WO1995002701A1 - Verfahren zur identifizierung von menschlichen und tierischen zellen mit der fähigkeit zu unbegrenzter proliferation oder zur tumorbildung - Google Patents

Verfahren zur identifizierung von menschlichen und tierischen zellen mit der fähigkeit zu unbegrenzter proliferation oder zur tumorbildung Download PDF

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WO1995002701A1
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cells
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human
protein
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Hinrich Johann Abken
Winfried Albert
Herbert Jungfer
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Boehringer Mannheim Gmbh
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    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification

Definitions

  • the invention relates to DNA-protein complexes, proteins, DNA sequences and antibodies which are suitable for the detection of cells with the ability for unlimited proliferation or for tumor formation, methods for obtaining such DNA-protein complexes, proteins or DNA sequences as well as their use for the identification of animal and human cells capable of unlimited proliferation or of tumor formation.
  • All differentiated human and animal cells have a limited potential for cell proliferation in vivo and in vitro before they are subject to cell aging (senescence) and cell death.
  • the number of cell divisions of a cell that are still possible at a certain point in time depends on the degree of differentiation of the cell, the age and the species of the donor from whom the cell is derived, and the duration of the cultivation of the cells that may have already started (Goldstein, S .: Replicative Senescence, Science 249 (1990), 1129-1133).
  • unlimited proliferation is often found in neoplastic transformed cells. As a result, they form constantly growing cell groups, which lead to the formation of a tumor and ultimately, together with the changed expression of other properties of these cells, to the tumor disease.
  • Such malignancies are clinical Tumors are distinguished from benign tumors by their rapid growth and frequent metastasis.
  • the neoplastic transformation of the cell is characterized by a heterogeneous picture of numerous changes in cellular morphology and physiology, which are also dependent on the degree of differentiation of the cells. So far, only a few molecularly definable parameters of the neoplastic transformation are known, such as. B. an altered degree of methylation of certain genes (W. Doerfler et al., Eukaryotic DNA methylation: facts and problems, FEBS Letters 268 (1990), 329-330), an altered gene expression or an altered phosphorylation of certain gene products.
  • This provides a controlled, short-term (transient) cell proliferation and only a temporary suppression of the programmed cell death in response represents a physiological stimulation.
  • the transient proliferation of normal cells is inhibited again after tissue regeneration by signals that have not yet been identified.
  • antibodies are used to detect proliferating malignant cells, which recognize antigens that are preferentially expressed by proliferating tumor cells, such as B. Ki67 (D.C. Matthews, F.O. Smith, I.D. Bernstein, Monoclonal antibodies in the study and therapy of hematopoietic cancers, Curr. Opinion Immunol. 4 (1992), 641-646;
  • the object of the invention is to identify cells with the potential for unlimited proliferation, in particular malignant tumor cells, quickly and reliably, without these cells having to be cultivated in vitro or propagated after injection into experimental animals. Cells with the potential for unlimited proliferation should be differentiated from cells with transient proliferation in a regenerating tissue cluster.
  • a DNA-protein complex (hereinafter referred to as a complex) which is suitable for the detection of human or animal cells with the ability for unlimited proliferation or for tumor formation and which can be obtained by isolating a mitochondrial-free fraction of the Cytoplasm from permanently divisible human or animal cells, which has a density of about 1.82-1.89 g / cm 3 in a cesium chloride gradient, and isolation of the complex from this fraction by extraction with phenol and precipitation with ethanol.
  • cytoplasm or a suitable cytoplasmic fraction with a complex according to the invention is used as standard in a gel electrophoresis, by determining the DNA content or by reaction with specific antibodies.
  • cytoplasts from human or animal cells that are capable of permanent division are obtained by known methods (see, for example, EP-BO 093 436, EP-BO 256 512 and Proc. Natl. Acad. Sci. 85 (1988), 468-472 ) and lysed, e.g. B. with the help of detergents such as NP40 or SDS (Wigler and Weistein,
  • the mitochondria are separated from this cytoplast fraction, preferably with the aid of a sucrose gradient (J. Biol. Chem. 249 (1974) 7991-7995). Those fractions that do not contain mitochondria are included
  • RNase preferably RNase A and RNase T1 as well as
  • Proteinase such as B. Proteinase K and Pronase incubated. From this approach, a fraction, which in one
  • Cesium chloride gradient has a density of approx. 1.82-1.89 g / cm 3 , enriched and a complex is isolated from this fraction by extraction with phenol and precipitation with ethanol.
  • a fraction which has a density of approximately 1.82-1.89 g / cm 3 in a cesium chloride gradient can be obtained either by centrifugation in a CsCl density gradient or by electrophoretic separation according to methods familiar to the person skilled in the art take place (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd edition, 1989).
  • the mitochondrial-free fraction of the cytoplasm used to isolate the complexes can alternatively be obtained by repeated freezing and thawing of the cells or by obtaining a cell fraction which is free of nuclear DNA. Such a fraction is preferably obtained by lysing the cells with sodium chloride and SDS ("Hirt extraction", J. Mol. Biol. 26 (1967) 365-369) and subsequent centrifugation. The complexes can then be isolated from the supernatant. In a preferred method, the complexes are isolated by sedimentation from a cytoplasmic lysate of the cells to be examined using a salt gradient.
  • the cells are lysed in a buffer containing Mg 2+ (50 mmol / l Tris-HCl, pH 7.2, 10 mmol / l EDTA, 3 mmol / l MgCl 2 ) by repeated freezing and thawing without using detergents, the cell nuclei were sedimented by centrifugation at 6000 ⁇ g and the supernatant was digested with Proteinase K (100 ⁇ g / ml) for 1 h at 60 ° C. The released complexes are isolated by centrifugation (150,000 xg, 10 h) through a CsCl two-stage gradient, the lower fraction having a density of approx.
  • Mg 2+ 50 mmol / l Tris-HCl, pH 7.2, 10 mmol / l EDTA, 3 mmol / l MgCl 2
  • the complexes are released by freezing and thawing in the Mg 2+ -containing buffer without having to lyse the cell nuclei or use detergents.
  • the complexes are stable to proteinases, while cytoplasmic organelles and membranes are broken down.
  • the complexes have a very high density (approx. 1.86 g / cm 3 ) and can thus be separated from chromosomal or other cytoplasmic DNA using salt gradients. DNA-protein binding is stable against high salt concentrations.
  • the complexes can be obtained from the cytoplasm of any transformed cells, in particular permanently growing human or animal cells, or of tumor cells, in particular those which have been obtained from tumor biopsies.
  • transformed cells are to be understood as cells that have been immortalized by an agent. Permanently proliferating cells of different species (e.g. human, mouse, rat) and different degrees of differentiation (fibroma, myeloma, ascites cells) contain complexes that are in their
  • the complexes according to the invention are therefore specific for the species and degree of differentiation of the cells.
  • complexes are therefore preferably isolated from cells of the same species and of a similar cell type as the cell to be examined. So z. B. for the detection of mouse fibroblasts / fibroma cells or mouse ascites tumor cells with unlimited proliferation, complexes which are transformed from cytoplasts transformed mouse L cells (L929 cells, ATCC CCL 1) or EhrlichAscites cells (ATCC CCL 77) were isolated by the method described.
  • cytoplasmic DNA fraction with a density of 1.86 g / cm 3 persists in cells of Hodgkin's lymphoma.
  • This DNA is also linked to proteins.
  • the DNA molecules contained in the fraction have a length between 50 and 500 bp. As with cells from mouse tumors, these are linear DNA molecules. However, they do not hybridize with those from mouse tumor cells. This shows that both animal and human lymphoma cells contain cytoplasmic DNA sequences according to the invention.
  • the fraction according to the invention is also found in human tumor cells of colon and breast cancer and of human melanoma.
  • the proteins or the DNA can be isolated from the complexes, which then also enables detection of human or animal cells with unlimited proliferation or the ability to form tumors.
  • proteins with a molecular weight of approx. 52, 62 or 64 kD which are suitable for the detection of human or animal cells with the ability for unlimited proliferation or for tumor formation and which are obtainable by Treatment of a complex according to the invention with DNase I and chromatographic or electrophoretic isolation of the approximately 52, 62 or 64 kD large released thereby
  • the complexes are treated with DNase I and the degraded nucleic acid is separated from the proteins by gel filtration, which are simultaneously separated according to their size.
  • Proteins with a size of 52, 62 and 64 kD are obtained using complexes from mouse L cells (L929) or Ehrlich ascites tumor cells. These proteins are characterized in that they are able to bind the pLC 108 DNA (SEQ ID NO 1) cloned according to the invention in the presence of 8 mM Zn 2 + .
  • the proteins from Ehrlich ascites cells are characterized in that they are able to bind the cloned pEFC38 DNA (SEQ ID NO 29) in the presence of 8 mM Na + .
  • a matrix-bound DNase is preferably used for the preparation of these proteins, e.g. B. a DNase covalently coupled to Sepharose.
  • the invention furthermore relates to antibodies which are suitable for the detection of human or animal cells with the ability for unlimited proliferation or for tumor formation and which can be obtained by immunizing animals with an invention
  • the DNA content is also suitable for the detection.
  • Another object of the invention is therefore a DNA which is suitable for the detection of human or animal cells with the ability for unlimited proliferation or for tumor formation and which can be obtained by cloning or enzymatically increasing the DNA of a complex according to the invention.
  • the DNA of the complex according to the invention can be ligated like an isolated DNA in cloning vectors or enzymatically z. B. can be amplified in a PCR, although this DNA is so tightly bound to the proteins in the complexes that it can neither be detached by detergents, proteases, high salt concentrations nor by heating.
  • the DNA can be obtained by the DNA of the complexes e.g. B. in common vectors such. B. pUC19, ligated and in the skilled worker familiar organisms, such as. BE coli HB101 or E. coli DH5 ⁇ , is cloned.
  • the recombinant clones which contain the DNA sequence according to the invention are then hybridized with the complexes according to the invention identified and the DNA isolated.
  • 20 recombinant plasmid clones from L929 cells (ATCC CCL 1) and 25 recombinant plasmid clones from Ehrlich-Ascites cells (ATCC CCL 77) were obtained, which are suitable for the molecular identification of cells with the ability to unlimited proliferation.
  • These DNA sequences are listed in the sequence listing SEQ ID NO 1-45. With the help of these sequences, it is possible to find further suitable DNA sequences of other cells of different degrees of differentiation or of other species for the identification of corresponding cells with the ability for unlimited proliferation.
  • SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 29 are for immortalization of human or animal
  • Suitable cells see also German patent application P 42 18 945.4.
  • the other DNA sequences (SEQ ID NO 2 - 28 and SEQ ID NO 30 - 45) have no immortalizing effect, but are suitable for the detection of human or animal cells with the ability for unlimited proliferation or for tumor formation.
  • a preferred subject of the invention is therefore a DNA according to the invention which contains one of the DNA sequences shown in SEQ ID NO 2-28 or SEQ ID NO 30-45 or hybridizes with one of these sequences.
  • Another preferred object of the invention are DNA which contains one of the DNA sequences shown in SEQ ID NO 46-61 or hybridizes with one or more of these sequences.
  • the nucleic acids SEQ ID NO 46-58 are derived from DNA from Hodgkin cells of the HD 428 line.
  • the sequences of SEQ ID NO 59-61 are from DNA clones of MCF 7 cells (breast carcinoma) derived.
  • the nucleic acids according to the invention can be DNA, but also RNA or nucleic acid analogs, e.g. those in which the sugar phosphate structure is replaced by a polypeptide chain.
  • the nucleic acid can be double-stranded, but it is preferably single-stranded.
  • the invention also relates to the respective complementary
  • Nucleic acids a sequence of at least 15 amino acids, this sequence of at least 15 amino acids being selected from - a sequence which is contained in a sequence according to SEQ ID NO 2-28 or 30-61, - a sequence which is composed of two sequences of the SEQ ID NO 1-45, 46-58 or 59-61,
  • the nucleic acids are particularly preferably between 16 and 100 nucleotides long. Depending on the length, they can be
  • Another object of the invention is a method for obtaining a DNA according to the invention by isolating a complex according to the invention from permanently divisible human or animal cells and cloning or enzymatically multiplying the DNA from this complex.
  • Another preferred object of the invention is a method for obtaining a DNA according to the invention, in which the DNA sequences according to the invention by hybridizing a genomic library or a cDNA bank of human or animal cells with one of the DNA shown in SEQ ID NO 1-61 Sequences are identified and the hybridizing cloned DNA is isolated from the gene bank by known methods.
  • gene banks can be used both from permanently proliferating tumor cells and from normal cells or tissues.
  • Another preferred subject of the invention is a method for obtaining a DNA according to the invention by binding the DNA of human or animal cells to a protein according to the invention, the proteins being based on
  • Nitrocellulose or other carrier membranes are bound and incubated in the presence of Zn 2+ or Na + (e.g. 4 ° C for 30 minutes). It is then washed stringently at a high salt concentration (e.g. 0.1% SDS, 2 ⁇ SSC).
  • a high salt concentration e.g. 0.1% SDS, 2 ⁇ SSC.
  • a particularly preferred object of the invention is a method for obtaining a DNA according to the invention by enzymatic propagation of a DNA or RNA fraction of human or animal cells using oligonucleotide starter molecules that hybridize with one of the sequences shown in SEQ ID NO 1-61. Oligonucleotide starter molecules with a length of 20-30 base pairs are preferably used.
  • the enzymatic multiplication of the desired DNA sequences with the aid of the polymerase chain reaction (PCR) is carried out according to methods known to the person skilled in the art (Mullis and Fallona, Meth. Enzymol. 155 (1987) 335-350, Saiki et al., Science 239 (1988) 487- 491). Both DNA banks and DNA or RNA preparations or can be used as DNA fractions
  • Cell lysates from permanently proliferating or normal senescent cells of humans or animals are used.
  • Another variant of the method according to the invention is finally the chemical synthesis of a DNA according to the invention which has one of the DNA sequences shown in SEQ ID NO 1-61 or parts of these DNA sequences.
  • This synthesis is carried out in accordance with the usual oligonucleotide synthesis methods known to the person skilled in the art (F. Eckstein, ed., Oligonucleotides and analogures: A practical approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford (1991)), preferably with the aid of commercially available oligonucleotide synthesis apparatus.
  • Another object of the invention is a method for the detection of human or animal cells capable of unlimited proliferation or for tumor formation by detection of a complex according to the invention in a mitochondrial-free fraction of the cytoplasm of the cell to be examined.
  • Normal cells with limited proliferation capacity do not contain such complexes in this fraction of the cytoplasm, while cells with unlimited proliferation, such as B. tumor cells, have several hundred copies of these complexes.
  • the complexes according to the invention are secreted.
  • the DNA-protein linkage of these complexes is very stable against proteolytic degradation.
  • the complexes can be detected in cell supernatants for several weeks.
  • the complexes can also be found in peripheral blood, urine or other body fluids and can be detected there.
  • a preferred subject of the invention is therefore a method for the detection of human or animal cells with unlimited proliferation potential or tumor formation by detection of a complex according to the invention in body fluids.
  • the complexes can be determined by their DNA content or by gel electrophoresis, it being possible to carry out complexes according to the invention as a standard for determining a positive reaction.
  • this method cannot distinguish between complexes from different species or tissue types.
  • specific detection is possible using antibodies according to the invention.
  • antibody fragments can also be used which contain the specific antigen recognition regions of the light or heavy chain (V L or V H ) of the antibody.
  • These fragments can with carriers such. B. proteins, sugars or Sepharose, or coupled with dyes to fusion products.
  • a fusion product can preferably be obtained by fusing the coding gene sequences for the antigen recognition regions V L and V H of the antibody with the gene sequences for a carrier molecule, e.g. B. a surface protein of a phage or a capsid protein of a virus, and this hybrid gene is then expressed in vitro.
  • the fusion products (on the surface of phages or viruses or in isolated form) can then be used like an antibody to detect the complexes.
  • the complexes in the cells to be examined can also be detected by hybridizing a DNA fraction of these cells with a DNA according to the invention.
  • the advantage of this method is that such DNA samples can be used to differentiate between cells of different degrees of differentiation (fibroma or azites tumor) and species (mouse or human).
  • Another object of the invention is therefore a method for the detection of human or animal cells with the ability to unlimited proliferation or tumor formation by hybridizing a DNA fraction of these cells with a DNA according to the invention.
  • a cytoplasmic cell fraction which contains complexes according to the invention can be used as the DNA fraction.
  • nuclear, chromosomal DNA of the cells it is also possible to use the nuclear, chromosomal DNA of the cells to be examined for this. It has been shown that nuclear, chromosomal DNA from normal transiently proliferating cells compared to cells capable of unlimited proliferation after restriction digestion and analysis of the restriction fragments obtained in a Southern blot, a different pattern of hybridizing restriction fragments when hybridizing a DNA according to the invention Sequence result. As a rule, additional restriction fragments hybridizing with the samples indicate the presence of cells capable of unlimited proliferation or tumor formation.
  • the DNA sequences according to the invention have such a high sensitivity and specificity that these samples can also be used for hybridization with cells or tissue in situ. Only those cells are marked in the cytoplasm that show an ability for unlimited proliferation or for tumor formation. Cells which have been cultured in vitro as well as cells from biopsies or tissue sections of biopsies can be used for this in situ hybridization, without a cell cultivation step being necessary to multiply cell material.
  • a preferred subject of the invention is therefore a variant of the method according to the invention, in which the hybridization is carried out as in situ hybridization becomes ,
  • the sensitivity of the method can be increased even further by the DNA of the complexes from the cells to be examined enzymatically, in particular with the aid of the polymerase chain reaction according to the method known to the person skilled in the art (Mullis and Fallona, Meth. Enzymol. 155 (1987): 335-350 ; Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491) for the actual detection reaction.
  • a preferred subject of the invention is therefore a special embodiment of the method according to the invention, in which one of a lysate of the cells to be examined or a DNA or RNA fraction of these cells
  • Nucleic acid is amplified enzymatically, using oligonucleotides that hybridize with a DNA according to the invention.
  • the described methods for the detection of cells with the ability for unlimited proliferation or for tumor formation are used for the detection of malignant tumors, the cells of a biopsy, a tissue section or cells or secreted complexes of body fluids from
  • Humans or animals can be used as sample material.
  • the methods described are therefore also suitable for finding such cells.
  • the methods described can also be used in a correspondingly modified form for isolating such cells.
  • Antibodies according to the invention can be used for this and the cells can then be isolated by fluorescence-activated sorting (FACS).
  • Cytoplasmic complexes are isolated from mouse tumor fibroblasts of the L929 line (L929 cells, ATCC CCL 1) and from Ehrlich ascites cells (EAZ, ATCC CCL 77).
  • L929 cells L929 cells, ATCC CCL 1
  • EAZ Ehrlich ascites cells
  • cytoplasts of these cells are obtained by known methods (Wigler and Weistein, Biochem. Biophys. Res. Comm. 63 (1975) 669-674) using cytochalasin B (50 / ig / ml) and lysed by repeated freezing and thawing.
  • the mitochondria are separated from the cytoplast lysate using a sucrose gradient according to J. Biol. Chem. 249 (1974) 7991-7995.
  • the fractions that do not contain mitochondria are added for 30 minutes at 37 ° C with RNase A (20 ⁇ g / ml) and RNase T1 (1000 U / ml) and then with Proteinase K (50 ⁇ g / ml) for 20 - 60 minutes Incubated at 60 ° C. From this approach, the complexes according to known methods of DNA isolation, z. B. by extraction with phenol and chloroform / isoamyl alcohol, isolated and a fraction which has a density of approximately 1.82-1.89 g / cm 3 in a cesium chloride gradient, via a CsCl density gradient (Sambrook et al.,
  • the complexes are dialyzed against 10 mmol / l Tris-HCl, 1 mmol / l EDTA, pH 7.2.
  • the DNA is subjected to a "replenishment reaction" with the aid of the KlenowDNS polymerase in the presence of dNTPs according to methods known to the person skilled in the art (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 2nd Edition 1989), then in the pUC19 vector in the presence ligated from 0-10 U ligase and the recombinant plasmid obtained was cloned in E. coli. When the plasmid is replicated in the bacteria, protein-free copies of this recombinant DNA molecule are produced.
  • Cells of the mouse tumor cytoplast line L929 are lysed in the presence of 50 mmo / 1 Tris HCl pH 7.2, 10 mmol / l EDTA and 1.5 mmol / l magnesium chloride by repeated freezing and thawing and the cell nuclei then separated by centrifugation at 6000 g for 30 minutes. The supernatant obtained in this way is incubated for 20 minutes at 60 ° C.
  • the lower fraction (1 ml) having a density of approximately 1.80 g / cm 3
  • the upper fraction (1 ml) has a density of approximately 1.70 g / cm 3 .
  • the sediment is resuspended in 100 ⁇ l 10 mmol / l Tris HCl pH 7.2, 1 mmol / l EDTA and the amount of the DNA obtained in this fraction is determined as described in Example 1.
  • cytoplasmic complexes in a lysate of these cells is used to detect human or animal cells with the ability for unlimited proliferation or for tumor formation.
  • cytoplasts of these cells are made using known methods (Wigler and
  • WIL-2 human tumor cells unlimited approx. 200 ng
  • HS-Sultan human tumor cells unlimited approx. 100 ng
  • EAZ mouse tumor cells unlimited approx. 500 ng
  • PBL human lymphocytes from peripheral blood
  • WIL-2 human T-leukemia line (ATCC CRL 8062)
  • HS-Sultan human leukemia line (ATCC CRL 1484)
  • MEF mouse embryo. Fibroblasts
  • L929 neoplastic transformed line of mouse L cells
  • EAZ neoplastic transformed line of mouse ascites tumor
  • Cells of the neoplastic transformed mouse line L929 (A) and primary mouse embryo fibroblasts (MEF) (passage 5) (B) are in the presence of 50 mmol / l Tris-HCl, pH 7.2,
  • Proteinase are degradable, the complexes (in contrast to other DNA-protein associations) remain intact under the chosen conditions and are retained in the filter.
  • the nitrocellulose filter is finally washed twice with 20 ⁇ SSC and dried at 120 ° C. for 15 minutes.
  • hybridization with a 32 P-labeled DNA of the sequence shown in SEQ ID NO 1 (pLC108) is carried out according to known methods under stringent hybridization conditions (55%
  • L929 ATCC CCL 1
  • B primary mouse embryo fibroblasts
  • Both cultures contain proliferating cells, whereby the L929 cells have unlimited proliferation potential
  • primary mouse fibroblasts stop their proliferation after about 15-20 passages in culture and then die.
  • a tumor is induced by subcutaneous injection of L929 cells in C3H mice, a frozen section of this tumor is made and transferred to a slide (C).
  • the slides are briefly twice with PBS
  • oligonucleotide 5'GATCTTGAGTTTCCTCGTTGTAGGT3 '(corresponding to nucleotides 1-25 of SEQ ID NO 1) homologous to the sequence shown in SEQ ID NO 1 (pLC108) is used.
  • This oligonucleotide (100 pmol) is in 20 ul reaction buffer (20 mmol / l potassium cocodylate, 25 mmol / l Tris-HCl, pH 6.8, 5 mmol / l CoCl 2 , 0.25 mg / ml bovine serum albumin) with 25 U terminaler Transferase (Boehringer Mannheim GmbH, catalog no. 220582) 20 min.
  • reaction buffer 20 mmol / l potassium cocodylate, 25 mmol / l Tris-HCl, pH 6.8, 5 mmol / l CoCl 2 , 0.25 mg / ml bovine serum albumin
  • 25 U terminaler Transferase (Boehringer Mannheim GmbH, catalog no. 220582) 20 min.
  • DIG-11-ddUTP dideoxy UTP labeled with digoxigenin (1 nmol.
  • the labeled oligonucleotide is separated from the free DIG-ddUTP
  • the slides with the fixed cells or tissue sections with 200 ⁇ l hybridization solution 50% deionized formamide, 4 ⁇ SSC, 10% dextran sulfate, 1 ⁇ Denhardts solution, 0.25 mg / ml denatured tRNA, 0.5 mg / ml denatured herring sperm DNA).
  • the solution is covered with coverslips on the slide and the slides are incubated for 1 hour at 42 ° C in a moist chamber.
  • the solution is then removed again, the cells are overlaid with DIG-ddUTP-labeled oligonucleotide sample (5 ng DNA in 40 ⁇ l hybridization solution) and incubated overnight at 42 ° C. in a moist chamber. Finally, the slides are washed twice for 20 minutes in 2 ⁇ SSC at 42 ° C.
  • the cells are coupled with an FITC-coupled anti-DIG antibody
  • Chromosomal DNA is derived from mouse cell lines of neoplastic transformed fibroblasts L929 (ATCC CCL 1), Ehrlich Ascites Tumor Cells (ATCC CCL 77), Myeloma Ag8.653 cells (ATCC CRL 1580), WEHI164 Fibrosarcoma Cells (ATCC CRL 1751), the permanent proliferating but non-tumorigenic fibroblast line NIH3T3 (ATCC CRL 6473) and from primary mouse embryo fibroblasts (MEF) (passage 6) according to known methods by incubating crushed mouse embryos (type 12) with collagenase (0.1 U / ml ) and Dispase (0.8 U / ml) in PBS for 1 h at 37 ° C (Abken et al., J.
  • the DNA is separated electrophoretically and transferred to a nylon membrane using the Southern blot method. To detect cells with unlimited proliferation, the blot is carried out with a 3 2 P-labeled DNA of the one in SEQ ID NO 29
  • the sizes of the hybridizing restriction fragments differ in the cells examined (Table 2).
  • the following special features can be seen: 1.
  • Cells with limited lifespan and proliferation eg MEF
  • the permanently proliferating mouse fibroma cells L929 carry cytoplasmic DNA-protein complexes that contain a DNA that hybridizes with the LC108 DNA (SEQ ID NO 1).
  • Mouse tumor cells of different degrees of differentiation, such as. B. Ehrlich ascites tumor cells have against it
  • L929 and Ehrlich-Ascites cells are in the cytoplasm of primary fibroblasts with limited proliferation capacity, such as. B. mouse embryo fibroblasts, no such complexes detectable.
  • the DNA of the respective complexes can be specifically amplified and the presence of permanently proliferating cells can be detected in a cell mixture.
  • the experimental conditions chosen also allow a differentiation of the degree of differentiation of these cells, whether they are fibroma or ascites cells.
  • neoplastic transformed mouse cells of lines L929 (ATCC CCL 1) and Ehrlich ascites (ATCC CCL 77) or a mixture of these cells are resuspended in 5 ⁇ l PBS, 15 ⁇ l H 2 O are added, immediately at -20 ° C frozen and then heated to 95 ° C for 10 min. The samples are then in Incubate proteinase K (500 ⁇ g / ml) for 1 hour at 55 ° C and finally heat again at 95 ° C for 10 minutes.
  • PCR technique polymerase chain reaction
  • primer oligonucleotide sequences are partial sequences of the DNA sequences shown in SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 29.
  • Primer A 5'GATCTTGAGTTTCCTCGTTGTAGGT3 '
  • Primer B 5'GATCCAAAGCCCTCTGCTGGCCTCC3 '
  • Primer C 5'GATCCAATCAGCTCAGCCACCCCCA3 '
  • Primer D 5'AAAACCAGGCCCTCCCACATG3 '
  • the DNA of cytoplasmic complexes amplified in this way is separated electrophoretically in a 1% agarose gel and, after incubation with ethidium bromide, made visible in UV light.
  • an amplified DNA (203 bp) is obtained when using the permanently proliferating L929 cells, but not with MEF and Ehrlich-Ascites cells.
  • an amplified DNA (372 bp) is obtained in the lysate of EhrlichAscites cells, but not in the samples of the MEF or L929 cells (Table 3).
  • the mixture of L929 cells or Ehrlich ascites cells in 10 4 mouse embryo fibroblasts shows that with the help of this test, unlimited proliferating cells (L929, EAZ) can be detected in 10 4 normal mouse fibroblasts with limited proliferation capacity.
  • L929, EAZ proliferating cells
  • the primer pairs A, B or C, D
  • the degree of differentiation of the respective malignant cells in the cell mixture can be determined (fibroma [L929] or ascites [EAZ] cells).
  • the number of cells with unlimited proliferation and certain degrees of differentiation in a mixture of normal pre-senescent cells with limited proliferation capacity can be determined (approximately).
  • the DNA of cytoplasmic complexes is amplified by means of specific primer oligonucleotides through the PCR reaction, the specific (to be detected) DNA competing with a constant amount of known, competitive DNA. Because the PCR reaction takes place in the presence of DIG-dUTP, the amplified DNA is labeled by modified nucleotides.
  • the sought, amplified DNA of the complexes is then hybridized to a single-stranded, homologous "capture probe", and the amount of bound, DIG-labeled DNA is then determined using an anti-DIG ELISA.
  • the method is designed so that the experimental steps can be carried out on a microtiter plate prepared for this.
  • Cell mixtures (a total of 10 5 cells) from primary mouse embryo fibroblasts (MEF) and Ehrlich ascites cells (EAZ), which contain the Ehrlich ascites cells to be detected in increasing concentrations, are dissolved in 100 ⁇ l 50 mmol / l Tris-HCl, pH 7.2, 10 mmol / l EDTA, 3 mmol / l MgCl 2 recorded and the cells lysed by freezing and thawing twice.
  • the cell nuclei are sedimented by centrifugation at 6000 ⁇ g for 10 min, proteinase K (50 ⁇ g / ml) is added to the supernatant and the mixture is incubated at 55 ° C. for 1 hour. The proteinase is then inactivated by heating to 95 ° C for 10 min.
  • a capture RNA For the detection of Ehrl ich-Asz ites cells, a capture RNA is used, which has a partial sequence of the sequence shown in SEQ ID NO 29 (372 bp).
  • the DNA sequence (from base pair 26 to base pair 350 of the sequence shown in SEQ ID NO 29) is translated into an SP6 vector, e.g. B. pSPT18, cloned by known methods (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd Edition, 1989). With the aid of the SP6-RNA polymerase, a single-stranded RNA is produced using known methods (Dünn and Studier, J. Mol. Biol. 166: 477, 1983; Kassavetis et al., J. Biol.
  • RNA is terminally labeled with the aid of Biotin-UTP and RNA ligase and purified from non-incorporated BiotinUTP by gel filtration through a Sephadex G50 column (Biorad).
  • Biotin-EFC38 (26-346) capture sample is now available for binding to a streptavidin-coated microtiter plate.
  • a 96-well microtiter plate suitable for ELISA tests is coated with streptavidin, washed and dried. Subsequently, 100 ⁇ l of TE buffer (10th mmol / l Tris-HCl, pH 7.5, 1 mmol / l EDTA) the biotin-labeled "capture sample" [500 ng biotin-EFC38 (26-246)] was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour. The capture sample binds to streptavidin on the microtiter plate via biotin. Finally, the holes in the microtiter plate are washed several times with TE buffer.
  • a DNA is required which competes with the DNA to be determined for the binding of the specific oligonucleotide primers.
  • a double-stranded "competition DNA” is obtained which, like the DNA shown in SEQ ID NO 29, is 372 bp long and whose base pairs 1-25 and base pairs 351-372 are identical to those of the DNA shown in SEQ ID NO 29.
  • base pairs 26-350 are not identical to the DNA sequence shown in SEQ ID NO 29, but instead have a random DNA sequence as can be produced using commercially available oligonucleotide synthesis apparatus.
  • the following PCR reaction mixture is added to the cell lysate (100 ⁇ l) (from 1.):
  • the samples are heated to 95 ° C for 10 min, cooled to 75 ° C, placed in the preheated microtiter plate and slowly cooled (2 ° C per min) to room temperature.
  • sample holes of the microtiter plate are washed several times with 500 ⁇ l PBS each and for 1 hour with an anti-DIG antibody, Fab fragments, coupled with peroxidase (150 mU / ml in PBS, 0.5 mg / ml bovine serum albumin) (Boehringer Mannheim) incubated at 37 ° C.
  • the sample holes are washed twice with PBS and finally incubated with 200 ⁇ l ABTS substrate (peroxidase substrate solution) for 1 hour at room temperature.
  • the absorbance of the color precipitate in the respective sample holes is measured at 405 nm wavelength using a microplate reader. The absorbance is proportional to the amount of PCR-amplified DNA
  • Ehrlich ascites cells can be measured in the cell-free culture supernatant. This method allows the specific determination of certain complexes for the differentiation of tumor cells of different degrees of differentiation.
  • Ehrlich ascites cells and primary mouse embryo fibroblasts are cultivated in Transwell TM (Costar, Cambridge, MA) dishes which allow the cells to be grown in a lower compartment, the culture supernatant being passed through a membrane with pores (diameter 0.3 ⁇ m) is separated from the cells and can be obtained from an upper compartment. Secreted complexes thus diffuse into the cell-free upper compartment.
  • 10 4 , 10 5 and 10 6 cells are sown in 3 ml of medium and after 2 days the cell-free culture supernatant (100 ⁇ l) is obtained from the upper compartment.
  • Proteinase K 50 ⁇ g / ml
  • the sample is then heated to 95 ° C. for 10 minutes to inactivate the proteinase. 2.
  • the ELISA microtiter plate is coated with streptavidin and the biotinylated capture sample is prepared as described in Example 8 with the DNA sequences given there.
  • the competition DNA is also prepared as in Example 8.
  • the culture supernatant is added to the coated microtiter wells and the PCR reaction mixture described in Example 8 is added.
  • the DNA is also amplified in the presence of DIG-dUTP as described there. Finally, the batch is heated at 95 ° C. for 10 minutes and slowly cooled to room temperature (2 ° C. per minute).
  • sample holes of the microtiter plate are washed several times with 500 ⁇ l PBS each and for 1 hour with an anti-DIG antibody, Fab fragments, coupled with alkaline phosphatase (20 ⁇ g / ml in PBS, 0.5 mg / ml bovine serum albumin) (Boehringer Mannheim ) incubated at 37 ° C.
  • the sample holes are washed twice with 500 ⁇ l PBS each. NADPH is added and converted to NADH by the alkaline phosphatase of the bound anti-DIG antibody.
  • AMPAK R Dako
  • DAK R diaphorase
  • NADH is now converted by the enzyme diaphorase after addition of INT into NAD + and formazan.
  • NAD + is made by the alcohol dehydrogenase after adding ethanol converted into acetaldehyde and NADH, which in turn is then ready for implementation by the diaphorase.
  • Each of these cycles creates a molecule of formazan.
  • the absorbance of the dye formed is measured at 492 nm using a microplate reader.
  • the competitive amplification of the DNA of the complexes to be determined using the PCR technique in the presence of DIG-dUTP and the detection of the amplified DNA using the alkaline phosphatase-coupled anti-DIG antibody and the subsequent amplification of the signal by an enzyme cycle allows one extremely sensitive detection of the cell-secreted complexes.
  • the absorbance measured is proportional to the amount of PCR-amplified, DIG-labeled DNA from secreted complexes and directly proportional to the amount of Ehrlich ascites cells used in the diffusion chamber culture.
  • DSM Microorganisms and cell cultures
  • MSM Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig on June 29, 1994 under No. DSM ACC2177, (HD 540) or available from the public collection of the DSM under No. DSM ACC197 (L 428)) Presence of 50 mmol / l Tris, pH 7.2, 10 mmol / l EDTA and
  • the supernatant obtained is at 20 ° C. for 20 minutes Proteinase K (100 ⁇ g / ml) incubated and then layered on a casium chloride two-stage gradient, the lower fraction (1 ml) having a density of approx. 1.80 g / cm 3 and the upper fraction (1 ml) having a density of 1.70 g / cm 3 . After centrifugation for 10 hours
  • the sediment is resuspended in 100 ⁇ l 100 mmol / l Tris-HCl, pH 7.2, 1 mmol / l EDTA, dialyzed against 10 mmol / l TrisHCl, 1 mmol / l EDTA, pH 7.2, and the amount of DNA obtained in this fraction, as described in Example 1, determined.
  • the DNA is subjected to a "replenishment reaction" using KlenowDNS polymerase in the presence of dNTPs according to methods known to the person skilled in the art (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 2nd Edition, 1989), then into the pUC19 vector ligated in the presence of 10 U ligase and the recombinant plasmid obtained was cloned in E. coli. When the plasmid is replicated, protein-free copies of this recombinant DNA molecule are produced in the bacteria.
  • Mouse tumor cells are said to be specific
  • Antiserums against cytoplasmic DNA-protein complexes can be detected.
  • a protein lysate of the cells is produced, separated electrophoretically, onto one
  • the rabbits were made with DNA-protein complexes
  • the cells L929 (mouse tumor cells) and MEF (mouse normal embryonic fibroblasts) are lysed in the presence of 50 mM Tris-HCl, pH 7.2, 10 mM EDTA, 3 mM MgCl 2 , 0.2% NP40. Cell debris, cell nuclei and
  • Membranes are centrifuged at 8,000 g. 2 min. severed. The supernatant (protein fraction) is stored at -20 ° C.
  • nitrocellulose membrane E. Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratories, CSH Press.
  • the membrane is incubated with TBS (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7.6), 3% (v / v) Tween 20, 5% (w / v) dry milk powder for 1 h, then the rabbit antiserum (1: 5,000) is added and incubated again for 1 h.
  • the membrane is washed in TBS, 3% Tween 20, then incubated for 1 h with a goat anti-rabbit antibody (HRPO-labeled) (1: 5,000).
  • HRPO-labeled HRPO-labeled
  • the antiserum reacts with proteins with a molecular weight of approx.
  • the proteins with a molecular weight of 52 kD, 62 kD, 64 kD are also isolated from the tumor protein cells (positive control) by reaction with the isolated DNA-protein complexes Antiserum found.
  • the band at 36 kD provides
  • DNA-protein complexes were obtained from cell line MCF 7 of the breast carcinoma. Part of the nucleic acid is sequenced and contained in SEQ ID NOS 59-61. These sequences can be used as probes for the identification and isolation of breast cancer cells which contain the complexes according to the invention. After in vitro or in vivo amplification of the nucleic acids, the overall sequence of the DNA of these complexes can be determined. The sequences found so far do not hybridize with the sequences found from Hodgkin or mouse cells. The invention thus also relates to nucleic acids which are part of the total sequence of the complexes or their functional equivalents as described above.
  • MOLECULE TYPE Genomic DNA
  • MOLECULE TYPE Genomic DNA
  • MOLECULE TYPE Genomic DNA
  • MOLECULE TYPE Genomic DNA
  • GATCTTTCCA ACACTTTTAT CATGAATGGG TGTTGGATCT TGTCAAATGC TTTT TCTGCA 60
  • MOLECULE TYPE Genomic DNA
  • MOLECULE TYPE Genomic DNA
  • SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO: 20:
  • MOLECULE TYPE Genomic DNA
  • CTGTACCACA TAGCAAATGT CAGGCCTCTT GGGGGAGTAT TGCAAGATAT TGCTACAAAT 120
  • TACTTCTACC ACATTTAAGA TTCCAAACAG ATTTTAAACG GTTGTGTTCCAA TATTACTTTA 240
  • MOLECULE TYPE Genomic DNA
  • SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO: 33:
  • AAAGATGTTC AC.AGAGTGTG TOITCGGGTG ATGTACCTGC TAATAGATAT CCATCATAAT 360
  • MOLECULE TYPE Genomic DNA
  • AAAAGCCAGG AAAAGCAACC AATAATCAGC ATTCTTCCAT GGCCTCTGCT TCAGTTTCTG 180
  • GAAAAGTTGT CATGTGTCAC CTATCATAGC CATCCAGCAC CCAAGTCAGT GGCCAGAAGA 300 CAGTGTGTCA GCTTGGGATG GAATGGAATC TCAAAACTGT CAATCAAATT AAACTGTGTG 360
  • MOLECULE TYPE Genomic DNA
  • MOLECULE TYPE Genomic DNA
  • SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO: 54:
  • MOLECULE TYPE Genomic DNA
  • SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO: 58:

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Abstract

Die Erfindung betrifft DNS-Protein-Komplexe, Proteine, DNS-Sequenzen und Antikörper, welche zum Nachweis von Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung geeignet sind, Verfahren zur Gewinnung von solchen Proteinen oder DNS-Sequenzen sowie Verfahren zur Identifizierung von tierischen und menschlichen Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung unter Verwendung von solchen Proteinen, DNS-Sequenzen oder Antikörpern.

Description

Verfahren zur Identifizierung von menschlichen und tierischen Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter
Proliferation oder zur Tumorbildung
Die Erfindung betrifft DNS-Protein-Komplexe, Proteine, DNS-Sequenzen und Antikörper, welche zum Nachweis von Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung geeignet sind, Verfahren zur Gewinnung von solchen DNS-Protein-Komplexen, Proteinen oder DNS-Sequenzen sowie deren Verwendung zur Identifizierung von tierischen und menschlichen Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung.
Alle differenzierten menschlichen und tierischen Zellen haben ein begrenztes Potential zur Zellvermehrung (Proliferation) in vivo und in vitro, ehe sie der Zellalterung (Seneszenz) und dem Zelltod unterliegen. Die Anzahl der zu einem bestimmten Zeitpunkt noch möglichen Zellteilungen einer Zelle ist vom Differenzierungsgrad der Zelle, vom Alter und der Spezies des Spenders, von dem die Zelle abstammt, sowie von der Dauer der gegebenenfalls bereits begonnenen Kultivierung der Zellen abhängig (Goldstein, S.: Replicative Senescence, Science 249 (1990), 1129 - 1133). Eine unbegrenzte Proliferation findet sich dagegen häufig bei neoplastisch transformierten Zellen. Sie bilden dadurch stetig wachsende Zellverbände, die zur Ausbildung eines Tumors und schließlich zusammen mit der veränderten Ausprägung anderer Eigenschaften dieser Zellen zur Tumorerkrankung führen. Klinisch zeichnen sich derartige maligne Tumore gegenüber gutartigen Tumoren durch ihr rasches Wachstum und häufige Metastasenbildung aus. Die neoplastische Transformation der Zelle ist gekennzeichnet durch ein heterogenes Bild zahlreicher Änderungen der zellulären Morphologie und Physiologie, die auch vom Differenzierungsgrad der Zellen abhängig sind. Bislang sind nur wenige molekular definierbare Parameter der neoplastischen Transformation bekannt, wie z. B. ein veränderter Methylierungsgrad bestimmter Gene (W. Doerfler et al., Eukaryotic DNA methylation: facts and problems, FEBS Letters 268 (1990), 329 - 330), eine veränderte Genexpression oder eine veränderte Phosphorylierung bestimmter Genprodukte.
Gemeinsam ist den Tumorzellen in der überwiegenden Mehrzahl dagegen die Fähigkeit zur unbegrenzten Proliferation in vivo. Aufgrund verschiedener Beobachtungen wird angenommen, daß die von Wachstumsfaktoren unabhängige Proliferation der Tumorzellen zwar eine häufig vorhandene, aber nicht unbedingt notwendige Eigenschaft tumorbildender Zellen darstellt (M. Strauss, B.E. Griffin, Cellular Immortalization, Cancer Cells 2 (1990), 360 - 365). Für zahlreiche Fragestellungen der Diagnostik und Therapie ist es aber dennoch von entscheidender Bedeutung, diejenigen Zellen aufzufinden, die der normalen Proliferationskontrolle nicht mehr unterliegen und somit das Potential zur unbegrenzten Proliferation haben.
Dabei ergibt sich die Schwierigkeit, diese bei Tumorzellen gefundene Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation zu unterscheiden von der in vielen Geweben gefundenen Fähigkeit zur Regeneration. Diese stellt eine kontrollierte, kurzzeitige (transiente) Zellvermehrung und eine nur vorübergehende Unterdrückung des programmierten Zelltods als Antwort auf eine physiologische Stimulation dar. Die transiente Proliferation normaler Zellen wird nach Regeneration des Gewebes durch noch nicht identifizierte Signale wieder gehemmt.
Die bekannten Verfahren zum Nachweis von malignen Tumorzellen beruhen auf klinischen, histologischen und zytologischen Beobachtungen sowie veränderten physiologischen Meßwerten. Diagnostische Routine-Verfahren erfolgen zumeist aufgrund histologischer Untersuchungen am Gewebeschnitt (W.A.D. Anderson und J.M. Kissane, Pathology I, II, Mosby, Saint Louis 1977, 7th edition; C . S . Herrington und J.O'D. McGee, Diagnostic Molecular Pathology, Oxford University Press, Vol. I, II, Ist ed., 1992). Der Verband maligner Zellen ist im Gegensatz zu gutartigen Wucherungen meist nur unscharf zum Nachbargewebe abgegrenzt und die Zellen wachsen infiltrierend und destruierend in das umgebende Gewebe ein. Meist liegt zusätzlich eine perifokale Entzündung vor. Häufig weisen eine große Anzahl von Mitosen auf die gesteigerte Proliferationsaktivität der Tumorzellen hin.
Neben diesen histologischen Untersuchungen werden zum Nachweis proliferierender maligner Zellen Antikörper eingesetzt, welche Antigene erkennen, die bevorzugt von proliferierenden Tumorzellen exprimiert werden, wie z. B. Ki67 (D.C. Matthews, F.O. Smith, I.D. Bernstein, Monoclonal antibodies in the study and therapy of hematopoietic cancers, Curr. Opinion Immunol. 4 (1992), 641 - 646;
M. Schwouzen, V. Diehl, M. Pfreundschuh, Immunozytologische Phänotypisierung von Leukämien und Lymphomen, Med. Klinik 85 (1990), 533 - 547). Diese Verfahren beruhen jedoch auf der Bestimmung indirekter Parameter, ohne die molekularen Prozesse, die im Zusammenhang mit der unbegrenzten Proliferation stehen, nachzuweisen. Aufgabe der Erfindung ist es, Zellen mit dem Potential zu unbegrenzter Proliferation, insbesondere maligne Tumorzellen schnell und sicher zu identifizieren, ohne daß dafür diese Zellen in vitro kultiviert oder nach Injektion in Versuchstieren propagiert werden müssen. Dabei sollen Zellen mit dem Potential zu unbegrenzter Proliferation von Zellen mit transienter Proliferation in einem regenerierenden Gewebeverband unterschieden werden können.
Diese Aufgabe wird gelöst durch einen DNS-Protein-Komplex (im weiteren als Komplex bezeichnet), welcher zum Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung geeignet ist und welcher erhältlich ist durch Isolierung einer Mitochondrien-freien Fraktion des Zytoplasmas aus permanent teilungsfähigen menschlichen oder tierischen Zellen, die in einem Cäsiumchlorid-Gradienten eine Dichte von etwa 1,82 - 1,89 g/cm3 aufweist, und Isolierung des Komplexes aus dieser Fraktion durch Extraktion mit Phenol und Fällung mit Ethanol.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung im Gegensatz zu normalen ruhenden Zellen, seneszenten Zellen oder Zellen mit transienter Proliferation derartige Komplexe im Zytoplasma aufweisen. Über diese erfindungsgemäßen Komplexe können dann solche Zellen nachgewiesen werden, welche z. B. infolge einer malignen Entartung ein unbegrenztes Wachstumspotential aufweisen. Dazu wird Zytoplasma oder eine geeignete Zytoplasmafraktion mit einem erfindungsgemäßen Komplex als Standard in einer Gelelektrophorese, durch Bestimmung des DNA Gehalts oder Reaktion mit spezifischen Antikörpern verwendet. Zur Isolierung der erfindungsgemäßen Komplexe werden Zytoplasten von permanent teilungsfähigen menschlichen oder tierischen Zellen nach bekannten Verfahren gewonnen (s. z. B. EP-B-O 093 436, EP-B-O 256 512 und Proc. Natl. Acad. Sei. 85 (1988), 468 - 472) und lysiert, z. B. mit Hilfe von Detergenzien wie NP40 oder SDS (Wigler und Weistein,
Biochem. Biophys. Res. Comm. 63 (1975) 669 - 674). Die Mitochondrien werden aus dieser Zytoplastenfraktion abgetrennt, vorzugsweise mit Hilfe eines Sucrosegradienten (J. Biol. Chem. 249 (1974) 7991 - 7995). Diejenigen Fraktionen, die keine Mitochondrien enthalten, werden mit
RNase, vorzugsweise RNase A und RNase Tl sowie mit
Proteinase wie z. B. Proteinase K und Pronase inkubiert. Aus diesem Ansatz wird eine Fraktion, welche in einem
Cäsiumchloridgradienten eine Dichte von ca. 1,82 -1,89 g/cm3 aufweist, angereichert und aus dieser Fraktion ein Komplex durch Extraktion mit Phenol und Fällung mit Ethanol isoliert. Die Gewinnung einer Fraktion, welche in einem Cäsiumchloridgradienten eine Dichte von ca. 1,82 -1,89 g/cm3 aufweist, kann dabei sowohl mit Hilfe einer Zentrifugation in einem CsCl-Dichtegradienten als auch über eine elektrophoretische Auftrennung nach dem Fachmann geläufigen Verfahren erfolgen (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory , 2nd edition , 1989 ) .
Die zur Isolierung der Komplexe verwendete Mitochondrienfreie Fraktion des Zytoplasmas kann alternativ auch durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Zellen oder durch Gewinnung einer Zellfraktion, welche frei von nuklearer DNS ist, erhalten werden. Eine solche Fraktion gewinnt man bevorzugt durch Lyse der Zellen mit Natriumchlorid und SDS ("Hirt-Extraktion", J. Mol. Biol. 26 (1967) 365 - 369) und anschließender Zentrifugation. Aus dem Überstand können dann die Komplexe isoliert werden . In einem bevorzugten Verfahren erfolgt die Isolierung der Komplexe über eine Sedimentation aus einem zytoplasmatischen Lysat der zu untersuchenden Zellen mit Hilfe eines Salz-Gradienten. Die Zellen werden dazu in einem Mg2+ -haltigen Puffer (50 mmol/l Tris-HCl, pH 7,2, 10 mmol/l EDTA, 3 mmol/l MgCl2 ) durch mehrmaliges Einfrieren und Auftauen ohne Verwendung von Detergentien lysiert, die Zellkerne durch Zentrifugation bei 6000 × g sedimentiert und der Überstand mit Proteinase K (100 μg/ml) 1 h bei 60°C verdaut. Die freigesetzten Komplexe werden durch Zentrifugation (150 000 x g, 10 h) durch einen CsCl-Zwei-StufenGradienten isoliert, wobei die untere Fraktion die Dichte von ca. 1.80 g/cm3 hat, die obere Fraktion eine Dichte von ca. 1.70 g/cm3. Dabei sedimentieren die zytoplasmatischen Komplexe, während die chromosomale DNS oder Komplexe ohne kovalente DNS-Protein-Bindungen im Überstand verbleiben.
Dieses Verfahren erlaubt eine sehr schnelle Isolierung zytoplasmatischer Komplexe, wobei folgende Eigenschaften ausgenutzt werden:
Die Komplexe werden durch das Einfrieren und Auftauen im Mg2+-haltigen Puffer freigesetzt, ohne daß die Zellkerne lysieren oder Detergentien verwendet werden müssen.
Die Komplexe sind stabil gegenüber Proteinasen, während zytoplasmatische Organellen und Membranen abgebaut werden.
Die Komplexe haben eine sehr hohe Dichte (ca. 1,86 g/cm3) und können so mit Hilfe von Salz-Gradienten von chromosomaler oder anderer zytoplasmatischer DNS abgetrennt werden. Die DNS-Protein-Bindung ist stabil gegenüber hohen Salzkonzentrationen.
Die Komplexe können aus dem Zytoplasma von beliebigen transformierten Zellen, insbesondere permanent wachsenden menschlichen oder tierischen Zellen oder von Tumorzellen, insbesondere von solchen, die aus Tumorbiopsien erhalten wurden, gewonnen werden. Unter transformierten Zellen sind in diesem Zusammenhang Zellen zu verstehen, die durch ein Agens unsterblich gemacht wurden. Permanent proliferierende Zellen verschiedener Spezies (z. B. Mensch, Maus, Ratte) und verschiedenen Differenzierungsgrades (Fibrom-, Myelom-, Asziteszellen) enthalten Komplexe, die sich in ihrem
Protein- und/oder DNS-Anteil unterscheiden. Die erfindungsgemäßen Komplexe sind also für Spezies und Differenzierungsgrad der Zellen spezifisch. Vorzugsweise werden daher für den Nachweis von Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder Fähigkeit zur Tumorbildung Komplexe aus Zellen der gleichen Spezies und eines ähnlichen Zelltyps wie der zu untersuchenden Zelle isoliert. So sind z. B. zum Nachweis von Maus-Fibroblasten/Fibromzellen bzw. MausAszites-Tumorzellen mit unbegrenzter Proliferation Komplexe besonders bevorzugt, die aus Zytoplasten transformierter Maus-L-Zellen (L929-Zellen, ATCC CCL 1) bzw. EhrlichAszites-Zellen (ATCC CCL 77) nach dem beschriebenen Verfahren isoliert wurden. Zur Gewinnung von Komplexen von permanent proliferierenden Zellen anderer Gewebe oder Differenzierungsgrade sowie Zellen anderer Spezies können für das beschriebene Verfahren andere, dem Fachmann geläufige Tumorzellinien der gewünschten Differenzierungsgrade und Spezies als Quelle zur Isolierung der Komplexe verwendet werden. So werden z. B. zur Gewinnung entsprechender
Komplexe aus humanen Cervix-Tumoren vorzugsweise die humanen Zellinien HeLa oder aus B-Lymphom-Linien die B-Zell-Lymphomlinie BJAB verwendet. Weiterhin können dabei auch permanent wachsende Zellinien verwendet werden, die aufgrund einer experimentellen Immortalisierung z. B. durch Fusion primärer Zellen mit Zytoplasten permanent wachsender Zellen (EP-B-O 093 436, Abken et al., J. Cell Biol. 130 (1986) 795 - 805) oder durch Transfektion mit DNS aus diesen Zytoplasten (EP-B-O 256 512 und DE 42 18 945.4 und Abken et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 85 (1988) 468 - 472) immortalisiert wurden.
Es hat sich gezeigt, daß in Zellen des Hodgkin-Lymphoms eine zytoplasmatische DNS-Fraktion der Dichte 1,86 g/cm3 persistiert. Diese DNS ist ebenfalls mit Proteinen verknüpft. Die in der Fraktion enthaltenen DNS-Moleküle haben eine Länge zwischen 50 und 500 bp. Wie bei Zellen aus MausTumoren handelt es sich um lineare DNS-Moleküle. Sie hybridisieren jedoch nicht mit denen aus Maus-Tumor-Zellen. Dies zeigt, daß sowohl tierische als auch menschliche Lymphomzellen erfindungsgemäße zytoplasmatische DNS-Sequenzen enthalten. Die erfindungsgemäße Fraktion findet sich auch in Mensch-Tumor-Zellen des Colon- und des Mammakarzinoms sowie des menschlichen Melanoms.
Aus den Komplexen können die Proteine bzw. die DNA isoliert werden, über die dann ebenfalls ein Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit unbegrenzter Proliferation oder der Fähigkeit zur Tumorbildung ermöglicht wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Proteine mit einem Molekulargewicht von ca. 52, 62 bzw. 64 kD, welche zum Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung geeignet sind und welche erhältlich sind durch Behandlung eines erfindungsgemäßen Komplexes mit DNase I und chromatographischer oder elektrophoretischer Isolierung der dabei freigesetzten ca. 52, 62 bzw. 64 kD großen
Proteine.
Zur Isolierung dieser Proteine werden die Komplexe mit DNase I behandelt und die abgebaute Nukleinsäure durch Gelfiltration von den Proteinen abgetrennt, die dabei zugleich nach der Größe aufgetrennt werden. Unter Verwendung von Komplexen aus Maus-L-Zellen (L929) bzw. Ehrlich AszitesTumorzellen werden dabei Proteine mit einer Größe von 52, 62 und 64 kD erhalten. Diese Proteine sind charakterisiert dadurch, daß sie die erfindungsgemäß klonierte pLC 108 DNS (SEQ ID NO 1) in Gegenwart von 8 mM Zn2 + zu binden vermögen. Die Proteine aus Ehrlich-Aszites-Zellen sind dadurch gekennzeichnet, daß sie die klonierte pEFC38 DNS (SEQ ID NO 29) in Gegenwart von 8 mM Na+ zu binden vermögen. Vorzugsweise wird für die Präparation dieser Proteine eine matrixgebundene DNase eingesetzt, z. B. eine kovalent an Sepharose gekoppelte DNase.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Antikörper, welche zum Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung geeignet sind und welche erhältlich sind durch Immunisierung von Tieren mit einem erfindungsgemäßen
Komplex oder Protein oder DNS. Hierbei können alle üblicherweise zur Immunisierung verwendeten Tiere, wie Mäuse (z. B. Stamm MNRI oder BALB/c) oder Kaninchen, und Immunisierungsprotokolle verwendet werden (siehe z. B. J. Peters und H. Baumgarten, Monoklonale Antikörper, Springer Verlag, 2. Auflage 1988). Bei Immunisierung mit den erfindungsgemäßen Komplexen, DNS oder Proteinen werden Antikörper erhalten, welche spezifisch an Proteine aus dem Zytoplasma von Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung binden, nicht jedoch an Proteine aus Zellen mit normaler Proliferationskapazität. Der Nachweis dieser Proteine mit Hilfe der erfindungsgemäßen Antikörper kann dabei nach den dem Fachmann geläufigen Immunoassaymethoden wie z. B. ELISA, Fluoreszenz-, Immunoassay, kompetitiver Immunoassay erfolgen.
Neben dem Proteinanteil der erfindungsgemäßen Komplexe eignet sich für den Nachweis auch der DNS-Anteil.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher eine DNS, welche zum Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung geeignet ist und welche erhältlich ist durch Klonierung oder enzymatische Vermehrung der DNS eines erfindungsgemäßen Komplexes.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß die DNS des erfindungsgemäßen Komplexes wie eine isolierte DNS in Klonierungsvektoren ligiert werden kann oder enzymatisch z. B. in einer PCR amplifiziert werden kann, obwohl diese DNS in den Komplexen so fest an die Proteine gebunden ist, daß sie weder durch Detergenzien, Proteasen, hohe Salzkonzentrationen noch durch Erhitzen ablösbar ist. Die DNS kann gewonnen werden, indem die DNS der Komplexe z. B. in geläufige Vektoren, wie z. B. pUC19 , ligiert und in dem Fachmann geläufigen Wirtsorganismen, wie z. B. E. coli HB101 oder E. coli DH5α, kloniert wird. Die rekombinanten Klone, die die erfindungsgemäße DNS-Sequenz enthalten, werden dann durch Hybridisierung mit den erfindungsgemäßen Komplexen identifiziert und die DNS isoliert. Auf diese Weise konnten 20 rekombinante Plasmidklone aus L929-Zellen (ATCC CCL 1) sowie 25 rekombinante Plasmidklone aus Ehrlich-AszitesZellen (ATCC CCL 77) erhalten werden, welche zur molekularen Identifizierung von Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation geeignet sind. Diese DNS-Sequenzen sind in den Sequenzprotokollen SEQ ID NO 1 - 45 aufgeführt. Mit Hilfe dieser Sequenzen ist es möglich, weitere geeignete DNS-Sequenzen anderer Zellen verschiedener Differenzierungsgrade oder anderer Spezies zur Identifizierung von entsprechenden Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation aufzufinden.
Die in SEQ ID NO 1 und SEQ ID NO 29 gezeigten DNS-Sequenzen sind zur Immortalisierung von humanen oder tierischen
Zellen geeignet (vergleiche auch Deutsche Patentanmeldung P 42 18 945.4). Die weiteren DNS-Sequenzen (SEQ ID NO 2 - 28 und SEQ ID NO 30 - 45) haben keine immortalisierende Wirkung, sind aber zum Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung geeignet.
Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist daher eine erfindungsgemäße DNS, welche eine der in SEQ ID NO 2 - 28 oder SEQ ID NO 30 - 45 gezeigten DNS-Sequenzen enthält oder mit einer dieser Sequenzen hybridisiert.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind DNS, welche eine der in SEQ ID NO 46-61 gezeigten DNS-Sequenzen enthält oder mit einer oder mehrerer dieser Sequenzen hybridisiert. Die Nukleinsäuren SEQ ID NO 46-58 sind aus DNA von Hodgkin-Zellen der Linie HD 428 abgeleitet. Die Sequenzen der SEQ ID NO 59-61 sind aus DNA-Klonen von MCF 7-Zellen (Mamma-Karzinom) abgeleitet.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können DNS, jedoch auch RNS oder Nukleinsäureanaloge, z.B. solche bei denen das Zuckerphosphatgerüst durch eine Polypeptidkette ersetzt ist, sein. Die Nukleinsäure kann doppelsträngig sein, bevorzugt ist sie jedoch einzelsträngig. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die jeweils komplementären
Sequenzen. Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen
Nukleinsäuren eine Sequenz von mindestens 15 Aminosäuren, wobei diese Sequenz von mindesten 15 Aminosäuren ausgewählt ist aus - einer Sequenz die in einer Sequenz nach SEQ ID NO 2-28 oder 30-61 enthalten ist, - einer Sequenz, die sich durch Aneinanderhängen zweier Sequenzen der SEQ ID NO 1-45, 46-58 oder 59-61 ergibt,
- Sequenzen, die für dieselbe Aminosäuresequenz
codieren, wie die beiden oben genannten Typen, - Sequenzen, die zu den beiden oben genannten Typen
mindestens zu 70 %, bevorzugt mehr als 90 %, besonders bevorzugt mehr als 95 % innerhalb der spezifischen Sequenzen aufweisen.
Die Nukleinsäuren sind besonders bevorzugt zwischen 16 und 100 Nukleotiden lang. Je nach Länge können sie nach
molekularbiologischen oder chemisch/synthetischen Methoden hergestellt werden. Überraschenderweise hat sich erwiesen, daß die meisten der bisher untersuchten DNS-Sequenzen die Konsenussequenz NNAAANTNTNGAANTGTANNANTGNAA (SEQ ID NO 62) aufweisen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung einer erfindungsgemäßen DNS durch Isolierung eines erfindungsgemäßen Komplexes aus permanent teilungsfähigen menschlichen oder tierischen Zellen und Klonierung oder enzymatische Vermehrung der DNS aus diesem Komplex.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung einer erfindungsgemäßen DNS, bei welchem die erfindungsgemäßen DNS-Sequenzen durch Hybridisierung einer genomischen Genbank oder eine cDNS-Bank von menschlichen oder tierischen Zellen mit einer der in SEQ ID NO 1 - 61 gezeigten DNS-Sequenzen identifiziert und die hybridisierende klonierte DNS aus der Genbank nach bekannten Verfahren isoliert wird. Hierzu können Genbanken sowohl aus permanent proliferierenden Tumorzellen als auch aus normalen Zellen oder Geweben verwendet werden.
Ein ebenfalls bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung einer erfindungsgemäßen DNS durch Bindung der DNS von menschlichen oder tierischen Zellen an ein erfindungsgemäßes Protein, wobei die Proteine auf
Nitrozellulose oder andere Trägermembranen gebunden werden und in Gegenwart von Zn2+ oder Na+ (z. B. 4°C für 30 Minuten) inkubiert werden. Anschließend wird stringent bei hoher Salzkonzentration (z. B. 0,1 % SDS, 2 × SSC) gewaschen.
Ein besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung einer erfindungsgemäßen DNS durch enzymatische Vermehrung einer DNS- oder RNS-Fraktion von menschlichen oder tierischen Zellen, wobei OligonukleotidStartermoleküle verwendet werden, die mit einer der in SEQ ID NO 1 - 61 gezeigten Sequenzen hybridisieren. Vorzugsweise werden dabei Oligonukleotid-Startermoleküle verwendet, welche eine Länge von 20 - 30 Basenpaaren aufweisen. Die enzymatische Vermehrung der gewünschten DNS-Sequenzen mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) erfolgt gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren (Mullis und Fallona, Meth. Enzymol. 155 (1987) 335 - 350, Saiki et al., Science 239 (1988) 487 - 491). Dabei können als DNS-Fraktionen sowohl Genbanken als auch DNS- oder RNS-Präparationen oder
Zellysate von permanent proliferierenden oder normalen seneszenten Zellen des Menschen oder von Tieren verwendet werden.
Eine andere Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens ist schließlich die chemische Synthese einer erfindungsgemäßen DNS, welche eine der in SEQ ID NO 1 - 61 gezeigten DNS-Sequenzen oder Teile dieser DNS-Sequenzen aufweist. Diese Synthese erfolgt gemäß den üblichen dem Fachmann geläufigen Oligonukleotidsyntheseverfahren (F. Eckstein, Hrsg., Oligonucleotides and analogures: A practical approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford (1991)), vorzugsweise mit Hilfe handelsüblicher Oligonukleotidsyntheseapparaturen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung durch Nachweis eines erfindungsgemäßen Komplexes in einer Mitochondrien-freien Fraktion des Zytoplasmas der zu untersuchenden Zelle. Normale Zellen mit begrenzter Proliferationskapazität enthalten keine derartigen Komplexe in dieser Fraktion des Zytoplasmas, während Zellen mit unbegrenzter Proliferation, wie z. B. Tumorzellen, mehrere hundert Kopien dieser Komplexe aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Komplexe werden sezerniert. Die DNS-Protein-Verknüpfung dieser Komplexe ist sehr stabil gegenüber proteolytischem Abbau. Die Komplexe sind mehrere Wochen lang in Zeilüberständen nachweisbar.
Die Komplexe können auch im peripheren Blut, im Urin oder anderen Körperflüssigkeiten enthalten sein und können dort nachgewiesen werden.
Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit unbegrenztem Proliferationspotential oder Tumorbildung durch Nachweis eines erfindungsgemäßen Komplexes in Körperflüssigkeiten.
Die Komplexe können über ihren DNS-Gehalt oder gelelektrophoretisch bestimmt werden, wobei erfindungsgemäße Komplexe als Standard für die Ermittlung einer positiven Reaktion mitgeführt werden können. Bei diesem Verfahren kann jedoch nicht zwischen Komplexen aus verschiedenen Spezies oder Gewebetypen unterschieden werden. Ein solcher spezifischer Nachweis ist jedoch unter Verwendung erfindungsgemäßer Antikörper möglich.
Neben kompletten Antikörpern können auch Antikörperfragmente verwendet werden, die die spezifischen Antigen-Erkennungsregionen der Leichten- oder Schweren-Kette (VL bzw. VH ) des Antikörpers beinhalten. Diese Fragmente können mit Trägern, wie z. B. Proteinen, Zuckern oder Sepharose, oder mit Farbstoffen zu Fusionsprodukten gekoppelt werden. Ein solches Fusionsprodukt kann vorzugsweise dadurch erhalten werden, daß man die kodierenden Gen-Sequenzen für die Antigen-Erkennungsregionen VL und VH des Antikörpers mit den Gensequenzen für ein Trägermolekül fusioniert, z. B. ein Oberflächen-Protein eines Phagen oder ein CapsidProtein eines Virus, und dieses Hybrid-Gen dann in vitro exprimiert. Die Verfahren zur Isolierung und Klonierung der für die V-Regionen des Antikörpers kodierenden Gensequenzen sowie deren Insertion in die DNS-Sequenz anderer Gene, z. B. in die Gensequenz für das Phagenprotein g3p, sowie Methoden zur Expression eines solchen Fusionsproteins sind dem Fachmann bekannt (Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989): 3833 - 3837; Chiang et al.,
BioTechniques 7 (1989): 360 - 366; Winter, G. , und
Milstein, C., Nature 349 (1991): 293 - 299). Die Fusionsprodukte (auf der Oberfläche von Phagen oder Viren oder in isolierter Form) können dann wie ein Antikörper zum Nachweis der Komplexe eingesetzt werden.
Schließlich können die Komplexe in den zu untersuchenden Zellen auch durch Hybridisierung einer DNS-Fraktion dieser Zellen mit einer erfindungsgemäßen DNS nachgewiesen werden. Der Vorteil dieses Verfahrens ist, daß mit derartigen DNS-Proben zwischen Zellen verschiedener Differenzierungsgrade (Fibrom- bzw. Azites-Tumor) und Spezies (Maus bzw. Mensch) unterschieden werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder Tumorbildung durch Hybridisierung einer DNS-Fraktion dieser Zellen mit einer erfindungsgemäßen DNS. Als DNS-Fraktion kann dabei eine cytoplasmatische Zellfraktion verwendet werden, welche erfindungsgemäße Komplexe enthält. Es ist jedoch auch möglich, hierfür die nukläre, chromosomale DNS der zu untersuchenden Zellen einzusetzen. Es hat sich nämlich gezeigt, daß nukläre, chromosomale DNS von normalen transient proliferierenden Zellen im Vergleich zu Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation nach Restriktionsverdau und Analyse der erhaltenen Restriktionsfragmente in einem Southern-Blot, ein anderes Muster an hybridisierenden Restriktionsfragmenten bei Hybridisierung einer erfindungsgemäßen DNS-Sequenz ergeben. In der Regel zeigen zusätzliche mit den Proben hybridisierende Restriktionsfragmente das Vorhandensein von Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung an.
Die erfindungsgemäßen DNS-Sequenzen weisen eine so hohe Sensitivität und Spezifität auf, daß diese Proben auch zur Hybridisierung mit Zellen oder Gewebe in situ eingesetzt werden können. Dabei werden nur diejenigen Zellen im Cytoplasma markiert, die eine Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung zeigen. Für diese in situHybridisierung können sowohl Zellen verwendet werden, die in vitro kultiviert wurden, als auch Zellen aus Biopsien oder Gewebeschnitten von Biopsien, ohne daß ein Kultivierungsschritt der Zellen zur Vermehrung an Zellmaterial erforderlich ist.
Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist daher eine Variante des erfindungsgemäßen Verfahren, bei welcher die Hybridisierung als in situ-Hybridisierung durchgeführt wird ,
Die Empfindlichkeit des Verfahrens kann noch weiter gesteigert werden, indem die DNS der Komplexe aus den zu untersuchenden Zellen enzymatisch, insbesondere mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion gemäß der dem Fachmann bekannten Methode (Mullis and Fallona, Meth. Enzymol. 155 (1987): 335 - 350; Saiki et al., Science 239 (1988), 487 - 491) für die eigentliche Nachweisreaktion vermehrt werden.
Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist daher eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei welcher aus einem Lysat der zu untersuchenden Zellen oder einer DNS- oder RNS-Fraktion dieser Zellen eine
Nukleinsäure enzymatisch vermehrt wird, unter Verwendung von Oligonukleotiden, die mit einer erfindungsgemäßen DNS hybridisieren.
Eine solche Amplifikation ist möglich, obwohl die DNS-Proteinbindung stabil gegenüber hohen Temperaturen (1
Stunde bei 90°C), hohen Salzkonzentrationen (wie z. B.
6,9 mol/l Cäsiumchlorid) und gegenüber einem Proteinase K-Verdau (100 μg/ml, 1 Stunde bei 60°C) ist.
Die beschriebenen Verfahren zum Nachweis von Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung finden Anwendung zum Nachweis maligner Tumoren, wobei die Zellen einer Biopsie, eines Gewebeschnitts oder Zellen oder sezernierte Komplexe aus Körperflüssigkeiten von
Menschen oder Tieren als Probenmaterial eingesetzt werden. Die beschriebenen Verfahren eignen sich somit auch zum Auffinden solcher Zellen. Weiterhin können die beschriebenen Verfahren in entsprechend abgewandelter Form auch zur Isolierung derartiger Zellen verwendet werden. Hierbei dienen die beschriebenen Verfahren insbesondere zur Identifizierung der gewünschten Zellen in einer bestimmten Fraktion während des Isolierungsverfahrens. Dazu können erfindungsgemäße Antikörper eingesetzt und die Zellen anschließend durch Fluoreszenz-aktiviertes Sortieren (FACS) isoliert werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele in Verbindung mit den Sequenzprotokollen, welche bevorzugte erfindungsgemäße DNS-Sequenzen zeigen, näher erläutert.
Beispiel 1
Isolierung von Komplexen und Klonierung der DNS dieser Komplexe, welche zum Nachweis von Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder Tumorbildung geeignet sind
Zytoplasmatische Komplexe werden aus Maus-Tumor-Fibroblasten der Linie L929 (L929-Zellen, ATCC CCL 1) sowie aus Ehrlich-Aszites-Zellen (EAZ, ATCC CCL 77) isoliert. Zunächst werden Zytoplasten dieser Zellen nach bekannten Verfahren (Wigler und Weistein, Biochem. Biophys. Res. Comm. 63 (1975) 669 - 674) unter Verwendung von Cytochalasin B (50 /ig/ml) gewonnen und durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen lysiert. Die Mitochondrien werden aus dem Zytoplasten-Lysat mit Hilfe eines Sucrosegradienten gemäß J. Biol. Chem. 249 (1974) 7991 - 7995 abgetrennt. Die Fraktionen, die keine Mitochondrien enthalten, werden 30 Minuten bei 37°C mit RNase A (20 μg/ml) und RNase T1 ( 1000 U/ml) sowie anschließend mit Proteinase K (50 μg/ml) für 20 - 60 Minuten bei 60°C inkubiert. Aus diesem Ansatz werden die Komplexe nach bekannten Methoden der DNS-Isolierung, z. B. durch Extraktion mit Phenol und Chloroform/-Isoamylalkohol, isoliert und eine Fraktion, welche in einem Cäsiumchloridgradienten eine Dichte von ca. 1,82 - 1,89 g/cm3 aufweist, über einen CsCl-Dichtegradienten (Sambrook et al.,
Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd
Edition 1989) angereichert. Die Fraktionen werden gegen 10 mmol/l Tris-HCl pH 7,2, 1 mmol/l EDTA dialysiert und die Komplexe mit Ethanol und Na-Acetat gefällt.
Zur Isolierung der DNS dieser Komplexe werden die Komplexe gegen 10 mmol/l Tris-HCl, 1 mmol/l EDTA, pH 7,2 dialysiert. Die DNS wird einer "Auffüll-Reaktion" mit Hilfe der KlenowDNS-Polymerase in Gegenwart von dNTP's nach dem Fachmann bekannten Verfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 2nd Edition 1989) unterzogen, anschließend in den pUC19 Vektor in Gegenwart von 0 - 10 U Ligase ligiert und das erhaltene rekombinante Plasmid in E.coli kloniert. Dabei werden bei der Replikation des Plasmids in den Bakterien proteinfreie Kopien dieses rekombinanten DNS-Moleküls hergestellt.
Auf diese Weise wurden mehrere unabhängige Plasmid-Klone zytoplasmatischen Komplexen von L929-Zellen gewonnen (pLC), und mehrere Plasmid-Klone aus der entsprechenden Fraktion von Ehrlich-Aszites-Zellen (pEFC), die zum Nachweis von neoplastisch transformierten Zellen mit unbegrenzter Proliferation geeignet sind (siehe Beispiel 2). Die entsprechenden DNS-Sequenzen sind in SEQ ID NO 1 - 46 gezeigt.
Beispiel 2
Vereinfachtes Verfahren zur Isolierung von Komplexen
Zellen der Maus-Tumor-Cytoplastenlinie L929 (ATCC CCL 1) werden in Gegenwart von 50 mmo/1 Tris HCl pH 7,2, 10 mmol/l EDTA und 1,5 mmol/l Magnesiumchlorid durch mehrmaliges Einfrieren und Auftauen lysiert und die Zellkerne anschließend durch 30minütige Zentrifugation bei 6000 g abgetrennt. Der hierbei erhaltene Überstand wird 20 Minuten lang bei 60°C mit Proteinase K (100 μg/ml) inkubiert und anschließend auf einen Cäsiumchlorid Zweistufengradienten geschichtet, wobei die untere Fraktion (1 ml) eine Dichte von ca. 1,80 g/cm3 aufweist, die obere Fraktion (1 ml) eine Dichte von ca. 1,70 g/cm3. Nach Zentrifugation für 10 Stunden bei 150 000 g wird das Sediment in 100 μl 10 mmol/l Tris HCl pH 7 , 2 , 1 mmol/l EDTA resuspendiert und die Menge der erhaltenen DNS in dieser Fraktion, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt.
Beispiel 3
Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation mit Hilfe der Bestimmung zytoplasmatischer Komplexe
Zum Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung dient die Bestimmung zytoplasmatischer Komplexe in einem Lysat dieser Zellen. Zunächst werden Zytoplasten dieser Zellen nach bekannten Verfahren (Wigler und
Weistein, Biochem. Biophys. Res. Comm. 63 (1975) 669 - 674) unter Verwendung von Cytochalasin B (50 μg/ml) gewonnen und durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen lysiert. Die Mitochondrien werden aus dem Zytoplasten-Lysat mit Hilfe eines Sucrosegradienten (J. Biol. Chem. 249 (1974) 7991 - 7995) abgetrennt und die Mitochondrien-freien Fraktionen werden mit RNase A (20 μg/ml) und RNase T1 (1000 U/ml) sowie anschließend mit Proteinase K (50 μg/ml) inkubiert. Der Ansatz wird einer Gleichgewichts-Zentrifugation in einem CsCl-Dichtegradienten nach bekannten Verfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd Edition 1989) unterzogen. Evtl. vorhandene Komplexe werden dann über den DNS-Gehalt der Fraktionen mit einer Dichte von ca. 1,82 - 1,89 g/cm3 bestimmt (Ergebnis siehe Tabelle 1) . Die Bestimmung des DNS-Gehalts erfolgt dabei photometrisch oder durch Aufnahme von Ethidiumbromid nach bekannten Verfahren (Sambrook et al.). Es zeigt sich, daß normale Maus-Embryo-Fibroblasten (MEF), die eine begrenzte Lebenszeit haben und in Kultur nur eine bestimmte Zahl von Zellteilungen durchlaufen (etwa 15 bis 20 Passagen), keine nachweisbare DNS in diesen Fraktionen des Zytoplasmas haben. Ebenso enthalten menschliche Lymphozyten aus dem peripheren Blut (PBL), die in diesem Differenzierungsstadium nur etwa 3 - 5 Zellteilungen in vivo und in vitro durchlaufen, ehe sie dem programmierten Zelltod unterliegen, keine nachweisbaren zytoplasmatischen Komplexe. Zellen mit unbegrenzter Proliferationskapazität, wie Zellen etablierter Linien von malignen Tumoren, enthalten dagegen zytoplasmatische Komplexe in den entsprechenden Fraktionen (Tabelle 1).
Tabelle 1
Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit der Fähigkeit zu uribegrenzter Proliferation mit Hilfe der Bestimmung zytoplasmatischer DNS-Protein Komplexe.
zytoplasmatische
Zellen Spezies Phanotyp Proliferation DNS-Protein Komplexe der Zellen [μg DNS/109 Zellen]
PBL Mensch normal transient < 1 ng
WIL-2 Mensch Tumorzellen unbegrenzt ca. 200 ng
HS-Sultan Mensch Tumorzellen unbegrenzt ca. 100 ng
MEF Maus normal transient < 1 ng
L929 Maus Tumorzellen unbegrenzt ca. 200 ng
EAZ Maus Tumorzellen unbegrenzt ca. 500 ng
Ag8.653 Maus Tumorzellen unbegrenzt ca. 300 ng
PBL: humane Lymphozyten aus dem peripheren Blut
WIL-2: humane T-Leukämie Linie (ATCC CRL 8062)
HS-Sultan: humane Leukämie Linie (ATCC CRL 1484)
MEF: Maus Embryo. Fibroblasten
L929: neoplastisch transformierte Linie der Maus-L-Zellen
(ATCC CCL 1)
EAZ: neoplastisch transformierte Linie des Maus Aszites Tumors
(ATCC CCL 77)
Ag8.653: Maus Myelom-Linie (ATCC CRL 1580) Beispiel 4
Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung in einem Zell-Lysat durch Hybridisierung zytoplasmatischer Komplexe mit der pLC108 DNS Probe (SEQ ID NO 1).
Zellen der neoplastisch transformierten Maus-Linie L929 (A) und primäre Maus Embryo Fibroblasten (MEF) (Passage 5) (B) werden in Gegenwart von 50 mmol/l Tris-HCl, pH 7.2,
10 mmol/l EDTA, 3 mmol/l MgCl2 durch mehrmaliges Einfrieren und Auftauen lysiert. Die Zellkerne werden durch Zentrifugation bei 6000 × g für 20 Min sedimentiert. Der Überstand (Lysat des Zytoplasmas) wird mit Proteinase K
(50 μg/ml) für 1 Stunde bei 60°C inkubiert. Anschließend wird die Fraktion mit KCl versetzt (ad 0,5 mol/l) und in einer Verdünnungsreihe durch einen Nitrozellulose-Filter BA85 (Schleicher & Schuell) mit Hilfe der "Minifold" Apparatur filtriert. Da die DNS-Protein-Bindung der nachzuweisenden Komplexe stabil gegenüber hohen Salzkonzentrationen und die Proteine in den Komplexen nicht durch
Proteinase abbaubar sind, bleiben die Komplexe (im Gegensatz zu anderen DNS-Protein-Assoziationen) unter den gewählten Bedingungen intakt und werden im Filter zurückgehalten. Der Nitrozellulose-Filter wird schließlich zweimal mit 20 × SSC gewaschen und bei 120°C für 15 Minuten getrocknet. Zum Nachweis der Komplexe von Maus-Fibroblasten mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation wird eine Hybridisierung mit einer 32P-markierten DNS der in SEQ ID NO 1 gezeigten Sequenz (pLC108) nach bekannten Methoden unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (55 %
Formamid, 1 mol/l NaCl, 1 % SDS, 10 % Dextransulfat,
100 μg/ml Hering Sperma DNS) bei 42°C (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd
Edition, 1989) durchgeführt.
Ergebnis:
(A) Die Proben der zytoplasmatischen Lysate von L929-Zellen zeigen in Abhängigkeit von der Verdünnung des Lysats ein Hybridisierungssignal mit der Probe der SEQ ID NO 1 gezeigten Sequenz (LC108).
(B) Es wird keine Hybridisierung mit dem zytoplasmatischen Lysat primärer Maus-Fibroblasten (MEF) erhalten.
Beispiel 5
Nachweis von menschlichen und tierischen Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung mit Hilfe der in situ Hybridisierung.
Zellen der Maus-Tumor-Linie L929 (ATCC CCL 1) (A) und primäre Maus-Embryo-Fibroblasten (Passage 5) (B) werden in DMEM-Medium auf Objektträgern kultiviert. Beide Kulturen enthalten proliferierenden Zellen, wobei die L929-Zellen unbegrenztes Proliferationspotential haben, primäre MausFibroblasten dagegen stellen ihre Proliferation nach ca. 15 - 20 Passagen in Kultur ein und sterben dann ab. Weiterhin wird durch subkutane Injektion von L929-Zellen in C3H-Mäusen ein Tumor induziert, ein Gefrierschnitt von diesem Tumor angefertigt und auf einen Objektträger übertragen (C). Die Objektträger werden zweimal kurz mit PBS
(Dulbecco/Vogt, J. Exp. Med. 99 (1954), 167 - 182) gewaschen, zur Fixierung mit 200 μl neutraler Paraformaldehydlösung (5 %) 5 Min. überschichtet und schließlich zweimal in 70%igem Ethanol gewaschen. Zum Nachweis von Zellen mit unbegrenztem Proliferationspotential wird das zu der in SEQ ID NO 1 gezeigten Sequenz (pLC108) homologe Oligonukleotid (Primer A): 5'GATCTTGAGTTTCCTCGTTGTAGGT3' (entsprechend Nukleotiden 1 - 25 von SEQ ID NO 1) verwendet. Dieses Oligonukleotid (100 pmol) wird in 20 μl Reaktionspuffer (20 mmol/l Kaliumkakodylat, 25 mmol/l Tris-HCl, pH 6,8, 5 mmol/l CoCl2, 0,25 mg/ml Rinderserumalbumin) mit 25 U Terminaler Transferase (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog Nr. 220582) 20 Min. bei 37°C mit Digoxigenin markiertem Didesoxy UTP (DIG-11-ddUTP) (1 nmol) markiert. Das markierte Oligonukleotid wird von den freien DIG-ddUTP Nukleotiden durch Gelfiltration über eine PlO-Säule (Biorad) abgetrennt. Zur Hybridisierung werden die Objektträger mit den fixierten Zellen oder Gewebeschnitten mit 200 μl Hybridisierungslösung (50% deionisiertes Formamid, 4 × SSC, 10% Dextransulfat, 1 × Denhardts-Lösung, 0,25 mg/ml denaturierte tRNS, 0,5 mg/ml denaturierte Heringssperma-DNS) überschichtet. Die Lösung wird mit Deckgläschen auf dem Objektträger abgedeckt und die Objektträger 1 Stunde bei 42 °C in einer feuchten Kammer inkubiert. Anschließend wird die Lösung wieder entfernt, die Zellen mit DIG-ddUTP-markierter Oligonukleotid Probe (5 ng DNS in 40 μl Hybridisierungslösung) überschichtet und über Nacht bei 42 °C in einer feuchten Kammer inkubiert. Schließlich werden die Objektträger zweimal 20 Min. in 2 × SSC bei 42 °C gewaschen. Zum Nachweis der hybridisierten Oligonukleotide werden die Zellen mit einem FITC-gekoppelten Anti-DIG-Antikörper
(Boehringer Mannheim GmbH, Katalog Nr. 1207741) 20 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Nicht-gebundene Antikörper werden durch zweimaliges Waschen in PBS entfernt. Die Auswertung der Präparate erfolgt mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie bei 470 nm Anregungswellenlänge. Ergebnis :
(A) Zellen der Tumorlinie L929 zeigen eine starke Fluoreszenz im Zytoplasma, während der Kern keine Fluoreszenz aufweist. Dabei fällt die Häufung der Hybridisierungssignale im kernnahen Bereich des Zytoplasmas besonders auf. In Kontrollexperimenten ("Scheinhybridisierung" der Zellen ohne Oligonukleotid, aber Inkubation mit dem FITC-anti-DIG Antikörper) wird kein Fluoreszenzsignal erhalten.
(B) Nach Hybridisierung primärer Maus-Embryo-Fibroblasten (MEF) wird keine Markierung der Zellen erhalten (weder im Zytoplasma noch im Zellkern).
(C) Nach Hybridisierung des Gewebeschnitts eines durch L929 Zellen induzierten Tumors zeigen Tumor-Zellen eine Fluoreszens im Zytoplasma, während das umgebende (normale) Bindegewebe und Subkutangewebe keine Hybridisierungssignale zeigt. In Kontrollexperimenten ("Scheinhybridisierung" der Zellen ohne Oligonukleotid, aber Inkubation mit dem FITC-anti-DIG Antikörper) wird kein Fluoreszenzsignal erhalten. Die zytoplasmatischen Komplexe der tumorigenen L929-Zellen mit unbegrenztem Proliferationspotential können also durch Hybridisierung mit einer erfindungsgemäßen OligonukleotidProbe in einem Gewebeschnitt nachgewiesen werden. Auf diese Weise können also neoplastisch transformierte Zellen in einem Gewebeschnitt oder einer Biopsie erkannt werden.
Beispiel 6
Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung durch Hybridisierung chromosomaler DNS.
Chromsomale DNS wird aus Zellen der Maus Linien neoplastisch transformierter Fibroblasten L929 (ATCC CCL 1), Ehrlich Aszites Tumor Zellen (ATCC CCL 77), Myelom Ag8.653 Zellen (ATCC CRL 1580), WEHI164 Fibrosarcom Zellen (ATCC CRL 1751), der permanent proliferierenden, aber nichttumorgenen Fibroblasten-Linie NIH3T3 (ATCC CRL 6473) und aus primären Maus-Embryo-Fibroblasten (MEF) (Passage 6) nach bekannten Verfahren durch Inkubation zerkleinerter Maus-Embryonen (Typ 12) mit Kollagenase (0,1 U/ml) und Dispase (0,8 U/ml) in PBS für 1 h bei 37°C gewonnen (Abken et al., J. Cell Biol. 103 (1986), 795 - 805); Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd Edition 1989) isoliert. Nach Spaltung der DNS mit Hind III wird die DNS elektrophoretisch aufgetrennt und im Southern Blot Verfahren auf eine Nylon-Membran übertragen. Zum Nachweis von Zellen mit unbegrenzter Proliferation wird der Blot mit einer 3 2 P-markierten DNS der in SEQ ID NO 29
(pEFC38) gezeigten Sequenz hybridisiert.
Ergebnis:
Die Größen der hybridisierenden Restriktionsfragmente sind in den untersuchten Zellen unterschiedlich (Tab. 2). Dabei sind folgende Besonderheiten erkennbar: 1. Zellen mit begrenzter Lebensdauer und Proliferation (z. B. MEF) zeigen eine Hind III-Bande von ca. 3 kb und eine vcn ca. 2,6 kb.
2. Zellen mit unbegrenztem Proliferationspotential und Tumorbildung (L929, EAZ, Ag8.653, WEHI164) oder unbegrenzter Proliferation ohne Tumorbildung (NIH3T3) zeigen zusätzliche Hybridisierungssignale von Hind III-Restriktionsfragmenten mit bestimmten Größen. Dabei fehlt öfters die 3 kb-Bande. Allen unbegrenzt proliferierenden Zellen gemeinsam ist das Auftreten bestimmter zusätzlicher Hind III-Restriktionsfragmente der Größe 10 kb, 13 kb, 14,5 kb, 16,6 kb und 21,1 kb. Das Auftreten dieser zusätzlichen hybridisierenden Banden oder und/oder das Fehlen der hybridisierenden 3 kb Hind III-Bande unter Verwendung der in SEQ ID NO 29 (EFC38) gezeigten DNS-Probe zeigt somit Maus-Zellen mit unbegrenztem Proliferationspotential an.
Tabelle 2
Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder Tumorbildung durch Hybridisierung chromosomaler DNS mit der pEPC38 DNS-Probe (SEQ ID NO 29) .
Zellen hybridisierende Restriktiorsfragemente [kb]
1,9 kb 2,6 kb 3,0 kb 6,0 kb > 10 kb
MEF - + + - -
NIH 3T3 - + + - +
L929 + + + + +
EAZ - + + + +
Ag8.653 + + - - +
WEHT164 - + - - +
+ / - Hybridisierung/keine Hybridisierung mit einem
HindIII-Restriktionsfragment genomischer DNS der genannten Größe. Hind III-Restriktionsfragmente > 10 kb: 10 kb, 13 kb, 14,5 kb, 16,6 kb, 21,1 kb.
Beispiel 7
Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation durch Amplifikation der DNS bestimmter zytoplasmatischer DNS-Protein Komplexe.
Die permanent proliferierenden Maus-Fibrom-Zellen L929 tragen zytoplasmatische DNS-Protein Komplexe, welche eine DNS enthalten, die mit der LC108 DNS (SEQ ID NO 1) hybridisieren. Maus Tumor-Zellen anderen Differenzierungsgrades, wie z. B. Ehrlich-Aszites-Tumorzellen, haben dagegen
Komplexe, welche eine DNS enthalten, die mit der EFC 38 DNS (SEQ ID NO 29) hybridisiert, aber nicht mit der LC108 DNS oder einer anderen der in SEQ ID NO 1 - 20 genannten
Sequenzen. Im Gegensatz zu den unbegrenzt proliferierenden Tumor-Zellen L929 und Ehrlich-Aszites-Zellen sind im Zytoplasma von primären Fibroblasten mit begrenzter Proliferationskapazität, wie z. B. Maus-Embryo-Fibroblasten, keine derartigen Komplexe nachweisbar. Mit Hilfe der PolymeraseKetten-Reaktion (PCR) kann die DNS der jeweiligen Komplexe spezifisch amplifiziert und so die Anwesenheit permanent proliferierender Zellen in einem Zellgemisch nachgewiesen werden. Die gewählten experimentellen Bedingungen erlauben außerdem eine Unterscheidung des Differenzierungsgrades dieser Zellen, ob es sich um Fibrom-oder Aszites-Zellen handelt.
Jeweils 104 Zellen primärer Maus-Embryo-Fibroblasten
(Passage 6), neoplastisch transformierter Maus-Zellen der Linien L929 (ATCC CCL 1) und Ehrlich-Aszites (ATCC CCL 77) oder ein Gemisch dieser Zellen werden in 5 μl PBS resuspendiert, 15 μl H2O hinzugegeben, sofort bei -20°C gefroren und dann 10 Min auf 95°C erhitzt. Die Proben werden dann in Gegenwart von Proteinase K (500 μg/ml) 1 Std. bei 55°C inkubiert und abschließend nochmals für 10 Min bei 95°C erhitzt. Zur Amplifikation der DNS zytoplasmatischer DNS-Protein Komplexe mit Hilfe der PCR-Technik (polymerase chain reaction) nach bekanntem Verfahren (Mullis und
Fallona, Meth. Enzymol. 155 (1987): 335 - 350; Saiki et al., Science 239 (1988): 487 - 491) wird folgender PCR-Reaktionsansatz hinzugefügt:
3 μl 10x Taq-Puffer (200 mmol/l Tris-HCl, pH 8,4, 250 mmol/l KCl, 0,5% Tween 20, 1 mg/ml BSA);
0,5 μl 100 mmol/l MgCl2;
1 μl dNTP-Lösung (2 mmol/l dATP, 2 mmol/l dCTP, 2 mmol/l dGTP, 2 mmol/l dTTP);
1 U Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim);
je 100 ng Primer-Oligonukleotide A und B für die Amplifikation der LC108 homologen DNS bzw. die Primer-Oligonukleotide C und D für die Amplifikation der EFC38 homologen DNS zytoplasmatischer DNS-Protein Komplexe.
Die Primer-Oligonukleotid-Sequenzen (Primer) sind Teilsequenzen der in SEQ ID NO 1 bzw. SEQ ID NO 29 gezeigten DNS-Sequenzen.
Primer A: 5'GATCTTGAGTTTCCTCGTTGTAGGT3'
(Nukleotide 1 - 25 von SEQ ID NO 1)
Primer B: 5'GATCCAAAGCCCTCTGCTGGCCTCC3'
(komplementär zu den Nukleotiden 203 - 179 von SEQ ID NO 1) Primer C: 5'GATCCAATCAGCTCAGCCACCCCCA3'
(Nukleotide 1 - 25 von SEQ ID NO 29)
Primer D: 5'AAAACCAGGCCCTCCCACATG3'
(komplementär zu den Nukleotiden 372 - 352 von SEQ ID NO 2)
Es werden 30 Zyklen mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt:
1. 1 × [2 min 95°C]
2. 30 × [30 sec 55°C; 90 sec 72°C; 60 sec 95°C]
3. 1 × [15 min 72°C]
Die so amplifizierte DNS zytoplasmatischer Komplexe wird in einem l%igen Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und nach Inkubation mit Ethidiumbromid im UV-Licht sichtbar gemacht.
Ergebnis:
Nach DNS-Amplifikation der LC108 homologen Komplexe mit Hilfe der Primer A und B wird eine amplifizierte DNS (203 bp) bei der Verwendung der permanent proliferierenden L929Zellen erhalten, nicht aber bei MEF und Ehrlich-AszitesZellen. Nach Amplifikation der EFC38 homologen DNS wird eine amplifizierte DNS (372 bp) bei dem Lysat von EhrlichAszites-Zellen, nicht aber in den Proben der MEF oder L929Zellen erhalten (Tab. 3). Der Mischungsansatz von L929Zellen oder Ehrlich-Aszites-Zellen in 104 Maus-EmbryoFibroblasten (MEF) zeigt, daß mit Hilfe dieser Versuchsdurchführung unbegrenzt proliferierende Zellen (L929, EAZ) in 104 normalen Maus-Fibroblasten mit begrenzter Proliferationskapazität nachgewiesen werden können. Mit Hilfe der Wahl der Primer-Paare (A, B oder C,D) kann außerdem der Differenzierungsgrad der jeweiligen malignen Zellen in dem Zellgemisch bestimmt werden (Fibrom-[L929] oder Aszites[EAZ] Zellen).
Tabelle 3
Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation durch Amplifikation der DNS bestimmter zytoplasmatischer Komplexe.
Zellen/ Anzahl der PCR-Amplifikation mit Hilfe der Zellgemisch Zellen Primer A, B Primer C, D (a) (b) (a) (b)
MEF - 104 - - -
L929 - 104 - + -
EAZ - 104 - - +
MEF L929 104 1 + -
MEF EAZ 104 1 - +
+/- Amplifikation/keine Amplifikation der DNS zytoplasmatischer Komplexe.
Beispiel 8
Bestimmung der Anzahl menschlicher oder tierischer Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation in einem Zellgemisch durch kompetitive PCR-Amplifikation der DNS zytoplasmatischer Komplexe.
Mit Hilfe der hier aufgeführten experimentellen Anordnung kann die Anzahl der Zellen mit unbegrenzter Proliferation und bestimmten Differenzierungsgrades in einem Gemisch von normalen prä-seneszenten Zellen mit begrenzter Proliferationskapazität (annäherungsweise) bestimmt werden. Dabei wird die DNS zytoplasmatischer Komplexe mit Hilfe spezifischer Primer Oligonukleotide durch die PCR-Reaktion amplifiziert, wobei die spezifische (nachzuweisende) DNS mit einer konstanten Menge an bekannter, kompetitierender DNS konkurriert. Dadurch, daß die PCR-Reaktion in Gegenwart von DIG-dUTP erfolgt, wird die amplifizierte DNS durch modifizierte Nukleotide markiert. Die gesuchte, amplifizierte DNS der Komplexe wird dann durch Hybridisieren an eine einsträngige, homologe "Fang-Probe" gebunden, und die Menge der gebundenen, DIG-markierten DNS wird dann mit Hilfe eines anti-DIG ELISA bestimmt. Die Methode ist so ausgearbeitet, daß die experimentellen Schritte auf einer dafür vorbereiteten Mikrotiterplatte erfolgen können.
1. Herstellen des Zellysats
Zellgemische (insgesamt 105 Zellen) aus primären MausEmbryo-Fibroblasten (MEF) und Ehrlich-Aszites-Zellen (EAZ), welche die nachzuweisenden Ehrlich-Aszites-Zellen in steigenden Konzentrationen enthalten, werden in 100 μl 50 mmol/l Tris-HCl, pH 7,2, 10 mmol/l EDTA, 3 mmol/l MgCl2 aufgenommen und die Zellen durch zweimaliges Einfrieren und Auftauen lysiert. Die Zellkerne werden durch Zentrifugation für 10 min bei 6000 × g sedimentiert, der Überstand mit Proteinase K (50 μg/ml) versetzt und 1 Stunde bei 55°C inkubiert. Die Proteinase wird anschließend durch Erhitzen auf 95°C für 10 min inaktiviert.
2. Herstellen einer spezifischen "Fangprobe"
Zum Nachweis von Ehrl ich-Asz ites-Zellen wird eine Fangproben-RNS verwendet, die eine Teilsequenz der in SEQ ID NO 29 gezeigten Sequenz (372 bp) aufweist. Die DNS-Sequenz (von Basenpaar 26 bis Basenpaar 350 der in SEQ ID NO 29 gezeigten Sequenz) wird in einen SP6-Vektor, z. B. pSPT18, nach bekannten Verfahren kloniert (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd Edition, 1989). Mit Hilfe der SP6-RNS-Polymerase wird nach bekannten Verfahren (Dünn und Studier, J. Mol. Biol. 166: 477, 1983; Kassavetis et al., J. Biol. Chem. 257: 5779, 1982) eine einzelsträngige RNS-Probe hergestellt und gereinigt, bevorzugt mit Hilfe von Matrix-gebundener DNase I (frei von RNase). Die RNS wird mit Hilfe von Biotin-UTP und RNA-Ligase terminal markiert und von nicht-eingebautem BiotinUTP durch Gelfiltration durch eine Sephadex G50 Säule (Biorad) gereinigt. Die Biotin-EFC38 (26-346) Fangprobe steht jetzt zur Bindung an eine mit Streptavidin beschichtete Mikrotiter-Platte zur Verfügung.
3. Beschichten der Mikrotiter-Platte
Der Boden einer für ELISA-Tests geeigneten 96-Loch Mikrotiter-Platte wird mit Streptavidin beschichtet , gewaschen und getrocknet . Anschließend wird in 100 μl TE-Puffer ( 10 mmol/l Tris-HCl, pH 7,5, 1 mmol/l EDTA) die Biotin-markierte "Fangprobe" [500 ng Biotin-EFC38 (26-246)] hinzugegeben und 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Fangprobe bindet über Biotin an Streptavidin auf der Mikrotiterplatte. Abschließend werden die Löcher der Mikrotiterplatte mehrmals mit TE-Puffer gewaschen.
4. Herstellen einer EFC38-PCR-Kompetitions-Probe.
Zur kompetitiven (quantitativen) Amplifikation mit Hilfe der PCR-Technik wird eine DNS benötigt, die mit der zu bestimmenden DNS um die Bindung der spezifischen Oligonukleotid-Primer konkurriert. Dazu wird eine doppelsträngige "Kompetitions-DNS" gewonnen, die wie die in SEQ ID NO 29 gezeigte DNS 372 bp lang ist und deren Basenpaare 1 - 25 und Basenpaare 351 - 372 mit denen der in SEQ ID NO 29 gezeigten DNS identisch sind. Die Basenpaare 26 - 350 sind aber nicht identisch mit der in SEQ ID NO 29 gezeigten DNS-Sequenz, sondern weisen eine zufällige DNS-Sequenz auf, wie sie mit Hilfe handelsüblicher Oligonukleotid-SyntheseApparaturen hergestellt werden können.
5. Kompetitive PCR der EFC38 homologen DNS der DNS-Protein Komplexe.
Zu dem Zellysat (100 μl) (aus 1.) wird zur Amplifikation der gesuchten EFC38 homologen DNS folgender PCR-Reaktionsansatz hinzugefügt:
12 μl 10 × Taq-Puffer (200 mmol/l Tris-HCl, pH 8,4, 250 mmol/l KC1, 0,5% Tween 20, 1 mg/ml BSA);
1,5 μl 100 mmol/l MgCl2;
2,5 μl DIG-dNTP-Lösung (2 mmol/l dATP, 2 mmol/l dCTP, 2 mmol/l dGTP, 2 mmol/l dTTP, 0,7 mmol/l DIG-dUTP)
(Boehringer Mannheim); 2 U Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim);
je 100 ng Primer-Oligonukleotide C und D (siehe Beispiel 7)
Es werden 30 Zyklen mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt:
1. 1 × [5 min 95°C]
2. 30 × [30 sec 55°C; 90 sec 72°C; 60 sec 95°C]
3. 1 × [15 min 72°C]
Abschließend werden die Proben 10 min auf 95 °C erhitzt, auf 75 °C abgekühlt, in die vorgewärmte Mikrotiterplatte gegeben und langsam (2°C pro min) auf Raumtemperatur abgekühlt.
6. Quantitative Bestimmung der amplifizierten DNS.
Die Probenlöcher der Mikrotiterplatte werden mehrfach mit je 500 μl PBS gewaschen und 1 Stunde mit einem anti-DIG╌Antikörper, Fab-Fragmente, gekoppelt mit Peroxidase (150 mU/ml in PBS, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin) (Boehringer Mannheim) bei 37 °C inkubiert. Die Probenlöcher werden zweimal mit PBS gewaschen und abschließend mit 200 μl ABTS-Substrat (Peroxidase-Substrat-Lösung) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Extinktion des Farbniederschlags in den jeweiligen Probenlöchern wird bei 405 nm Wellenlänge mit Hilfe eines Mikroplate-Readers gemessen. Die Extinktion ist proportional der Menge PCR-amplifizierter DNS aus
Komplexen und somit direkt proportional der Menge der
Ehrlich-Aszites-Zellen in dem Zellgemisch. Beispiel 9
Quantitativer Nachweis von Komplexen, die von Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation sezerniert werden.
Zellen mit unbegrenzter Proliferationskapazität sezernieren zytoplasmatische Komplexe. Der Nachweis dieser sezernierten Komplexe kann somit für den Nachweis von Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation, insbesondere zum Nachweis von Tumorzellen, eingesetzt werden. In diesem Beispiel wird gezeigt, daß die sezernierten Komplexe von
Ehrlich-Aszites-Zellen im zellfreien Kulturüberstand gemessen werden können. Dieses Verfahren erlaubt dabei die spezifische Bestimmung bestimmter Komplexe zur Unterscheidung von Tumor-Zellen verschiedenen Differenzierungsgrades.
1. Präparation des zellfreien Kulturüberstandes.
Ehrlich-Aszites-Zellen und primäre Maus Embryo Fibroblasten werden in Transwell™ (Costar, Cambridge, MA) Schalen kultiviert, die es erlauben, die Zellen in einem unteren Kompartiment zu züchten, wobei der Kulturüberstand durch eine Membran mit Poren (Durchmesser 0,3 μm) von den Zellen getrennt ist und aus einem oberen Kompartiment gewonnen werden kann. Sezernierte Komplexe diffundieren somit in das zellfreie obere Kompartiment. Es werden jeweils 104, 105 und 106 Zellen in 3 ml Medium ausgesät und nach 2 Tagen der zellfreie Kulturüberstand (100 μl) aus dem oberen Kompartiment gewonnen. Der Überstand wird mit Proteinase K (50 μg/ml) versetzt und 1 Stunde bei 55°C inkubiert. Anschließend wird zur Inaktivierung der Proteinase die Probe 10 min auf 95°C erhitzt. 2. Präparation der Mikrotiterplatten, der "Fangprobe" und der Kompetitions-DNS.
Die Besichtung der ELISA-Mikrotiterplatte mit Streptavidin und die Präparation der biotinylierten Fang-Probe erfolgt wie in Beispiel 8 beschrieben, mit den dort angegebenen DNS-Sequenzen. Die Kompetitions-DNS wird ebenfalls wie in Beispiel 8 präpariert.
3. Kompetitive PCR-Amplifikation der DNS der zu bestimmenden Komplexe.
Der Kulturüberstand wird zu den beschichteten MikrotiterLöchern gegeben und mit dem in Beispiel 8 beschriebenen PCR-Reaktionsansatz versetzt. Die Amplifikation der DNS in Gegenwart von DIG-dUTP erfolgt ebenfalls wie dort beschrieben. Abschließend wird der Ansatz 10 min bei 95 °C erhitzt und langsam (2°C pro min) auf Raumtemperatur abgekühlt.
4. Bestimmung der amplifizierten DNS.
Die Probenlöcher der Mikrotiterplatte werden mehrfach mit je 500 μl PBS gewaschen und 1 Stunde mit einem anti-DIG╌Antikörper, Fab-Fragmente, gekoppelt mit alkalischer Phosphatase (20 μg/ml in PBS, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin) (Boehringer Mannheim) bei 37°C inkubiert. Die Probenlöcher werden zweimal mit je 500 μl PBS gewaschen. NADPH wird zugesetzt und durch die alkalische Phosphatase des gebundenen anti-DIG Antikörpers zu NADH umgesetzt. Mit Hilfe eines Enzymzyklus (AMPAKR , Dako), der Alkoholdehydrogenase und Diaphorase umfaßt, wird nun NADH von dem Enzym Diaphorase nach Zugabe von INT in NAD+ und Formazan umgesetzt. NAD+ wird durch die Alkoholdehydrogenase nach Zugabe von Ethanol in Azetaldehyd und NADH umgesetzt, das dann wiederum für die Umsetzung durch die Diaphorase bereit steht. Bei jedem dieser Zyklen entsteht ein Molekül Formazan. Die Extinktion des gebildeten Farbstoffes wird bei 492 nm mit Hilfe eines Mikroplate Readers gemessen.
Die kompetitive Amplifikation der DNS der zu bestimmenden Komplexe mit Hilfe der PCR-Technik in Gegenwart von DIG-dUTP und der Nachweis der amplifizierten DNS mit Hilfe des alkalische Phosphatase-gekoppelten anti-DIG-Antikörpers sowie die anschließende Verstärkung des Signals durch einen Enzymzyklus erlaubt eine äußerst sensitiven Nachweis der zellsezernierten Komplexe. Die gemessene Extinktion ist proportional der Menge PCR-amplifizierter, DIG-markierter DNS aus sezernierten Komplexen und direkt proportional der Menge eingesetzter Ehrlich-Aszites-Zellen in der Diffusionskammer-Kultur.
Beispiel 10
Isolierung von DNS-Protein-Komplexen zum Nachweis von
Zellen des Hodgkin-Lymphoms
Zellen der menschlichen Hodgkin-Linien HD 540 (L540) und HD 428 (L428) (Diehl et al. Cancer Treat. Rev. 66, 615-632 (1982) hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM) Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig am 29.06.1994 unter Nr. DSM ACC2177, (HD 540) bzw. erhältlich aus der öffentlichen Sammlung der DSM unter der Nr. DSM ACC197 (L 428)) werden in Gegenwart von 50 mmol/l Tris, pH 7,2, 10 mmol/l EDTA und
1,5 mmol/l MgCl2 durch mehrmaliges Einfrieren und Auftauen lysiert und die Zellkerne anschließend durch 30minütige Zentrifugation bei 6.000 g abgetrennt. Der hierbei
erhaltene Überstand wird 20 Minuten lang bei 60 °C mit Proteinase K (100 μg/ml) inkubiert und anschließend auf einem Casiumchlorid-Zweistufengradienten geschichtet, wobei die untere Fraktion (1 ml) eine Dichte von ca. 1,80 g/cm3 aufweist, die obere Fraktion (1 ml) eine Dichte von ca. 1,70 g/cm3. Nach Zentrifugation für 10 Stunden bei
150.000 g wird das Sediment in 100 μl 100 mmol/l Tris-HCl, pH 7,2, 1 mmol/l EDTA resuspendiert, gegen 10 mmol/l TrisHCl, 1 mmol/l EDTA, pH 7 , 2 dialysiert und die Menge der erhaltenen DNS in dieser Fraktion, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt.
Die DNS wird einer "Auffüll-Reaktion" mit Hilfe der KlenowDNS-Polymerase in Gegenwart von dNTPs nach dem Fachmann bekannten Verfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 2nd Edition, 1989) unterzogen, anschließend in den pUC19-Vektor in Gegenwart von 10 U Ligase ligiert und das erhaltene rekombinante Plasmid in E.coli kloniert. Bei der Replikation des Plasmids werden in den Bakterien proteinfreie Kopien dieses rekombinanten DNS-Moleküls hergestellt.
Auf diese Weise wurden mehrere unabhängige Plasmidklone zytoplasmatischer Komplexe von menschlischen Hodgkin-Zellen gewonnen (pHD540, pHD420). Die Insert-DNS dieser Plasmidklone ist zum Nachweis neoplastisch transformierter Zellen des Hodgkin-Lymphoms bei sinngemäßer Anwendung der Beispiele 3 bis 9 geeignet. Die dabei zur Anwendung kommenden DNS-Sequenzen sind in SEQ ID NO 45-58 gezeigt.
Diese Sequenzen hybridisieren nicht mit den aus Mauszellen gefundenen Sequenzen. Beispiel 11
Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Serums
gegen zytoplasmatische DNS-Protein-Komplexe zum Nachweis von Maus-Tumor-Zellen
Maus-Tumor-Zellen sollen mit Hilfe eines spezifischen
Antiserums gegen zytoplasmatische DNS-Protein-Komplexe nachgewiesen werden. Dazu wird ein Protein-Lysat der Zellen hergestellt, elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine
Trägermembran übertragen und mit dem spezifischen Antiserum aus Kaninchen im Western-Blot-Verfahren inkubiert. Die gebundenen Kaninchen-Antikörper werden mit Hilfe eines sekundären anti-Kaninchen-Antikörpers und der
Chemolumineszenz-Reaktion nachgewiesen.
Durchführung:
1. Gewinnung des Antiserums
Die Kaninchen wurden mit DNS-Protein-Komplexen
(isoliert aus dem Zytoplasma von Maus L929 Zellen) durch drei s.c. Injektionen in 3 Wochen Abständen immunisiert und anschließend das Serum gewonnen.
2. Gewinnung eines Protein-Lysats
Die Zellen L929 (Maus-Tumor-Zellen) und MEF (Maus normale embryonale Fibroblasten) werden in Gegenwart von 50 mM Tris-HCl, pH 7.2, 10 mM EDTA, 3 mM MgCl2, 0,2 % NP40 lysiert. Zelltrümmer, Zellkerne und
Membranen werden durch Zentrifugation bei 8.000 g. 2 min. abgetrennt. Der Überstand (Protein-Fraktion) wird bei -20°C gelagert.
3. Western-Blot und Nachweis-Reaktion
Die Protein-Fraktion der Zellen L929 und MEF
(entsprechend ca. 105 Zellen) sowie isolierte DNS- Protein-Komplexe (2 μg) (als positive Kontrolle) werden in Gegenwart von SDS denaturiert, in einem SDS- Polyacrylamid Gel elektrophoretisch aufgetrennt und nach dem Fachmann bekannten Verfahren
elektrophoretisch auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen (E. Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratories, CSH Press). Die Membran wird TBS (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7.6), 3 % (v/v) Tween 20, 5 % (w/v) Trockenmilchpulver 1 h inkubiert, anschließend das Kaninchen-Antiserum (1:5.000) hinzugegeben und nochmals 1 h inkubiert. Die Membran wird in TBS, 3 % Tween 20 gewaschen, dann 1 h mit einem Ziege-antiKaninchen-Antikörper (HRPO-markiert) (1:5.000) inkubiert.
Nach erneutem Waschen wird die Detektionslösung (ECL, Amersham, RPN 2106, 2108, 2109) hinzugegeben und eine Autoradiographie angefertigt.
Ergebnis:
Aus dem Protein-Lysat der L929 Tumorzellen reagiert das Antiserum mit Proteinen des Molekulargewichts von ca.
36 kD, 52 kD, 62 kD, 64 kD sowie mit Protein-Aggregaten von > 150 kD. Die Proteine vom Molekulargewicht 52 kD, 62 kD, 64 kD werden auch bei den isolierten DNS-Protein-Komplexen aus Tumorzellen (positive Kontrolle) durch Reaktion mit dem Antiserum gefunden. Die Bande bei 36 kD stellt
wahrscheinlich Protein-Abbauprodukte dar.
In dem Protein-Lysat der MEF Normalzellen sind keine spezifischen Reaktionen mit dem Antiserum zu erkennen. Eine leichte Reaktion mit Protein-Aggregaten > 150 kD stellt wahrscheinlich eine unspezifische Bindung des Antiserums dar.
Beispiel 12
Isolierung von DNS-Protein-Komplexen aus Mamma-Karzinomen
Analog zur Vorgehensweise von Beispiel 10 wurden DNS-Protein-Komplexe aus Zellinie MCF 7 des Mamma-Karzinoms gewonnen. Ein Teil der Nukleinsäure ist sequenziert und in SEQ ID NOS 59-61 enthalten. Diese Sequenzen können als Sonden zur Identifizierung und Isolierung von MammaKarzinomzellen benutzt werden, die die erfindungsgemäßen Komplexe beinhalten. Nach in-vitro oder in-vivo Vermehrung der Nukleinsäuren kann die Gesamtsequenz der DNS dieser Komplexe bestimmt werden. Die bisher gefundenen Sequenzen hybridisieren nicht mit den aus Hodgkin- oder Maus-Zellen gefundenen Sequenzen. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind also Nukleinsäuren, die ein Teil der Gesamtsequenz der Komplexe sind, bzw. deren funktioneile Äquivalente wie oben beschrieben.
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
(B) STRASSE: Sandhofer Str. 116
(C) ORT: Mannheim
(E) LAND: DE
(F) POSTLEITZAHL: 68305
(G) TELEFON: 0621/759-4348
(H) TELEFAX: 0621/759-4457
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG:
Verfahren zur Identifizierung von menschlichen und tierischen Zellen mit der Faehigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 62
(iv) CCMPÜTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30B (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 203 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
GATCTTGAGT TTCCTCGTTG TAGGTCTTCC CTGGCTCTGC TCACGCTCTC ACTGACTTCT 60 CTCAGCTCAG TCACAGTGTC TATTTCTTTC CACTTAAAGA TGTGCATTTT TATTTGATGC 120 GTGCAGGTGT TTTGCCTGCA TGGATGGCIG TGCACCATGT ATGGGACCTG GTGCTCTTGG 180 AGGCCAGCAG AGGGCTTTGG ATC 203
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUΕNZKEWZEICHEN:
(A) LÄNGE: 69 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGPORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2 :
GATCTTTTCT TGAAAGTACG TAAGCCTGGG GTTTTAATTC TCATCTTAGA ACACAGTGTA 60
AAAAGGATC 69
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3 :
(i) SEQUEN-.KENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 224 Baεenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3 :
GATCTTCAGT GTCCATACAC TCAGATTCCT GATTAAATCA AAGCATCAGA ACCACTCCCC 60
CTGCAAAATG TCCCAAAATG TAAAATCAAT TGATGTACAA CTCAGAATAC ACCACTCTGA 120
GGCATATTTT CCAGGGACTC TAACCTACTT CAGAAGTACA TGCTACTTGC TΓCTCTATTA 180
CAGCATAATA GAGATGAGCA. ACATAGTGCA CTTACAAACA GATC 224
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 50 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPODDGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS : Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
GATCAGACCT CTACCTTCAC CCATGAGGCT TGCTTGCAGC AATTAAGATC 50
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENZEICHEN:
(A) LÄNGE: 55 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGPORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS : Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5 :
GATCTTTAGC TCCCTGGATA CTITCTCTAG CTCCTCCATT GGGGGCCCTG TGATC 55
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 72 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGPORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
GATCTTTCCA AGACTTTTAT CATGAATGGG TGTTGGATCT TGTCAAATGC TTTTTCTGCA 60
TCCAACGAGA TC 72
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 47 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGPORM: Einzelstrang
(D) TOPODDGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
GATCCTGGCA TTACCCTATC CTGCATTAAG GGGGGAACAG GAAGATC 47
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 34 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID ΝO: 8:
GATCCATTCT ATCTCCACCC CCACCATGAG GATC 34
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUEN.-KENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 176 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGPORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
GATCTTCGCC GCCGACCTGA CCTCGATCGA GGTGGCGCNN GGOGTCGATC ATATCATCTT 60 TGGCTGGGTG TTCTTCGCGC TGGTGATGGC AGCGGTGCTG GCCATCGGCT GGCAGTTTTT 120 CGATCKTTCC CCCGATGATC CCATCACTGG CCAGGCATGG AGGCCCACAG GGGATC 176 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUΕNZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 43 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
GATCACGCCG GACGAAGCCT AOGACATCAC CGTCTACCAG ATC 43
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
GATCTCCTCG CCTCTCTATC CCCAGCACCT GCCAAGAGGA TC 42
(2) ANGABEN ZU SBQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 110 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
GATCTGGTCG ATGCCGATTG CTGAGGTTGG TTGGTGCGGT GATTCCTGTT AATTTCCTTA 60
GAGGAGGGTG GGTTTGCAGT GTCATGAGAA TGGAGGGTCG GGATTTGATC 110
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 70 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
GATCAAAAAG CGTGGAAAAA TTTGAATGTC ATGTCGAGCT GGTATOGGCT TCTGGAATAC 60
CGAAAGGATC 70
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SBQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 88 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(Xi) SBQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
GATCTGGGGC CAGTGATAGC CATCTCTGTN CCTGTATGTG CODGGACATC CIGGGGATAA 60 AGAGAGATCC TTCATGTGGA GGAAGATC 88
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZKEMJZEICHEN:
(A) LÄNGE: 75 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGPORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15 :
GATCTTTCCA ACACTTTTAT CATGAATGGG TGTTGGATCT TGTCAAATGC TTTT TCTGCA 60
TCCAACGAGA TGATC 75
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 94 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS : Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID ΝO: 16 :
GATCCGTCGT CGCTGCCGTG CRCCGCCTTG CCΑTGGGAAC CGTGTCTGGG CCCTCTGTCA 60
CAAGGTTCCC CCCGGGATGA CAACCGTTGT GATC 94
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17 :
(i) SEQUENZKEININZEICHEN:
(A) LÄNGE: 47 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
GATCTAACCG TGGAAGGCAG OGCCAGAGAG ACTGAATCAG GAGGATC 47
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 94 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
GATCTGAGTT CGAGGCTAGT CTGGTCTACA GAATAAGTTC CAGGACAACC AGGGCTGCAC 60
AGAGAAATCC TGCCTCCGGA AAGGAAAAAA GATC 94
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUEN.-KENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 202 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
GATCTTGAGT TTCCTCGTTG TAGGTCTTCC CTGGCTCTGC TCACGCTCTC ACTGACTTCT 60
CTCAGCTCAG TCACAGTGTC TATTTCTTTC CACTTAAAGA TGTGCATTTT TATTTGATGC 120
GTGCAGGTGT TTTGCCTGCA TC4GATGGCTG TGCACCATGT ATGGGCCTGG TGCTGTTGGA 180
GGCCAGCAGA GGGCTTTGGA TC 202
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 80 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
GATCCATGAC CACTCTTAGA AGCTGGTCTG GGTCTGAAGG GAAGGGGTCT TCAGAAGTCC 60
AGATGTGTGT GAACTGGATC 80
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 59 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGPORM: Einzelstrang
(D) TOPOUDGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
GATCTGCICT ATCTCAAATG GCATTCATTC CAGGCAGCCT ATGAAAGGAA CACTTGATC 59
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 233 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGPORM: Einzelstrang
(D) TOPOUDGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
GATCAGCTCT CCTGCTCTCA GGACCCTAGG GCCAGGTCTC CTACCTGCAG CAC4GTTATGA 60 GGAGTAAAGG GGTCTACCCC ACCATAAGGA GATGAGTATG CXΑGTTCCCA TGTTCACATT 120 CTTGAGGACA GCTCACTTGT ATCICCCATG TGAGGGGCTC ACTCTAAGGA GTATTACAAC 180 TTGACTGTCA GGTGGCATCC AAGCATCTCT CTGCTGCTAC ATGGCCAAGG ATC 233 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:
(i) SBQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 282 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: E-Lnzelεtrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23 :
GATCTCAGCT TTTGATAGAC TGAGGAAGAA GGGCCTCCTA GGGTACAAAT GTAAGTTTTA 60
TTCACCCGAG GTAATTΪCCA GCTGCTAACC TGGAAGCTTC TACXXTCAGT AAAATCTTAC 120
CTAGACCTAG AATGTTTTTC AGCCTAAGAC TTATTGCAGA ATAATGCTCA CXCTTTCTAG 180
GTTCATTCTG TGCTGACTGG TCAACTCAGC TATGCAAATT GCTGACTGAC TTAAGCAGGT 240
TCTTCAGCTT GGACTGACGG CCCGCTTGGC CTCAGACTAC TT 282
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 125 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID ΝO: 24 : GATCTTCATA AACCCGGGGGT TCGGTCCCAG GGCTGGCACT CTGTCGTAGT ACCCCACCGA 60
GACCCCTATT AGGCCAATAC AGCACCGOGN NNCTTCCTTT TCCCCACCCC ACCCGGCCTA 120
TAGTT 125
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 118 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGPORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(Xi) SBQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25 :
GATCTTTGGC GCIGCGCAGA AGCCCAGTCC CÄGGCGCGCG TCTTCGACCG GGACCCGTGCT 60
CCGCGGCGNG CTGCCAGCCA AAGCCCAGGT CGACAGGTAG CCGTCGCGGA ACTCGATC 118
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 500 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS : Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26 :
GATCTGAGCA AAAGTTTTCA AAATTCTGGA ATTAGAAAAT TTGAAGGTCG AAAATACTTA 60
TATGGAACAT GAAGGACTGT GCTTTACACT TATGTGGTTT GTTGTTGTTT ATCTGTTATG 120
GTITTGTTTT TGCTTTGTTT TGTTTTTCTG GTGCTGCACA TAGGCCCTGA AGAAGCTTGG 180
TTGCCGAGAC AAGCCACCAC AGCACACGGA ACTCCAGGGC TACTCTGATC CTATITTTTC 240
ATCCATTCAG TTAGCCTGAA TCTTTTTTAT TAGGGAATTG AGTCCATTGA TGTTGAGAGA 300
TATTAATGAC CAATGATTGT TAATTCCTGT TATTTTGATG GTGGTGGTAG TAGTGIGTGT 360 GTGTGTATGT GTGTGTGTAG TATTTCCCTT CTTTTGGTTT TGCTGATGTG ATATITATTT 420
CATGTTTTCA TGGGTGTACT TAATCTTCTT GGGTTGGAGT TTTCCTTCTA CTAGGGATAA 480
ATTTGTGGAC AGATATGGTT 500
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 592 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:
GATCCCGGAC TAGGATTAGC CTGTCTATGC CAGCAAATGA GTCAGGCAAC TGATGGTGAG 60
TCCTTCAGGT GTATATGTGT GGACAATTAA TTTTTATTAA AAAAATAAAT AAAGCCAAAG 120
GGAAATGTAT ATTTTAATGA CCTAGGGTAT TAATTTTTTT GAAAGTCACA CATCAAAGAC 180
TAGGAAAAGC CACCAACACC CTAAGAATGT GATTTTATCC TTTTTCCTCT GTGTGGGATG 240
TGTTTTAGTT TAGGTTTCTT TCTGTTTCAA TTTGGACCTG TAGAGGAATG ACCGTCACTG 300
TCTTATTCTG GAGGGAAGTC CCTGATAGTG CCCCACTACA CACACACACA CACACATACA 360 CACACACAAA TTAGGTATTA AAATATGGTT TTAAGAGTTT TAAAAATGGA TTAGCAGTGA 420 TTCAATTAAA ATTAGAAAAG AACAACAACA AATATGTGAG AGACTTGCCT CTCAGTGACC 480 CCACGCCCTG TCAGCTGATA GTGGGTGGTA ACCAGACAGC CCATITCTGT GTCGATAGAT 540 GAACIGTGGG AGAGTGACTC CAGAAAGAAC CAACCAGTGA GGGGTCGAGA TC 592 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 255 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28 :
GATCCCTTTA GCTCCTTGGG TTCTITCTCT AGCTCCTCCA TTGGGAGCCC TGTGATCAGC 60
CTGTACCACA TAGCAAATGT CAGGCCTCTT GGGGGAGTAT TGCAAGATAT TGCTACAAAT 120
AACAACAAAA GCAAACAAAG TTAACGTTTG CATAGCAACC TCCACCCCCC CAAGATTATA 180
CCTGTACATA ATTTATGTTC AAAGACAGTG GCACΑGGTCT GGCAAGATGC CTCACTTGAG 240
AGAAGCTCAC AGATC 255.
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 372 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFCRM: Einzelstrang
(D) TCPCLOGiE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID ΝO: 29 :
GATCCAATCA GCTCAGCCAC CCCCAGCICT CCTGTATGTA TGGCTCCAAT GCTGTTCATC 60
CCTCAGCATA AATCAATCAT TTGGTTTAGA TTCCTCCCTT TGACTTATTG CTACTATTAG 120
TATCAGTGAC TCTTCAGCCG ATTCTTTTCA GACATTGGAA CCCCΑGCCTC AGATCACAGT 180
TGTAGAACAA ATATTAAAAG AGTAAATTAT TATATCATTG AACATTCAAA AGTGCTTTGC 240
AGTCATTGAC ACATAATAAT AATGAAGCCT AAACAGTAAC ATGAAAATGT GGAATTGTAT 300
TAATGTAAAA TCAAGGCCTG GGGNATAGCT CATTGGTGGA TGTTTGGCTA TCATGTGGGA 360 GGGCCTGGTT TT 372
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 128 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFCRM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:
GATCTTGTCA AATGCT T TTT CTGCATCCAA CGAGATGATC CAACACCCAT TCATGATAAA 60
AGTCTTGGAA ACATCATGGC GACCACACCC GTCCTGTGGA TCCACAGGAC GGGTGTGGTC 120
GCATGATC 128
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 184 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TCPCLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:
GATCAGCAAC AGATTACTAC GAAAAGGCAA GCAAACAAAC AATAACAATA ACAAAACAAA 60
CCACTGTGTT GGATTTACTG ACTGCCIGAA ACAAATTACC CAAAGTATAG ACCTCAAAAT 120
ATCCATGTGA ACAGGGAAAC AAAGCACACA GACGAGCAAA AGTGGTCTCG AGGTGCTTAT 180
GATC 184
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 372 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES M0I£KÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32 :
GATCTAATAC CAATACTCTT CAAACTAΠC CACAAAATAG AAACAGAAGG AACACTACCC 60
ATTCATTCTA TGAAGCCACA TTTTTGCCAT GTATTCTCCC TTCAAAATGG AAAGGTTTCT 120
GTCTAATCAG GAACTTGTCA CAATTTCCTT TCTTGGAGGA CTTCATAAGA GATTTTTTTC 180
TACTTCTACC ACATTTAAGA TTCCAAACAG ATTTTAAACG GTTGTGTTCCAA TATTACTTTA 240
GTTCAGAAGA TATCATGTAT ATATAAGAGG CATTTAACAA TTATAAATTA TTTGGATGAC 300
TTAAAAATAT CAATACTGAG TTGTATATTT TAAAATAAAT TTTATTGGTT TTAAAAAAAC 360 AACCATAGGA TC 372 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 184 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGPCRM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:
GATCTCAGTT TTTAAAAATA AAGAAAATGC ATTCTTTTCA GAAGGAACAT GAAGATCTAG 60 AAGAAGTTCT GTGGCTAGAT GGATTTTGAA AGGTCCCGAA AGGTCCCGAA AGGTCCCGGGG 120 GNNGCCTGCT TCATGACTGT CACACACTTC AGTTGTCCAG GGAAGAGATA GAAAATGTGT 180 GATC 184
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 385 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGPCRM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:
GATCTCGCCT TGCAGATTTT TTTACCAACT GCCAGCCAGA GTCAAGGTCT GTCAGCAACT 60
GTCTTAAGGA GAACTACGCA GACTGCCTCC TGGCCTACTC GGGACIGATT GGTAAGACCA 120
GGGGAGGGAG GGAATGGCAA AGAAATCTGG ATTACAGATC AAGATGGGAC AGTTTAGCTT 180
CDGGTGACAG GCTAGATCCG ATGCCCTCTT CTGGTGTGTC TCAAGACAGC TACAGTGTAC 240
TTATATACAT AAAGTAAATA AATATTTTAA ACAAAACTTT TAAAAAAAAA AAGATTGGCT 300
ACAAAACTGA CCTATAGGGC TCCTAGCAGT CCTTGTCACC ACATAGCTGC AAACCCACCT 360
AGGGGAAAAC TGAGGCAGGA GGATC 385
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 35 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 371 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGPCRM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGGE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO: 35 : GATCTAACTT CCCIGTCCTG ATTGCTTTCA TGTAGAAACA TTCTGCAGCC AGAAGTGGCA 60
GCACACAGCC CCGGKCCCA CATCTGGGAG TCTGAGATAG ATGGAGCCTA AGTTTGAGAA 120
CTAAGTACTT TACAATTGCA GGCATAATTG AAATTGAGCT GCCITCTGTG TCTTCIGGAC 180
AAAGTTAACG TGATTTATAG GAAGGCATTC TGTGATCCTT TICIGGTTGC ACCATCCIGT 240
TCTCTCCAGG CCTGTGAATC ACAGCACACC AGTCCACATG TGCCTGCGCT GCTCTGTTGT 300
GGCAAGTGCT CCATCAGACT GCX-ATTTCTC TGCCAGGAAG GCAGGCTGGT CCCAGGCTAC 360
TTAGGAAGAT C 371
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 36 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 396 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 36 :
GATCTAGAGA GGTTAGGTAA AGAGTAGAGC TATAAATATA AGCCTGGGTT TCCCTGGGAA 60
GGAGTATTAA TTAGACTAGA TTCTCCATGA GCTGGGGAAG GGGGTAGAGG GNNGGGGAAG 120
GGAAGAAGAC AGGAACAGGA GAGATATTGT GTGTATGTAT CΩXΞGTGGGGT GGTGGAGGGA 180
AAGAGTGTAG NNGACTGGCA GTCAGATTGG GAGGCATTGA GTGATGTAGA ACTAGTGTGG 240
TAGAACTTGT GACTCTCTGA GTGTAACACT ATTGCAGACT C ACTAATGGA GGATTCAGAG 300
TCTGATTTGT CACTTTTTGT AGTCAGGCAA GGCITCCAGC GGAAGCTGTG GGCTACACTT 360
GATTCGCTG TIGGCTGAGG AGGACCCATG GAGATC 396
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 37 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 433 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37 :
GATCCAAGGG AGTGTTCCAG TTTTTCTGGA AGCTGAGATG CTCCAGCTGG TAGCTTGAGC 60
TTCACAAAGA TGCTGCCCTA ATAAATGTCA AGCACCCAGG GACTTCTCAG GAGCACATGC 120
TATGCTTAAA GGGGCCACAG TGAAATCTTA GACAAAGATG GATGGAGGTC TTGGCTTCTT 180
TIGTCTGTCT CTGTCTCATC TTTCTCTCTC TCICTGTGGC CTGTATGTAT GCATGTGCCT 240
TGTGCCAAGG AGGGCAGAAA AGGGTGTTAG ATCCTCCTGC CTCAGTCTTC TACATGCTGG 300
TTTTGAAGGC TGGTGCCACC ATTCCCAGCT CTCAAACTTG CTCGTGCCTG TCCCCTTTAT 360
AGAGGATAAG TTAGCTAAAT TGGTTCTCAT TATCCTTCTG TTTTCIGGCT TTTGGACCAT 420 CAGTGGTTTG ATC 433 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 38:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 434 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGPCRM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO: 38 :
GATCTGTATA AAGCACAAGG AQ-KTTTATC TGTCTGGACT CATCIGAGGA TTCTTTGGAT 60
CACTATTTAG ACATGTTAAA TTGATTAGAG AAGTCATTCA CTGTCATTGG GTACCATTTG 120
TCACATCATA -WAGCTGCA GTGTGCTGCC TCCAAATGCA GAAGGACCAA CAAATAAATC 180
ACATCAAATG GTGGGAGTAG ATGCTATCTT TCATCTATAA TTGGTATAGC CTTICCTGTC 240
ACATIGCTCA TTCTTATGAT TCTAGTGTGA TTGACAGACA 03GAAAGGGC AGCCTCTGTC 300
AAAGATGTTC AC.AGAGTGTG TOITCGGGTG ATGTACCTGC TAATAGATAT CCATCATAAT 360
ATTACATTAA TGTCACCATG CATCAAACAT ACAACTTACC CATCTAGGTA TCTGATGTTA 420
GACCCATAAG GATC 434
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 39 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 128 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFCRM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 39 :
GATCCAGCTA CAAATCTCAC AAAACACTCT GCCTGGGACA GAGGGTGTGA GTTGTAGTGG 60
TCTGAGGCAG GAAGCTCTGA GGCAGGGCTA GAAGAATTAC CTTGGAATTA CCTTCAGAAG 120
ACAGGATC 128
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 40 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 185 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES -TOLEXÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 40:
GATCAGCAAC AGATTACTAC GAAAAGGCAA GCAAACAAAC AATAACAATA ACAAAACAAA 60
CCACTGTGTT GGATTTACTG ACTGCCIGAA ACAAATTACC CAAAGTATAG ACCGCAAAAT 120
ATCCATGTGA ACAGGGAAAC AAAGCACACA GACAGAGCAA AAGTGGTCTC GAGGTGCTTA 180
TGATC 185 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 41:
(i) SEQUENZKINNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 129 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 41:
GATCAAGTGA CCATAGGTGT ATGGATTCAT CTCAGGGTCT TCAATTCTGT TCCATTGGTC 60
TACTTGTCTG TTGCCATACC AGTACCATGC ACTTTTTATC ACAAGTGCTC TGTAGTACAG 120
CTTTAGATC 129
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 42:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 275 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 42 :
GATCTGACAC CCTCTCTGGT CTCTCTGGGC ACTσPGCTCA CGTGCTCCTC AACTCCCΑTN 60
ACACGGAATT AAGAATCAAA ATATAAAATC TATAAAAAGA AAGGAAGGAA GGAAGGAAGG 120
AAGGAAGGAA GGAAGGAAGG AAGGAAGGAA GGCAGGTAGG CAGACAGGAA GAAAGAAAGA 180
AAGAAAGAAA GAAAGAAAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAAGAA GAAGAAGAAG 240
AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAA 275
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 43 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 225 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 43 : TCCACATTCT CCTTTGCTCT ATTATCCTTT CCTTTCCACT ACCACTGGTG AGTGATGGGC 60
TAGAGGTTAA AGCTTATATA AACTCTTATT TAAAATAAGT TTTAAAAAAT TTAAGTCTAT 120
AAAAGCCAGG AAAAGCAACC AATAATCAGC ATTCTTCCAT GGCCTCTGCT TCAGTTTCTG 180
CCTCGAAGTT CCTGCCTTGA CTTCCCTCAT TAATGCAACA TGATC 225
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 44 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 403 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFCRM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 44:
GATCTGGCCT CCCICTTCTT GCCTTTGCAA GAACTCTATG TACATGATAT GTGTACACAT 60
GCAAGCAAAA TACCCATGCA CACAAAATAA GGGGGTGGGA GGAACAGTCC CAGAGCGAAT 120
GCGTGAATTA AGACAAGCCA GGTGTAGTGG CACAGCTCTG TGGTCCTAAT GCTTGGAGAA 180
TATAATCAGG AGGATTTCTA GCTCAGTGTA TAACAAGACC TTCTCCTAAG AGAATAAAAA 240
TAGATGTAAA TATAAATAAA TAAACATAAA ATAAGACAAT TTGTAAACTC CTTATGAGAA 300
CTTGCTGTGG CTTTACTGGT ACATAGACCA GTAAGATTTC AGTGTAAAAG ACGCTCTCTG 360
TAAAGGGTGA GNCAAAGGGT CCAGGAGAGG CTITCCTTAG ATC 403
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 45 :
(i) SEQUEN.-KENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 543 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGPCRM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 45:
GATCTGAAAT TTTGAATATA TAAATAACTA ATCTTTACTA CCTTTAGATT GATGTCTTCC 60
AAGATGAGTA TGGTTAAATA ATATTCAAAA ATCTGCATGC TAAAGATTTG TCTCAAGCAA 120
GTCACTGTTG GGAAGTAGTT ATATTGTAAG AAGAAGTTGG GTCATAAGGA CACAGCTTGA 180
AAGGCAAAGT AGGACTGCAC CCACTTTCTC AGCTTTTATA TTGCTTCATG ACTAGGAAAT 240
GAAAAGTTGT CATGTGTCAC CTATCATAGC CATCCAGCAC CCAAGTCAGT GGCCAGAAGA 300 CAGTGTGTCA GCTTGGGATG GAATGGAATC TCAAAACTGT CAATCAAATT AAACTGTGTG 360
TGTGGAGGGC TGTATAAGTA TGTACATGTG AGTTTATGTT TGTATGTACA TAGATGCACA 420
TGTATGTGTG TATATACATG TGTATCATGT GTGTGTGTGT GTGTGTATGT CTATGTGTGT 480
GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTAG TACAGAAATC AATCATGGGC ATTATTCCTG 540 ATC 543 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 46 :
(i) SEQUEN-!KENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 76 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFoRM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 46:
CAAGAAATGC TAGAGCTAGG GTTCCTTTTA AAATTGTCGA TGTTTCTGAT GAAAATTATT 60
ATCAAAAGAT TAATAC 76
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 47:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 114 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS : Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 47:
GCCTTTATTT ATTACCAAAA AGAAAAGTAT TTTCTTTAAT TTGGAAGTTT TCACAAAAGG 60
CAATATCAAT ATTATATTGT AACATTTAAG AATTTTAAAG CCAGAAATTA AAGA 114
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 48:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 88 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 48 :
ACAGGATCAC TTGGGGACAT CTCAGGTAAC CGTGTTTTCA AAGGTATGAC ATGCCAGGTC 60
ACTTAGGAGC TGTTAGAACA ACAGTTCA 88
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 49 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 66 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGPCRM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS : Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 49 :
CTTTTTAAAG TAATTAGATT TGTAACATAA GGTATTTTAA GAAAATAAAT ATTITGATTG 60
GTTAGT 66
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 50:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 105 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGPCRM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 50:
ATGTCAACAT TTTTTTCTTG AACTAGTGCT AATAGAAGAT CAAGTTGCCT TATTTTTAAA 60 ATAAAATTTA GTTAAAATTT TGTCAAAACC CTTTAATTTT ATTTT 105 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 51:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 52 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFCRM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO: 51 :
CCAGATTCTC TTGCTTTTTC AGCTGTTTTA TCAGTACAAT TATGTGCTAT AA 52
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 52:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 202 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 52 :
CGGACCTATT ATCCTTAATG AATTACTTAA AGTTGCTGAC ACTCGITCAG TTCAAAACTA 60
CTTATTGAAA GAAGTACAAA GACTTTATCG TCTTCAAGGT ATCACAATTA GTGATAAATA 120
TATTGAAATG ATTATTCGTC AAATGCTTTC AAAAATTGTT ATTACTGATC CAGGAGATAG 180
TAAATTCTTT AGTGGTAACT TA 202
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 53:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 170 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGPCRM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 53:
AAGAAGATTA ACTTACAAAG ATTTTTTGGA AAAATATAAA CTTATTATGG ATAAAAATAC 60 TATTCTAAAA TTCAAATCAG ATAATGATAA ACTTTATGAA TTTTCATTAG AAAGCTTTAA 120 AGAAAACGAT AAATATAATT TCATATGGCA GAGATTTGCA TAAAAGCAAA 170 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 54:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 188 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO: 54 :
TTGAGTTTTA TTAGTTGAAG TTTTAAAGCG CTAGTACAAG AAAATTTTTC AGAAAACGTT 60
CTTATTGTAC TTTGAACGTG GTTGTAGAAA TTTAAAAAAC ACACTAGTTA TTTGAGGATT 120
CTGTAGTGAA GGCGGACATG AACTCAATTA ATAATAATTA TTTCGGCGAC GATAAGGACG 180
AACATTTT 188
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 55 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 230 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO: 55 :
CTTTAACAAT TCTTACATTT AAAACTTCTA CTAATACATC TAAATGTTTT TTAACTCCAT 60
GGCTCGAGCT TAAGCATTAG TACCAGTATC GACAAAGGCA CACATTTAAC AATAGGOGAG 120
TGTTAAGGTG TGTTGTATGC TCGGCCTTCG TATTTCACAT TCGGACCCCA CGGATTACTC 180
ACTCGATTGA GTGTAATTAA CGCAACGCGA GTGACGGCGA AGTCAGCCTT 230
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 56 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 139 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 56 :
CACTTGTAGG TACTACAGTT GTAAAAAAAG AACTTGATCA CXATTATCTT CTAGTTCAAC 60
GGAATAAAAA TTTTATTTTA AATCAATTTT AAAACAGTTT TGGAAATTAG AAAATAAAAC 120 CCATGGCTCG AGCTTAGCA 139 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 57:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 225 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 57:
ACGTCCGTAC GTTCGAACCG CATTACTACC AGTATCGACA AAGGCACACA TTTAACAATA 60 GGCGATTGTT AAGGTGTGTT GTAAGCTCGG CCTTCGTATT TCACATTTCG GACCCCACGG 120 ATTACTCACT CGATTGAGTG TAATTAACGC AACGCGAGTG ACC4GGCGAAA GGTCAGCCCT 180 TTGGACAGCA CGGTCGACGT AATTACTTAG CCGGTTGCGC GCCCC 225
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 58:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 22 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 58:
ACCTGCAGGC ATGCAAGCTT GG 22
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 59:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 215 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 59 :
CCCTAAAATT AAAGAATTTA AAGAATTAGT TAAAAGCAGC AAAGAATTAT TCTTACAAAA 60
AATACAAGCA AAATTTGAAA TGACTAAAAC GAGATTCAAG AATCAAGCCT TGCATTGTTT 120
CAATAATCAA TTAGCAACTT TTTCAATAGT AAAAGAAAAA GTTATTCAAC CTAATCCATT 180
AAAATATTAG AAAGTTTCGA AGTTACAATG AACAC 215
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 60:
(i) SEQUΕNZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 192 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 60 :
TAATTGAAAA ACATGTTGAT GAAGTCGATA TGGTAGAAAA TTAAGTTACA TTTCAAAAAA 60
TAGTTGAAAT TGAACAAAAT AACAAAATTA ATAAACCAAC AAAAGTAAAC ATTGAAAACG 120
TTTTTGAAAA AGATTATAAA AATTACCTAA TGTAACTTAT TGAAAAAGAA AATGATAACT 180
TTTTCAACGA TT 192
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 61 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 91 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGPORM: Einzelstrang
(D) TOPOUDGIE: linear
(ii) ART DES MCLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 61:
ATGACCAAAA TAAATTAACG TGAGTTTTCG TTCCACTGAG CGTCAGACCC CGTAGAAAAG 60
ATCAAAGGAT GTTCTTGAGA CCTTTTTTTC T 91
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 62:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 62:
NNAAANTNTN GAANTGTANN ANTGNAA 27

Claims

Patentansprüche
1. DNS-Protein-Komplex, welcher zum Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung geeignet ist, erhältlich durch Isolierung einer Mitochondrienfreien Fraktion des Zytopiasmas aus transformierten menschlichen oder tierischen Zellen, die eine Dichte von etwa 1,82 - 1,89 g/cm3 aufweist, und Isolierung des Komplexes aus dieser Fraktion durch Extraktion mit Phenol und Fällung mit Ethanol.
2. Protein, welches zum Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung geeignet ist, erhältlich durch Behandlung eines Komplexes gemäß Anspruch 1 mit DNase I und chromatographische Isolierung des dabei freigesetzten Proteins.
3. Protein gemäß Anspruch 2, mit einem Molekulargewicht von 52 kD.
4. Protein gemäß Anspruch 2, mit einem Molekulargewicht von 62 kD.
5. Protein gemäß Anspruch 2, mit einem Molekulargewicht von 64 kD.
6. Antikörper, welcher zum Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung geeignet ist, erhältlich durch Immunisierung von Tieren mit einem DNSProtein-Komplex gemäß Anspruch 1, einem Protein gemäß einem der Ansprüche 2 - 5 oder DNS gemäß den Ansprüchen 7 oder 8.
7. DNS, welche zum Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung geeignet ist, erhältlich durch Klonierung oder enzymatische Vermehrung der DNS eines Komplexes gemäß Anspruch 1.
8. DNS gemäß Anspruch 7, welche eine der in SEQ ID NO 2 - 28 oder SEQ ID NO 30 - 61 gezeigten DNS-Sequenzen enthält oder mit einer dieser Sequenzen hybridisiert.
9. Verfahren zur Gewinnung einer DNS gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8 durch Isolierung eines DNS-ProteinKomplexes gemäß Anspruch 1 aus transformierten menschlichen oder tierischen Zellen und Klonierung oder enzymatische Vermehrung der DNS dieses DNS-ProteinKomplexes.
10. Verfahren zur Gewinnung einer DNS gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8 durch Hybridisierung einer genomischen Genbank oder einer cDNS-Bank von menschlichen oder tierischen Zellen mit einer der in SEQ ID NO 1 61 gezeigten DNS-Sequenzen und Isolierung der hybridisierenden DNS.
11. Verfahren zur Gewinnung einer DNS gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8 durch Bindung der DNS von menschlichen oder tierischen Zellen an ein Protein gemäß einem der Ansprüche 2 - 5 in Gegenwart von Zn- oder NaIonen.
12. Verfahren zur Gewinnung einer DNS gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8 durch enzymatische Vermehrung einer DNS-oder RNS-Fraktion von menschlichen oder tierischen Zellen, wobei Oligonukleotid-Starter Moleküle verwendet werden, die zu Teilen einer -der in SEQ ID NO 1 61 gezeigten Sequenzen oder Teilen davon homolog sind.
13. Verfahren zur Gewinnung einer DNS gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8 durch chemische Synthese einer der in SEQ ID NO 1 - 61 gezeigten DNS-Sequenzen oder von Teilen dieser DNS-Sequenzen.
14. Verfahren zur Gewinnung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Komplex gemäß Anspruch 1 mit DNase I behandelt und die dabei freigesetzten Proteine chromatographisch oder elektrophoretisch nach ihrer Größe auftrennt.
15. Verfahren zum Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung, dadurch gekennzeichnet, daß man Komplexe gemäß Anspruch 1 in einer Mitochondrien-freien Fraktion des Zytoplasmas der Dichte von ca. 1,82 - 1,89 g/cm3 bestimmt.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Antikörper gemäß Anspruch 6 in einer Antigen-Erkennungs-Reaktion einsetzt.
17. Verfahren zum Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder Tumorbildung durch Hybrididsierung einer DNS-Fraktion der zu untersuchenden Zellen mit einer DNS gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8.
18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hybridisierung als in situ Hybridisierung durchführt.
19. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß aus einem Lysat der Zellen oder einer DNS- oder RNS-Fraktion dieser Zellen eine Nukleinsäure enzymatisch vermehrt wird unter Verwendung von Oligonukleotiden, die mit einer DNS gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8 hybridisieren.
20. Anwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 15 - 19 zum Nachweis maligner Tumoren , wobei die Zellen einer Biopsie, eines Gewebeschnitts oder Zellen oder sezernierte Komplexe aus Körperflüssigkeiten von Menschen oder Tieren als Probenmaterial eingesetzt werden.
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