ES2608480T3 - Composiciones repelentes y enfoques genéticos para controlar la Huanglongbing - Google Patents

Abstract

Procedimiento para el controlar la Huanglongbing (HLB) en plantas de cítricos que comprende expresar por lo menos un gen aislado que codifica un polipéptido que presenta actividad de ß-cariofileno sintasa y/o de α-copaeno sintasa en plantas de cítricos para producir ß-cariofileno, α-copaeno adicionales o combinaciones de los mismos con el fin de repeler los insectos psílidos Diaphorina citri y/o Tryoza erytrae para controlar la HLB.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones repelentes y enfoques geneticos para controlar la Huanglongbing.

Campo de la invencion

La invencion se refiere a composiciones repelentes que comprenden sesquiterpenos para controlar la Huanglongbing (HLB) en plantas de cftricos. Asimismo, se dan a conocer procedimientos para controlar la HLB mediante la modificacion genetica de plantas de cftricos.

Antecedentes de la invencion

La Huanglongbing (HLB), tambien conocida como degeneracion de las venas del floema de los cftricos (DVFC), enfermedad de verdecimiento de los cftricos, enfermedad del brote amarillo (traducido del chino "huang-lunpin"), "likubin" en Taiwan (traducido del chino como enfermedad del marchitamiento inmediato), enfermedad del moteado amarillo foliar en las Filipinas y mortalidad de los cftricos en la India, es probablemente la peor enfermedad de las plantas de cftricos causada por un patogeno vectorizado. El agente causal es una bacteria motil, Candidatus liberibacter spp., que es transmitida por el psflido asiatico de los cftricos (Sternorrhyncha. Psyllidae), tambien conocido como Diaphorina citri o, en Africa, como Trioza eritreae, el psflico africano de los cftricos.

La distribucion de la HLB es principalmente del Asia tropical y subtropical. Se ha informado en todas las regiones productoras de cftricos de Asia. La enfermedad ha afectado a cultivos en China, Taiwan, India, Sri Lanka, Malasia, Indonesia, Myanmar, las Filipinas, Pakistan, Tailandia, las islas Ryukyu, Nepal, Reunion, islas Mauricio y Afganistan.

Algunas areas fuera de Asia, tales como Arabia saudita, Brasil y Florida en los Estados Unidos tambien han informado de la presencia de la enfermedad.

Aunque las composiciones insecticidas y repelentes actuales pueden resultar utiles para controlar la HLB, se ha cuestionado la seguridad de estas composiciones, ya que muchas de ellas resultan excesivamente toxicas para otros organismos en el ecosistema. Ademas, muchas de estas composiciones presentan una vida extraordinariamente larga y persisten en el medio ambiente en el que se aplican practicamente de manera indefinida. Ademas, muchas especies de insectos han desarrollado resistencia a muchas de las composiciones insecticidas y repelentes conocidas. De esta manera, existe una necesidad de una composicion repelente eficaz de vida corta y relativamente no toxica, tal como una composicion repelente biologica.

Se conoce desde hace mucho tiempo en Vietnam que la guayaba cultivada en proximidad o asociada con cftricos presenta un efecto protector o repelente del psflido asiatico de los cftricos. Las guayabas son plantas de la familia del mirto (Myrtaceae), genero Psidium, que contiene aproximadamente 100 especies de arbustos y arboles pequenos tropicales. La especie mas frecuente y la denominada con frecuencia simplemente como "la guayaba" es la guayaba manzana (Psidium guajava).

El efecto protector del cultivo asociado de guayaba y cftricos probablemente se debe a los compuestos volatiles producidos por las hojas de la guayaba debido a que el efecto protector se encuentre presente durante todo el ano. Aunque se han identificado cincuenta y siete componentes, incluyendo 27 terpenos (o sesquiterpenos) conjuntamente con 14 alcoholes y 4 esteres en la CG-EM del aceite de la hoja de guayaba obtenido mediante una hidrodestilacion de las hojas de la guayaba, no se conoce cual es el mecanismo exacto que subyace al efecto protector de la guayaba. Una publicacion reciente (Rouseff et al., Sulfur Volatiles in Guava (Psidium guajava L.) Leaves. Possible Defense Mechanism, J. Agric. Food Chem. 56.8905-10, 2008) sugiere que algunos compuestos volatiles del azufre, tales como el disulfuro de dimetilo, son responsables del efecto repelente de la guayaba y no los compuestos volatiles principales, tales como el p-cariofileno, ya que este ultimo tambien se encuentra presente en los cftricos. Sin embargo, los compuestos volatiles del azufre contenidos en las hojas de la guayaba se emiten a niveles minusculos y solo durante un periodo de aproximadamente 30 minutos despues de la lesion, indicando que estos compuestos estan apenas relacionados o nada relacionados con lo observado en el cultivo asociado de cftricos-guayaba en Vietnam. Por otra parte, el p-cariofileno se encuentra presente en hojas de cftricos no danadas a concentraciones generalmente inferiores a 0,2% del total de compuestos volatiles, mientras que representa habitualmente mas de 50% de los compuestos volatiles totales emitidas por las hojas de guayaba.

Sigue existiendo una necesidad de control de la HLB en las plantas de cftricos y la presente invencion proporciona una nueva solucion a este problema.

Sumario de la invencion

Se ha encontrado que algunos sesquiterpenos tales como el p-cariofileno y el a-copaeno producidos por las hojas de la guayaba repelen los insectos psflidos Diaphorina citri y/o Tryoza erytrae. De esta manera, la invencion satisface una necesidad de la industria de control de la HLB en las plantas de cftricos mediante la provision de una composicion repelente biologica que comprende sesquiterpenos. Tambien se proporcionan procedimientos para

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controlar la HLB mediante modificacion genetica de las plantas de cftricos para que sobreexpresen los genes codificantes de sesquiterpeno sintasas.

De esta manera, la invencion se refiere en general a un procedimiento para controlar la HLB en las plantas de cftricos, que comprende expresar por lo menos un gen codificante de un polipeptido que presenta actividad de sesquiterpeno sintasa en las plantas de cftricos para producir sesquiterpenos adicionales con el fin de repeler los insectos psflidos Diaphorina citri y/o Tryoza erytrae, de manera que se controle la HLB, en el que el sesquiterpeno acumulado en exceso es el p-cariofileno, el a-copaeno o las combinaciones de los mismos. En dicho procedimiento, el gen o genes presentan actividad de p-cariofileno sintasa y/o de a-copaeno sintasa.

En determinadas formas de realizacion, la expresion de por lo menos un gen esta controlada por sus propias regiones promotoras y terminadoras. En otras formas de realizacion preferidas, la expresion de por lo menos un gen esta controlada por una region reguladora heterologa que proporciona una expresion constitutiva, especffica de tejido o inducible fuerte. Mas preferentemente, la region reguladora heterologa proporciona una expresion especffica de tejido fuerte en el citosol, cloroplastos o mitocondrias.

En formas de realizacion adicionales, el presente procedimiento comprende ademas la expresion de un gen codificante de farnesil pirofosfatasa sintasa para incrementar la acumulacion del sesquiterpeno producido por el polipeptido que presenta actividad de sesquiterpeno sintasa.

La invencion se refiere ademas un procedimiento para controlar la enfermedad Huanglongbing (HLB) de las plantas de cftricos, que comprende aplicar por lo menos un sesquiterpeno purificado, que repele los insectos psflidos Diaphorina citri y/o Tryoza erytrae, de manera que se controla la enfermedad HLB de las plantas de cftricos, en el que por lo menos un sesquiterpeno se selecciona de entre el grupo que consiste de p-cariofileno y a-copaeno, o combinaciones de los mismos. En dicho procedimiento, el sesquiterpeno o sesquiterpenos purificados se purifican a partir de un organismo seleccionado de entre el grupo que consiste de plantas, bacterias y levaduras. En una forma de realizacion preferida, el sesquiterpeno o sesquiterpenos purificados se purifican a partir de la planta de la guayaba, preferentemente de los extractos de hojas de la planta de la guayaba.

En algunas formas de realizacion preferidas, el sesquiterpeno o sesquiterpenos se aplican a las plantas de los cftricos mediante sistemas de administracion lenta, tales como los ya utilizados por entomologos para administrar feromonas.

Breve descripcion de las figuras

las figuras 1A y 1B representan las secuencias de nucleotidos de SEC ID n° 1 y n° 3, y las secuencias de protefna de SEC ID n° 2 y n° 4.

la figura 2 representa los terpenos volatiles emitidos (cromatograma superior) y extrafdos (cromatograma inferior) de las hojas de la guayaba.

la figura 3 representa la separacion representativa mediante cromatograffa de gases de los compuestos volatiles emitidos a partir de hojas de los diferentes genotipos de cftricos.

la figura 4 representa la separacion representante mediante cromatograffa de gases de los compuestos volatiles emitidas a partir de hojas de la guayaba en diferentes estadios de desarrollo: A, brote; B, plantula; C, madura; D, senescente.

la figura 5A representa la cromatograffa representativa de iones totales de productos sesquiterpeno de SEC ID n° 2. Los ensayos se llevaron a cabo con extractos de protefna en bruto de la expresion in vitro con farnesil difosfato como sustrato. El pico 2 corresponde a un estandar interno. La figura 5B representa la comparacion entre el patron de fragmentacion de TIC del pico 1 corregido para el fondo y los espectros del p-cariofileno obtenidos de bibliotecas.

la figura 6 representa el porcentaje representativo y numero de seleccionados de Diaphorina citri respecto a los compuestos volatiles de cftricos ± olor de guayaba (A) y de compuestos volatiles de guayaba frente a aire limpio (B) en olfatometros de dos y cuatro brazos, respectivamente.

la figura 7 representa alineaciones de las secuencias de aminoacidos de la beta-cariofileno sintasa QHS1 de Artemisia annua (n° de acceso AAL79181), de la beta-cariofileno sintasa de Mikania micrantha (n° de acceso ACN67535), de la beta-cariofileno sintasa de Cucumis sativus (n° de acceso AAU05952), de la beta- cariofileno/alfa-humuleno sintasa de Arabidopsis thaliana (n° de acceso AAO85539), de la (E)-beta-cariofileno sintasa de Zea mays (n° de acceso ABY79206) y de la (E)-beta-cariofileno/beta-elemeno sintasa de Oryza sativa (n° de acceso ABJ16553). Se subraya en negro y en gris los residuos identicos y similares, respectivamente, en dichas secuencias.

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las figuras 8A y 8B representan alineaciones de las secuencias de aminoacidos de la beta-cariofileno sintasa QHS1 de Artemisia annua (n° de acceso AAL79181), de la beta-cariofileno sintasa de Mikania micrantha (n° de acceso ACN67535), de la beta-cariofileno sintasa de Cucumis sativus (n° de acceso AAU05952) y de la beta- cariofileno/alfa-humuleno sintasa de Arabidopsis thaliana (n° de acceso AAO85539) (A) y alineaciones de las secuencias de aminoacidos de la (E)-beta-cariofileno sintasa de Zea mays (n° de acceso ABY79206) y de la (E)- beta-cariofileno/beta-elemeno sintasa de Oryza sativa (n° de acceso ABJ16553) (B). Se subrayan en negro y en gris se encuentran los residuos identicos y similares, respectivamente, en dichas secuencias.

la figura 9 representa alineaciones de las secuencias de aminoacidos de la beta-cariofileno sintasa QHS1 de Artemisia annua (n° de acceso AAL79181), de la beta-cariofileno sintasa de Mikania micrantha (n° de acceso ACN67535), de la beta-cariofileno sintasa de Cucumis sativus (n° de acceso AAU05952), de la (E)-beta- farneseno sintasa de Citrus junos (n° de acceso AAK54279), de la terpeno sintasa de Citrus janos (n° de acceso AAG01339), de la terpeno sintasa putativa de Citrus x paradisi (n° de acceso AAM00426) y de la beta- cariofileno/alfa-humuleno sintasa de Arabidopsis thaliana (n° de acceso AAO85539). Se subrayan en negro y en gris los residuos identicos y similares, respectivamente, en dichas secuencias. Los cebadores disenados para amplificar los genes de la beta-cariofileno sintasa se encuentran subrayados.

la figura 10 representa la secuencia de ADN parcial correspondiente a la sesquiterpeno sintasa de cftrico (SEC ID n° 3) y cebadores disenos para la amplificacion rapida de los extremos 5' y 3' de la misma mediante metodologfa RACE.

la figura 11 representa alineaciones de las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de la farnesil pirofosfato sintasa 1 (FPPS1) de Arabidopsis thaliana (n° de acceso X75789). Se subrayan las secuencias utilizadas para disenar cebadores para la amplificacion de un ADNc de longitud completa codificante de un gen de FPP sintasa funcional.

Descripcion detallada de la invencion

La invencion se refiere a procedimientos para controlar la HLB basados en la observacion de que los sesquiterpenos producidos por las hojas de guayaba repelen los vectores de HLB, los insectos psflidos de Diaphorina citri y/o Tryoza erytrae.

Un terpeno es un hidrocarburo insaturado basado en una unidad isopreno (CsHa), que puede ser acfclico o cfclico. Un sesquiterpeno es un terpeno basado en una estructura C15.

La guayaba, al igual que otras plantas aromaticas o plantas de aceites esenciales, acumula grandes cantidades de sesquiterpenos en sus hojas. Tfpicamente los sesquiterpenos tales como el p-cariofileno y el a-copaeno representan 50% a 60% de la cantidad total de compuestos volatiles emitidos por las hojas de la guayaba. En las plantas de la guayaba, los sesquiterpenos con frecuencia se sintetizan y se acumulan en estructuras anatomicas especializadas, glandulas tricomas o cavidades secretorias, localizadas sobre las hojas y la superficie de los tallos. Los sesquiterpenos acumulados en las plantas pueden extraerse mediante diferentes medios, tales como la destilacion al vapor que produce el denominado aceite esencial, que contiene los sesquiterpenos concentrados.

En determinadas formas de realizacion de la invencion, como procedimiento para controlar la HLB, se aplica por lo menos un sesquiterpeno extrafdo de las plantas de la guayaba, preferentemente p-cariofileno, en las plantas de cftricos mediante pulverizacion o sistemas de administracion lenta. Los sistemas de administracion lenta ya han sido utilizados por los entomologos para administrar feromonas. En dichos sistemas, se aplica p-cariofileno puro en una resina de PVC que conserva y libera el compuesto qufmico. Esta resina se aplica directamente en los arboles de cftricos en los huertos. Presenta la propiedad de liberar el compuesto durante un periodo de 3 a 4 meses.

El precio y disponibilidad de los extractos naturales de plantas dependen de su abundancia, rendimiento de aceite y origen geografico de las plantas. Debido a la complejidad de su estructura, la produccion de las moleculas individuales de sesquiterpeno mediante sfntesis qufmica con frecuencia esta limitada por el coste del procedimiento y puede no ser en todos los casos qufmica o economicamente viable. Por lo tanto, resultana de gran interes una via bioqufmica para la produccion de moleculas de sesquiterpeno. La construccion de una via bioqufmica para la produccion de moleculas de sesquiterpeno requiere una clara comprension de la biosfntesis de los sesquiterpenos y del aislamiento de los genes codificantes de enzimas que participan en etapas biosinteticas especfficas.

La biosfntesis de los sesquiterpenos en las plantas ha sido estudiada extensivamente. El precursor de cinco carbonos comun a todos los terpenos es el isopentenil pirofosfato (IPP). La mayorfa de los enzimas que catalizan las etapas que conducen al IPP han sido clonados y caracterizados. En las plantas coexisten dos rutas diferentes para la biosfntesis de IPP. La ruta del mevalonato se localiza en el citosol y retfculo endoplasmatico y la ruta no mevalonato (o ruta del desoxixilulosa 5-fosfato (DXP)) se localiza en los plastidios. En la etapa siguiente, se condensa repetitivamente el IPP con prenil transferasas para formar los precursores prenil pirofosfato terpeno acfclicos para los sesquiterpenos, el farnesil-pirofosfato (FPP). Estos precursores sirven de sustrato para las sesquiterpeno sintasas, que catalizan complejas ciclizaciones en multiples etapas. De esta manera, la primera etapa

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realizada en la biosfntesis del p-cariofileno es la ciclizacion del precursor universal de sesquiterpeno FPP por una sesquiterpeno sintasa. Se ha clonado un grupo de genes codificantes de p-cariofileno sintasas a partir de plantas. Estas sintasas habitualmente participan en la produccion de diferentes sesquiterpenos. Por ejemplo, una unica protefna codificada por un gen de p-cariofileno sintasa de Arabidopsis es capaz de convertir FPP en los productos sesquiterpeno (-)-a-copaeno, a-humuleno y (-)-(E)-p-cariofileno (Chen et al., Biosynthesis and emission of terpenoid volatiles from Arabidopsis flowers, Plant Cell 15:481-494, 2003; Tholl et al., Two sesquiterpene synthases are responsible for the complex mixture of sesquiterpenes emitted from Arabidopsis flowers, The Plant J. 42:757-771, 2005). Una p-cariofileno sintasa del mafz produce 6-elemeno, a-humuleno y (-)-(E)-p-cariofileno (Kollner et al., A maize (E)-p-caryophyllene synthase implicated in indirect defense responses against herbivores is not expressed in most American maize varieties, The Plant Cell 20:482-494, 2008). Las p-cariofileno sintasas tambien han sido aisladas a partir de Artemisia annua (Cai et al., A cDNA clone for p-caryophyllene synthase from Artemisia annua, Phytochem. 61:523-529, 2002), pepino (Mercke et al., Combined transcript and metabolite analysis reveals genes involved in spider mite induced volatile formation in cucumber plants, Plant Phys. 135:2012-2024), arroz (Cheng et al., The rice (E)-p-caryophyllene synthase (OsTPS3) accounts for the major inducible volatile sesquiterpenes, Phytochem. 68:1632-1641, 2007) y oregano (Degenhardt et al., Restoring a maize root signal that attracts insectkilling nematodes to control a major pest, PNAS 106:13213-218, 2009).

Los genes quimericos codificantes de sesquiterpeno sintasas han sido utilizados para transformar geneticamente plantas con el objetivo de atraer/repeler polinizadores (Kessler et al., Field experiments with transformed plants reveal the sense of floral scents, Science 321:1200-1202, 2008), de atraer insectos que eliminan plagas (Kappers et al., Genetic engineering of terpenoid metabolism attracts bodyguards to Arabidopsis, Science 309:2070-2072, 2005); Schnee et al., The productos of a single maize sesquiterpene synthase form a volatile defense signal that attracts natural enemies of maize herbivores, PNAS 103:1129-1134, 2006) y nematodos (Degenhardt et al., Restoring a maize root signal that attracts insect-killing nematodes to control a major pest, PNAS 106:13213-218, 2009) y directamente a la eliminacion de plagas de insectos (Wu et al., Redirection of cytosolic or plastidic isoprenoid precursors elevates terpene production in plants, Nature Biotechnology 24:1441-1447, 2006), indicando que las estrategias transgenicas dirigidas a incrementar la acumulacion de dichos sesquiterpenos, incluyendo el p- cariofileno, podrfan ser una alternativa ecologicamente segura, que sola o en combinacion con un menor uso de pesticidas, podrfa evitar los danos causados por enfermedades devastadoras transmitidas por plagas.

Una forma de realizacion de la presente invencion se refiere al aislamiento de acidos nucleicos codificantes de sesquiterpeno sintasas de plantas de cftricos, plantas relacionadas con cftricos pertenecientes a la familia de las rutaceas, la guayaba, las plantas relacionadas con la guayaba de la familia de las mirtaceas, o cualquier otro organismo vivo. Tal como se utiliza en la presente memoria, una sesquiterpeno sintasa es cualquier enzima que cataliza la sfntesis de un sesquiterpeno. Puede determinarse si un polipeptido codificado por un acido nucleico de la invencion presenta actividad de sesquiterpeno sintasa mediante el ensayo de caracterizacion enzimatica indicado en los ejemplos en la presente memoria.

En una forma de realizacion del acido nucleico de la invencion, el acido nucleico se selecciona de entre (a) un acido nucleico que comprende la secuencia de nucleotido sustancialmente indicada en SEC ID n° 1, o (b) un acido nucleico codificante del polipeptido sustancialmente indicado en SEC ID n° 2, en el que el polipeptido codificado por dicho acido nucleico presenta actividad de sesquiterpeno sintasa.

En otra forma de realizacion del acido nucleico de la invencion, el acido nucleico se selecciona de entre: (a) un acido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos sustancialmente indicada en SEC ID n° 3, o (b) un acido nucleico codificante del polipeptido sustancialmente indicado en SEC ID n° 4, en el que el polipeptido codificado por dicho acido nucleico presenta actividad de sesquiterpeno sintasa.

Preferentemente, el acido nucleico y/o polipeptido de la invencion se afsla a partir de plantas de cftricos. En una forma de realizacion, el acido nucleico se afsla a partir de plantas de la guayaba.

Preferentemente, el acido nucleico segun la invencion comprende la SEC ID n° 1.

En una forma de realizacion particular, la invencion se refiere a determinadas secuencias de nucleotidos aisladas, incluyendo aquellas que estan sustancialmente libres de material endogeno contaminante. Las expresiones "acido nucleico" o "molecula de acidos nucleicos" se refieren a un polfmero desoxirribonucleotido o ribonucleotido en forma de cadena sencilla o de doble cadena, y a menos que se encuentre limitado de otra manera, comprenderfa analogos conocidos de nucleotidos naturales que pueden funcionar de una manera similar a los nucleotidos naturales. Una "secuencia de nucleotidos" tambien se refiere a una molecula polinucleotida o una molecula oligonucleotida en forma de un fragmento separado o como componente de un acido nucleico de mayor tamano. Algunas de las moleculas de acidos nucleicos de la invencion se derivan de ADN o ARN aislado por lo menos una vez en forma sustancialmente pura y en una cantidad o concentracion que permite la identificacion, manipulacion y recuperacion de su secuencia de nucleotidos componente mediante procedimientos bioqufmicos estandares. Se dan a conocer ejemplos de dichos procedimientos, incluyendo procedimientos para protocolos de PCR que pueden utilizarse en la presente memoria, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring

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Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, editado por F.A. Ausubel et al., John Wiley and Sons, Inc., 1987, e Innis M. et al., editores, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, 1990.

Tal como se indica en la presente memoria, entre las moleculas de acidos nucleicos de la invencion se incluye ADN en forma tanto de cadena sencilla como de doble cadena, asf como el complemento de ARN del mismo. El ADN incluye, por ejemplo, ADNc, ADN genomico, ADN sintetizado qufmicamente, ADN amplificado por PCR, y combinaciones de los mismos. El ADN genomico, incluyendo las regiones traducidas, no traducidas y de control, pueden aislarse mediante tecnicas convencionales, por ejemplo utilizando cualquiera de los ADNc de la invencion, o fragmentos adecuados de los mismos, como sonda, para identificar un segmento de ADN genomico que seguidamente puede clonarse utilizando procedimientos comunmente conocidos de la tecnica. En general, entre las moleculas de acidos nucleicos comprendidas dentro del alcance de la invencion se incluyen secuencias que se hibridan con secuencias de la invencion a temperaturas de 5°C, 10°C, 15°C, 20°C, 25°C o 30°C inferiores a la temperatura de fusion del duplex de secuencias de ADN de la invencion, incluyendo cualquier intervalo de condiciones incluido dentro de dichos intervalos.

En otra forma de realizacion, los acidos nucleicos de la invencion comprenden una secuencia sustancialmente tal como se indica en SEC ID n° 1 o SEC ID n° 3. En una forma de realizacion, los acidos nucleicos son por lo menos 70%, por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% identicos a las secuencias de nucleotidos SEC ID n° 1 o SEC ID n° 3, y cada acido nucleico codifica una protefna que presenta actividad de sesquiterpeno sintasa, tal como se demuestra en, por ejemplo, el ensayo enzimatico indicado en los ejemplos, con una estabilidad y eficacia incrementadas en comparacion con la del polipeptido codificado por SEC ID n° 1 o SEC ID n° 3. En una forma de realizacion, el acido nucleico comprende la secuencia de nucleotidos SEC ID n° 1. En otra forma de realizacion, el acido nucleico comprende la secuencia de nucleotidos SEC ID n° 3.

En todavfa otra forma de realizacion, el acido nucleico comprende un tramo contiguo de por lo menos 50, 100, 250, 500 o 750 nucleotidos contiguos de SEC ID n° 1 o SEC ID n° 3. Dichos fragmentos contiguos de dichos nucleotidos tambien pueden contener por lo menos una mutacion con la condicion de que la secuencia mutante conserve la funcionalidad de la secuencia original y la capacidad de hibridarse con dichos nucleotidos bajo condiciones de baja o alta astringencia, tal como, por ejemplo, condiciones de astringencia moderada o alta. Dicho fragmento puede derivarse, por ejemplo, de los nucleotidos (nt) 200 a nt 1.700, de nt 800 a nt 1.700, de nt. 1.000 a nt. 1.700, de nt. 200 a nt. 1.000, de nt 200 a nt 800, de nt 400 a nt 1.600, o de nt 400 a nt 1.000 de la SEC ID n° 1 o de la SEC ID n° 3.

Tal como se ha indicado anteriormente, los polipeptidos codificados por los acidos nucleicos de la invencion se encuentran comprendidos en la invencion. Los acidos nucleicos aislados de la invencion pueden seleccionarse de entre un acido nucleico codificante del polipeptido indicado sustancialmente en SEC ID n° 2 o SEC ID n° 4. En una forma de realizacion, los polipeptidos son por lo menos 70%, por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% identicos a SEC ID n° 2 o SEC ID n° 4, y los polipeptidos presentan actividad de sesquiterpeno sintasa, tal como se demuestra, por ejemplo, en el ensayo enzimatico indicado posteriormente.

Debido a la degeneracion del codigo genetico, en el que mas de un codon puede codificar el mismo aminoacido, multiples secuencias de ADN pueden codificar el mismo polipeptido. Dichas secuencias de ADN variantes pueden resultar de la deriva genetica o de la manipulacion artificial (por ejemplo la que se produce durante la amplificacion por PCR o como producto de la mutagenesis deliberada de una secuencia nativa). De esta manera, la presente invencion comprende cualquier acido nucleico derivado de la SEC ID n° 1 o SEC ID n° 3 capaz de codificar un polipeptido sustancialmente indicado en la SEC ID n° 2 o SEC ID n° 4.

La mutagenesis deliberada de una secuencia nativa puede llevarse a cabo utilizando numerosas tecnicas bien conocidas. Por ejemplo, pueden utilizarse los procedimientos de mutagenesis especffica de sitio dirigida por oligonucleotido, en particular en el caso de que se desee mutar un gen de manera que nucleotidos o codones de restriccion predeterminados resulten alterados mediante sustitucion, delecion o insercion. Se dan a conocer procedimientos ejemplares de realizacion de dichas alteraciones en Walder et al. (Gene 42:133, 1986), Bauer et al., (Gene 37:73, 1985), Craik (BioTechniques, Jan. 12-19, 1985), Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981), Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985), Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987), y patentes US n° 4.518.584 y n° 4.737.462.

En una forma de realizacion, la invencion proporciona polipeptidos aislados. Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "polipeptidos" se refiere a un genero de polipeptido o fragmentos peptfdicos que comprende las secuencias de aminoacidos identificadas en la presente memoria, asf como fragmentos de menor tamano. Alternativamente, puede definirse un polipeptido en terminos de su grado de relacion antigenica con cualquier peptido codificado por las secuencias de acidos nucleicos de la invencion. De esta manera, en una forma de realizacion, un polipeptido dentro del alcance de la invencion se define como una secuencia de aminoacidos que comprende un epftopo lineal o tridimensional compartido por cualquier peptido codificado por las secuencias de acidos nucleicos de la invencion. Alternativamente, un polipeptido dentro del alcance de la invencion resulta reconocido por un anticuerpo que reconoce especfficamente cualquier peptido codificado por las secuencias de acidos nucleicos de la invencion. Se define que los anticuerpos que se unen especfficamente en el caso de que se

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unan a polipeptidos de la invencion con una Ka superior o igual a aproximadamente 107 M-1, tal como superior o igual a 108 M-1.

Una "variante" de polipeptido tal como se indica en la presente memoria se refiere a un polipeptido sustancialmente homologo a un polipeptido nativo, pero que presenta una secuencia de aminoacidos diferente de la codificada por cualquiera de las secuencias de acidos nucleicos de la invencion debido a una o mas deleciones, inserciones o sustituciones.

Las variantes pueden comprender secuencias sustituidas conservadoramente, es decir se sustituye un residuo aminoacido dado por un residuo que presenta caracterfsticas ffsicoqufmicas similares. Entre los ejemplos de sustituciones conservadoras se incluyen la sustitucion de un residuo alifatico por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala por otro, o sustituciones de un residuo polar por otro, tal como entre Lys y Arg, Glu y Asp, o Gln y Asn. Ver Zubay, Biochemistry, Addison-Wesley Pub. Co., 1983. Los efectos de dichas sustituciones pueden calcularse utilizando matrices de puntuaciones de sustituciones, tales como PAM-120, PAM-200 y PAM-250, tal como se comenta en Altschul (J. Mol. Biol. 219:555-65, 1991). Otras sustituciones conservadoras similares, por ejemplo sustituciones de regiones enteras que presentan caracterfsticas de hidrofobicidad similares, son bien conocidas.

Las variantes de peptido naturales tambien se encuentran comprendidas en la invencion. Son ejemplos de dichas variantes, protefnas que resultan de sucesos de procesamiento alternativo del ARNm o del corte proteolftico de los polipeptidos indicados en la presente memoria. Entre las variaciones atribuibles a la proteolisis se incluyen, por ejemplo, diferencias en los extremos N-terminal o C-terminal con la expresion en diferentes tipos de celula huesped debido a la eliminacion proteolftica de uno o mas aminoacidos terminales de los polipeptidos codificados por las secuencias de la invencion.

Las variantes de las sesquiterpeno sintasas de la invencion pueden utilizarse para conseguir la actividad enzimatica incrementada o reducida, regioqufmica o estereoqufmica modificada, o alteraciones de la utilizacion de sustratos o de la distribucion de producto que se desea. Ademas, pueden prepararse variantes que presenten por lo menos una propiedad modificada, por ejemplo una afinidad incrementada para el sustrato, una especificidad mejorada para la produccion de uno o mas compuestos deseados, una distribucion de producto diferente, una actividad enzimatica diferente, un incremento de la velocidad de la reaccion enzimatica, una actividad o estabilidad mas elevada en un medio especffico (pH, temperatura, solvente, etc.) o un nivel de expresion mejorado en un sistema de expresion deseado. Puede prepararse una variante o mutante dirigido a sitio mediante cualquier procedimiento conocido de la tecnica. Tal como se ha indicado anteriormente, la invencion proporciona polipeptidos aislados y purificados recombinantes y no recombinantes, tales como de la guayaba o de plantas de cftricos. Pueden obtenerse variantes y derivados de polipeptidos nativos mediante el aislamiento de variantes naturales, o la secuencia de nucleotidos de variantes, de otras o las mismas lfneas o especies de planta, o mediante la programacion artificial de mutaciones de secuencias de nucleotidos codificantes de polipeptidos nativos de guayaba o de cftrico. Pueden llevarse a cabo alteraciones de la secuencia de aminoacidos nativa mediante cualquiera de entre varios procedimientos convencionales.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invencion proporciona un procedimiento para preparar una sesquiterpeno sintasa funcional variante, comprendiendo el procedimiento las etapas de (a) seleccionar cualquiera de los acidos nucleicos de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 1 o n° 3, (b) alterar la secuencia de acidos nucleicos para obtener una poblacion de acidos nucleicos mutantes, y (c) transformar las celulas huesped con el acido nucleico mutante para expresar polipeptidos, y (d) cribar los polipeptidos para un polipeptido funcional que presenta por lo menos una propiedad modificada. La propiedad modificada puede ser cualquier propiedad deseada, por ejemplo las propiedades indicadas anteriormente. La alteracion del acido nucleico seleccionada puede llevarse a cabo mediante mutagenesis aleatoria, mutagenesis especffica de sitio o reorganizacion del ADN, por ejemplo, La alteracion puede ser por lo menos una mutacion puntual, delecion o insercion. Por ejemplo, los polipeptidos que presentan una secuencia de aminoacidos codificada por un acido nucleico obtenido mediante tecnicas de reorganizacion que implican por lo menos cualquiera de las SEC ID n° 1 o n° 3, tambien se encuentran comprendidas en la presente invencion. Las etapas del procedimiento segun la presente forma de realizacion de la invencion, tales como el cribado de los polipeptidos para un polipeptido funcional, son conocidas por el experto en la materia, quien adaptara rutinariamente los protocolos conocidos a la propiedad modificada especffica que se desea.

Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones en loci particulares mediante la sfntesis de oligonucleotidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restriccion que permiten la ligacion a fragmentos de la secuencia nativa. Tras la ligacion, la secuencia reconstruida resultante codifica un analogo que presenta la insercion, sustitucion o delecion de aminoacido deseada. Alternativamente, pueden utilizarse procedimientos de mutagenesis especffica de sitio dirigida por oligonucleotido con el fin de proporcionar un gen alterado en el que pueden alterarse codones predeterminados mediante sustitucion, delecion o insercion. La presente invencion comprende ademas acidos nucleicos obtenidos a partir de la alteracion de un acido nucleico de la presente invencion, por ejemplo con el fin de obtener un polipeptido variante.

Existen varios procedimientos conocidos de la tecnica para la creacion de plantas transgenicas. Entre ellas se incluyen, aunque sin limitacion, la electroporacion de protoplastos vegetales, la transformacion mediada por

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liposomas, la transformacion mediada por Agrobacterium, la transformacion mediada por polietilenglicol, la microinyeccion de celulas vegetales y la transformacion utilizando virus. En una forma de realizacion, se utiliza la transferencia genica directa mediante bombardeo de partfculas. En otra forma de realizacion se utiliza la transformacion mediada por Agrobacterium.

La transformacion mediada por Agrobacterium tumefaciens es el procedimiento mas comun utilizado para transformar plantas de cftricos. Utiliza una cepa A. tumefaciens atenuada que porta el gen o genes de interes en su genoma como vector para transformar celulas o tejidos de cftricos mediante el cocultivo durante unos cuantos dfas.

La transformacion genetica es utilizada de manera natural por las especies de Agrobacterium como sistema para insertar fragmentos de su propio ADN en las celulas vegetales infectadas. La expresion de los genes transferidos por las bacterias a las celulas vegetales lleva a la induccion de tumores de agallas de corona en plantas habitualmente en los sitios de lesiones. En A. tumefaciens, el ADN transferido se denomina ADN-T y reside en un megaplasmido denominado plasmido Ti (por sus siglas en ingles, inductor de tumor).

Los plasmidos Ti desarmados pueden manipularse mediante eliminacion de los genes de ADN-T que participan en la formacion de tumor. A continuacion, pueden insertarse genes heterologos con las regiones reguladoras apropiadas en una nueva region de ADN-T quimerica que una vez incorporada en las celulas de Agrobacterium que portan un plasmido Ti desarmado pueden utilizarse para integrar y expresar los genes foraneos en las celulas vegetales. A partir de las celulas vegetales transformadas resulta posible regenerar plantas transgenicas completas mediante la utilizacion de sistemas de cultivo de tejido estandares.

La transferencia genica directa mediante bombardeo de partfculas proporciona otro ejemplo de transformacion de tejido vegetal. En esta tecnica, se dispara una partfcula, o microproyectil, recubierto con ADN, a traves de las barreras ffsicas de la celula. Puede utilizarse el bombardeo de partfculas para introducir ADN en cualquier tejido diana que resulte penetrable por partfculas recubiertas con ADN, aunque para la transformacion estable es imperativo utilizar celulas regenerables. Tfpicamente las partfculas estan realizadas en oro o tungsteno. Las partfculas se recubren con ADN utilizando procedimientos de precipitacion con CaCl2 o etanol que son comunmente conocidos de la tecnica.

Se disparan partfculas recubiertas con ADN con una pistola de partfculas. Puede obtenerse una pistola de partfculas adecuada de Bio-Rad Laboratories (Hercules, Calif.). Se controla la penetracion de las partfculas modificando parametros tales como la intensidad del estallido explosivo, el tamano de las partfculas o la distancia que deben salvar las partfculas para alcanzar el tejido diana.

El ADN utilizado para el recubrimiento de las partfculas puede comprender un casete de expresion adecuado para controlar la expresion del gen de interes que comprendera un promotor operablemente ligado al gen de interes.

Los procedimientos para llevar a cabo la transferencia genica directa mediante bombardeo de partfculas se dan a conocer en la patente US n° 5.990.387 de Tomes et al. En una forma de realizacion, el ADN transfectado se integra en un cromosoma de un organismo no humano de manera que resulta un sistema recombinante estable. Puede utilizarse cualquier procedimiento de integracion cromosomica conocido de la tecnica en la practica de la invencion, incluyendo, aunque sin limitacion, el intercambio de casetes mediado por recombinasa (ICMR), la insercion cromosomica especffica de sitio vfrico, adenovirus y la inyeccion pronuclear.

Ademas de en el ejemplo operativo, o cuando se indique de otro modo, todos los numeros que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reaccion, etc. utilizados en la memoria y reivindicaciones deben entenderse como modificados en todos los casos por el termino "aproximadamente". De acuerdo con lo expuesto anteriormente, a menos que se indique lo contrario, los parametros numericos indicados en la memoria y reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que busca obtener la presente invencion. Como mfnimo absoluto, y no como intento de limitar la aplicacion de la doctrina de equivalentes al alcance segun las reivindicaciones, cada parametro numerico debe interpretarse a la luz del numero de dfgitos significativos y enfoques ordinarios de aproximacion.

Con independencia de que los intervalos y parametros numericos que indican el amplio alcance de la invencion son aproximaciones, los valores numericos indicados en los ejemplos especfficos se informan con la maxima precision posible. Sin embargo, cualquier valor numerico contiene inherentemente determinados errores que resultan necesariamente de la desviacion estandar observada en sus mediciones de ensayo respectivas. Los ejemplos siguientes pretenden ilustrar la invencion sin limitar el alcance de la misma. Los porcentajes se expresan en peso.

A menos que se defina de otra manera, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en la presente memoria presentan el significado entendido comunmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invencion. Aunque tambien pueden utilizarse cualesquiera procedimientos y materiales similares o equivalentes a los indicados en la presente memoria en la practica de la presente memoria, se indican procedimientos y materiales ejemplares con fines ilustrativos. Todas las publicaciones mencionadas en la presente solicitud se incorporan como

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referencia para dar a conocer y describir los procedimientos y/o materiales en relacion a los que se citan las publicaciones.

Ademas, las publicaciones expuestas en la presente memoria se proporcionan unicamente para la exposicion de las mismas antes de la fecha de presentacion de la presente solicitud. Nada en la presente memoria debe interpretarse como admision de que la presente invencion no posee el derecho a anteceder a dicha publicacion en virtud de invencion anterior. Ademas, las fechas de publicacion proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicacion reales, las cuales podrfan requerir confirmacion independiente.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes estan destinados a ilustrar las formas de realizacion preferentes de la invencion sin limitar el alcance de la misma como consecuencia.

Material

Las plantas de cftricos utilizadas en los presentes ejemplos se obtuvieron de The Citrus Germplasm Bank (Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA), Moncada, Valencia, Espana). Las semillas de guayaba se obtuvieron de productores locales de Vietnam y Brasil y se cultivaron en un invernadero en el IVIA. Otras fuentes disponibles de plantas maduras de guayaba son la Universitat Politecnica y el Jardf Botanic de Valencia (Espana).

Ejemplo 1

Analisis del contenido y emision de compuestos volatiles en hojas de plantas de cftricos y de guayaba

Se estudio el contenido y emision de compuestos volatiles en hojas de diferentes genotipos (Psidium guajava, Citrus sinensis, Citrus aurantifolia y Citrus Clementina). Los analisis se llevaron a cabo utilizando hojas en diferentes etapas de desarrollo recogidas en diferentes horas del dfa y en diferentes estaciones. Se analizo cada muestra por lo menos cuatro veces (dos replicas biologicas mas dos replicas tecnicas).

Para determinar el contenido de compuestos volatiles, el tejido foliar recogido se congelo inmediatamente en nitrogeno lfquido y se almaceno a -80°C hasta la extraccion. Se peso el material congelado molido (200 mg) en tubos de Pyrex con tapon de rosca y se anadieron inmediatamente 3 ml de pentano frfo. Las muestras se homogeneizaron sobre hielo durante 30 s con un homogeneizador Yellowline (modelo DI 25). La suspension se agito con vortex durante 15 l y se anadieron 3 ml de agua Milli-Q, se agitaron con vortex adicionalmente durante 30 s y se centrifugaron a 1.800 g durante 10 min. a 4°C. Se recupero la fase organica con una pipeta Pasteur y la fase acuosa se reextrajo dos veces mas con 3 ml de pentano. Una alfcuota de 2 pl de las fases organicas agrupadas se inyecto directamente en el CG-EM para el analisis de los compuestos volatiles (ver posteriormente).

Debido a que el analisis del espacio de cabeza proporciona una representacion mas realista del perfil de compuestos volatiles emitidos por las plantas y detectados por los insectos que responden a los compuestos volatiles de plantas, se llevo a cabo un muestreo estatico del espacio de cabeza con un dispositivo de microextraccion en fase solida (MEFS). Las muestras de hojas se encerraron en tubos de Pyrex de tapon de rosca de 50 ml que portaban un septo en la parte superior y que contenfan 1 ml de agua Milli-Q para evitar el estres hfdrico de las hojas. Se expuso la fibra de MEFS (100 pm de poli(dimetil)siloxano, Supelco, Bellefonte, PA) a una temperatura controlada de 22°C, durante 1 a 4 horas. Inmediatamente despues se transfirio la fibra a un inyector de CG (220°C) y se prolongo la desorcion termica durante 4 min.

Los resultados demostraron que los compuestos principales identificados en el contenido de compuestos volatiles tambien eran los compuestos volatiles principales emitidos por las hojas (para un ejemplo representativo, ver la fig. 2). Tal como se indica en la literatura, mas del 80% de los compuestos volatiles totales contenidos y emitidos por las hojas de cftricos son monoterpenos, siendo el linaool el mas abundante en todos los genotipos y fechas de muestreo analizados (fig. 3). En estas muestras, no se detecto o se detecto a niveles muy bajos p-cariofileno, y no en todas las replicas. En las hojas de guayaba, los sesquiterpenos eran los compuestos volatiles predominantes y, en todas las muestras analizadas, el p-cariofileno constitufa por lo menos 50% del total de compuestos (fig. 4).

Ejemplo 2

Analisis de CG-EM

Se utilizo un aparato Thermo Trace GC Ultra acoplado con un espectrometro de masas Thermo DSQ con modo de ionizacion electronica (IE) a 70 eV. La fuente de iones y la lfnea de transferencia se encontraban a 200°C y a 260°C, respectivamente. Los compuestos volatiles se separaron en una columna HP-INNOWax (Agilent J&C Columns) (30 m x 0,25 mm d.i. x pelfcula de 0,25 pm). Las temperaturas de la columna se programaron a 40°C durante 5 min., se elevaron a 150°C a 5°C min-1, despues se elevaron a 250°C a 20°C min-1 y se mantuvieron durante 2 min. a 250°C. La temperatura del inyector era de 220°C. El gas portador era helio a un caudal de 1,5 ml min-1 en el modo sin

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fraccionamiento. Se registraron los espectros de masas con impacto de electrones en el intervalo de 30 a 400 amu a una velocidad de escaneo de 0,5 escaneos-1. Los compuestos se identificaron mediante correspondencia de los espectros de masas adquiridos con los almacenados en bibliotecas de referencia (NIST, MAINLIB, REPLIBT) o con compuestos estandares autenticos, en caso de encontrarse disponibles.

Ejemplo 3

Respuesta de D. citri a compuestos volatiles de guayaba

Se diseno una serie de experimentos con el objetivo de investigar el efecto de los compuestos volatiles de la hoja de guayaba sobre el comportamiento de D. citri. Se obtuvieron adultos de D. citri de sexo mixto a partir de cultivos cultivados en continuo a partir de plantulas de C. limonia mantenidos en Fundecitrus (Araraquara, Brasil) a 25 ± 1°C, 70 ± 10% de humedad relativa y un fotoperiodo de L14:D10.

Para los ensayos de comportamiento se utilizo un olfatometro de tubo Y con un brazo de entrada de 12,5 cm de longitud y dos brazos de ensayo de 21,0 cm de longitud (diametro interior: 0,6 cm). Se bombeo aire filtrado (0,4 l min-1) a traves de carbono (granulado de 4-8 mm, Applichem GmbH, Darmstadt, Alemania) a traves de dos frascos de vidrio de 2 litros que contenfan las fuentes de compuestos volatiles, que consistfan de aire o plantulas de guayaba. Se sometieron a ensayo 40 psflidos en cada experimento y cada experimento se llevo a cabo por lo menos por triplicado. Se determino la posicion de los psflidos tras 10 min. y aquellos que se habfan desplazado 10,0 cm despues de la ramificacion se registraron como 'sensibles'. Los resultados demostraron que los compuestos volatiles de la guayaba repelfan o inmovilizan los psflidos o limitaban el atractivo de los cftricos (fig. 6A). Se llevaron a cabo estudios adicionales utilizando un olfatometro de cuatro brazos. El aire lavado a traves de carbono se humidifico mediante el paso por un cilindro de vidrio lleno de agua y se separo en cuatro flujos (0,4 l min-1) cada uno de los cuales se dirigio a uno de los cuatro campos de olfatometro. El aire que flufa al interior del campo de ensayo del olfatometro se paso a traves de un cilindro de vidrio (1 l) que contenfa las muestras o aire limpio. Se sometieron a ensayo 40 psflidos en cada experimento, y cada experimento se llevo a cabo por lo menos por triplicado. Los resultados de guayaba frente a aire limpio indican claramente que los compuestos volatiles de guayaba presentaban un efecto repelente (fig. 6B).

Tambien se evaluo el efecto de p-cariofileno puro (pureza>98,5%, Sigma-Aldrich, Alemania) y de a-copaeno (pureza>90,0%, Sigma-Aldrich, Alemania) sobre D. citri utilizando un olfatometro de cuatro brazos. En cada observacion se coloco un psflido en la parte media del olfatometro permeado por aire procedente de cada uno de sus brazos extendidos. En todos de los brazos se bombeo aire limpio mientras que en los brazos restantes se bombeo a traves de viales de vidrio que contenfan 10 pl de compuestos puros. Cada observacion se prolongo durante cinco min. y se registro la primera y ultima elecciones de cada psflido individual. Se utilizaron por lo menos 29 psflidos para estudiar la respuesta de comportamiento a cada compuesto. En el ensayo preliminar con aire limpio no se observaron diferencias significativas entre brazos, indicando que todos ellos eran equivalentes y no introducfan ningun sesgo durante los ensayos de opcion. Los ensayos llevados a cabo con p-cariofileno y a-copaeno mostraron un nivel mas alto de psflidos que entraban en el brazo sin olor, observando el efecto repelente de dichos compuestos (tabla 1).

Tabla 1

p-cariofileno Aire limpio X2 p n

Primera eleccion

42,3% 57,7% 1,23 0,4054 29(26)

Eleccion final

32,0% 68,0%* 6,48 0,0237 29(25)

a-copaeno Aire limpio X2 p n

Primera eleccion

42,0% 58,0% 0,76 0,4862 34(33

Eleccion final

33,0% 67,0%** 7,33 0,0138 34(33)

Tabla 1: resultados representativos de ensayos olfatometricos de tubo Y. Porcentaje de individuos que selecciono cada compuesto en ensayos de olfatometro de cuatro brazos que examinaban las respuestas de los psflidos al tratamiento con fuentes de olor frente a un control de aire limpio. n: tamano total de la muestra (con el numero de individuos que realizaron una seleccion entre parentesis). Se compararon los datos utilizando pruebas de chi- cuadrado (*p<0,05; **p<0,01).

Estos resultados se reprodujeron al utilizar en ensayos olfatometricos dosis mas bajas de los compuestos puros. Ejemplo 4

Aislamiento de ARN total

Se recogieron hojas de plantas de cftricos y de guayaba, se congelaron inmediatamente en nitrogeno lfquido y se molieron utilizando un mortero. Se extrajo el ARN total utilizando el kit Qiagen RNeasy Mini. Tal como indica Keszei et al. (Phytochem. 71:844-852, 2010) se modifico el tampon de extraccion mediante la adicion de PVP al 2% (Sigma-

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Aldrich) y 120 mg/ml de isoascorbato sodico (hasta la saturacion) (Sigma-Aldrich) para inhibir la conjugacion oxidativa de los fenolicos al ARN. Tfpicamente se obtuvo un promedio de 100 pg de ARN total a partir de 200 mg de tejido molido. Se estimo la concentracion de ARN a partir de la DO a 260 nm. Se evaluo la integridad del ARN en un gel de agarosa mediante la verificacion de la integridad de las bandas de ARN ribosomico.

Ejemplo 5

Transcripcion inversa (TI) y amplificacion por PCR

Se llevo a cabo la sfntesis de ADNc con 1 pg de ARN total. Se llevo a cabo la TI en presencia de 500 ng de oligo-dT y 200 unidades de transcriptasa inversa SuperScript II (Gibco BRL, Alemania). Se incubaron las muestras durante 5 min. a 65°C, durante 50 min. a 42°C y durante 15 min. a 70°C. Para la amplificacion por PCR, se disenaron cebadores que contenfan codones de inicio y de parada de SEC ID n° 1 y SEC ID n° 3 (tabla 2).

Tabla 2

Cebador Secuencia del cebador (5'—»3') Orientacion

SEC ID n° 5

B27F CACCATGTCCGCTCAAGTTC S

SEC ID n° 6

B28R T CAGAT GGT AACAGGGT CTC AS

SEC ID n° 7

B27F GCAT GAGGGAT GTT AAGAG S

SEC ID n° 8

B28R CT GTTTT CTTT GAAGACT AGGC AS

S: sentido, AS: antisentido.

Tabla 2: cebadores utilizados para amplificar los ADNc correspondientes a las secuencias SEC ID n° 5 (B25F) y SEC ID n° 6 (B26R), SEC ID n° 7 (b27F) y SEC ID n° 8 (B28R). Se han subrayado los codones de inicio y de parada.

Las condiciones del ciclador termico fueron: 5 min. a 95°C; 35 ciclos de 30 s a 94°C, 30 s a 56°C y 150 s a 72°C, y finalmente 10 min. a 72°C. Se evaluaron los tamanos de los productos de PCR en un gel de agarosa al 1%. Las bandas correspondientes al tamano esperado se extrajeron del gel, se purificaron utilizando el kit de extraccion de gel QIAquick™ (Qiagen) y se clonaron en pTZ57R/T (Fermentas GmbH). A continuacion, los fragmentos de ADN insertados se sometieron a secuenciacion de ADN y la secuencia se comparo con las de la base de datos de protefnas no redundantes GenBank (NCBI) utilizando el algoritmo BLASTX (Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W. y Lipman D.J., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990).

Ejemplo 6

Construccion de plasmidos de expresion para el ensayo de actividad de la sesquiterpeno sintasa

Cada casete de expresion preparado comprendfa una o mas regiones de inicio de transcripcion o de control transcripcional (por ejemplo un promotor), la region codificante de la protefna de interes y una region terminadora de la transcripcion. Con el fin de evitar la posible toxicidad del compuesto sesquiterpeno al acumularse en un huesped microbiano, se selecciono un promotor inducible. Para la expresion funcional de las sesquiterpeno sintasas, los ADNc se subclonaron en el vector pF3K WG (BYDV) Flexi® de Promega disenado para la expresion in vitro de protefnas. Este vector porta el gen letal barnasa, que es sustituido por el fragmento de ADN de interes y actua como seleccion positiva para la ligacion con exito de la insercion y un gen de resistencia a la canamicina para la seleccion de colonias bacterianas. Ademas, permite la clonacion direccional de los productos de PCR en los sitios de restriccion SgfI y PmeI. En este plasmido, se situo el ADNc cadena abajo del promotor SP6.

Se amplificaron las inserciones por PCR utilizando un oligonucleotido de PCR aminoterminal que inclufa el codon de inicio y el sitio SgfI y un cebador de PCR carboxiterminal que inclufa el codon de parada y el sitio PmeI (tabla 3). En el cebador directo, se anadieron seis codones de histidina en el marco con el fin de crear una protefna etiquetada N- terminalmente. Los ADNc amplificados se purificaron y se ligaron en el plasmido pF3K WG (Promega) siguiendo el protocolo del fabricante. Los constructos se verificaron mediante digestion y secuenciacion del ADN.

Todas las amplificaciones de ADNc para la expresion se llevaron a cabo utilizando la ADN polimerasa Pfu (Promega) en un volumen final de 50 pl que contenfa 5 pl de tampon 10X de ADN polimerasa Pfu, 200 pM de cada dNTP, 0,4 pM cada cebador directo e inverso, 2,9 unidades de ADN polimerasa Pfu y 5 pl de 1 pl de ADNc (preparado tal como se ha indicado anteriormente). Las condiciones de ciclado termico fueron las siguientes: 2 min. a 95°C, 25 ciclos de 30 s a 95°C, 30 s a 52°C y 4 min. a 72°C y 10 min. a 72°C. Los productos de PCR se purificaron en un gel de agarosa y se eluyeron utilizando el kit de extraccion de gel QIAquick® (Qiagen).

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Tabla 3

Cebador

Secuencia de cebador (5'—»3') Orientacion

SQS5F

GCGA7CGCCATGCAT CACCAT CACCAT CACGGATCCGCT CAAGTT CT AGC (SEC ID n° 9) S

SQS5R

G TTTAAA CT CAGAT GGT AACAGGGT CTCT (SEC ID n° 10) AS

Tabla 3: cebadores utilizados para la clonacion de SEC ID n° 1 en el vector pF3KW Flexi (Promega) correspondiente a las secuencias SEC ID n° 9 (SQS5F) y SEC ID n° 10 (SQS5R). S, sentido; AS, antisentido. Los sitios de restriccion se senalan en cursiva. Los nucleotidos codificantes de HHHHHH se muestran en negrita. Los codones de inicio y de parada estan subrayados.

Ejemplo 7

Expresion de sesquiterpeno sintasa y ensayos enzimaticos

En un experimento de expresion de protefnas estandar, los plasmidos de expresion que contienen el ADNc de la sesquiterpeno sintasa asf como el plasmido vacfo (control negativo) se transformaron en celulas E. coli XL1-Blue (Stratagene). Se utilizaron colonias individuales de E. coli transformadas para inocular 5 ml de medio LB. Se cultivaron cultivos lfquidos de bacterias que alojaban el constructo de expresion o el plasmido vacfo a 37°C hasta una DO600 de 0,8. Se aislo el ADN de plasmido a partir de bacterias utilizando el kit miniprep QIA prep spin (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron 2 pg de ADN plasmfdico purificado para la transcripcion/traduccion in vitro en sistema de expresion sin celulas de extracto de germen de trigo de Promega (sistema de expresion de protefnas de germen de trigo de alto rendimiento TnT® SP6) en un volumen final de 50 pl. Tras la incubacion a 25°C durante 2 horas se confirmo la produccion de protefna analizando una alfcuota de 1 pl mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato sodico-poliacrilamida (SDS-PAGE) y transferencia western utilizando procedimientos estandares. Se sondearon membranas de nitrocelulosa con anticuerpo monoclonal anti His G HRP de Invitrogen.

Se llevaron a cabo los ensayos enzimaticos en 15 ml de tubos de vidrio sellado con teflon utilizando 49 pl de extracto de protefna en un volumen final de 1 ml de tampon de reaccion (tampon de fosfato potasico 25 mM, pH 6,8; MgCl2 10 mM, MnSO4 1 mM y DTT 1 mM) complementado con FPP 100 pM (Sigma). Sobre el medio se aplico 1 ml de pentano para atrapar los productos volatiles y los tubos se incubaron durante la noche a 30°C. Se recupero la fase de pentano, que contenfa el sesquiterpeno, y el medio se extrajo con un segundo volumen de pentano. Se analizaron 2 pl de las fracciones de pentano agrupadas, mediante cromatograffa de gases tal como se ha indicado anteriormente. De esta manera, se atribuyo la actividad de cariofileno sintasa a la secuencia SEC ID n° 2 (fig. 5).

Ejemplo 8

Aislamiento de secuencias parciales correspondientes a las sesquiterpeno sintasas utilizando RT-PCR

Las secuencias de aminoacidos deducidas de las p-cariofileno sintasas vegetales se alinearon para identificar regiones conservadas y disenar oligonucleotidos especfficos de p-cariofileno sintasa vegetal (fig. 7). Se obtuvieron de la base de datos NCBI secuencias de aminoacidos de sesquiterpeno sintasas vegetales con actividad demostrada de p-cariofileno sintasa. El analisis de homologfa mostro una identidad de protefna baja (aproximadamente 21%) entre las p-cariofileno sintasas vegetales conocidas. Sin embargo, se encontro una homologfa mas alta al separar las secuencias de protefna en dos grupos (fig. 8). El primer grupo (fig. 8A) contenfa las secuencias de las p-cariofileno sintasas de plantas dicotiledoneas, tales como Arabidopsis (Chen et al., Biosynthesis and emission of terpenoid volatiles from Arabidopsis flowers, Plant Cell 15:481-494, 2003; Tholl et al., Two sesquiterpene synthases are responsible for the complex mixture of sesquiterpenes emitted from Arabidopsis flowers, The Plant J. 42:757-771, 2005), el pepino (Mercke et al., Combined transcript and metabolite analysis reveals genes involved in spider mite induced volatile formation in cucumber plants, Plant Phys. 135:2012-2024), Mikania micrantha (Wang et al., Cloning, expression and wounding induction of p-caryophyllene, Allelopathy J. 24:35-44, 2009) y Artemisia annua (Cai et al., A cDNA clone for p-caryophyllene synthase from Artemisia annua, Phytochem. 61:523-529, 2002). El segundo grupo (fig. 8B) contenfa secuencias de p-cariofileno sintasas de plantas monocotiledoneas tales como el mafz (Kollner et al., A maize (E)-p-caryophyllene synthase implicated in indirect defense responses against herbivores is not expressed in most american maize varieties, The Plant Cell 20:482-494, 2008) y el arroz (Cheng et al., The rice (E)-p-caryophyllene synthase (OsTPS3) accounts for the major inducible volatile sesquiterpenes, Phytochem. 68:1632-1641, 2007). Las p-cariophileno sintasas de las monocotiledoneas presentaban una identidad global de 47%, las p-cariofileno sintasas de M. micrantha y de Artemisia annua mostraban una homologfa de 58%, mientras que las de Arabidopsis y el pepino mostraban una identidad baja (aproximadamente de 17%) respecto al resto de secuencias de aminoacidos. Con el fin de conocer mejor las sesquiterpeno sintasas de cftricos, se alinearon las secuencias de aminoacidos de la base de datos de NCBI con p- cariofileno sintasas de plantas dicotiledoneas (fig. 9). Las secuencias utilizadas para el analisis eran la (E)-p-

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farneseno sintasa de Citrus junos (AAK54279), la terpeno sintasa putativa de Citrus junos (AAG01339), la terpeno sintasa putativa de Citrus paradisi (AAM00426) y la valenceno sintasa de Citrus sinensi (AAQ04608). El motivo de union a ion metalico (DDxxD) y el dominio RRxaW, ambos caracterfsticos de las sesquiterpeno sintasas vegetales (tanto monocotiledoneas y dicotiledoneas) se identificaron en todas las secuencias peptfdicas. Ademas, se identificaron otros aminoacidos conservados, localizados mayoritariamente en la region central de las secuencias. Basandose en dichas secuencias conservadas entre plantas, se disenaron cebadores degenerados de las p- cariofileno sintasas y sesquiterpeno sintasas de cftricos (subrayados en la fig. 9) con el fin de aislar la p-cariofileno sintasa de las plantas de guayaba. Se proporciona una secuencia detallada de dichos cebadores en la tabla 4. Se encontro la homologfa de secuencia mas alta en la parte central de las secuencias. Se seleccionaron tres regiones que contenfan aminoacidos suficientemente conservados y se disenaron oligonucleotidos degenerados especfficos para dichas regiones (es decir, se dedujeron cuatro cebadores directos (CSF1A, CSF1B, CSF2 y CSF3) y tres cebadores inversos (CSR3, CSR2 y CSR1) (tabla 4). Se amplificaron, clonaron y secuenciaron secuencias parciales siguiendo procedimientos estandares. Basandose en estas secuencias, se disenaron nuevos cebadores y se llevo a cabo la amplificacion de los extremos 5' y 3' utilizando el kit 5'/3' RACE (Roche, Mannheim, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Tabla 4

Cebador Secuencia de cebador (5'^ 3') Orientacion

SEC ID n° 11

CSF1A TKGGKGTRKCKTATCAYTTTGA S

SEC ID n° 12

CSF1B GGAGTRKCMTAYCATTTTGAA S

SEC ID n° 13

CSF2 GGSATGTTAAGTTTGTAYGARGC S

SEC ID n° 14

CSF3 GATGAYACWTWTGACGCKTAYGG S

SEC ID n° 15

CSR3 CCRTAMGCGTCAWTWGTRTCATC AS

SEC ID n° 16

CSR2 TCCTCATTCATATCTTTCCA AS

SEC ID n° 17

CSR1 CT AT CT CTT GCAAAAGG AS

S, sentido; AS,

antisentido. K: G o T; R: A o G; M: C o A; W: T o A; Y: T o C.

Tabla 4: CSF1A, CSF1B, CSF2, CSF3 y CSR1, CSR2 y CSR3 son cebadores disenados basandose en motivos conservados con el fin de amplificar secuencias parciales correspondientes a sesquiterpeno sintasas. FPPF y FPPR son cebadores disenados para amplificar la FPP sintasa de Arabidopsis thaliana.

Ejemplo 9

Aislamiento de las secuencias de longitud completa correspondientes a los genes de sesquiterpeno sintasa. 3'- y 5'- RACE

Se llevo a cabo la sfntesis de ADNc de primera cadena a partir de tejidos de hojas y amplificaciones por PCR, tal como se ha indicado anteriormente. Para la PCR se utilizaron combinaciones de cebadores sentido y antisentido detalladas en la tabla 3. Los productos de PCR se ligaron en pTZ57R/T (Fermentas GmbH) y se secuenciaron. La informacion de secuencia permitio una rapida amplificacion de los extremos del ADNc mediante la estrategia de RACE-PCR utilizando el kit 5'/3' RACE (Roche, Mannheim, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Por ejemplo, CSF1B y CSR1 amplificaron una banda de 621 pb con elevada homologfa respecto a los genes de sesquiterpeno sintasa de la base de datos del NCBI. Basandose en esta secuencia, se disenaron nuevos cebadores especfficos para la amplificacion de extremo 5' (B62R y B63R) y para la amplificacion de extremo 3' (B61F) (fig. 10). Para la amplificacion de extremo 5', se sintetizo ADNc de primera cadena utilizando el cebador especffico CSR1 (tabla 4). Se anadio una cola A homopolimerica al extremo 3' del ADNc purificado y despues se amplifico por PCR utilizando el cebador especffico de gen B62R y un cebador de anclaje oligo-dT especffico. Se amplifico una banda de aproximadamente 800 pb, se purifico en gel con el kit de extraccion de gel QlAquick (Qiagen) y se amplifico adicionalmente mediante una segunda PCR utilizando el cebador anidado especffico de gen B63R y el cebador de anclaje de PCR. El producto de amplificacion (700 pb) se purifico a partir del gel de agarosa, se ligo en pTZ57R/T (Fermentas GmbH) y se secuencio. Para la amplificacion de extremo 3', se sintetizo el ADNc utilizando un cebador de anclaje oligo-dT y se llevo a cabo la amplificacion por PCR con cebador de anclaje de PCR y el cebador especffico de gen b61F. Se purifico el producto de amplificacion (900 pb) a partir del gel de agarosa, se ligo en pTZ57R/T (Fermentas GmbH) y se secuencio.

Las secuencias obtenidas en primer lugar se compararon con la base de datos de protefnas no redundantes GenBank (NCBI) utilizando el algoritmo BLASTX (Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W. y Lipman D.J., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990) y despues se compararon con la secuencia de ADN inicial para garantizar que se obtenfa un solapamiento significativo de la secuencia de ADN.

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Ejemplo 10

Clonacion de FPPS y peptidos de transito

Con el objetivo de incrementar adicionalmente el contenido y emision de sesquiterpenos en plantas de cftricos transgenicas, se introdujo un casete de gen de FPP sintasa en plasmidos binarios para la transformacion de las plantas (ver posteriormente). Una estrategia similar fue adoptada por Wu et al. (Redirection of cytosolic or plastidic isoprenoid precursors elevates terpene production in plants. Nature Biotech. 24:1441-1447, 2006), quienes utilizaron la coexpresion transgenica de FPP sintasa y amorfadieno sintasa en plastidios para la sfntesis exitosa a nivel elevado de amorfadieno en plantas de tabaco transgenico (Nicotians tabacum). Hasta hoy no se ha aislado ninguna FPP sintasa a partir de cftricos, aunque una secuencia de nucleotidos de la base de datos CFGP (Citrus Functional Genomic Project), la acL9351contig1, presenta una identidad elevada (78%; homologfa de 87%) respecto a una FPP sintasa de Arabidopsis (n° de acc. X75789). Con el fin de seleccionar un gen de FPP sintasa, se llevo a cabo una busqueda en la base de datos publica del NCBI. La protefna FPP sintasa se encuentra altamente conservada en las plantas dicotiledoneas. Por ejemplo, las protefnas FPP sintasas de dichas especies no relacionadas, tales como Arabidopsis (n° de acc. Q09152), Malus domestics (n° de acc. AAM08927), Vitis vinifera (n° de acc. AAX76910), Gossypum hirsutum (n° de acc. CAA72793) y Hevea brasilensis (n° de acc. AAM98379) muestran una identidad global de 79% (homologfa de 89%). La identidad de las protefnas FPP sintasa de las plantas monocotiledoneas y dicotiledoneas tambien es elevada. Por ejemplo, la FPPS de Zea mays (n° de acc. AC634051) es identica al 71% (similar al 85%) a la de Arabidopsis. Finalmente, el elevado grado de similitud entre las FPPS de plantas y las FPPS de otros reinos, por ejemplo la FPPS de Saccharomyces cerevisiae (n° de acc. EDN63217) es 66% homologa respecto a la de Arabidopsis, sugiere que esta protefna se encuentra muy conservada durante la evolucion. De esta manera, se crefa que cualquier FPPs de una planta dicotiledonea resultaba adecuada para incrementar la produccion de FPP en las plantas de cftricos. Debido a que las de Arabidopsis han sido bien caracterizadas y su actividad ha sido demostrada (Cunillera et al., Arabidopsis thaliana contains two differentially expressed farnesyl diphosphate synthase genes, J. Biol. Chem. 221:7774-780, 1996), se disenaron cebadores basados en la secuencia de AtFPS1 (n° de acc. X75789) con el fin de amplificar un ADNc de longitud completa codificante de una FPP sintasa funcional (fig. 11). Se extrajo el ARN total de hojas de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia) utilizando el minikit RNeasy de Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante y se sintetizo el ADNc tal como se ha indicado anteriormente. Se llevo a cabo la amplificacion del ADNc utilizando la ADN polimerasa Pfu (Promega) y la misma mezcla de reaccion indicada anteriormente. Las condiciones de ciclado termico eran: 2 min. a 95°C; 30 ciclos de 30 s y 95°C, 30 s a 50°C y 1,5 min. a 72°C y 10 min. a 72°C. El producto de PCR se purifico a partir del gel de agarosa con el kit de extraccion del QIAquick® (Qiagen) ligado en pTZ57R/T (Fermentas GmbH) y se confirmo su identidad mediante secuenciacion.

Aparte de lo anterior, el desplazamiento de la biosfntesis de sesquiterpenos del citosol a plastidios o mitocondrias puede mejorar los resultados de la manipulacion metabolica. En primer lugar, lo anterior puede evitar posibles efectos perjudiciales de la acumulacion de sesquiterpenos en el citosol y, en segundo lugar, evitar la composicion para el pool citosolico de FPP por la sesquiterpeno sintasa introducida y los enzimas endogenos que utilizan FPP puede proporcionar un pool de sustratos sustancial para esta ruta manipulada sin comprometer el crecimiento de la planta. Esta estrategia ha sido utilizada con exito anteriormente, por Wu et al. (Redirection of cytosolic or plastidic isoprenoid precursors elevates terpene production in plants, Nature Biotech. 24:1441-1447, 2006), quienes han llevado a cabo la coexpresion transgenica de FPP sintasa y de amorfadieno sintasa en plasticos para la sfntesis exitosa de nivel elevado de amorfadieno en plantas de tabaco transgenicas (Nicotiana tabacum). El cambio de la localizacion subcelular de la sesquiterpeno sintasa introducida a la mitocondria tambien ha sido utilizada anteriormente por Kappers et al. (Genetic engineering of terpenoid metabolism attracts bodyguards to Arabidopsis, Science 309:2070-2072, 2005), quienes han informado de que el FPP se encuentra facilmente disponible en este organulo para la biosfntesis de sesquiterpenos.

El peptido de transito (PT) de la subunidad pequena de Rubisco (SSU) de Pissum sativum (n° de acc. X00806) se sintetizo como tres fragmentos oligonucleotidos solapantes y posteriormente se amplifico mediante PCR introduciendo los sitios de restriccion Ndel y Clal en los extremos 5' y 3', respectivamente, de los mismos. El producto de PCR se ligo en pTZ57R/T (Fermentas GmbH), generando el plasmido pTZ-TPssu, y se secuencio. Se sintetizo la secuencia CoxlV (de Saccharomyces cerevisiae, n° de acc. X01048) como dos fragmentos oligonucleotidos complementarios y posteriormente se amplifico mediante PCR introduciendo los sitios de restriccion NdeI y ClaI en los extremos 5' y 3', respectivamente, de los mismos. El producto de PCR se ligo en PTZ57R/T (Fermentas GmbH), generando el plasmido pTZ-mtTP, y se secuencio.

Ejemplo 11

Construccion de vector de expresion

Para generar los vectores de expresion, se utilizaron los plasmidos pMOG 180 (Mogen International, resistencia a la ampicilina) y el vector binario pROK (resistencia a la canamicina, Invitrogen), portadores ambos de las secuencias

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de promotor constitutivo CaMV 35S y de terminador nopalina sintasa (NOS). El ADN-t de pROK tambien portaba el gen de la neomicina fosfotransferasa II (NPTII) bajo el control de las secuencias de promotor y terminador NOS.

Las sesquiterpeno sintasas clonadas y FPPS1 se amplificaron mediante PCR a partir de pTZ57R/T (Fermentas GmbH) anadiendo sitios de restriccion convenientes para la ligacion de los peptidos de transito (Ndel, Clal) y en el vector pMOG (BamHI), se ligaron nuevamente en pTZ57R/T (Fermentas GmbH) y se secuenciaron, generando los plasmidos pTZ-CsCS+rest, pTZ-PgCS+rest, pTZ-CsCoS+rest, pTZ-PgCoS+rest y pTZ-FPPS+rest. Todos estos plasmidos y los que portan los peptidos de transito (pTZ-TPssu y pTZ-mtTP, ver el ejemplo, anteriormente) se sobredigirio 10 veces con los enzimas de restriccion Ndel y Clal de Takara (Shuzo, Co., Ltd.). Los fragmentos digeridos de tamano adecuados se extrajeron del gel de agarosa y se purificaron utilizando el kit de extraccion de gel QIAquick® (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras la desfosforilacion de los plasmidos con fosfatasa antartica (New England Biolabs), se llevo a cabo la ligacion de los fragmentos correspondientes a ambos peptidos de transito con ligasa de T4 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se comprobo la correcta orientacion y mantenimiento de los ORF de las inserciones mediante secuenciacion y digestion. Los plasmidos resultantes que alojaban TPssu para la importacion de plasticos se denominaron pTZ-TPssu-CsCS, pTZ-TPssu- PgCS, pTZ-TPssu-CsCoS, pTZ-TPssu-PgCoS y pTZ-TPssu-FPPS, mientras que aquellos con senal de importacion mitocondrial se denominaron pTZ-mtTP-CsCS, pTZ-mtTP-PgCS, pTZ-mtTP-CsCoS, pTZ-mtTP-PgCoS y pTz-mtTP- FPPS. Los plasmidos con FPPS, que inclufan o no inclufan peptido de transito, se sobredigirieron 10 veces con BamHI y se ligaron entre el promotor CaMV 35S y el terminador nopalina sintasa ((NOS) del vector pMOG 180. Los plasmidos resultantes se denominaron pMOG-FpPS, pMMOG-TPssu-FPPS y pMOG-mtTP-FPPS. La correcta orientacion y mantenimiento de los ORF de las inserciones se comprobaron mediante secuenciacion y digestion. Los casetes de dichos tres plasmidos se amplificaron mediante PCR con cebadores especfficos para el promotor CaMV 35S y el terminador nOs que contenfan los sitios de restriccion AseI para fines de subclonacion. Los productos de PCR se sobredigirieron con AseI y se ligaron en el vector pROK, generando los vectores pROK-FPPS, pROK- TPssu-FPPS y pROK-mtTP-FPPS. Los ORF de los genes de sesquiterpeno sintasa se amplificaron a partir de pTZ- CsCS , pTZ-TPssu-CsCS, pTZ-mtTPCsCS, pTZ- CsCoS, pTZ-TPssu- CsCoS, pTZ-mtTP- CsCoS, pTZ-PgCS , pTZ- TPssu-PgCS, pTZ-mtTP-PgCS, pTZ-PgCoS, pTZ-TPssu-PgCoS y pTZ-mtTP-PgCoS con cebadores especfficos para el plasmido pTZ57R/T que contenfa el sitio de restriccion XbaI.

Los productos amplificados se purificaron en gel, se sobredigirieron con XbaI (New England Biolabs) y se ligaron en los vectores de expresion pROK, pROK-FPPS, pROK-TPssu-FPPS y pROK-mtTP-FPPS. Se comprobo la correcta orientacion y mantenimiento de los ORF de las inserciones mediante secuenciacion y digestion. Los plasmidos resultantes que expresaban los peptidos sesquiterpeno sintasa dirigidos al citosol se denominaron pROK-CsCs, pROK-CsCoS, pROK-PgCS y pROK-PgCoS. Los plasmidos resultantes que expresaban FPPS mas un peptido sesquiterpeno sintasa, ambos dirigidos al citosol, se denominaron pROK-FPPS-CsCs, pROK-FPPS-CsCoS, pRQK- FPPS-PgCS y pROK-FPPS-PgCoS. Los plasmidos que expresaban peptidos sesquiterpeno sintasa dirigidos a cloroplastos se denominaron pROK-TPssu-CsCs, pROK-TPssu-CsCoS, pROK-TPssu-PgCS, pROK-TPssu-PgCoS, mientras que los que expresaban peptidos sesquiterpeno sintasa dirigidos a la mitocondria se denominaron pROK- mtTP-CsCs, pROK-mtTP-CsCoS, pROK-mtTP-PgCs y pROK-mtTP-PgCoS. Los plasmidos resultantes que expresaban FPPS mas un peptido sesquiterpeno sintasa, ambos dirigidos al cloroplasto, se denominaron pROK- TPssu-FPPS-TPssu-CsCs, pROK-TPssu-FPPS-TPssu-CsCoS, pROK-TPssu-FPPS-TPssu-PgCS, pROK-TPssu- FPPS-TPssu-PgCoS. Los plasmidos resultantes que expresaban FPPS mas un peptido sesquiterpeno sintasa, ambos dirigidos a la mitocondria, se denominaron pROK-mtTP-FPPS-mtTP-CsCs, pROK-mtTP-FPPS- mtTP-CsCoS, pROK-mtTP-FPPS-mtTP-PgCS y pROK-mtTP--FPPS-mtTP-PgCoS.

Cada constructo se incorporo mediante electroporacion en celulas competentes para A. tumefaciens. Se utilizo NPTII como gen de marcador seleccionable, ya que su expresion proporciona a las celulas vegetales resistencia a los antibioticos aminoglucosidos, tales como canamicina, neomicina, geneticina y otros.

Ejemplo 12

Transformacion de las plantas de cftricos con un gen de sesquiterpeno sintasa de la guayaba o de cftrico

Se transformaron naranjas dulces (Citrus sinensis L. Osb.) variedades Valencia y Pera con un gen de p-cariofileno sintasa o un gen de a-copaeno sintasa de la naranja dulce o de Psidium guajava, bajo el control del promotor constitutivo CaMV 35S y el terminador nopalina sintasa (NOS).

Se utilizo la cepa EHA 105 de A. tumefaciens en el presente ejemplo para la transformacion de explantes de cftricos maduros. las bacterias se cultivaron durante la noche en un agitador orbital a 28°C y 200 rpm en medio de caldo de Luria (CL) que contenfa los antibioticos apropiados para cultivar los sistemas binarios. Se sedimentaron las celulas bacterianas a 3.500 rpm durante 10 min., se resuspendieron y se diluyeron hasta 4x107 o 4x108 celulas/ml en medio de inoculacion lfquido, que consistfa de solucion salina MS, hidrocloruro de tiamina 0,2 mg/l, hidrocloruro de piridonxina 1 mg/l, acido nicotfnico 1 mg/l y sacarosa al 3% (p/v), pH 5,7.

Para la transformacion de tejidos maduros de naranja dulce, se recogieron brotes de arboles mantenidos en un invernadero y se injertaron en plantulas de un portainjertos vigoroso bajo condiciones de invernadero (18°C a 27°C)

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y se utilizaron brotes recien alargados como material de partida. Se deshojaron trozos de tallo (20 cm de longitud) y las espinas se desinfectaron durante 10 min en una solucion de hipoclorito sodico al 2% (v/v) y se enjuagaron tres veces con agua destilada esteril. Los segmentos de tallo internodales (de 1 cm de longitud aproximadamente) se cortaron transversalmente y se incubaron durante 15 min. en platos de 10 cm de diametro que contenfan 15 ml de la suspension bacteriana en medio de inoculacion mediante agitacion suave. Los explantes infectados se secaron sobre papel de filtro esteril y se depositaron horizontalmente sobre platos con el medio de cocultivo durante un periodo de cocultivo de 3 dfas. El medio de inoculacion consistfa de 4,3 g/l de sales MS, 10 ml/l de solucion madre de vitaminas y 30 g/l de sacarosa, pH 5,7, 10. El medio de cocultivo consistfa de medio de inoculacion mas 2,4-D 2 mg/l, IAA 2 mg/l, 2,i-P 1 mg/l y agar 8 g/l, pH 5,7.

Tras el cocultivo, los explantes se secaron sobre papel de filtro esteril y se transfirieron a medio de regeneracion de brotes (MRB), que consistfa de sales MS, hidrocloruro de tiamina 0,2 mg/l, hidrocloruro de piridoxina 1 mg/l, acido nicotfnico 1 mg/l, sacarosa al 3% (p/v), agar al 1% (p/v), pH 5,7, mas canamicina 100 mg/l para la seleccion de los brotes transgenicos y 250 mg/l de vancomicina y 500 mg/l de cefotaxima para el control del crecimiento bacteriano. Dicho medio se complemento con 3 mg/l de BAP. Los cultivos se mantuvieron en la oscuridad durante 4 semanas a 26°C y despues se transfirieron a un fotoperiodo de 16 h, iluminacion de 45 pEm-2s-1 y 26°C.

Se extrajeron de los explantes los brotes regenerados a partir de explantes cultivados en el medio de seleccion que contenfa canamicina y se cortaron en dos trozos. La parte basal se sometio a ensayo de PCR y, en el caso de que la reaccion fuese positiva para el gen de interes, se injerto la parte apical in vitro en una plantula cultivada in vitro decapitada no transgenica. Aproximadamente 3 a 4 semanas despues del injerto de pua terminal, las plantulas se injertaron nuevamente en un portainjertos de plantula vigoroso en un invernadero a una temperatura de entre 18°C y 27°C.

Los procedimientos para transformar tejidos maduros de cftrico se dan a conocer en la patente US n° 6.103.955 de Pena et al. La transformacion resulto en plantas que producfan cantidades elevadas de p-cariofileno o a-copaeno, constitutivamente. Se seleccionaron tres lfneas transformadas independientemente, basandose en dicha caracterfstica. Los bioensayos de comportamiento en olfatometros revelaron que las plantas de cftricos transgenicos no atrafan sino que repelfan los psflidos de cftricos.

Ejemplo 13

Produccion de p-cariofileno y a-copaeno y la utilizacion de los mismos para repeler Diaphorina citri en el campo mediante un sistema de administracion lenta

El p-cariofileno es un compuesto extendido en el reino vegetal, es decir se encuentra presente en muchas oleorresinas de la mayorfa de confferas de la familia de las pinaceas. Sin embargo, dicho sesquiterpeno se produce tfpicamente con una abundancia baja en el organismo huesped. El aceite del arbol del clavo Eugenia caryophyllata (Syzygium aromaticum) contiene p-cariofileno en una cantidad considerable y sirve como fuente de preparacion para el aislamiento de dicho compuesto. El a-copaeno se encuentra como componente menor en los aceites esenciales de las hojas de diversas especies vegetales, tales como la guayaba, mientras que es abundante en rafces y semillas de copaiba (Copaifera officinalis (Jacq) L.) y de angelica (Angelica archangelica L.) (Jacobson et al., Optical isomers of a-copaene derived from several plant sources, J. Agric. Food Chem. 35(5):798-800, 1987).

Actualmente, a pesar de la utilizacion de tecnicas modernas, el aislamiento de dichos sesquiterpenos a partir de fuentes vegetales adolece de bajos rendimientos y un consumo elevado de recursos naturales (es decir, Quispe- Condori et al., Obtaining p-caryophyllene from Cordia verbenacea de Candolle by supercritical fluid extraction, J. of Supercritical Fluids 46:27-32, 2008; Jacobson et al., Optical isomers of a-copaene derived from several plant sources, J. Agric. Food Chem. 35(5):798-800, 1987). Ademas, la concentracion de p-cariofileno y de a-copaeno en las plantas depende de factores diffciles de controlar, tales como las condiciones climaticas y las enfermedades vegetales. Por otra parte, aunque se consiguio la sfntesis del p-cariofileno hace decadas (Corey et al., Total synthesis of d,1-caryophyllene and d,l-iscaryophyllene, J. Am. Chem. Soc. 86:485-492, 1964), todavfa resulta diffcil de escalar a la produccion industrial.

De esta manera, la presente invencion proporciona ademas procedimientos de biosfntesis y manipulacion metabolica del pcariofileno y el a-copaeno con el objetivo de desarrollar procedimientos de buena relacion coste- eficacia para la produccion estable a gran escala y de calidad consistente.

Una estrategia alternativa atractiva es manipular rutas metabolicas para la produccion de p-cariofileno en un huesped diverso. Incluso en una celula, que no puede sintetizar sesquiterpenos, contiene farnesil pirofosfato en el caso de que sintetice esteroides o terpenos. Debido a que toda celula contiene por lo menos esteroides o terpenos, en teorfa practicamente todos los huespedes son capaces de sintetizar sesquiterpenos utilizando las secuencias de ADN de la presente invencion en la medida en que se encuentra disponible un sistema de huesped-vector adecuado. Se conocen sistemas de huesped-vector, por ejemplo, para plantas tales como Nicotiana tabacura, Petunia hybrida y similares, microorganismos tales como bacterias, por ejemplo Escherichia coli, Zymornonas

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mobilis y similares, levaduras, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae y similares, y hongos (por ejemplo especies de ascomicetos y basidiomicetos).

La manipulacion de la produccion del p-cariofileno en un huesped heterologo puede requerir la disponible de su precursor (FPP) en cantidad suficiente para evitar la competencia para el pool de FPP por enzimas exogenos y endogenos que utilizan FPP que podrfa resultar en efectos perjudiciales. Con este fin, resultarfan eficientes varios enfoques: (i) el cambio de la compartimentacion celular del enzima de citosol a mitocondrias o plastidios utilizando senales de transito peptfdicas conocidas (es decir, Kappers et al., Genetic engineering of terpenoid metabolism attracts bodyguards to Arabidopsis, Science 309:2070-2072, 2005), (ii) coexpresar los genes de la p-cariofileno sintasa y la FPP sintasa (es decir, Wu et al., Redirection of cytosolic or plastidic isoprenoid precursors elevates terpene production in plants, Nature Biotechnology 24:1441-1447, 2006), (iii) manipular el huesped con una ruta MVA/MEP heterologa (es decir, Yu et al., Molecular cloning and functional characterization of a-humulene synthase, a possible key enzyme of zerumbone biosynthesis in shampoo giner (Zingiber zerumbet Smith), Planta 227:12911299, 2008), (iv) incrementar la expresion de HMGR, una etapa putativa limitadora de la velocidad en la ruta de MVA, (v) optimizar el flujo por la ruta MEP, es decir, la regulacion positiva de DXR en plantas de menta transgenicas resulto en un incremento de 50% del rendimiento de aceite esencial (Mahmoud y Croteau, Metabolic engineering of essential oil yield and composition in mint by altering expression of deoxyxylulose phosphate reductoisomerase and menthofuran synthase, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:8915-8920, 2001). Tambien podrfan utilizarse combinaciones de dichos enfoques, es decir, la coexpresion de los genes de la p-cariofileno sintasa y de la FPP sintasa, desviando simultaneamente el compartimiento subcelular de ambos enzimas. Ademas, la optimizacion del gen de la p- cariofileno sintasa para reflejar el sesgo en el uso de codones del huesped podrfa incrementar la produccion de p- cariofileno en algunos organismos.

Con el fin de expresar las secuencias de ADN de la presente invencion en un huesped, resulta necesario insertar los genes en un vector para introducirlos en el huesped. Pueden utilizarse cualquiera de entre diversos vectores conocidos, tales como pBIN19, pC2200, pROK o similares para las celulas vegetales (Nicotiana tabacura y Petunia hybrida), pC19, pET101 o similares para E. coli, y YEp13 o similares para levaduras.

Ademas, resulta necesario transcribir las secuencias de ADN de la presente invencion en el ARNm en el huesped. Con este fin puede utilizarse en la presente invencion una diversidad de promotores, tales como CaMV35S, NOS, TR1', TR2' (para plantas); lac, Tcr, Cat, trp (para E. coli); Tcr, CAT (para Zymomonas mobilis); ADH1, GAL7, PGK, TRP1 (para levaduras) y similares. En el caso de los huespedes procarioticos, resulta necesario introducir un sitio de union ribosomica (secuencia SD en E. coli) varios nucleotidos cadena arriba del codon de inicio (ATG).

La transformacion del huesped con el vector obtenido de esta manera puede llevarse a cabo mediante cualquier procedimiento apropiado, que se utiliza convencionalmente en los campos de la manipulacion genetica o de la biologfa celular. Pueden utilizarse como referencias publicaciones o revisiones apropiadas, por ejemplo para la transformacion de microorganismos, T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

Las condiciones de cultivo de los transformantes son esencialmente las mismas que las utilizadas comunmente para el huesped no transformado. Podrfa mejorarse el rendimiento de los cultivos microbianos en el caso de que se eliminase el p-cariofileno de los biorreactores, es decir, utilizando resinas de intercambio ionico o pervaporacion de cultivos microbianos o destilacion de hojas.

Se aplica p-cariofileno puro a una resina de PV que conserva y libera el compuesto qufmico. Esta resina se aplica directamente en arboles de cftricos en los huertos. Presenta la propiedad de liberar el compuesto durante un periodo de 3 a 4 meses. Los dispensadores de PVC-resina para los estudios de tasa de liberacion se preparan mezclando 40% en peso de copolfmero en emulsion de cloruro de vinilo/acetato de vinilo (Vinnol E5/65C, Wacker Chemicals Ltd., Reino Unido) con una mezcla 1:1 de los plastificadores Cereclor (S45, ICI Ltd., Reino Unido) y di-(2-etilh exi l )- ftalato (DEHP, Sigma Aldrich Ltd., Reino Unido). En los compuestos qufmicos de interes se incluye un antioxidante y el filtro de UV negro Waxoline (WB, ICI Ltd., Reino Unido), los cuales son anadidos al prepolfmero segun se requiera, tfpicamente 1% en peso de cada uno. Se mezcla el prepolfmero y se desgasifica en un evaporador rotatorio durante 1 h bajo vacfo; se vierte en un molde compuesto de dos placas de vidrio con espaciadores adecuados (0,1 cm) y se cura mediante calentamiento a 150°C durante 15 min. Las laminas de PVC resultantes se sacan de los moldes y se cortan en cuadrados de 1 cm.

Claims (11)

1. 5

   10

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   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para el controlar la Huanglongbing (HLB) en plantas de cftricos que comprende expresar por lo menos un gen aislado que codifica un polipeptido que presenta actividad de p-cariofileno sintasa y/o de a-copaeno sintasa en plantas de cftricos para producir p-cariofileno, a-copaeno adicionales o combinaciones de los mismos con el fin de repeler los insectos psflidos Diaphorina citri y/o Tryoza erytrae para controlar la HLB.
2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicho por lo menos un gen aislado presenta una o mas mutaciones en comparacion con su forma natural, en el que el polipeptido codificado por dicho por lo menos un gen aislado conserva la actividad de p-cariofileno sintasa y/o de a-copaeno sintasa.
3. 3. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que la expresion de dicho por lo menos un gen aislado esta conducida por las regiones promotoras y de terminacion constitutivas.
4. 4. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que la expresion de dicho por lo menos un gen aislado esta conducida por una region reguladora heterologa que proporciona una expresion constitutiva fuerte, especffica de tejido o inducible.
5. 5. Procedimiento segun la reivindicacion 4, en el que la region reguladora heterologa proporciona una expresion fuerte en el citosol, los cloroplastos o las mitocondrias.
6. 6. Procedimiento segun la reivindicacion 1, que comprende ademas expresar un gen que codifica una farnesil pirofosfato sintasa para aumentar la acumulacion del p-cariofileno, a-copaeno o combinaciones de los mismos producidos por el polipeptido que presenta actividad de p-cariofileno sintasa y/o a-copaeno sintasa.
7. 7. Procedimiento para controlar la enfermedad Huanglongbing (HLB) de las plantas de cftricos que comprende aplicar p-cariofileno, a-copaeno purificados, o combinaciones de los mismos, que repele los insectos psflidos Diaphorina citri y/o Tryoza erytrae, a plantas de cftricos para controlar la enfermedad HLB de las plantas de cftricos.
8. 8. Procedimiento segun la reivindicacion 7, en el que el p-cariofileno, el a-copaeno purificados, o combinaciones de los mismos se purifican a partir de un organismo seleccionado de entre el grupo que consiste en plantas, bacterias y levaduras, o sus contrapartes modificadas geneticamente que pueden sobreproducir p-cariofileno, a-copaeno o combinaciones de los mismos.
9. 9. Procedimiento segun la reivindicacion 8, en el que el p-cariofileno, el a-copaeno purificados, o combinaciones de los mismos se purifican a partir de la planta de la guayaba.
10. 10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, en el que el p-cariofileno, el a-copaeno purificados, o combinaciones de los mismos se purifican a partir de extractos de hojas, frutos o tallos de la planta de la guayaba.
11. 11. Procedimiento segun la reivindicacion 7, en el que el p-cariofileno, a-copaeno purificados, o combinaciones de los mismos se aplican a las plantas de cftricos mediante sistemas de administracion lenta.