BRPI1004594A2 - mÉtodo para conseguir resistÊncia Às doenÇas de cÍtrus causadas por insetos, por fungos ou bactÉrias ou por oomicetos ou nematàides - Google Patents

Abstract

METODO PARA CONSEGUIR RESISTÊNCIA ÀS DOENÇAS DE CÍTRUS CAUSADAS POR lNSETOS, POR FUNGOS OU BACTÉRIAS OU POR OOMICETOS OU NEMATàIDES. Consiste em modificar os níveis de acumulação e de emissão de monoterpenos e sesquiterpenos em citrus, como mecanismo de resistência á patógenos e pragas. A alteração do conteúdo de d-limoneno e outros terpenos conseguem-se através da introdução via transformação genética, de um gene que codifica uma enzima com atividade d-limoneno sintase, bem procedente de cítrus ou bem procedente de outra planta ou outro organismo vivo, em anti-senso ou em forma de molécula indutora de interferência de RNA (RNAi). A modificação genética é realizada através da Agro bacterium tumefaciens ou qualquer outro método de transformação genética de plantas, a partir de protoplastos ou explantes da planta. A construção se incorpora em genótipos de citrus ou gêneros afins da família Rutaceae, com a finalidade de reduzir os níveis de acumulação e de emissão dos monoterpeno e compostos precursores e/ou seus derivados, tanto em nível de folhas, como flores e frutas.

Description

"MÉTODO PARA CONSEGUIR RESISTÊNCIA ÀS DOENÇAS DE CÍTRUS CAUSADAS POR INSETOS, POR FUNGOS OU BACTÉRIAS OU POR OOMICETOS OU NEMATÓIDES"

DESCRIÇÃO

CAMPO DA TÉCNICA

A presente invenção refere-se a um método para conseguir resistência às doenças de cítrus causadas por insetos, fungos ou bactérias ou oomicetos ou nematóides, especialmente aplicável em matéria de fitopatologia, entomologia, infecções fungicas, infecções bacterianas, tecnologia pós-colheita, podridão, patógenos de plantas, processamento de alimentos, características organolépticas, melhora de aroma, melhora de sabor.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

As plantas produzem uma grande variedade de metabólitos secundários, muitos dos quais são compostos voláteis emitidos pelas folhas, flores, raízes e frutos com diferentes funções, entre os quais se encontram as que atuam como moléculas sinalizadoras da interação das plantas com outras plantas, no ambiente ou em áreas distantes da área central da mesma planta, defesas contra as pragas de insetos e contra patógenos, como atrativos para os predadores de insetos herbívoros em folhas e raízes, como atrativos para insetos polinizadores de flores, ou como atrativo para a dispersão de sementes por frutos (Gershenzon e Dudareva, 2007). Além disso, os compostos voláteis emitidos pelas flores contribuem significativamente para o sucesso reprodutivo das plantas e sobrevivência em ecossistemas naturais (Kessler et aL, 2008). Finalmente, os aromas de plantas, e mais especificamente, seus frutos têm contribuído significativamente para a seleção dos melhores genótipos e sua utilização pelos seres humanos para fins alimentares, medicinais e industriais (Goff e Klee, 2006).

Nos últimos tempos, houve avanços significativos na compreensão da via Biosintética, na clonagem de genes regulatórios importantes na purificação de enzimas envolvidas na descoberta e mecanismos de regulação que levam à formação destes compostos voláteis e de emissões pelos diferentes tecidos ou órgãos das plantas. Por conseguinte, propôs usar o conhecimento adquirido para melhorar as plantas através da engenharia genética, principalmente com finalidades agronômicas e nutricionais.

Os cítrus são as árvores frutíferas economicamente mais importantes do mundo, com produção superior a 105 milhões de toneladas em 2008, em uma área de mais de 7,6 milhões de hectares (FAO, 2009). Cultivadas em mais de 130 países em áreas tropicais e subtropicais (até 40 graus de latitude de ambos os lados do Equador) onde há solo e condições climáticas favoráveis. Os maiores produtores são o Brasil, Estados Unidos, China, Espanha e México, que representam cerca de 55% da citricultura mundial.

As frutas cítricas são afetadas por importantes pragas, tais como doenças causadas por nematóides, fungos, ooomicetos, bactérias, spiroplasmas, fitoplasmas, vírus e viróides, doenças de etiologia desconhecida. Algumas dessas doenças afetam a maioria das áreas citrícola, tais como aquelas causadas por oomicetos Phytophthora sp, ou vírus da tristeza, também conhecido como Citrus Tristeza Virus (CTV), que impede a utilização de importantes porta-enxertos e restringe a produção e qualidade do fruto em alguns países. Outros, como o cancro, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri, que afeta a maioria das variedades cítricas mais importantes e está amplamente alastrado. Com isso, passou a constituir uma séria ameaça para a citricultura da Flórida e para a maioria dos países sul-americanos. Outras doenças estão localizadas em áreas geográficas específicas, como os produzidos pela bactéria Xylella fastidiosa, em São Paulo (Brasil). Finalmente, existem doenças importantes em determinados locais e que nos últimos tempos espalharam para outras áreas citrícolas, como o Greening, causada pela bactéria Candidatus Liberibacter spp., que afeta todas as variedades. Esta bactéria tem impedido o desenvolvimento das indústrias de cítrus em países do sudeste asiático e está atualmente condenando milhões de árvores na Flórida e no Brasil. No caso das três bactérias acima mencionadas, não existem meios eficazes de controle. Algumas doenças também são muito importantes para a manutenção pós- colheita de frutos, tais como as produzidas por fungos do gênero Penicillium.

Em relação às pragas e outras que afetam diretamente a árvore e/ou frutos produzidos, como a mosca da fruta (Ceratitis capitata) e do piolho vermelho (Aonidiella aurantii) da Califórnia e aqueles que são portadores de doenças como o Psila Diaphorina citri, transmitindo a bactéria Candidatus Liberibacter spp. ou o pulgão Toxoptera citricidus, transmissor muito eficiente de CTV. Embora atualmente utilizados principalmente tratamentos agressivos com produtos químicos para controlar pragas de cítrus, eles não representam uma solução duradoura, nem economicamente ou ambientalmente sustentável em médio prazo.

Diante destas ameaças graves para a indústria mundial de cítrus, é prioridade a busca de soluções alternativas, como os baseados em melhoramento genético. Apesar dos esforços dos programas tradicionais de melhoramento genético por mais de um século, a citricultura atual está baseada em um pequeno grupo de variedades de alta qualidade que são enxertadas em um número não muito grande de variedades de porta-enxertos. A maioria destes genótipos ocorreu de forma aleatória, ou seja, surgiram a partir de mutações espontâneas detectada no campo por agricultores ou do cultivo de sementes e germinação de plantas de interesse de forma aleatória. Além disso, os programas de melhoramento são severamente limitados pela complexidade da biologia reprodutiva dos cítrus. Neste contexto, a modificação genética através da transgenia oferece enormes possibilidades porque permite introduzir caracteres únicos em genótipos de elite sem alterar o seu fundo genético. Embora exista controvérsia social sobre o uso desta tecnologia para o melhoramento vegetal, acredita-se que o uso de transgenes de interesse, procedente do próprio cítrico que se deseja modificar, superaria a relutância de certos sectores, especialmente se esta estratégia mostrar-se superior, em termos ambientais, as tecnologias atualmente utilizadas no controle de pragas e agentes patogênicos.

Na última década, foi publicado uma série de trabalhos fundamentais sobre o papel dos voláteis de plantas como repelentes de pragas e atrativos de predadores herbívoros (Aharoni et al. 2003, Arimura et al., 2000, De Moraes et al., 2001). Isto levou a pensar que era possível modular as emissões dos compostos voláteis pelas plantas através da engenharia metabólica para o propósito de melhorar a resposta de defesa da planta contra as pragas. Assim, a superexpressão do gene precursor de uma linalol/nerolidol sintase de morango, em plantas transgênicas de Arabidopsis, levaram a acumulação de elevados níveis de linalol e, conseqüentemente, à indução de repelência contra pulgões (Aharoni et al., 2003). A superexpressão deste mesmo transgene em Arabidopsis, mas desta vez dirigida à mitocôndria, levou à acumulação de nerolidol e homoterpeno secundária (E)-DMNT, fez com que as plantas tornassem atraentes para os insetos predadores carnívoros, inimigos naturais dos ácaros-praga (Kappers et al., 2005). Nesse mesmo sentido, a superexpressão do gene precursor de um sesquiterpeno sintase, TPS10, em Arabidopsis transgênicas, tornou-a atraente á abelha parasita devido à emissão de níveis elevados de sesquiterpenos que, normalmente, são liberados quando larvas destas abelhas mastigam as folhas (Schnee et al., 2006). Mais recentemente, a expressão de um gene precursor de uma trans- cariofileno sintase de orégano em milho transgênico, fez com que as raízes da planta tornassem atrativas para nematóides que as protegem de ataques de insetos-praga (Degenhardt et al., 2009). A superexpressão em tabaco transgênico do gene de um pachulol sintase, junto com o do gene precursor de um difosfato farnesil sintase, precursor de sesquiterpenos, levou a um acúmulo elevado de pachulol e outros 13 sesquiterpenos, tornando as plantas altamente resistentes às larvas de insetos praga (Wu et al., 2006).

O papel dos diferentes compostos terpenóides para conferir resistência á patógenos é bem documentada, sobre tudo no sector florestal, mas não foi testado a superexpressão de genes precursores destes compostos como estratégia de biotecnologia de proteção até a presente data (Trapp e Croteau, 2001).

Em última análise, todos estes estudos sugerem que a engenharia metabólica para atingir a resistência á agentes bióticos, representa uma tecnologia alternativa ao uso de produtos caros, fungicidas, bactericidas, inseticidas, altamente tóxicos e que a sua utilização resultaria em aumento da qualidade do produto.

Por outro lado, os compostos voláteis são importantes para a percepção do aroma e sabor do fruto pelos seres humanos (Goff e Klee, 2006). O melhoramento genético tradicional de plantas tem se preocupado em maximizar atributos como produtividade ou vigor, em detrimento de outros, como o aroma, e isso levou a novas variedades de frutos que foram aos poucos perdendo seu sabor e aroma. Além disso, propõe-se que alguns dos fatores determinantes de tais compostos dos frutos são benéficos para a saúde (Bisignano e Saija, 2002). Hoje, o aroma é considerado um atributo de qualidade que deve ser reincorporado as novas variedades de frutos. Novamente, a engenharia metabólica se mostra como uma tecnologia necessária. Além disso, esta poderia permitir a produção de novas combinações de aromas das plantas com interesse industrial, tanto para alimentos, como para produtos de perfumaria, cosméticos, produtos de limpeza, etc.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO Esta invenção diz respeito ao uso de seqüências de DNA que codifica uma enzima com atividade d-limoneno sintase em anti-senso ou RNAi para transformação genética de plantas de Citrus spp. e gêneros e espécies afins da família Rutaceae, visando reduzir o acúmulo de compostos monoterpeno nessas plantas para conseguir resistência sistêmica ou repelência á pragas, especialmente Ceratitis capitata Wied., Tetranychus urtieae Koch., Panonychus eitri (McGregor)5 Dialeurodes eitri Ash, Parabemisia myrieae (Kuw.) Trioza erytreae (Del Guercio), Coccus hesperidium L., Insulapsis gloverii (Pack), Chrysomphalus dyetiospermi, Ceroplastes sinensis, Paraleyrodes minei Laccarino, Aspidiotus nerii Bouché, Parlatarioa pergandei Const., Cornuaspis beekii New., Diaphorina eitri Kuwayama, Aonidiella aurantii (Mask.), Planoeoecus eitri (Risso), Pseudoeoecus adoidum L., P. maritimus (Ehrhom), Prays eitri Mill, Aphys gossypii Glover, Mizus persieae Sulzer, Aphys spiraeeola (Patch.), Toxoptera aurantii (B. de F.), Aleurothrixus floeeosus Mask., Ieerya purchasi Mask., Saissetia oleae Oliver, cigarrinha vetores CVC (Family Cieadellidae'. Subfamília Cieadellinae), Anastrepha spp., Gymnandrosoma aurantiana Lima, Phyllocnistis eitrella Stainton, Orthezia praelonga Douglas, Unaspis eitri (Comstock), Brevipalpus phoenieis (Geijskes) e Phyllocoptruta oleivora (Ashmead), a resistência á patógenos, especialmente bactérias como Xanthomonas eampestris (Pammel), Pseudomonas syringae Van Hall, Xanthomonas eitri subsp. eitri (ex Hasse), Xylella fastidiosa Wells, Candidatus Liberibacter spp., oomicetos e fungos Alternaria eitri Eli. & Pierce, Alternaria alternata (Fries) estirpes, Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Sacc., Rhizoetonia solani JG Kühn, Aspergillus niger P.E.L. van Tieghem, Guignardia eitricarpa Kiely, Penieillium italieum Wehmer, Botrytis einerea Pers: Fr., Sphaeropsis tumefaciens Hedges, Phytophthora spp., Pythium sp., Fusarium oxysporum f.sp. eitri Timmer, Penieillium digitatum (Pers.) Sacc., Phoma traeheiphila (Petri) LA Kantsch. & Gikaschvili, Alternaria limicola E.G. Simmons & M.E. Palm, Armillaria mellea (Vahl) P. Kumm., Phanerochaete salmonicolor (Berk. & Broome) Jülich, Colletotrichum aeutatum JH Simmonds, Oidium tingitaninum J.C. Carter, Rhizopus stolonifer (Ehrenb.: Fr) Vuillemin., Pythium ultimum, Selerotinia selerotiorum (Lib.) de Bary, Geotriehum eandidum Link., Rosellinia sp., Elsinoe fawcettii Bitan. e Jenk., Elsinoe australis Bitan. e Jenk., Pseudocercospora angolensis (T. Carvalho & O. Mendes) Crous & U. Braun, Diaporthe citri Wolf, Mycosphaerella eitri Whiteside, Septoria spp., ou como nematóides Pratylenchus spp., Xiphinema spp., Meloidogyne spp., ou Tylenchulus semipenetrans, assim como obter novos compostos aromáticos dos tecidos das plantas e melhorar as características organolépticas de frutas, flores e folhas.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Para complementar a descrição a ser feita e para ajudar a compreender melhor as características do invento, de acordo com um exemplo preferido de realização prática do mesmo, acompanha em anexo, como parte integrante dessa descrição, um conjunto de desenhos, como caráter ilustrativo e não limitativo, representados da seguinte forma:

Figura 1..- Mostra uma seqüência de nucleotídeos do gene precursor da enzima com atividade d-limoneno sintase, base dos módulos de expressão que são usadas para transformar geneticamente plantas de Citrus spp. na presente invenção.

Figura 2..- mostra uma seqüência de polipeptídeos de d- limoneno sintase produto da tradução da seqüência de nucleotídeos mostrada na Figura 1.

Figura 3..- Mostra a construção anti-senso, gerada a partir da seqüência de nucleotídeos da Figura 1, em vetor de transformação pBIN 19.

Figura 4..- Mostra a construção RNAi, gerada a partir da seqüência de nucleotídeos da Figura 1, em vetor de transformação pBIN 19. Tabela IA..- Mostra seqüências de iniciadores utilizados para clonar um gene precursor da d-limoneno sintase de laranja doce.

Tabela IB..- Mostra as condições de PCR utilizadas para clonar um gene precursor da d-limoneno sintase de laranja doce. REALIZAÇÃO PREFERENCIAL DA INVENÇÃO

A presente invenção descreve um método para obter resistência á pragas e patógenos de plantas cítricas e afins através da geração de plantas transgênicas em que estão ativos genes da resposta de defesa das plantas através da redução nos níveis de acumulação de certos compostos voláteis monoterpenos e sesquiterpenos e aumento de monoterpenos acíclicos alcoólicos. Isto é conseguido através da supressão parcial do acúmulo de um ou várias d-limoneno sintase/s de Citrus spp. através da expressão recombinante no sentido anti-senso ou RNAi de um gene precursor em plantas de Citrus spp. e afins.

Os terpenos constituem no maior grupo de produtos naturais derivados de plantas, com mais de 30.000 compostos conhecidos. São hidrocarbonetos insaturados baseados em um esqueleto de isopreno (C5H8). Nas plantas, a produção de grandes quantidades de terpenos, assim como sua subseqüente acumulação, emissão ou descarga, está associada com a presença de estruturas anatômicas altamente especializadas, tais como as glândulas de óleo da flavedo dos frutos cítrus.

Todos os terpenos são derivados de um precursor de cinco carbonos, o isopentenil difosfato (IPP). O IPP é formado a partir de acetil- CoA seguindo a rota clássica do acetato/mevalonato no citoplasma e retículo endoplasmático, enquanto que nos plastídios sé forma a partir do gliceraldeído fosfato e piruvato seguindo a rota do metileritritol-4-fosfato (MEP).

A isomerização de IPP pelo IPP isomerase produz o isômero alílico dimetilalil difosfato (DMAPP), que é considerado como o precursor do prenil difosfato. O DMAPP sofre condensação com o IPP para dar o intermediário de dez carbonos, o geranil difosfato (ou GDP) (CIO). A repetição desta reação com a adição de uma ou duas moléculas de IPP fornece a farnesil difosfato (FPP ou FDP) (Cl5) ou geranilgeranil difosfato (GGPP ou GGDP) (C20), respectivamente. As reações de alongamento eletrofílica que produzem CIO, C15 e C20 prenil difosfatos são catalisados por enzimas preniltransferases. Estas enzimas podem usar o IPP ou DMAPP indistintamente.

As reações que estes compostos sofrem (normalmente ciclizações), catalisada por terpeno sintases, produzem uma grande variedade de compostos terpênicos. A família de enzimas responsáveis pela formação de terpenóides a partir do GPP, FPP e GGPP é conhecida como monoterpeno, sesquiterpeno e diterpeno sintases, respectivamente. Muitos terpenóides são cíclicos, e muitos contêm vários sistemas de anéis, embora haja terpenos acíclicos. Os terpenos sintases que produzem produtos cíclicos são também conhecidos como ciclasas. Estas enzimas têm propriedades semelhantes e contêm elementos de seqüências conservadas.

Os monoterpenos constituídos por duas unidades de isopreno (CIO) são componentes voláteis de essências de flores e óleos essenciais de plantas aromáticas e especiarias, que podem representar até 5% da produção de matéria seca da planta. São isolados por destilação ou extração e tem uso industrial considerável em perfumes e aromatizantes. As glândulas de óleos essenciais dos frutos cítrus são ricas em monoterpenos. Destes, d-limoneno é de aproximadamente entre 90 e 98% do total de óleos na casca de laranja doce, laranja amarga e pomelo. Nas flores de cítrus, d-limoneno também é um dos principais componentes, mas não atinge a concentração de mais de 90% observado na casca do fruto. Também é citado como um componente importante em folhas de cítrus. O d-limoneno é um monoterpeno monocíclicos (l-metil-4-(l- metiletenil) ciclo-hexano), cuja composição r

química é C10H16. Seu peso molecular é 136,24. E formado a partir da união de duas moléculas de isopreno. É um composto líquido com odor similar ao aroma de limão, insolúvel em água e solúvel com álcool, encontra-se comumente na forma de seu d-isômero.

Nos últimos anos, foi clonado duas d-limoneno sintases de

limão (CILIMS1 e CILIMS2) (Lücker et al, 2002) e duas de Satsuma mandarin (CitMTSEl e CUMTSE2) (Shimada et al, 2004, 2005). Lücker et al (2004) foram superexpressados CILIMS1 juntamente a um y-terpinene sintase e β-pineno sintase, também de limão, em tabaco mediante transformação genética e conseguiu-se aumentar ligeiramente o conteúdo de d-limoneno e de outros monoterpenos nas flores destas plantas. Endo et al (2009) superexpressou CitMTSEl no sentido anti-senso em Poncirus trifoliata, um afim de Citrus spp. Para superar o longo período juvenil da planta, superexpressaram também uma forma rápida de floração que lhes permitiram obter frutos em apenas dois anos, porém as plantas eram aberrantes. Em todo caso, o uso de CitMTSEl anti-senso permitiu reduzir ligeiramente os níveis de d-limoneno na casca do fruto de Poncirus trifoliata. Não alterou o nível de qualquer outro terpeno nessas frutas. Nenhum desses trabalhos pioneiros, ou outros realizados com genes precursores de d-limoneno incorporados mediante transformação genética a outras plantas, menciona quaisquer outros efeitos biológicos resultantes da utilização do transgênico do gene precursores de d-limoneno sintases.

Um aspecto da presente invenção refere-se ao isolamento de ácidos nucléicos que codificam enzimas com atividade d-limoneno sintase de Citrus spp. ou afins da família Rutaceae, ou qualquer outro organismo vivo. Entende-se que um d-limoneno sintase é uma enzima que catalisa a síntese do d-limoneno. Isto pode ser determinado por um ensaio enzimático conhecido para aqueles familiarizados com a arte.

Em uma parte do presente invenção, o ácido nucléico selecionado compreendendo uma seqüência de nucleotídeos substancialmente homóloga a apresenta na Figura 1, a qual codifica um polipeptídeo substancialmente homólogo e funcionalmente equivalente à mostrada na Figura 2, com atividade d-limoneno sintase.

Preferencialmente o ácido nucleico de presente invenção

procede de Citrus spp. Em outra aplicação da invenção usa-se um ácido nucléico de qualquer organismo vivo que seja codificante de uma enzima funcionalmente equivalentes, ou seja, com atividade d-limoneno sintase.

Nesta invenção, o termo ácido nucléico refere-se ao ácido desoxirribonucléico (ADN-DNA em Inglês), em forma de cadeia simples ou dupla, isolado a partir de uma molécula de DNA maior ou sintetizado a partir dele mesmo por PCR, em quantidade e concentração suficiente para permitir a sua identificação e manipulação usando procedimentos normais em bioquímica. Assim, o termo DNA inclui, por exemplo, cDNA, DNA genômico, DNA sintetizado quimicamente, DNA amplificado por PCR e combinações dos anteriores. Em geral, os ácidos nucléicos da invenção incluem seqüência que hibridam com a seqüência de nucleotídeos da invenção nas temperaturas de 5°C, 10°C, 15°C, 20°C, 25°C ou 30°C abaixo da temperatura de união de DNA duplex das seqüências da invenção, incluindo as fileiras médias entre essas temperaturas.

Caso contrário, os ácidos nucléicos da invenção compreendem seqüências substancialmente homólogas ao da Figura 1. Em outra aplicação, ácidos nucléicos são pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% idênticos com a seqüência da Figura 1, codificando cada uma das seqüências de proteínas com atividade d-limoneno sintase.

Em outra aplicação, os ácidos nucléicos compreendem um trecho de pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 250, pelo menos 500, ou pelo menos 750 a seqüência de nucleotídeos contíguos da Figura 1. Estes fragmentos contíguos de nucleotídeos poderiam ter pelo menos uma mutação, de modo que, ainda mantêm a sua funcionalidade original e sua capacidade de hibridizar com os nucleotídeos originais sem condições tanto de baixa como de alta adstringência. Este fragmento pode ser obtido, por exemplo, dos nucleotídeos 200 al800, de 800 al800, de 1000 al800, de 200 alOOO, de 200 a 800, de 400 al600 ou de 400-1000 da seqüência da Figura 1.

Os ácidos nucléicos da invenção codificam um polipeptídeo substancialmente homólogos e funcionalmente equivalente a Figura 2. Em outra aplicação da presente invenção, os polipeptídeos são pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% idênticas com a seqüência da Figura 2 e tem atividade de d-limoneno sintase.

Devido à característica do código genético, onde mais de um códon pode codificar o mesmo aminoácido, várias seqüências de nucleotídeos codificam um único polipeptídeo. Essas variantes de seqüência poderiam gerar naturalmente ou artificialmente na presente invenção. Todos eles codificam um polipeptídeo substancialmente homólogo ao representado na Figura 2. Em outra aplicação da invenção contempla-se a possibilidade de usar ácidos nucléicos que codificassem variantes do polipeptídeo da Figura 2. Entendem-se como variantes tanto os ácidos nucléicos como os polipeptídeos de uma ou mais eliminação, uma ou mais substituição ou uma ou mais inserção de nucleotídeos e aminoácidos, respectivamente. Em todo caso, o produto traduzido manteria a sua atividade d-limoneno sintase.

Em uma aplicação da invenção,o cDNA é transcrito em RNA anti-senso. RNA anti-senso é o RNA cuja seqüência é o complemento reverso do RNA mensageiro (RNA sentido) codificado por um gene. Um vetor que leve a expressão de um RNA anti-senso é aquele o qual o RNA cópia está disposto em "orientação invertida" em relação ao promotor de tal forma que a cadeia não codificante é transcrita. A expressão de RNA anti-senso é utilizada para reduzir o acúmulo da proteína codificada pelo RNA mensageiro do qual ο RNA anti-senso é complementar. Os vetores que produzem RNA anti-senso são usados para produzir plantas transgênicas na presente invenção.

Em outra aplicação da invenção, com a intenção de reduzir ainda mais os níveis de acumulo de d-limoneno sintase, o cDNA é expresso como RNA anti-senso seguido por RNA senso, separadas por uma seqüência de intermediários, de preferência um intron, para gerar interferência de RNA (RNAi). Esta se dá ao expressar o RNA transcrito de forma reversa e direta na mesma molécula, de modo que as duas formas complementares emparelhem e dêem origem a uma molécula de RNA bicatenário perfeitamente complementares. Isto é reconhecido pelo complexo Dicer da célula que digere a molécula de RNA em pequenos fragmentos entre 20 a 26 nucleotídeos, que por sua vez são reconhecidos e orientados pelo complexo RISC para identificar a cadeia de RNA mensageiro perfeitamente complementar a estes RNAs pequeno. Assim, são geradas zonas de RNA bicatenário no RNA mensageiro, que são utilizadas como iniciadores para gerar novas moléculas de RNA aberrantes (reconhecido pelo Dicer) ou são diretamente degradado pela endonucleases (SLICER) do complexo RISC. Os vetores indutores de RNAi também são usados para transformar geneticamente plantas na presente invenção.

Com as estratégias de RNA anti-senso RNAi, conseguiu-se silenciar a expressão dos transgenes e de moléculas de RNA mensageiro complementar à das moléculas indutoras, de modo que é reduzida ou bloqueada a expressão do d-limoneno sintase endógeno e com isso, se produz a redução mais ou menos significativa nos níveis de acumulação e de liberação de d-limoneno nas células.

Em uma aplicação desta invenção, o cDNA do RNA anti- senso que se utiliza tem pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1500, ou a seqüência de nucleotídeo inteira inversa complementaria ao gene precursor da d-limoneno sintase.

Em outra aplicação, os fragmentos de cDNA, precursores de RNA anti-senso e RNA senso da construção geradora de RNAi são pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1500 ou a seqüência de nucleotídeos inteira (seja em sentido senso ou anti-senso) do gene precursor da d-limoneno sintase.

Na presente invenção, os DNAs cópias, precursores das construções de diferentes aplicações foram subclonado em plasmídeos vetores de transformação genética de plantas, tais como aqueles representados nas Figuras 3 e 4, relativos às construções anti-senso e RNAi,, respectivamente, mostradas como exemplo.

Na invenção, as construções genéticas estão clonadas em vetor de transformação, de preferência sob o controle de seqüências regulatórias constitutivas e que conferem expressão alta, como o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) e do terminador do gene da nopalina sintase (NOS) ou do 35S, ou similar. Em outra aplicação, as construções estão clonadas sob o controle das suas próprias seqüências promotoras e terminadoras do gene de d-limoneno sintase cuja expressão pretende-se reprimir. Em outra aplicação, utiliza seqüências regulatórias que conferem expressão induzida ou específica tanto em fruto, como em tecido verde ou em tecidos florais, conhecidos por aqueles familiarizados com a arte.

Esses vetores de transformação com seus correspondentes módulos de expressão de interesse são usados na presente invenção para transformar plantas geneticamente. Existem inúmeros procedimentos para transformar geneticamente células vegetais e regenerar a plantas inteiras a partir destas. Estes incluem (mas não estão limitados a isso) a transformação mediada por bactérias do gênero Agrobacterium, balística, por microinjeção, eletroporação, por vírus de plantas, por fibras de carboneto de silício, por infiltração de tecidos florais, mediada por lipossomas, mediada por polietilenoglicol e mediada por outras bactérias, entre outros.

Na aplicação preferencial da presente invenção é usado a Agrobacterium tumefaciens como um vetor para transformação, sem descartar nenhuma das outras vias possíveis de transformação genética. A transformação genética de plantas mediada por Agrobacterium tumefaciens é o método mais comum pára cítrus e relacionados.

A. tumefaciens utiliza normalmente a transformação como sistema para transferir fragmentos concretos de seu DNA no genoma das células vegetais. Neste DNA residem genes envolvidos na biossíntese de hormônios vegetais, de modo que sua expressão nas células leva à formação do tumor nas áreas infectadas. Os genes que são transferidos residem no T- DNA, que por sua vez são megaplásmideo chamado Ti (tumor de indução, indução de tumor). Através da engenharia genética pode ser substituído em Agrobacterium o T-DNA oncogênico do plasmídeo Ti por outro que tenha os genes de interesse que se pretende integrar nas células vegetais. Assim, as bactérias desarmadas são utilizadas como vetores para incorporar genes desejados nas células vegetais. A partir das células transformadas pode se regenerar planta inteira usando sistemas padrão de regeneração in vitro, bem conhecido por aqueles familiarizados com a arte.

Na invenção, utilizando protoplastos, células em suspensão de explantes de folhas, entrenós, nós, cotilédones, semente, epicótilo, flores, raízes, segmentos de frutas, ou qualquer outro órgão ou tecido da planta para a transformação.

Na invenção, as construções genéticas de interesses são usadas para transformar geneticamente plantas de laranja doce, tangerina, Clementina, de satsuma, laranja amarga, limão, lima, toranja, cidra, de macrófila, pomelo ou quaisquer outras espécies do gênero Citrus, de Poneirus trifoliata, de Fortunella spp., ou qualquer outra Rutaeeae, de citrange, de citrumelo, de tangelo, de tangor, ou qualquer outro híbrido entre cítricos ou cítricos e Rutaceae.

Na invenção, é preferencialmente usado material adulto para transformar, seguindo os procedimentos da patente ES 9700491ÍX (patente US 6.103.955) e Pena et ai. (2008).

Assim, as plantas transgênicas são geradas, preferencialmente adultos, e são caracterizadas pelas técnicas moleculares convencionais como PCR, Southern blot, Northern blot e similares. Na invenção, é realizada a análise por cromatografia gasosa - espectrometria de massa de diferentes tecidos obtidos das plantas transgênicas, como folhas, pétalas, flavedo, vesículas de frutas e tecidos similares, ou por outra técnica semelhante, que permite determinar a modificação do conteúdo e a liberação de terpenos voláteis nos tecidos das plantas transgênicas.

Na invenção, a utilização das estratégias anti-senso e de RNAi leva a uma redução no acúmulo de transcrição do gene da d-limoneno sintase introduzido e de transcrições de genes suficientemente homólogos da espécie transformada. Isto leva a uma drástica redução no acúmulo de enzimas com atividade d-limoneno sintase. Com isso, ocorre na presente invenção uma diminuição na síntese, acúmulo e liberação de d-limoneno e outros monoterpenos cíclicos como sabineno, delta-3-careno, beta-mirceno, ocimeno, alfa-terpinoleno, óxido de limoneno,, entre outros e sesquiterpenos como alfa-copaeno, beta-cubeneno, germacreno-D, beta-elemeno, cariofileno, beta-farneseno, alfa-farneseno, e beta-sinensal entre outros.

Na invenção, a redução no acúmulo de d-limoneno leva a um aumento no acúmulo e emissão de álcool monoterpeno acíclicos como beta- citronelol, nerol, geraniol e aldeídos como citronelal e ésteres, tais como geranil acetato entre outros.

Na invenção, a alteração no acúmulo e emissão de compostos terpenos faz as plantas transgênicas repelentes ou resistentes á insetos-pragas, como Ceratitis capitata Wied., Tetranychus urtieae Koch., Panonyehus eitri (McGregor), Dialeurodes citri Ash, Parabemisia myrieae (Kuw.) Trioza erytreae (Del Guercio), Coccus hesperidium L., Insulapsis gloverii (Pack), Chrysomphalus dyetiospermi, Ceroplastes sinensis, Paraleyrodes minei Laccarino, Aspidiotus nerii Bouché, Parlatarioa pergandei Const., Cornuaspis beekii New., Diaphorina citri Kuwayama, Aonidiella aurantii (Mask.), Planococcus citri (Risso), Pseudococcus adoidum L., P. maritimus (Ehrhom), Prays citri Mill, Aphys gossypii Glover, Mizus persicae Sulzer, Aphys spiraecola (Patch.), Toxoptera aurantii (B. de F.), Aleurothrixus floccosus Mask., Icerya purchasi Mask., Saissetia oleae Oliver, cigarrinha vetores CVC (Family Cicadellidae: Subfamília Cieadellinaé), Anastrepha spp., Gymnandrosoma aurantiana Lima, Phyllocnistis citrella Stainton, Orthezia praelonga Douglas, Unaspis citri (Comstock), Brevipalpus phoenicis (Geijskes) e Phyllocoptruta oleivora (Ashmead), a resistência á patógenos, especialmente bactérias como Xanthomonas campestris (Pammel), Pseudomonas syringae Van Hall, Xanthomonas citri subsp. citri (ex Hasse), Xylella fastidiosa Wells, Candidatus Liberibacter spp., oomicetos e fungos Alternaria citri Eli. & Pierce, Alternaria alternata (Fries) estirpes, Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Sacc., Rhizoctonia solani JG Kühn, Aspergillus niger P.E.L. van Tieghem, Guignardia citricarpa Kiely, Penicillium italicum Wehmer, Botrytis cinerea Pers: Fr., Sphaeropsis tumefaciens Hedges, Phytophthora spp., Pythium sp., Fusarium oxysporum f.sp. citri Timmer, Penicillium digitatum (Pers.) Sacc., Phoma tracheiphila (Petri) LA Kantsch. & Gikaschvili, Alternaria limicola E.G. Simmons & M.E. Palm, Armillaria mellea (Vahl) P. Kumm., Phanerochaete salmonicolor (Berk. & Broome) Jülich, Colletotrichum acutatum JH Simmonds, Oidium tingitaninum J.C. Carter, Rhizopus stolonifer (Ehrenb.: Fr) Vuillemin., Pythium ultimum, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, Geotrichum candidum Link., Rosellinia sp., Elsinoe fawcettii Bitan. e Jenk., Elsinoe australis Bitan. e Jenk., Pseudocercospora angolensis (Τ. Carvalho & Ο. Mendes) Crous & U. Braun, Diaporthe eitri Wolf, Mycosphaerella citri Whiteside, Septoria spp., ou como nematóides Pratylenehus spp., Xiphinema spp., Meloidogyne spp., ou Tylenchulus semipenetrans. Em outra aplicação da presente invenção, a redução no acúmulo de d-limoneno envolve o aumento da produção de certos monoterpeno acíclicos alcoólicos e gera novas misturas de óleos essenciais que são de interesse para uso industrial, farmacêutico e/ou médico.

EXEMPLOS DE INVENÇÃO Os dados numéricos, percentagens, ingredientes concretos e

organismos que se detalhem a constituição listadas abaixo devem ser considerados apenas como exemplos, sem colocar quaisquer restrições sobre o alcance das reivindicações da patente. Todos os termos científicos acima têm o mesmo significado com que são utilizadas na literatura e são conhecidos para aqueles familiarizados com a arte.

Materiais

O material de Citrus utilizado nos exemplos descritos a seguir foi obtido do banco de germoplasma de Citrus do IVIA (Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, Moncada, Valência, Espanha). Exemplo 1

Construção de módulos de expressão.

A partir de 2 g de flavedo de frutos da laranja doce, o RNA total foi extraído utilizando o procedimento descrito por Rodrigo et al. (2004) e como detalhado abaixo: Adicione as 2 gramas de tecido em um tubo de ensaio, 10 mL

de tampão de extração (200 mM Tris-HCl pH8, 400 mM NaCl, 50 mM EDTA pH8, Sarkosyl 2%, 1% PVP-40), 100 μι β -mercaptoetanol e 5 mL de fenol (equilibrado com Tris). Agitar e incubar durante 15 minutos a 65 0C. Adicionar 5 mL de cloforomo: álcool isoamílico (24:1). Centrifugar a 4500 rpm por 20 minutos a 4°C. Recuperar a fase aquosa para um novo tubo. Adicionar novamente 5 mL de fenol e 5 mL de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1). Centrifugar a 4500 rpm por 20 minutos a 4 °C. Recuperar a fase aquosa novamente e passar para um novo tubo de centrífuga. Adicionar 1,5 volumes de etanol 100%, misturar e centrifugar a 15000 rpm por 15 minutos a 4 0C. Remover o sobrenadante e lavar o pellet com 5 mL de etanol a 70% (a frio). Centrifugar a 15000 rpm por 5 min a 4°C. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 7,5 mL de TESa (10 mM Tris-HCl pH8, 5 mM EDTA, 0,1% Sarkosyl). Incubar 15 minutos em banho-maria a 65 0C para completar a ressuspensão. Adicionar 7,5 mL de água Milli-Q estéril. Centrifugar a 8000 rpm por 5 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga. Adicionar 0,33 volumes de 12M cloreto de lítio e incubadas a 4 0C durante uma noite. Centrifugar a 15000 rpm por 30 minutos a 4 0C. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento com 1,5 mL de etanol a 70%. Centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos. Ressuspender o sedimento com 1 mL de acetato de sódio 3M pH 6. Centrifugar a 15000 rpm por 15 minutos em temperatura ambiente. Lavar o sedimento com 0,5 mL de etanol a 70%. Centrifugar a 15000 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente. Secar o sedimento e ressuspender em 100 μΕ de água milli-Q estéril. Posteriormente, o RNA foi purificado usando um kit de

purificação de RNA e foi realizada em tratamento DNase coluna para evitar a contaminação do DNA na amostras.

A partir do RNA tratado com DNase, foi realizada a transcrição reversa do RNA para obter a cópia do DNA. Para a clonagem de d-limoneno sintase de laranja doce, iniciadores específicos foram desenhados (LAS-F e LSIR), os quais acrescentaram um sítio de restrição BamHl para posterior clonagem em um plasmídeo binário. Os iniciadores utilizados estão descritos no Tabela IA. O iniciador reverso utilizado era o LS1-R. Para amplificação do d-limoneno sintase, utilizou-se de PCR (reação em cadeia da polimerase), no qual foram utilizados iniciadores LAS-F e LSl-R e as condições estabelecidas no Quadro IB. Este fragmento foi clonado no plasmídeo binário pBIN 19 por digestão com a enzima BamHl entre as seqüências de terminação do gene da nopalina sintase (NOS) e do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor, introduzido previamente ao plasmídeo. A orientação dos fragmentos foi avaliada por seqüenciamento.

Para resumir a construção geradora de RNAi foi clonada uma seqüência de um intron, o cDNA em anti-senso e cDNA senso em um plasmídeo intermediário pGEM-T.

Exemplo 2

Transformação genética de cítrus com as construções de interesse precursoras de d-limoneno sintase anti-senso e RNAi e regeneração de plantas transgênicas inteiras.

As construções genéticas de interesse foram clonados no vetor de transformação pBIN 19 sob o controle do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) e do terminador do gene da nopalina sintase (NOS). Além da expressão da forma de interesse, o plasmídeo de transformação continha o gene da neomicina fosfotransferase II (nptll), que confere resistência a canamicina às células transformadas, sob o controle do promotor e terminador do gene NOS. Os plasmídeos de interesse pBIN19/AS e pBIN19/RNAi foram introduzidos em Agrobacterium tumefaciens, cepa EHA 105 (derivada desarmada de cepa A281).

Como material de partida foi utilizado gemas de material adulto de laranja doce enxertada, em ambiente de estufa, em porta-enxerto vigoroso. Uma vez brotadas, foram cortadas as varetas de tamanho aproximado de 30 a 40 cm, foram retiradas as folhas e espinhos e, posteriormente, lavadas com sabão e água sanitária a 2%. Em condições estéreis, os segmentos de entrenó foram cortados com tamanho aproximado de 1 cm e foram utilizados como explantes para a transformação. Foram mergulhados cerca de 40 explantes por placa em 30 mL de cultura de A. tumefaciens por 15 minutos com agitação no meio da inoculação (4,3 g/L sais de Murashige e Skoog (1962), 10 mL/L de solução de vitamina (100 mg/L de mio-inositol, 0,2 mg/L de tiamina-HCl, 1 mg/L de piridoxina-HCl, 1 mg/L de ácido nicotínico), 30 g/L de sacarose, pH 5,7). Após esse tempo, os explantes foram secos em papel filtro estéril. Alguns explantes foram inoculados em meio de inoculação sem bactérias para controlar que a regeneração de brotos ocorre normalmente. Após o tempo de inoculação, foram colocados cerca de 40 explantes por placa em meio de cultura de co-cultura (meio de inoculação com 2 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 2 mg/L de ácido indolacético (IAA), 1 mg/L, 2-isopentenil-adenina (2,ip), 8 g/L de agar, pH 5,7) e incubadas em semi-escuridão, durante 3 dias a 26°C (10 μΕιη-28-1, fotoperíodo de 16 h). Após a co-cultura, os explantes foram transferidos para o meio de seleção (meio de inoculação mais de 1,3 mg/L de 6- benzilaminopurina (BAP), 10 g/L de Agar, ph 5,7, 250 mg/L cefotaxima e 250 mg/L de vancomicina) (10 explantes/placa), sulfato de kanamicina a 100 mg/L. Os explantes foram mantidos no escuro por um período de aproximadamente 4 semanas a 26 °C, até observar formação de calos nas áreas de corte dos explantes. Foram posteriormente transferidos para câmara de crescimento com um fotoperíodo de 16 h, 45 μΕηι-28-1 de luz e 26 °C. As gemas começaram-se a formar, normalmente, em 7 a 9 semanas do co-cultura. Foi realizada uma seleção dos brotos por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) com iniciadores específicos do transgene (P35S-F, LAS-F para a verificação da construção do anti-senso e RNAi, Quadro IA e IB) que permitiu diferenciar os brotos positivo dos negativos.

Brotos positivos foram enxertados em porta-enxertos in vitro de citrange Troyer ou Carrizo, a partir de sementes germinadas in vitro. Estes enxertos foram transferidos para câmara de crescimento a 25°C, fotoperíodo de 16 h, 45 μΕηι-28-1 luz. Os brotos desenvolveram de 2 a 3 folhas expandidas em 3 a 4 semanas após o enxerto. Uma vez os brotos desenvolvidos, estes foram enxertados em porta-enxertos vigorosos, em ambiente de em casa de vegetação sob malha de sombreamento e coberto com um saco de plástico durante as primeiras três semanas, isso permitiu uma rápida aclimatação e desenvolvimento das plantas. Em aproximadamente 4 a semanas após serem enxertados em casa de vegetação, cada planta foi transferida para um local sem a malha de sombreamento onde continuou o seu crescimento.

As plantas foram posteriormente caracterizadas por Southern blot e Northern blot para confirmar a integração estável e determinar o padrão de integração dos transgenes em cada linha transgênica independente e os níveis de acumulação de transcrição, respectivamente.

Exemplo 3

Foi conduziu análise por cromatografia gasosa espectrometria de massa de diferentes tecidos obtidos de plantas transgênicas (folhas, pétalas, flavedo e vesículas de frutos). O uso das estratégias anti- senso e RNAi levou à obtenção de linhagens transgênicas independentes nas quais houve redução no acúmulo de transcrição do gene da d-limoneno sintase introduzido e de genes homólogos da laranja. Isto levou a uma drástica redução no acúmulo das enzimas com atividade d-limoneno sintase. Com isso, houve uma diminuição na síntese, acúmulo e liberação de d-limoneno e outros monoterpenos cíclicos como sabinene, delta-3-carene, beta-mirceno, ocimeno, alfa-terpinoleno, óxido de limoneno, hidrato de sabineno, propionato de linalila e, aldeído de perila, octanal, nonanal, decanal ou undecanal, isopiperitenona, e sesquiterpenos como alfa-copaeno, beta- cubeneno, germacreno-D, beta-elemeno, cariofileno, beta-farneseno, alfa- farneseno, muuroleno, elemol ou beta-sinensal nos frutos.

A diminuição do acúmulo de d-limoneno levou a um aumento no acúmulo e emissão de monoterpeno acíclicos alcoólicos como beta- citronelol, nerol, geraniol, aldeídos como citronelal e ésteres como geranil acetato.

Exemplo 4

Testes de infecção com fungos na pós-colheita a fim de demonstrar a atividade antifungica das plantas geneticamente transformadas com as construções de d-limoneno sintase anti-senso e RNAi.

Em experimentos de infecção de frutos cítrus por P. digitatum e P. minioluteum, foram utilizados frutos de duas colheitas diferentes. Foi usado laranjas das variedades Navelina e Pineapple. Todos os frutos foram colhidos antes de receberem qualquer tratamento pós-colheita e processados no mesmo dia da coleta. Foram selecionados frutos que não apresentaram danos ou podridão, estes foram desinfetados por imersão em solução de cloro (0,5% NaCl) por 1 minuto. Em seguida, foram lavados com água e seco com papel para imediata utilização. Os frutos foram infectadas com o fungo P. digitatum (Pers.:

Fr.) Sacc. (PD), agente causador da podridão-verde dos cítrus durante a pós- colheita. Foi usada a cepa NAV-7 do laboratório de tecnologia pós-colheita do IVIA. Além disso, foram inoculados outros fungos não patogênico de cítrus, Penicillium minioluteum (PM), obtidos no mesmo laboratório para verificar a ausência de infecção a partir dele.

O fungo P. digitatum (IO4 esporos/mL) foi inoculado em 3 pontos eqüidistantes da zona equatorial do fruto utilizando furador clássico de inoculação de cítrus mergulhando em suspensão de esporos. Uma das áreas da zona de inoculação foi marcada como 1 para facilitar a leitura. O fungo P (IO4 esporos/mL) foi inoculado em 8 pontos do córtex utilizando a mesma metodologia. Os frutos identificados e inoculados permaneceram em uma caixa sem fechadura hermética e com buracos (1 bandeja por tratamento) e foram incubadas em câmara termostática a 20 0C. Depois de três dias e até aproximadamente após 14 dias da inoculação, foi medido o diâmetro da podridão e calculado a área de progresso da doença (AUDPC). Somente as lesões com sintomas foram usados para determinar a severidade da doença. Para a análise também foi utilizado o percentual de feridas infectadas e esporulados ao longo do tempo.

Os dados de incidência e severidade das lesões

corresponderam ao valor médio de pelo menos 15 frutos com 3 feridas por fruto. A análise dos dados foi realizada utilizando o pacote estatístico Statgraphics Plus 5,1 "(Manugistics, Inc.), utilizando análise de variância (ANOVA). Foi realizado um estudo da homogeneidade da variância e, quando homogênea aplicava-se o teste LSD, considerando diferenças significativas ρ <0,05.

Os resultados apontaram diferenças significativas entre os tratamentos para a incidência das doenças entre os tratamentos das linhas geneticamente transformadas com a construção de d-limoneno sintase, anti- senso ou RNAi e controles. Existe uma redução muito significativa no aparecimento de feridas com sintomas nas linhas anti-senso e RNAi.

Exemplo 5

Testes de infecção com bactérias fitopatogênicas com objetivo de demonstrar a atividade antibacteriana das plantas geneticamente transformadas com construções de d-limoneno sintase anti-senso e RNAi.

Em experimentos de infecção com frutos cítrus pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri foram utilizados frutos de dois diferentes estágios de maturação. Foram usadas as variedades de laranja Navelina e Pineapple. Todos os frutos foram colhidos antes de receberem qualquer tratamento pós-colheita e foram processados no mesmo dia da coleta. Foram selecionados frutos intactos os quais foram desinfetados por uma lavagem em solução de álcool 70% e secos com papel para uso imediato.

No primeiro ensaio foram utilizados frutos verdes com 5 a 6 cm de diâmetro, enquanto que para o segundo ensaio, foram utilizados frutos na fase de mudança de cor fruto de 7 a 8 cm de diâmetro. Foi usada para inocular o isolado brasileiro de X. citri (cepa 306), na concentração de IO6 células/mL. Foram realizadas entre 5 e 7 pontos de inoculação por fruto mediante pressão por seringa. Os frutos foram cultivados em câmara de incubação com condições controladas, temperatura de 30 0C e 55% RH. Foi avaliado o diâmetro do halo e da formação da úlcera ou ferida.

Os resultados apontaram diferenças significativas entre os tratamentos para a incidência de doenças entre os tratamentos das linhas geneticamente transformadas e linhas controles. Houve uma redução significativa nos sintomas em linhas anti-senso e RNAi.

Exemplo 6

Testes de repelência com insetos, visando demonstrar as atividades dos voláteis de plantas geneticamente transformadas com as construções de d-limoneno sintase, anti-senso e RNAi, sobre o comportamento dos mesmos. Foram realizados ensaios biológicos apropriado tomando a mosca da fruta do Mediterrâneo (Ceratitis capitata Wied.) como exemplo. Experimentos com gaiolas.

Nos ensaios realizados sobre o comportamento da mosca da fruta (Ceratitis capitata Wied.) foram utilizadas plantas de laranja doce com frutificação, com um fruto por planta em estado de mudança na cor. Foram usadas plantas das variedades Navelina propagadas em casa de vegetação, tanto plantas não transformadas como transformadas com a construção d- limoneno sintase, anti-senso e RNAi. Também foi incluída em cada ensaio uma planta controle na qual foi atada uma maçã como controle de Ceratitis. As plantas foram individualizadas em gaiolas específicas na casa de vegetação, juntamente com 40 machos e 40 fêmeas de C. capitata de 5 a 6 dias de idade e criadas em laboratório. As moscas foram mantidas nas gaiolas por 3 dias com comida e água para a desova. Após 3 dias, os frutos foram cortados e estes foram mantidos em câmara de incubação para o desenvolvimento da pupa. Foi avaliada a afluência de moscas da fruta, o número de picadas por fruto, o número total de polpas por fruto e o número de adultos emergidos (tanto machos como fêmeas).

Os testes mostraram uma preferência das moscas pelo aroma dos frutos das plantas não transformadas, quando comparado com os das plantas transformadas as quais tinham drasticamente reduzido os níveis de monoterpeno d-limoneno e outros terpenos e aumento dos níveis de monoterpenos acíclicos.

Exemplo 7

Testes de repelência com insetos visando demonstrar a

atividade dos voláteis de plantas geneticamente transformadas com as construções de d-limoneno sintase, anti-senso e RNAi sobre o comportamento dos mesmos. Foram realizados testes biológicos apropriados tendo a mosca da fruta do Mediterrâneo (Ceratitis capitata Wied.) como exemplo. Experimentos em túnel de vento.

Nos estudos realizados sobre o comportamento da mosca da fruta (Ceratitis capitata Wied.) foram usados frutos de laranja doce em estádio de mudança de cor. Foram usadas laranjas da variedade Navelina propagadas na casa de vegetação e foram usadas plantas não transformadas e plantas transformadas com as construções de d-limoneno sintase anti-senso e RNAi. Vários estudos foram realizados em túnel de vento, no qual foi colocado um fruto de uma planta transformada e outro controle. Em cada ensaio foram liberados 50 machos de C. capitata de 5 a6 dias de idade criados em laboratório. Os machos de C. capitata permaneceram 30 minutos no túnel de vento. Foi avaliado seu comportamento pelo fluxo das moscas em cada fruto.

Os testes mostraram uma preferência das moscas pelo aroma dos frutos de plantas não transformadas em comparação com dos frutos de plantas transformadas os quais tinham reduzido drasticamente os níveis da monoterpeno d-limoneno e outros terpenos e aumento dos níveis de monoterpenos acíclicos.

Exemplo 8

Melhoria das características organolépticas.

A modificação das características organolépticas dos frutos, flores, folhas de cítrus, foi confirmada pela análise de cromatografia gasosa - espectrometria de massa de plantas das plantas de laranja doce transformada com a construção de d-limoneno sintase, anti-senso e RNAi.

O uso das construções de d-limoneno sintase em anti-senso e RNAi, resultou em uma variação total do perfil dos voláteis dos frutos de plantas de laranja doce transformadas. Foram reduzidos os níveis de d- limoneno 50 vezes e também foram reduzidos os níveis de outros monoterpenos, tais como sabinene, delta-3-carene, beta-mirceno, ocimeno, alfa-terpinoleno, óxido de limoneno, hidrato de sabineno, propionato de linalila ou isopiperitenona. Da mesma forma, houve diminuição dos níveis de monoterpenos do grupo dos aldeídos como o aldeído de perila, octanal, nonanal, decanal ou undecanal e sesquiterpenos como alfa-copaeno, beta- cubeneno, germacreno-D, beta-elemeno, cariofeno, beta-farneseno, alfa- farneseno, muuroleno, elemol ou beta-sinensal. Por outro lado, houve um aumento do teor de monoterpenos acíclicos alcoólicos como beta-citronelol, nerol, geraniol aldeídos como citronelal ou ésteres como geranil acetato.

Estas características deram origem a plantas com perfil de voláteis completamente alterados e que levou à obtenção de um novo produto aromático para o mercado. O aumento dos alcoóis típicos das fragrâncias florais resultou na obtenção de produtos mais atraentes para o consumidor, segundo revelação de degustação dos aromas realizados, e com potenciais propriedades medicinais.

Exemplo 9

A obtenção de novos aromatizantes com oportunidades nas indústrias de perfumes, condimento, produtos de limpeza, farmacêuticas e médicas.

A modificação das características organolépticas dos frutos, das folhas e das flores de cítrus transformados com as construções em anti- senso e RNAi, resultou na produção de óleos essenciais com diferentes composições dos atualmente comercializado a partir de tecidos de cítrus. A destilação de óleos essenciais destas plantas deu origem a novos produtos que podem ser combinados perfeitamente com os componentes habituais de perfumes e outros produtos. As composições preparadas podem ser usadas diretamente sobre o perfume ou durante as preparações de cosméticos, tais como cremes, loções, colônias, sprays, sabonetes, agentes de saúde da boca, assim como para melhorar o odor do produto como amaciante de roupas, produtos de limpeza e desinfecção dos agentes. Também pode ser utilizado na indústria de alimentos, aromatizantes e conservantes de bebidas e alimentos. O aumento do teor de cada um dos compostos terpênicos com potenciais de propriedades medicinais permitem propor a utilização de óleos essenciais em preparações farmacêuticas.

As aplicações e exemplos apresentados e discutidos acima tem a intenção de ensinar aqueles familiarizados com a arte o melhor modo conhecido dos inventores de fazer uso da invenção. Isso não impede que, a partir da invenção, podem ser encontradas outras aplicações facilmente dedutíveis por aqueles familiarizados com a arte. Por outro lado, todas as modificações que poderão ser feitas no processo por qualquer familiarizado com a arte ou como resultado de experimentos de rotina, considera-se que se encontram dentro do espírito e escopo da patente, tal como definido nas suas reivindicações. TABELA IA

Nome dos iniciadores Secuencia 5' - 3' LAS-F GAGAGGATCCATGTCTTCTTGCATTA LS1-R GAGAGGATCCTCAGCCTTTGGTGCC P35S-F ATCTCCACTGACGTAAGGGATGACG

TABELA IB

Etapa N ciclos Tempo Temperatura Desnaturação 1 5 minutos 95 0C Desnaturação 35 30 segundos 95 0C Anelamento 30 segundos 58 0C Alongamento 90 segundos 72 0C Alongamento 1 10 minutos 72 0C BIBLIOGRAFIA

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Claims (8)

1. Método para conseguir resistência às doenças de cítrus causadas por insetos, por fungos ou bactérias ou por oomicetos ou nematóides, caracterizado pelo fato de que consiste na incorporação, mediante transformação genética, de um transgene que codifica um transcrito, anti- senso ou ativador de RNAi contra o RNA mensageiro/s de pelo menos um polipeptídeo endógena com atividade d-limoneno sintase, de modo que reduz a atividade da d-limoneno sintase endógena e a acumulação de d-limoneno a níveis que provocam a resposta de defesa da planta contra patógenos.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a seqüência precursora do gene de interesse que codifica uma enzima com atividade d-limoneno sistase, é procedente de Citrus spp. ou da família Rutaceae.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o transgene de interesse engloba apenas uma parte do gene endógeno cuja expressão se pretende silenciar, ou a seqüência completa, porém com pelo menos uma mutação da seqüência de nucleotídeos, ou a seqüência com inserções ou supressões, de modo que em qualquer caso, reduza ou bloqueie a expressão do gene precursor de pelo menos um d- limoneno sintase endógeno nas células transformadas geneticamente.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a redução da atividade da d-limoneno sintase e a queda na acumulação e libertação de d-limoneno levam à modificação drástica do perfil do conteúdo e das emissões de terpenos voláteis em frutos, folhas, flores e todos os tecidos vegetais, como os monoterpenos, sesquiterpenos e outros derivados dos precursores geranil difosfato, farnesil difosfato ou geranilgeranil difosfato, de maneira que são sintetizadas novas combinações de aromas e óleos essenciais com novas propriedades industrial, farmacêutico e médicas.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os transgenes de interesses são clonados sob o controle de um promotor forte e constitutivo, para reduzir os níveis de d-limoneno sintase em todas as células das plantas transformadas.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os transgenes de interesse são clonados sob o controle do seu próprio promotor e terminador ou sob o controle de regiões promotoras e terminadoras específicas do tecido ou induzíveis, com o objetivo de reduzir os níveis de acumulação do monoterpeno d-limoneno e alterá-los de outros compostos voláteis.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os transgenes de interesse são incorporados em plantas do gênero Citrus ou de Rutaceae afins, através da transformação genética de células ou tecidos e regeneração de plantas inteiras via organogênese ou através de embriogênese somática.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a redução dos níveis de terpenos serve como meio para aumentar a expressão de genes relacionados com a produção de voláteis relacionados com a atração de diferentes de predadores das principais pragas de cítrus e Rutaceae.