para esta aplicação, é necessário desenvolver um perfil de susceptibilidade destes estágios de vida a fim de optimizar o momento de aplicação das formulações em apreço. Isto é feito testando a susceptibilidade de ovos, larvas neo-natas e adultos às formulações, tanto aplicadas de fresco como ao resíduo destas que permanece após a aplicação inicial.

As composições em apreço de saponina e aldeídos aromáticos são também úteis para o controlo de escamas de São José, que é um insecto de forma estranha e imóvel. Como percevejos pálidos as escamas assemelham-se mais a organismos de doença do que a animais. Há duas famílias de escamas: escamas macias (Coccidea) que tendem a alimentar-se de culturas de jardins, e as escamas blindadas (Diaspididae) que preferem as cultura de pomares. Membros da super -48- família Coccidea, eles juntam-se às folhas, frutos e troncos de muitas plantas diferentes. Portanto, as formulações em apreço são de preferência aplicadas às folhas, frutos e troncos de plantas susceptíveis.

Os métodos e composições em apreço são também úteis para o controlo dos percevejos pálidos , que são semelhantes aos afídeos, psilídeos, e filoxera. Os percevejos pálidos sugam os sumos de plantas e espalham doença, e a substância doce que segregam convida ao crescimento de um fungo fuliginoso que interfere com a fotosíntese. A aplicação foliar é usada para controlar o fungo fuliginoso, e a quantidade usada deve ser suficiente para induzir SAR na planta de modo a controlar o crescimento de insectos que sugam a seiva em regiões remotas da planta onde os insectos se alimentam.

Além de tratar uma planta hospedeira, as sementes também podem ser tratadas usando as formulações em apreço. As sementes podem ser pulverizadas com uma formulação em pó (ver Pedido de Patente U. S. No. 4,978,686 para exemplos dè materiais inorgânicos aos quais as formulações podem ser adsorvidas) ou misturada num substrato de planta tal como a vermiculita. As sementes também podem ser obtidas de culturas trangénicas, em que os componentes de fórmula (1) foram expressos em semente, de preferência preferencialmente em semente. As mudas desenvolvidas sob condições estéreis a partir de sementes tratadas são livres de fungos e insectos susceptíveis. Além disso, as mudas podem também ser tratadas com as formulações em apreço. Em alguns casos pode ser necessário ajustar a formulação de tratamento de modo a reduzir qualquer fitotoxicidade associada com o tratamento uma vez que brotos jovens são mais passíveis de exibir sintomas de fitotoxicidade.

Os exemplos a seguir são mostrados a título de ilustração e não a título de limitação.

EXEMPLOS

Materiais e Métodos

Os químicos usados nos exemplos dados abaixo foram obtidos a partir das seguintes fontes: aldeído cinâmico, Spectrum Chemical Company, NJ; aldeído coniferílico, APIN Chemical, R. U.; Tween 80 e bicarbonato de sódio Spectrum Chemical Company, Gardena, CA; aldeído a-hexilcinâmico, Firmenich, Plainsboro, Nova Jérsia; saponina, Danco Corp., Fresno, CA.

Exemplo 1

Tratamento de Míldio Pulverulento em Cultivares de Rosas A. Rosas em Vasos. Oito cultivares de rosas foram testados para investigar o efeito de uma formulação de‘aldeído cinâmico/ NaHC03 na ferrugem e esporos. Os cultivares usados incluíam Moss sem nome (Moss), Galica, Rosette Delize (Hybrid Tea, Chá Híbrida), Rosa Rugosa Rubra (Rugosa), Abel Morrison (perpétua Híbrida), John Laing, Betty Prior, e Rose de Roi. Cinco (5) cultivares em vaso (Moss, Galica, Chá Híbrida, Rugosa e Híbrida perpétua) foram seleccionados e atribuiu-se-lhes uma taxa de doença de acordo com Paulus e Nelson {supra) para míldio pulverulento, ferrugem e esporos1. Os cultivares de Moss e Galica estavam em 5 numa escala de 0 - 5 (onde 0 = nenhum dano causado por míldio pulverulento, ferrugem/ esporos, 1 = 1 - 25, 2 = 26 - 50, 3 = 51 - 75, 4 = 76 - 90, e 5 = > 90 % do total das folhas por arbusto). À Chá Híbrida e perpétua Híbrida foi atribuída taxa 3, e à Rugosa foi atribuída a taxa 1. A Moss e Galica também foram infectadas com ferrugem equivalente a uma taxa 3. 1

Os esporos foram avaliados apenas nas Moss, Galica e nas plantas de controlo. -50-

Cada cultivar recebeu uma aspersão foliar de cerca de 100 ml de uma fórmula de aldeído cinâmico contendo 5 g de aldeído cinâmico, 80 g de NaHC03, 10 g de Tween 80 e água até 1000 g. Além disto, 250 ml de 0,01 % (v/v) de solução aquosa de extracto de saponina a 10° brix da planta iuaca shidigera foram administrados a cada planta envasada uma vez por semana começando com a data do primeiro tratamento de aldeído cinâmico/ NaHC03. As plantas de controlo não receberam qualquer tratamento. Um único tratamento foi suficiente para erradicar o míldio pulverulento, a ferrugem e os esporos através da observação de campo semanal final oito semanas mais tarde em comparação com os controlossem tratamento que se mantiveram a uma taxa de doença de 5, 3, e 4 relativamente ao míldio pulverulento, à ferrugem e aos esporos, respectivamente. Além disto, o tratamento pareceu ter induzido uma resistência sistémica. Não foi observada qualquer fitotoxicidade. B. Rosas criadas no campo. Foi concebida outra experiência para rosa criada no campo para flor de corte a fim de avaliar a eficácia do controlo do míldio pulverulento por aldeído cinâmico/ NaHC03 durante o mesmo período (estação do ano) e condições ambientais. Os inoculados de míldio pulverulento e ferrugem foram altos no campo de teste, e não foi necessário mais nenhum inoculado adicional para fornecer pressão da doença. Nesta investigação foram usados cultivares John Laing, Betty Prior, e Rose de Roi. Oito plantas John Laing de uma fila com um bloco de dezasseis foram seleccionadas para tratamento. As plantas foram tratadas de duas em duas, começando com a primeira planta da fila. Três plantas Betty Prior seleccionadas de um bloco de seis foram tratadas de modo semelhante, assim como duas plantas de Rose de Roi de um bloco de quatro. Um único tratamento de aspersão foliar (cerca de 100 ml) de uma formulação contendo aldeído cinâmico (5 g), Tween 80 (10 g), NaHC03 (80 g) e água até 1000 g foi aplicado a cada grupo de cultivares. As plantas estavam a uma média de 0,86 cm de distância entre si. A taxação de doença foi a mesma que foi usada para avaliar o míldio pulverulento em cultivares envasados. Os controloseram plantas não tratadas. A ausência de vento e a aspersão efectuada com exactidão protegeram os controlosde qualquer aspersão indevida. Os cultivares de John Laing eram de plantas jovens, de 45 dias de idade com uma taxa de 5 para o míldio pulverulento. Os cultivares de Betty Prior eram de plantas mais velhas (= 240 dias), previamente aspergidas com Eagle (120 dias antes) com uma taxa de 3 para o míldio pulverulento e os de Rose de Roi eram de plantas com 240 dias com uma taxa de 2 para o míldio pulverulento e de 2 para a ferrugem usando a mesma escala apresentada acima. A resistência sistémica induzida foi determinada observando o número de lesões de míldio pulverulento e ferrugem produzidas em cada planta depois do tratamento em comparação com controlosnão tratados. Foram feitas revisões semanais das várias plantas. O efeito do regime de tratamento sobre a taxa de crescimento foi determinado na última observação de campo de cada planta.

Com a excepção dos controlosnão tratados e de três plantas de cultivar Betty Prior que tiverám re-infecção de míldio pulverulento com uma taxa de 3, todas as plantas estavam livres de míldio pulverulento ao fim do teste de cinco semanas. Não foi observada qualquer fitotoxicidade. Todas as plantas apresentaram novos brotos excedendo os dos controlosnão tratados. A Percentagem Média de Controlo de Doença (Mean Percentage of Desease Control, MPDC), foi calculada para cada grupo de plantas. Os resultados relativamente ao míldio pulverulento foram como a seguir: John Laing, 98,3 %; Betty Prior, 64,3 %; Rose de Roi, 100 %. A média total das três rosas foi de 90.7 % para o míldio pulverulento. A ferrugem foi avaliada somente na Rose de Roi, e foi de 85,0 %. Os fungicidas eficazes para o míldio pulverulento devem fornecer uma MPDC de = 70 % sob condições de estufa ou de campo, e de = 65 % para a ferrugem. -52- *As rosas de vaso ou rosas criadas no campo aspergidas até escorrer com uma emulsão contendo aldeído cinâmico e bicarbonato de sódio e ao mesmo tempo aspergidas com saponina, permaneceram livres de míldio pulverulento e ferrugem durante até 56 dias, ao passo que as plantas aspergidas apenas com água não permaneceram livres. As plantas tratadas também permaneceram livres de afídeos. Tem sido reportado que a média de resistência sistémica induzida em rosas com míldio pulverulento aspergidas com Rubigon é de cerca de 20 dias. Determinações médias de controlo de doença de aproximadamente 70 % foram obtidas para rosas aspergidas com uma solução aquosa de aldeído cinâmico e aldeído coniferílico ou emulsões contendo bicarbonato de sódio e aldeído cinâmico e/ ou aldeído coniferílico. Em experiências paralelas, o Benomyl deu uma média de controlo de doença de aproximadamente 80 %.

Exemplo 2

Tratamfento de Fungos e Insectos em Rosas com Saponina e Aldeído coniferílico São usados seis cultivares de rosa infectada em jardins de rosas dedicados à experiência. Quatro de Mrs. John Laing (perpétuas Híbridas) e duas Marchionese of Londonderry (perpétuas Híbridas) são tratadas com uma de duas formulações de aldeído coniferílico. O tratamento de baixa dose (Tl) é uma formulação contendo aldeído coniferílico (5 g), Saponina (0,86 ml de uma solução de saponina a 10° brix) (10 g), e H20 para 1000 g de produto. O tratamento de alta dose (T2) é uma fórmula de aldeído coniferílico compreendendo 100 g de aldeído coniferílico, saponina (0,86 ml de uma solução de sponina a 10° brix) e o H20 de equilíbrio para 1000 g de produto. Ver tabela 1 (abaixo). -53- > * As plantas é atribuída uma taxação de doença para míldio pulverulento e ferrugem usando o sistema de taxação de Paulus e Nelson {supra). Cada planta (de PI até P6) recebe um tratamento de aspersão de ~100 ml da formulação como indicado na Tabela 1 abaixo. As plantas de controlo são aspergidas apenas com água. A alteração na taxa desde o pré-tratamento até ao pós-tratamento é calculada como percentagem média de controlo de doença (MPDC, Mean Percentage of Desease Control) como descrito acima.

Tabela 1 Planta - Atribuição de Tratamento/ Dose Tratamento / Dose Planta TI - Baixa P1,P4, P6 T2 - Alta P2, P3, P5

Exemplo 3

Tratamento de Míldio Pulverulento em Rosa

Uma experiência de três tratamentos com fórmula de aldeído cinâmico, saponina e fórmula combinada de cinâmico e saponina é avaliada em rosas criadas no campo conhecidas por serem susceptíveis ao míldio pulverulento. As plantas são organizadas em blocos por variedade antes dos tratamentos com fungicida e são escolhidas ao acaso. São usadas duas variedades em cada uma de três experiências como descrito abaixo. Na experiência 1, são usadas Reichsprasident von Hindenburg (Bourbon) e Oskar Cordel (Perpétua Híbrida); Na experiência 2, são usadas Rosa Galllica Officinalis (Rosa Apothecary) e Deuil de Paul Fontaine (Moss Híbrida). Na experiência 3 são -54- usadas Comte de Chambord (Portland) e Madame Pierre Oger (Bourbon). A experiência 1 avalia o efeito do aldeído cinâmico por si só, a experiência 2 avalia o efeito da saponina por si só e a experiência 3 avalia a combinação de aldeído cinâmico e saponina. Cada planta recebe uma única aspersão foliar de 100 ml a seguir à avaliação do míldio pulverulento usando a taxação da escala de Paulus/ Nelson (supra). As plantas são avaliadas usando esta escala imediatamente antes e quatro dias depois do tratamento.

Exemplo 4

Tratamento de Filoxera de Uva com Saponina por si só e/ ou Com Aldeído Cinâmico ou Aldeído Cinâmico Alfa Hexil

Teste in locco do Local de Alimentação A mortalidade resultante da interrupção do processo fisiológico é determinada pela experiência de mortalidade dos adultos e ninfas e pela experiência do choco dos ovos. Depois de deixar o ovo, os novos insectos devem assegurar um local de alimentação apropriado verificado. Esta actividade tem que ser bem sucedida se o ciclo de vida do insecto é para continuar. Pesquisas indicam que aproximadamente 80 % da mortalidade da filoxera ocorre durante esta actividade. Concentrações de baixa dose de fórmulas podem ser protectoras para os rizomas das raízes das uvas pela interrupção do comportamento de "procurar e identificar local de alimentação" do insecto. Os três tipos de efeitos são todos avaliados usando os seguintes protocolos.

Experiência de Mortalidade de Adultos e Ninfas

Aproximadamente vinte e quatro ovos de filoxera são deixados a -55- desenvolver durante até 30 dias em raízes de uva padrão excisadas. Por volta dos 30 dias, alguns do insectos são ninfas enquanto outros são adultos. Os ovos novos são retirados durante o processo. As raízes infectadas por insectos são submergidas numa fórmula de teste durante 6 segundos e depois postas de lado para secar ao ar. A percentagem de insectos vivos, como definida pelo crescimento, a deposição de ovos e o movimento dos membros, é determinada após 5 dias. Um insecto é considerado morto se abandona o seu local de alimentação. Num teste inicial, são avaliadas formulações de saponina com doses de 20.000 ppm de aldeído cinâmico em água (isto é, aldeído cinâmico a 2 %) ou 20.000 ppm de aldeído alfa-hexilcinâmico. Agua sem quaisquer aditivos é usada como controlo negativo, enquanto é usada uma solução de controlo positivo de 250 ppm de malatião em água.

Experiência do choco dos ovos

Grupos de idades mistas de 60 ovos de filoxera de uva foram estabelecidos em papel de filtro (Whatman #1, círculos de 5,5 cm) em caixas de Petri de plástico com selagem de 50 X 9 mm tratadas com 100 μΐ de solução. Uma concentração seleccionada de uma formulação de teste de 400 μΐ é adicionada ao disco de filtro e a caixa coberta com a tampa da caixa de Petri e colocada numa caixa recipiente de plástico. Ao fim de 6 horas, a caixa foi colocada num câmara ambiental a 24° C no escuro. Os ovos foram colocados em grupos de 10. Uma semana depois, foi determinada a percentagem de choco. Num teste inicial, saponina (0,86 ml de uma solução de saponina a 10° brix) com doses de aldeído cinâmico em 6 % de NaHCOa e 2 % de Tween 80 foi avaliada com um único grupo de ovos em cada dosagem. Foram realizadas três réplicas da experiência. Os efeitos da formulação foram avaliados ao fim de 7 dias e foi marcado o número de ninfas que morreram na casca (Died in shell, DIS), ou ovos que não chocaram completamente (IH) (isto é, morreram todos). LD50 e LD95 -56- são determinados por análise probit. A 100 ppm de aldeído cinâmico, 88 % das ninfas morreram na casca e as restantes 12 % não chocaram completamente. A adição de saponina à formulação a 100 ppm aumentou para 93 % o número de ninfas que morreram na casca. Todos os ovos de filoxera tratados só com H20 chocaram; 100 % dos que foram tratados com Carbofurano (10 ppm) ou malatião (250 ppm) morreram na casca.

Os ovos de filoxera das uvas também são tratados com saponina (0,86 ml de uma solução a 10° brix) com ou sem cinamaldeído (CNMA) num bioensaio de laboratório. A mortalidade é indicada pelo fracasso em iniciar a abertura da casca do ovo. O EC50 e o LC50 de 7 dias para os tratamentos de ninfas e adultos por imersão de raízes ao fim de 7 dias são avaliados.

Exemplo 5

Protocolo para Afídeos. Ácaros de Aranha e Mosca Branca

A actividade da saponina com aldeído cinâmico e/ ou aldeído coniferílico com afídeos de feijão preto, Aphid fabae, ácaro de aranha de duas manchas, Tetranychus urticae, e mosca branca da folha prateada, Bemisia argentifolii é determinada como a seguir:

Bioensaio em Caixas de Petri

Cada caixa de Petri (60 mm de diâmetro) é tratada com uma taxa específica de aldeído aromático (por exemplo, 10 - 1000 ppm) dissolvido em água e/ ou uma diluição em série de um extracto de saponina a 10° brix de T. schidigera (variando de 0,001 % - 1 % (v/v) de solução aquosa) que é então deixado a secar. Vinte espécimens de cada artrópode são postos em cada caixa -57- (replicar 10 vezes). A mortalidade ao fim de 3 horas em contacto com uma caixa tratada, é comparada com a dos artrópodes em caixas de Petri tratadas apenas com diluente.

Bioensaio de Folhagem de Plantas

As plantas são desenvolvidas em potes de 7,5 mm em solo de envasamento em estufa. Plantas de algodão são usadas para ácaros de aranha e moscas brancas, e beterrabas são usadas para afideos. Quando as plantas atingem o estágio de três folhas, são infestadas com 60 dos artrópodes especificados (6 replicações). O insecto/ ácaro é deixado a instalar-se e a alimentar-se. A planta é aspergida até escorrer com um aldeído cinâmico ou aldeído α-hexilcinâmico de 100 a 2000 ppm, ou com 0,1 a 2 g/1 com uma solução aquosa de 0,05 % a 1% (v/v) de extracto de saponina a 10° brix de Y. schidigera com ou sem um aldeído cinâmico ou aldeído α-hexilcinâmico de 100 a 2000 ppm, ou de 0,1 a 2 g/1. A planta é coberta com uma gaiola alta de plástico (5 mm de altura X 10 mm de diâmetro). A mortalidade ao' fim de três dias dos insectos/ ácaros nas plantas aspergidas com uma formulação de teste é determinada e comparada com a dos insectos/ ácaros nas plantas aspergidas apenas com água.

Exemplo 6

Tratamento de Infestação de Nemátodos Vários tipos de nemátodos infestam os tecidos das plantas, incluindo o nemátodo do caule e do bolbo (.Ditylenchus dipsací) e o nemátodo dos nós das raízes (Meloidogyne spp). O tratamento do nemátodo do caule {Ditylenchus dipsací) com várias formulações contendo saponina e/ ou aldeído cinâmico é testado como a seguir. -58- 1. Nemáfodos do Caule

Os nemátodos do caule são extraídos de dentes de alho cortando o tecido em pedaços para dentro de um balão com fundo de malha e suspendendo o balão com fundo de malha num balão de água. Os nemátodos migram do tecido hospedeiro e afundam-se através da malha para dentro do fundo do balão. A água sobrenadante é removida e os nemátodos que permanecem no balão são transferidos para um vidro de observação e usados no protocolo do tratamento como a seguir. Tabuleiros de plástico límpido são divididos em células de topo aberto medindo 20 mm X 20 mm X 20 mm. Meio ml de água da torneira à temperatura ambiente (19° C) é pipetado para dentro de cada célula. Dez nemátodos são colocados em cada célula usando um cílio colado a uma agulha de dissecação para manusear cada animal. Meio ml de uma solução de teste (0,05 % a 1 % v/v de solução aquosa de extracto de saponina a 10° brix com ou sem aldeído cinâmico ou aldeído a-hexilcinâmico (100 - 2000 ppm) são então acrescentados a cada célula.’ Água é acrescentada aos poços de controlo. A sobrevivência dos nemátodos na célula é monitorada por observação usando um microscópio binocular. É registado o número de animais que sobrevivem 1, 5, 10, 20, 30 e 60 minutos depois da adição das soluções. A mortalidade é assumida se nemátodos individuais estão imóveis e não respondem à manipulação. O teste é repetido três vezes. 2. Nemátodos da Raiz a. Ensaio em placa de Petri

Num estudo aleatório, concentrações de saponina com ou sem aldeído cinâmico foram testadas para avaliação da actividade contra nemátodos -59- dos nós das raízes, Meloidogyne javanica. Os nemátodos foram postos em contacto dirècto com a formulação e a intervalos de 24 horas, a mortalidade foi avaliada tanto visualmente como por sonda. Meloidogyne javanica foram produzidas usando hidropónica. Os nemátodos foram colhidos e usados dentro de 24 horas.

Aproximadamente 100 nemátodos em 0,07 mis de água foram pipetados para dentro de um prato de siracusa (Fisher) e 1 ml de formulação de teste foi imediatamente pipetado para dentro de cada prato. Os pratos foram então colocados dentro de sacos de plástico para reter a humidade e evitar a evaporação. Foram usados quatro pratos de siracusa para cada formulação de solução de teste. A cada 24 horas, durante 7 dias, as soluções foram examinadas e os primeiros 10 nemátodos encontrados foram avaliados como vivos ou mortos, com base na integridade morfológica do nemátodo e no toque. Os nemátodos que se moviam eram contados como vivos. A concentrações maiores do que 100 ppm de aldeído cinâmico em veículo (2 % de Tween 80, 6 % de NaHCOs), 100 % dos nemátodos estavam mortos em 24 horas. A 10 ppm, 0 %, 15 %, 17,5 %, 22,5 %, 27,5 %, 52,5 % e 52,5 % estavam mortos em 24, 48, 72, 96, 108, 132, e 156 horas, respectivamente. Não houve qualquer efeito sobre a mortalidade a 1 ppm e 0,1 ppm de aldeído cinâmico em veículo. A adição de uma diluição de 1 : 60 de concentrado de saponina de Yucca shidigera a 10 brix resultou em 100 % de mortalidade em 24 horas com a menor concentração de aldeído cinâmico em veículo testado, 0,1 ppm. No entanto, a saponina por si só teve o mesmo efeito. EtOH (95 %) matou todos os nemátodos em 24 horas. Foi observado efeito mínimo do veículo sobre a mortalidade: 2,5 % em 72 horas e 5 % em 108 horas. -60- b. Bioensaio Foliar das Plantas

As formulações em apreço são testadas para avaliação da capacidade de reduzir a infestação da vinha por nemátodos dos nós da raiz, anel, barbas, e lesões de enrolamento. Vinhas (Harmony rootstock) num vinhedo foram tratadas com 1000 ppm ou 3000 ppm de cinamaldeído numa solução de saponina (0,86 ml de uma solução 100 brix), o agente comercial anti-nemátodos Nemacur, ou uma formulação em branco. A extensão da infestação de nemátodos é determinada no momento do tratamento e passados 30 e 60 dias após o tratamento.

Exemplo 7

Tratamento do Núcleo Vermelho do Morango (Phvtophthora Fra2ariaé) A doença do núcleo vermelho do morango é causada pelo fungo Hickman que se dissemina por meio de material de plantio infectado ou solo infestado com oósporos crescidos de escombros infectados. Várias formulações contendo saponina e aldeído cinâmico ou aldeído alfa-hexilcinâmico são testados como a seguir. Raízes maceradas de morango infectadas com Phytophthora fragariae são completamente misturadas com adubo infectado e deixadas a decompor durante 4 a 6 semanas a fim de produzir um inoculado bem podre para tratamento. Este é divido em lotes de 1 kg e misturado com 1500 ml de uma formulação de teste em diferentes concentrações. Ao fim de 10 minutos de tratamento, o adubo é enxaguado sob água corrente da torneira numa peneira de 25 mm durante um mínimo de 5 minutos para remover todos os vestígios da formulação de teste. O adubo é então posto em potes de plástico de 9 cm de -61 - diâmetro e plantado com 4 plantas de morango por pote. São usados cinco potes para cada tratamento. As plantas crescem num local de ambiente controlado a 15° Ce 18 h de duração do dia; o adubo é mantido húmido para encorajar a infecção. Os potes são colocados sobre grades para evitar infecção cruzada entre tratamentos.

Ao fim de 9 semanas as raízes das plantas de morango são lavadas para ficarem livres de adubo e examinadas para avaliar os sinais de infecção cortando as raízes longitudinalmente e procurando esteias vermelhas, e raízes podres ou castanhas. Todas as infecções são confirmadas por exame microscópico dos pedaços das raízes para avaliar a presença de oósporos de Phytophthora fragariae.

Exemplo 8

Tratamento de Patógenos Fúngicos no Milho É avaliada uma experiência de três tratamentos com saponina, com/ sem aldeído cinâmico ou aldeído alfa-hexilcinâmico. A quantidade de saponina usada é de 0,05 % a 1 % v/v de uma solução aquosa de extracto de saponina a 10° brix de Y. schidigera. As formulações são testadas em milho crescido no campo conhecido por ser susceptível a infestação fúngica patogénica. As plantas são separadas em blocos por variedade e são escolhidas ao acaso. Cada planta recebe uma única aspersão foliar até escorrer depois da avaliação da infecção fúngica (de acordo com Paulus e Nelson). A resposta variável registada para cada planta é a taxa de infecção fúngica com base na escala de taxação de Paulus/ Nelson {supra). As plantas são avaliadas nesta escala imediatamente antes do tratamento e quatro dias depois.

Exemplo 9

Doença Cancro da Resina A doença cancro da resina, causada pelo fungo Fusarium subglutinans f. sp. pini é caracterizada por uma exsudação resinosa na superfície dos brotos, galhos, raízes expostas e troncos de árvores infestadas. O hospedeiro e a variação geográfica do patógeno do cancro da resina têm aumentado grandemente desde que foi descoberto na Califórnia em 1986. O patógeno foi recentemente descoberto no México e no Japão.

Um bioensaio aleatório foi levado a cabo usando saponina com e sem aldeído cinâmico em várias concentrações e formulações. O bioensaio baseou-se na inibição do crescimento radial de Fusarium subglutinans f. sp. pini. Oito ml de formulação (concentração desconhecida) foram pipetados para dentro de 200 ml de agar de dextrosé de batata derretido (potato dextrose agar, PDA) a 2 % e a mistura foi dispersa em 5 caixas de Petri de plástico (caixa de 25 ml). Cada uma de quatro caixas foi inoculada no centro com uma cala de agar transferida de uma cultura de PDA de Fusarium subglutinans f. sp pini (isolar SL-1, UCB) em crescimento, enquanto a quinta placa foi deixada sem inoculação para controlo. Estes passos foram repetidos para cada formulação do aldeído cinâmico. Como controlo positivo, quatro placas de PDA completadas com 5 ppm de benomil foram inoculadas como descrito; o controlo negativo eram quatro placas de PDA não tratados que foram inoculadas com F. subglutinans. Todas as placas inoculadas e não inoculadas foram incubadas a 18° C durante cinco dias, após o que foram medidos os diâmetros da colónias. A tabela 10 mostra as médias dos dados brutos do diâmetro das -63- colónias para o bioensaio, e a Tabela 11 compara o efeito no diâmetro das colónias de CNMA em várias concentrações, com e sem saponina (extracto de Yucca schidegira a 10° BRIX a 0,86 ml).

Tabela 10

Crescimento Radial de Fusarium subzlitinans f. sp. vini _(Médias dos dados)*_

Tratamento_Diâmetro da colónia (cm) PDA (sem completar) 4,038 lOppmdeCNMA 4,363 lOOppmdeCNMA 4,238 100 ppm de CNMA + Saponina 4,300 Glutaraldeído 2 % 3,663 5.000 ppm de CNMA + Saponina 2,913 10 ppm de CNMA + Saponina 3,600 h2o 3,738 2,500 ppm de CNMA 3,513 2,500 ppm de CNMA + Saponina 3,600 Saponina 4,138 5.000 de CNMA 2,908 Fórmula em branco 4,380 12.500 de CNMA + Saponina 0,000 25.000 de CNMA 0,000 5 ppm de Benomil (Controlo Positivo) 0,000 12.500 ppm de CNMA 0,000 25.000 de CNMA + Saponina 0,000 -64-

Tabela 11

Crescimento Radial de F. subglutinans f. sp. pini

Tratamentos CNMA + Saponina CNMA (0,86 ml) ppm diâmetro da colónia (cm) diâmetro da colónia (cm) 10 4,36 3,60 100 4,24 4,30 2.500 3,51 3,60 5.000 2,91 2,91 12.500 0 0 25.000 0 0 Controlos diâmetro da colónia (cm) 2% Glutaraldeído 3,66 ho2o 3,74 5 ppm de Benomil 0 PDA (sem completar) 4,04

Exemplo 10

Bioensaio sinergista O efeito sinergístico de um composto é determinado seguindo os protocolos aqui descritos. Uma quantidade eficaz de um composto de teste sinergista é adicionada ou aplicada separadamente em combinação com uma dada formulação numa diluição em série e regime de concentração variando de níveis -65- -65-

de controlo destituído do composto de teste sinergista até uma concentração que está bem acima de óptima. O efeito antipatogénico e/ ou fitotóxico de um composto de teste sinergista específico num dado patógeno e/ ou hospedeiro planta é medido para cada fórmula e componente com ou sem um diluente em série do composto de teste sinergista seguindo essencialmente os protocolos dos Exemplos acima. A variação de dose óptima é calculada in vitro e in vivo a partir de níveis de dose de controlo até níveis de dose de saturação em que um aumento maior em uma variável de controlo não produz qualquer aumento positivo no efeito resultante. A eficácia de cada formulação de teste é medida pela comparação com formulações de controlo destituídas do composto de teste sinergista e calculadas as MDICs e MDITs. São identificados compostos sinergistas que fornecem: uma média de resistência a doença para uma formulação específica de pelo menos cerca de 60 % ou melhor com uma formulação específica óptima de cerca de 70 % ou mais; e/ ou uma taxa de fitotoxicidade de 2 ou menos, com 1 ou menos sendo a óptima.

Bioensaio de Saponina A saponina ou o extracto de saponina é misturado ou aplicado como uma solução separada em combinação com uma dada formulação num regime de diluição em série variando de níveis de controlo com 0 % de saponina e 100 % de outro componente através de níveis de igualdade e depois de saturação de cada componente. O efeito sinergístico da formulação é medido examinando o efeito antipatogénico e fitotóxico de um patógeno em particular e/ ou hospedeiro planta a cada fórmula e componente com ou sem um diluente em série de saponina seguindo os protocolos dos Exemplos acima. Uma quantidade eficaz de saponina é medida em comparação com um equivalente em actividade de um controlo de extracto de saponina de Y. schidigera compreendendo de 0,05 % a 1 % v/v de solução aquosa de extracto de saponina a 10° brix. A variação de -66- dose óptima para uma dada formulação é calculada in vitro e in vivo. A eficácia de cada formulação de teste é medida comparando com formulações destituídas de saponina. São identificadas saponinas tendo propriedades sinergísticas que fornecem: uma resistência média a doença para uma formulação específica de pelo menos 60 % ou melhor com uma formulação específica óptima de cerca de 70 % ou mais; e/ ou uma taxa de fitotoxicidade de 2 ou menos, com 1 ou menos sendo a óptima.

Exemplo 11

Efeito de Saponina e/ ou Aldeído Cinâmico sobre Caracóis Materiais e Métodos

Experiência 1:

Estudos de bioteste moluscicida por contacto foram levados a cabo por um método de contacto de substrato. Para a formulação líquida, discos de papel de filtro (15 cm de diâmetro) foram mergulhados em soluções de teste por 2 segundos e subsequentemente secos ao ar. Para formulações secas, os substratos foram colocados em discos de papel de filtro até uma profundidade de 0,5 cm. O substrato seco (por exemplo, fibra de saponina, passada por moagem) foi humedecido com 10 ml de fórmula. Foram colocados discos no fundo de pratos de papel (25 cm de diâmetro) cujas bordas tinham sido revestidas com vaselina e NaCl para evitar que animais escapassem dos pratos. Quatro caracóis (Sephia hortensis) da Connecticut Valley Biological e duas lesmas (Deroceras reticulatum) da Carolina Science foram colocados nos discos tratados ou empilhados em cada replicação (cinco replicações). As formulações experimentais foram atribuídas como: -67-

Formulação e Número de Composição #1 F1 - 2 % de Aldeído Cinâmico, 2 % de T80, 6 % de NaHC03 #2 F2 = Saponina (10° BRIX) e F1 (1 : 9) o #3 F3 = Fibra de Saponina + F1 (para humedecer - 10 ml) #4 F4 = Fibra de Saponina + Passagem por moinho de trigo (50/50 p) #5 F5 = Saponina (10° BRIX) (para humedecer 10 ml) e Passagem por moinho de trigo #6 F6 = Fibra de Saponina #7 F7 = Fórmula em branco (CNMA) (para humedecer - 10 ml) e Passagem por moinho de trigo #8 F8 = H20 #9 F9 = Lilly Miller "SSIKB" (Controlo positivo - Produto Metaldeído) #10 F10 = Emulsão de CNMA (encapsulado) em óleo (Calgene cc - 22F), CNMA encapsulado @ 31,4 + 1,2 % p/p em cápsulas de sacarose de amido (85/ 15)

Experiência 2:

Os componentes da fórmula de aldeído cinâmico foram avaliados relativamente à actividade como a seguir. Discos de papel de filtro de 7,5 cm de diâmetro foram completamente humedecidos com produto ou componente e deixados a secar ao ar. Os discos foram colocados no fimdo de jarros de vidro "Mason 1/2 pint". Dois caracóis e uma lesma foram colocados em cada jarro para 5 replicações. Os jarros foram selados com pano de queijo e mola de tampa para permitir respiração. Foram feitas observações em 48 hrs.

Resultados e Debate

Em geral, como mostrado na Tabela 12, as formulações contendo -68- aldeído cinâmico foram moluscicidas eficazes demonstrando 100 % de mortalidade-em 48 hrs. A fórmula F1 teve desempenho tão bom como a fórmula baseada em saponina e teve uma percentagem de mortalidade mais alta do que o controlo positivo (F9 - "SSIKB"). A fibra de saponina bruta (F3 - com Fl) combinada com CNMA alcançou uma alta percentagem de mortalidade no início das experiências, logo a seguir, apenas ao CNMA encapsulado que foi extremamente letal alcançando 100 % de mortalidade em 30 minutos. A Tabela 13 apresenta dados dos componentes da experiência 2 relativos à fórmula, controlo negativo e percentagens de actividades relacionadas.

Experiência 3:

Saponina (0,86 ml de solução a 10° brix) com ou sem (10 - 25.000 ppm) é avaliada por aldeído cinâmico relativamente ao efeito sobre dissecação de musgo. Um disco de papel de filtro Whatman (7,5 cm) é colocado no fundo de cada caixa de Petri. Três ml de H20 são pipetados sobre os discos. Secções de musgo (3,5 cm x 3,5 cm) são tiradas do núcleo do lote envasado e colocadas sobre os discos de papel de filtro para todos as caixas. Dois ml de soluções de teste são aspergidos sobre cada caixa, com cinco réplicas por tratamento. As caixas de Petri são deixadas à temperatura ambiente e as áreas de dissecação são observadas a 24, 48 e 60 horas após o tratamento. Os resultados são mostrados na Tabela 13. Em geral, o musgo tratado com a formulação de aldeído cinâmico mostrou a maior percentagem de dissecação ao longo do tempo. Embora a saponina tenha sido eficaz tanto só como em combinação com aldeído cinâmico, esta aumentou a quantidade de dissecação sobre a que foi vista só com aldeído cinâmico.

Os dados na Tabela 14 mostram o percentual de actividade dos componentes da fórmula. -69-

Tabela 12

Análise de Dados - Lesmas e Caracóis % de Mortalidade (¾ Hrs. Depois do Tratamento Fórmula 0 0,5 2,5 24 48 #1 F1 (2 %) Caracóis 0 0 50 50 100 Lesmas 0 0 100 100 100 #2 10° B + F1 Caracóis 0 0 25 50 50 Lesmas 0 0 50 100 100 #3 Fibra de Caracóis 0 0 75 75 100 Saponina/ F1 Lesmas 0 100 100 100 100 #4 Fib. de Sapo- Caracóis 0 0 100 100 100 nina + Moagem Lesmas 0 50 100 100 100 #5 10° B + Caracóis 0 0 50 75 100 Moagem Lesmas 0 0 0 100 100 #6 Fibra de Caracóis 0 0 75 75 75 Saponina Lesmas 0 0 100 100 100 #7 CNMA em branco Caracóis 0 0 0 0 0 +Moagem Lesmas 0 0 0 100* 100* #8 Controlo Neg. Caracóis 0 0 0 0 0 (H20) Lesmas 0 0 0 0 100* #9 Controlo Pos. Caracóis 0 0 0 50 75 (SSIKB) Lesmas 0 0 0 100 100 #10 CNMA encaps. Caracóis 0 100 100 100 100 + óleo Lesmas 0 100 100 100 100 *Animal Contactou Borda do Prato (NACL)

Exemplo 12

Fitotoxicidade e Bioensaio de Formulações Contendo Aldeído Cinâmico e Sanonina A. Provas de Fitotoxicidade

Foram realizadas provas de fitotoxicidade em três plantações -70- de estufa a fim de determinar a compatibilidade do uso de saponina como adjuvante de* surfactante com CNMA em vez de polisorbatos (por exemplo Tween). O que se segue sumarisa os resultados dos ensaios:

Tabela 13

Percentage BRYOPHYTA (MUSGO) m de Dissecação (ao longo do tempo) 0 24 hrs. 48 hrs. 60 hrs. MUSGO: DICRANUM F1 0 15 40 90 F2 0 10 40 80 F3 0 15 50 85 F4 0 5 15 25 F5 0 6 18 26

SPAGNUM (MUSGO DE F1 0 20 60 90 PÂNTANO) F2 0 15 55 75 F3 0 20 60 85 F4 0 8 12 20 F5 0 9 12 22 WOODLAND F1 0 20 60 85 F2 0 10 40 70 F3 0 20 50 80 F4 0 10 15 20 F5 0 12 18 28

F1 2 % de CNMA F2 SAPONINA (10° Brix)

F3 2 % de CNMA + SAPONINA

F4 Controlo Neg - H2O F5 Fórmula em branco

Tabela 14 MUSGO (60 hrs.) Formulação % de Dissecação Nenhuma 70 T80 10 NaHC03 20 T80 + NaHC03 25 Fórmula 90 Controlo Negativo 10 1. Mini rosas, ÍSunburst). Quatro plantas de mini rosas (Sunburst) envasadas foram tratadas com cada uma de três aplicações de tratamento; 0,5 % de CNMA mais 0,05 % de saponina, 0,25 % de CNMA mais 0,025 % de saponina e um controlo de apenas água. As plantas foram aspergidas no laboratório usando uma torre de aspersão e todas as plantas foram aspergidas até escorrer. Depois da aspersão, as plantas foram observadas por um período de cinco dias. Não foi observada nenhuma fitotoxicidade nos brotos velhos, nos brotos novos ou nas pétalas das flores, indicando que estas taxas são seguras para aplicação em mini rosas. 2. Crisântemos. Três crisântemos envasados foram tratados, cada um, com 0,5 % de CNMA mais 0,05 % de saponina, 0,25 % de CNMA mais 0,025 % de saponina, ou um controlo de apenas água. As plantas foram aspergidas como discutido acima. Ao fim de um período de observação de cinco dias não foi observada nenhuma toxicidade nas folhas ou pétalas das flores, demonstrando que estas taxas são seguras para aplicação. -72- 3. Poinsetias. Duas poinsetias envasadas foram tratadas, cada uma, com 0,5 % dè CNMA mais 0,05 % de saponina, 0,25 % de CNMA mais 0,025 de saponina, ou um controlo de apenas água. Ao fim de um período de observação de cinco dias, a fitotoxicidade foi observada em brotos novos de folhas da taxa de aplicação alta (0,5 % de CNMA, 0,05 % de saponina). Não foram observados quaisquer sintomas em brotos novos de folhas da taxa mais baixa (0,25 % de CNMA, 0,025 % de saponina), indicando que a taxa mais baixa é segura para aplicação. B. Bioensaios de Insectos Nocivos 1. Tetrânicos de Dois Pontos. Os ácaros foram testados colocando folhas de rosa infestadas com ácaros de aranha em números aproximadamente iguais em caixas de Petri com papel Whatman colocado no fundo. Quatro caixas de Petri com ácaros foram aspergidas em ambos os lados das folhas para cada um de três tratamentos: 0,5 % de CNMA mais 0,05 % de saponina, 0,25 % de CNMA mais 0,025 % de saponina e um Controlo de apenas água. Os ácaros tratados foram deixados por 24 horas e o número de ácaros sobreviventes foi então contado e registado. Os resultados foram como a seguir: Caixas de Petri de controlo (H20 apenas), 53,25 ± 15,57 ( Média ± SE); 0,25 % de CNMA, 6,75 ± 1,18; 0,5 % de CNMA, 0,75 ± 0,48. Estes resultados indicam que as formulações contendo CNMA mais saponina têm um alto grau de eficácia contra ácaros no que se refere a aplicações de aspersão directa. 2. Tisanópteros de Flores Ocidentais. Os tisanópteros foram testados colocando folhas de rosa infestadas com tisanópteros em números aproximadamente iguais em caixas de Petri com papel Whatman colocado no fundo. Quatro caixas de Petri com tisanópteros foram aspergidas em ambos os lados das folhas para cada um de três tratamentos: 0,5 % de CNMA mais 0,05 % -73- de saponina, 0,25 % de CNMA mais 0,025 % de saponina e um controlo de apenas água^Os tisanópteros tratados foram deixados por 6 horas e o número de tisanópteros mortos foram então contados e registados. Os resultados foram como a seguir: Caixas de Petri de controlo (H20 apenas), 1,4 % ± 0,85 % (média SE); 0,25 % de CNMA, 53, 2 % ± 11,8; e 0,5 % de CNMA, 87,2 ± 2,79. Estes resultados indicam que CNMA mais saponina têm um alto grau de eficácia contra tisanópteros no que se refere a aplicações de aspersão directa. 3. Afídeos do Melão. Os afídeos do melão foram testados usando plantas de crisântemos inteiras e não florescentes envasadas. Duas plantas foram tratadas para cada tratamento e duas folhas, uma da parte superior da planta e uma da parte inferior da planta, foram usadas como amostras para determinar o número de afídeos do melão vivos e mortos. Foram aplicados três tratamentos: 1,0 % de CNMA mais 0,5 % de saponina, 0,5 % de CNMA mais 0,25 % de saponina, e 0,5 % de saponina apenas. As plantas inteiras foram aspergidas até "pingar" tanto no lado superior como inferior das folhas. Os resultados são apresentados como a proporção de afídeos encontrados mortos. Os resultados são como a seguir: planta de controlo (0,5 % de saponina apenas) 14,8 % ± 4,5; 0,5 % de CNMA 48,3 ± 16,1; 1,0 % de CNMA 72,0 % ± 11,2. Estes resultados indicam que o CNMA pode matar um alto grau de afídeos no que se refere a aplicações de aspersão directa..

Actividade Residual de Saponina. Cinamaldeído e a- Hexilcinamaldeído

Duas experiências separadas indicaram que o cinamaldeído (CNMA) e α-hexil cinamaldeído (HCA) têm ambos actividade residual. Na primeira experiência, dois ml de duas concentrações de CNMA (0,3 e 1 %) foram aspergidos sobre papel de filtro (Whatman). Como controlo negativo, dois ml de água também foram aspergidos sobre papel de filtro. Vinte e quatro horas mais tarde, dois nil de água foram aspergidos no papel de filtro de tratamento e de controlo, que foram então secos durante 30 min. Aproximadamente 30 insectos de tisanópteros {Frankliniella occidentalis) foram introduzidos e o número de F. occidentalis foi observado ao fim de 1 hora. A média de mortalidade foi calculada para cada tratamento.

Ao fim de 72 horas, os filtros de papel de tratamento foram virados ao contrário e apenas o papel de filtro de controlo negativo e o papel de filtro tratado com 1 % de CNMA foram aspergidos com 2 ml de água e deixados a secar durante 30 minutos. Aproximadamente 30 tisanópteros foram introduzidos aos dois filtros de papel tratados e ao fim de uma hora foi observado o número de F. occidentalis mortos e a média de mortalidade calculada para cada tratamento. Um teste semelhante foi conduzido usando α-hexil cinamaldeído. A média de mortalidade foi mais alta para filtros de papel rehidratados em comparação com filtros de papel não rehidratados ao longo do tempo. Estas experiências demonstram que a rehidratação tem uma função no efeito letal contínuo de papel de filtro tratado em contacto com os tisanópteros.

Testes de Exposição Contínua A fim de determinar tanbém a actividade residual da saponina, CNMA e HCA, insectos são confinados a depósitos em duas superfícies representativas. Vidro é usado para representar superfícies não porosas e papel de filtro é usado como superfície porosa. Dois ml de cinco concentrações diferentes de saponina com ou sem um aldeído aromático numa fórmula são aplicados a discos de papel de filtro (9 cm de diâmetro) ou ao fundo de caixas de Petri de vidro (9 cm de diâmetro). Como controlo, são também aplicados dois ml de fórmula menos saponina. Os depósitos são deixados a secar por 24 horas antes de serem testados. A intervalos de teste de 7, 14, 28, e 56 dias, um conjunto de pratos e papeis de filtro são rehidratados com 2 ml de água, ao passo que um conjunto paralelo não é rehidratado. Insectos são então confinados aos depósitos continuamente e o número de insectos mortos pelos depósitos é contado regularmente. Se os depósitos não conseguem matar insectos dentro de 48 horas, estes tratamentos são descontinuados de outros estudos de envelhecimento.

Exemplo 14

Superprodução de Aldeídos Aromáticos em Plantas Transgénicas

Vinte pg de poli A RN A são preparados a partir de um tecido de planta que produz cinamaldeído, e o cDNA é sintetizado. Parte disto é clonado em vector lambda-ZAP II (um vector de clonagem disponível comercialmente). Pelo menos 500.000 recombinantes são seleccionados usando uma sonda de oligonucleótido concebida a partir de sequências conservadas de genes de CA4H e de CAD clonados obtidos do GenBank, ou concebidos a partir de sequência de peptídeo de proteína purificada da planta hospedeira pretendida. Clones que hibridizam fortemente são seleccionados e usados para re-proteger o arquivo de cDNA. Os clones resultantes são sequenciados para tomar possível a introdução de sequências de genes apropriadas para dentro de uma cassette de expressão de planta quer na orientação contrária ao sentido quer na orientação do sentido. As construções contrárias ao sentido e a favor do sentido são introduzidas no Agrobacteríum tumefaciens LBA4404 por transformação directa seguindo procedimentos publicados. Discos de folhas de tabaco (N. tabacum variedade Samsun) usando procedimentos publicados bem estabelecidos (Horsch et al. (1985) Science 227 : 1229 - 1231. Plantas contendo construções tanto de CA4H -76- como de CAD são identificadas por PCR ou hibridização e seleccionadas para futuras análises.

Material de planta de plantas de controlo tanto transformadas como não transformadas é usado para as determinações de actividade enzimática de CA4H e CAD usando ensaios publicados bem estabelecidos. Plantas nas quais a actividade de CA4H ou CAD foi reduzida para menos de 20 % do que foi visto nas plantas de controlo são seleccionadas para futuras análises. Plantas seleccionadas com baixa actividade de CA4H são cruzadas com plantas com baixa actividade de CAD e a progénie que herde ambas as construções de genes é seleccionada por PCR. Plantas com actividade suprimida de CA4H e actividade suprimida de CAD são analisadas para a produção de aldeído aromático usando procedimentos padrão publicados.

Exemplo 16

Produção de Aldeídos Aromáticos em Sistemas Microbianos

Um arquivo de cDNA é gerado usando RNA extraído de caules de tabaco com seis semanas de idade. 20 pg de poliA RNA são preparados e sintetizados por cDNA. Parte deste é clonado em vector lambda-ZAP II (um vector de clonagem disponível comercialmente). Pelo menos 500.000 recombinantes são seleccionados usando uma sonda de oligonucleótido concebida a partir de sequências de proteína purificada CCoAr de sequência de peptídeos de tecido de caule de tabaco com seis semanas de idade usando o protocolo de Goffner, et al., Plant Physiol. (1994) 106 : 625. Clones que hibridizam fortemente são seleccionados e usados para re-proteger o arquivo de cDNA. Os clones resultantes são sequenciados para tomar possível a identificação de inserções de comprimento total de cDNA e a introdução de sequências de genes de CCoAR apropriadas em vector de expressão de levedura pMTL8110 (Faulkner, et al. (1994) Gene 143 : 13 - 20. As sequências com codificação para fenilalanina amónia-liase (Phenylalanina Ammonia Lyase, PAL; GenBank locus RHDPAL) de Rhodosporidium toruloides e um 4-cumarato de salsa: CoAL ligase (4CL; GenBank locus PC4CL1AA) são introduzidos de modo semelhante em vectores de expressão de levedura equivalentes. As construções de PAL, 4CL e CCoAR são usadas para transformar linhagens de Saccharomyces cerevisiae por electroporação usando procedimentos publicados estabelecidos (Becker, e Guarente, Methods in Enzymology 194 : 182 - 187, 1991; Simon, (1993) Methods in Enzymol 217 : 478 - 483. Os transformantes são seleccionados em leucina destituída de meio mínimo. As linhagens de transformantes carregando as três construções de genes são identificadas por PCR e seleccionadas para futuras análises.

Extractos de linhagens de controlo tanto transformadas como não transformadas são usados para determinações das actividades enzimáticas de PAL, 4CL e CCoAR usando ensaios publicados bem estabelecidos. As linhagens nas quais a actividade de PAL, 4CL e CCoAR é significativamente maior do que a actividade de fundo detectada em linhagens de controlo são seleccionadas para futuras análises. As linhagens seleccionadas são analisadas relativamente à produção de aldeído aromático usando procedimentos publicados padrão e aquelas que produzem quantidades significativas de cinamaldeído são seleccionadas para optimização das condições de fermentação.

Exemplo 17

Construção de uma Linhagem de Levedura que Produz HCA

Uma linhagem de levedura, tal como Saccharomyces cerevisiae, que contém as enzimas necessárias para a biosíntese de cinamaldeído (CNMA) é construída como a seguir. Primeiramente, a linhagem é concebida para expressão de PAL de alto nível como descrito por Faulkner et al. (1994) Gene 143 : 13020. Um gene de 4-hidroxilase de cinamato de planta é também ligado operavelmente a sinais de controlo apropriados e inserido na linhagem (ver Urban et al. (1994) Eur. J. Biochem. 222 : 843 - 850). Um gene de cinamoilCoA reductase (CCoAR) é obtido pela aplicação de técnicas de clonagem de genes padrão para isolar um clone de cDNA usando como sonda uma sequência de nucleótidos derivada de uma sequência parcial de amino ácido da proteína purificada, que foi purificada e parcialmente caracterizada a partir de várias fontes de plantas. O gene CCoAR é também ligado para controlar sinais operáveis em levedura e inseridos na linhagem da levedura. O gene que codifica a enzima que catalisa a conversão de CNMA para HCA é então clonado como a seguir. Um arquivo de cDNA é construído num vector de expressão de levedura usando mRNA obtido a partir de plantas de arroz. O arquivo de cDNA* é depois transformado na linhagem de levedura previamente construída e os transformantes seleccionados usando um marcador seleccionável presente no vector de expressão. A fim de identificar aquelas linhagens de levedura que produzem HCA, os tranformantes são transferidos para poços de microtitulação contendo agar médio de crescimento de levedura. Placas de microtitulação são então colocados numa câmara que contém pulgas, que são sensíveis a HCA mas não a CNMA. Linhagens de levedura de poços que contêm um maior número de pulgas mortas estatisticamente significativo contendo linhagens de levedura de controlo não transformadas são diluídas e re-colocadas em placas de microtitulação após o que o processo de selecção é repetido para obter colónias derivadas de uma única célula de levedura transformada. 4 t*

-79-

As coIonias derivadas de células únicas que exibem mortalidade de pulgas aumentada são analisadas relativamente à produção de HCA por cromatografia líquida-gasosa (Gas Liquid Chromatography, GLC), usando uma coluna capilar de polidimetilsiloxano não polar de 30 metros (por exemplo, HP-1. Hewlett-Packard, ou SPB-1, Supelco) e um detector de ionização por chama. Usando hélio como gás portador (8 ml/ min.) e uma temperatura de coluna de aproximadamente 240° C, o isómero (E)-cis (componente principal) tem um tempo de retenção de aproximadamente 6,0 minutos e o isómero (Z)-trans (componente secundário) tem um tempo de retenção de aproximadamente 6,3 minutos. O vector de expressão de DNA é isolado de colónias que produzem HCA e a inserção sequenciada para obter a sequência de nucleótidos e a sequência de amino ácido deduzido da enzima que catalisa a conversão de CNMA para HCA.

Exemplo 18

Construção de Plantas Trangénicas que Produzem HCA

Um gene que codifica para a enzima que catalisa a conversão de aldeído cinámico (CNMA) para aldeído α-hexilcinâmico (HCA) é clonado a partir de plantas de arroz por mutagénese de elemento de transposição. Protoplastos de arroz são transformados com um vector de clonagem que contém um elemento transponível Ac de milho inserido dentro de um gene de fosfotransferase de higromicina B (hygB) de modo a interromper a sequência de codificação do gene higQ (ver, por exemplo, Izawa et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227 : 391 - 396; Murai et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19 : 617 - 622) . Os

-80- protoplastos transformados são colocados sobre agar em meio de crescimento contendo quantidades de higromicina B para evitar a regeneração de protoplastos não resistentes à higromicina. Os protolastos em que o elemento transponível Ac saltou do gene hygB para a genoma do arroz são resistentes à higromicina B, e deste modo regeneram-se para formar tecido caloso. As plantas são regeneradas a partir de tecido caloso resistentes à higromicina (ver, Izawa et al., supra).

As plantas de arroz regeneradas são analisadas para verificar a presença ou ausência de CNMA e HCA como descrito no Exemplo anterior. Plantas que produzem CNMA mas não produzem HCA potencialmente carregam um elemento de transposição AC inserido dentro do gene de biosíntese de HCA. O DNA genómico é isolado de mutantes de CNMA+/ HCA' e hibridizados para elemento de transposição de DNA marcado. Os fragmentos que hibridizam para a sonda do elemento de transposição de DNA são sub-clonados para um vector de clonagem apropriado para mapeamento e análise de sequência. O gene de biosíntese de HCA é identificado como uma configuração aberta que é interrompida pela inserção da sequência conhecida do elemento de transposição Ac. Um fragmento do gene é usado para sondar um arquivo de cDNA a fim de isolar o cDNA correspondente. O cDNA para a enzima de biosíntese de HCA é inserido dentro de um vector de expressão, ligado operavelmente a um promotor fortemente expresso que seja funcional em planta para a qual a resistência a insectos seja desejada. O vector de expressão é inserido dentro das plantas usando métodos de transformação conhecidos dos especialistas na matéria. As plantas trangénicas são analisadas para verificar a produção de HCA e/ ou a actividade de repelente ou pesticida contra insectos nocivos como descrito no Exemplo 17 acima. -81 -

Como mostram os resultados acima, rosas envasadas ou do campo aspergidas até escorrer com uma emulsão contendo aldeído cinâmico e bicarbonato de sódio e concomitantemente aspergidas com saponina permaneceram livres de míldio pulverulento e ferrugem durante até 56 dias quando em comparação com plantas aspergidas apenas com água. As plantas também permaneceram livres de afídeos. Os resultados também demonstram que a saponina aumenta a eficácia do aldeído cinâmico contra insectos nocivos tais como filoxera, nemátodos, lesmas, caracóis e fungos tais como Fusarium subglutinans. Ficou também demonstrado que as saponinas e formulações de CNMA são eficazes contra ácaros de aranha, tisanópteros, e afídeos do melão. A invenção é apropriada para fornecer sementes, mudas, plantas e partes de planta tais como frutas substancialmente livre de organismos patogénicos tais como fungos e insectos sugadores de seiva. A invenção é também apropriada para reduzir o nível de micotoxinas e outros metabólitos secundários tóxicos associados com a partes de plantas tais como o caule, folhas, raízes, frutas, sementes, e/ ou flores antes, durante e/ ou depois de a planta e/ ou parte da planta ser colhida e/ ou processada para consumo.

Todas as publicações e pedidos de patentes mencionados nesta especificação são indicativos do nível de perícia daqueles especialistas na matéria a quem esta invenção diz respeito.

Lisboa, 24 de Maio de 2000

JORGE CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um método para controlar o crescimento de organismos patológicos numa planta pelo qual se proporciona à superfície da planta uma composição aquosa compreendendo uma quantidade eficaz de controlo de crescimento de organismos patológicos de um ou mais compostos de saponina e pelo menos um composto de acordo com a seguinte fórmula

em que Ri representa -CHO, R2 representa H, -OH ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, R3 representa -H, -OCH3 ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, e R4 representa -H ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono pelo qual a referida quantidade é não fitotóxica à referida planta.
2. Um método de acordo com a reivindicação 1, pelo qual a referida planta é posta em contacto com uma formulação aquosa compreendendo de 0,01 — 50 g/1 de um ou mais dos compostos de acordo com a fórmula (2) da Reivindicação 1.
3. O método de acordo com a Reivindicação 1, pelo qual a referida formulação aquosa compreende de 0,025 - 3 % de saponina. -2-
4. Um método de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, em que Ri representa - CHO, R2 e R3 representam -H e R4 representa -(CH2)5-CH3.
5. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a espécie da planta é rosa, uva, maçã, pêssego, relva, tomate, pimento, pinheiro ou espécies de algodão.
6. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 - 5 pelo qual organismos patológicos compreendem pelo menos um de fungos, bactérias, nemátodEs, algas, insectos, aracnídeos e moluscos terrestres.
7. Um método de acordo com as reivindicações 5 e 6 pelo qual 0 organismo patológico é um fungo que causa míldio pulverulento, ferrugem, botrite, cancro da resina, "mancha de dólar" Sclerotonia, míldio Phythium e míldio Rhizoctonia.
8. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 - 6 pelo qual o organismo patológico é pelo menos um de afídeos, cigarrinhas, enroladores de folhas, nemátodes do caule e do bolbo, filoxera, algas de relva azuis-verdes, traça pequena e tisanópteros.
9. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 - 3 e de 5 - 8, em que pelo menos um dos compostos é aldeído cinâmico ou aldeído coniferílico.
10. Uma composição aquosa para uso num método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores compreendendo um ou mais compostos de saponina e de 0,01 - 50 g/1 de um ou mais compostos da fórmula -3 -

R4 r2

Ri R3 (2) em que Ri representa -CHO, R2 representa -H, -OH ou um substituente inorgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, R3 representa -H, -OCH3 ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, e R4 representa -H ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono.
11. Uma composição de acordo com a Reivindicação 10 em que Ri representa -CHO, R2 e R3 representam - H e R4 representa -(CH2)5-CH3.
12. A composição de acordo com a Reivindicação 10 ou 11, em que a referida saponina está numa quantidade de 0,025 - 3 %.
13. Uma composição de acordo com a reivindicação 10, em que pelo menos um composto é aldeído cinâmico ou aldeído coniferílico.
14. Uso de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 - 13 no controlo do crescimento de organismos patológicos numa planta.
15 Um método para induzir a resistência de plantas contra organismos patológicos pelo qual as referidas plantas são postas em contacto com -4- uma quantidade de uma combinação de pelo menos um composto de saponina e pelo menos um composto da fórmula

em que representa -CHO, R2 representa -H, -OH ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, R3 representa-H, -OCH3 ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, e R4 representa -H ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono pela qual a referida quantidade é suficiente para induzir resistência sistémica aos referidos organismos patológicos.
16. Uma composição aquosa para uso num método de acordo com a Reivindicação 15, compreendendo pelo menos um composto de saponina e pelo menos um composto da fórmula

em que Ri representa -CHO, R2 representa -H, -OH ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, R3 representa -H, -OCH3 ou um -5-

ϊ substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, e R* representa -H ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono numa quantidade eficaz para induzir a referida resistência sistémica.
17. Uso de uma composição de acordo com as reivindicações de 10 - 13 ou 16 na indução de resistência sistémica em plantas contra organismos patológicos.
18. Uma composição aquosa compreendendo uma quantidade moduladora de crescimento de patógeno de pelo menos um composto de saponina e um ou mais compostos da fórmula

em que Ri representa -CHO, R2 representa -H, -OH ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, R3 representa -H, -OCH3 ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, e R4 representa -H ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, num portador compatível com a agricultura, em que a referida composição fornece uma média de resistência a doença de 70 % ou mais contra pelo menos um organismo patogénico que coloniza uma ou mais superfícies das plantas.
19. Uso de uma composição de acordo com as reivindicações de 10 - 13, 16 ou 18 para fomecer uma média de resistência a doença de 70 % ou mais contra pelo menos um organismo patogénico que coloniza uma ou mais superfícies das plantas.
20. Um método para a selecção de sensibilidade de um patógeno de planta a uma formulação moduladora de crescimento fúngico compreendendo pelo menos um composto de saponina e pelo menos um composto da fórmula

em que Ri representa -CHO, R.2 representa -H, -OH ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, R3 representa -H, -OCH3 ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, e R4 representa -H ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, compreendendo o referido método: colocar 0 referido patógeno de planta em contacto com a referida formulação moduladora de crescimento fúngico; e determinar a eficácia da referida formulação como um patógeno fúngico.
21. Um método para controlar o crescimento de organismos patológicos numa planta pelo qual a superfície da planta é fornecida com uma composição aquosa compreendendo um ou mais compostos de saponina e pelo menos um composto de acordo com a seguinte fórmula -7-

em que Rj representa -CHO, R2 representa -H, -OH ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, R3 representa -H, -OCH3 ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, e R4 representa -H ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, pelo qual os referidos compostos de saponina são sinergistas a fim de aumentar o efeito do referido composto de fórmula (2) no controlo do crescimento de organismos patológicos numa planta e permitem uma redução na concentração do referido composto de fórmula (2) na referida formulação em comparação com a concentração do referido composto de fórmula (2) quando usado sem os referidos compostos de saponina.
22. Um método de acordo com a reivindicação 21, em que a referida formulação é uma formulação aquosa compreendendo de 0,01 - 50 g/1 de um ou mais dos compostos de acordo com a fórmula (2) da reivindicação 21.
23. Um método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, em que Ri representa -CHO, R2, e R3 representam - H e R4 representa -(CH2)5-CH3.
24. Uma composição aquosa para uso num método de acordo com as Reivindicações de 21 - 23 compreendendo um ou mais compostos de saponina e de 0,01 — 50 g/1 de um ou mais compostos da fórmula -8- -8-

em que R\ representa -CHO, R2 representa H, -OH ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, R3 representa -H, -OCH3 ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos de carbono, e R4 representa -H ou um substituente orgânico compreendendo de 1 a 10 átomos.
25. Uma composição de acordo com a Reivindicação 24, em que Ri representa -CHO, R2 e R3 representam -H e R* representa -(CH2)5-CH3.
26. Uma composição de acordo com a reivindicação 24, em que pelo menos um composto é aldeído cinâmico ou aldeído coniferílico. c Lisboa, 24 de Maio de 2000

JORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 USBOA