WO1995004832A1 - Procede de detection d'un acide nucleique - Google Patents

Procede de detection d'un acide nucleique Download PDF

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WO1995004832A1
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polyamine
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acid according
enzyme
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Akio Matsuhisa
Kiyotaka Shiba
Yoshikazu Mikawa
Yuichiro Kishi
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Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a nucleic acid utilizing the property that a polyamine electrostatically binds to a nucleic acid.
  • a method for detecting nucleic acids a method using bromination reagents has been widely used.
  • a nucleic acid is combined with a bromide medium (intercalation), and the position of the nucleic acid is known by the fluorescence emitted at that time.
  • this method was inconvenient because fluorescence could not be confirmed in a light place, and the position of the nucleic acid had to be known by comparing the image taken under ultraviolet irradiation in a dark place with the actual product, which was inconvenient.
  • brominated bromide has strong carcinogenicity
  • the present invention provides (1) contacting a nucleic acid and a polyamine to which a label capable of generating a measurable signal or a precursor thereof has been bound to a solid carrier suspected of having or containing the nucleic acid; The precursor is converted to a label if a precursor is used, the polyamine which has not formed a complex before or after that is removed, and then the label is searched for.
  • Nucleic acid detection method Nucleic acid detection method
  • a probe capable of hybridizing to a target nucleic acid to which a label capable of generating a measurable signal or a precursor thereof has been ligated is attached to a solid carrier suspected of adhering or containing the target nucleic acid.
  • a solid carrier suspected of adhering or containing the target nucleic acid is attached to a solid carrier suspected of adhering or containing the target nucleic acid.
  • Contact under ditization conditions to form a hybrid convert to a label if a precursor is used, remove the unhybridized probe before or after, and then search for the label And forming a complex between the nucleic acid and the polyamine by contacting the polyamine with another label capable of generating a measurable signal or a precursor thereof, which is capable of generating a measurable signal.
  • a method for discriminating and detecting a target nucleic acid and other nucleic acids which comprises performing a combination of the second detection operation, which includes removing the min, and then searching for a label, in any order.
  • An object of the present invention is to provide a kit for detecting nucleic acids, including (a) a polyamine labeled with an enzyme, and (mouth) a chromogen which generates a signal by the action of an enzyme.
  • a kit for detecting nucleic acids including (a) a polyamine labeled with an enzyme, and (mouth) a chromogen which generates a signal by the action of an enzyme.
  • nucleic acid is a polymer in which nucleotides formed by binding of a purine or pyrimidine base and pentose and phosphoric acid are used as basic units and polymerized by ester bonds of phosphoric acid.
  • Bases include adenine, cytosine, guanine, thymine, peracil and their modified bases.
  • Nucleic acids also have DNA and RNA depending on the difference in the sugar moiety, and further have differences in single-stranded, double-stranded, etc., and steric structures.
  • the “solid carrier” includes a thin plate, a sheet, a strip, a slab, a film, a membrane, and the like used for separating or detecting nucleic acids. Typical examples are agarose gel, nylon membrane, filter paper, nitrocellulose membrane and the like.
  • a “label” is a substance that produces a measurable signal and includes enzymes (as a combination with a substrate), spin compounds, radionuclides, fluorescent substances, chemiluminescent substances, and light-absorbing substances.
  • Preferred labels are enzymes. Enzymes include peroxidase, / 3-galactosidase, glucose oxidase, alkaline phosphatase, glucose-16-phosphate dehydrogenase, etc. c
  • the methods for measuring enzyme activity include absorbance, fluorescence, and chemical. There is a luminescence method.
  • peroxidase uses a substrate such as 2,2'-azinodi (3-ethylbenzthiazoline) -16'-sulfonic acid (ABTS) as a chromogen and measures the resulting dye by an absorbance method.
  • ABTS 2,2'-azinodi (3-ethylbenzthiazoline) -16'-sulfonic acid
  • glucose oxidase produces hydrogen peroxide based on glucose, it is conjugated with peroxidase and Can be measured.
  • yS-galactosidase can be measured using 0-ditrophenyl-S—D—calactoside as a substrate.
  • peroxydase uses p-hydroxyphenylpropionic acid as a substrate
  • ⁇ -ii lactosidase is fluorescein
  • S—D-galactoside or 4-methyl umbelliferyl-D —Measurement can be performed using galactoside as a substrate
  • phosphatase using emberiffurilyl phosphate or bromocloyl loindolyl phosphate nitroble-tetrazolium as a substrate.
  • peroxidase can be measured using luminol and hydrogen peroxide as substrates.
  • a label for example, an enzyme
  • a polyamine for example, benzoquinone (quinhydrone), bis [2- (succinimidylcarboxyl) ethyl] sulfone (BSOCOES), bis (sulfosuccinimidyl) suberate ( BS 3), 1,2-difluoro-2,4-dinitrobenzene (DF DNB), 4,4'-diisothiocyano 2,2'-disulfostilbene, disodium salt (CD IDS).
  • Adipinimid acid Dimethyl dihydrochloride N- (7-maleimidbutyryloxy) succinimide (GMB S :), N- (4-azidofurinylthio) phthalimid (APT P :), N-succinimidyl-1- Use a cross-linking reagent such as (4'-azidophenyl) -1,3'-dithiopropionate (SADP), pyridine disulfide, or thiophthalimid.
  • SADP (4'-azidophenyl) -1,3'-dithiopropionate
  • a “labeled precursor” is a substance that can be converted to a label, eg, a label blocked with an inhibitor.
  • Signal refers to visible light, fluorescence, radioactivity, other electromagnetic waves, and the like. Preference is given to being able to relate the measured value to the amount of the substance which generated it.
  • Searching for a label involves detecting such a signal by physical or mechanical means.
  • Polyamine is an aliphatic skeleton compound having two or more primary amino groups. And includes natural (biological) amines and synthetic polymers. There are primary amino groups at both ends of an aliphatic chain usually having 3 to 50, preferably about 6 to 15 or about 20 carbon atoms, and the chain may be interrupted by imino groups.
  • Representative natural polyamines are 1,3-diaminopropane, putrethsin, cadaverine, norspermidine, spermidine, homospermidine, aminopropyl cadadaberin, thelmin, spermine, thermospermine, canabalmin, aminopantyl norspermidine, N , N'-bis (aminopropyl) cadaverine, Hirudo pentamine, Homo lord pen mine, Hirudo hexamine and the like.
  • Typical synthetic polyamines include diethylenetriamine, triethylenetetramine, tetraethylenepentamine, pentaethylenehexamine, hexamethylenediamine, and polyethyleneimine (average molecular weight of about 10,000 to about 200, 000, preferably from about 20,000 to about 100,000, for example, from about 50,000 to about 60,000, for example, BASF's Polymin G 35).
  • Complex or “complex” means electrostatic and / or physical or binding, not covalent or binding. Complexes are usually reversible and can be easily dissociated.
  • Hybridization or “hybridization” means that two single-stranded polynucleotides are complementary or almost (e.g., 70% or more, preferably 80 or 85% or more, particularly 90 or 95% or more) complementary In this case, it means to combine to form a double strand.
  • Hybridization conditions refers to conditions under which a hybridizable polynucleotide forms a hybrid. Generally, these conditions include a temperature of about 70 ° C or less, preferably about 60 ° C or less, usually about 40-55 ° C. Short time is enough.
  • Target indicates an object of interest.
  • a “probe” is a DNA that is highly complementary to a target DNA or a portion thereof, and is usually shorter than the target DNA, about 5 to 50 bases, preferably about 10 to 40 bases, for example about 20 to 30 bases. Consists of a base.
  • FIG. 1 is a diagram showing the detection results of IDNA in Example 1.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of detection of Escherichia coli (E. coli) rRNA in Example 1.
  • FIG. 3 is a photograph of electrophoresis of I Hind III DNA in Example 1.
  • FIG. 4 is a photograph of electrophoresis of a DNA fragment inserted into pBR322 in Example 1 digested with a restriction enzyme (color development according to the present invention).
  • FIG. 5 is a photograph of electrophoresis of a DNA fragment (X-ray image) obtained by digesting a DNA fragment inserted into pBR322 with a restriction enzyme in Example 1.
  • FIG. 6 is a photograph of electrophoresis of ⁇ Hind III DNA in Example 1.
  • FIG. 7 is the same as FIG. 6 in Example 1; it is a photograph of electrophoresis of I Hind III DNA.
  • FIG. 8 is a diagram showing the difference in color in FIG.
  • ENZ is a residue obtained by removing an amino group from an enzyme
  • PA is a residue obtained by removing an amino group from a polyamine
  • X is a primary or secondary amino group.
  • Nucleic acid can be detected, for example, as follows.
  • (A) Dot spot the nucleic acid sample on the membrane or agarose gel electrophoresis, electrotransfer to the membrane, bake and fix. After treatment with bovine serum albumin in a buffer, add a labeled or precursor-bound polyamine and react. After washing, label precursor If so, convert to a sign and search.
  • the DNA fragment is fixed to the membrane by dot blotting or Southern blotting after agarose gel electrophoresis, and after prehybridization, hybridization is performed using a Bio-DNA probe. After washing and blocking, the enzyme-labeled streptavidin is reacted. After washing and pre-incubation, a polyamine labeled with another enzyme is reacted. After washing, when each enzyme is subjected to a color development treatment, an image in which hybridized DNA and non-hybridized DNA develop different colors due to the two colors is obtained. For example, the alkaline phosphatase / BCIP—NBT system develops a purple color, and the peroxidase ZDAB system develops a brown color. In this method, the processing order of the probe and the polyamine can be reversed.
  • the membrane itself is colored, not as an X-ray film, so that the nucleic acid can be directly confirmed on the membrane.
  • amplified products having similar molecular weights but different sequences can be distinguished by hybridization.
  • the method of the present invention has the advantage that it does not require the use of dangerous reagents, has high sensitivity (for example, several picograms for DNA and several tens of picograms for RNA), and is easy to operate. If reagents necessary for carrying out the present invention are provided in a kit, the operation is further facilitated.
  • the membrane containing the immobilized DNA or RNA was immersed in 5 mM phosphate buffer, 1% bovine serum albumin (BSA, Sigma, fraction V) and incubated at room temperature for 60 minutes. Next, alkaline phosphatase (or peroxidase) labeled polyethyleneimine was added at a rate of 10012 Oml and incubated at 37 ° C for 120 minutes. The membrane was washed three times with 5 mM phosphate buffer-1% BSA—0.1% Tween 20 for 10 minutes, and rinsed with 0.1 M Tris HCl (pH 9.5) —1 OmM—MgCl 2 .
  • BSA bovine serum albumin
  • a nick translation reaction was carried out using 32 P-dCTP or Bio-11-dUTP (BRL) according to a conventional method, and 32 P- DNA or Bio-DNA was prepared.
  • the membrane was hybridized overnight at 42-55 ° C with a hybridization buffer (5 XSSC, 0.1% BSA, 0.1% Tween 20) containing the denatured probe. Then wash with 0.16 XSSC—0.1% Tween 20 at 55 ° C for 30 minutes Cleaned (time A).
  • the cells were treated with PBS-0.5% Tween 20 at room temperature for 60 minutes. After treatment with PBS-0.05% Tween 20 containing alkaline phosphatase-labeled streptavidin for 20 minutes at room temperature,? Washed twice with 83-0.5% Tween 20 for 10 minutes each. Next, after preincubation for 20 minutes at room temperature using PBS-1% BSA-0.1% BSA-0.1% Queen 20, peroxidase-labeled polyethyleneimine was added and reacted at 42 ° C for 3 hours.
  • FIGS. 1 and 2 The results obtained by dot-spotting 2DNA or Escherichia coli (E. coli) rRNA and detecting with polyphosphoric acid-labeled polyethyleneimine are shown in FIGS. 1 and 2, respectively.
  • the spot amount is ⁇ A1 4.7 /! G, 470 470ng, 3 47ng, 4 4.7ng, 5 47 Opg, 6 47pg, 7 4.7pg, 8 470fg, RNA from top of Fig. 2 1 5 /; g, 2 500ng, 3 50ng, 4 5ng, 5500pg, 65 Opg. Detection was possible with a sensitivity of 470 fg for DNA and 5 Opg for RNA.

Description

明 細 書
核酸の検出法
技術分野
この発明は、 ポリアミンが核酸と静電気的に結合する性質を利用した核 酸の検出法に関するものである。
背景技術
核酸の検出法としては、 従来、 臭化工チジゥムを用いる方法が広く行な われている。 この方法は、 核酸に臭化工チジゥムを複合（インターカレー シヨン）させ、 その際発せられる蛍光によって核酸の位置を知る方法であ る。 しかし、 この方法によるときは明所では蛍光を確認できないため、 暗 所で紫外線照射下に撮影した像を現物と対照して核酸の位置を知らねばな らず、 不便であった。 また、 臭化工チジゥムは強い発がん性を有するので
[例えば 「遺伝子操作マニュアル」 （講談社サイェンティフィ ック）第 2頁 第 1 8— 2 1行]、 取扱いが危険であった。 そのほかの方法として、 ァニ オン性金コロイ ドを用いる方法およびカチオン性力コジル酸鉄コロイ ドを 用いる方法 [ジーン ·アナリシス ·テクニックス（Gene Anal. Techn. ) 1 9 8 6年、 1一 5頁]が知られている。 し力、し、 これらは何れも感度が 悪く、 また金コロイ ドによる方法は背景染色であるから識別が容易でなく、 さらに染色後のハイブリダイゼーションが影響を受けるという欠点があり、 鉄コロイ ドによる方法はハイプリダイゼーション後の染色ができないとい う欠点があった。 したがって、 上記のような欠点のない、 容易、 安全、 確 実、 簡便な核酸検出法の開発が望まれていた。
ポリアミンが D N Aに結合し、 また R N Aにも親和性を有することは既 に知られている [バイオケミカル · ジャーナル （Biochem. J. ) 103巻， 811 - 8 15頁（1967)、 ジャーナル 'ォブ 'モレキュラー 'バイオロジー （J. Mol. Bo il. ) 24巻， 113-122頁（1967)、 ジャーナル ·ォブ♦モレキュラー ·バイオ ロジー （J. Mol. Boil. ) 42巻， 363-373頁（1969)、 ジャーナル，ォブ ·モレ キユラ一.バイオロジー (J. Mol. Boil. ) 121卷， 327-337頁 C1978)等]。 ま た、 ポリアミンで修飾した蛋白質相補的ポリヌクレオチドと共有結合させ てなるプローブを、 標的ポリヌクレオチドの検出に用いることも公知であ る （特表昭 6 0— 5 0 1 4 8 8号、 その公告公報である特公平 2— 5 9 7 2 0号およびその分割出願である特開平 1—1 2 4 4 0 0号） 。 しかし、 標識したポリアミンを核酸に複合させることによる核酸検出法は知られて いない。
発明の開示
この発明は、 （1 )核酸を付着または含有している疑のある固形担体に、 測定可能なシグナルを発生し得る標識またはその前駆体を結合させたポリ アミンを接触させて、 核酸とポリアミンとの間で複合体を形成させ、 前駆 体を用いた場合は標識に変換し、 その前または後に複合体を形成していな いポリアミンを除去し、 その後、 標識を検索することを特徵とする、 核酸 の検出法、
( 2 )標的核酸を付着または含有している疑のある固形担体に、 （ィ）測定 可能なシグナルを発生し得る標識またはその前駆体を結台させた標的核酸 にハイプリダイズし得るプローブをハイプリダイゼーション条件下で接触 させて、 ハイプリッ ドを形成させ、 前駆体を用いた場合は標識に変換し、 その前または後にハイブリツ ドを形成していないプローブを除去し、 その 後、 標識を検索することを含む第 1の検出操作、 および（口）測定可能なシ グナルを発生し得る別の標識またはその前駆体を結合させたポリアミンを 接触させて、 核酸とポリアミンとの間で複合体を形成させ、 前駆体を用い た場合は標識に変換し、 その前または後に複合体を形成していないポリア ミ ンを除去し、 その後、 標識を検索することを含む第 2の検出操作、 を組 合わせて任意の順序で実施することを特徵とする、 標的核酸とそれ以外の 核酸の識別検出法および
( 3 ) (ィ）酵素で標識したポリアミ ン、 および（口）酵素作用によりシグナ ルを発生する色原体を含む、 核酸検出用キッ トを提供するものである。 この発明で使用する用語について説明すると次の通りである。
「核酸」 は、 プリンまたはピリ ミジン塩基、 ペントースぉよびりん酸が 結合してなるヌクレオチドを基本単位とし、 りん酸のエステル結合によつ て重合したポリマーである。 塩基としては、 アデニン、 シトシン、 グァニ ン、 チミン、 ゥラシルおよびそれらの修飾塩基が含まれる。 また、 核酸に は糖部分の違いによって D N Aと R N Aがあり、 さらに 1本鎖、 2本鎖等 および立体構造の違いがある。
「固形担体」 は、 核酸の分離または検出に用いられる薄板、 シート、 ス トリップ、 スラブ、 フィルム、 メンブラン等を包含する。 代表的なものは、 ァガロースゲル、 ナイロン膜、 濾紙、 ニトロセルロース膜等である。
「標識」 は、 測定可能なシグナルを発生する物質であり、 酵素 (基質と の組合わせとして）、 スピン化合物、 放射性核種、 蛍光物質、 化学発光物 質、 吸光物質等が含まれる。 好ましい標識は酵素である。 酵素としては、 ペルォキシダーゼ、 /3—ガラク トシダーゼ、 グルコースォキシダーゼ、 ァ ルカリホスファタ一ゼ、 グルコース一 6—りん酸脱水素酵素等が含まれる c 酵素活性の測定法には、 吸光度法、 蛍光法および化学発光法がある。 例え ば、 ペルォキシダ一ゼは色原体としては 2 , 2 '—アジノジ（3—ェチルベ ンズチアゾリン）一 6 '—スルホン酸（A B T S )のような基質を用い、 生じ た色素を吸光度法で測定する。 グルコースォキシダーゼはグルコースを基 質として過酸化水素を生ずるので、 ペルォキシダーゼと共役させて上と同 様に測定できる。 yS—ガラク トシダーゼは 0—二トロフヱニルー S— D— カラク トシドを基質として測定できる。 蛍光法としては、 例えばペルォキ シダーゼは p—ヒドロキシフエニルプロピオン酸を基質として、 β— iiラ ク トシダーゼはフルォレスセィンー; S— D—ガラク トシドまたは 4ーメチ ルゥンベリフヱリル一 — D—ガラク トシドを基質として、 またホスファ ターゼはゥンベリフユリルりん酸またはブロモク口ロインドリルホスフェ 一ト ニトロブル一テトラゾリゥムを基質として測定できる。 化学発光法 としては、 例えばペルォキシダーゼはルミノールと過酸化水素を基質とし て測定できる。 標識 (例えば酵素）をポリアミ ンに結合させるには、 例えば ベンゾキノン（キンヒ ドロン）、 ビス [2—（スクシンイミ ドカルボ二ルォキ シ）ェチル]スルホン（B S OCOE S)、 ビス（スルホスクシンィ ミ ジル）ス ベラート（B S 3)、 1, 2—ジフルオロー 2, 4—ジニトロベンゼン（DF DNB)、 4, 4'ージイソチオシァノー 2, 2'—ジスルホスチルベン、 ジ ナトリウム塩（CD I D S). アジピンィミ ド酸ジメチル . ジ塩酸塩、 N— (7—マレイミ ドブチリルォキシ）スクシンィ ミ ド（GMB S：)、 N - ( 4 - アジ ドフヱ二ルチオ）フタルイ ミ ド（APT P：)、 N—スクシンィ ミ ジル一 6— (4'—アジドーフエニル）ー 1, 3'—ジチォプロピオナート（SADP) 、 ピリジンジスルフィ ド、 チオフタルイミ ド等の架橋試薬を用いる。
「標識前駆体」は、 例えば阻害物質でブロックされた標識のように、 標識 に転換され得る物質である。
「シグナル」は、 可視光、 蛍光、 放射能、 その他の電磁波等である。 測定 値をそれを発生した物質の量と関連づけることができるものが好ましい。
「標識の探索」は、 上記のようなシグナルを肉体的または機械的手段で検 出することを含む。
「ポリアミン」は、 第 1級アミノ基を 2個以上有する脂肪族骨格の化合物 であり、 天然（生体）ァミ ンおよび合成ポリマーが含まれる。 通常炭素原子 数 3〜50、 好ましくは 6〜15または 20程度の脂肪族鎖の両端に第 1 級ァミノ基があり、 鎖がィミノ基で中断されることがあり得る。 代表的な 天然ポリアミンは、 1, 3—ジアミノプロパン、 プトレツシン、 カダベリ ン、 ノルスペルミジン、 スペルミジン、 ホモスペルミジン、 ァミノプロピ ルカダベリ ン、 テルミ ン、 スペルミ ン、 テルモスペルミ ン、 カナバルミ ン、 ァミノペンチルノルスペルミジン、 N， N'一ビス（ァミノプロピル）カダべ リン、 力ルドペンタミン、 ホモ力ルドペン夕ミ ン、 力ルドへキサミン等で ある。 代表的な合成ポリアミンには、 ジエチレントリァミン、 トリェチレ ンテトラミ ン、 テトラエチレンペン夕ミ ン、 ペンタエチレンへキサミ ン、 へキサメチレンジァミン、 ポリエチレンィミン（平均分子量約 10, 000 一約 200, 000、 好ましくは約 20, 000—約 100, 000、 例え ば約 50, 000—約 60, 000のもの、 例えば BASF社のポリ ミン G 35)等が含まれる。
「複合」または「複合体」は、 静電的およびノまたは物理的結合または結合 物を意味し、 共有結合または結合物を意味しない。 通常、 複合は可逆的で あり、 容易に解離させることができる。
「ハイプリダイズ」または「ハイプリダイゼーション」とは、 2本の 1本鎖 ポリヌクレオチドが相補的またはほぼ (例えば 70%以上、 好ましくは 8 0または 85%以上、 特に 90または 95%以上)相補的である場合に、 結合して 2本鎖を形成することをいう。
「ハイブリダィゼーション条件下」とは、 ハイブリダィズし得るポリヌク レオチドがハイプリッ ドを形成する条件をいう。 一般に、 この条件は、 温 度として約 70 以下、 好ましくは約 60°C以下、 通常、 約 40— 55°C を含む。 時間は短時間で充分である。
-0- 「標的」は、 関心の対象であることを表わす。
「プローブ」は、 標的 DN Aまたはその一部分と相補性が高い DN Aであ り、 通常、 標的 DN Aより短く、 約 5— 50塩基、 好ましくは約 10— 4 0塩基、 例えば約 20— 30塩基からなる。
図面の簡単な説明
図 1は実施例 1における； I D N Aの検出結果を示す図である。
図 2は実施例 1におけるェシエリキア ·コリ（E.coli)rRNAの検出結 果を示す図である。
図 3は実施例 1における； I Hind III DN Aの電気泳動の写真である。 図 4は実施例 1において、 pBR322に挿入された DNA断片を制限 酵素で消化したもの （本発明による発色） の電気泳動の写真である。 図 5は実施例 1において、 pBR 322に挿入された DN A断片を制限 酵素で消化したもの （X線像） の電気泳動の写真である。
図 6は実施例 1における λ Hind III DNAの電気泳動の写真である。 図 7は実施例 1における図 6と同じ； I Hind III DNAの電気泳動の写 真である。
図 8は図 7における色の違いを示す図である。
発明を実施するための最良の形態
代表的な実施方法を概説すると次の通りである。
ベンゾキノンを用いる酵素とポリアミンの結合を例にとると、 反応は、 下記反応式に従って進行すると考えられている。
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000009_0002
[上式中、 E N Zは酵素からアミノ基を除いた残基、 P Aはポリアミ ンか らァミノ基を除いた残基、 Xは第 1級または第 2級ァミノ基である] この反応は、 例えば次のように行なわれる。 透析のような手段で精製し た酵素 (約 1 5 0部）にべンゾキノン（約 1部）を加え、 好ま-しくは僅かに加 温して反応させるとワイン赤色の反応液となる。 これをゲル濾過等の方法 でクロマトグラフィ一的に分離すると紫色、 黄色およびワイン赤色のフラ クシヨンに分かれる。 ワイン赤色のフラクションをとり、 弱塩基の存在下 にポリアミン (酵素の数分の 1量）を僅かな加温下に反応させ、 適宜精製す ると酵素標識したポリアミンが得られる。
核酸の検出は、 例えば次のようにして行うことができる。
(ィ）核酸試料をメンブランにドッ トスポッ 卜するか、 またはァガロース ゲル電気泳動後メンブランにエレク トロ トランスファーし、 ベーキングし て固定する。 緩衝液に入れたうし血清アルブミンで処理後、 標識または前 駆体を結合したポリアミンを加えて反応させる。 洗浄後、 標識前駆体の場 合は標識に変換し、 検索する。
(口） DN Aフラグメントをァガロースゲル電気泳動に付し、 サザンブロッ ティングする。 放射能標識したプローブを用いて、 加温下にプレハイプリ ダイゼーシヨン後、 ハイブリダィゼーシヨンを行なう。 洗浄後、 X線フィ ルムで DN Aの位置を調べる。 その後、 標識または前駆体を結合したポリ ァミンを反応させ、 適宜発色させて検索する。 -
(ハ） DN Aフラグメントをドッ トブロッティングによるかまたはァガロ ースゲル電気泳動後のサザンプロッティングによりメンブランに固定し、 プレハイブリダイゼーション後 Bio— DNAプローブを用いてハイブリダ ィゼーシヨンを行なう。 洗浄、 ブロック後、 酵素標識したストレブトアビ ジンを反応させ、 洗浄、 プレインキュベーション後さらに別の酵素で標識 したポリアミンを反応させる。 洗浄後、 それぞれの酵素の発色処理に付す ると、 2色の発色により、 ハイブリダィズした DN Aとハイブリダィズし ない DNAが異なる色に発色した像が得られる。 例えば、 アルカリホスファ ターゼ/ BC I P— NBT系は紫、 ペルォキシダーゼ ZDAB系は褐色に 発色する。 この方法において、 プローブとポリアミ ンの処理順序は逆にす ることもできる。
上記のようにして発色処理したものは、 X線フィルムとしてではなくメ ンブランそのものが発色しているので、 直接メンブラン上に核酸を確認す ることができる。 また、 PCRの場合、 同程度の分子量をもつが配列が異 なる増幅物を、 ハイブリダィゼーションにより区別することができる。 この発明の方法は、 危険な試薬を用いる必要がなく、 高感度（例えば、 DNAは数ピコグラム、 RNAは数十ピコグラム）であり、 しかも、 操作 が容易であるという利点を有する。 なお、 この発明の実施に必要な試薬類 をキッ トにしておくと、 操作がさらに容易となる。 実施例
以下、 実施例によりこの発明の具体的実施態様を説明する。
実施例 1
(ペルォキシダーゼまたはアルカリホスファタ一ゼ標識ポリエチレンィ ミンの製造）
アルカリホスファターゼ（C I P、 ベーリンガー ·マイハイム社、 グレ 一ド 1 )0.8 lml/4.05mg/7 δ 00単位または西洋わさびペルォキ シダーゼ（ベーリンガー ·マンハイム社製）を、 40°Cで一夜、 0. 1Mり ん酸緩衝液で透析し、 ィムノケミストリ一（ I圏 uno C hemistry) 14巻 7 67- 774頁（1977年)記載の方法にしたがって、 p—べンゾキノン（1 20 /zl/3 OmgZエタノール）と遮光下 37°Cで 60分間反応させ、 セファ デックス G— 25でゲル濾過後、 ワイン赤色のフラクション（2. 7ml)を 分取した。 これに 300 /zlの 1M— NaHC03(pH9.0)、 30 1のポ リエチレンィミン（ェポミン）を加え、 よく混合した。 これを 37 °Cで遮光 下に一夜反応させた後、 5mMりん酸緩衝液（pH6.8)で透析して酵素 * ポリエチレンイミン · コンジュゲートを得た。 本品は 4てで 1年以上安定 であった。
(メンブラン上の核酸のプロッティング）
「モレキュラー · クローニング」（"Molecular Cloning", 1982年、 コールド ·スプリング ·ハーバー 'ラボラ トリー）記載の方法に従って、 ナイロンメンブラン（ポール社製 Biodyne A)上に変性した； I Hind I I I DNAまたはェシエリキア · コリ（E.coli)K— 12 rRNAをドッ ト プロッティングした。 また、 ベクター pBR322の Hind I I I 部位 にランダムクローニングしたスタフイロコッカス 'ァウレウス（St. aureu s)ゲノム DNAのクローンを、 定法により増幅、 抽出した後、 Hind I I Iで処理した。 試料を 1%ァガロースゲル電気泳動で分離後、 メンブラン 上にエレク トロブロッテイングした。 （40V, 4時間）。 同様に、 λΗίη d I I I DNAもブロッテイングした。 これらの DNAまたは RNA試 料はべ一キング（80°C、 2時間)することにより、 メンブラン上に固定し た
(メンブラン上にプロッ トした核酸の検出）
固定された DN Aまたは RN Aを含むメンブランを 5mMりん酸緩衝液 一 1%うし血清アルブミン（B S A、 シグマ社、 フラクション V)に浸し、 室温で 60分間インキュベートした。 次に、 アルカリホスファターゼ（ま たはペルォキシダーゼ）標識ポリエチレンィミンを 100 1 2 Omlの割 合で加え、 37°Cで 120分間インキュベートした。 メンブランを 5mM りん酸緩衝液一 1%BSA— 0.1%ツイーン 20で 10分間づっ 3回洗 浄し、 0.1Mトリス HCl(pH9.5)— 1 OmM— MgCl2でリンスした。 ブロモク口ロインドリルホスフエ一ト（B C I P)7 Smg/ml 0.1Mトリ ス HC 1 ( H 9.5) - 1 OmM-MgCl2 20 mlおよびニトロブル一テ トラゾリゥム（NBT)5 OmgZml各 300 Omlを加えた発色液中 でメンブランを発色させた。
(サザン .ブロッ ト 'ハイブリダィゼーシヨン）
ス夕フィロコッカス ·ァゥレウス（St. aureus)ゲノム kbpフラグメント DNAを使用し、 常法に従って32 P— dC TPまたは Bio— 11— dUTP (BRL)を用いてニック トランスレーション反応を実施し、 32P— DNA または Bio— DNAを調製した。 変性したプローブを含むハイプリダイゼ ーシヨ ン緩衝液（5 X S S C、 0.1%BSA、 0.1%ツイーン 20)によ り、 メンブランを 42— 55 °Cで一夜ハイプリダイゼーション処理した。 その後、 55°Cで 30分間、 0.16 X S S C— 0.1%ツイーン 20で洗 浄した（時点 A)。
32P— DNAプローブを用いた場合は、 時点 Aでメンブランを湿ったま まサランラップに包み、 X線フィルムに露出してシグナルを検出した。 そ の後、 メンブランを 42 °Cで 3時間以上にわたり 3%BSA— 0.1%ッ ィーン 20—りん酸緩衝食塩水（PBS)でブロッキング処理し、 ペルォキ シダーゼ標識ポリエチレンィミンを 100 ilZシー卜の割で 0.1%BS A— 0.1%ツイーンー PB Sに加え、 2— 3時間反応させた。 ついで、 0.1 %ツイーン 20— PBSで 20分間づっ 3回洗浄し、 ジァミノベン ジディン（DAB)— H202系で発色させた。
Bio— DNAプローブを用いた場合は、 時点 A後、 PBS— 0.5%ッ ィーン 20を用いて室温で 60分間処理した。 ついで、 アルカリホスファ タ一ゼ標識ストレプトアビジンを含む P BS— 0.05%ツイーン 20に より室温で 20分間処理後、 ？83— 0.5%ッィーン20で10分間づ つ 2回洗浄した。 次に、 PBS— 1%BSA— 0.1%BSA— 0.1%ッ ィーン 20を用い室温で 20分間プレインキュベーション後ペルォキシダ ーゼ標識ポリエチレンイミンを加え、 42°Cで 3時間反応させた。 メンブ ランを PBS— 0.1%ツイーン 20で 10分間づっ 3回洗浄後、 0.1M トリス HC 1 (pH9.5) 一 1 OmM— MgCl2でリ ンスし、 B C I P— N BT系を用いて室温で 20分間発色処理した。 ？83で10分間づっ 3回 洗浄後、 さらに DAB— H202系で発色処理した。 メ ンブランを PBS— 0.1%ツイーン 20で洗浄後保存した。
(結果）
(ィ） 2DNAまたはェシエリキア · コリ（E.coli)rRNAをドッ トス ポッ トし、 アル力リホスファターゼ標識ポリエチレンィミンで検出した結 果をそれぞれ図 1および図 2に示す。 スポッ ト量は、 図 1の上から λϋΝ A① 4.7/!g、② 470ng、③ 47ng、 ④ 4.7ng、⑤ 47 Opg、⑥ 47p g、 ⑦ 4.7pg、 ⑧ 470fg、 図 2の上からァ RNA① 5/;g、② 500ng、 ③ 50ng、④ 5ng、 ⑤ 500pg、⑥ 5 Opgである。 DNAでは 470fg、 RNAでは 5 Opgの感度で検出できた。
(口） AHind I I I DNAの希釈系列を作り、 その各試料をァガロー スゲル電気泳動で分り後、 ゲルからメンブランへエレク トロブロッテイン グしたものを、 アル力リホスファターゼ標識ポリエチレンィミンで検出し た結果を図 3に示す。 ここでは、 希釈系列（0.06/ig)の試料においても、 ゲル分り後のェチジゥムブロミ ド染色パターンと、 ブロッテイングの検出 パターンは完全に一致していた。 これによりこの発明の方法の正しさが裏 づけられた。
(ハ） ；iHind I I I D N Aのサイズマーカーを含む PB R 322に挿 入された DN A断片を、 制限酵素で切り出した後、 ァガロースゲル電気泳 動で分りし、 メンブラン上にエレク トロブロッテイングし、 32P— DNA プローブでハイブリダィズして、 そのハイブリ ッ ドを X線フィルムに露出 して、 シグナル （図 5) を得た。 このハイブリダィズした DN Aの種類を 特定するために、 そのメンブランをペルォキシダーゼ標識ポリエチレンィ ミン処理し、 すべてのブロッテイングされた DNAの位置 （図 4) を確認 した。
(二） 上記（ハ）と同様に行なったものを、 Bio— DNAプローブを用い た系でハイプリダイズすることにより、 ハイプリダイズした DNAとハイ ブリダィズしなかった DN Aを同時に検出した。 ここでは、 Bio—プロ一 ブとアル力リホスファターゼストレプ卜アビジン、 ペルォキシダーゼ標識 ポリエチレンィミンのそれぞれ酵素を使い分けることにより、 ハイプリダ ィズした D N Aと非ハイブリダイズ D N Aを 2重染色することにより区別 することができた。 結果を図 7に示す。 また、 色の違いを図 8に示す。 図 中、 斜線部は褐色 （ペルォキシダーゼ標識ポリエチレンィミン系） 、 黒色 部は紫色 （アルカリホスファターゼノストレブトアビジン系） を示す。 そ のパターンは、 同様に行なってェチジゥムブロミ ド染色した結果 （図 6 ) と一致していた。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 核酸を付着または含有している疑のある固形担体に、 測定可能なシグ ナルを発生し得る標識またはその前駆体を結合させたポリアミンを接触さ せて、 核酸とポリアミンとの間で複合体を形成させ、 前駆体を用いた場合 は標識に変換し、 その前または後に複合体を形成していないポリアミンを 除去し、 その後、 標識を検索することを特徵とする、 核酸の検出法。
2. 測定可能なシグナルを発生し得る標識またはその前駆体が酵素である、 請求項 1記載の核酸の検出法。
3. 酵素が、 アルカリホスファタ一ゼまたはペルォキシダーゼである、 請 求項 2記載の核酸の検出法。
4. 酵素が架橋試薬を介してポリアミ ンに結合している、 請求項 2または 3記載の核酸の検出法。
5. 架橋試薬がベンゾキノンである、 請求項 4記載の核酸の検出法。
6. ポリアミンが、 炭素原子数 3〜 5 0の脂肪族鎖であり、 鎖の両端に第 1級ァミノ基があり、 鎖はィミノ基で中断されることがあり得る、 天然ポ リアミンまたは合成ポリアミンである、 請求項 1または 4記載の核酸の検 tlj法。
7. ポリアミ ンが、 炭素原子数 6〜1 5の脂肪族鎖である、 請求項 6記載 核酸の検出法。
8. ポリアミンが、 合成ポリアミンである、 請求項 7記載の核酸の検出法。
9. 合成ポリアミンが、 ポリエチレンィミンである、 請求項 8記載の核酸 の検出法。
1 0. 標的核酸を付着または含有している疑のある固形担体に、
(ィ）測定可能なシグナルを発生し得る標識またはその前駆体を結合させ た標的核酸にハイプリダイズし得るプローブをハイプリダイゼ一ション条 件下で接触させて、 ハイプリッ ドを形成させ、 前駆体を用いた場合は標識 に変換し、 その前または後にハイブリツ ドを形成していないプローブを除 去し、 その後、 標識を検索することを含む第 1の検出操作、 および
(口）測定可能なシグナルを発生し得る別の標識またはその前駆体を結合 させたポリアミンを接触させて、 核酸とポリアミンとの間で複合体を形成 させ、 前駆体を用いた場合は標識に変換し、 その前または後に複合体を形 成していないポリアミンを除去し、 その後、 標識を検索することを含む第
2の検出操作、
を組合わせて任意の順序で実施することを特徴とする、 標的核酸とそれ以 外の核酸の識別検出法。
1 1 . 第 1の検出操作がサザン ·プロッ ト ·ハイプリダイゼーション法に より行われる、 請求項 1 0記載の核酸の検出法。
1 2. 測定可能なシグナルを発生し得る標識またはその前駆体が酵素であ る、 請求項 1 0記載の核酸の検出法。 -
1 3. 酵素が、 アルカリホスファターゼまたはペルォキシダーゼであ,る、 請求項 1 2記載の核酸の検出法。
1 4. 酵素が架橋試薬を介してポリアミンに結合している、 請求項 1 2ま たは 1 3記載の核酸の検出法。
1 5. 架橋試薬がベンゾキノンである、 請求項 1 4記載の核酸の検出法。
1 6. ポリアミンが、 炭素原子数 3〜 5 0の脂肪族鎖であり、 鎖の両端に 第 1級ァミノ基があり、 鎖はィミノ基で中断されることがあり得る、 天然 ポリアミンまたは合成ポリアミンである、 請求項 1 0または 1 4記載の核 酸の検出法。
1 7. ポリアミンが、 炭素原子数 6〜1 5の脂肪族鎖である、 請求項 1 6 記載核酸の検出法。
1 8. ポリアミンが、 合成ポリアミンである、 請求項 1 7記載の核酸の検
1 9. 合成ポリアミンが、 ポリエチレンィミンである、 請求項 1 8記載の 核酸の検出法。
2 0.
(ィ）酵素で標識したポリアミン、 および
(口）酵素作用によりシグナルを発生する色原体
を含む、 核酸検出用キッ ト。
2 1. 酵素が、 アルカリホスファターゼまたはペルォキシダーゼである、 請求項 2 0記載の核酸の検出法。
2 2. 酵素が架橋試薬を介してポリアミンに結合している、 請求項 2 0ま たは 2 1記載の核酸の検出法。
2 3. 架橋試薬がベンゾキノンである、 請求項 2 2記載の核酸の検出法。
2 4. ポリアミンが、 炭素原子数 3〜 5 0の脂肪族鎖であり、 鎖の両端に 第 1級ァミノ基があり、 鎖はィミノ基で中断されることがあり得る、 天然 ポリアミンまたは合成ポリアミンである、 請求項 2 0または 2 2記載の核 酸の検出法。
2 5. ポリアミンが、 炭素原子数 6〜1 5の脂肪族鎖である、 請求項 2 4 記載核酸の検出法。
2 6. ポリアミンが、 合成ポリアミンである、 請求項 2 5記載の核酸の検 出法。
2 7. 合成ポリアミンが、 ポリエチレンィミンである、 請求項 2 6記載の 核酸の検出法。
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