WO1994018566A1

WO1994018566A1 - Method of assaying specific antibody

Info

Publication number: WO1994018566A1
Application number: PCT/JP1993/000143
Authority: WO
Inventors: Satoshi Tanaka
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited
Priority date: 1993-02-04
Filing date: 1993-02-04
Publication date: 1994-08-18
Also published as: US5639627A; EP0683396A1

Description

明細書

特異的抗体測定法

「技術分野」

本発明は、ある抗原に対して特異的な抗体を高感度に測定する方法に関する。

「背景技術」

抗体の定量に関しては、免疫学的検定法の原理による様々な方法がすでに報告されている。主な手法として、凝集法、競合法、サンドイッチ法等が挙げられる力 \ 感度という観点では、サンドイッチ法の原理に基づく測定法が最も高感度であることは周知の通りである。

特異的抗体のサンドィツチ測定法としては、例えば抗原結合担体を測定すべき抗体を含む被検波と接触させ、次いでこの担体に標識結合抗 I g抗体（二次抗体）を反応させ、担体に結合した標識量から抗体含量を測定する方法がある。しかしながら、この方法は、被検液中に大量に含有される非特異的抗体が担体に吸着するためバックグランドが高くなり、検出感度の向上が困難であるという欠点を有している。

また、担体に抗 I g抗体を結合させ、被検液と接触後、測定すべき抗体に特異的な（標識）抗原を反応させる方法がある。この方法の欠点は、担体上への目的抗体の結合が、被検液中に大量に含有される非特異的抗体によって妨げられるため、十分な信号（シグナル）量が得られない点であり、上記の方法と同様に高感度化は困難である。

その他の方法として、抗原結合担体を被検液と接触後、標識結合抗原を反応させる方法がある。この方法の欠点は、担体に結合した抗体に対する標識結合抗原の反応性が低いため、短時間では十分な信号量が得られない点であり、この方法もまた高感度測定は困難である。

一方、抗体を高感度かつ簡便に測定する方法として、近年、標識結合抗原とハプテン結合抗原を被検液中の目的抗体と液相で反応させ、生じた複合体を抗ハプテン抗体で担体上にトラップして測定する方法が報告されている〔石川ら、アナリティカル · レターズ（Analytical Letters), 第 21巻、第 2033頁、（1988) 〕、〔トーマス ·ガイガーら、特許 DE 3705686 明細書〕。この方法によって、高感度測定が期待されるが、アツセィコンポーネントが複雑な上、被検液中に測定すべき抗体が比較的多量に存在した場合、却って測定値が低くなる現象（プロゾーン現象）が起こるという欠点がある。

「発明の開示 J

本発明の課題は、従来のサンドィツチ測定法と同程度の簡便な操作性を有し、高感度でかつプロゾーン現象を生じない特異的抗体測定法を開発することである c 本発明者は、担体結合抗原および標識結合抗原と、測定すべき特異的抗体を含む被検液とを同時に混合することによって、前記両抗原と前記特異的抗体とを反応させる反応系において、担体結合抗原 -特異的抗体 -標識結合抗原の複合体を形成させ、前記反応系から反応後の前記担体を分離した後、分離された前記担体と前記標識結合抗原とを再度混合することによって、プロゾーン現象が解消され、目的の特異的抗体を高感度に測定できることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は下記の（A：) 、（B ) および（C ) 工程を含む特異的抗体測定法である。

工程（A ) ：予め標識を結合させた、測定すべき特異的抗体に対する抗原（標識結合抗原）および予め担体を結合させた、前記特異的抗体に対する抗原（担体結合抗原）と、前記特異的抗体を含む被検液とが混合された第 1反応系中にて、標識結合抗原 -特異的抗体一担体結合抗原なる複合体を形成する工程、

工程（B ) ：前記第 1反応系から反応後の前記担体を分離した後、分離された前記担体と前記標識結合抗原とを混合して第 2反応系を得る工程、

工程（C ) ：前記第 2反応系から反応後の前記担体を分離した後、分離された前記担体に結合する標識量を測定する工程。

「図面の簡単な説明」

図 1は、実施例 1〜2および比較例 1〜3における抗サイログロプリン抗体の検量曲線を示したものである。横軸は検体中の抗サイログロプリン抗体の濃度、縦軸は各固相に結合したペルォキダーゼの活性に由来するシグナル量を示す。図 2は、実施例 3〜 4および比較例 4における抗サイログロブリン抗体の検量曲線を示したものである。横軸は検体中の抗サイログロブリン抗体の濃度、縦軸は各固相に結合した ;5— D—ガラクトシダーゼの活性に由来するシグナル量を示す。 ―'

「発明の詳細な説明」

本発明について工程順に説明する。

工程（A ) について

工程（A) は、簡便な方法で感度を向上させるためのステップである。このェ程（A) において、第 1反応系に加える標識結合抗原の量は、標識結合抗原が液相中で被検液中の特異的抗体と反応する速度と、担体結合抗原が特異的抗体と反応ずる速度とが、ほぼ等しくなるように設定されるのが望ましい。通常の免疫学的測定の場合では、標識結合抗原と担体結合抗原との分子モル比が 1 ： 1〜 1 _: 5 0の範囲が挙げられ、好ましくは 1 ： 2 0〜 1 ： 5の範囲である。

本発明でいう抗原とは、測定すべき特異的抗体と抗原抗体反応を生じうる特異抗原、抗ィディオタイブ抗体あるいは適当なキヤリア一に結合したハプテンのような成分をいう。

被検液としては、例えば血清、血漿、髄液、唾液、尿等の体液、緩衝液等が挙げられる。

本発明でいう測定すべき特異的抗体は、その抗体により特異的に認識される抗原を用いれば実質上、従来の免疫学的測定法で測定し得る全ての抗体であり、本発明によれば、かかる特異的抗体を測定することが可能である。例を挙げれば、核酸を用いた抗 D N A抗体の測定、免疫凝集体を用いたリウマトイド因子の測定、ピルビン酸デヒドロゲナ一ゼを用いた抗ミトコンドリア抗体の測定、甲状腺ペルォキシダーゼを用いた抗ミクロゾーム抗体の測定、サイログロプリンを用いた抗サイログロプリン抗体の測定、 T S Hレセプターを用いた抗 T S Hレセプター抗体の測定、インスリンを用いた抗ィンスリン抗体の測定、アセチルコリンレセプターを用いた抗ァセチルコリンレセプター抗体等自己抗体の測定やウィルス抗原を用いた抗 H B V抗体、抗 H I V抗体など抗ウィルス抗体の測定、その他微生物に対する抗体の測定、インターフヱロンゃヒト成長ホルモンなどの蛋白製剤に対する抗体の測定、アレルギー疾患におけるアレルゲンに対する抗体の測定等が挙げられる。

予め標識を結合させた標識結合抗原における標識としては、免疫学的測定にお' いて測定に利用されるいずれの物質でもよく、酵素、放射性物質、発光物質、蛍光物質、金属化合物等が挙げられる。例えば、酵素ではペルォキシダ一ゼ、 — D—ガラクトシダ一ゼ、アルカリホスファターゼ等が、放射性物質としてはヨウ素、水素等が、蛍光物質としてはフルォレセインイッチオシァネート等が、発光物質としてはアタリジゥ厶塩等が、金属化合物としてはユーロピウム（E u ^{3 +}) 等が挙げられる。

抗原に上記標識を結合させる方法としては、従来免疫学的測定法において抗体、抗原に標識を結合するために報告されているいずれの結合方法をも用いることができる。標識が酵素であれば、適当な多価架撟剤を介入して共有結合させる方法が好ましい。架橋反応には、ァミノ基とアルデヒド基（シッフ反応）、ァミノ基と活性エステル、チオール基とマレイミド基およびチオール基とピリジル · ジスルフィド基等の反応を利用することが、抗原や酵素の活性を損なうおそれがなく有利である。これらの反応はすべて、 p H 6〜9の範囲の緩衝液中にて、 4〜37 て、数分〜数日の範囲でインキュベートすることにより達成される。また、標識が放射性物質の場合は、例えば分子内にチロシン残基をもつ抗原であれば、クロラミン Tのような酸化剤の存在で〔 ^{1 2 5} I〕ヨウ化ナトリゥムと 0〜10°C、数分〜数十分の範囲で反応させることにより ^{1 2 5} Iが導入される。

これらの標識は、（A) 、 ( B ) および（C ) の工程で行われる抗原抗体反応に影響を及ばさない適当なスぺ一サ一を介在させて抗原に結合させてもよい。抗原が低分子量である場合には、特にこの様なスぺ一サ一の介在が好ましい。スぺーサ一としては、例えば非特異ゥサギ I g G、ゥシ血清アルブミン、デキストランもしくは適当な長さを有する炭化水素（炭素数 4〜 1 0個）等が挙げられる。担体は、本発明の目的を損なわない限り特に制限はなく、従来の免疫学的測定法において使用されているものを使用すれば十分である。例えば、ポリスチレン、ポリアクリル、テフロン、紙、ガラス、ァガロース等が挙げられる。また、その形状にも特に制限はない。

担体への抗原の結合は、免疫学的測定における担体作成のための公知の方法で行うことができる。一般には比較的分子量の大きい蛋白質などの抗原の場合は、担体と抗原の間に働く疎水性相互作用を利用した物理的吸着法が用いられる。通常は、抗原を数十〜数百 mgZ ^の範囲の濃度で含む緩衝液（p H 7〜p H 9. 5の範囲）に、担体を 4〜3 7 、数時間〜数日の範囲で浸漬すればよい。また、担体との疎水性相互作用の小さい物質には、予めァミノ基ゃカルボキシル基のような官能基が導入された担体に、グルタルアルデヒドなどの架橋剤を介して共有結合させる方法、あるいは適当なモノマーと混合させた後、 y線などで重合して固定化する方法等がある。抗原が低分子量の場合、これら結合は（A ) から（C ) の工程に影響を及ばさないスぺーサーを介在させて担体に結合させる。スぺーサ一としては、非特異的ゥサギ I g G、ゥシ血清アルブミン、デキストラン、あるいはハプテンと抗体、ピオチンとアビジンなどが挙げられる。

工程（A) において、被検液中の特異抗体と標識結合抗体と担体結合抗原とを混合させて第 1反応系を得た後、この第 1反応系中にて、標識結合抗原一特異的抗体一担体結合抗原なる複合体を形成させる反応は、通常の抗原抗体反応に採用される条件下に行われる。一般には、 0〜4 5 °C、数時間〜数 1 0時間の範囲、好ましくは 2 0 ^eC〜3 7。C、 1〜6時間の範囲で複合体が形成される。

工程（B ) について

工程（B ) は、プロゾーン現象を解消するために設けられたステップである。即ち、（A：) 、（C ) の工程のみでは、もし被検液中の測定すべき特異的抗体の量が、担体に結合した抗原がトラップできる抗体の量に比し過剰に存在している場合、この過剰量の特異的抗体は、担体結合抗原に結合せずに標識結合抗原に結合し、標識結合抗原一特異的抗体の不完全な複合体を形成する。したがって、過剰な特異的抗体によって、完全な複合体を形成するために必要な標識結合抗原が消費され、標識結合抗原は、担体結合抗原に結合した特異的抗体量に比し不足するため、特異的抗体一担体結合抗原なる不完全な複合体が部分的に形成されることがある。その結果として、担体結合抗原に結合した抗体の量についての測定値は、実際に結合した抗体量に対応する測定値よりも低い値になる（プロゾーン現象）。そこで本工程によって、被検液中の過剰量の抗体により消費された標識結合抗原が補われ、特異的抗体 -担体結合抗原なる不完全な複合体に標識結合抗原が結合され、標識結合抗原 -特異的抗体 -担体結合抗原なる完全な複合体が形成されるため、プロゾーン現象による信号値の低下を補正することが可能となる。前記第 1反応系から反応後の前記担体を分離する方法、即ち工程（A ) 終了後の第 1反応系において、標識結合抗原 -特異的抗体の不完全な複合体、未反応の特異的抗体および未反応の標識結合抗原と、標識結合抗原 -特異的抗体 -担体結合抗原なる完全な複合体、特異的抗体 -担体結合抗原なる不完全な複合体および未反応の担体結合抗原とを分離する方法としては、従来から担体を用いた免疫学的測定法にて採用されるいずれの方法でもよい。

次に、前記第 1反応系から分離された担体と標識結合抗原とを再び混合して第 2反応系を得る。第 1反応系から分離された担体として特異的抗体一担体結合抗原なる不完全な複合体が存在する場合に、この不完全な複合体に標識結合抗原を確実に結合させるためには、標識結合抗原を混合する前に、第 1反応系から分離された担体を洗浄するのが好ましい。洗浄はサンドィツチ法で通常用いられる条件で行えばよい。一般には、 T w e e n 2 0のような穏やかな界面活性剤を含む溶液と第 1反応系から分離された担体とを一定時間接触させた後、前記溶液と担体とを分離するという工程を数回繰り返すことにより達成される。

工程（B ) における標識結合抗原の混合量は特に規定されないが、過剰量の混合は、分離後の担体への標識結合抗原の非特異的結合を増加させ、バックグランドを上昇させて感度の低下をもたらすため、反応を完了させるに必要かつ十分な量を用いるのが好ましい。通常、工程（A) において用いた標識結合抗原の量の 1 0分の 1から等量の範囲である。

第 2反応系中における標識結合抗原と担体に結合した不完全な複合体（担体結合抗原一特異的抗体）との反応は、通常の抗原抗体反応にて採用される条件下に行われる。一般には、 0〜45°C、数十分〜数時間の範囲、好ましくは 20〜37°C、 3 0分〜 2時間の範囲で完全な複合体（標識結合抗原 -特異的抗体 -担体結合抗原）が形成される。

工程（C ) について

工程（C ) において、前記第 2反応系から反応後の担体を分離する方法および分離後の担体を洗浄する方法としては、工程（B ) と同様に、従来から担体を用いた免疫学的測定法で採用されるいずれの方法でもよい。洗浄は、反応系に洗浄液を加え、数分間放置した後に洗浄液を除去するのが好ましい。担体に結合した標識の量を測定するには、（A ) の工程で記した抗原に導入させた標識物の特有の性質に基づいて、放射線検出、蛍光検出、吸光度検出、分光検出、原子吸光分析などの手法により達成される。

放射線を測定する場合には、 7カウンタ一や液体シンチレーシヨンカウンターを用いて、数十秒〜数分間の範囲で測定を行えばよい。酵素を標識として使用した場合には、この酵素の作用を受けて前記のような手法によって、検出可能なシグナルを発する基質を添加した後に検出操作を実施すればよい。例えば酵素が西洋ヮサビペルォキシダーゼであれば、 H₂0₂と 0-フヱニレンジァミン（吸光度検出） H₂0₂と 0 -ヒドロキシフユニルプロピオン酸（蛍光検出）等が基質として例示できる。酵素が例えば yg— D—ガラクトシダ一ゼであれば、 -ニトロフエ二ルー^ー D—ガラクトピラノシド（吸光度検出）、 4—メチルゥンべリフエリルー一 D 一ガラクト一ス（蛍光検出）等が基質として例示できる。例えば、酵素がアル力リフォスファターゼであれば、 -ニトロフヱニルフォスフヱ一ト（吸光度検出）、 4ーメチルゥンベリフヱリルフォスフヱ一ト（蛍光検出）等が基質として例示できる。これらの反応は 2 0〜3 7 °C、数分〜数時間の範囲で達成される。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例 1

〔サイログロプリンの精製〕

ヒトーサイログロブリン（U C Bバイオプロダクツ社、ベルギー） 1 O mgを D E— 5 2セルロース（ヮットマン社、ゲント州、イギリス）カラムを用いる方法

〔大滝ら、ジャーナル ·ォブ · クリニカル 'エンドクリノロジー 'アンド ' メタボライト（J. C I i n. En d o c r i n o l . Me t a b. ) 第 5 2巻、第

2 3 9頁（ 1 9 8 1 ) 〕にて精製した。

更に上述の精製サイログロプリン 7, Omgをゥサギ（抗ヒト I gG 7鎖） I gG" 固定化セファロース 4 Bカラム（1.0 X 4.5 cm) を用いて、 0. 1 Mリン酸ナトリゥム緩衝液、 PH7.0で溶出した。次いで、ウルトロゲル A c A 2 2 (LKB、ストックホルム、スウェーデン）（ 1.6 X 4 5cm) を用いて、同緩衝液でゲル濾過を行った。精製の純度は、 SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した。サイログロプリンの濃度は、 2 8 0 nmの吸光度から吸光係数 1.0 £/g - cmとして ¾<：めァこ。

〔サイログロブリン—ペルォキシダーゼ（標識結合抗原）の調製〕

1. メルカプトサクシ二ルーサイログロブリンの調製

精製サイ口グロブリンに S—ァセチルメルカプトサクシ二ック ·ァンハイドライドを用いる公知の方法〔石川ら、ジャーナル 'ォブ ' ィムノアッセィ（J. I mmu n o a s s a y) . 第 4巻、第 2 0 9頁（ 1 9 8 3) 〕によりチオール基を導入した。サイログロプリン 1分子あたり導入されたチオール基の数は 3.8 個であった。

2. マレイミドーペルォキシダーゼの調製

W-サクシ二ミジル一 6—マレイミドへキサノエートを用いる公知の方法〔橋田ら、ジャーナル ·ォブ ·アプライド ·バイオケミストリ（J. Appl. Biochem. )、第 6巻、第 5 6頁（ 1 9 8 4 ) 〕により、西洋ヮサビ ·ペルォキシダーゼにマレイミド基を導入した。導入されたマレイミド基の数は、ペルォキシダーゼ 1分子あたり 1.3個であった。

3. サイログロブリン—ペルォキシダ一ゼの調製

メルカプトサクシ二ルーサイログロプリン 3 1 0 >u gを溶解した 5mM ED TAを含む 0. 1 Mリン酸ナトリゥム緩衝液、 pH6.0、 7 0 ^とマレイミド— ペルォキシダーゼ 9 3〃 gを溶解した 5mM 50丁八を含む0. 1 Mリン酸ナトリウム緩衝液、 pH6.0、 5〃とを 4°Cにて 2 0時間反応させた。反応液は、ウルトロゲル A c A 2 2カラム（1.6 x 4 5 cm) を用いて、 0. 1 Mリン酸ナトリゥム緩衝液、 pH6.5によりゲル濾過を行った。サイログロブリン 1分子当たり導入されたペルォキシダーゼの数は 1.7個であった。

〔サイログロブリン結合固相（担体結合抗原）の調製〕 ―' 精製サイログロプリン溶液（0.0 1 g/β) を用いてマイクロプレート〔3 3 mm² X 1 1.3腿、マキシソープ F 8 (ヌンク社、デンマーク）〕の各ゥエル表面上に公知の方法〔石川ら、スカンジナビヤン · ジャーナル ·ォブ ·ィ厶ノロジー

(S c a n d. J. I mmu n o l . ) 、第 8巻（補 7) 、第 4 3頁（1978) 〕にて、物理的吸着によりサイログロプリンをプレートに結合させた。

〔ヒト抗サイログロプリン抗体の測定〕

予め抗サイログロプリン抗体濃度が定量されたバセドウ病患者の血清を健常者の血清で種々の濃度に希釈した検体 0.0 と、サイログロブリン一ペルォキシダ一ゼ 1 0 0 ί m 0 し 0.5 5 M塩化ナトリウム、 0.1 %ゥシ血淸了ルブミンぉよび 0.1 5 %Twe e n 20を含む 0.0 1 Mリン酸ナトリゥム緩衝液 p H 7.0、 0.1 とをサイログロブリン結合プレート（固相）の各ゥエル内に添加し、室温で 2時間静置して反応させた。各ゥヱルを 0.1 M塩化ナトリゥ厶および 0. 1 %T we e η20を含む 0.0 1 Μリン酸ナトリウム緩衝液、 pH7.0、にて 3回洗浄した後、サイログロブリン—ペルォキシダーゼ 5 0 ί m 0 】、 0.1 M塩化ナトリゥ厶、 0.1 %ゥシ血清アルブミンおよび 0.1 %Twe e n 2 0を含む 0.0 1 Mリン酸ナトリウム緩衝液、 p H 7.0、 0.1 5 を添加した後、室温で 1時間静置して反応させた。各ゥエルを上記洗浄液で 3回洗浄した後、以下のようにしてプレートに結合したペルォキシダーゼ活性を測定した。

〔ペルォキシダーゼ活性の測定〕

各ゥヱルに基質溶液（0.0 1 7%過酸化水素、 0.6mgZ 0-フヱニレンジァミンを含む 0.0 5Mリン酸 ' クェン酸ナトリウ厶緩衝液、 pH4.8) を 150 u ί 加え、室温で 3 0分静置した後、 5 0 の 2Ν硫酸を各ゥルに添加して反応を停止した。各ゥエル中の反応液の 4 9 2 nmの吸光度を測定することによって、複合体を形成するペルォキシダーゼの活性を求めた。その結果を図 1に示す。以下に本発明の比較例として、担体結合抗原と標識結合抗 I g抗体とで目的の特異的抗体をサンドイッチする従来の測定法（比較例 1 ) と、.担体結合抗原と標識結合抗原とで 2ステップにて目的の特異的抗体をサンドィツチする従来の測定法（比較例 2) とを示す。

比較例 1

サイログロプリンの精製、サイログロプリン結合固相の調製およびペルォキシダーゼ活性の測定は、実施例 1の方法に従った。

〔ヒト抗サイログロプリン抗体の測定〕

予め抗サイログロプリン抗体濃度が定量されたバセドウ病患者の血清を健常者の血清で種々の濃度に希釈した検体 0.0 5 と、 0.5 5 M塩化ナトリウム、 0.1 %ゥシ血清アルブミンおよび 0.1 5 %Twe e n 2 0を含む 0.0 1 Mリン酸ナトリウム緩衝液、 pH7.0、 0. lm とを、サイログロブリン結合プレート（固相）の各ゥエル内に添加し、室温で 2時間静置して反応させた。各ゥエルを 0.1 M塩化ナトリゥムおよび 0.1 %Twe e n 20を含む 0.0 1 Mリン酸ナトリウム緩衝液、 pH7.0、 0.37 ^にて 3回洗浄した後、ペルォキシダーゼ標識ァフィ二ティ精製ャギ抗ヒト I gG (カッペル社、メリーランド州） 7.5 n g、 0.1 M塩化ナトリゥム、 0.1 %ゥシ血清アルブミンおよび 0.1 %Twe e n 2 0を含む 0· 0 1 Μリン酸ナトリウム緩衝液、 ρΗ7.0、 0.1 5 を添加し、室温で 2時間静置して反応させた。各ゥュルを上記洗浄液で 3回洗浄した後、固相に結合したペルォキシダーゼ活性を測定した。その結果を図 1に示す。

比較例 2

サイログロブリンの精製、サイログロブリン—ペルォキシダーゼの調製、サイログロブリン結合固相の調製およびペルォキシダ一ゼ活性の測定は実施例 1の方法に従った。

〔ヒト抗サイログロプリン抗体の測定〕

予め抗サイログロプリン抗体濃度が定量されたバセドウ病患者の血清を、健常者の血清で種々の濃度に希釈した検体 0.0 と、 0.55Μ塩化ナトリウム、 0.1 %ゥシ血清アルブミンおよび 0.1 5 %Twe e n 20を含む 0.0 1 Mリン酸ナトリウム緩衝液、 ρΗ7.0、 Ο. ΐττ^とを、サイログロブリン結合プレート（固相）の各ゥル内に添加し、室温で 2時間静置して反応させた。各ゥエルを 0. 1 M塩化ナトリウムおよび 0. 1 %Twe e n 2 0を含む 0.0 1 Mリン酸ナトリウム緩衝液、 pH7.0で 3回洗浄した。各ゥエルにサイログロブリン—ペルォキシダーゼ一 1 0 0 imo 】、 0. 1 M塩化ナトリ ^ム、 0. 1 %ゥシ血清アルブミンおよび 0. I %Twe e n 2 0を含む 0.0 1 Mリン酸ナトリゥム緩衝液、 p H7.0、 0. 1 mS を添加し、室温で 2時間静置して反応させた。各ゥエルを上記洗浄液で 3回洗浄した後、固相に結合したペルォキシダーゼ活性を測定した。その結果を図 1に示す。

次に、本発明の他の実施例として、他の担体結合抗原を用いた場合の実施例を示す。

実施例 2

サイログロブリンの精製、サイログロブリン—ペルォキシダーゼの調製、ヒト抗サイログロプリン抗体の測定およびペルォキシダーゼ活性の測定は、実施例 1 の方法に従った。

〔ジニト-ロフヱルーサゴログロプリン結合ゥサギ（抗ジ二トフェニルーゥシ血清アルブミン） I gG結合固相（担体結合抗原）の調製〕

1. ゥサギ（抗ジニトロフヱニルーゥシ血清アルブミン） I gG結合固相の調製ゥサギ（抗ジニトロフ二ルーゥシ血清アルブミン）抗血清（生化学工業、東京） 4.2 3 gに 0.7 4 7 gの硫酸ナトリウムを少しずつ加え、室温、 3 0分間攪拌した後、 lO.OOOx gで 1 5分間遠心した。沈殿を 4.0 の 0.0 1 7 5 Mリン酸ナトリウム緩衝液、 pH 6.3に溶解し、同緩衝液で透析した後、 0£_ 5 2セルロース（ヮットマン社、ケント州、イギリス）カラム（1.6 X 8.0 cm) を用いて、塩化ナトリウムの直線濃度勾配による陰イオン交換クロマトグラフィを行った。次いで、この溶液を用いてマイクロプレート〔3 3腿² X 1 1· 3mm、マキシソ一プ F 8 (ヌンク社、デンマーク）〕の各ゥル表面上に公知の方法〔石川ら、スカンジナビヤン ' ジャーナル 'ォブ 'ィ厶ノロジ一（前出）〕にて、物理的吸着によりゥサギ（抗ジニトロフエ二ルーゥシ血清アルブミン） I gGをプレートに結合させた。 2. ジニトロフエニル—サイログロブリンの調製

(1) サクシ二ミジル— 2, 4—ジニトロフエ二ルー £一力ブロン酸の合成

2, 4—ジニトロフエ二ルー ε—カブロン酸（シグマ社、ミズーリ州）と、 W ヒドロキシサクシニミド（和光純薬工業、大阪）とを、ジクロロカルポジイミド (和光純薬工業）を用いて、公知の方法〔F. レビ ' シエーファ（F. 1 e V i s c h a f f e r ) ら、アメリカン ' ジャーナル ·ォブ · トロピカル ' メディスン . アンド ·ハイジーン（Am. J. T r o p. Me d. Hy g. ) 、第 3 2巻、第 3 4 3頁（ 1 9 8 3) 〕によって縮合して、サクシニミジルー 2, 4—ジニト口フエ二ルー £一力ブロン酸を合成した。次いで、シリカゲル（4 0 g) カラムを用い、クロ口ホルムメタノール〔4 0/ 1 (v/v) 〕の系で精製を行った後、 NMR (核磁気共鳴法）および質量スペクトル法によって構造を確認した。

(2) ジニトロフヱニルーサイログロブリンの調製

精製サイログロプリン 0.5mgを溶解した 0.1 Mリン酸ナトリウ厶緩衝液、 pH 7.0、 0.6 に、上記 (1)で調製したサクシ二ミジル一 2, 4—ジニトロフエニル — ε—カブロン酸 6 6 nm ο 1を含む W, W-ジメチルホル厶ァミド 6 0〃 _gを加え、

3 0°C、 3 0分間反応させた。反応後、セフアデックス G— 2 5 (フアルマシア、スウェーデン）カラム（1.0 X 30cm) を用い、 0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液、 pH7.0でゲル濾過を行った。サイログロプリン 1分子当たり導入されたジニトロフヱニル基の数は、 1 1個であった。

ジニトロフヱニル基の定量は、 3 6 0 nmの吸光度から吸光係数 1 74 0 0 Z Μ · cmとして求めた。

3.ジニトロフエ二ルーサイログロプリン結合ゥサギ（抗ジニトロフエニル—ゥシ血清アルブミン） I gG結合固相の調製

上記しにて調製したゥサギ（抗ジニトロフヱニルーゥシ血清アルブミン） I gG結合プレート（固相）に、上記 2. にて調製したジニトロフヱニル—サイログロブリン 5 0 0 f m 0 1を溶解した 0.1 M塩化ナトリウム、 0.1 %ゥシ血清ァルブミンおよび 0.1 %アジ化ナトリゥムを含む 0.0 1 Mリン酸ナトリゥム緩衝液、 pH7.0、 0.1 を添加し、 4°Cで 1 6時間反応させた。反応後、同緩衝液で洗浄し、同緩衝液 0. 3 を添加した状態で保存した。

〔ヒト抗サイログロプリン抗体の測定〕

実施例 1において、担体結合抗原であるサイログロブリン結合プレート（固相）を、ジニトロフヱニルーサイログロブリン結合ゥサギ（抗ジニトロフエ二ルーゥシ血清アルブミン） I g G結合プレート（固相）に変更し、実施例 1 と同様にして、プレートに結合したペルォキシダーゼ活性を測定した。その結果を図 1に示す。

次に、本発明の比較例として、ハブテン結合抗原と標識結合抗原とで目的の特異的抗体をサンドィッチした後、抗ハプテン抗体結合担体にトラッブする従来の測定法（比較例 3 ) を示す。

比較例 3

サイログロプリンの精製、サイログロプリンーペルォキシダーゼの調製およびペルォキシダーゼ活性の測定は実施例 1の方法に従い、ジニトロフヱニルーサイログロブリンの調製およびゥサギ（抗ジニトロフエ二ルーゥシ血清アルブミン） I g G結合固相の調製は実施例 2の方法に従った。

〔ヒト抗サイログロプリン抗体の測定〕

予め抗サイログロプリン抗体濃度が定量されたバセドウ病患者の血清を健常者の血清で種々の濃度に希釈した検体 0. 0 と、サイログロブリン一ペルォキシダーゼ、ジニトロフエ二ルーサイログロブリンともに 100 f m o 0. 5 5 M塩化ナトリウ厶、 0. 1 %ゥシ血清アルブミンおよび 0. 1 5 % T w e e n 2 0を含む 0. 0 1 IV [リン酸ナトリウム緩衝液、 p H 7. 0、 0. とを、抗ジニトロフエニルーゥシ血清アルブミン I g G結合プレート（固相）の各ゥエル内に添加し、室温で 3時間静置して反応させた。各ゥエルを 0. 1 M塩化ナトリゥムおよび 0. 1 % Ύ w e e η 2 0を含む 0. 0 1 Μリン酸ナトリゥム緩衝液、 ρ Η 7. 0、 0. にて 3 回洗浄した後、固相に結合したペルォキシダーゼ活性を測定した。その結果を図 1に示す。

図 1に示される実施例 1〜2および比較例 1〜3の結果から明らかなように、実施例 1によれば、比較例 1に比して約 1 0 0倍、比較例 2に比して約 1 0倍の高感度で目的の特異的抗体を測定でき、また比較例 3で発生したプロブーン現象という問題点を解消することができた。さらに、実施例 2に示されるように、実施例 1 と異なる他の担体結合抗原を用いた場合であっても、上記効果を奏することが確認された。

以下に、上記実施例 1および 2において、他の標識結合抗原を用いた場合の実施例を実施例 3および 4として示す。

実施例 3

サイログロプリンの精製、サイログロプリン結合固相の調製およびヒト抗サイログロブリン抗体の測定は、実施例 1の方法に従った。

〔サイログロプリンー β— Ό—ガラウトシダーゼ（標識結合抗原）の調製〕

1. マレイミド—サイログロブリンの調製

0. 1 Μリン酸ナトリウム緩衝液、 ΡΗ7.0 (2. Ο τηβ) に溶解した精製サイログロブリン（1.0 8mg) に、ジメチルホルムアミドに溶解した 0.5 5mMの W -サクシニミジル一 6—マレイミドへキサノエート（0. を加え、 3 0°Cにて 30分間反応させた。反応後、 5mlV [の EDTAを含む 0.1 Mリン酸ナトリゥム緩衝液、 pH6.0で平衡化したセフアデックス G— 2 5カラム（ 1 X 3 0 cm) を用いてゲル濾過を行い、マレイミド化サイログロブリンを得た。サイログロブリンに導入されたマレイミド基は、 1分子あたり 4個であった。

2. サイログロプリン一 ^一 D—ガラクトシダーゼの調製

5mIV [の EDTAを含む 0. 1 Mリン酸ナトリウム緩衝液、 p H 6.0 (50〃 ^) に溶解したマレイミド化サイログロブリン（0.55mg) に、同緩衝液（85 ^) に溶解した — D—ガラクトシダーゼ（0.45mg) を加え、 4て、 2時間反応させた _c 0. 1 Mの塩化ナトリウム、 0. 1 %ゥシ血清アルブミン、 0. 1 mMの MgC ^ ₂ および 0. 1 %NaN₃ を含む 0.0 1 Mリン酸ナトリゥム緩衝液、 pH7.0で平衡化したウルトロゲル A c A 2 2カラム（1.6 x 7 0 cm) を用いて、反応液のゲル濾過を行い、サイログロプリンー一 D—ガラクトシダ一ゼを得た。導入された /3 —D—ガラクトシダ一ゼは、サイログロプリン 1分子あたり 1個であった。

〔ヒト抗サイログロプリン抗体の測定〕実施例 1において、サイログロブリンーペルォキシダ一ゼをサイログロブリン一^— D—ガラクトシダ一ゼに変更して、以下のようにしてプレートに結合した yS— D—ガラクトシダーゼ活性を測定した。

〔;8— D—ガラクトシダーゼ活性の測定〕

；5— D—ガラクトシダーゼ活性は、 4—メチルゥンベリフエリル 5— D—ガラクトシドを基質として、室温、 3 0分間の反応で測定した〔今川ら、アナルス · クリニカル ·バイオケミストリ（An n. C l i n. B i o c h em. ) 、第 21 巻、第 3 1 0頁（ 1 9 8 4) 〕。蛍光光度は、 1 (T⁸Mの 4ーメチルゥンベリフェロン（4MU) を溶解した 0.1 Mグリシン—Na〇H緩衝液、 pH l 0.3の示す蛍光強度を 1 0 0として補正した。その結果を図 2に示す。

実施例 4

サイログロプリンの精製およびヒト抗サイログロプリン抗体の測定は実施例 1 の方法に従い、ジニトロフヱニル—サイログロプリン結合ゥサギ（抗ジニトロフェニルーゥシ血清アルブミン） I gG結合固相の調製は実施例 2の方法に従い、さらにサイログロブリン一 /5— D—ガラクトシダーゼの調製および8— D—ガラクトシダーゼ活性の測定は実施例 3の方法に従った。

〔ヒト抗サイログロプリン抗体の測定〕

実施例 3において、サイ口グロブリン結合固相をジニトロフヱニルーサイログロブリン結合ゥサギ（抗ジニトロフヱニルーゥシ血清アルブミン） I gG結合固相に変更して、実施例 3と同様にしてプレートに結合した — D—ガラクトシダーゼ活性を測定した。その結果を図 2に示す。

上記比較例 2の測定法において、上記実施例 3および 4と同じ標識結合抗原を用いた場合の比較例を示す。

比較例 4

サイログロプリンの精製およびサイログロプリン結合固相の調製は実施例 1-の方法に従い、サイログロプリン— yS— D—ガラクトシダーゼの調製および yS— D 一ガラクトシダーゼ活性の測定は実施例 3の方法に従った。

〔ヒト抗サイログロプリン抗体の測定〕比較例 2において、サイログロブリンーペルォキシダーゼをサイログロブリン一；5— D—ガラクトシダーゼに変更して、実施例 3と同様にしてプレートに結合した — D—ガラクトシダーゼ活性を測定した。その結果を図 2に示す。

図 2に示される実施例 3〜 4および比較例 4の結果から明らかなように、実施例 1および 2と異なる標識結合抗原を用いた場合であっても、目的の特異的抗体を高感度に測定できることが確認された。

Claims

請求の範囲

1 . 下記の（A )、（B ) および（C ) 工程を含む特異的抗体測定法。

工程（A ) ：予め標識を結合させた、測定すべき特異的抗体に対する抗原（標識結合抗原）および予め担体を結合させた、前記特異的抗体に対する抗原（担体結合抗原）と、前記特異的抗体を含む被検液とが混合された第 1反応系中にて、標識結合抗原一特異的抗体 -担体結合抗原なる複合体を形成する工程、

2 . 工程（A) において、前記標識結合抗原と前記担体結合抗原とのモル比が 1 1〜1 ： 5 0の範囲にあることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の特異的抗体測定法。

3 . 工程（A ) において、前記標識結合抗原と前記担体結合抗原とのモル比が 1 5〜1 ： 2 0の範囲にあることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の特異的抗体測定法。

4 . 工程（A ) において、前記標識結合抗原の標識と抗原との結合が、スぺ一サ一を介していることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の特異的抗体測定法。

5 . 工程（A ) において、前記担体結合抗原の担体と抗原との結合が、スぺーサ一を介していることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の特異的抗体測定法。

6 . 前記スぺーサ一が、ゥシ血清アルブミンであることを特徴とする請求の範囲第 4又は 5項記載の特異的抗体測定法。

7 . 工程（A ) において、標識がペルォキシダ一ゼ又は — D—ガラクトシダ一ゼであることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の特異的抗体測定法。

8 . 工程（B ) において混合する前記標識結合抗原と、工程（A) において混合する前記標識結合抗原とのモル比が 1 ： 1〜1 ： 1 0の範囲にあることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の特異的抗体測定法。

9 . 工程（B ) において、前記第 1反応系から反応後の前記担体を分離した後であって、分離された前記担体と前記標識結合抗原とを混合する前に、分離された前記担体を洗浄することを特徴とする請求の範囲第 1項記載の特異的抗体測定法

1 0 . 前記特異的抗体が、抗サイログロブリン抗体であることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の特異的抗体測定法。