DE4341161A1 - Membrangängiger Wirkstoff zur Störung der DNA-Biosynthese - Google Patents
Membrangängiger Wirkstoff zur Störung der DNA-BiosyntheseInfo
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Description
Das Wachstum von schnell proliferierenden Zellen, vor
allem Krebszellen, läßt sich durch gezielte Störung des
Stoffwechsels der Nukleinsäuren hemmen. Solche Störungen
lassen sich durch verschiedene Wirkstoffe erzielen.
Hierzu gehören Alkylantien, welche durch chemische
Modifizierung von Nukleinsäuren, deren Struktur und
Funktion zu stören vermögen. Mit bestimmten Antibiotika,
die sich in die DNA-Struktur einlagern lassen
(Interkalation), kann die Informationsübertragung
DNA→RNA→Protein gestört werden. Antimetabolite der
Nukleinsäurebiosynthese, deren Molekülstruktur
derjenigen von Zwischenstufen im Aufbau von
Nukleinsäuren ähneln, können spezifische Synthese
schritte durch Konkurrenz mit den biologischen
Zwischenstufen blockieren.
Zu den im klinischen Einsatz befindlichen Antimeta
boliten gehören Methotrexat (MTX), 5-Fluoruracil,
6-Mercaptopurin und Cytosin-Arabinosid, die erhebliche
Nebenwirkungen aufweisen.
Die mit den genannten Cytostatika beabsichtigten
Störungen des DNA-Stoffwechsels führen grundsätzlich
auch zur Schädigung von gesunden Zellen. Das gilt
besonders für schnell proliferierende Zellen, weswegen
diese Cytostatika vor allem schnell proliferierende
normale Wechselgewebe (Knochenmarkzellen, Zellen des
Gastrointestinaltraktes und die Zellen der Haarfollikel)
schädigen. Außerdem treten Leberschädigungen auf.
Nachteilig ist auch, daß die bekannten Antimetabolite,
wie z. B. MTX als Folsäureantagonist häufig nicht nur
einen bestimmten Stoffwechselschritt der Nukleinsäure-
Biosynthese, sondern gleich mehrere Stoffwechselschritte
stören. Dadurch kann nicht nur die DNA-Biosynthese
blockiert werden, sondern andere, zusätzliche Stoff
wechselwege können gestört werden, die bei nicht
proliferierenden Zellen relativ stärker betroffen sind,
so daß die Selektivität des verabreichten Wirkstoffes
weiter herabgesetzt ist.
Selbst bei relativ guter Wirksamkeit der verabreichten
Cytostatika können sich nach längerer Behandlung gegen
das verabreichte Cytostatikum resistente Krebszellen
ausbilden. Die Resistenz kann verschiedenartige
biologische Ursachen haben, z. B. erhöhte Biosynthese der
blockierten Enzyme, Mutation der Zielenzyme mit der
Folge einer Unempfindlichkeit gegen das verabreichte
Cytostatikum oder gesteigerte Biosynthese eines
Transportsystems, z. B. Glykoprotein p, wodurch das
Cytostatikum aus der Zelle entfernt wird.
Es sind bereits Maßnahmen zur Verringerung der Neben
wirkungen der betreffenden Cytostatika und der
Resistenzbildung der behandelten Krebszellen vorge
schlagen worden. Zu diesen Maßnahmen gehören die
kombinierte Verabreichung von mehreren verschiedenen
Antimetaboliten oder die Vergabe von Antimetaboliten in
Kombination mit Alkylantien und Antibiotika. Dabei
können diese Kombinationen synergistisch wirken, so daß
sie zur Erniedrigung der verabreichten Gesamtdosis
führen können. Diese Wege zur Verringerung der Neben
wirkungen der Antimetaboliten werden jedoch allgemein
nicht als ausreichend angesehen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen
neuen Wirkstoff anzugeben, der selektiv nur einen
bestimmten Stoffwechselschritt der DNA-Biosynthese zu
stören vermag, ohne dabei gleichzeitig weitere
Stoffwechselschritte zu stören, die auch bei
nichtproliferierenden Zellen betroffen wären.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß mit den Merkmalen des
Anspruches 1 gelöst. Vorteilhafte Ausführungen nach der
Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Unteran
sprüche.
Die Erfindung umfaßt damit Wirkstoffe, die gegen das
Enzym Desoxyuridintriphosphat-Hydrolase (dUTPase) ge
richtet sind.
Das Enzym dUTPase kommt bekanntlich in den Zellen aller
Lebewesen vor. Animalische Viren, wie Herpes-simplex-
Virus sowie Retroviren, z. B. EIAV (equine infective
anemia virus) oder MMTV (mouse mammary tumor virus)
kodieren für eine eigene dUTPase. Escherichia coli-
Zellen sind nicht lebensfähig, wenn das Enzym mutiert
wird. Das Enzym hydrolysiert Desoxyuridintriphosphat
(dUTP) zu Desoxyuridinmonophosphat (dUMP) und
anorganischem Pyrophosphat (PPi) nach der Gleichung (1)
dUTP + H₂O → dUNP + PPi (G1)
Mit der Katalyse dieser Reaktion erfüllt das Enzym eine
doppelte Funktion:
- (i) Es gewährleistet die Bereitstellung der für eine Zelle erforderliche ausreichende Menge von dUMP. Diese ist notwendiges Substrat für das Enzym Thymidylatsynthetase, welches den für die DNA-Synthese unerläßlichen Baustein (Metabolit) Desoxythymidin monophosphat (dTMP) herstellt;
- (ii) Es gewährleistet in der Zelle die Einstellung eines niedrigen Konzentrationsverhältnisses dUTP: dUMP, bei dem die Konzentration von dUTP kleiner als die von dUMP ist. Gelingt dies nicht, dann wird statt Thymin Uracil durch den dann reichlich zur Verfügung stehenden Baustein dUTP in die DNA eingebaut. Das fälschlich eingebaute Uracil wird durch die Reparaturenzyme der Zelle erkannt. Diese zerschneiden die DNA in solche Einzelfragmente, die sich nicht vollständig korrigieren und zusammenfügen lassen. Es kommt dann zum Zelltod.
Diese biologische Funktion ist durch mehrere
Beobachtungen belegt. Es ist daher zu erwarten, daß eine
Beeinflussung der katalytischen Reaktion des Enzyms
dUTP-Hydrolase gemäß der vorstehenden Gleichung (G1)
zum Zelltod führt und daß vor allem Krebszellen oder von
Viren befallene Zellen davon deutlich stärker betroffen
sein werden als normale gesunde Zellen.
Mit anderen Worten liegt der Erfindung damit der Gedanke
zugrunde, das intrazelluläre duTp:dUMP-Gleichgewicht
durch Hemmung des Enzyms dUTPasen vor allem bei
proliferierenden Zellen (insbesondere Melanomen,
Lymphomen und Gliomen), bei virusinfizierten Zellen
(insbesondere mit Herpes simplex Virus und Retroviren
infizierte Zellen) und bei Autoimmunkrankheiten mit
gesteigerter Zellproliferation (insbesondere therapie
resistenter Psoriasis, Psoriasis-Arthritis und
rheumatoider Arthritis) zu stören und damit den
vermehrten Einbau von Uracil in die DNA zu unterstützen.
Nachstehend werden die Strukturen einiger
erfindungsgemäßer Wirkstoffe aufgezeigt, die die dUTP-
Hydrolyse des dUTPase-Enzyms nach der erfindungsgemäßen
Lehre hemmen bzw. zu stören vermögen.
Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe werden aus dem
Substratmolekül dUTP abgeleitet, wobei die Bindung des
veränderten Moleküls an das aktive Zentrum des Enzyms
gewährleistet bleiben soll, die Hydrolyse der -P-O-P-
Bindung zwischen der α- und der β-ständigen
Phosphatgruppe aber verlangsamt oder verhindert wird.
Dabei zeichnen sich die erfindungsgemäßen Wirkstoffe
vorzugsweise dadurch aus, daß sie dem dUTP in seinen
Wechselwirkungen mit dem Enzym dUTPase weitgehend
wirkungsgleich sind.
Die Struktur der erfindungsgemäßen Wirkstoffe ist so
beschaffen, daß sie auf geeignete Weise in die
betreffende Zelle gelangen bzw. auf geeignete Weise in
die Zelle transportiert werden können.
Die Strukturformel des dUTP in der Säureform ist nach
stehend in der Formel F1 wiedergegeben:
wobei in der wäßrigen Lösung die OH-Gruppen der
Phosphatgruppen weitgehend ionisiert sind. Bestimmte
Positionen des Moleküls sind mit 1-34, 1′-6′ bzw.
α, β und γ gekennzeichnet.
Zur Hemmung der Hydrolyse des dUTP können
erfindungsgemäß die P-O-P-Bindung der Phosphatgruppen
α und β in der Position 24 und/oder die P=O-Gruppen
der Phosphatgruppen α und β in den Positionen 21 und
25 gemäß F2
in einer Weise geändert werden, daß ihre hydrolytische
Spaltung zu 2′-Deoxyuridininonophosphat und an
organischen Pyrophosphat verhindert bzw. erschwert wird.
ersetzt wird, wobei R, R¹ und R² ein organischer Rest
oder das Wasserstoffatom sein können.
Beispielsweise kann die Verknüpfung der α- und β-
ständigen Phosphatgruppen erfindungsgemäß wie folgt ge
ändert werden:
Ein weiterer Weg zur Hemmung der Hydrolyse des dUTP kann
erfindungsgemäß auf die Weise erreicht werden, daß die
Sauerstoffatome in den Positionen 21 und/oder 25
und/oder 29 z. B. durch Schwefel ersetzt sind, wie die
nachfolgenden modifizierten Triphosphat-Gruppen zeigen:
Wie gesagt, kann der erste Weg (Ersatz des Sauerstoff
atomes in der Position 24) mit dem zweiten Weg (Ersatz
des Sauerstoffatoms in wenigstens einer der Positionen
21, 25 und 29) kombiniert sein.
Die Hemmung der Hydrolyse des dUTP kann erfindungsgemäß
auch dadurch erreicht werden, daß das dUTP wie folgt
modifiziert wird.
- (a) Ersatz der γ-ständigen Phosphatgruppe in (F1) mit den Atomen 29 bis 33 durch Wasserstoff;
- (b) Ersatz der OH-Gruppe 16 und/oder 17 durch Wasser stoff;
- (c) Ersatz des 2′-Desoxyribose-Restes durch Arabinose;
- (d) Ersatz wenigstens eines der Atome 8, 10 bis 15, 17 bis 19 und 34 in (F1) durch einen Stoff ausgewählt aus der Stoffgruppe Fluor und einem Alkylrest;
- (e) Ersatz der Atome 5 und/oder 6 in (F1) durch Stickstoff;
- (f) Ersatz der Triphosphatgruppe in (F1) durch einen Stoff, der eine ähnliche räumliche Ausdehnung, Polarität und Ladung aufweist und damit dem dUTP; in seiner Wechselwirkung mit dem Enzym dUTPase, weitgehend wirkungsgleich ist.
- (g) Ersatz wenigstens einer der Atomgruppen 22, 23 und 26, 27 und 30, 31 in (F1) durch S-R, wobei S für Schwefel und R für einen organischen Rest steht.
Von den vorstehenden Modifizierungen kann wenigstens
eine ausgewählt sein.
Die neuen Verbindungstypen, wie sie lediglich für Bei
spiele in den Formeln (F5) bis (F9) angegeben sind,
werden besonders leicht membrangängig (erleichterte Auf
nahme durch die Zellmembran), wenn geeignete chemische
Gruppen so an das Molekül geheftet werden, daß damit die
Bindung an das Enzym nicht/oder nicht wesentlich
beeinträchtigt wird.
Für die kovalente Anheftung solcher Gruppen bieten sich
in (F1) erfindungsgemäß besonders wenigstens eine der
Positionen oder Positionspaare (16 und 17); 17; (22 und
23), 23; (26 und 27); 27; (30 und 31); 31; (32 und 33)
und 33 an.
Erfindungsgemäß sind als geeignete Gruppen alle
lipophilen Gruppen anzusehen, welche die Membrangängig
keit verbessern und ausreichend biokompatibel sind (d. h.
bei einer eventuellen hydrolytischen Abspaltung
metabolisiert werden und/oder keine schädigenden Ein
flüsse auf andere Komponenten des Organismus ausüben).
Zum Beispiel kann es sich erfindungsgemäß um folgende
Gruppen handeln:
- - Alkylreste, insbesondere Hexadecyl und Octadecyl, ungesättigte Alkylreste und deren Derivate;
- - Phenyl- und Phenylalkylreste, z. B. Benzylreste;
- - Alkylreste membranabhängiger Alkohole, z. B. Retinol, Dolichol, Pantothenol;
- - Mono- und Diacylglycerolyl.
Es kann sich aber auch um eine Vielzahl vergleichbarer
Moleküle handeln, die selbst Membranbestandteile bilden
oder für den Fachmann als membrangängig bekannt oder
erkennbar sind.
So werden die vorstehenden neuen Verbindungstypen
besonders leicht membrangängig, wenn die terminale
Phosphatgruppe über eine OH-Gruppe des erfindungsgemäßen
Wirkstoffes mit einer lipophilen Gruppe R in der
Position 31 und/oder 33 von (F1) verestert wird. Als
lipophiler Rest eignen sich z. B. die bei der Synthese
der neuen Verbindungstypen als Schutzgruppen
eingesetzten Benzylgruppen
Erfindungsgemäße Wirkstoffe können vorteilhafterweise
eine Struktur entsprechend F1 aufweisen, wobei die Was
serstoffatome 31 und/oder 33 durch einen lipophilen Rest
ersetzt sind und die Spaltung des dUTP verhindert wird,
indem nach F1 die Position 21 durch Schwefel und/oder
die Position 24 durch CH₂ oder NH oder N-CH₃ eingenommen
wird. Diese erfindungsgemäß z. B. vorgeschlagene Blockade
der dUTP-Spaltung führt schließlich zum Zelltod.
Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können vor allem zur
Krebstherapie (insbesondere bei Melanomen, Lymphomen und
Gliomen) zur Therapie von Autoimmunkrankheiten
(insbesondere bei therapieresistenter Psoriasis,
Psoriasis-Arthritis und rheumatoider Arthritis) und zur
Therapie von Virus-Erkrankungen (insbesondere bei
Infektionen mit Herpes Simplex Virus und Retrovieren)
dienen.
Nachstehend werden die Synthese der erfindungsgemäßen
Wirkstoffe 2′-Desoxyuridin-5′-[(α,β-methylendiphosphat)-
monobenzyl-phosphat) nach (F5) und (F10), 2′-
Desoxyuridin-5′-(α,β-methylentriphosphat) nach (F5) und
2′-Desoxyuridin-5′-O-(1-thiotriphosphat) nach (F8) in
mehreren aufeinanderfolgenden Schritten zur Überprüfung
der Hydrolyse durch dUTPase aus E.coli sowie des
inhibitorischen Einflusses auf das Enzym aufgezeigt:
1 g 2′-Desoxyuridin in Pyridin und 1,8 g (4,4′-
Dimethoxytrityl)-chlorid werden 2 h bei Raumtemperatur
gerührt. Man gibt Wasser zu und extrahiert die wäßrige
Phase mit Ethylacetat. Die organische Phase wird
nacheinander mit NaHCO₃-Lösung, Wasser und NaCl-Lösung
gewaschen. Nach Entfernen des Lösungsmittels löst man in
Chloroform, gibt das Produkt über eine Kieselgel 60-
Säule und chromatographiert stufenweise mit Chloroform-
Methanol-Gemischen.
2,1 g 5′-(4,4′-Dimethoxytrityl)-2′-desoxyuridin und
3,43 ml Methoxyessigsäureanhydrid läßt man in Pyridin
bei Raumtemperatur reagieren. Man rotiert das
Lösungsmittel und Reste des Axylierungsmittels ab.
Das unter 2. beschriebene Produkt wird ohne Reinigung
weiter verwendet. Man löst es in 1% Trifluoressigsäure
in Dichlormethan, und extrahiert nach 15 min die
organische Phase mit einer Lösung von 0,1%
Trifluoressigsäure in Wasser. Nach Lyophilisierung
erhält man das Produkt.
Eine Mischung aus 1 g 3′-Methoxyacetyl-2′-desoxyuridin,
2,688 g Methylendiphosphonsäure und 12,6 g N,N′-Dicyclo
hexylcarbodiimid wird in einem Gemisch aus Pyridin und
Tributylamin bei 50°C reagieren gelassen. Das Filtrat
wird zu einem kleinen Volumen eingeengt, welches mit
Wasser versetzt und mit Diethylether gewaschen wird. Die
das Produkt enthaltende Phase wird evaporiert.
Das Produkt wird in Startpuffer (0,01 M Triethyl
ammoniumhydrogencarbonatpuffer (TEAB), pH 7,0) aufge
nommen und chromatographisch mittels DEAE-Sephadex A-50
gereinigt. Die Chromatographie erfolgt mit einem
Gradienten aus 0,01 M TEAB pH 7,0 zu steigendem TEAB-
Gehalt des gleichen pH. Die entsprechenden Fraktionen
werden gesammelt und im Rotationsverdampfer eingeengt.
12,45 g N-Chlorsuccinimid, und 8,816 ml Dibenzylphosphit
werden in Toluol reagieren gelassen. Das Filtrat wird zu
0,5 g 3′-Methoxyacetyl-2′-desoxyuridin-5′-(α,β-
methylendiphosphat) in einem Gemisch aus Pyridin und
Tributylamin gegeben und läßt man bei 40°C reagieren.
Anschließend rotiert man zur Trockene ein.
Das unter 5. erhaltene Produkt wird mit einer Mischung
aus Methanol, konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung und
Wasser die Methoxyacetylgruppe abgespalten. Man rotiert
zur Trockene ein, nimmt es in Wasser auf und extrahiert
mit Diethylether. Das Lösungsmittel wird abgezogen.
Die Hälfte des unter 6. erhaltenen Produktes wird in
Methanol gelöst. Dazu gibt man Ammoniumformiat, 5%
Palladium auf Aktivkohle und rührt 90 min bei
Raumtemperatur.
Man trennt die Aktivkohle ab, rotiert zur Trocknung ein,
gibt Wasser zu und extrahiert mit Diethylether. Die das
Produkt enthaltende Phase wird evaporiert. Man erhält
2′-Desoxyuridin-5′-[(α,β-methylendiphosphat)-monobenzyl
phosphat). Führt man die Hydrogenolyse 5h lang anstatt
90 min lang durch, so erhält man 2′-Desoxyuridin-5′-(α,
β-methylentriphosphat).
Das unter 7. gewonnene Produkt wird in Startpuffer
(0,01 M TEAB, pH 7,0) aufgenommen und chromatographisch
mittels DEAE-Sephadex A-50 gereinigt. Die Elution
erfolgt mit einem linearen Gradienten von 0,01 M TEAB pH
7,0 zu steigenden TEAB-Gehalt des gleichen pH. Die
Absorption des Produktes wird durch stark
absorbierendes, bräunliches Nebenprodukt überdeckt.
Fraktionen werden in Abständen gesammelt und im
Rotationsverdampfer eingeengt und dann auf Hydrolyse
durch dUTPase aus E. coli sowie ihren inhibitorischen
Einfluß auf das Enzym überprüft. Fraktionen, die
inhibitorisch auf die Enzymaktivität wirken, werden
weiter aufgereinigt.
Die weitere Aufreinigung erfolgt chromatographisch
mittels DEAE-Sephadex A-50 mit einem linearen Gradienten
aus 0,01 M Ammoniumformiat zu steigendem
Ammoniumformiatgehalt. Die eluierten Syntheseprodukte
werden wie oben beschrieben auf Hydrolyse und
Enzyminhibition getestet und die entsprechenden
Fraktionen einrotiert.
Die Entsalzung des Syntheseproduktes erfolgt mittels
DEAE-Sephadex A-50.
Das Produkt wird auf die mit 0.01 M TEAB pH 7,0
eguilibrierte Säule aufgegeben und die Salze mit dem
gleichen Puffer ausgewaschen. Die Elution des Produktes
erfolgt mit TEAB pH 7,0 höheren Gehalts. Das gereinigte
und entsalzte Syntheseprodukt wird einrotiert und
lyophilisiert.
30 mg 3′-Methoxyacetyl-2′-desoxyuridin werden in Pyridin
gelöst und im Reaktionsgefäß zur Trockene eingedampft.
55 µl einer 1M Lösung von 2-Chlor-1,3,2-
benzodioxaphosphorin-4-on in Dioxan werden zur Lösung
des Nucleosids gegeben. Nach 10 min wird eine Mischung
aus 27,3 g Tributylammoniumpyrophosphat in DMF und
Tributylamin zugegeben. Nach 10 min wird eine
Schwefelsuspension (3,2 mg Schwefel in DMF) zugegeben.
Nach 10 min wird Wasser zugegeben.
Nach 30 min wird die Reaktionsmischung zur Trockene
eingedampft und der Rückstand in konzentriertem Ammoniak
gelöst und reagieren gelassen, um die Methoxyacetyl
gruppe zu entfernen. Die Reaktionsmischung wird zur
Trockene einrotiert, in Wasser gelöst und auf die Säule
appliziert.
Säule: DEAE-Sephadex A-50.
Es wird ein Gradient von 0,4 M Triethylammonium
hydrogencarbonat-Puffer (TEAB) pH 7,0 zu steigendem
TEAB-Gehalt des gleichen pH benutzt.
Die Fraktionen, die das Produkt enthalten, werden
kombiniert und zur Trockene einrotiert.
Nachstehend wird die Hemmwirkung des erfindungsgemäßen
Wirkstoffes 2′-Desoxyuridin-5′-[(α,β-methylendi
phosphat)-monobenzylphosphat] auf gereinigte dUTPase von
E. coli nachgewiesen, der nachstehend mit F71-90
bezeichnet ist.
Die Untersuchungen wurden mit einer gereinigten Fraktion
71-90 durchgeführt, wie sie vorstehend gewonnen wurde.
Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in einem Diagramm
zusammengefaßt, das Fig. 1 wiedergegeben ist.
Hier ist die doppelt reziproke Auftragung der durch E.
coli dUTPase katalysierten Hydrolysegeschwindigkeit in
Abhängigkeit von der Substratkonzentration ohne und mit
Zugabe der Fraktion 71-90 kenntlich gemacht. Das
Diagramm zeigt dabei das kompetitive Verhalten des
natürlichen Substrats dUTP und F71-90.
Die dUTPase-Aktivität wurde unter Standard-Assay-
Bedingungen (pH 8,0; 50 µM MgSO₄ in 1 mM Phenolrot bei,
25°C gemessen. Zu 50 nM dUTPase wurden 50 µM
70 µM der Fraktion 71-90 hinzugefügt und mit dUTPase
o ohne Zusatz der Fraktion 71-90 verglichen.
Die Reaktionen wurden mit dUTP gestartet und 60 s lang
beobachtet.
Die Hemmkonstante der beobachteten Hemmung wurde zu 0,3 ±
0,02 µM bestimmt. Dies zeigt, daß der erfindungsgemäße
Hemmstoff vergleichbar gut an das Enzym bindet wie das
natürliche Substrat dUTP.
Zur Ermittlung des Einflusses von erfindungsgemäßen
dUTPase-Wirkstoffen auf das Zellwachstum von bestimmten
Krebszellen wurden folgende allgemeine Arbeitsbe
dingungen angewendet:
Der Einfluß von erfindungsgemäßen dUTPase-Wirkstoffen auf das Wachstum von bestimmten Krebszellen im Vergleich zu seiner Wirkung auf das Wachstum von humanen Fibroblasten wurde in vitro untersucht.
Der Einfluß von erfindungsgemäßen dUTPase-Wirkstoffen auf das Wachstum von bestimmten Krebszellen im Vergleich zu seiner Wirkung auf das Wachstum von humanen Fibroblasten wurde in vitro untersucht.
Das Zellwachstum wurde in Zellkultur-Mikrotestplatten
mit Hilfe der MTT-Test-Methode bestimmt.
Zellen der Zellinien EG 463 (malignes Melanom), OH 77
(malignes Lymphom) und U373 (Gliom), wurden im Vergleich
zu humanen Fibroblasten unter Standardbedingungen in
McCoy′s Medium (mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 1%
Glutamin, 1,2% Penicillin/Streptomycin), pH 7,2 bei
37°C, 5,5% CO₂ und 95% relativer Luftfeuchtigkeit
kultiviert.
In jeweils vier Parallelansätzen wurde den Medien die
Fraktion 71-90 in Konzentrationen zwischen 0,01 µg/ml
und 20 µg/ml zugesetzt. Kontrollmedien sowie Medien für
die Testansätze enthielten kein Penicillin bzw.
Streptomycin.
Die Zellzahlbestimmung der Kontrollen mit Standardmedium
erfolgte 1 Tag nach dem Ausplattieren der Zellen in die
Testplatten und wird als K₀ (d. h. Zellzahl zum Zeitpunkt
Null) dargestellt. Gleichzeitig wurde den Testansätzen
sterilfiltrierter, in Medium gelöster Wirkstoff
zugegeben. Die Inkubationsdauer betrug 3 bis 48 h. Das
zellbiologische Arbeiten erfolgte unter sterilen
Bedingungen. Die Zellzahl der Kontrollen wurde nach t
Stunden als Kt, die der Testansätze als Tt bestimmt.
Die Darstellung der Wirkung der Hemmstoffe auf das
Zellwachstum erfolgt als relative Wachstumsrate der
Kontrollen und der Testansätze, wobei die Wachstumsraten
der Kontrollen vom Zeitpunkt Null bis t Stunden als
100% zugrundegelegt wird.
In weiteren Versuchen wird die cytostatische bzw.
cytotoxische Wirkung erfindungsgemäßer Wirkstoffe auf
menschliche Krebszellen in vitro untersucht. Die
Ergebnisse sind in Diagrammen zusammengefaßt, die in den
nachstehenden Figuren wiedergegeben sind. Hierin zeigt:
Fig. 2 den Einfluß des erfindungsgemäßen Wirkstoffes
71-90 und von Methotrexat auf das Zellwachs
tum von OH 77 und EG 463;
Fig. 3.1 den Einfluß des Wirkstoffes 71-90 auf das
Zellwachstum von EG 463;
Fig. 3.2 den Einfluß des Wirkstoffes 71-90 auf das
Zellwachstum von OH 77,
Fig. 3.3 und 3.4 den Einfluß des Wirkstoffes 71-90 auf das
Zellwachstum von OH 77 und EG 463 im Vergleich
zu humanen Fibroblasten;
Fig. 4.1 den Einfluß des Wirkstoffes 71-90 auf das
Zellwachstum von EG 463 in Abhängigkeit von
der Inkubationszeit;
Fig. 4.2 den Einfluß des Wirkstoffes 71-90 auf das
Zellwachstum von U 373 in Abhängigkeit von der
Inkubationszeit, und
Fig. 5 die Einflüsse der erfindungsgemäßen Wirkstoffe
71-90, 14-17, αSdUTP (abgekürzt αS), dUTP
auf das Zellwachstum von U 373 und EG 463.
Der erfindungsgemäße Wirkstoff 71-90, d. h. 2′-Desoxy
uridin-5′-[(α,β-methylendiphosphat)-monobenzylphosphat]
ist vorstehend durch (F5) und (F10) gekennzeichnet. Der
erfindungsgemäße Wirkstoff 14-17, d. h. 2′-Desoxyuridin-
5′-(α,β-methylentriphosphat) ist vorstehend durch (F5)
gekennzeichnet und dUTP ist als erfindungsgemäßer
Wirkstoff in der Konzentration 5 µg/ml (dUTP5) und 10
µg/ml (dUTP 10) verwendet. Der erfindungsgemäße
Wirkstoff SdUTP, d. h. 2′-Desoxyuridin-5′-O-(1-thiotri
phosphat) ist vorstehend durch (F8) gekennzeichnet.
In Fig. 2 erfolgte die Inkubation der Zellen unter
Standardbedingungen. Die Testansätze enthielten
verschiedene Konzentrationen der Wirkstoffe F71-90 (I)
und Methotrexat (MTX).
Fig. 2 zeigt, daß die 48-stündige Inkubation der Zellen
OH 77 und EG 463 mit dem Wirkstoff I (F71-90) in der
Konzentration 1 µg/ml bei Zellen beider Zellinien
bereits zu einer Wachstumshemmung im Vergleich zur unter
Standardbedingungen kultivierten Kontrolle K48 führt.
Signifikant wurde das Zellwachstum bei einer
Wirkstoffkonzentration von 10 µg/ml gehemmt. Deutlich
cytotoxisch auf das Wachstum der Zellen wirken 20 µg/ml
des Wirkstoffes. Der Vergleich mit dem bekannten
Chemotherapeutikum Methotrexat (MTX) verdeutlicht die
Effektivität von F71-90, sowie ihre synergistische
Wirkungsweise mit MTX bei kombiniertem Einsatz. MTX/I
zeigt die Kombination von MTX mit 20 µg/ml und F71-90
mit 1 µg/ml.
In den Fig. 3.1 und 3.2 ist die Abhängigkeit der
relativen Wachstumsrate von Zellen der Zellinien EG 463
(Fig. 3.1) und OH 77 (Fig. 3.2) von der eingesetzten
Konzentration an dem Wirkstoff F71-90 im Vergleich zu
unter Standardbedingungen kultivierten Kontrollen K48
dargestellt. In Konzentrationen von 0,1 µg/ml und 1,0
µg/ml wird bereits bei Zellen beider Zellinien eine
Hemmung des Wachstums erreicht, deutlich cytotoxische
Wirkung hat der Wirkstoff F71-90 in Konzentrationen ab
5,0 µg/ml.
Ein Vergleich der relativen Zellzahlen des Wirkstoffes
F71-90 gegenüber den Zellinien OH 77, EG 463 und humanen
Fibroblasten zeigt in Fig. 3.3 den selektiven Einfluß
des Wirkstoffes nach 48stündiger Inkubation mit
unterschiedlichen Konzentrationen bezüglich schnell
proliferierenden Zellen. Die relativen Zellzahlen wurden
mittels der MTT-Testmethode bestimmt.
Signifikant zeigte sich die Selektivität bei einer
Konzentration von 10 µg/ml F71-90 (Fig. 3.4). Zieht man
die unterschiedlichen Wachstumsgeschwindigkeiten der
Zellen in Betracht, entspricht die Zellzahl nach 48 h
bei humanen Fibroblasten nur 23%, bei OH 77 nur 68%
der Zellzahl von EG 463. Das bedeutet, daß das
Verhältnis von Wirkstoffmenge zu Zellzahl bei humanen
Fibroblasten höher als bei OH 77 und EG 463 ist und
somit der in Fig. 3.3 dargestellte Effekt als
entsprechend größer angesehen werden muß.
In den Fig. 4.1 und 4.2 ist die Abhängigkeit der
relativen Wachstumsrate von Zellen der Zellinien EG 463
(Fig. 4.1) und U 373 (Fig. 4.2) von der Inkubationszeit
mit dem Wirkstoff F71-90 dargestellt. Die Inkubation der
Zellen erfolgte in vitro unter Standardbedingungen bzw.
nach Zugabe von 71-90 (5 µg/ml).
Unabhängig von der Inkubationsdauer wurde das Wachstum
der Zellen beider Zellinien im Vergleich zu unter
Standardbedingungen kultivierten Kontrollen gehemmt.
Nach 3stündiger Inkubationszeit war die relative
Hemmwirkung bei Behandlung mit 5 µg/ml F71-90 im
Vergleich zur Kontrolle am größten (ausgedrückt als
Cytotoxizitätsindex).
Bei 8,24 und 48 h blieb die Verminderung der relativen
Wachstumsrate im Bereich um 46% bis 59% (U 373), um 38%
bis 52% (EG 463). Die Darstellung zeigt die
Zeitabhängigkeit der relativen Wachstumsrate. Die größte
Verminderung der relativen Wachstumsrate erfolgte
bereits nach 3stündiger Inkubation der Zellen mit F71-
90 (um 83% bei U 373, bei 71% bei EG 463) und macht
die Effektivität und die Geschwindigkeit des
Wirkmechanismus deutlich.
In Fig. 5 ist der Einfluß verschiedener
erfindungsgemäßer Wirkstoffe und die relative
Wachstumsrate von Zellen der Zellinien U 373 (Fig. 5.1)
und EG 463 (Fig. 5.2) dargestellt.
Die Wirkstoffe 71-90, 14-17, αSdUTP (αS) und dUTP
wurden den Testmedien zugegeben und die relative
Wachstumsrate nach 48 h im Vergleich zu der unter
Standardbedingungen kultivierten Zellen ermittelt. Die
Testansätze enthielten jeweils 5 kg/ml und bei dUTP10
10 kg/ml.
Jeder der getesteten Wirkstoffe führte zu einer
Reduktion der Wachstumsrate, sowohl bei EG 463, als auch
bei U 373. F71-90 hemmte jeweils am effektivsten das
Zellwachstum auf 36% (EG 463) bzw. 50% (U 737) im
Vergleich zu je 100% der Kontrollen. Unterschiedliche
Wirkungen zeigte die Inkubation der Zellen mit SdUTP,
die bei U 373 zu einer Wachstumsreduktion auf 56%, bei
EG 463 auf nur 82% führte. Eine Konzentrations
verdoppelung von dUTP von 5,0 auf 10,0 kg/ml korreliert
nicht mit einer stärkeren Verminderung der
Wachstumsrate, die bei 67% und 65% (EG 463) bzw. 73%
und 80% (U 373) liegt. Die relative Wachstumsrate der
von 14-17 inkubierten Zellen liegt mit 72% (EG 463) und
81% (U 373) im Bereich deren die mit dUTP inkubiert
sind.
Zur Therapie kann ein erfindungsgemäßer Wirkstoff bei
einer Tagesdosis (high dose) in einer Menge bis zu 300
µg/m² Körperoberfläche verwendet werden. Die
Verabreichungsformen können intravenös, intramuskulär
und subkutan sein. Zur Injektion wird der
erfindungsgemäße Wirkstoff in einem isotonischen Medium,
vorzugsweise in einer physiologischen Kochsalzlösung
verwendet.
Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können auch in
Kombination mit anderen Cytostatika und/oder mit
Histonen der Klassen H1, H2A und/oder H2B verabreicht
werden.
Außerdem können auch zwei oder mehrere der
erfindungsgemäßen Wirkstoffe in Kombination
untereinander und/oder in Kombination mit anderen
Cytostatika und/oder in Kombination mit Histonen der
Klassen H1, H2A und/oder H2B verabreicht werden.
Claims (17)
1. Wirkstoff, der dem dUTP in seinen
Wechselwirkungen mit dem Enzym dUTPase im wesentlichen
wirkungsgleich ist.
2. Wirkstoff nach Anspruch 1 zur Störung des
intrazellulären Gleichgewichtes dUTP:dUMP durch Hemmung
des Enzyms dUTPase.
3. Wirkstoff nach Anspruch 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das Gleichgewicht zu Gunsten von
dUTP gestört wird, so daß bei der DNA-Biosynthese
vermehrt Uracil statt Thymin in die DNA eingebaut wird.
4. Wirkstoff nach Anspruch 2 und 3 zur Erhöhung
der Konzentration von dUTP.
5. Wirkstoff nach einem der vorstehenden
Ansprüche, gekennzeichnet durch dUTP oder ein
modifiziertes dUTP, das eine bei der DNA-Biosynthese
vergleichbare Wirkungsweise wie das dUTP aufweist, aber
eine gegenüber dem dUTP vergleichweise erhöhte
Membrangängigkeit besitzt.
6. Wirkstoff nach einem der vorstehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die endständige
OH-Gruppe oder das endständige Wasserstoffatom der
γ-ständigen Phosphatgruppe des dUTP durch ein die
Membrangängigkeit verbesserndes Atom oder Atomgruppe
ersetzt ist.
7. Wirkstoff nach einem der vorstehenden
Ansprüche zur Hemmung der von dem Enzym dUTPase
bewirkten dUTP-Hydrolyse nach der Gleichung
dUTP + H₂O → dUMP + PPi, wobei dUMP Desoxyuridinmono
phosphat und PPi ein anorganisches Phosphat ist.
8. Wirkstoff nach einem der vorstehenden
Ansprüche, bestehend aus einem Substratmolekül dUTP, das
derart verändert ist, daß die Hydrolyse der -P-O-P-
Bindung zwischen der α- und β-ständigen Phosphatgruppe
gehemmt ist, die Bindung des veränderten Moleküls an das
Enzym aber erhalten bleibt.
9. Wirkstoff nach Anspruch 8, dadurch
gekennzeichnet, daß der Sauerstoff zwischen der α- und
β-ständigen Phosphatgruppe durch ein Atom oder eine
Atomgruppe ersetzt ist, um die Spaltung des dUTP an
dieser Stelle zu hemmen.
10. Wirkstoff nach Anspruch 5, dadurch
gekennzeichnet, daß der Sauerstoff durch die Atomgruppe
C-R¹R² ersetzt ist, wobei R¹ und R² ausgewählt sind aus
den Stoffen Wasserstoff und organische Reste.
11. Wirkstoff nach Anspruch 10, dadurch
gekennzeichnet, daß der Sauerstoff durch -CH₂ - ersetzt
ist.
12. Antimetabolite nach Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, daß der Sauerstoff durch die Atomgruppe
ersetzt ist, wobei R Wasserstoff oder ein Alkylrest ist.
13. Wirkstoff nach einem der vorstehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der
alleinstehende, an Phosphor doppeltgebundene Sauerstoff
der α-, und/oder β-und/oder γ-ständigen Phosphatgruppe
durch Schwefel ersetzt ist.
14. Wirkstoff nach einem der vorstehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wasserstoff
wenigstens der einen endständigen OH-Gruppe der
γ-ständigen Phosphatgruppe durch eine Benzylgruppe
ersetzt ist.
15. Wirkstoff nach einem der vorstehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das dUTP
modifiziert ist, indem wenigstens eine der nachstehenden
Bedingungen ausgewählt ist
- (a) Ersatz der γ-Phosphatgruppe mit den Atomen 29 bis 33 durch Wasserstoff;
- (b) Ersatz der OH-Gruppe 16, 17 durch Wasserstoff;
- (c) Ersatz des 2′-Desoxyribose-Restes durch Arabinose;
- (d) Ersatz wenigstens eines der Atome 8, 10 bis 15; 17, 18, 19 und 34 durch einen Stoff, ausgewählt aus der Stoffgruppe Fluor und einem Alkylrest;
- (e) Ersatz der Atome 5 und/oder 6 durch Stickstoff;
- (f) Ersatz der Triphosphatgruppe in (F1) durch einen Stoff, der eine ähnliche räumliche Ausdehnung, Polarität und Ladung aufweist und damit dem dUTP in seiner Wechselwirkung mit dem Enzym dUTPase weitgehend wirkungsgleich ist;
- (g) Ersatz wenigstens einer der OH-Gruppen 22, 23 und/oder 26, 27 und/oder 30, 31 durch die Gruppe S-R, wobei S für Schwefel und R für einen organischen Rest steht.
16. Wirkstoff nach einem der vorstehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er mit einem
herkömmlichen Cytostatikum oder wenigstens einem Histon,
ausgewählt aus der Gruppe H1, H2A, H2B kombiniert ist.
17. Wirkstoff nach einem der vorstehenden
Ansprüche zur Therapie von Krebserkrankungen
(insbesondere Melanomen, Lyphomen, Gliomen),
Viruserkrankungen (insbesondere mit Herpex-Simplex oder
Retro-Viren infizierte Zellen) und Autoimmunerkrankungen
mit gesteigerter Zellproliferation (insbesondere
therapieresistente Psoriasis, Psoriasis Arthritis und
rheumatische Arthritis).
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