明 細 書 ヒ トイ ンタ一ロイキン 6 レセプターに対するアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体を含む発現阻害剤 技術分野
本発明は、 ヒ トイ ンターロイキン一 6 レセプター (ヒ ト IL- 6R)の 発現を阻害する医薬と して有用なァンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド 誘導体に関する。
背景技術
ヒ トイ ンターロイキン— 6 (ヒ ト IL- 6) は B細胞の抗体産生細胞 への最終段階の分化を誘導する因子と してクローニングされたサイ トカイ ンであり (Kishimoto T ら、 Blood 74, 1-10, 1989) 、 現在で は肝臓における急性期蛋白の誘導などさまざまな作用を持つことが 知られている (Kishimoto T ら、 Blood 74, 1-10, 1989) 。
またヒ ト IL- 6はリ ンパ系細胞のみにかぎらず、 線維芽細胞、 血管 内皮細胞、 膀胱癌細胞株 T 24ゃグリオブラス トーマなどにおいても 産生されていることが報告され (Kohase M. ら、 J. Cell Physiol. 132, 271-278, 1978; Meir EV ら、 Cancer Res.50, 6683- 6688, 1990) 、 さ らにその標的細胞も多種類にわたっている (Kishimoto T ら、
Blood 74, 1-10, 1989) 。
近年 Kawano Mらにより ヒ ト IL-6が骨髄腫細胞では autocrine growth factorと して機能していることが報告され (Kawano Mら、 Nature, 332, 83-85, 1988) 、 さ らに腎細胞癌においても同様のこ とが報告さ れた (Miki Sら、 FEBS Letter 250, 607-610, 1989) 。
一方、 ヒ ト IL- 6による細胞の増殖あるいは分化のシグナルは細胞
表面に存在する ヒ ト IL- 6R 及び糖蛋白質 gpl30 を介して細胞に伝達 されるこ とが知られている。 (Taga T. ら、 Cell 58, 573- 581, 1989 Hibi Mら、 Cell 68, 1149-1157, 1990) 。
近年、 病態の原因となっている遺伝子の働きを抑制する方法と し て、 DNA から転写された mRNAに相捕的なォリ ゴヌ ク レオチ ド (ァン チセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド) を用いて、 該蛋白質の発現を抑制す ることが提案されている (村上、 化学、 46巻、 681-684 頁、 1991) c さ らには、 アンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ドの寿命、 安定性、 細 胞への取り込み効率などの問題点を解消する方法と してヌ ク レオチ ドのリ ン酸基の酸素をメ チル基に置換したメ チルホスホネ一 ト型誘 導体やィォゥに置換したホスホロチォエー ト型誘導体などの修飾ァ ンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ドが知られており (村上、 前述) 、 実 際これらのアンチセンスヌ ク レオチ ドがウィルスの蛋白質合成を阻 害することが認められている (Agris, H. ら、 Biochemistry, 25, 6268-6275, 1986) 。
このような考えをもとに Levy Yらは、 ヒ ト IL- 6の mRNAの翻訳をァ ンチセンスオ リ ゴヌ ク レオチ ドによ って阻害する こ とによ り、 ヒ ト IL- 6を増殖因子と している骨髄腫細胞株の増殖が抑制されることを 確認した (Lovy Yら、 J. Clin. Invest. , 88, 696-699, 1991) 。
しかしながら、 ヒ ト IL- 6R を発現する種々の細胞において IL-6R の発現を有意に抑制するようなアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘 導体については知られていない。 発明の開示
従って本発明は、 ヒ ト IL- 6R の発現を阻害するア ンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体を提供しよう とするものである。
さ らに詳しく は、 本発明は、 ヒ ト IL- 6R をコー ドする] nRNAの翻訳
開始コ ドンを含む少なく と も 9個の連続する塩基配列に対するアン チセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体を含んで成る ヒ ト IL- 6R の発現 阻害剤を提供する。 図面の簡単な説明
図 1 は実験例における本発明のアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド 誘導体が可溶性 IL-6R の発現を抑制するこ とを示すグラフである。 発明を実施するための具体的な形態
本発明者はヒ ト IL- 6R をコー ドする mRNAの翻訳開始コ ドンを含む 少なく と も 9個の連続する塩基配列に対するァンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体を合成し、 ヒ ト腎細胞癌とと もに培養したところ 癌の増殖を抑制することを見い出した。
本発明の好ま しい態様においては、 ヒ ト IL- 6R をコ一 ドする mRNA の翻訳開始コ ドンを含む 9〜30個、 より好ま し く は 12〜25個の連続 する塩基配列に対するアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体を用 いる
こ こでいう 「アンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド」 とは、 DNA 又は mRNAの所定の領域を構成するヌ ク レオチ ドに対応するヌ ク レオチ ド がすべて相補的であるもののみならず、 DNA 又は mRNAとオリ ゴヌ ク レオチ ドとが安定にハイブリ ダィズできる限り、 多少の ミ スマッチ が存在してもよい。
ヒ ト IL- 6R の翻訳開始コ ドンおよびその近傍の塩基配列は次の通 りである (例えば特開平 2 — 288, 898 号公報参照)(配列番号 : 1 ) 。
1 -1
5 ' CTGTCCGCCTCTGCGGGACCATGGAGTGGTAGCCGAGGAGGAAGC
ATG CTG GCC GTC GGC TGC GCG CTG CTG GCT GCC CTG CTG GCC GCG 3 Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala
従って、 本発明のアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体の塩基 配列は、 第 1 ア ミ ノ酸 Me t のコ ドンの ATG を含みその 5 ' 側および 3 ' 側の連続する塩基配列から適宜選択てきる ものである。
本発明の 1 つの態様によれば、 発現阻害オリ ゴヌ ク レオチ ドは、 配列番号 : 1 における開始コ ドン ATG とその下流の配列とから成る 塩基配列に対するアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ドであり、 例えば 第 1 位の Me t から第 5位の G l y までをコー ドするコ ドンの塩基配列 に相補的なヌ ク レオチ ド配列、 すなわち、 5 ' GCCGACGGCCAGCAT 一 3 ' (配列番号 : 2 ) を有するものである。
本発明の好ま しい態様によれば、 発現阻害オリ ゴヌ ク レオチ ドは. 配列番号 : 1 における開始コ ドンとその上流の配列とから成る塩基 配列に対するアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ドである。 この様なォ リ ゴヌ ク レオチ ドの 1 例と して、 開始コ ドン ATG とその上流の 17個 の塩基とに対して相補的な塩基配列、 すなわち 5 ' - CATGCTTCCTCC TCGGCTAC - 3 ' (配列番号 : 3 ) を有するものが挙げられる。 また, 他の 1 例と して、 開始コ ドンとその上流の 12個の塩基とに対して相 捕的な塩基配列、 すなわち 5 ' - CATGCTTCCTCCTCG 一 3 ' (配列番 号 : 4 ) を有する ものが挙げられる。
本発明の他の好ま しい態様によれば、 発現阻害オ リ ゴヌ ク レオチ ドは、 配列番号 : 1 における開始コ ドン並びにその上流及び下流の 配列から成る塩基配列に対するアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ドで ある。 この様なォリ ゴヌ ク レオチ ドの 1 例と して、 開始コ ドン並び にその上流の 11個の塩基及び下流の 6個の塩基から成る塩基配列に 対して相補的な塩基配列、 すなわち 5 ' - GGCCAGCATGCTTCCTCCTC - 3 ' (配列番号 : 5 ) を有するものが挙げられる。
本発明において使用されるオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体がデォキシ リ ボヌ ク レオチ ドの場合それぞれの構造は、 構造式 1 に示したとお
りであるが、 Xは独立して、 ィォゥ ( S ) 、 低級アルキル基あるい は一級ア ミ ンまたは二級ァ ミ ンのいずれでもい。 Yは独立して酸素 ( 0 ) あるいはィォゥ ( S ) のいずれでもよい。 Bはアデニン、 グ ァニン、 チ ミ ン、 あるいはシ ト シ ンのいずれかから選ばれ、 主と し てヒ ト Iい 6レセプターをコー ドする DNA 又は mRNAの相捕的ォリ ゴヌ ク レオチ ドである。 Rは独立して水素またはジメ トキシ ト リ チル基 あるいは低級アルキル基である。 nは 7 — 28である。
好ま しいオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体と しては例えば前述のメチル ホスホネ一 ト型又はェチルホスホネ一 ト型のような低級アルキルホ スホネー ト修飾体、 その他ホスホロチォエー ト修飾体あるいはホス ホロア ミ デ一 ト修飾体等が挙げられる (後記構造式 2 を参照のこ と) 構造式 1
ROCH
X
メ チノレホスホネー ト
OOPII
C
H Y
の
例 OO oP o P OOPII——II
一一
ホスホ ロチォエ ー ト S o o S
ホ ロ ホ ロ ジチォエ ー ト S
0
ホスホ ロ ア ミ デー ト N - P = 0
0
0
リ ン酸 ト リ エステル CH30- P = 0
0 構造式 1 の X及び Yが 0であ るォ リ ゴヌ ク レオチ ドは市販の DNA 仓成装置 (例えば Applied B i osys tems社製な ど) によ っ て容易に合
成される。
合成法はホスホロァ ミ ダイ 卜を用いた固相合成法、 ハイ ドロジェ ンホスホネー トを用いた固相合成法などで得ることができる。
例えば、 T. Atkinson, M. Smi th, in Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach, ed. M. J. Gai t, IRL Press, 35-81 (1984); M. H.
Car ut hers, Science, 230, 281 (1985) ;A. Kume, M. Fuji i, M. Sekine, .
Hat a, J. Org. C em., 49, 2139(1984) ;B. C. Froehler, M. atteucci,
Teterahedron Lett. , 27, 469(1986) ;P. J. Gar egg, I. Lindh, T. Regberg, J. Stawinski, R. Stromberg, C. Henrichson, ibid. , 27, 4051(1986);
B. S. Sproat, M. J. Gai t, in Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach, ed. M. J. Gai t. IRL Press, 83-115(1984) ; S. L. Beaucage and M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. , 22, 1859-1862(1981) ;M. D.
Matteucci and M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. , 21, 719-722
(1980); M. D. Matteucci and M. H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc. , 103, 3185-3191(1981) を参照のこと。
Xが低級アルコキシ基である リ ン酸 ト リエステル修飾体は、 常法、 例えば化学合成で得られたォリ ゴヌ ク レオチ ドを ト シルク ロ リ ドの DMF//メ タノールノ 2, 6 —ルチジン溶液で処理することにより得 ることができる (Moody H. . , etal. , ucleic Acids Res. , 17, 4769- 4782(1989)) 。
Xがアルキル基であるアルキルホスホネー ト修飾体は、 常法、 例 えばホスホア ミ ダイ トを用いて得ることができる (M. A. Dorman, et. al. , Tetrahedron, 40, 95-102(1984) ;Κ. L. Agar al and F. Rif tina, Nucleic Acids Res. , 6, 3009-3024(1979)) 0
Xが Sであるホスホロチォエート修飾体は、 常法、 例えばィォゥ を用いた固相合成法 (C. A. Stein, et. al. , Nucleic Acids Res.,16, 3209- 3221(1988))あるいはテ トラェチルチウラム ジスルフィ ドを
用いて、 固相合成法により得ることができる (H. Vu and B. L.
Hirschbein, Tetrahedron Letters, 32, 3005-3008(1991))。
X , Yがと もに Sであるホスホロ ジチォエー ト修飾体は、 例えば ビスア ミ ダイ トをチォア ミ ダイ 卜に変換しィォゥを作用させるこ と により固相合成法により得ることができる (W. K. -D. Brill, et. al., J. Am. Chem. So , 111, 2321 - 2322(1989)) 。
Xがー級ァ ミ ンあるいは二級ァ ミ ンであるホスホロア ミ デー ト修 飾体は、 例えばハイ ドロジヱ ンホスホネー トを一級あるいは二級ァ ミ ンで処理することにより固相合成法で得ることができる (B.
Froehler, et. al. Nucleic Acids Res., 16, 4831-4839(1988)) 。 ある いは、 ア ミ ダイ トを tert—ブチルハイ ドロパーォキサイ ドで酸化し ても得ることができる (H. Ozaki, et. al., Tetrahedron Lett. , 30, 5899-5902(1989))。
精製および純度確認は、 高速液体ク ロマ トグラフィ ー、 ポ リ アク リルア ミ ドゲル電気泳動で行う ことができる。 分子量の確認は、 Electrospray Ionization Mass Spectrometry 又は Fast Atom Bonbardment-Mass Spectrometry で行う こと力くできる。
本発明のァンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体はヒ ト IL- 6R を コー ドする DNA 又は mRNAの塩基配列にハイブリ ダィズする配列を有 するものであれば、 その合成法や由来はいずれでもよい。
本発明のァンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体は、 ヒ ト IL- 6R の産生細胞に作用 して、 ヒ ト IL-6R をコー ドする DNA 又は mRNAに結 合することにより、 その転写又は翻訳を阻害し、 ヒ ト IL- 6R の発現 を抑制することによって結果的にヒ ト IL- 6の作用を抑制する効果を 有する。 本発明のアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体により抑 制される ヒ ト IL-6の作用と しては、 血小板増多作用、 抗体産生増強 作用、 急性期蛋白誘導作用、 腫瘍細胞増殖作用、 神経細胞分化作用
等が挙げられる。
従って、 これらの作用に起因する疾患、 例えば腎癌、 ミ エローマ レンネル ト T リ ンパ腫、 力ポジ肉腫などの癌、 慢性関節リ ウマチ等 の自己免疫疾患、 メサンギゥム増殖性腎炎、 乾癬、 癌性悪液質、 感 染症におけるエン ド トキシ ンシ ョ ッ ク等の治療において本発明のァ ンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体は有効であると考えられる。 本発明のァンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体は、 それらに対 して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、 パップ剤などの外用剤 とすることができる。 また、 必要に応じて、 賦形剤、 等張化剤、 溶 解補助剤、 安定化剤、 防腐剤、 無痛化剤等を加えて錠剤、 散剤、 顆 粒剤、 カプセル剤、 リボソームカプセル剤、 注射剤、 液剤、 点鼻剤 など、 さ らに凍結乾燥剤とすることができる。 これらは常法に従つ て調製することができる。
本発明のアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体は患者の患部に 直接適用するか、 または血管内に投与するなどして結果的に患部に 到達し得るように患者に適応させる。 さ らに持続性、 膜透過性を高 めるア ンチセンス封入素材を用いることもできる。 例えば、 リ ポゾ ーム、 ポ リ 一 L — リ ジン、 リ ピッ ド、 コ レステロール、 リ ボフェク チン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のァンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体の投与量は、 患 者の状態に応じて適宜調整し好ま しい量を用いることができる。 例 えば、 0. 1〜100 mg Z kg好ま しく は 0. l〜50mg Z kgの範囲で投与す ることができる。
以下本発明を実施例において詳しく説明する。
実施例
合成例 1
5 ' -GCCGACGGCCAGCAT - 3 ' (配列番号 : 2 ) の合成
ヒ ト IL- 6R アンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ドと してヒ ト IL- 6レセプ ター mRNAの開始コ ドンよりの 5 コ ドンに相補的な 15ヌ ク レオチ ド
(GCCGACGGCCAGCAT) (配列番号 : 2 ) を、 DNA 合成装置 (Gene Assembler Plus, Pharmacia社製) で合成した。
合成例 2
5 ' -GCCGACGGCCAGCAT - 3 ' (配列番号 : 2 ) (ホスホロチォェ 一ト修飾体) の合成
3 ' 一水酸基が支持体に結合した 5 ' —ジメ トキシ ト リ チルチ ミ ジ ン ( 1 zmol)のジメ トキシ ト リチル基を ト リ クロ口酢酸によつて脱 保護し、 その 5 ' —水酸基に 5 ' —ジメ トキシ ト リチルデォキシァ デノ シン ^—シァノエチルホスホア ミ ダイ ト誘導体をテ トラゾー ルにより縮合し、 テ トラェチルチウラム ジスルフィ ドによってリ ンをィォゥ化した後、 未反応の 5 ' —水酸基を無水酢酸とジメ チル ァ ミ ノ ピリ ジンでァセチル化する。
同様に脱保護、 縮合、 ィォゥ化、 ァセチル化を繰り返す。 最後の 5 ' ージメ トキシ ト リ チルデォキシグアノ シン β— シ了ノ エチル ホスホア ミ ダイ ト誘導体を縮合し、 ィォゥ化して得られた 15— mer のホスホロチォエー ト修飾体 (以上までの工程は Applied Biosystems 社製 381A型 DNA 合成装置により行った) 。 を濃アンモニア水 2 mlに よって支持体から切り出すと共に、 リ ンからシァノエチル基をはず し、 さ らにアデニン、 グァニン、 シ ト シンに付いている保護基をは ずす。
得られた 5 ' —ジメ トキシ ト リ チルオリ ゴヌ ク レオチ ドホスホロ チォエー トは未精製のまま、 または高速液体クロマ トグラフィ ーに
より精製した後、 ト リ フルォロ酢酸 5 mlによって 5 ' —ジメ トキシ 保護基をはずす。 得られたオリ ゴヌク レオチ ドホスホロチォエー ト を必要があれば高速液体ク口マ トグラフィ一で精製し、 目的の 5 ' -GCCGACGGCCAGCAT - 3 ' (配列番号 : 2 )(ホスホロチォエー ト修 飾体) 約 2.09mgを得る。
合成例 3
5 ' - GCGCAGCCGACGGCCAGCAT- 3 ' (配列番号 : 6 ) (ホスホロチ ォエー ト修飾体) の合成
合成例 2 と同様にして、 目的の 5 ' -GCGCAGCCGACGGCCAGCAT- 3 '
(配列番号 : 6 ) (ホスホロチォエー ト修飾体) 約 1.81mgを得る。 合成例 4
5 ' -CATGCTTCCTCCTCGGCTAC- 3 ' (配列番号 : 3 ) (ホスホロチ ォエー ト修飾体) の合成
合成例 2 と同様にして、 目的の 5 ' -CATGCTTCCTCCTCGGCTAC- 3 '
(配列番号 : 3 ) (ホスホロチォエー ト修飾体) 約 1.96mgを得る。 合成例 5
5 ' - CATGCTTCCTCCTCG - 3 ' (配列番号 : 4 ) (ホスホロチォェ 一ト修飾体) の合成
合成例 2 と同様にして、 目的の 5 ' -CATGCTTCCTCCTCG - 3 ' (配 列番号 : 4 ) (ホスホロチォエー ト修飾体) 約 1.91mgを得る。
合成例 6
5 ' -GGCCAGCATGCTTCCTCCTC- 3 ' (配列番号 : 5 ) (ホスホロチ ォェ— ト修飾体) の合成
合成例 2 と同様にして、 目的の 5 ' -GGCCAGCATGCTTCCTCCTC- 3 '
(配列番号 : 5 ) (ホスホロチォエー ト修飾体) 約 1.08mgを得る。 実験例 1. ヒ ト可溶性 IL- 6R の発現抑制効果
ヒ ト IL- 6R 遺伝子 (特開平 2 - 288,898 号第 2図及び第 3図参照)
から Nco I フラグメ ン トを作製し、 それに TAG リ ンカ一 (CATGTAGA GATCT)を付加し、 CH0 発現ベクター pdR (文献名 : M. Hasegawa, Eur. J. Biochem., 210, 9-12 (1992))に挿入し、 可溶性 Iレ 6R 発現べク 夕一 (pRNDRl) を構築した。
pRNDRlを dhfr — · CH0 細胞にリ ン酸カルシウム法により導入し、 MTX にて増幅した。 最終的に 1 M MTX耐性可溶性 IL- 6R 産生 CH0 細胞(CH0 · RN1)を得た。 この pRNDRlには配列番号 1 の翻訳開始コ ド ン ATG の上流 (5 ' 側) 一 26番目から始まる可溶性 IL- 6R 遺伝子が 含まれている。
細胞の培養は 1 %FCS (ベーリ ンガーマンハイム社製) 及び 1 M MTX を含む IMDM培地 (GIBC0 社製) で行った。
96穴の培養プレー ト上で CH0 · RN1 培養液 75/z (6.6x 104 個 Z mi) に 10〃 Mのヒ ト IL- 6R 了ンチセンスォリ ゴヌク レオチ ド 75〃 £ を加え、 37°C、 5 %C02 イ ンキユ ーベータ一で培養した。
24時間培養後、 その培養上清の可溶性 IL-6R 量をマウス抗 IL- 6R モノ ク ローナル抗体 (MT-18) (特開平 2 — 288, 898 号参照) 及びゥ サギ抗 IL- 6R ポリ クローナル抗体を用いたサン ドィ ッチ ELISA 法に よつて測定した。
なお、 対照 (コン トロール) と しては上記培養液のみをまた比較 例と して合成例 1 で得られたォリ ゴヌク レオチ ドを用いて測定した。
ヒ ト IL- 6R のアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体は可溶性 IL-6R の発現抑制効果を示した (図 1 ) 。 産業上の利用可能性
本発明のヒ ト IL-6の発現阻害剤は、 ヒ トインターロイキン 6の作 用を抑制するため医薬として有望である。
配列表
配列番号 : 1
配列の長さ : 90
配列の型 : 核酸
鎖の数 : 一本鎖
配列の種類 :
配列
CTGTCCGCCT CTGCGGGACC ATGGAGTGGT AGCCGAGGAG GAAGC ATG CTG
Met Leu 1
GCC GTC GGC TGC GCG CTG CTG GCT GCC CTG CTG GCC GCG
Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala
5 10 15 配列番号 : 2
配列の長さ : 15
配列の型 : 核酸
鎖の数 : 一本鎖
配列の種類 : 合成 DNA
配列
GCCGACGGCC AGCAT 15 配列番号 : 3
配列の長さ : 20
配列の型 : 核酸
鎖の数 : 一本鎖
配列の種類 :
配列
CATGCTTCCT CCTCGGCTAC 20
配列番号 : 4
配列の長さ : 15
配列の型 : 核酸
鎖の数 : 一本鎖
配列の種類 : 合成 DNA
配列
CATGCTTCCT CCTCG 15 配列番号 : 5
配列の長さ : 20
配列の型 : 核酸
鎖の数 : 一本鎖
配列の種類 :
配列
GGCCAGCATG CTTCCTCCTC 20 配列番号 : 6
配列の長さ : 20
配列の型 : 核酸
鎖の数 : 一本鎖
配列の種類 : 合成 DNA
配列
GCGCAGCCGA CGGCCAGCAT 20