WO1995015332A1

WO1995015332A1 - Membrangängiger wirkstoff zur störung der dna-biosynthese

Info

Publication number: WO1995015332A1
Application number: PCT/EP1994/003969
Authority: WO
Inventors: Michael Zeppezauer; Petra Zalud; Wolfgang Oliver Wachs; Per Olaf Nyman
Original assignee: Michael Zeppezauer; Petra Zalud; Wolfgang Oliver Wachs; Per Olaf Nyman
Priority date: 1993-12-02
Filing date: 1994-11-30
Publication date: 1995-06-08
Also published as: DE4341161A1

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Wirkstoff, der dem dUTP in seinen Wechselwirkungen mit dem Enzym dUTPase im wesentlichen wirkungsgleich ist.

Description

MEMBRANGÄNGIGER WIRKSTOFF ZUR STÖRUNG DER

DNA-BIOSYNTHESE

Dos Wachstum von schnell proliferierenden Zellen, vor allem Krebszellen, läßt sich durch gezielte Störung des Stoffwechsels der Nukleinsäuren hemmen. Solche Störungen lassen sich durch verschiedene Wirkstoffe erzielen. Hierzu gehören Alkylantien, welche durch chemische Modifizierung von Nukleinsäuren, deren Struktur und Funktion zu stören vermögen. Mit bestimmten Antibiotika, die sich in die DNA-Struktur einlagern lassen (Interkalation), kann die Informationsübertragung DNA→RNA→Protein gestört werden. Antimetabolite der Nukleinsäurebiosynthese, deren Molekülstruktur derjenigen von Zwischenstufen im Aufbau von Nukleinsäuren ähneln, können spezifische Synthese-schritte durch Konkurrenz mit den biologischen Zwischenstufen blockieren.

Zu den im klinischen Einsatz befindlichen Antimetaboliten gehören Methotrexat (MTX), 5-Fluoruracil, 6-Mercaptopurin und Cytosin-Arabinosid, die erhebliche Nebenwirkungen aufweisen.

Die mit den genannten Cytostatika beabsichtigten Störungen des DNA-Stoffwechsels führen grundsätzlich auch zur Schädigung von gesunden Zellen. Das gilt besonders für schnell proliferierende Zellen, weswegen diese Cytostatika vor allem schnell proliferierende normale Wechselgewebe (Knochenmarkzellen, Zellen des Gastrointestinaltraktes und die Zellen der Haarfollikel) schädigen. Außerdem treten Leberschädigungen auf.

Nachteilig ist auch, daß die bekannten Antimetabolite, wie z.B. MTX als Folsäureantagonist häufig nicht nur einen bestimmten Stoffwechselschritt der NukleinsäureBiosynthese, sondern gleich mehrere Stoffwechselschritte stören. Dadurch kann nicht nur die DNA-Biosynthese blockiert werden, sondern andere, zusätzliche Stoffwechselwege können gestört werden, die bei nichtproliferierenden Zellen relativ stärker betroffen sind, so daß die Selektivität des verabreichten Wirkstoffes weiter herabgesetzt ist.

Selbst bei relativ guter Wirksamkeit der verabreichten Cytostatika können sich nach längerer Behandlung gegen das verabreichte Cytostatikum resistante Krebszellen ausbilden. Die Resistenz kann verschiedenartige biologische Ursachen haben, z.B. erhöhte Biosynthese der blockierten Enzyme, Mutation der Zielenzyme mit der Folge einer Unempfindlichkeit gegen das verabreichte Cytostatikum oder gesteigerte Biosynthese eines Transportsystems, z.B. Glykoprotein P, wodurch das Cytostatikum aus der Zelle entfernt wird Es sind bereits Maßnahmen zur Verringerung der Nebenwirkungen der betreffenden Cytostatika und der Resistenzbildung der behandelten Krebszellen vorgeschlagen worden. Zu diesen Maßnahmen gehören die kombinierte Verabreichung von mehreren verschiedenen Antimetaboliten oder die Vergabe von Antimetaboliten in Kombination mit Alkylantien und Antibiotika. Dabei können diese Kombinationen synergistisch wirken, so daß sie zur Erniedrigung der verabreichten Gesamtdosis führen können. Diese Wege zur Verringerung der Nebenwirkungen der Antimetaboliten werden jedoch allgemein nicht als ausreichend angesehen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen neuen Wirkstoff anzugeben, der selektiv nur einen bestimmten Stoffwechselschritt der DNA-Biosynthese zu stören vermag, ohne dabei gleichzeitig weitere Stoffwechselschritte zu stören, die auch bei nichtproliferierenden Zellen betroffen wären.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß mit den Merkmalen des

Anspruches 1 gelöst. Vorteilhafte Ausführungen nach der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Unteransprüche.

Die Erfindung umfaßt damit Wirkstoffe, die gegen das

Enzym Desoxyuridintriphosphat-Hydrolase (dUTPase) gerichtet sind. Das Enzym dUTPase kommt bekanntlich in den Zellen aller Lebewesen vor. Animalische Viren, wie Herpes-simplex-Virus sowie Retroviren, z.B EIAV (equine infective anemia virus) oder MMTV (mouse mammary tumor virus) kodieren für eine eigene dUTPase. Escherichia coliZellen sind nicht lebensfähig, wenn das Enzym mutiert wird. Das Enzym hydrolysiert Desoxyuridintriphosphat (dUTP) zu Desoxyuridinmonophosphat (dUMP) und anorganischem Pyrophosphat (PP_i) nach der Gleichung (1) dUTP + H₂O → dUMP + PP_i (G1)

Mit der Katalyse dieser Reaktion erfüllt das Enzym eine doppelte Funktion:

(i) Es gewährleistet die Bereitstellung der für eine Zelle erforderliche ausreichende Menge von dUMP. Diese ist notwendiges Substrat für das Enzym Thymidylatsynthetase, welches den für die DNA-Synthese unerläßlichen Baustein (Metabolit) Desoxythymidinmonophosphat (dTMP) herstellt;

(ii) Es gewährleistet in der Zelle die Einstellung eines niedrigen Konzentrationsverhältnisses dUTP:dUMP, bei dem die Konzentration von dUTP kleiner als die von dUMP ist. Gelingt dies nicht, dann wird statt Thymin Uracil durch den dann reichlich zur Verfügung stehenden Baustein dUTP in die DNA eingebaut. Das fälschlich eingebaute Uracil wird durch die Reparaturenzyme der Zelle erkannt. Diese zerschneiden die DNA in solche Einzelfragmente, die sich. nicht vollständig korrigieren und zusammenfügen lassen. Fs kommt dann zum Zelltod.

Diese biologische Funktion ist durch mehrere Beobachtungen belegt. Es ist daher zu erwarten, daß eine Beeinflussung der katalytischen Reaktion des Enzyms dUTP-Hydrolase gemäß der vorstehenden Gleichung (Gl) zum Zelltod führt und daß vor allem Krebszellen oder von Viren befallene Zellen davon deutlich stärker betroffen sein werden als normale gesunde Zellen.

Mit anderen Worten liegt der Erfindung damit der Gedanke zugrunde, das intrazelluläre duTP:dUMP-Gleichgewicht durch Hemmung des Enzyms dUTPasen vor allem bei proliferierenden Zellen (insbesondere Melanomen, Lymphomen und Gliomen), bei virusinfizierten Zellen (insbesondere mit Herpes simplex Virus und Retroviren infizierte Zellen) und bei Autoimmunkrankheiten mit gesteigerter Zeilproliferation (insbesondere therapieresistenter Psoriasis, Psoriasis-Arthritis und rheumatoider Arthritis) zu stören und damit den vermehrten Einbau von Uracil in die DNA zu unterstützen. Nachstehend werden die Strukturen einiger erfindungsgemäßer Wirkstoffe aufgezeigt, die die dUTP-Hydrolyse des dUTPase-Enzyms nach der erfinclungsgemäßen Lehre hemmen bzw. zu stören vermögen. Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe werden aus dem Substratmolekül dUTP abgeleitet, wobei die Bindung des veränderten Moleküls an das aktive Zentrum des Enzyms gewährleistet bleiben soll, die Hydrolyse der -P-O-P-Bindung zwischen der α- und der ß-ständigen Phosphatgruppe aber verlangsamt oder verhindert wird. Dabei zeichnen sich die erfindungsgemäßen Wirkstoffe vorzugsweise dadurch aus, daß sie dem dUTP in seinen Wechselwirkungen mit dem Enzym dUTPase weitgehend wirkungsgleich sind.

Die Struktur der erfindungsgemäßen Wirkstoffe ist so beschaffen, daß sie auf geeignete Weise in die betreffende Zelle gelangen bzw. auf geeignete Weise in die Zelle transportiert werden können.

Die Strukturformel des dUTP in der Säureform ist nachstehend in der Formel F1 wiedergegeben:

wobei in der wäßrigen Lösung die OH-Gruppen der Phosphatgruppen weitgehend ionisiert sind. Bestimmte Positionen des Moleküls sind mit 1-34, 1'-6' bzw. α, ß und gekennzeichnet.

Zur Hemmung der Hydrolyse des dUTP können erfindungsgemäß die P-O-P-Bindung der Phosphatgruppen α und ß in der Position 24 und/oder die P=O-Gruppen der Phosphatgruppen α und ß in den Positionen 21 und 25 gemäß F2

in einer Weise geändert werden, daß ihre hydrolytische Spaltung zu 2'-Deoxyuridinmonophosphat und an-organischen Pyrophosphat verhindert bzw. erschwert wird.

Dies kann nach der Erfindung z.B. dadurch erreicht werden, daß das Sauerstoffatom in der Position 24 durch eine der beiden Gruppen oder

ersetzt wird, wobei R, R¹ und R² ein organischer Rest oder das Wasserstoffatom sein können.

Beispielsweise kann die Verknüpfung der α - und ß- ständigen Phosphatgruppen erfindungsgemäß wie folgt geändert werden:

oder

oder

Ein weiterer Weg zur Hemmung der Hydrolyse des dUTP kann erfindungsgemäß auf die Weise erreicht werden, daß die Sauerstoffatome in den Positionen 21 und/oder 25 und/oder 29 z.B. durch Schwefel ersetzt sind, wie die nachfolgenden modifizierten Triphosphat-Gruppen zeigen:

Wie gesagt, kann der erste Weg (Ersatz des Sauerstoffatomes in der Position 24) mit dem zweiten Weg (Ersatz des Sauerstoffatoms in wenigstens einer der Positionen 21, 25 und 29) kombiniert sein.

Die Hemmung der Hydrolyse des dUTP kann erfindungsgemäß auch dadurch erreicht werden, daß das dUTP wie folgt modifiziert wird.

(a) Ersatz der

-ständigen Phosphatgruppe in (F1) mit den Atomen 29 bis 33 durch Wasserstoff; (b) Ersatz der OH-Gruppe 16 und/oder 17 durch Wasserstoff;

(c) Ersatz des 2'-Desoxyribose-Restes durch Arabinose;

(d) Ersatz wenigstens eines der Atome 8, 10 bis 15, 17 bis 19 und 34 in (F1) durch einen Stoff ausgewählt aus der Stoffgruppe Fluor und einem Alkylrest; (e) Ersatz der Atome 5 und/oder 6 in (F1) durch Stickstoff;

(f) Ersatz der Triphosphatgruppe in (F1) durch einen Stoff, der eine ähnliche räumliche Ausdehnung, Polarität und Ladung aufweist und damit dem dUTP; in seiner Wechselwirkung mit dem Enzym dUTPase, weitgehend wirkungsgleich ist.

(g) Ersatz wengistens einer der Atomgruppen 22, 23 und 26, 27 und 30, 31 in (F1) durch S-R, wobei S für

Schwefel und R für einen organischen Rest steht.

Von den vorstehenden Modifizierungen kann wenigstens eine ausgewählt sein.

Die neuen Verbindungstypen, wie sie lediglich für Beispiele in den Formeln (F5) bis (F9) angegeben sind, werden besonders leicht membrangängig (erleichterte Aufnahme durch die Zellmembran), wenn geeignete chemische Gruppen so an das Molekül geheftet werden, daß damit die Bindung an das Enzym nicht/oder nicht wesentlich beeinträchtigt wird. Für die kovalente Anheftung solcher Gruppen bieten sich in (F1) erfindungsgemäß besonders wenigstens eine der Positionen oder Positionspaare (16 und 17); 17; (22 und 23), 23; (26 und 27); 27; (30 und 31); 31; (32 und 33) und 33 an.

Erfindungsgemäß sind als geeignete Gruppen alle lipophilen Gruppen anzusehen, welche die Membrangängigkeit verbessern und ausreichend biokompatibel sind (d.h. bei einer eventuellen hydrolytischen Abspaltung metabolisiert werden und/oder keine schädigenden Einflüsse auf andere Komponenten des Organismus ausüben). Zum Beispiel kann es sich erfindungsgemäß um folgende Gruppen handeln:

Alkylreste, insbesondere Hexadecyl und Octadecyl, ungesättigte Alkylreste und deren Derivate;

╌ Phenyl- und Phenylalkylreste, z.B. Benzylreste;

╌ Alkylreste membranabhängiger Alkohole, z.B. Retinol, Dolichol, Pantothenol;

╌ Mono- und Diacylglycerolyl.

Es kann sich aber auch um eine Vielzahl vergleichbarerer Moleküle handeln, die selbst Membranbestandteile bilden oder für den Fachmann als membrangängig bekannt oder erkennbar sind.

So werden die vorstehenden neuen Verbindungstypen besonders leicht membrangängig, wenn die terminale Phosphatgruppe über eine OH-Gruppe des erfindungsgemäßen Wirkstoffes mit einer lipophilen Gruppe R in der Position 31 und/oder 33 von (F1) verestert wird. Als lipophiler Rest eignen sich z.B. die bei der Synthese der neuen Verbindungstypen als Schutzgruppen eingesetzten Benzylgruppen

Erfindungsgemäße Wirkstoffe können vorteilhafterweise eine Struktur entsprechend F1 aufweisen, wobei die Wasserstoffatome 31 und/oder 33 durch einen lipophilen Rest ersetzt sind und die Spaltung des dUTP verhindert wird, indem nach F1 die Position 21 durch Schwefel und/oder die Position 24 durch CH₂ oder NH oder N-CH₃ eingenommen wird. Diese erfindungsgemäß z.B. vorgeschlagene Blockade der dUTP-Spaltung führt schließlich zum Zelltod.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können vor allem zur Krebstherapie (insbesondere bei Melanomen, Lymphomen und Gliomen) zur Therapie von Autoimmunkrankheiten (insbesondere bei therapieresistenter Psoriasis, Psoriasis-Arthritis und rheumatoider Arthritis) und zur Therapie von Virus-Erkrankungen (insbesondere bei Infektionen mit Herpes Simplex Virus und Retrovieren) dienen.

Nachstehend werden die Synthese der erfindungsgemäßen Wirkstoffe 2'-Desoxyuridin-5'-[(α,ß-methylendiphosphat)-monobenzyl-phosphat] nach (F5) und (F10), 2'-Desoxyuridin-5'-(α,ß-methylentriphosphat) nach (F5) und 2'-Desoxyuridin-5'-O-(1-thiotriphosphat) nach (F8) in mehreren aufeinanderfolgenden Schritten zur Überprüfung der Hydrolyse durch dUTPase aus E.coli sowie des inhibitorischen Einflusses auf das Enzym aufgezeigt: Svnthese von 2'-Desoxyuridin-5'-(α, β-methylentriphosphat.

1. Synthese von 5'-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-desoxyuridin

1 g 2'-Desoxyuridin in Pyridin und 1,8 g (4,4'-Dimethoxytrityl)-Chlorid werden 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Man gibt Wasser zu und extrahiert die wässrige Phase mit Ethylacetat. Die organische Phase wird nacheinander mit NaHCO₃-Lösung, Wasser und NaCl-Lösung gewaschen. Nach Entfernen des Lösungsmittels löst man in Chloroform, gibt das Produkt über eine Kieselgel 60-Säule und chromatographiert stufenweise mit Chloroform-Methanol-Gemischen.

2. Synthese von 3'-Methoxyacetyl-5' - ( 4 ,4'-Dimethoxytrityl)-2'-desoxyuridin 2,1 g 5'-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-desoxyuridin und 3,43 ml Methoxyessigsäureanhydrid läßt man in Pyridin bei Raumtemperatur reagieren. Man rotiert das Lösungsmittel und Reste des Axylierungsmittels ab. 3.. Synthese von 3'-Methoxyacetyl-2'-desoxyuridin

Das unter 2. beschriebene Produkt wird ohne Reinigung weiter verwendet. Man löst es in 1 % Trifluoressigsäure in Dichlorroethan, und extrahiert nach 15 min die organische Phase mit einer Lösung von 0,1 % Trifluoressigsäure in Wasser. Nach Lyophilisierung erhält man das Produkt. 4. Synthese von 3'-Methoxyacetyl-2'-desoxyuridin-5'- (α,ß-methylendisphophat)

Eine Mischung aus lg 3'-Methoxyacetyl-2'-desoxyuridin, 2,688g Methylendiphosphonsäure und 12,6g N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid wird in einem Gemisch aus Pyridin und Tributylamin bei 50°C reagieren gelassen. Das Filtrat wird zu einem kleinen Volumen eingeengt, welches mit Wasser versetzt und mit Diethylether gewaschen wird. Die das Produkt enthaltende Phase wird evaporiert.

4.1 Reinigung von 3'-Methoxyacetyl-2'-desoxyuridin-5'-(α,ß-methylendiphosphat) Das Produkt wird in Startpuffer (0,01 M Triethylammoniumhydrogencarbonatpuffer (TEAB), pH 7,0) aufgenommen und chromatographisch mittels DEAE-Sephadex A-50 gereinigt. Die Chromatographie erfolgt mit einem Gradienten aus 0,01 M TEAB pH 7,0 zu steigendem TEAB-Gehalt des gleichen pH. Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und im Rotationsverdampfer eingeengt.

5. Synthese von 3'-Methoxyacetyl-2'-desoxyuridin-5'-[(α,ß-methylendiphosphat)-dibenzylphosphat)]

12,45 g N-Chlorsuccinimid, und 8,816 ml Dibenzylphosphit werden in Toluol reagieren gelassen. Das Filtrat wird zu 0,5 g 3'-Methoxyacetyl-2'-desoxyuridin-5'-( α,ß-methylendiphosphat) in einem Gemisch aus Pyridin und Tributylamin gegeben und läßt man bei 40°C reagieren. Anschließend rotiert man zur Trockene ein. 6. Synthese von 2'-Desoxyuridin-5'-[(α,ß-methylendiphosphat)-dibenzylphosphat]

Das unter 5. erhaltene Produkt wird mit einer Mischung aus Methanol, konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung und Wasser die Methoxyacetylgruppe abgespalten. Man rotiert zur Trockene ein, nimmt es in Wasser auf und extrahiert mit Diethylether. Das Lösungsmittel wird abgezogen. 7. Synthese von 2'-Desoxyuridin-5'-[(α,ß-methylendiphosphat)-monobenzylphosphat] und 2'-Desoxyuridin-5'-(α,ß-methylentriphosphat)

Die Hälfte des unter 6. erhaltenen Produktes wird in Methanol gelöst. Dazu gibt man Ammoniumformiat, 5% Palladium auf Aktivkohle und rührt 90 min bei Raumtemperatur.

Man trennt die Aktivkohle ab, rotiert zur Trockne ein, gibt Wasser zu und extrahiert mit Diethylether. Die das Produkt enthaltende Phase wird evaporiert. Man erhält 2'-Desoxyuridin-5'-[(α,ß-methylendiphosphat)-moncbenzylphosphat]. Führt man die Hydrogenolyse 5h lang anstatt 90 min lang durch, so erhält man 2'-Desoxyuridin-5'-(α ,ß-methylentriphosphat).

7.1 Reinigung von 2'-Desoxyuridin-5'-[(α,ß-methylendiphosphat)-monobenzylphosphatl und 2'-Desoxyuridin-5'-(α,ß-methylentriphosphat)

Das unter 7. gewonnene Produkt wird in Startpuffer

(0,01 M TEAB, pH 7,0) aufgenommen und chromatographisch mittels DEAE-Sephadex A-50 gereinigt. Die Elution erfolgt mit einem linearen Gradienten von 0,01 M TEAB pH 7,0 zu steigenden TEAB-Gehalt des gleichen pH. Die Absorption des Produktes wird durch stark absorbierendes, bräunliches Nebenprodukt überdeckt. Fraktionen werden in Abständen gesammelt und im Rotationsverdampfer eingeengt und dann auf Hydrolyse durch dUTPase aus E. coli sowie ihren inhibitorischen Einfluß auf das Enzym überprüft. Fraktionen, die inhibitorisch auf die Enzymaktivität wirken, werden weiter aufgereinigt.

Die weitere Aufreinigung erfolgt chromatographisch mittels DEAE-Sephadex A-50 mit einem linearen Gradienten aus 0,01 M Ammoniumformiat zu steigendem Ammoniumformiatgehalt. Die eluierten Syntheseprodukte werden wie oben beschrieben auf Hydrolyse und Enzyminhibition getestet und die entsprechenden Fraktionen einrotiert.

Die Entsalzung des Syntheseproduktes erfolgt mittels DEAE-Sephadex A-50.

Das Produkt wird auf die mit 0.01 M TEAB pH 7,0 equilibrierte Säule aufgegeben und die Salze mit dem gleichen Puffer ausgewaschen. Die Elution des Produktes erfolgt mit TEAB pH 7,0 höheren Gehalts. Das gereinigte und entsalzte Syntheseprodukt wird einrotiert und lyophilisiert.

Synthese des erfindungsgemäßen Wirkstoffes 2'-Desoxyuridin-5'-O-(1-thiotriphosphat) gemäß (F8)

30 mg 3'-Methoxyacetyl-2'-desoxyuridin werden in Pyridin gelöst und im Reaktionsgefäß zur Trockene eingedampft. 55 μl einer IM Lösung von 2-Chlor-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on in Dioxan werden zur Lösung des Nucleosids gegeben. Nach 10 min wird eine Mischung aus 27,3 g Tributylammoniumpyrophosphat in DMF und Tributylamin zugegeben. Nach 10 min wird eine Schwefelsuspension (3,2 mg. Schwefel in DMF) zugegeben. Nach 10 min wird Wasser zugegeben.

Nach 30 min wird die Reaktionsmischung zur Trockene eingedampft und der Rückstand in konzentriertem Ammoniak gelöst und reagieren gelassen, um die Methoxyacetylgruppe zu entfernen. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene einrotiert, in Wasser gelöst und auf die Säule appliziert.

Säule: DEAE-Sephadex A-50,

Es wird ein Gradient von 0,4 M Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (TEAB) pH 7,0 zu steigendem TEAB-Gehalt des gleichen pH benutzt.

Die Fraktionen, die das Produkt enthalten, werden kombiniert und zur Trockene einrotiert. Nachstehend wird die Hemmwirkung des erfindungsgemäßen Wirkstoffes 2'-Desoxyuridin-5'-[( α ,ß-methylendiphosphat)-monobenzylphosphat] auf gereinigte dUTPase von E. coli nachgewiesen, der nachstehend mit F71-90 bezeichnet ist.

Die Untersuchungen wurden mit einer gereinigten Fraktion 71-90 durchgeführt, wie sie vorstehend gewonnen wurde. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in einem Diagramm zusammengefaßt, das Fig. 1 wiedergegeben ist. Hier ist die doppelt reziproke Auftragung der durch E. coli dUTPase katalysierten Hydrolysegeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Substratkonzentration ohne und mit Zugabe der Fraktion 71-90 kenntlich gemacht. Das Diagramm zeigt dabei das kompetitive Verhalten des natürlichen Substrats dUTP und F71-90.

Die dUTPase-Aktivität wurde unter Standard-Assay-Bedingungen (pH 8,0; 50 μM MgSO₄ in 1 mM Phenolrot bei, 25°C gemessen. Zu 50 nM dUTPase wurden 50 μM ▼ , 70 μM □ der Fraktion 71-90 hinzugefügt und mit dUTPase o ohne Zusatz der Fraktion 71-90 verglichen. Die Reaktionen wurden mit dUTP gestartet und 60 s lang beobachtet.

Die Hemmkonstante der beobachteten Hemmung wurde zu 0,3± 0,02 μM bestimmt. Dies zeigt, daß der erfindungsgemäße Hemmstoff vergleichbar gut an das Enzym bindet wie das natürliche Substrat dUTP.

Zur Ermittlung des Einflusses von erfindungsgemäßen dUTPase-Wirkstoffen auf das Zellwachstum von bestimmten Krebszellen wurden folgende allgemeine Arbeitsbedingungen angewendet:

Der Einfluß von erfindungsgemäßen dUTPase-Wirkstoffen auf das Wachstum von bestimmten Krebszellen im Vergleich zu seiner Wirkung auf das Wachstum von humanen Fibroblasten wurde in vitro untersucht.

Das Zellwachstum wurde in Zellkultur-Mikrotestplatten mit Hilfe der MTT-Test-Methode bestimmt. Zellen der Zellinien EG 463 (malignes Melanom), OH 77 (malignes Lymphom) und U373 (Gliom), wurden im Vergleich zu humanen Fibroblasten unter Standardbedingungen in McCoy's Medium (mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS) , 1% Glutamin, 1,2 % Penicillin/Streptomycin), pH 7,2 bei 37°C, 5,5 % CO₂ und 95 % relativer Luftfeuchtigkeit kultiviert. In jeweils vier Parallelansätzen wurde den Medien die Fraktion 71-90 in Konzentrationen zwischen 0,01 μg/ml und 20 μg/ml zugesetzt. Kontrollmedien sowie Medien für die Testansätze enthielten kein Penicillin bzw. Streptomycin.

Die Zellzahlbestimmung der Kontrollen mit Standardmedium erfolgte 1 Tag nach dem Ausplattieren der Zellen in die Testplatten und wird als K_o (d.h. Zellzahl zum Zeitpunkt Null) dargestellt. Gleichzeitig wurde den Testansätzen sterilfiltrierter, in Medium gelöster Wirkstoff zugegeben. Die Inkubationsdauer betrug 3 bis 48 h. Das zellbiologische Arbeiten erfolgte unter sterilen Bedingungen. Die Zellzahl der Kontrollen wurde nach t Stunden als K_t, die der Testansätze als T_t bestimmt.

Die Darstellung der Wirkung der Hemmstoffe auf das Zellwachstum erfolgt als relative Wachstumsrate der Kontrollen und der Testansätze, wobei die Wachstumsraten der Kontrollen vom Zeitpunkt Null bis t Stunden als 100% zugrundegelegt wird.

In weiteren Versuchen wird die cytostatische bzw. cytotoxische Wirkung erfindungsgemäßer Wirkstoffe auf menschliche Krebszellen in vitro untersucht. Die Ergebnisse sind in Diagrammen zusammengefaßt, die in den nachstehenden Figuren wiedergegeben sind. Hierin zeigt:

Fig. 2 den Einfluß des erfindungsgemäßen Wirkstoffes

71-90 und von Methotrexat auf das Zellwachstum von OH 77 und EG 463;

Fig. 3.1 den Einfluß des Wirkstoffes 71-90 auf das

Zellwachstum von EG 463;

Fig. 3.2 den Einfluß des Wirkstoffes 71-90 auf das

Zellwachstum von OH 77,

Fig. 3.3 den Einfluß des Wirkstoffes 71-90 auf das und 3.4 Zellwachstum von OH 77 und EG 463 im Vergleich zu humanen Fibroblasten;

Fig. 4.1 den Einfluß des Wirkstoffes 71-90 auf das

Zellwachstum von EG 463 in Abhängigkeit von der Inkubationszeit;

Fig. 4.2 den Einfluß des Wirkstoffes 71-90 auf das

Zellwachstum von U 373 in Abhängigkeit von der Inkubationszeit, und

Fig. 5 die Einflüsse der erfindungsgemäßen Wirkstoffe

71-90, 14-17, αSdUTP (abgekürzt αS), dUTP auf das Zellwachstum von U 373 und ES 463.

Der erfindungsgemäße Wirkstoff 71-90, d.h. 2'-Desoxyuridin-5'-[(α,ß-methylendiphosphat)-monobenzylphosphat] ist vorstehend durch (F5) und (F10) gekennzeichnet. Der erfindungsgemäße Wirkstoff 14-17, d.h. 2'-Desoxyuridin- 5'-(α,ß-methylentriphosphat) ist vorstehend durch (F5) gekennzeichnet und dUTP ist als erfindungsgemäßer Wirkstoff in der Konzentration 5 μg/ml (dUTP5) und 10 μg/ml (dUTP 10) verwendet. Der erfindungsgemäße Wirkstoff SdUTP, d.h. 2'-Desoxyuridin-5'-O-(1-thiotriphosphat) ist vorstehend durch (F8) gekennzeichnet.

In Figur 2 erfolgte die Inkubation der Zellen unter Standardbedingungen. Die Testansätze enthielten verschiedene Konzentrationen der Wirkstoffe F71-90 (I) und Methotrexat (MTX).

Fig. 2 zeigt, daß die 48-stündige Inkubation der Zellen OH 77 und EG 463 mit dem Wirkstoff I (F71-90) in der Konzentration 1 μg/ml bei Zellen beider Zellinien bereits zu einer Wachstumshemmung im Vergleich zur unter Standardbedingungen kultivierten Kontrolle K48 führt. Signifikant wurde das Zellwachstum bei einer Wirkstoffkonzentration von 10 μg/ml gehemmt. Deutlich cytotoxisch auf das Wachstum der Zellen wirken 20 μg/ml des Wirkstoffes. Der Vergleich mit dem bekannten Chemotherapeutikum Methotrexat (MTX) verdeutlicht die Effektivität von F71-90, sowie ihre synergistische Wirkungsweise mit MTX bei kombiniertem Einsatz. MTX/I zeigt die Kombination von MTX mit 20 μg/ml und F71-90 mit 1 μg/ml.

In den Fig. 3.1 und 3.2 ist die Abhängigkeit der relativen Wachstumsrate von Zellen der Zellinien EG 463 (Fig. 3.1) und OH 77 (Fig. 3.2) von der eingesetzten Konzentration an dem Wirkstoff F71-90 im Vergleich zu unter Standardbedingungen kultivierten Kontrollen K48 dargestellt. In Konzentrationen von 0,1 μg/ml und 1,0 μg/ml wird bereits bei Zellen beider Zellinien eine Hemmung des Wachstums erreicht, deutlich cytotoxische Wirkung hat der Wirkstoff F71-90 in Konzentrationen ab 5,0 μg/ml. Ein Vergleich der relativen Zellzahlen des Wirkstoffes F71-90 gegenüber den Zellinien OH 77, EG 463 und humanen Fibroblasten zeigt in Fig. 3.3 den selektiven Einfluß des Wirkstoffes nach 48-stündiger Inkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen bezüglich schnell proliferierenden Zellen. Die relativen Zellzahlen wurden mittels der MTT-Testmethode bestimmt.

Signifikant zeigte sich die Selektivität bei einer Konzentration von 10 μg/ml F71-90 (Fig. 3.4). Zieht man die unterschiedlichen Wachstumsgeschwindigkeiten der Zellen in Betracht, entspricht die Zellzahl nach 48 h bei humanen Fibroblasten nur 23 %, bei OH 77 nur 68 % der Zellzahl von EG 463. Das bedeutet, daß das Verhältnis von Wirkstoffmenge zu Zellzahl bei humanen Fibroblasten höher als bei OH 77 und EG 463 ist und somit der in Fig. 3.3 dargestellte Effekt als entsprechend größer angesehen werden muß.

In den Fig. 4.1 und 4.2 ist die Abhängigkeit der relativen Wachstumsrate von Zellen der Zellinien EG 463 (Fig. 4.1) und U 373 (Fig. 4.2) von der Inkubationszeit mit dem Wirkstoff F71-90 dargestellt. Die Inkubation der Zellen erfolgte in vitro unter Standardbedingungen bzw. nach Zugabe von 71-90 (5 μg/ml).

Unabhängig von der Inkubationsdauer wurde das Wachstum der Zellen beider Zellinien im Vergleich zu unter Standardbedingungen kultivierten Kontrollen gehemmt. Nach 3-stündiger Inkubationszeit war die relative Hemmwirkung bei Behandlung mit 5 μg/ml F71-90 im Vergleich zur Kontrolle am größten (ausgedrückt als Cytotoxizitätsindex). Zeit Cytotoxizitätsindex

(h) EG 463 U 373

3 72. 83

8 44 54

24 37 59

48 52 46

Bei 8,24 und 48 h blieb die Verminderung der relativen Wachstumsrate im Bereich um 46% bis 59% (U 373), um 38 % bis 52 % (EG 463). Die Darstellung zeigt die Zeitabhängigksit der relativen Wachstumsrate. Die größte Verminderung der relativen Wachstumsrate erfolgte bereits nach 3-stündiger Inkubation der Zellen mit F71-90 (um 83 % bei U 373, bei 71 % bei EG 463) und macht die Effektivität und die Geschwindigkeit des Wirkmechanismus deutlich.

In Fig. 5 ist der Einfluß verschiedener erfindungsgemäßer Wirkstoffe und die relative Wachstumsrate von Zellen der Zellinien U 373 (Fig. 5.1) und EG 463 (Fig. 5.2) dargestellt.

Die Wirkstoffe 71-90, 14-17, αSdUTP ( αS) und dUTP wurden den Testmedien zugegeben und die relative Wachstumsrate nach 48 h im Vergleich zu der unter Standardbedingungen kultivierten Zellen ermittelt. Die Testansätze enthielten jeweils 5 μg/ml und bei dUTP10 10 μg/ml.

Jeder der getesteten Wirkstoffe führte zu einer Reduktion der Wachstumsrate, sowohl bei EG 463, als auch bei U 373. F71-90 hemmte jeweils am effektivsten das Zellwachstum auf 36 % (EG 463) bzw. 50 % (U 737) im Vergleich zu je 100 % der Kontrollen. Unterschiedliche Wirkungen zeigte die Inkubation der Zellen mit SdUTP, die bei U 373 zu einer Wachstumsreduktion auf 56 %, bei EG 463 auf nur 82 % führte. Eine Konzentrationsverdoppelung von dUTP von 5,0. auf 10,0 μg/ml korreliert nicht mit einer stärkeren Verminderung der Wachstumsrate, die bei 67 % und 65 % (EG 463) bzw. 73 % und 80 % (U 373) liegt. Die relative Wachstumsrate der von 14-17 inkubierten Zellen liegt mit 72 % (EG 463) und 81 % (U 373) im Bereich deren die mit dUTP inkubiert sind.

Zur Therapie kann ein erfindungsgemäßer Wirkstoff bei einer Tagesdosis (high dose) in einer Menge bis zu 300 2

μg/m Körperoberfläche verwendet werden. Die

Vsrabreichungsformen können intravenös, intramuskulär und subkutan sein. Zur Injektion wird der erfindungsgemäße Wirkstoff in einem isotonischen Medium, vorzugsweise in einer physiologischen Kochsalzlösung verwendet.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können auch in Kombination mit anderen Cytostatika und/oder mit Histonen der Klassen H1, H2A und/oder H2B verabreicht werden.

Außerdem können auch zwei oder mehrere der erfindungsgemäßen Wirkstoffe in Kombination untereinander und/oder in Kombination mit anderen Cytostatika und/oder in Kombination mit Histonen der Klassen H1, H2A und/oder H2B verabreicht werden.

Claims

P A T E N T A N S P R U C H E

1. Wirkstoff, der dem dUTP in seinen Wechselwirkungen mit dem Enzym dUTPase im wesentlichen wirkungsgleich ist.

2. Wirkstoff nach Anspruch 1 zur Störung des intrazellulären Gleichgewichtes dUTP:dUMP durch Hemmung des Enzyms dUTPase.

3. Wirkstoff nach Anspruch 2 , dadurch gekennzeichnet, daß das Gleichgewicht zu Gunsten von dUTP gestört wird, so daß bei der DNA-Biosynthese vermehrt Uracil statt Thymin in die DNA eingebaut wird.

4. Wirkstoff nach Anspruch 2 und 3 zur Erhöhung der Konzentration von dUTP.

5. Wirkstoff nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch dUTP oder ein modifiziertes dUTP, das eine bei der DNA-Biosynthese vergleichbare Wirkungsweise wie das dUTP aufweist, aber eine gegenüber dem dUTP vergleichweise erhöhte Membrangängigkeit besitzt.

6. Wirkstoff nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die endständige OH-Gruppe oder das endständige Wasserstoffatom der -ständigen Phosphatgruppe des dUTP durch ein die Membrangängigkeit verbesserndes Atom oder Atomgruppe ersetzt ist.

7. Wirkstoff nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Hemmung der von dem Enzym dUTPase bewirkten dUTP-Hydrolyse nach der Gleichung dUTP + H₂O → dUMP + PP_i, wobei dUMP Desoxyuridinmonophosphat und PP^ ein anorganischss Phosphat ist.

8. Wirkstoff nach einem der vorstehenden Ansprüche, bestehend aus einem Substratmolekül dUTP, das derart verändert ist, daß die Hydrolyse der -P-O-P- Bindung zwischen der α - und ß-ständigen Phosphatgruppe gehemmt ist, die Bindung des veränderten Moleküls an das Enzym aber erhalten bleibt.

9. Wirkstoff nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Sauerstoff zwischen der α - und ß-ständigen Phosphatgruppe durch ein Atom oder eine Atomgruppe ersetzt ist, um die Spaltung des dUTP an dieser Stelle zu hemmen.

10. Wirkstoff nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Sauerstoff durch die Atomgruppe C-R¹R² ersetzt ist, wobei R¹ und R² ausgewählt sind aus den Stoffen Wasserstoff und organische Reste.

11. Wirkstoff nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Sauerstoff durch -CH₂- ersetzt ist.

12. Antimetabolite nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Sauerstoff durch die Atomgruppe

ersetzt ist, wobei R Wasserstoff oder ein Alkylrest ist.

13. Wirkstoff nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der alleinstehende, an Phosphor doppeltgebundene Sauerstoff der α-, und/oder ß-und/oder -ständigen Phosphatgruppe

durch Schwefel ersetzt ist.

14. Wirkstoff nach einem der vorstehenden

Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wasserstoff wenigstens der einen endständigen OH-Gruppe der -ständigen Phosphatgruppe durch eine Benzylgruppe ersetzt ist.

15. Wirkstoff nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das dUTP

modifiziert ist, indem wenigstens eine der nachstehenden Bedingungen ausgewählt ist

(a) Ersatz der -Phosphatgruppe mit den Atomen 29 bis

33 durch Wasserstoff;

(b) Ersatz der OH-Gruppe 16, 17 durch Wasserstoff;

(c) Ersatz des 2'-Desoxyribose-Restes durch Arabinose;

(d) Ersatz wenigstens eines der Atome 8, 10 bis 15; 17, 18, 19 und 34 durch einen Stoff, ausgewählt aus der

Stoffgruppe Fluor und einem Alkylrest;

(e) Ersatz der Atome 5 und/oder 6 durch Stickstoff; (f) Ersatz der Triphosphatgruppe in (F1) durch einen Stoff, der eine ähnliche räumliche Ausdehnung, Polarität und Ladung aufweist und damit dem dUTP in seiner Wechselwirkung mit dem Enzym dUTPase weitgehend wirkungsgleich ist;

(g) Ersatz wenigstens einer der OH-Gruppen 22, 23 und/oder 26, 27 und/oder 30, 31 durch die Gruppe S-R, wobei S für Schwefel und R für einen organischen Rest steht.

16. Wirkstoff nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er mit einem herkömmlichen Cytostatikum oder wenigstens einem Histon, ausgewählt aus der Gruppe H1, H2A, H2B kombiniert ist.

17. Wirkstoff nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Therapie von Krebserkrankungen (insbesondere Melanomen, Lyphomen, Gliomen), Viruserkrankungen (insbesondere mit Herpex-Simplex oder Retro-Viren infizierte Zellen) und Autoimmunerkrankungen mit gesteigerter Zeilproliferation (insbesondere therapieresistente Psoriasis, Psoriasis Arthritis und rheumatische Arthritis).