WO1994010312A1 - Gene coding for megakaryocyte potentiator - Google Patents

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WO1994010312A1
WO1994010312A1 PCT/JP1993/001540 JP9301540W WO9410312A1 WO 1994010312 A1 WO1994010312 A1 WO 1994010312A1 JP 9301540 W JP9301540 W JP 9301540W WO 9410312 A1 WO9410312 A1 WO 9410312A1
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PCT/JP1993/001540
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Inventor
Nozomi Yamaguchi
Tetsuo Kojima
Masayoshi Oh-Eda
Kunihiro Hattori
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons

Definitions

  • the present invention relates to genes, and more particularly, to megakaryocyte colonies such as interleukin-3 (IL-3), which acts on megakaryocyte colony-forming units differentiated from pluripotent blood stem cells.
  • Megakaryocyte Potentia tor [Meg-POT] A human-derived megakaryocyte potentiator that promotes the maturation of megakaryocytes in the presence of an active substance.
  • the present invention relates to a gene encoding an active polypeptide, a recombinant vector containing the gene, a transformant using the vector, and a method for producing a megakaryocyte amplification factor using the gene.
  • the gene of the present invention encodes a megakaryocyte amplification factor having an action of amplifying megakaryocyte colony in vitro in the presence of IL-3 in a dose-dependent manner.
  • a megakaryocyte amplification factor having an action of amplifying megakaryocyte colony in vitro in the presence of IL-3 in a dose-dependent manner.
  • Platelets are one of the blood components that have important significance in hemostasis and thrombus formation in living organisms. Platelets become megakaryoblasts from hematopoietic stem cells in the bone marrow via megakaryocyte precursor cells, and are released into the blood from mature megakaryocytes.
  • Meg-CSF which forms megakaryocyte colonies simply by adding it, has no activity to form megakaryocyte colonies by itself, but when added together with Meg-CSF, it increases the number of megakaryocyte colonies or matures them.
  • Meg—P0T which has the effect of promoting
  • IL-13 (Teramura.M et al. ⁇ Exp. Hematol. Ej_6, 843 (1988)) and granulocyte-macrophage colony stimulating factor (Teramura. Et al., “Exp. Hema to 1.” ⁇ , 1011 (1989)).
  • M eg arsenide Bok - P 0 is assumed to have a T activity
  • interleukin 6 (Teram ura.M and Mizoguchi.H "IiU.J.Cel l CloningJ i L 245 (1990 ))
  • Lee Interleukin 11 (Teramura'M et al. "Blood” 79, 327 (1992)), erythropoietin and runo.E et al. "Blood” 73, 671 (1989)) are known.
  • the present inventors have found megakaryocyte amplification activity in the culture supernatant of a cell line “HPC-Y5” derived from a human cancer cell, and identified megakaryocyte amplification from the culture supernatant.
  • a novel megakaryocyte amplification factor was purified using its activity as an index, and its properties were clarified (International application number: PCT / JP92 / 019689, International publication number: WO93) ⁇ 1 3 1 3 2).
  • oligonucleotide primers were synthesized based on the amino acid sequence information, and from the cDN ⁇ library prepared from mRN N prepared from “HPC — ⁇ 5”, using the above-described synthetic primer, DNA fragment encoding megakaryocyte amplification factor was obtained by polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR). Next, using the DNA fragment as a probe, the cDNA library was screened, and the gene encoding the novel novel megakaryocyte amplification factor was successfully isolated. The entire nucleotide sequence was revealed.
  • the transformant transformed with the expression vector is cultured, and then the target protein produced is separated and purified to obtain novel megakaryocyte amplification. It also revealed that the factor can be manufactured in large quantities. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a gene encoding a polypeptide having human megakaryocyte amplification factor activity.
  • the present invention further provides a recombinant vector containing a gene encoding a polypeptide having human megakaryocyte amplification factor activity.
  • the present invention also provides a prokaryotic or eukaryotic host cell transformed with a recombinant vector containing a gene encoding a polypeptide having human megakaryocyte amplification factor activity.
  • the present invention further comprises culturing a transformant obtained by transformation with a recombinant vector containing a gene encoding a polypeptide having human megakaryocyte amplification factor activity, and producing the target protein, preferably human.
  • a method for producing a protein having megakaryocyte amplification factor activity BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 shows the results of reverse phase HPLC (III) of Step-7 in Example 3.
  • Figure 2 shows the structure of the plasmid pKPO27.
  • Figure 3 shows the structure of plasmid PRVHKP027.
  • Figure 4 shows the structure of Brasmid PRVHKP02 7 f.
  • FIG. 5 shows the structure of Brasmid PCITE.KP027.
  • FIG. 6 shows the structure of the plasmid p MB PKP027.
  • Figure 7 shows the structure of the plasmid pEFDKP0f.
  • FIG. 8 shows a diagram of a diaster blot using an antibody prepared by analyzing a culture supernatant expressed using CHO cells by SDS / PAGE using a synthetic peptide near the N-terminal as an antigen.
  • Lane 1 molecular weight marker
  • lane 2 sample.
  • FIG. 9 shows that each purified fraction (see Example 29 (i)) of the culture supernatant expressed using CHO cells was analyzed by SDS / PAGE, and the Meg- FIG. 2 shows a diagram of a Western blot performed using an antibody against POT.
  • Lane 1 molecular weight marker
  • lane 2 pass-through and wash fractions
  • lane 3 0.1 MNa C1 fraction
  • lane 4 0.2M NaC 1 fraction
  • lane 5 0.3M NaC1 fraction
  • lane 6 0.5M NaC1 fraction
  • lane 7 1.0M NaC1 fraction.
  • Example 29 (iii) shows a Western plot of each purified fraction of the culture supernatant expressed using CHO cells (see Example 29 (iii)), which was subjected to SDS / PAGE.
  • Lane 1 elution time 42 to 43 min fraction
  • lane 2 elution time 43 to 44 min fraction
  • lane 3 elution time 44 to 45 min fraction
  • lane 4 Fraction with an elution time of 45 to 46 minutes.
  • FIG. 11 shows the location of the PCR primers performed for construction of the modified Meg-POT expression vector.
  • FIG. 12 shows the structures of the modified Meg- ⁇ 0T expression vectors pEFNKPOS, pEFNKPOL252V and pEFNKP0Q220E. Detailed description of the invention
  • the megakaryocyte amplification factor gene can be obtained, for example, by preparing mRNA from cells producing a megakaryocyte amplification factor or the like, and then converting it to double-stranded cDNA by a known method.
  • the cell serving as the source of mRNA is a cell line “HP C—Y5” derived from human cancer tumor cells (Nozomi Yamaguchi et al. CANCER RESEARC H 7008 1990) [19] 9 1 1 1 2 7 2 7 Deposited by the Institute of Industrial Science and Technology, Microbiological Institute of Technology, as a FERM BP-3703 (FERM BP-3703) using an international deposit based on the Budapest Treaty). Not only tumor cell lines, but also cells that can be isolated from mammals or other established cell lines may be used.
  • preparation of mRNA is performed after guanidine thiosinate treatment.
  • Cesium chloride density gradient centrifugation was performed (Chirgwin et al., Biochemistry jj ⁇ 5294 1979) to obtain total RNA, but the methods already used for cloning genes for other bioactive proteins, such as the vanadium complex A surfactant treatment and a phenol treatment in the presence of a ribonuclease inhibitor (Berger & Birkenmeier, Biochemistry, U5-31979) can be used.
  • poly (A) + RNA For preparation of poly (A) + RNA from total RNA, use a carrier to which oligo (dT) is bound, such as affinity cellulose chromatography using a cepharose cellulose, etc. It can be performed by the method. Further, poly (A) + RNA can be further purified by sucrose density gradient centrifugation or the like. In addition, there is a method to obtain poly (A) + RNA directly without preparing RNA.
  • a carrier to which oligo (dT) is bound such as affinity cellulose chromatography using a cepharose cellulose, etc. It can be performed by the method. Further, poly (A) + RNA can be further purified by sucrose density gradient centrifugation or the like. In addition, there is a method to obtain poly (A) + RNA directly without preparing RNA.
  • cDNA double-stranded cDNA from the mRNA obtained as described above, for example, by making the mRNA a type III, oligo (dT) complementary to the polyA-chain at the 3 'end, random primer, or megakaryocyte A synthetic oligonucleotide corresponding to a part of the amino acid sequence of the sphere amplification factor is treated with reverse transcriptase as a primer to synthesize DNA (cDNA) complementary to mRNA.
  • cDNA DNA complementary to mRNA.
  • the resulting single cDNA is transformed into type ⁇ and treated with reverse transcriptase or DNA polymerase (eg, Kleenow fragment, etc.), and then S 1 nuclease is removed.
  • reverse transcriptase or DNA polymerase eg, Kleenow fragment, etc.
  • Isolation of cDNA encoding a megakaryocyte amplification factor can be performed, for example, by using megakaryocyte amplification activity as an index, or by direct expression cloning using an antibody.
  • the megakaryocyte amplification activity can be measured by applying a soft agar culture method using bone marrow cells in the presence of IL-3.
  • poma serum (treated at 56 ° C for 30 minutes, manufactured by Biocell) 0.2 ml, mouse (C57B LZ6 N male, 6 to 12 weeks old) Femur bone marrow cell suspension 0. 1 ml (2 X 1 0 5 nucleated cells), recombinant murine IL- 3 5 DgZml containing Iscove's modified Du lbecco 's culture (I MDM) 0.
  • the agar layer was taken out on a slide glass and dried, and a film-like specimen was fixed with 5% glutaraldehyde, and the method of Nakeif et al. (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 151 According to 587 1976), the cells are stained with acetylcholinesterase and the number of megakaryocyte colonies is calculated. At this time, a clump containing four or more cells positive for acetylcholinesterase staining is defined as a megakaryocyte colony. The speculum magnification is 40 times.
  • Meg-POT activity was determined by the number of megakaryocyte colonies generated by adding the test sample and the number of megakaryocyte colonies without adding the test sample (only I MDM containing 10% serum serum was added). -3 The difference from the number of megakaryocyte colonies generated alone is used as an index.
  • the present inventors isolated and purified a megakaryocyte amplification factor from a culture supernatant of a cell line that produces a megakaryocyte amplification factor, synthesized a primer based on the amino acid sequence information, and performed PCR. Using this, a gene fragment encoding a polypeptide having a human-derived megakaryocyte amplification activity was cloned. Using the DNA as a probe, a clone containing a full-length cDNA encoding a novel megakaryocyte amplification factor of interest was screened from the cDNA library by a known method.
  • E. coli JM109 strains were sent to the Institute of Microbial Industry and Technology of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) on October 12, 1992, respectively. -40 29), deposited on January 10, 1992 under the Budapest Treaty as FERM BP-4071 (FERM BP-4071).
  • a full-length cDNA can be obtained by repeating the PCR used in the present invention.
  • a probe can be synthesized from amino acid sequence information without using PCR, and the cDNA library can be directly screened to obtain a desired cDNA.
  • the gene encoding the cloned megakaryocyte amplification factor can be transformed into other prokaryotic or eukaryotic host cells by incorporating it into the appropriate vector DNA. . Furthermore, by introducing an appropriate promoter and a sequence relating to expression into these vectors, the gene can be expressed in each host cell.
  • a gene encoding another polypeptide is linked to the gene of interest and expressed as a fusion protein to facilitate purification or to increase the expression level, and to perform appropriate treatment in the purification process. Thus, it is also possible to cut out the target protein.
  • it is possible to try to enhance megakaryocyte amplification activity by using a gene to be ligated from another bioactive factor and keeping the fusion protein.
  • eukaryotic genes are considered to exhibit polymorphism, as is known as the human interferon gene (for example, Nishi et al., J. Biochem. 97 153 198 85).
  • One or more amino acids may be replaced by this polymorphism, or the amino acid may not change at all despite changes in the base sequence.
  • polypeptides substituted with acids may also have megakaryocyte amplification activity.
  • boriveptide obtained by converting a base sequence corresponding to cystine of the human interleukin 2 (IL-2) gene to a sequence corresponding to serine retains IL-12 activity. (Wang et al., Science, 224 1431 1984).
  • the obtained polypeptide has megakaryocyte proliferative activity, and a gene that hybridizes with a gene encoding a polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 or 13 is also disclosed. Included in the invention.
  • the hybridization conditions are as follows: Ordinary probe hybridization conditions can also be applied.
  • Example _ is Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Coldspring Habor Laboratory Press, 1989) 0
  • the expression vector of the present invention contains an origin of replication, a selection marker, a promoter located before the gene to be expressed, an RNA splice site, a polyadenylation signal, and the like.
  • promoters for gene expression in mammalian cells include viral promoters such as retrovirus, poliovirus, adenovirus, simian virus 40 (SV40), lipopeptides, chains, and elongations.
  • viral promoters such as retrovirus, poliovirus, adenovirus, simian virus 40 (SV40), lipopeptides, chains, and elongations.
  • a cell-derived promoter such as Factor 1 (HE F-la) may be used.
  • HE F-la Factor 1
  • the promoter of SV40 it can be easily carried out according to the method of Mulligan (Nature 277 108 (1979)).
  • replication origin those derived from SV40, poliovirus, adenovirus, bovine papillomavirus (BPV) and the like can be used.
  • phosphotransferase APH can be used. (3 ') II or I (neo) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthine-guanine phosphoribosyl transfunylase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (DHFR) gene, etc. it can.
  • a prokaryotic host cell for example, Escherichia coli
  • pBR322 is a vector using it as a host
  • pBR322 contains genes for ampicillin and tetracycline resistance, and transformed cells can be identified by utilizing either of these resistances.
  • the promoters required for gene expression in prokaryotic hosts include the /?-Lactamase gene promoter (Chang et al .: Nature 275 615 (1978)) and the peroxidase promoter (Goeddel et al .: Nature 281 544).
  • prokaryotic host cells include, for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis, and Bacillus subtilis. Bacillus t hermo phli 1 us and the like.
  • host cells for eukaryotic microorganisms include, for example, Saccharomyces cerevisia_e
  • host cells derived from P mammals include, for example, C 0 S Cell, Chinese hamster ovary (CH0) cell, C127 cell, 3T3 cell, Hela cell, BHK cell, Nabarba cell and the like.
  • the transformant of the present invention may be cultured by appropriately selecting culture conditions suitable for the host cell.
  • the transformant transformed with the gene encoding the megakaryocyte amplification factor of interest as described above is cultured, and the produced megakaryocyte amplification factor is separated from the inside or outside of the cell and purified to homogeneity. be able to.
  • the separation and purification of the human megakaryocyte amplification factor which is the target protein of the present invention, may be performed by a separation and purification method used for ordinary proteins, and is not limited at all.
  • human megakaryocyte amplification factor can be separated and purified by appropriately selecting and combining various chromatographies, ultrafiltration, salting, dialysis and the like.
  • the production method will be described in detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited by these examples.
  • Tumors obtained from the lymph nodes of a liver cancer patient were treated with a carbon dioxide gas cuvetter (5% carbon dioxide, humidity 10%) using RPMI 164 medium containing 10% fetal serum (FBS). (100%).
  • FBS fetal serum
  • This cell line was adapted to Ham's F10 medium containing 1% FBS, and the FBS concentration was gradually reduced until the cells could be grown in Ham's F10 medium containing no protein. .
  • This cell line grew in a monolayer on a plastic dish and the doubling time was about 33 hours (No zomi Yamaguchi et al. CANCER RESEARCH 50 7008 1990). This cell line is called HPC-Y5 cells.
  • Example 2 Subculture of HPC- ⁇ 5 and mass culture by roller bottle The subculture of HPC-Y5 cells described in Example 1 was performed as described below. Bra Suchi' click cultured off La score (1 5 0 cm 2, Co ruing Co., Ltd.) Yore ,, 1 0- 8 M nitrous Seren'na Application Benefits um, 1 0 0 U / ml Bae Nishiri emission G mosquitoes Li um and 1
  • the HPC-Y5 cells were cultured in 50 ml of Ham's Nutrient Mixture F12 medium containing kanamycin sulfate (0 «g / ml), and the culture medium was replaced every four days.
  • the culture solution was removed at the time of cell passage, and 0.125% tribusin (GIBC 0) preheated to 37 ° C, 0.01% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Calcium- and magnesium-free Dulbecco's Phosphate-puffed saline (PBS) solution was added, and the mixture was heated at 37 ° C for 5 minutes.
  • the cells were detached by a pitting operation, transferred to a plastic centrifuge tube having a volume of 15 ml, and collected by centrifugation at 15 ( ⁇ . Rotation, 5 minutes. The cells were transferred to the above medium.
  • the cells were suspended and subcultured to 4 to 5 new flasks.
  • Tween 20 was added to the culture supernatant (27.3 liters) of HPC- ⁇ 5 cells obtained according to the method described in Example 2 so that the final concentration became 0.01%, and then the artificial kidney was added. It was concentrated about 200-fold using PAN1200 (Asahi Medi Power). The concentrate was dialyzed against 10 mM acetate buffer (pH 5.0) containing 0.01% Tween 20 at 4 ° C. The dialysis solution was centrifuged (I 000 xg, 60 minutes) to remove insolubles, and the supernatant was used for the following purification.
  • Step-1 S—Sepharose—Ion Exchange Chromatography Add the above centrifuged supernatant to an S-Sepharose Fast Flow CPh armacia column (510 cm) equilibrated with 20 l ⁇ acetate buffer (pH 5.0) containing 0.01% Tween 20. did. After washing the column with the same buffer, the adsorbed protein was eluted by sequentially increasing the concentration of NaCl in the same buffer to 0 to 15M, 0.5M and 1.0M.
  • Step-2 The activity was measured according to the method described above for the flow-through fraction, the washed fraction, and the eluted fraction at each salt concentration, and as a result, Meg-POT activity was observed in the 0.15M-NaC1 eluted fraction. .
  • Step-2 The active fraction obtained in DEAE-Sepharose ion exchange chromatography step-1 was added to a 10 mM Tris-hydrochloride buffer containing 0.0 l% Tween 20 (PH7. 4) was dialyzed at 4 ° C.
  • step-2 To the active fraction obtained in step-2, 5% trifluoroacetic acid (TFA) was added to adjust the pH to about 2, and the reverse was equilibrated with 5% acetate nitrile containing 0.1% TFA.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the solution was applied to a phase HPLC column (Protein C4, 10 x 250 mm, manufactured by Vydac) at a flow rate of 1.0 ml / min.
  • the adsorbed protein was eluted with a linear concentration gradient of acetonitrile (5% -65%, 120 minutes, 0.5% acetonitrile // min) at a flow rate of 1. OmlZ.
  • Detection of the eluted protein was performed by following the absorbance at 220 nm and 280 ⁇ , and fractionation was performed in 1 ml portions. The activity of each fraction was measured. As a result, Meg-POT activity was observed in the fraction having an acetonitrile concentration of 40 to 45%.
  • the active fraction obtained in Step-3 was diluted 2-fold with 0.1% TFA, and then equilibrated with 35% acetonitrile containing 0.1% TFA.
  • X250 mm, manufactured by Vydac at a flow rate of 1. OmlZ.
  • the adsorbed protein was eluted at a flow rate of 1. OmlZ with a linear concentration gradient of acetonitrile (355%, 75 minutes, 0.2% acetonitril). Detection of eluted protein is 2 20 And by following the absorbance at 280 nra and fractionating 1 ml each. As a result of measuring the activity of each fraction, Meg-POT activity was observed in the fraction having an acetate nitrile concentration of 40 to 45%.
  • the active fraction obtained in Step 5 was TSK equilibrated with 50 ml of Tris-HCl buffer (PH7.4) containing 0.01% Tween 20 and 0.15M NaC1. Flow through the column at a flow rate of 3 ml on a ge 1 G3000 SW column (21.5 x 600 nm, Tosoh Ichisha, 21.5 x 75 nm guard column), and detect eluted proteins at 22 Onm did . The activity of each fraction fractionated by 3 ml was measured. As a result, Meg-POT activity was observed in the fraction with an elution time of 49 to 54 minutes, and the fraction was collected.
  • Tris-HCl buffer PH7.4
  • the active fraction obtained in Step-6 was adjusted to a pH of about 2 by adding 5% TFA, and chromatographed under the same conditions as the reversed-phase HPLC (II) of Step-4. .
  • Meg-POT activity was observed in the main peak (acetonitrile concentration: 40% to 45%). The result is shown in FIG.
  • the fraction shown by the horizontal bar in FIG. 1 was collected as purified Meg-POT.
  • the purified Meg-P0T sample obtained in Example 3 was subjected to Edman degradation using a gas-phase protein sequencer type 470A (manufactured by Applied Biosystems) to obtain a sample.
  • Phenylthiohydantoin (PTH) amino acids were identified using a PTH Analyzer-120 (Applied Biosystems). As a result, the amino acid near the N-terminus The following three sequences (sequences-1 to 3) were observed.
  • the elution of the peptide was carried out in 0.1% TFA by increasing the concentration of acetonitrile from 0 to 64% in 128 minutes and then to 80% in 16 minutes. .
  • the peptides were detected at two wavelengths, 220 and 280 ⁇ .
  • the amino acid sequence of the obtained partially digested peptide fragments was sequentially analyzed using a gas-phase protein sequencer type 1473A (manufactured by Applied Biosystems).
  • RNA was prepared from HPC-Y5 cells according to the method described by Chirgwin et al. (Biochemistry, 18 5294 (1979)). That is, about 1 X 1 0 9 amino H (: -. ⁇ 5 cells 4 91111 3 1 2 5 RAM Kuen Sanna Application Benefits um and 0.6 25% La ⁇ Rirusarukoshin'na Application Benefits ⁇ beam
  • the homogenate was completely homogenized in a solution containing 5 M guanidine thiocinate (Full Co., Ltd.) and placed on a 5.3 M cesium chloride solution layer containing 0.1 MEDTA in a centrifuge tube. Then, RNA was precipitated by centrifuging this in a SW40 rotor (manufactured by Beckman) at 31,100 rpm at 20 for 17 hours.
  • RNA precipitate was washed with 80% ethanol, and 1 OmM Tris-HCl buffer (H7.5) containing 1 mM EDTA and 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS). 2. After dissolving in 4 ml, pronase (manufactured by Boehringer Mannheim) was added to a concentration of 0.5 mg Zml, and the mixture was kept at 37 ° C for 20 minutes. Protein was removed by subjecting the RNA solution to phenol treatment. After the residual phenol in the solution was extracted with chloroform, the RNA was precipitated with ethanol.
  • Olig poly (A) + RNA from total RNA. (DT) A cellulose spun column was purified using an mRNA Separator (manufactured by Clontech 1 aboratories). Kit Purification was increased twice by repeating purification according to the attached prescription.
  • Double-stranded cDNA was synthesized using E (manufactured by Clontech laboratories), and an Ec0RI linker was attached to the end. Free Ec0RI linkers were separated by agarose gel electrophoresis, and cDNAs with a length of more than 600 base pairs were recovered by electroelution using Geneluter (Invitrogen). .
  • This linker-added double-strand cDNA and DNA ZAPII vector (Satagene), which had been treated with Ec0RI and ALRI phosphatase (Takara Shuzo) in advance, were mixed with 7 mM magnesium chloride, In 50 mM Tris-HCl buffer (PH7.5) containing 1 mM DTT, 1 mM ATP and 2 units of T4D ⁇ ligase (Takara Shuzo) at 4 ° C. Incubated for hours and ligated.
  • the primers T7 and T3 near the EcoRI site of ZAP II, the primers T7 and T3-2, the primers near the motor and the partial amino acid near the N-terminus of this factor The sequence Gly-Glu-Thr-Gly-Gin-Glu-Ala is mixed with a primer N1 containing all possible codons as a gene that encodes 381 A DNA Synthesizer (Applied Biosy (stems).
  • N 1 5 '-GG (GATC) GA (GA) AC (GATC) GG (GATC) CA (GA) GA (GA) GC-3'
  • K 4-2 A 5 '-GC (GA) TC C (GATC) AG or (TC) AA] (AG) TC (TC) TC (GATC) GG
  • the protein was removed by treating the DNA solution with fininol. After the residual phenol in the solution was extracted with chloroform, DNA was precipitated with ethanol.
  • Vector PSP73 Promega treated with the restriction enzymes SmaI (Takara Shuzo) and ALRI phosphatase (Takara Shuzo) and this DNA sample were treated with 7 mM magnesium chloride and ImM. Incubate at 16 ° C for 16 hours in 5 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing DTT, 1 mM ATP and 2 units of T 4 DN ⁇ ligase (Takara Shuzo). Connected.
  • coli transformants were obtained. Five clones among the appearing transformants were cultured at 37 ° C. for 16 hours in 5 ml of LB medium containing 50 ⁇ g of ampicillin at 50 ° C. for 16 hours. Plasmid DNA was prepared in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Each inserted nucleotide sequence was determined by dideoxy 'sequencing method using Sequenase Version 2.0 (manufactured by United States Biochemica 1). As shown in SEQ ID NO: 6, primers K4S and K4 -The sequence of 40 base pairs flanked by 2A was revealed.
  • sense 'primer 7D-1S 5'-CTCTCAACAGAGCA GCTGCG-3' and 7D-3S: 5'-CTGGCTCACCGGCTCTCTGA-3 'and antisense' primer 7D-1A: 5′-AGAGCCGGTGAGCCAGACAG-3 ′ and 7D—2A: 5′-GCGCAGCTGCTCTGTTGAGA-3 ′ were synthesized.
  • the first-stage PCR was performed using a combination of T7 and 7D-1S and T3-2 and 7D-1A with the library DNA as ⁇ .
  • the second stage PCR was performed with the combination of primers T7 and 7D-3S and T3-2 and 7D-2A, respectively.
  • the PCR product was analyzed by 1% agarose gel electrophoresis, a gel portion containing the amplified DNA fragment was cut out, and DNA was extracted using Sepliaglas BandPrep Kit (Pharmacia).
  • the nucleotide sequence of these DNAs was determined directly using imol DNA Sequencing System (produced by Promega3 ⁇ 4), and as shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, a part of the gene encoding this factor was confirmed. Was done.
  • sense 'primer 3 AS1 5'-AACTCCTTGGCTTCCC GTGTG-3 'and antisense primer 7 SA 1-5'-CGCATCTGGGTTGAGGAA TAG-3 'were synthesized, and pool D was prepared under the above conditions.
  • PCR was carried out, amplification of a DNA fragment of 197 base pairs (SEQ ID NO: 9) was confirmed.
  • the amino acid sequence encoded by this DNA fragment was the purified Meg-1 POT obtained in Example 3. The amino acid sequence was determined using the above method. This DNA fragment (Q197A) was used as a probe in the following screening.
  • Example 8 Screening using the probe QDNA197A of the cDNA library Using 5 g of the poly (A) + RNA obtained in Example 5 as a material, ZAP—cDNA SYNTHESIS KIT (manufactured by Stratagene) ) To synthesize cDNA for cDNA It was linked to the arm of PII vector-1 (Stratagene). This was packaged using Gigapack Gold II packaging extract (Stratagene) to construct a new cDNA library of HPC-Y5 cells.
  • ZAP—cDNA SYNTHESIS KIT manufactured by Stratagene
  • the 197 bp DNA amplified by the PCR of Example 7 was recovered from the gel after electrophoresis with an acrylamide gel, and this DNA fragment Q197A was random-primed DNA labeling kit (Takara Shuzo) It was labeled with 32 P using a company-made). However, primers 3AS1 and 7SA1 were used at a concentration of 400 nM in place of the attached random primer. Free dNTP was removed by passing through NICK-11111111 and 1133 (manufactured by ⁇ 3). Next, plaque hybridization was performed according to the method of Benton and David (Science 180, 1977).
  • Hybond-N + filter manufactured by Amersham was placed on the agar medium on which phage plaques were formed, and the phage was transferred.
  • the filters were processed in the following order. Contain 1.5 M sodium chloride. Denature DNA with 0.5 N sodium hydroxide aqueous solution for 5 minutes, and contain 1.5 M sodium chloride. 2 minutes with 0.5 M sodium chloride buffer (pH 7.4) containing 1.5 M sodium chloride, followed by 2 XSSCP (2 The cells were treated with 40 mNaCl, 30 mNa3 citrate, 26 mM KH2P04, 2 mM EDTA) for 1 minute.
  • the filter was dried, and then washed with a 0.4 N aqueous solution of sodium hydroxide for 20 minutes using 5 XSSPE (Molecular Cloning: A Laboratory anua 1, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Treated twice for a minute. 50% formamide, 5 XSSPE, 5 Denhardt's So 1 ution (Mo1 ecu 1 ar Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), 0.1% SDS and 0% The cells were incubated at 42 ° C for 4 hours in a prehybridization solution containing 1 mg Znil-denatured DNA (salmon testis DNA, manufactured by Boehringer Mannheim).
  • a hybridization solution containing a Q197A probe labeled as above (50% formamide, 5XSSPE, 5X Denhardt's Solution, 0.1 mg Zml denatured DNA ( ⁇ testis DNA), Hybridization was performed at 42 ° C for 16 hours in 0.1% SDS).
  • the filter is washed twice at room temperature with 2 XSSC containing 0.05% SDS for 1 hour, then at 68 ° C twice for 1 hour with 1 x SSC containing 0.1% SDS, and then at 68 ° C. At 0.1% including SDS 0.2 at 1 at XSSC After washing for a while, detection was performed by autoradiography.
  • nucleotide sequence and the amino acid sequence encoded thereby were examined by GenBank Re 1.71, and it was confirmed that both the nucleotide sequence and the amino acid sequence were novel.
  • Escherichia coli containing plasmid PKP027 was Escherichia coli JM109 (pKP027), and Escherichia coli containing plasmid ⁇ 021 was Escherichia coli JM109 (pKP02l).
  • the Research Institute of Microbial Technology (1-3 1-3, Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) was launched on October 12th, 1992, and was named No. 40-29, No. 209 (F ERM BP-4029). ), And on January 10, 1992, were deposited internationally under the Budapest Treaty as FERM BP-4071 (FERM BP-4071).
  • agarose gel electrophoresis was performed to recover a 1.8 kbp DNA fragment.
  • the vector—HEF—12h—g a1 was treated with the restriction enzymes Ec0RI and BamHI in the same manner as described above, followed by addition of Alfa Rifophosphatase (Takara Shuzo). After dephosphorization by incubating at 65 ° C for 2 hours, agarose gel electrophoresis was performed, and the recovered 8.7 kbp DNA was mixed with the above 1.81 cbp DNA fragment.
  • this plasmid contains the EF1 ⁇ promoter, the human immunoglobulin ⁇ retinal constant region gene, the SV40 enhancer motor, the replication initiation region derived from pBR322, and /?-Lactamama.
  • Ichize gene include EF 1 "promoter and human Bokui beam Roh Guropuri emissions H chain constant region human Bok M eg between genes - some P OT c DNA is connected.
  • the vector HEF-12h-g71 was prepared as follows.
  • the 2.5 kbp HEF-1 promoter-enhancer region which is a component of the vector-HEF-12h-gyi, is composed of approximately 1.5 kb P DNA, which is in contact with the 5'-end of the gene, in the first exon. 33 bp, 943 bp in the first intron, and 10 bp in the first part of the second exon.
  • the 2.5 kbp Hindll—EcoRI fragment was converted to plasmid pEF321—CAT (D. WKim et al., Gene 91, 217 (1990); and T. Uetsuki et al., J. Biol. Chem. 264. 5791 0989)) and the pd KCR vector (M.
  • pTEF-1 was digested with EcoRI, filled in with Klenow polymerase, and ligated to a Hindll linker. Next, a Hind in -Smal fragment of about 1.6 kbp was excised from the modified pTEF-1 vector DNA.
  • h CMV—12 h—gyi (Maeda et al., Hubo Antibodies and Hybridomas 2, 124 (1991); CA Ke 111 eb or ough et al., Protein Engeneering 4, 773 (1991)) was partially digested with EcoRI, filtered with K1en0w polymerase, and self-ligated to obtain HCMV—12h—ga1 to plasmid HC MV—12h. -g 7 1 ( ⁇ ⁇ 2) was prepared.
  • Plasmid HCMV—12h—ga1 ( ⁇ 2) was digested with EcoRI, filled in with K1 enow polymerase, and digested with Hindlll. The approximately 7 kbp fragment containing the DNA sequence encoding the human a-IC region was ligated to the 1.6 kbp Hindlll-SmaI fragment containing the HEF-1 "promoter-enhancer. HEF-1 2 h-g 71. The HEF-l ff promoter-enhancer region in this vector is p TEF — 1 except for the 0 'of 3 8 01 ⁇ , which is adjacent to the 5'-region. It was identical to that in.
  • Example 1 0 C 0 S cells in the megakaryocyte potentiator (M eg - P 0 T) was suspended expressed IC 0 S cellular gene in PBS to a 1 X 1 0 7 or ZML, this cell suspension The solution, 0.8 mip RVHKP 0,271,0 g, was added. Plasmid was introduced into COS cells by electroporation (e1 ecoporati.n) using GenePulsar (manufactured by BioRad) under the conditions of 190 V, 25 / iF, and 0-4 msec.
  • the electroporated cells were added to 25 ml of DuUecco's Minimum Essential Medium (DMEM) (GIBCO) containing 1% fetal serum. added. After culturing for 72 hours, the culture supernatant was collected.
  • DMEM DuUecco's Minimum Essential Medium
  • a part of the culture supernatant of the C0S cell thus obtained was concentrated about 10-fold with Centreprep-10 (manufactured by Amicon) and analyzed by SDSZPAGE.
  • culture supernatants of untreated COS cells and COS cells into which only the vector was introduced were similarly electrophoresed about 10-fold and electrophoresed.
  • the gel concentration was 12%, and the gel was electrophoresed according to the method of Laemmli, Nature, 11], 680 (1970).
  • One of the gels was prepared using 2D-silver staining reagent. The protein was stained.
  • the molecular weight markers were low molecular weight markers manufactured by Biorad (phosphorylase B (92.5 kd), pepsin albumin (66.2 kd), ovalbumin (45.O kd ), Carbonic anhydrase (31. O kd), soybean tribcine inhibitor (21.5 kd), and lysozyme (14.4 kd)].
  • megakaryocyte amplification factor was detected by the Western blot method.
  • the molecular weight markers were Biotin's prestained molecular weight markers-[phosphorylase B (10. 6. Okd), peroxyserum albumin (80.0 kd), ovalbumin ( 49.5 kd), carbonic anhydrase (32.5 kd), soybean trypsin inhibitor (27.5 kd), and lysozyme (18.5 kd)] were used.
  • the primary antibody was a rabbit with an 18-residue peptide synthesized as an antigen based on the N-terminal sequence analysis of megakaryocyte amplification factor purified from the culture supernatant of HP C-Y5. Boliq oral antibody obtained by immunization was used.
  • the band stained by the silver staining method was compared by three individuals, the band with a molecular weight of about 33,000 was found to be the culture supernatant of the C0S cell into which the gene for megakaryocyte amplification factor was introduced.
  • the band with a molecular weight of about 33,000 strongly developed color in the Western blotting method, indicating that this band was a recombinant megakaryocyte amplification factor.
  • Example 1 Measurement of megakaryocyte amplifying factor (Meg_P0T) activity in culture supernatant of C0S cells I
  • the megakaryocyte amplification factor activity of the culture supernatant of the C0S cells obtained in Example 10 was measured according to the method described above. However, since it is known that IL-6 is induced in the culture supernatant by stimulating the introduction of genes into C0S cells, the measurement was performed using a system to which an antibody against mouse IL-6 receptor was added. went.
  • the culture supernatant of untreated C0S cells into which no gene was introduced was also used as a control C0S transfected with a vector containing no Meg-P0T cDNA.
  • the culture supernatant of S cells also did not show megakaryocyte amplification factor activity, but the culture supernatant of COS cells transfected with a vector containing Meg-POT cDNA clearly showed megakaryocyte amplification factor activity.
  • COS cell megakaryocyte amplifying factor activity a) Culture supernatant concentration (%) 5 0 0.5 0 5 0 No treatment C 0 S 1.5 3 ND b control COS 0 2.5 ND
  • the band having a molecular weight of about 33,000 found in Example 10 was found to have a NaC1 concentration of 0.1 M in the first half. Detect only part was issued. This fraction was collected and subjected to subsequent purification by reverse phase HPLC.
  • the obtained peak was analyzed by SD SZPAGE, and as a result, a band having a molecular weight of about 33,000 was observed at an acetonitrile concentration of about 41%. After diluting this fraction with 0.1% T.FA, reverse phase HPLC was performed again under the same conditions, and the main peak was collected.
  • Example 1 Analysis of Amino Acid Sequence of Recombinant Megakaryocyte Amplification Factor (Meg-POT)
  • the recombinant Meg-POT obtained in Example 12 was subjected to gas-phase broncin-quantification.
  • Example 4 Pro-Pro-Xaa-Ile-Ser-Xaa-Leu-Xaa-Pro-Arg-Gln-Leu- Of these, (b) and (c) are HP C—Y5 fine particles in Example 4 (i). These correspond to polypeptide sequence 1 (SEQ ID NO: 1) and sequence 3 (SEQ ID NO: 3) from the culture supernatant of the vesicles, respectively.
  • Ethanoate as an Lumpur precipitate was recovered the DNA, then 1 OmM M g C 1 2, 1 mM DTT, 1 0 OmM N a C 1 5 0 mM Application Benefits scan HCl buffer containing (PH7. 5) Medium Treatment with a restriction enzyme Sa1I (manufactured by Toyobo) at 37 ° C for 2 hours, addition of alkaline phosphatase (manufactured by Takara Shuzo), and release at 65 ° C for 2 hours Then, a 8.5 Kbp DNA fragment was recovered by agarose gel electrophoresis. The 8.5 1 of DNA fragments in the previous Kbp. After mixing the DN A fragment 3Kbp, 6.
  • PR VHK P027f was derived from the EF1 promoter, the human immunoglobulin H constant region gene, the SV40 enhancer motor, and pBR322. replication origin region and /? - comprises lactamase gene (Am p r), human Bok M eg- P OT c DNA is connected between the EF 1 "promoter one and human Toimuno grayed Roburi emissions H chain constant region gene .
  • Example 1 Expression of megakaryocyte amplification gene (Meg-P0T) gene in C0S cells
  • a portion of the culture supernatant of the C0S cells thus obtained was centriprep-10 (Am icon company) (about 10 times) and analyzed by SD SZP AG E. Similarly, culture supernatants of COS cells into which only the vector was introduced as a control were electrophoresed side by side, about 10 times concentrated respectively. The gel concentration was 12%, and the gel was electrophoresed according to the method of Laeminli, Nature, 227, 680 (1970). Was stained.
  • the molecular weight markers are low-molecular-weight markers manufactured by Bio-Rad (Phosphorylase B (92.5 kd), peroxyserum albumin (66. 2 led), ovalbumin (45. Okd)). , Carbonic anhydrase (31. Okd), soybean tribcine inhibitor (21.5 led), and lysozyme (14.4 kd)].
  • the other was used to detect megakaryocyte amplification factor by the Estanblot method.
  • the molecular weight markers used at this time were Biotin's Prestin molecular weight markers-[Phosphorylase B (10. 6. Okd), P. serum albumin (80. Okd), Ovalbumin (49. 5kd), carbonic anhydrase (32.5), soybean trypsin inhibitor (27.5U) and lysozyme (18.5kd) were used.
  • the primary antibody was expressed in rabbits using an 18-residue peptide synthesized as an antigen based on the N-terminal sequence analysis of megakaryocyte amplification factor purified from the culture supernatant of HPC-Y5. A polyclonal antibody obtained by immunization was used.
  • the band stained by the silver staining method was compared between the two, the band with a molecular weight of about 33,000 was found to be the culture of C0S cells transfected with the megakaryocyte amplification factor gene. Only observed in the supernatant. Furthermore, only the band with a molecular weight of about 33,000 strongly developed color in the Western blotting method, indicating that this band was a recombinant megakaryocyte amplification factor.
  • Example 1 Megakaryocyte amplification factor (Meg-POT) in culture supernatant of C0S cells
  • the megakaryocyte amplification factor activity of the culture supernatant of the COS cells obtained in Example 15 was measured according to the method described above. However, since it is known that IL-6 is induced in the culture supernatant by stimulating the introduction of the gene into C0S cells, the measurement was performed using a thread to which an antibody against the mouse IL-6 receptor was added. went.
  • the culture supernatant of untreated COS cells into which the gene was not introduced was also used as a control CO-introduced vector containing no Meg-POT cDNA.
  • the culture supernatant of S cells also did not show megakaryocyte amplification factor activity, but the culture supernatant of COS cells transfected with a vector containing Meg-POT cDNA clearly showed megakaryocyte amplification factor activity.
  • Table 4 the culture supernatant of untreated COS cells into which the gene was not introduced was also used as a control CO-introduced vector containing no Meg-POT cDNA.
  • the culture supernatant of S cells also did not show megakaryocyte amplification factor activity, but the culture supernatant of COS cells transfected with a vector containing Meg-POT cDNA clearly showed megakaryocyte amplification factor activity.
  • COS cell megakaryocyte amplifying factor activity "Culture supernatant concentration (%) 2 0.2 0 2 0 0 0 0 2 Untreated C 0 S 0 ND h> NDND
  • Example 1 Recombinant megakaryocyte amplification factor (Meg) from the culture supernatant of C0S cells
  • Tween 20 was added to 350 ml of the culture supernatant of the COS cells obtained in Example 15 so that the final concentration was 0.01%, and Amicon PM-10 (manufactured by Amicon) was used. It was concentrated about 10 times by ultrafiltration. From this concentrate, recombinant megakaryocyte amplification factor (Meg-POT) was purified by the following procedure.
  • Ci 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.4) containing 0.1% Tween 20 was dialyzed against 101 at ⁇ 4 ° C., and then the same buffer was used. The mixture was added to a DEAE-Sepharose fast flow column (2.2 x 18 cm, manufactured by Pharmacia) equilibrated in the above. After washing the column with the same buffer, the NaC1 concentration was gradually increased to 0, 0 in the same buffer. The protein adsorbed on the column was eluted by increasing the concentration to 1, 0.1, 15, 0.2, and 0.5 M.
  • the obtained fraction was analyzed by SDS / PAGE, and as a result, the band having a molecular weight of about 33,000 recognized in Example 15 was detected in the fraction having a NaC1 concentration of 0.1 M.
  • the fractions were subjected to the next reverse phase HPLC purification.
  • Vydac C4 column (4.6 x 2) equilibrated with 24% acetonitril containing 0.1% TFA after adding 10% TFA to the above fraction to adjust the pH to 3 or less. After washing the column with the same eluent, the concentration of acetate nitrile in 0.1% TFA was linearly increased from 24 to 64% in 80 minutes and then to 80% in 10 minutes. The protein adsorbed on the column was eluted. The flow rate was about 1 inlZmin, and protein detection was performed at two wavelengths, 220 nm and 280 nm.
  • the obtained peak was analyzed by SDS / PAGE, and as a result, a band having a molecular weight of about 33,000 was observed at an acetonitrile concentration of about 41%. After diluting this fraction with 0.1% TFA, reverse phase HPLC was performed again under the same conditions, and the main peak was collected.
  • Example 1 Measurement of megakaryocyte amplification factor activity of purified recombinant Meg-POT
  • the recombinant megakaryocyte amplifying factor (Meg-POT) purified in Example 17 was cultured in Iscove's Modified Dulbecco's culture solution (IMDM) containing 10% poma serum at a predetermined concentration (IMDM).
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's culture solution
  • Test sample diluted to 50.1, 3.1, 0.2 ng / ral 0.1 ml, poma serum (5
  • the agar layer was taken out on a slide glass and dried, and a film-like specimen was fixed with 5% glutaraldehyde, and the method of Nakeif et al. (Proc. Soc. Ep. Biol. Med. 151 587) was used. According to 1976), the cells were stained with acetylcholinesterase and the number of megakaryocyte colonies was calculated. At this time, a clump containing four or more acetylcholinesterase-staining positive cells was defined as a megakaryocyte colony (the colony was examined at a magnification of 40 times).
  • the megakaryocyte amplifying factor activity was determined by adding megakaryocyte generated by adding recombinant Meg-POT.
  • the difference between the number of hemisphere colonies and the number of megakaryocyte colonies produced by recombinant IL-3 alone in the absence of recombinant Meg-POT (added only I MDM containing 10% sera) was used as an index.
  • the purified recombinant Meg-POT showed megakaryocyte amplification factor activity.
  • Example 1 In vitro transcription / translation of a gene encoding megakaryocyte amplification factor (Meg-POT)
  • the reaction product was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis and subjected to autoradiography. As a result, a band having a molecular weight of about 70,000 was recognized.
  • PKP027 obtained in Example 8 was restricted at 37 ° C in 2 OmM tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 10 mM MgC 12 , 1 mM DTT, and 10 OmM KC 1 Treat with enzyme Xh0I (manufactured by Toyobo) for 2 hours, collect DNA as ethanol precipitate, and contain 5 mM MgC12, 1 OmM DTT, 1 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP 10 in 2 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.4). In C, the ends were blunted by treating with a K1en fragment of DNA polymerase for 1 hour. Next, agarose gel electrophoresis was performed to recover a 1.9 Kbp DNA fragment.
  • Example 2 Expression of fusion protein in E. coli JM109 strain
  • E. coli transformed with pMB PK PO27 in Example 20 was cultured at 37 ° C for 16 hours in 5 ml of LB medium containing 5 OugZnil ampicillin and 0.2% glucose. Liquid 41111 to 5 was added to 40 ml of LB medium containing 0.2% of dalcopse. After culturing at 37 ° C. for about 2 hours, isopropyl-5_D-thiogalactoside was added to a concentration of 0.3 mM, and the culturing was continued for another 3 hours.
  • the cultured cells were subjected to SDS polyacrylamide electrophoresis in the same manner as in Example 10, and subjected to Western blotting with the above-mentioned anti-Meg-POT peptide serum or anti-MBP serum. Expression of the fusion protein was confirmed.
  • the expressed recombinant megakaryocyte amplification factor (Meg_POT) was purified from the cells as follows.
  • 2-ME 2-mercaptoethanol
  • Factor Xa was added to the dialysate, and enzyme digestion was performed at 37 ° C. for 16 hours. After concentrating with a filter PM-10 (manufactured by Amicon), the solution was passed through a PD-10 column equilibrated with the above-mentioned equilibration buffer for the amylose column, and then added to the amylose column again. The column was washed with the liquid, and a flow-through fraction and a washed fraction were collected, and the above fraction was concentrated with Centriprep 10.
  • Rabbits were sensitized five times every two weeks with the recombinant megakaryocyte amplification factor thus obtained together with the complete adjuvant of Freund. On day 10 after the final sensitization, whole blood was collected from the cerebral artery to obtain an anti-megakaryocyte amplification factor antiserum.
  • PKP 0 2 7 the 1 0 mM M g C 1 2 , 1 m DTT, 1 0 0 mM KC 1 2 OmM Bokuri scan HCl buffer containing (pH8. 5) 3 7 limited by ° C the enzyme E co After treatment with RI and BamHI (Takara Shuzo), agarose gel electrophoresis was performed to recover a 1.8 kbp DNA fragment.
  • the vector DHF R-Em-RVh is similarly treated with Ec0RI and BamHI, and then dephosphorylated by treatment with alkaline phosphatase (Takara Shuzo) at 60 ° C for 2 hours.
  • the resulting 7 kbp DNA was subjected to agarose gel electrophoresis and ligated to the 1.8 kbp DNA fragment to obtain pEFDKP05 '.
  • a new O ⁇ M ⁇ 0 ⁇ 27 was added to a 2 OmM tris-HCl buffer containing 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, and 100 mM KC 1 ( After cleavage with the restriction enzyme XhoI at 37 ° C in pH 8.5), 6.7 mM MgCl 2 , 16.6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 1 O mM 2 — The ends were blunt-treated by treatment with T4 DNA polymerase in a 67 mM Tris buffer containing mercaptanol, 6.7 mM EDTA, and 330 mM dNTP at 37 ° C for 5 minutes.
  • the vector DHFR-AE-RVh was obtained by using DHFR- ⁇ -PMh-ga1 and RVh-PM1f-4 described in International Publication WO92 / 19759. It was prepared as follows.
  • CH 0 cells (M eg - P 0 T) expression of a gene CH 0 cell DXB-1 1 a to be 1 X 1 0 7 cells / m 1 phosphate - bufferedsaline ( The suspension was added to 0.8 g of the cell suspension and 10 g of pEFDKP was added thereto.
  • Blasmid was introduced into CHO cells by electroporation (e 1 ectroporation) using Gene Pulser (BioRad) under the conditions of 1900 V and 25 / iF. After a 10-minute recovery period at room temperature, the cells that had been subjected to electoral port replacement were treated with 10% fetal bovine serum.
  • “-MEM medium (GIBCO) was added to 25 ml. After culturing at 37 ° C for 24 hours, the cells recovered by trypsinization were diluted 100-fold and diluted with 10% The cells were cultured for 3 weeks in a ⁇ ⁇ M medium (manufactured by GIBCO) containing no ribonucleoside and deoxyribonucleoside added to fetal serum, and the medium was exchanged once every 3 to 4 days. Since it grew to the point where it could be confirmed, the clones were picked up, culture was continued for each clone, methotrexate (MTX) (manufactured by Sigma) was added to the previous medium, and selective culture was continued.
  • MTX methotrexate
  • the MTX concentration was set at 10OnM, and the resulting resistant clones were subjected to secondary selection in a medium with an MTX concentration of 50nM. And 2% FCS-containing IDMM medium (GIBC 0) in large scale, and the culture supernatant was used for purification.
  • the culture supernatant was analyzed by SDSZPAGE, and Meg-POT was detected by Western blotting using an antibody prepared using a synthetic peptide near the N-terminal as an antigen.
  • a molecular weight marker a Prestin molecular weight marker manufactured by Biorad shown in Example 15 was used. As shown in FIG. 8, three bands were detected at molecular weights of about 33 kd, 30 kd, and 27.5 kd.
  • Tween 20 was added to 10 ml of the culture supernatant of the CHO cells prepared in Example 23 to a final concentration of 0.01%, and a 5 m membrane filter (manufactured by Fuji Film Co., Ltd.) was added. ) To remove insolubles.
  • the recombinant megakaryocyte amplification factor was purified from the culture supernatant by the following procedure.
  • V ydac C 4 power obtained by equilibrating the 0.1 MNa Cl fraction containing recombinant M eg — POT with 24% acetonitrile containing 0.1% TFA in advance After washing the column with the same eluent, the concentration of acetonitrile in 0.1% TFA was linearized to 24-48% in 48 minutes. To elute the protein adsorbed on the column. The flow rate was 1 m 1 / min, and the detection of protein was performed at two wavelengths of 220 nm and 280 nm. Fractions containing the recombinant Meg-POT with an acetonitrile concentration of 40-45% were collected and subjected to the following GelPermEatiotnChromapatoygraphy.
  • the recombinant megakaryocyte amplification factor (Meg-POT) thus obtained was analyzed by SDS PAGE.
  • the gel concentration was 12%, and the gel was electrophoresed according to the method described in Lae mm 1 i, Nature, 227, 680 (1970).
  • the protein was stained using the following method.
  • the molecular weight markers were low molecular weight markers manufactured by Biorad [Phosphorylase (92.5 kd), pepsin albumin (66.2 kd), and ovalbumin (45 ⁇ 0 kd). ), Carbonic anhydrase (31.0 kd), soybean ribosin inhibitor (21.5 kd), and lysozyme (14.4 kd)].
  • N-terminal amino acid sequence of the recombinant Meg-POT obtained in Example 24 was determined using a gas phase protein sequencer 476A (manufactured by Applied Biosystems). Analysis was carried out. As a result, the following three types of N-terminal amino acid sequences (a) to (c) were recognized.
  • the C-terminal peptide fragment was further digested with EndoAsp-N.
  • the C-terminal peptide was dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 8.0), EndoAsp—N was added, and the mixture was subjected to enzyme digestion at room temperature for 16 hours. After adding 10% TFA to the reaction mixture and adjusting the pH to 3, the mixture was added to a V ydac CI 8 column equilibrated with 0.1% TFA, and the acetonitrile concentration was increased to 0 to 48% for 48 minutes. The peptide adsorbed on the column was eluted linearly. The obtained fragment was analyzed with a gas phase protein sequencer type 476 A, and as a result, the amino acid sequence of the C-terminal fragment was as shown below.
  • Example 23 Culture supernatant of CHO cells obtained in Example 23 and recombinant purified in Example 24
  • the megakaryocyte amplifying factor activity of the pancreatic megakaryocyte amplifying factor was measured according to the method described above.
  • Table 6 the culture supernatant of CHO cells into which the vector containing the megakaryocyte amplifying factor cDNA was introduced clearly showed megakaryocyte amplifying factor activity, and Type megakaryocyte amplification factor also showed megakaryocyte amplification factor activity.
  • Example 2 Purification of recombinant megakaryocyte amplifying factor (MegPOT) from culture supernatant of CHO cells!
  • Tween 20 was added to the CHO cell culture supernatant 101 (10 liters) prepared in Example 23 to a final concentration of 0.01%, and a 5 m membrane filter was added. Insoluble matter was removed through a filter (Fuji Film Co., Ltd.). The recombinant megakaryocyte amplification factor was purified from the culture supernatant by the following procedure.
  • the fraction was concentrated with a membrane filter PM-10 (manufactured by Amicon), diluted 10-fold with lOmM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 0.01% Tween 20, and then subjected to anion exchange chromatography. I took one.
  • the recombinant megakaryocyte amplification factor (Meg-POT) thus obtained was analyzed by SDS / PAGE.
  • the gel concentration was 12%, electrophoresed according to the method of Laemrali, Nature, 227, 680 (1970), and the protein was stained with 2D-silver staining reagent "Daiichi” (Daiichi Pure Chemicals).
  • the molecular weight marker used was the low molecular weight marker manufactured by Biorad, which was used in Example 15.
  • the purified recombinant Meg-POT gave a single band at a molecular weight of about 30,000.
  • the megakaryocyte amplification factor activity of this was measured according to the method described above, and compared with that obtained in Example 24 having a molecular weight of about 33,000. As a result, as shown in Table 7, those having a molecular weight of about 30,000 showed no activity at any of the measured concentrations.
  • Example 2 N-terminal and C-terminal amino acid sequence analysis of recombinant megakaryocyte amplification factor (Meg-POT) H
  • a 70% formic acid solution containing 10 mg Zm1 of cyanogen bromide was added to recombinant Meg_POT having a molecular weight of about 30,000, and cyanogen bromide was decomposed at room temperature for 24 hours. Excess reagent was removed with a centrifugal concentrator. The residue was dissolved in 0.1% TFA, applied to a Vydac C4 column (4.6 x 250 mm) equilibrated with 0.1% TFA, and the concentration of acetate nitrile in 0.1% TFA was adjusted to 80% for 40 minutes. Cyan bromide fragments adsorbed on the column were eluted linearly to 0%.
  • the flow rate was 1 ml / min, and peptide detection was performed at 22 Onm and 280 nm.
  • the obtained two peaks were analyzed using a gas phase protein sequencer.
  • the amino acid sequence of the C-terminal fragment was as shown below.
  • the molecular weight is about 33,000.
  • the amino acid sequences having a molecular weight of 0 and about 30,000 have the same N-terminal but different C-terminal.
  • those having a molecular weight of about 33,000 show activity, while those having a molecular weight of about 30,000 show no activity. Therefore, it is thought that there is an important site involved in megakaryocyte amplification factor activity in the amino acid sequence at the C-terminus between the molecular weights of about 33,000 and about 30,000. .
  • Meg-POT was detected by the Western blotting method using the antibody against Meg-POT prepared in Example 23.
  • the molecular weight markers were pre-stained molecular weight markers (Phosphorylase ⁇ (106 kd), Bioserum albumin (80.0 kd), Ovalbumin (4 9.5 kd), carbonic anhydrase (32.5 kd), soybean trypsin inhibitor (27.5 kd), and lysozyme (18.5 kd)].
  • Vydac C4 column prepared by adding acetic acid to a 0.2M NaCl fraction containing molecular species of about 70,000 and adjusting the pH to 5, and then equilibrating with 32% acetonitrile containing 0.1% TFA. was added. After washing the column with the same eluent, the concentration of acetonitrile in TFA was increased linearly up to 40 minutes to elute the proteins adsorbed on the column. Minerals with an acetonitrile concentration of 39-41% were collected and subjected to the next gel filtration.
  • the molecular weight marker used was the above-mentioned molecular weight marker manufactured by Biorad.
  • PCK was used to obtain the modified Meg-POT gene.
  • the following oligonucleotides were synthesized as primers for PCR using 381A DNA Synthesizer (Applied Biosystems) based on the nucleotide sequence of the gene shown in SEQ ID NO: 10.
  • Primer-3S 5'-CTGGCTCACCGGCTCTCTGA-3 'Primer —: 5'-ATGGATCCTTACCGCCGGAACCGCGGCCG-3'
  • Meg-POT which encodes the recognition sequence of the intracellular processing enzyme Furin, which is located near the C-terminus of Meg-POT purified from the culture supernatant of recombinant CH0 cells Arg_x-Arg-Arg 295 A gene was prepared, and the expression vector was constructed using the gene.
  • KR was performed using PKP027 as a mirror type and using a DNA Thermal Cycler (Erkin Elmer Cetus).
  • dNTP oxynucleotide ioti detriphosphate
  • DNA Polymerase (Stratagene) was added. Thereafter, PCK was performed by repeating the cycle of denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 60 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 2 minutes 30 times (Fig. 11). The sample was subjected to agarose gel electrophoresis, and the amplified 590 bp MA fragment was extracted. The 5 'end of the DNA was phosphorylated using Polynucleotide kinase and ligated with PSP73, a vector previously treated with the restriction enzyme Smal and alkaline phosphatase, to give PSP982A. This inserted base sequence was determined by the Dideoxy sequencing method, and it was confirmed that the 982th G was substituted with T, and a BamIII site was located on the 3 ′ side, and that no other mutation was found.
  • COS cells were suspended in PBS at 1 ⁇ 10 7 cells / ⁇ 1, and 20 ⁇ g of pEF M'POS was added to 0.8 ml of the cell suspension. Plasmid was introduced into COS cells by electroporation using GenePu 1 sar (BioRad) at 1500 V and 25 FD. The electroporated cells were added to DMEM medium (GIBC0) containing 1% fetal bovine serum, and cultured for 72 hours, and the culture supernatant was collected. Each culture supernatant was concentrated about 10-fold with Centriprep-10 and subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
  • DMEM medium GIBC0
  • fetal bovine serum fetal bovine serum
  • Example 21 Western blotting was performed using an anti-megakaryocyte amplification factor antiserum obtained by immunizing rabbits with the Meg-POT protein expressed and purified in Escherichia coli obtained in Example 1 as an antigen. The accumulation of the modified Meg-POT in the culture supernatant was confirmed.
  • the megakaryocyte amplification factor activity of the culture supernatant was measured according to the method described above. Table 9 shows the results.
  • oligonucleotides as primers for PCR were synthesized using 381A DNA Synthesizer (Applied Biosystems) based on the nucleotide sequence of the gene shown in SEQ ID NO: 10.
  • Primer T3- 2 5'-CATGATTACGCCAAGCTCGAA-3 'Primer 754GA: 5'-GCTGCCTCCTCCTGGTCCTGGTCCAGGGGTCC-3 J Primer 754GS: 5'-CCAGGACCAGGAGGAGGCAGCCAGGGCGGC-3' Primer 850 GA 5'-AGCACGGGCGCGCCGCC -CTGCGGGGCCTGGTGCCCGTGCTGGGCCAGCCC-3 '1 ⁇ 8-? ( ⁇ Modified expression vector-pEFMPOL 252 V in which the 252nd 1 ⁇ 11 of pEFMPOS was replaced with 1) PKP027 was primed under the same conditions as above.
  • PCR was performed using the combination of -2 and 850GA and the combination of 850GS and G982A, respectively.
  • the sample was subjected to gel electrophoresis, and OJkb 150bpMA was extracted, respectively.
  • PCR was performed again using G982A (Fig. 11) .
  • Agarose gel electrophoresis was performed to extract the amplified lkbpDM. Then, the 5 'end of the DNA was phosphorylated and ligated with PSP73, a vector previously treated with the restriction enzyme Smal and Alkali phosphatase to obtain PSP850G.
  • the inserted base sequence was determined by the Dideoxy sequencing method, and the 850th C force; the 9th G position was replaced with a T, and the 3 'side BamHI site force; It was confirmed.
  • agarose gel electrophoresis was performed to recover 190 bp and 9.5 kbp D fragments, respectively, and these were ligated to obtain pEFNKPOU 52V. (Fig. 12).
  • a Meg-POT modified expression vector in which the 220th Gin of pEFMPOS was replaced with Glu-pEFN KPO £ i22 (IE was constructed.
  • PKP027 was combined with primer-T3-2 and 754GA under the same conditions as above. . with 2 and G 2A - and PCR was carried out each with a combination of 754GS and G982A sample performs gel electrophoresis, respectively 0.9 kbp, was extracted 150bpMA these DNA fragments after mixed-, primer one T 3.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human
  • Characteristic cDNA derived from cultured cells obtained from lymph nodes of a human pancreatic cancer patient and encoding a part of a polypeptide having human megakaryocyte amplification factor activity.
  • Sequence type nucleic acid Number of chains: two main
  • Organism name human
  • Characteristic cDNA derived from cultured cells obtained from lymph nodes of human cancer patients and encoding a polypeptide having human megakaryocyte amplifying factor activity.
  • GAATTCGGCA CGAGGCCACT CCCGTCTGCT GTGACGCGCG GACAGAGAGC 50 TACCGGTGGA CCCACGGTGC CTCCCTCCCT GGGATCTACA CAGACC ATG GCC 102
  • AGC ACG GAG CGT GTC CGG GAG CTG GCT GTG GCC TTG GCA CAG AAG 372 Ser Thr Glu Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gin Lys S "0" SI2
  • ATC CTC CGG CCG CGG TTC CGG CGG GAA GTG GAG AAG ACA GCC TGT 1002 lie Leu Ar Pro Arg Phe Arg Arg Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys

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Description

明 細 書
巨核球増幅因子をコー ドする遺伝子 技術分野
本発明は遺伝子に関し、 さらに詳しくは、 多能性血液幹細胞より分化した巨核 球コロニー形成細胞 （Megakaryocyte Colony-Forming Unit.) に作用しイ ンタ一 ロイキン - 3 ( I L - 3 ) 等の巨核球コロニー刺激因子 （Megakaryocyte Colony -Stimulating Factor ： M e g - C S Fと略記する） 活性を有する物質の存在下 に巨核球の成熟を促進するヒ ト由来の巨核球増幅因子 （Megakaryocyte Potentia tor 〔以下 M e g - P O Tと峪記することあり〕 ) 活性を有するポリベプチ ドを コー ドする遺伝子、 該遺伝子を含有する組換ベクター、 該ベクターによる形質転 換体、 及び該遺伝子を用いた巨核球増幅因子の製造方法に関する。
本発明の遺伝子は、 in vitroにおいて I L - 3存在下、 用量依存的に巨核球コ ロニーを増幅させる作用を有する巨核球増幅因子をコー ドする。 本発明の遺伝子 を、 適当なベクターに挿入した後、 常用の宿主細胞を形質転換することにより大 量に均一な巨核球増幅因子を製造することが可能となる。 このことから、 本発明 は、 例えば血小板減少あるいは血小板の機能低下を伴う疾患に対して臨床上の有 用性が期待される治療剤の提供が可能となる。 背景技術
血小板は、 生体の止血、 血栓形成に重要な意義を持つ血液有形成分の一つであ る。 血小板は、 骨髓中の造血幹細胞から巨核球系前駆細胞を経て巨核芽球となり 、 さらに成熟した巨核球から血液中に放出される。
骨髄細胞から巨核球コロニーを形成させるには、 2種類の異なった作用を持つ 因子が必要であると考えられている（Williams, N et al . 「J.CeIl Physiol. 」 11 i_. 101 ( 1982 )) 。 すなわち、 それを加えるだけで巨核球コロニーが形成される M e g - C S Fと、 それだけでは巨核球コロニーを形成させる活性はないが、 M e g - C S Fとともに加えると巨核球コロニー数を増やしたり、 その成熟を促進 する作用を示す M e g — P 0 Tである。
ヒ 卜では M e g - C S F活性を有するものとして I L一 3 (Teramura.M et al. Γ Exp.Hematol.j j_6 , 843 ( 1988 )) や顆粒球 ·マクロファージコロニー刺激因子 (Teramura. et aし 「Exp .Hema t o 1.」 Π, 1011 ( 1989))等力；知られている。 また 、 ヒ 卜で M e g — P 0 T活性を有するものと しては、 イ ンターロイキン 6 (Teram ura.M and Mizoguchi.H 「IiU.J.Cel l CloningJ iL 245 ( 1990 )), イ ンタ一ロイ キン 1 1 (Teramura'M et al . 「Blood 」 79， 327 ( 1992 )) 、 エリ スロポエチンお runo.E et al . 「Blood 」 73, 671 ( 1989)) 等が知られている。
しかし、 これらのものは巨核球 ·血小板系に特異的な因子ではなく、 むしろ他 の血球系や血球系以外の細胞にも作用を有していることが知られている。 従って 、 これらのものを医薬品として巨核球 ·血小板系への作用を期待して投与した場 合、 それとは別の作用をも発現してしまうことが危惧される。 このようなことか ら、 巨核球 ·血小板系に特異的に作用し、 医薬品としての有用性の高い生理活性 物質が望まれている。
そこで巨核球 ·血小板糸に作用する新規な巨核球増殖因子を見出すと同時に、 該巨核球増幅因子を医薬用途に用いるために、 それを大量に得る必要があった。 巨核球増幅因子を産生細胞の培養上清から単離する方法では、 培養上清中の巨核 球増幅因子濃度が低く、 均一な巨核球増幅因子を得るには複雑な精製工程を必要 と し、 かつ微量にしか得られない等の難点があった。 従って上記利用目的のため 、 組換え D N A技術を用いて、 巨核球 ·血小板系に作用する新規な巨核球増幅因 子を大量に製造することが望まれていた。
かかる状況において、 本発明者らは、 ヒ ト脬臓癌細胞由来の株化細胞 「H P C - Y 5」 の培養上清中に巨核球増幅活性を見い出し、 該培養上清中から巨核球増 幅活性を指標として目的とする新規な巨核球増幅因子を精製し、 その性状を明ら ^かにした （国際出願番号： P C Tノ J P 9 2ノ 0 1 6 8 9、 国際公開番号： WO 9 3 Ζ 1 3 1 3 2 ) 。
さらに、 そのアミノ酸配列の情報をもとにオリゴヌク レオチ ドプライマ一を合 成し、 「H P C — Υ 5」 より調製した mR N Αから作製した c D N Αライブラリ 一から、 上記合成ブライマ一を用いて、 ポリメラーゼ連鎖反応 （以下 P C Rと略 記する） により、 巨核球増幅因子をコー ドする DN A断片を得た。 次いで、 この D NA断片をプローブとして、 c D N Aライブラリ一をスクリ一ニングにかけ、 目的とする新規な巨核球増幅因子をコ— ドする遺伝子を単離することに成功し、 その全塩基配列を明らかにした。
また、 この遺伝子を適当なベクターに挿入した後、 この発現ベクターにより形 質転換された形質転換体を培養し、 次に、 産生された目的蛋白質を分離 ·精製す ることにより新規な巨核球増幅因子を大量に製造することができることも明らか にした。 発明の開示
従って、 本発明は、 ヒ 卜巨核球増幅因子活性を有するポリペプチドをコー ドす る遺伝子を提供する。
本発明はさらに、 ヒ 卜巨核球増幅因子活性を有するポリペプチドをコー ドする 遺伝子を含む組換えベクターを提供する。
本発明はまた、 ヒ ト巨核球増幅因子活性を有するポリペプチドをコー ドする遺 伝子を含む組換えベクターによって形質転換された原核もしくは真核宿主細胞を 提供する。
本発明はさらに、 ヒ ト巨核球増幅因子活性を有するポリペプチドをコー ドする 遺伝子を含む組換えベクターによって形質転換して得られた形質転換株を培養し 、 産生された目的蛋白質、 好ましくはヒ ト巨核球増幅因子活性を有する蛋白質の 製造方法を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は実施例 3におけるステツプ- 7の逆相 H P L C(III) の結果を示す。 図 2はプラ ス ミ ド p K PO 2 7の搆造を示す。
図 3はプラスミ ド P RVHKP02 7の構造を示す。
図 4はブラスミ ド P RVHKP02 7 f の構造を示す。
図 5はブラスミ ド P C I TE . K P02 7の構造を示す。
図 6はプラ ス ミ ド p MB P K P 02 7の構造を示す。 図 7はブラ スミ ド p E F D K P 0 f の構造を示す。
図 8は、 C H 0細胞を用いて発現した培養上清を S D S /PAGEにて分析し て、 N末近傍の合成べプチドを抗原として作成した抗体を用いたゥエスタ ンブロ ッ 卜の図を示す。 レーン 1 ：分子量マーカー、 レーン 2 ： サンプル。
図 9は、 CHO細胞を用いて発現した培養上清の各精製画分 （実施例 2 9 ( i ) 参照） を S D S/P AG Eにて分析して、 実施例 2 で作製する M e g - P 0 Tに対する抗体を用いて行ったウェスタ ンブロッ 卜の図を示す。 レー ン 1 ：分子 量マーカー、 レーン 2 ：素通りおよび洗浄画分、 レーン 3 : 0. 1 M N a C 1 画分、 レー ン 4 : 0. 2M N a C 1画分、 レーン 5 : 0. 3M N a C 1画分 、 レー ン 6 : 0. 5M N a C 1画分、 レーン 7 : 1. 0M N a C 1画分。 図 1 0は、 CHO細胞を用いて発現した培養上清の各精製画分 （実施例 2 9 ( iii) 参照） を S D S/PAGEにかけた後行ったウェスタ ンプロッ 卜の図を示す 。 レー ン 1 ：溶出時間 4 2〜 4 3分の画分、 レー ン 2 ：溶出時間 4 3 ~ 4 4分の 画分、 レー ン 3 ：溶出時間 44 ~ 4 5分の画分、 レー ン 4 ：溶出時間 4 5 ~ 4 6 分の画分。
図 1 1は、 修飾体 M e g - P 0 T発現べクタ一構築のために実施した P C Rの ブラィマーの位置を示す。
図 1 2は、 修飾体 M e g - Ρ 0 T発現べクタ一 p E FNKPO S、 p E FNK POL 2 5 2 V、 p E F NK P 0 Q 2 2 0 Eの構造を示す。 発明の詳細な説明
巨核球増幅因子の遺伝子は、 例えば巨核球増幅因子を産生する細胞等から mR N Aを調製した後、 既知の方法により二本鎖 c DN Aに変換することにより得ら れる。 この mRN Aの供給源となる細胞は、 本発明においてはヒ ト脬臓癌腫瘍細 胞由来の株化細胞 「HP C— Y 5」 （Nozomi Yamaguchi et al. CANCER RESEARC H 7008 1990) 〔 1 9 9 1年 1 2月 2 7日 工業技術院微生物工業技術研究所 に微ェ研条寄第 3 703号 （F E RM B P— 3 7 0 3 ) としてブタペス ト条約 に基づき国際寄託〕 を用いたが、 腫瘍細胞株に限らず、 哺乳動物から分離できる 細胞、 あるいは樹立した他の細胞株でもよい。
また、 mRN Aの調製は本発明においてはグァニジンチオシァネー ト処理後、 塩化セシウム密度勾配遠心を行い（Chirgwin et aし Biochemistry jj^ 5294 1979 ) 全 RN Aを得たが、 すでに他の生理活性蛋白の遺伝子をクローン化する際に用 いられた方法、 例えばバナジウム複合体等のリボヌク レア一ゼィ ンヒ ビター存在 下に界面活性剤処理、 フ ヱ ノ ール処理を行う （Berger & Birkenmeier, Biochemi stry, U 5Π 3 1979 ) 方法を用いることができる。
全 RNAからの poly (A) +R N Aの調製はオリゴ （d T) を結合した担体、 例えばセフ ァ ロ一スゃセルロース等を用いたァフ ィ 二ティ 一力ラムクロマ 卜 グラ フ ィ ーかバッチ法により行うことができる。 また、 ショ糖密度勾配遠心法等によ り poly (A) +R NAをさらに精製することもできる。 その他、 いったん RNA を調製せずに直接 poly (A) +R N Aを得る方法もある。
上記の如く して得た mR N Aからニ本鎮 c DNAを得るには、 例えば mRNA を铸型にして、 3 '端にある polyA—鎖に相補的なオリゴ （d T) またはランダ ムブラィマー或いは巨核球増幅因子のァミ ノ酸配列の一部に相応する合成ォリゴ ヌク レオチ ドをブライマ一と して逆転写酵素で処理して mR N Aに相補的な DN A ( c DNA) を合成する。
mRN Aをアル力リ処理により分解 ·除去した後、 得られた一本鎮 c DN Aを 铸型にして逆転写酵素あるいは DN Aボリ メラーゼ （例えば Kl enow断片等） 処理 後、 S 1 ヌクレア一ゼなどで処理する力 直接 R N a s e Hおよび DNAポリ メラーゼ等で処理することによってもニ本鎮 c DN Aを得ることができる（Mania t is et a】. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory 1982および Gu bier & Hoffman, Gene 25 263 1983)0
巨核球増幅因子をコー ドする c DN Aを単離するには、 例えば巨核球増幅活性 を指標とするか抗体を用いて直接発現クローニング等の方法で行うことができる 。 巨核球増幅活性の測定は、 I L - 3存在下で骨髄細胞を用いた軟寒天培養法 を適用して実施できる。
即ち、 ゥマ血清 （5 6 °C 3 0分処理、 Biocell社製） 0. 2 ml、 マウス （C 5 7 B LZ6 N系雄性、 6 ~ 1 2週齢） 大腿骨骨髄細胞浮遊液 0. 1 ml (2 X 1 05 有核細胞） 、 組換え型マウス I L— 3を 5 DgZml含む Iscove's Modified Du lbecco' s培養液 （ I MDM) 0. 2ml、 寒天を 0. 7 5 %含む改変 McCoy' s 5 A 培養液 0. 4ml、 および被検検体 （ 1 0 %ゥマ血清を含む I MDMで希釈したも の） 0. 1 mlを混合して、 直径 3 5 nunの組織培養ブラスチックディ ッシュに入れ て固まらせたのち、 3 7°C， 5 %炭酸ガス/ / 9 5 %空気、 1 0 0%湿度の条件で 培養を行う。
培養 6 日目に寒天層ごとスライ ドガラス上に取出し乾燥させ、 フィルム状標本 と したものを 5 %グルタルアルデヒ ドで固定し、 Nakeif らの方法 （Pr o c . So c . Exp .Biol. Med. 151 587 1976)に従って、 アセチルコ リ ンエステラーゼ染色し、 巨核 球コロニー数の算定を行う。 この際、 アセチルコ リ ンエステラーゼ染色陽性細胞 を 4個以上含む集塊を巨核球コロニーとする。 検鏡の倍率は 40倍である。 なお 、 Me g - POT活性は、 被検検体を添加して生じた巨核球コロニー数と被検検 体を添加せずに （1 0 %ゥマ血清を含む I MDMのみ添加） 組換え型 I L - 3単 独で生じた巨核球コロニー数との差を指標とする。
本発明者らは、 巨核球増幅因子を産生する株化細胞の培養上清から巨核球増幅 因子を単離精製し、 そのアミ ノ酸配列の情報をもとにプライマ一を合成し、 P C Rを用いて、 ヒ ト由来巨核球増幅活性を有するポリペプチ ドをコー ドする遺伝子 断片をクローニングした。 その DN Aをプローブと して既知の方法により c DN Aライ ブラ リ—から目的とする新規な巨核球増幅因子をコ一 ドする完全長 c DN Aを含むクローンをスク リ ーニングした。
なお、 これらの c DN Aを pBlue script SK (-)の EcoRI, Xbol 切断部位間に挿 入した P K P027を含有する大腸菌（E. co 10 J M 1 09株、 および p K P 0 .2 1を含有する大腸菌（Ε· coli) J M 1 09株は、 工業技術院微生物工業技術研 究所に、 各々、 平成 4年 1 0月 1 2日に微ェ研条寄第 4 0 2 9号 （FERM B P - 40 29) 、 平成 4年 1 1月 1 0日に微ェ研条寄第 4 0 7 1号 （FERM B P - 407 1 ) と してブタぺス ト条約に基づき国際寄託されている。
また、 本発明で用いた P C Rを繰り返し行うことで、 完全長の c DNAを得る こともできる。 また、 P CRによらずアミ ノ酸配列の情報からプローブを合成し 、 直接 c DNAライ ブラ リ一をスク リーニングし、 目的とする c DNAを得るこ ともできる。
このようにして、 クローン化された巨核球増幅因子をコー ドする遺伝子は適当 なベクター DN Aに組み込むことによ り、 他の原核細胞または真核細胞の宿主細 胞を形質転換させることができる。 さらに、 これらのベクターに適当なプロモーターおよび形質発現に係る配列を 導入することにより、 それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現することが可能 である。 また、 目的とする遺伝子に他のポリペプチドをコー ドする遺伝子を連結 して、 融合蛋白質として発現させ、 精製を容易にしたり、 発現量を上げ、 精製ェ 程中で適当な処理をほどこすことにより、 目的とする蛋白質を切り出すことも可 能である。 また、 連結する遺伝子を他の生理活性因子のものを用い融合蛋白質の まま、 巨核球増幅活性を増強するような試みも可能である。
一般に、 真核生物の遺伝子はヒ 卜イ ンタ一フエ口ン遺伝子等で知られているよ うに、 多形現象を示すと考えられ （例えば、 Nishi等、 J.Biochem. 97 153 198 5)、 この多形現象によって 1個またはそれ以上のアミ ノ酸が置換される場合もあ れば、 塩基配列の変化はあってもァミ ノ酸は全く変わらない場合もある。
また、 配列番号 1 2もしくは 1 3のァミ ノ酸配列の中の 1個またはそれ以上の アミ ノ酸を欠くかまたは付加したポリペプチドあるいはァミ ノ酸が 1個もしくは それ以上のァミ ノ酸で置換されたポリベプチドでも巨核球増幅活性を有すること がある。 例えば、 ヒ トイ ンタ一ロイ キン 2 ( I L— 2 ) 遺伝子のシスティ ンに相 当する塩基配列をセリンに相当する配列に変換して得られたボリベプチドが I L 一 2活性を保持することも既に公知となっている （Wang等、 Science, 224 1431 1984) 。
また、 真核細胞で発現させた場合その多くは糖鎖が付加されるが、 アミノ酸を 1ないしそれ以上変換することにより糖鎖付加を調節することができるがこの場 合も、 巨核球増幅活性を有することがある。 それゆえ、 本発明における巨核球増 幅因子の遺伝子を人工的に改変したものを用いて得られたポリべプチドをコ一 ド する遺伝子は全て本発明に含まれる。 その際、 無作為にアミノ酸を変換したポリ ぺプチドをコ一 ドする遺伝子を作製することもできるが、 例えば、 ヒ ト以外の動 物種 （マウス、 ラ ッ 卜、 サル等） の巨核球増幅因子活性を有するタ ンパク質のァ ミノ酸配列を参考にして塩基配列を置換、 欠除して種々の修飾体をコードする遺 伝子を作製することも可能である。
さらに、 得られたポリペプチドが巨核球増殖活性を有し、 配列番号 1 2もしく は 1 3に示されたァミ ノ酸配列を含むポリベプチドをコ一ドする遺伝子とハイブ リダィズする遺伝子も本発明に含まれる。 なお、 ハイブリダィゼ一シヨ ン条件は 、 通常行われているプローブハイ プリ ダイゼーショ ンの条件を適用することもで きる 例 _は Molecular Cloning ： A Laboratory Manual, Sambrook ら、 Cold s pr i ng Habor Laboratory Press , 1989 ) 0
本発明の発現べクタ—は、 複製起源、 選択マーカ—、 発現させようとする遺伝 子の前に位置するプロモーター、 R N Aスブライ ス部位、 ポリアデニル化シグナ ルなどを含んでいる。
哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモーターと してはレ トロウィルス、 ポ リ オ一マウィルス、 アデノ ウイルス、 シミアンウィルス 4 0 ( S V 4 0 ) などの ウィルスプロモータ一ゃヒ ト . ボリペプチ ド . チェーン . ェロンゲーシヨ ン . フ アクター 1 な （HE F— l a) などの細胞由来のプロモータ一を用いればよい。 例えば S V 4 0のプロモータ一を使用する場合は、 Mulliganなどの方法（Nature 277 108 ( 1979 )) に従えば容易に実施することができる。
複製起源と しては、 S V 4 0、 ポリ オ一マウィルス、 アデノ ウイルス、 牛パピ 口一マウィルス （B P V) 等の由来のものを用いることができ、 選択マーカーと しては、 ホスホ トラ ンスフェラーゼ A P H (3 ' ) IIあるいは I (neo) 遺伝子、 チミ ジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌キサンチン -グァニンホスホリボシル トラ ンスフニラーゼ （Ecogpt) 遺伝子、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （DH F R) 遺伝 子等を用いることができる。
また、 原核宿主細胞、 例えば大腸菌の場合には、 それを宿主とするベクタ一で ある p B R 3 2 2を用いて形質転換することができる（Boliver等 ： Gene 95 ( 1975 )) 。 p B R 3 2 2はア ンピシリ ンおよびテ 卜ラサイク リ ン耐性の遺伝子を 含んでおり、 どちらかの耐性を利用することによって形質転換細胞を同定するこ とができる。 原核生物宿主の遺伝子発現に必要なプロモーターと しては、 /? -ラ クタマ一ゼ遺伝子のプロモーター（Chang等： Nature 275 615 ( 1978))、 ゃラク ト —スプロモーター（Goeddel等 ： Nature 281 544' ( 1979 )) およびト リ ブトファ ン プロモーター（Go edd el等 ： Nucleic Acid Res.8 4057 (1980)) , t a c ブロモ —ター等があげられ、 どのプロモータ一も本発明のヒ ト巨核球増幅因子の発現に 使用できる。
本発明の発現系に用いる宿主のうち原核生物宿主細胞と しては、 例えば、 大腸 困 （Escherichia coli) 、 /くシ レス · ズフ "チリ ス (Bacillus subtilis) 、 ノく シルス 'サ一モフィルス (Bacillus t he rmo ph i 1 us) 等が挙げられる。 また真核 生物のうち、 真核微生物の宿主細胞と しては、 例えばサッカロミセス · セレビシ ェ— (Saccharomvces cerevisia_e) 等が挙げられ、 P甫乳動物由来の宿主細胞と しては、 例えば C 0 S細胞、 チャイニーズ ハムスター卵巣 （C H 0) 細胞、 C 1 2 7細胞、 3 T 3細胞、 H e 1 a細胞、 BHK細胞、 ナバルバ細胞などが挙げ られる。 なお、 本発明の形質転換体の培養は、 宿主細胞に適した培養条件を適宜 選択して行えばよい。
以上のようにして目的とする巨核球増幅因子をコー ドする遺伝子で形質転換し た形質転換体を培養し、 産生した巨核球増幅因子は、 細胞内または細胞外から分 離し均一にまで精製することができる。
なお、 本発明の目的蛋白質であるヒ ト巨核球増幅因子の分離，精製は、 通常の 蛋白質で用いられる分離 ·精製方法を使用すればよく、 何ら限定されるものでは ない。 例えば各種クロマ トグラフィ ー、 限外濾過、 塩折、 透析等を適宜選択、 組 合せれば、 ヒ 卜巨核球増幅因子は分離 ·精製することができる。 実施例
本発明の巨核球増幅因子をコ— ドする遺伝子を得る方法、 該遺伝子を有する組 換えべクタ一及びこれを含有する形質転換体並びにこの形質転換体を培養し取得 した目的の蛋白質、 並びに夫々の製造方法について、 以下の実施例によって詳細 に説明するが、 この実施例によって本発明が限定されるものではない。
実施例 1 . M e g - P 0 T産生細胞株 H P C - Y 5の樹立
脬臓癌患者のリ ンパ節より得られた腫瘍を 1 0 %ゥシ胎児血清 （F B S) を含 む R PM I 1 6 4 0培地を用い、 炭酸ガスィンキュベ一ター （炭酸ガス濃度 5 % 、 湿度 1 0 0 %) 中にて培養することにより樹立した。 この細胞株を 1 %F B S 含有 Ham's F 1 0培地に順化させ、 さらに F B S濃度を徐々に低下させ、 最終的 に蛋白不含の Ham's F 1 0培地中にて増殖し得るまで順化させた。 本細胞株はプ ラスチックディ ッシュ上で単層状に増殖し、 倍化時間は約 3 3時間であった （No zomi Yamaguchi et al . CANCER RESEARCH 50 7008 1990 ) 。 この細胞株を H P C — Y 5細胞と称する。
実施例 2. H P C - Υ 5の継代培養およびローラーボトルによる大量培養 実施例 1で述べた H P C - Y 5細胞の継代培養は以下に示す如く行った。 ブラ スチッ ク培養フ ラ スコ （ 1 5 0 cm2， Co ruing社製） を用レ、、 1 0— 8M亜セレンナ ト リ ウム、 1 0 0 U/mlぺニシリ ン Gカ リ ウムおよび 1 0 0 « g/ml) 硫酸カナ マイ シンを含む Ham's Nutrient Mixture F 1 2培地 5 0 ml中で H P C— Y 5細 胞を培養し、 4 日毎に培養液を交換した。
細胞継代時に培養液を除去し、 あらかじめ 3 7 °Cに加温した 0. 1 2 5 % ト リ ブシン （G I B C 0社製） 、 0. 0 1 %エチレンジァミ ン四酢酸 （EDTA) ( 和光純薬社製） を含むカルシウム， マグネシウム不含 Dulbecco' s Ph o spha t e-bu f f ered sal ine(P B S ) 溶液を加え 3 7 °Cで 5分間加温した。 ピぺッティ ング操 作により細胞を剥離し、 1 5 ml容量のプラスチッ ク製遠心管に細胞を移し、 1 5 (^。回転 分、 5分間の遠心により細胞を回収した。 細胞を上記培地に懸濁し、 新しいフラ スコ 4 ~ 5本に継代した。 一晚静置後、 培養液を非付着性細胞と共に 除去し、 新たに上記培地を加えて培養を継続した。 以後 4 日毎に培養液を交換し た。 また、 実施例 3で述べる M e g - P 0 Tの精製に供するための H P C - Y 5細胞のローラーボ トルによる大量培養を以下の如く実施した。
上記の如く継代された H P C - Y 5細胞が完全に密に増殖した 1 5 0 cm2 のプ ラスチック培養フラスコょり上記の如く 卜 リ プシン - E DT Aを用いて細胞を回 収し、 これを 0 . 2 %ゥシ胎児血清（Hyclone社製） を含有する上記培地 2 5 Oml に浮遊させ、 1 7 0 0 cm2 のプラスチック製口一ラーボ トル（Corning社製） に移 し、 0. 5回転/分の速度で回転培養を行った。 7 日後に培養液を血清を含まな い上記培地に交換し、 以後 4 日毎に上記無血清培地の交換を行うことによ り、 精 製用無血清培養上淸を回収した。
実施例 3. H P C - Y 5株培養上清からの M e g - P O Tの精製
実施例 2で述べた方法に従って得た H P C - Υ 5細胞の培養上清 （2 7 . 3 リ ッ トル） に Tween 2 0を終濃度0. 0 1 %となるように加えた後、 人工腎臓 P A N 1 2 0 0 (旭メディ 力） を用いて、 約 2 0 0倍に濃縮した。 濃縮液を 0. 0 1 %Tween 2 0を含む 1 0 mM酢酸緩衝液 （pH 5. 0) に対し、 4 °Cでー晚透析じた 。 透析内液に遠心操作 （ I 0 0 0 0 x g , 6 0分） を施し不溶物を除去し上清を 以下の精製に用いた。
(ステッ プ— 1 ) S— Sepharose—イオン交換クロマ ト グラフ ィ ー 上述の遠心上清を 0. 0 1 %Tween 2 0を含む 20 ιηΜ酢酸緩衝液 （pH 5. 0 ) で平衡化した S - Sepharose Fast Flow CPh armacia社製) カラム (5 1 0 cm) に添加した。 同緩衝液でカラムを洗浄した後、 同緩衝液中、 N a C lの濃度を 0 - 1 5M, 0. 5M及び 1. 0Mと順次上げて吸着蛋白質を溶出した。 素通り画 分、 洗浄画分および各塩濃度における溶出画分について前述の方法に従って活性 を測定した結果、 0. 1 5M- N a C 1溶出画分に M e g - P OT活性が認めら れた。 （ステッ プ- 2) D E A E - Sepharose イ オン交換クロマ 卜グラフ ィ ステッ プ— 1で得た活性画分を 0. 0 l %Tween 2 0を含む 1 0 mMトリ ス—塩 酸緩衝液 （PH7. 4) に対し 4 °Cでー晚透析した。 透析内液を同緩衝液で平衡化 した D E A E - Sepharose Fast Flow (Pharmacia社製） カラム （2. 2 x 1 3 cm ) に添加し、 同緩衝液で力ラムを洗浄した。 同緩衝液中 N a C 1の濃度を 0. 1 5 M, 0. 5Mおよび 1. 0Mと順次上げて吸着蛋白質を溶出した。 素通り画分 、 洗浄画分および各塩濃度における溶出画分について前述の方法に従って活性を 測定した結果、 0. 1 5 M- N a C 1溶出画分に M e g - P 0 T活性が認められ た。 （ステッ プ一 3) 逆相 H P L C ( I )
ステツプ- 2で得た活性画分に 5 %ト リフルォロ酢酸 （TF A) を加えて pHを 約 2に調整し、 0. 1 %T F Aを含む 5 %ァセ 卜二 ト リルで平衡化した逆相 H P L Cカラム （Protein C 4 , 1 0 x 2 5 0 mm, Vydac社製） に流速 1. 0 ml/分 で添加した。 吸着蛋白質はァセ トニ ト リルの直線濃度勾配 （ 5 %— 6 5 %、 1 2 0分、 0 · 5 %ァセトニトリ ル/ /分） により流速 1. OmlZ分で溶出した。 溶出 蛋白質の検出は 2 20 nmおよび 2 8 0 ηηιにおける吸光度を追跡することにより行 レ、、 1mlずつ分画した。 各画分について活性測定を行った結果、 ァセトニト リル 濃度 40 - 45 %の画分に M e g - P 0 T活性が認められた。
(ステッ プ一 4) 逆相 H P LC (II)
ステッ プ- 3で得た活性画分を 0. 1 %TFAで 2倍希釈し、 0. 1 %TFA を含む 3 5 %ァセトニト リルで平衡化した逆相 H P L Cカラム （Protein C 4 , 4. 6 X 2 5 0 mm, Vydac社製） に流速 1. OmlZ分で添加した。 吸着蛋白質は ァセ トニ 卜 リルの直線濃度勾配 （3 5 5 0 %、 7 5分、 0. 2 %ァセ トニ ト リル 分） によ り流速 1. OmlZ分で溶出した。 溶出蛋白質の検出は 2 20 お よび 28 0 nraの吸光度を追跡することにより行い、 1 mlずつ分画した。 各画分に ついて活性測定を行った結果、 ァセ 卜二トリル濃度 40 - 4 5 %の画分に M e g - POT活性が認められた。
(ステッ プ一 5) D E A E · ィ ォン交換 H P L C
ステッ プ- 4で得た活性画分を凍結乾燥した後、 0. 0 1 %Tween 2 0を含む
1 0mMトリス-塩酸緩衝液 （pH8. 0) に溶解し、 同緩衝液で平衡化した Pro tei n Pak G— DEAEカラム （Waters社製、 8. 2 x 7 5 mm) に流速 0. 7 ml/分 で添加した。 吸着蛋白質は N a C 1の直線濃度勾配 （ 0. 0M→ 0. 2 M、 4 0 分、 5mM N a C 1ノ分） により流速 0. 7 ml/分で溶出した。 溶出蛋白質は 2 2 0ιιπιで検出し、 0. 7mlずつ分画した。 各画分について活性を測定した結果、 N a C 1濃度 7 5ιηΜ以下の画分に M e g - P OT活性が認められた。
(ステッ プ— 6 ) T SK g e 】 G 30 00 SWゲル濾過
ステッ プ— 5で得た活性画分を、 0. 0 1 %Tween 2 0及び0. 1 5M N a C 1 を含む 5 0 mlトリ ス -塩酸緩衝液 （PH7. 4 ) で平衡化した T S K g e 1 G 3000 S Wカラム （東ソ一社製 2 1. 5 X 600 nm、 ガー ドカラム 2 1. 5 X 7 5 nm) に流速 3 mlノ分でカラムに流し、 溶出蛋白質は 2 2 Onmで検出した 。 3 mlずつ分画した各画分について、 活性測定した結果、 Me g - POT活性は 溶出時間 49〜 54分の画分に認められたので、 その画分を回収した。
(ステッ プ— 7 ) 逆相 H PL C (111)
ステッ プ- 6で得た活性画分を 5 %T FAを加えて pHを約 2に調整し、 ステツ プ- 4の逆相 HPL C (II) と同一条件下にクロマ トグラフ ィ ーを行った。 各画 分について活性を測定した結果、 主ピーク （ァセトニトリル濃度 4 0 % - 4 5 % ) に M e g - P OT活性が認められた。 この結果を図 1に示す。 図 1において横 棒で示す画分を精製 M e g - P 0 Tとして回収した。
実施例 4. 巨核球増幅因子 （Me g - POT) のァミ ノ酸配列
( i ) N末端アミノ酸配列の决定
実施例 3で得た精製 Me g一 P 0 T試料を気相式プロティンシークェンサ一4 7 0 A型 （Applied B i o sy s t ems社製） を用いてェ ドマン分解を行い、 得られたフ ェニルチオヒダン トイ ン （PTH) —アミ ノ酸を PTHアナライザ一 1 2 0型 （ Applied Biosystems社製） を用いて同定した。 その結果、 N末端近傍のアミ ノ酸 配列 （配列- 1〜 3) は以下に示す 3種が認められた。
[表 1 ]
配列— 1
(配列番号： 1 )
Leu Ala Gly Glu Xaa Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu
1 5 10 15
(なお、 X a aは未同定のァミ ノ酸を示す。 以下同じ。 ） 配列 - 2
(配列番号： 2 )
Ala Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu Ala
1 5 10 15 配列 - 3
(配列番号： 3 )
Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu Ala Asn
I S 10 15
(配列の下に示す数字はェドマン分解時のサイクル数である） 上記配列- 1〜配列- 3のァミ ノ酸配列において以下のァミ ノ酸配列が共通し ていることが認められた。
Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu (配列番号： 4 )
(ii) エン ドプロティナーゼ G 1 u — C消化
試料を 0. 1 M炭酸水素アンモニゥム緩衝液 （pH7. 8) に溶解し、 尿素およ びジチォスライ 卜一ル （DTT) をそれぞれ終濃度が、 7. 8Mおよび 5 0mMと なるように加え、 3 7 °Cで 2時間インキュベー トした。 そこに、 Endo G 1 u - C (Bcehringer-Mannlieim社製） を 0. 5 >" g加え、 3 7 °Cで 2時間反応させた後 、 さらに同量の酵素を加え、 再度 3 7 で 1 8時間反応させた。 反応液に 1 0 % ト リ フルォロ酢酸 （T F A) を加えて pHを 2 と した後、 0. 1 %TF Aで平衡化 した C 1 8カラム （4. 6 2 5 cm, Vydac社製） に力、けた。
ぺプチ ドの溶出は 0. 1 %TF A中、 ァセ トニ 卜 リルの濃度を 1 2 8分間に 0 から 6 4 %まで、 その後 1 6分間に 8 0 %まで直線的に上げて行った。 ペプチ ド は 2 2 0 および 2 8 0 ηιηの二波長で検出した。 得られた部分消化べプチ ド断片 について順次、 気相式プロテイ ンシークェンサ一 4 7 3 A型 （Applied Biosyste ms社製） を用いてアミ ノ酸配列を分析した。
その結果、 部分消化断片のうちのひとつは以下に示す配列を有することがわか つた。
Leu -Ala-Val -Ala-Leu -Ala-Gln-Lys-A sn-\a l-Lys-Leu-Ser-Thr-Gl u-Gln-Leu-A rg- Xaa-Leu-Ala-His-Arg-Leu-Ser-Glu-Pro-Pro-Glu -Asp-Leu-Asp -A la-Leu-Pro- - - (配列番号 5 )
実施例 5. H P C— Y 5細胞からの poly (A) +R N Aの調製
H P C— Y 5細胞から Chirgwin等 （Biochemistry, 18 5294 ( 1979 )) により記 載されている方法に従って全 RN Aを調製した。 すなわち、 約 1 X 1 09 個の H （： — ¥ 5細胞を 4 91111の 3 1 . 2 5 raMクェン酸ナ ト リ ウム及び 0. 6 2 5 %ラ ゥ リルサルコシンナ ト リ ゥムを含む 5 Mグァニジンチオシァネ一 ト（Full 社製） 溶液中で完全にホモジナイズした。 ホモジネ一 卜を遠心管中の 0. 1 M E DT Aを含む 5 . 3M塩化セシウム溶液層上に重層し、 次にこれを SW4 0ローター (Beckman社製） で 3 1 , 0 0 0 rpm にて 2 0でで 1 7時間遠心分離することによ り R NAを沈澱させた。
R N A沈澱物を 8 0 %エタ ノ ールにて洗浄し、 l mM E DTA及び 0. 5 % ド デシル硫酸ナ ト リ ウム （S D S) を含有する 1 OmMト リ ス塩酸緩衝液 H7 . 5 ) 2. 4ml中に溶解し、 プロナーゼ（Boehringer Mannheim社製） を 0 · 5 mgZml となるように添加した後、 3 7 °Cにて 2 0分間保温した。 RNA溶液をフヱノー ル処理することによ り蛋白質を除いた。 溶液中の残存フユ ノールをクロ口ホルム で抽出した後、 RN Aをエタ ノールで沈澱させた。
全 RNAから poly (A) +RNAを olig。 （dT) cellulose spun column力 らな る mRNA Separator(Clontech 1 ab o r a t o r i e s社製） を用いて精製した。 キッ ト 添付の処方に従って、 二度精製を繰り返すことにより精製度を高めた。
上記操作を 2回行い、 それぞれ 3 7 g及び 1 9 0 gの poly (A) +R N A を得た。
実施例 6. P C R用 c DNAライ ブラ リ一の構築
上記 poly (A) +R NA 1 0 gを材料と して c D N A合成キッ ト c — CL0N
E (Clontech laboratories社製） を用いて二本鎖 c D N Aを合成し末端には E c 0 R I リ ンカ一を付着した。 遊離の E c 0 R I リ ンカ一はァガロースゲル電気泳 動にて分離した後、 6 0 0塩基対以上の長さを持つ c DN Aは Geneluter(Invitr ogen社製） を用いた電気溶出により回収した。 このリ ンカ一付加ニ本鎮 c DN A と予め E c 0 R I及びアル力 リ フォ スファ ターゼ （宝酒造社製） 処理したス Z A P IIベクタ一 （S atagene社製） とを、 7 mM塩化マグネシウム、 1 mM DTT, 1 mM AT P及び 2単位の T 4 D Ν Αリガ—ゼ （宝酒造社製） を含む 5 0 mM卜 リ ス塩酸緩衝液 （PH7. 5 ) 中で 4 °Cにて 2 4時間保温して連結した。
これ ¾rGigapack Go 1 d II packaging extract (S t r a t a ge n e社製) を用レヽてノくッ ケージングし、 H P C— Y 5細胞の c D N Aライ ブラ リ一を構築した。 さらにこ のライ ブラ リ一を 7つのプール （A _ G) に分け、 増幅し、 5. 8 gZ l塩化ナ ト リ ウム、 2 1硫酸マグネシウム · 7水和物および 0. 0 1 %ゼラチンを含 む 5 0 卜 リ ス塩酸緩衝液 （pH7. 5 ) 中に回収した。
実施例 7. P C Rによ—るク _ロ一 丄
Z A P IIの E c o R Iサイ 卜近傍の T 7 プロモータ一配列のブライマ一 T 7 ， T 3 プ口モータ一近傍配列のブライマ一 T 3 - 2及び本因子の N末端近傍の部 分ァミ ノ酸配列 Gly-Glu-Thr- Gly- Gin- Glu-Alaをコ― ドする遺伝子と して可能性 のある全てのコ ドンを含むミ ックスプライマー N 1 を 3 8 1 A DNA Synthe sizer(Applied B i o sy s t ems社製） 用いて合成した。
さらに実施例 4 (ii) に示したように、 本因子の End。 G 1 u - C断片 （配列 番号 5 ) 中に Ala- Gin- Lys-Asn- Val- Lys- Leu- Ser- Thr- Glu- Gin- Leu- Arg- Xaa- Leu -Ala-His-Arg-Leu-Ser- Glu-Pro-Pro-Glu-Asp-Leu-As -Ala という比較的コ ドン usage の低い配列 （下線部） が見いだされたため、 このアミ ノ酸配列をもとにこ れらをコ— ドする遺伝子と して可能性のある全ての塩基配列を含むミ ックスブラ イマ一 K 4 S及び K 4 — 2 Aも同様に合成した。 これらプライマ一の塩基配列を 以下に示す。 T 7 ： 5 ' - TAATACGACTCACTATAGGG- 3 '
T 3 - 2 ： 5 ' - CATGATTACGCCAAGCTCGAA - 3 '
N 1 ： 5 ' - GG(GATC)GA(GA)AC(GATC)GG(GATC)CA(GA)GA(GA)GC - 3 '
(センス）
K 4 S ： 5 ' -GC(GATC)CA(AG)AA(AG)AA(TC)GT(GATC)AA(AG)CTC)T - 3 ' (センス）
K 4 - 2 A ： 5 ' - GC(GA)TC C(GATC)AG or (TC)AA〕 (AG)TC(TC)TC(GATC)GG
(GATC)GG(TC)TC— 3酢酸マグネシウム、 0. 1 mM E DTAを含 む 5 0 0 mM酢酸ナトリゥム中で破碎し、 3 7。Cで 1 6時間保温して D N Aを抽出 した。 エタ ノ ールで沈殿させた DNAを 1 mMスべルミ ジン、 0. 1 mM E DTA を含む 2 OraM卜 リ ス塩酸緩衝液 （pH9. 5) 7 5 Iに溶解し 9 0 °Cで 2分間加 熱後、 急冷し 1 0 0 mM 2 -メルカブ 卜エタ ノ ール、 1 0 0 mM塩化マグネシゥム を含む 5 0 0 mMトリス塩酸緩衝液 （pH9. 5 ) を 1 0 1、 1 0 mM AT Pを 1 3 1、 ポリヌク レオチ ド キナーゼ （東洋紡社製） を 2 0単位添加後 3 7 °C 1時間反応させて 5 '端をリン酸化した。
DNA溶液をフニ ノール処理することにより蛋白質を除いた。 溶液中の残存フ エノ一ルをクロ口ホルムで抽出した後、 D N Aをエタ ノールで沈澱させた。 制限 酵素 S m a I (宝酒造社製） 及びアル力 リ フォスファターゼ （宝酒造社製） で処 理したべクタ一 P S P 7 3 (Promega社製） とこの DN A試料を 7 mM塩化マグネシ ゥ厶、 I mM DTT, 1 mM AT P及び 2単位の T 4 DN Αリガーゼ （宝酒造 社製） を含む 5 OmMト リス塩酸緩衝液 （pH7. 5 ) 2 0 1中で 1 6°Cにて 1 6 時間保温して連結した。
次に上記連結混合物のうち 1 0 1 を大腸菌 J M 1 0 9のコンビテン ト細胞 1 0 0 / 1に加え、 氷上で 3 0分間、 4 2 °Cにて 1分間そして再び氷上で 1分間静 置した。 次いで 4 0 0 1の S O C培地 （Molecular Cloning: A Laboratory Ma nua 1 , Sambrookら、 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)を加え、 3 7 °Cにて 3 0分間保温した後 5 0 μ gZmlのアンピシリ ンを含む L B寒天培地 （Mo 1 e cu 1 a r Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら、 Cold Spring Harbor Lab oratory Press, 1 9)上にこの大腸菌を広げ、 3 7 °Cにて 1 6時間保温して大腸 菌形質転換体を得た。 現われた形質転換体のうち 5 クローンについてそれぞれを 5 0；« gZmlのアン ピシリ ンを含む L B培地 5 ml中で 3 7 Cにて 1 6時間培養し、 その培養物からァ ノレ刀 リ & (Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Sambrookら、 Cold Spr i n g Harbor Laboratory Press, 1989 )にてプラスミ ド D N Aを調製した。 それぞれ の挿入塩基配列を Sequenase Version 2.0 (United States B i o chemi c a 1社製） を 用いてジデォキシ ' シーケンシング法にて決定したところ、 配列番号 6に示した ようにプライマ— K 4 S及び K 4 - 2 Aに挟まれた 4 0塩基対の配列が明らかと なった。
この塩基配列をもとにセンス ' プライマ一 7 D - 1 S ： 5 ' 一 CTCTCAACAGAGCA GCTGCG- 3 '及び 7 D — 3 S ： 5 ' - CTGGCTCACCGGCTCTCTGA - 3 ' とアンチセン ス ' プライマー 7 D — 1 A : 5 ' - AGAGCCGGTGAGCCAGACAG- 3 '及び 7 D — 2 A ： 5 ' - GCGCAGCTGCTCTGTTGAGA- 3 ' を合成した。 上記と同様の条件でライ ブラ リ一 D N Aを鍀型に T 7 と 7 D — 1 S及び T 3 — 2 と 7 D — 1 Aの組合せで一段 階目の P C Rを行なった。 さらに二段階目の P C Rをそれぞれプライマー T 7 と 7 D - 3 S及び T 3 — 2 と 7 D — 2 Aの組合せで行なった。
P C R産物を 1 %ァガロースゲル電気泳動で分析し、 増幅された D N A断片を 含むゲル部分を切出し、 Sepliaglas BandPrep K i t (Ph a rma c i a社製） を用いて D N Aを抽出した。 これらの D N Aについて imol DNA Sequencing Sy s t em(Pr ome g a¾ 製） を用いて直接塩基配列を決定したところ、 配列番号 7及び 8に示したように 本因子をコー ドする遺伝子の一部が確認された。
この塩基配列をもとにセンス ' プライマ一 3 A S 1 ： 5 ' - AACTCCTTGGCTTCCC GTGTG - 3 ' とアンチセンス · プライマー 7 S A 1 — 5 ' - CGCATCTGGGTTGAGGAA TAG - 3 ' を合成し、 上記の条件でプール Dについて P C Rを行なったところ 1 9 7塩基対 （配列番号 9 ) の D N A断片の増幅が確認され、 この D N A断片がコ 一ドするァミ ノ酸配列は実施例 3で得た精製 M e g一 P O Tを用いて決定したァ ミ ノ酸配列と一致した。 この D N A断片 （Q 1 9 7 A) を以下のスク リ一ニング にプローブと して用いた。
実施例 8 . c D N Aライ ブラ リーのプローブ Q 1 9 7 Aによるスク リーニング 実施例 5で得られた po ly (A) +R N A 5 gを材料と して Z A P — c D N A SYNTHESIS KIT (Stratagene社製） を用いてニ本鎮 c D N Aを合成し、 ス Z A P IIベクタ一 （Stratagene社製） のアームに連結した。 これを Gigapack Gold II packaging extract (S t r a t a ge n e社製） を用いてパッケージングし、 新たに H P C一 Y 5細胞の c DNAライ ブラ リ一を構築した。
実施例 7の P C Rで増幅された 1 9 7 bpの DN Aをァク リルァミ ドゲル電気泳 動後ゲルから回収し、 この DNA断片 Q 1 9 7 Aをランダムプライマ一 DN Aラ ベリ ングキッ ト （宝酒造社製） を用いて32 Pで標識した。 但し、 添付のラ ンダム プライマーの代りにプライマ— 3 A S 1及び 7 S A 1 を 4 0 0 nMの濃度で用い標 識した。 遊離の d NT Pは N I C K - 11111111ひ113 3(^3社製） に通搭して除いた 。 次に、 Bentonと Dav i sの方法（Sc i ence 180 , 1977 )に準じてプラークハイ ブリダィゼーシヨ ンを行なった。
ファ一ジプラークの生じた寒天培地上に Hy bond - N +フ ィルタ一 （Amersham社 製） をのせてファージを移し、 以下の順序でフ ィ ルターを処理した。 1 . 5 M塩 化ナ 卜 リ ゥムを含む 0. 5 N水酸化ナ 卜 リ ゥム水溶液にて 5分間 DN Aを変性さ せ、 1 . 5 M塩化ナ ト リ ウムを含む 0. 1 N水酸化ナ ト リ ウム水溶液で 1分間続 いて 1 . 5 M塩化ナ ト リ ウムを含む 0. 5M ト リ ス塩酸緩衝液 （pH7. 4) で 1 分間 2回、 最後に 2 X S S C P ( 2 4 0 m N a C 1 , 3 0 m N a 3 citrate, 2 6 mM K H 2 P 04 , 2 mM E D T A ) で 1分間処理した。
次いでフ ィ ルタ—を乾燥し、 0. 4 N水酸化ナ ト リ ウム水溶液で 2 0分間、 5 X S S P E (Molecular Cloning: A Laboratory anua 1 , Sambrookり、 Cold Spr ing Harbor Laboratory Press, 1989)で 1分間 2回処理した。 5 0 %ホルムア ミ ド， 5 X S S P E , 5 Denhardt' s So 1 u t i o n(Mo 1 e cu 1 a r Cloning: A Laborator y Manual, Sambrookら、 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), 0. 1 % S D S及び 0. 1 mgZnil変性 DN A (鮭精巣 DNA, Boehringer Mannheim 社 製） を含むプレハイ ブリ ダィゼーシヨ ン溶液中で 4 2 °C， 4時間保温した。
上記の様にして標識した Q 1 9 7 Aプローブを含むハイ プリダイゼーショ ン溶 液 （5 0 %ホルムアミ ド， 5 X S S P E , 5 X Denhardt' s Solution, 0. 1 mg Zml変性 DNA (鲑精巣 DNA) ， 0. 1 % S D S ) 中で 4 2 °Cにて 1 6時間ハ イ ブリダィゼーシヨ ンを行なった。 フ ィルターを室温下に 0. 0 5 %S D Sを含 む 2 X S S Cで 1時間 2回洗浄し、 次いで 6 8 °Cで 0. 1 % S D Sを含む 1 x S S Cで 1時間 2回、 さらに 6 8でで 0. 1 % S D Sを含む 0. 2 X S S Cで 1時 間洗浄した後、 ォ一 卜ラジオグラフィ一で検出した。
その結果、 2 3個の陽性ファージクローンが得られた。 得られたファージクロ ーンのうち完全長 c D N Aを含むと思われるク口―ンについてヘルパーファ―ジ R 408を用いてブラスミ ドへの切出しを ZAP— c DNA SYNTHESIS KIT (St ratagene社製） 添付の処方に従って行なった。 得られたブラスミ ド p KP02 7 (図 2) についてクローン化 DN Αの塩基配列を Sequenase Version 2.0 (Unite d States B i o ch emi c a 1社製） を用いてジデォキシ · シーケンシング法にて調べた ところ、 配列番号 1 0に示す塩基配列が得られた。 また、 他のプラスミ ド p K P 02 1についてク口―ン化 D Ν Αの塩基配列を同様の方法で調べたところ、 配列 番号 1 0に示す塩基配列の内、 1 87 3番目の G (グァニン） が A (アデニン） に変化しており （従って 593番目の V a 1 (パリン） が Me t (メチォニン） に変化している） 、 配列の他の部分は p K PO 2 7のそれと同一であった。
これらの塩基配列およびそれらによりコ一 ドされているアミノ酸配列を Gen Ba nk Re 1.71により調査したところ、 塩基配列及びアミ ノ酸配列はいずれも新規で あることが確認された。
なお、 前記ブラスミ ド P KP02 7を含有する大腸菌は Escherichia coli JM1 09 (pKP027) 、 およびプラスミ ド ρ Κ Ρ 02 1を含有する大腸菌は Es che r i ch i a coli JM109 (pKP02l) と して工業技術院微生物工業技術研究所 （茨城県つくば市 東 1丁目 1番 3号） に、 各々、 平成 4年 1 0月 1 2日に微ェ研条寄第 4 0 2 9号 (F ERM B P - 4 029 ) 、 および平成 4年 1 1月 1 0日に微ェ研条寄第 4 0 7 1号 （F ERM B P - 40 7 1 ) としてブダぺス 卜条約に基き国際寄託さ れた。
実施例 9. p R VHK P 02 7ベクターの構築 （動物細胞用）
実施例 8で得られた p KP02 7を l OmM M g C 1 2 , 1 mM DTT, 1 0 OmM N a C 1 を含む 2 OmMトリス塩酸緩衝液 （pH7. 5) 中 37 °Cにて制限酵 素 E c 0 R I (宝酒造社製） で 2時間処理しエタノ一ル沈殿として DN Aを回収 し、 さらに 1 0 mM M g C 12 , 1 mM DTT, 1 00 mM KC 1 を含む 2 0 mM トリス塩酸緩衝液 （PH 8. 5) 中 37 °Cにて制限酵素 B am H I (宝酒造社製 ) で 2時間処理した後、 ァガロースゲル電気泳動を行ない 1. 8 kbp の DNA 断片を回収した。 ベクタ— H E F— 1 2 h— gァ 1 を上記と同様に制限酵素 E c 0 R I及び B a mH I にて処理した後アル力 リ フ ォ スフ ァ タ 一ゼ （宝酒造社製） を加えて 6 5 °C にて 2時間保温することにより脱リ ン酸してァガロースゲル電気泳動を行ない回 収した 8. 7 kbp DNAを先の 1 . 81cbp の DNA断片と混合後 6. 6 mM Mg C 1 , 5 mM DTT, 1 mM AT Pを含む 6 6 mMト リ ス塩酸緩衝液 （pH7. 5 ) 中 1 6 °Cにて T 4 DNAリガ一ゼを一晚反応させ、 これを大腸菌 J M 1 0 9 株に導入して P R VHK P 02 7を得た （図 3 ) 。
図 3に示されるごと く このプラスミ ドは E F 1 αプロモーター、 ヒ トイムノ グ ロブリ ン Η鎮定常領域遺伝子、 S V 4 0ェンハンサーブ口モータ—、 p B R 3 2 2由来の複製開始領域および/? -ラクタマ一ゼ遺伝子 （Am p r ) を含み E F 1 "プロモーターと ヒ 卜ィ ム ノ グロプリ ン H鎖定常領域遺伝子の間にヒ 卜 M e g - P OT c DNAの一部が接続されている。
なお、 前記ベクター H E F - 1 2 h - g 7 1 は次の様にして作製した。
ベクタ一 H E F— 1 2 h — g y i の構成要素である 2. 5 kbpの H E F— 1 プロモーター -ヱンハンサー領域は、 該遺伝子の 5 ' -末端に接する約 1 · 5 kb Pの D N A、 第一ェクソン中の 3 3 bp、 第一ィ ン トロン中の 9 4 3 bp、 及び第二 ェクソンの最初の部分の 1 0 bpから成る。 この 2. 5kbpの H i n d lll — E c o R I断片をブラスミ ド p E F 3 2 1 — C A T (D .W.K imら、 Gene 91 , 217 (199 0)；及び T. Uetsukiら、 J. Biol. Chem. 264. 5791 0989))から切り出し、 そし て p d K C Rベクタ一（M. Tsuchiyaら、 Emb。 J. 6 , 611 (1987))， K. 0' Hara ら、 Proc. Natl , Acad. Sci . USA 78_, 1527 ( 1981 ), (R. Fukunaga ら、 Proc. Natl . Acad. Sci . USA. i\ , 5086 ( 19 ))にクローニングして、 S V 4 0前期プ ロモ—ター—ェンハンサーを含有する約 3 0 0 bpの H i n d lll — E c o R I断 片と置き換えて P TE F - 1 を得た。
p TE F— 1 を E c o R I で消化し、 K l e n o wポリ メラーゼでフ ィ ルーィ ンし、 そして H i n d lll リ ンカーに連結した。 次に、 この修飾された p TE F — 1ベクター D N Aから約 1 . 6kbpの H i n d in - Sm a l断片を切り出し た。
h CMV— 1 2 h — g y i (Maedaら、 Hu議 Antibodies and Hybridomas 2 , 124 ( 1991 ) ； C. A. Ke 111 eb o r ou ghら、 Protein Engeneering 4 , 773 (1991 )) を E c o R Iにより部分消化し、 K 1 e n 0 wポリメラーゼによりフ ィル一ィ ン し、 そして自己連結することにより、 H CMV — 1 2 h — gァ 1からブラスミ ド H C MV - 1 2 h - g 7 1 (Δ Ε 2 ) を作製した。
プラ スミ ド H C M V — 1 2 h — gァ 1 (Δ Ε 2 ) を E c o R Iで消化し、 K 1 e n o wポリ メ ラーゼでフ ィルーイ ンし、 そして H i n d ll l で消化した。 ヒ 卜 a - I C領域をコ— ドする D N A配列を含有する約 7 kbpの断片を、 H E F - 1 "プロモータ一—ェンハンサ一を含有する前記の 1 . 6 kbp H i n d l l l 一 S m a I断片に連結して H E F - 1 2 h - g 7 1を得た。 このベクター中の H E F - l ff プロモータ一 'ェンハンサー領域は、 5 ' —領域に接する 3 8 01^の0 Aを除き、 p T E F — 1中のそれと同一であった。
実施例 1 0 . C 0 S細胞での巨核球増幅因子 （M e g - P 0 T) 遺伝子の発現 I C 0 S細胞を 1 X 1 0 7 個 Zmlになるように P B Sに懸濁し、 この細胞浮遊液 0 . 8 mi p R V H K P 0 2 7 1 0 gを加えた。 1 9 0 0 V、 2 5 /iF、 0 - 4 msecの条件で GenePulsar (BioRad社製） を用いて電気穿孔法（e 1 e c o p o r a t i 。n) によりプラスミ ドを C O S細胞に導入した。 室温にて 1 0分間の回復期間の 後、 エレク ト ロボレ一シヨ ンした細胞を 1 %ゥシ胎児血清を含む DuUecco' s Min imum Essential Me d i um( D M E M) ( G I B C O社製） 2 5 mlに加えた。 7 2時 間培養後、 培養上清を集めた。
こうして得られた C 0 S細胞の培養上清の一部をセン 卜リプレツプ— 1 0 (Am icon社製） で約 1 0倍に濃縮し、 S D S ZP A G Eにて分析した。 コン ト ロール として同様に無処理の C 0 S細胞およびベクターのみ導入した C 0 S細胞の培養 上清も同様にそれぞれ約 1 0倍に濃縮したものについても並べて泳動した。 ゲル 濃度は 1 2 %で、 Laemml iの方法 Nature, 11] ， 680 (1970)に従って泳動し、 一 枚は 2 D -銀染色試薬 · I I 「第一」 （第一化学薬品製） を用いて蛋白質を染色し た。
なお分子量マーカーはバイオラ ッ ド社製低分子量マ一力一 〔ホスホリ ラ一ゼ B ( 9 2 . 5 kd) 、 ゥシ血清アルブミ ン （ 6 6 . 2 kd) 、 オボアルブミ ン （ 4 5 . O kd) 、 炭酸脱水素酵素 （3 1 . O kd) , 大豆卜リブシンイ ンヒビター （2 1 . 5 kd) 、 リ ゾチーム （ 1 4 . 4 kd) 〕 を用いた。
もう一枚はゥヱスタ ンブロッ ト法により巨核球増幅因子を検出した。 このときの分子量マーカ一は、 バイオラッ ド社製プレスティ ン ド分子量マーカ — 〔ホスホ リ ラ一ゼ B (1 0 6. Okd) 、 ゥシ血清アルブミ ン （ 8 0. 0 kd) , オボアルブミ ン （ 4 9. 5 kd) 、 炭酸脱水素酵素 （3 2. 5 kd) 、 大豆トリプシ ンイ ンヒビタ一 （ 2 7. 5 kd) , リゾチーム （ 1 8. 5 kd) 〕 を用いた。 一次抗 体は、 HP C -Y 5の培養上清より精製した巨核球増幅因子の N末端配列分析よ り得られた配列をもとに合成した 1 8残基のぺプチドを抗原として家兎に免疫し て得たボリク口一ナル抗体を用いた。
その結果、 銀染色法により染色されたバン ドを 3者で比較したところ、 分子量 約 33， 000にみられたバン ドは巨核球増幅因子の遺伝子を導入した C 0 S細 胞の培養上清にのみ認められた。 さらに、 ウェスタ ンプロッ ト法でもこの分子量 約 3 3 , 0 0 0のバン ドのみ強く発色したことから、 このバン ドが組換え型巨核 球増幅因子であると考えられた。
実施例 1 1. C 0 S細胞の培養上清中の巨核球増幅因子 （M e g _ P 0 T) 活性 測定 I
実施例 1 0で得られた C 0 S細胞の培養上清の巨核球増幅因子活性を前述した 方法に従って測定した。 但し、 C 0 S細胞への遺伝子の導入刺激で、 その培養上 清中に I L - 6が誘導されることが知られているので、 測定はマウス I L - 6受 容体に対する抗体を添加した系で行った。
その結果、 表 2に示したように、 遺伝子を導入しなかった無処理の C 0 S細胞 の培養上清も M e g— P 0 Tの c DN Aを含まないベクタ一を導入した対照 C 0 S細胞の培養上清も巨核球増幅因子活性を示さなかったが、 Me g - POTの c DNAを含むベクタ—を導入した CO S細胞の培養上清は明らかに巨核球増幅因 子活性を示した。
[表 2 ] c o s細胞の培養上淸中の巨核球増幅因子活性
C O S細胞 巨核球増幅因子活性 a) 培養上清濃度 （％) 5 0 0. 5 0. 0 0 5 無処理 C 0 S 1 . 5 3 N D b 対照 C O S 0 2. 5 ND
Meg - POT cDNA 導入 C 0 S 8. 5 7 3. 5 a) 形成されたコロニー数から I L _ 3単独で形成されたコロニー数
(2 6. 5個） を引いた値。
b ) 測定せず。 実施例 1 2. C 0 S細胞の培養上清からの組換え型巨核球増幅因子 （Me g - P
OT) の精製 I
実施例 1 0で得られた C 0 S細胞の培養上清 3 5 0 mlに Twee n 2 0を終濃度が 0. 0 1 %になるように加え、 Amicon PM— 1 0 (Amicon社製） を用いた限外 濾過法により約 1 0倍濃縮した。 この濃縮液から以下の手順で組換え型巨核球増 幅因子 （M e g - P OT) を精製した。
( i ) 0. 0 1 %Tween 2 0を含む 1 0 mMトリス塩酸緩衝液 （pH8. 4 ) 、 1 0 1に対し前記濃縮液をー晚 4 °Cにて透析した後、 同緩衝液にて平衡化した DE A E - Sepharose fast flow カラム （2. 2 1 8 cm, Pharmacia 社製） に添加 した。 カラムを同緩衝液で洗浄後、 同緩衝液中、 N a C 1濃度を段階的に 0， 0 . 1 , 0. 1 5 , 0. 2 , 0. 5 Mと上げてカラムに吸着した蛋白質を溶出させ た。 得られた画分を S D SZP AG Eで分析した結果、 実施例 1 0で認めた分子 量約 3 3 , 0 0 0のバン ドは N a C 1濃度が 0. 1 Mの画分の前半部分にのみ検 出された。 この画分を集め、 次の逆相 H P L Cでの精製にかけた。
(ii) 上記画分に 1 0 %T F Aを加え pEを 3以下とした後、 0. 1 %TFAを 含む 24 %ァセ 卜二 ト リルで平衡化した Vydac C 4カラム （4. 6 x 2 5 0 nun) に添加し、 同溶離液にてカラムを洗浄後、 0. 1 %TF A中ァセ 卜二ト リル濃度 を 80分間に 24 ~ 64 %、 さらに 1 0分間に 8 0%まで直線的に上げてカラム に吸着した蛋白質を溶出させた。 流速は約 1 ml/miii で、 蛋白質の検出は 2 2 0 nmおよび 2 80 nmの二波長で行った。 得られたピークについて SD SZPAGE で分析した結果、 ァセ トニ ト リルの濃度で約 4 1 %に分子量約 33， 000のバ ン ドが認められた。 この画分を 0. 1 %T.F Aで希釈した後、 再び同条件で逆相 HPL Cを行い、 メイ ンピークを回収した。
実施例 1 3. 組換え型巨核球増幅因子 （Me g - POT) のァミ ノ酸配列分析 実施例 1 2で得られた組換え型 Me g - POTについて、 気相式ブロティ ンシ —クェンサ一 4 7 3 A型 （Applied B i o sy 2 s t ems社製） を用いて N末端ァミ ノ酸配
4
列分析を行った。 その結果、 以下に示す （a) 〜 （c) の 3種類の N末端ァミ ノ 酸配列が認められ実施例 1 0で認めた分子量約 33 , 000のバン ドが組換え型 巨核球増幅因子であることが確認された。
^ a ) Ser-Arg-Thr-Leu-Ala-Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-iiiu-Ala-Al -Pro-Leu-Asp- (配列番号 1 1 )
( b ) L eu-Ala-Gl -Glu-Thr-Gl y-Gln-Glu-A la-Ala-Pro-L eu-Asp-Gly-Va 1 -Leu- Ala -A sn-Pro-Pro-X aa-Ile-Ser-X aa-Leu- aa-Pro -A rg-
C c ) Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Ala-Ala-Pro-Leu-Asp-Gly-Val-Leu-Ala-Asn-
Pro-Pro-Xaa-Ile-Ser-Xaa-Leu-Xaa-Pro-Arg-Gln-Leu- これらの内、 （b) および （c) は実施例 4 ( i ) における、 HP C— Y 5細 胞の培養上清からのポリペプチドの配列- 1 (配列番号： 1 ) および配列- 3 ( 配列番号： 3) にそれぞれ対応する。
また、 組換え型 Me g— POTに 1 0 mg/mlの臭化シアンを含む 70 %ギ酸溶 液 1 00 1 を加え、 室温にて 24時間臭化シアン分解した後、 遠心濃縮機にて 過剰の試薬を除いた。 その残渣を 0. 1 %T F A 1 mlに溶解し、 0. 1 % TF Aで平衡化した Vydac C 4カラム （ 4. 6 x 2 5 0 mm) に添加し、 0. 1 %TF A中、 ァセトニ 卜 リル濃度を 40分間に 80 %まで直線的に上げ、 カラムに吸着 O s
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± 3 P C^ Π H Y 5<— 瞎A^髒 g ¾f 7^ ¾¾r?eV ^ 73A7.C/い V M Va I . i , 実施例 9で得られた P RVHK P 02 7を l OmM Mg C l 2 , 1 mM DTT , 1 0 0 mM K C 1 を含む 2 0 mM卜 リ ス塩酸緩衝液 （pH8. 5 ) 中 3 7 °Cにて制 限酵素 B a mH I (宝酒造社製） で 2時間処理した後エタ ノ ール沈殿と して D N Aを回収した。 次に 5 mM M g C 1 2 , 1 0 mM DTT, 1 mMの d A T P， d C TP , d G T P , d TT Pを含む 2 OmMト リ ス塩酸緩衝液 （pH7. 4 ) 中 1 0 °C にて D N Aボリ メラーゼの K 1 e n ow断片で 1時間処理し末端を平滑化した。
エタ ノ ール沈殿と してこの DNAを回収し、 次いで 1 OmM M g C 1 2 , 1 mM D T T , 1 0 OmM N a C 1 を含む 5 0 mMト リ ス塩酸緩衝液 （PH7. 5 ) 中 3 7 °Cにて制限酵素 S a 1 I (東洋紡社製） で 2時間処理し、 アルカ リ フォスファ ターゼ （宝酒造社製） を加えて 6 5 °Cにて 2時間保温することにより脱リ ン酸し てァガロースゲル電気泳動を行ない 8. 5Kbp の DNA断片を回収した。 この 8 . 5 Kbp の D N A断片と先の 1 . 3Kbp の DN A断片とを混合した後、 6. 6 mM M g C 1 2 , 5 mM DTT, 1 mM AT Pを含む 6 6 mMト リ ス塩酸緩衝液 （pH 7. 5 ) 中 1 6 °Cにて T 4 DN Aリガーゼを一晚反応させ、 これを大腸菌 J M 1 0 9株に導入して p R V H K P 02 7 f を得た （図 4 ) 。
なお P R VHK P 02 7 f は、 図 4に示されるごと く、 E F 1 プロモータ一 、 ヒ 卜ィ 厶ノ グロブリ ン H鎮定常領域遺伝子、 S V 4 0ェンハンサーブ口モータ 一、 p B R 3 2 2由来の複製開始領域および/? -ラクタマーゼ遺伝子 （Am p r ) を含み、 ヒ 卜 M e g— P OT c DNAは E F 1 "プロモータ一と ヒ トイムノ グ ロブリ ン H鎖定常領域遺伝子の間に接続されている。
実施例 1 5. C 0 S細胞での巨核球増幅遺伝子 （M e g - P 0 T) 遺伝子の
発現 II
C O S細胞を 1 X 1 07 個 Zmlになるように P B Sに懸濁し、 この細胞浮遊液 0. 8 mlに p R VHK P 02 7 f 1 0 μ gを加えた。 1 9 0 0 V, 2 5 uFD 0 . 4msecの条件で GenePulsar (BicEad社製） を用いて電気穿孔法 （ e 1 e c t r o p o r a t ion)により プラスミ ドを C 0 S細胞に導入した。 室温にて 1 0分間の回復期間の 後、 エレク ト ロボレーシヨ ンした細胞を 1 %ゥシ胎児血淸を含む Dulbecco' s in imum Essential Me d i um(DMEM) (GIBCO社製） 2 5mlに加えた。 7 2時間培養後、 培養上清を集めた。
こう して得られた C 0 S細胞の培養上清の一部をセン 卜 リ ブレップ— 1 0 (Am icon社製） で約 1 0倍に濃縮し、 S D SZP AG Eにて分析した。 コ ン トロール と してべクタ—のみ導入した C O S細胞の培養上清も同様にそれぞれ約 1 0倍に 濃縮したものについて並べて泳動した。 ゲル濃度は 1 2 %で、 Laeminli の方法 Na ture, 227 , 680 ( 1970 ) に従って泳動し、 一枚は 2 D -銀染色試薬 · II 「第 1」 (第 1化学薬品製） を用いて蛋白質を染色した。
』なお分子量マーカ—はバイオラッ ド社製低分子量マ一力一 〔ホスホリラ一ゼ B (9 2. 5 kd) 、 ゥシ血清アルブミ ン （6 6. 2 led) 、 オボアルブミン （4 5. Okd) 、 炭酸脱水素酵素 （3 1 . Okd) 、 大豆卜リブシンイ ンヒビタ一 （2 1 . 5 led) 、 リゾチーム （1 4. 4 kd) 〕 を用いた。
もう一枚はゥエスタ ンブロ ッ ト法によ り巨核球増幅因子を検出した。
このときの分子量マーカ一は、 バイオラッ ド社製プレスティン ド分子量マーカ - 〔ホスホリ ラ一ゼ B ( 1 0 6. Okd) 、 ゥシ血清アルブミ ン （8 0. Okd) 、 オボアルブミ ン （4 9. 5kd) 、 炭酸脱水素酵素 （3 2. 5 ) 、 大豆トリブシ ンイ ン ヒ ビタ一 （2 7. 5U) 、 リゾチ一厶 （1 8. 5 kd) 〕 を用いた。 一次抗 体は、 H P C - Y 5の培養上清より精製した巨核球増幅因子の N末端配列分析よ り得られた配列をもとに合成した 1 8残基のぺプチドを抗原として家兎に免疫し て得たポリクロ一ナル抗体を用いた。
その結果、 銀染色法により染色されたバン ドを両者で比較したところ、 分子量 約 3 3， 0 0 0にみられたバン ドは巨核球増幅因子の遺伝子を導入した C 0 S細 胞の培養上清にのみ認められた。 さらに、 ウェスタンプロッ ト法でもこの分子量 約 3 3 , 0 0 0のバン ドのみ強く発色したことから、 このバン ドが組換え型巨核 球増幅因子であると考えられた。
実施例 1 6. C 0 S細胞の培養上清中の巨核球増幅因子 （M e g - P OT)
活性測定 11
実施例 1 5で得られた C O S細胞の培養上清の巨核球増幅因子活性を前述した 方法に従って測定した。 但し、 C 0 S細胞への遺伝子の導入刺激で、 その培養上 清中に I L - 6が誘導されることが知られているので、 測定はマウス I L - 6受 容体に対する抗体を添加した糸で行った。
その結果、 表 4に示したように、 遺伝子を導入しなかった無処理の C O S細胞 の培養上清も M e g— P OTの c D N Aを含まないベクターを導入した対照 C O S細胞の培養上清も巨核球増幅因子活性を示さなかったが、 M e g - P OTの c DNAを含むベクタ一を導入した C O S細胞の培養上清は明らかに巨核球増幅因 子活性を示した。 4 ]
C 0 S細胞の培養上清中の巨核球増幅因子活性
C O S細胞 巨核球増幅因子活性 " 培養上清濃度 （％) 2 0. 2 0. 0 2 0. 0 0 2 無処理 C 0 S 0 N D h> N D N D
対照 co s 2 N D N D N D
Meg-POT cDNA 導入 C 0 S 7 4 7 1 a) 形成されたコロニー数から I L一 3単独で形成されたコロニー数
( 1 0個） を引いた値。
b) 測定せず。 実施例 1 7. C 0 S細胞の培養上清からの組換え型巨核球増幅因子 （M e g
- P O T) の精製 11
実施例 1 5で得られた C O S細胞の培養上清 3 5 0 mlに Tween 2 0を終濃度が 0. 0 1 %になるように加え、 Amicon PM - 1 0 (Amicon社製） を用いた限外 濾過法により約 1 0倍濃縮した。 この濃縮液から以下の手順で組換え型巨核球増 幅因子 （M e g— P OT) を精製した。
C i ) 0. 0 1 %Tween 2 0を含む 1 0 mM卜リス塩酸緩衝液 （pH8. 4 ) 、 1 0 1に対し前記濃縮液をー晚 4 °Cにて透析した後、 同緩衝液にて平衡化した D E A E - Sepharose fast flow カラム （2. 2 x 1 8 cm, Pharmacia 社製） に添カ卩 した。 カラムを同緩衝液で洗浄後、 同緩衝液中、 N a C 1濃度を段階的に 0， 0 . 1， 0. 1 5， 0. 2 , 0. 5 Mと上げてカラムに吸着した蛋白質を溶出させ た。 得られた画分を S D S/P AGEで分析した結果、 実施例 1 5で認めた分子 量約 33 , 000のバン ドは N a C 1濃度が 0. 1 Mの画分に検出され、 この画 分を次の逆相 H PL Cでの精製にかけた。
(ii) 上記画分に 1 0%TF Aを加え pHを 3以下とした後、 0. 1 %TFAを 含む 24 %ァセ トニ ト リルで平衡化した Vydac C 4カラム （4. 6 x 2 5 0 mm) に添加し、 同溶離液にてカラムを洗浄後、 0. 1 %TF A中ァセ卜二トリル濃度 を 80分間に 2 4〜 64 %、 さらに 1 0分間に 80 %まで直線的に上げてカラム に吸着した蛋白質を溶出させた。 流速は約 1 inlZmin で、 蛋白質の検出は 2 20 nmおよび 280 nmの二波長で行った。 得られたピークについて SD S/PAGE で分析した結果、 ァセトニト リルの濃度で約 4 1 %に分子量約 33， 000のバ ン ドが認められた。 この画分を 0. 1 %TFAで希釈した後、 再び同条件で逆相 HP L Cを行い、 メインピークを回収した。
実施例 1 8. 精製組換え型 M e g - P OTの巨核球増幅因子活性測定
実施例 1 7で精製された組換え型巨核球増幅因子 （Me g - POT) を 1 0% ゥマ血清を含む Iscove' s Modified Du lbecco' s培養液 （ I MDM) で所定濃度 （
50. 1 , 3. 1， 0. 2 ng/ral) に希釈した被検検体 0. 1ml, ゥマ血清 （5
6 °C 30分処理、 Biocell 社製） 0. 2ml、 マウス （C 5 7 B LZ6 N系雄性 、 6 ~ 1 2週齢） 大腿骨骨髄細胞浮遊液 0. 1 ml ( 2 X 1 05 有核細胞） 、 組換 え型マウス I L— 3を 5 ngZmlを含む I MDM 0. 2 ml, および寒天を 0. 7 5 %含む改変 McCoy's 5 A培養液 0. 4 mlを混合した。 次いで、 これらを直径 3 5 nunの組織培養ブラスチックディ ッシュに入れて固まらせたのち、 37°C、 5 % 炭酸ガス Z95 %空気、 1 0 0 %湿度の条件で培養を行った。
培養 6日目に寒天層ごとスライ ドガラス上に取出し乾燥させ、 フィルム状標本 と したものを 5 %グルタルアルデヒ ドで固定し、 Nakeif らの方法 （Proc. Soc. E p. Biol . Med. 151 587 1976)にしたがって、 アセチルコ リ ンエステラーゼで染 色し、 巨核球コロニー数の算定を行った。 この際、 アセチルコ リ ンエステラーゼ 染色陽性細胞を 4個以上含む集塊を巨核球コロニーとした （コロニーの検鏡は 4 0倍の倍率で行なった） 。
なお、 巨核球増幅因子活性は、 組換え型 Me g - POTを添加して生じた巨核 球コロニー数と組換え型 M e g― POT無添加 （1 0%ゥマ血清を含む I MDM のみ添加） で組換え型 I L - 3単独で生じた巨核球コロニー数との差を指標とし た。
その結果、 表 5に示したように、 精製組換え型 Me g - POTは巨核球増幅因 子活性を示した。
ほ 5] 精製組換え型 M e g - P O Tの巨核球増幅因子活性
M e - Ρ 0 T濃度 巨核球増幅因子活性
(n g/m 1 ) a)
5 0. 1 9. 5
3. 1 8. 5
0. 2 3 a ) アミノ酸分析法により測定。 b) 形成されたコロニー数から I L _ 3単独で形成
されたコロニー数 （1 9. 5) を引いた値。 実施例 1 9. 巨核球増幅因子 （Me g - POT) をコ— ドする遺伝子の試験管内 転写翻訳
実施例 8で得られた P KP02 7を l OmM M g C 12 , 1 mM DTT, 1 0 Oni K C 1 を含む 2 OmMトリス塩酸緩衝液 （pH8. 5 ) 中 3 7 °Cにて制限酵素 X h 0 I (東洋紡社製） で 2時間処理し、 次いでァガロースゲル電気泳動を行な い、 1. 9 Kb の DN A断片を回収した。 ベクタ一 p C I TE _ 2 c (Novagen 社製） を 1 0mM M g C 12 , 1 mM DTT, 1 00 mM K C 1 を含む 20 raM卜 リ ス塩酸緩衝液 （PH 8. 5) 中 3 7。Cにて制限酵素 X h o I (東洋紡社製） で 2 時間処理した後アル力 リ フォスファタ一ゼ （宝酒造社製） を加えて 65°Cにて 2 時間保温することにより脱リン酸して得られた DN Aをフヱノ一ル処理を行なう ことにより精製した。 これと先の 1. 9Kbp の DNA断片と混合後、 6. 6raM M g C 1 2 , 5 mM D T T , 1 m ATPを含む 6 6 mMトリス塩酸緩衝液 （pH7 . 5) 中 1 6°Cにて T 4 DNAリガーゼをー晚反応させ、 大腸菌 J M 1 09株に 導入して p C I TE · KPO 2 7を得た （図 5) 。
P C I TE . K P02 7を 1 0mM M g C 12 , 1 mM D Τ Τを含む 1 0 mM T r i s - H C 1 (pH7. 5) 中 3 7 °Cにて制限酵素 N a e I (東洋紡社製） で 2時間処理した後、 DNAをフエ ノ ール処理を行なうことによ り精製した。 この 铸型 DN Aに 2mM spermidine, 6 mM M g C 12 ， 1 0 mM N a C 1 , 1単位 / μ 1 RNasin ribonuclease i nh i b i t o r (Pr ome ga¾fc¾) 、 0. 5mMの ATP, G TP, CTP， UTPを含む 4 OmMトリス塩酸緩衝液 （pH7. 5) 中 37°Cにて T 7 RNA P 0 1 y m e r a s eを反応させて転写を行なった。 これをフエ ノ ール処理を行なうことにより精製し、 ェタ ノ ール沈殿として RNAを回収した 。 つづいて Red Nova Lysate (Novagen社製） を用いて35 S—メチォニンを含む標 識体として RN Aを翻訳させた。 この反応物を SDSポリアクリルアミ ドゲル電 気泳動にかけ、 オー トラジオグラフィ 一をとつたところ約 70 , 000の分子量 のバン ドが認められた。
実施例 20. pMB PKPO 2 7ベクターの構築 （大腸菌用）
実施例 8で得られた P KP02 7を 1 0mM M g C 12 , 1 mM DTT, 1 0 OmM KC 1 を含む 2 OmM卜 リ ス塩酸緩衝液 （pH8. 5 ) 中 37 °Cにて制限酵素 X h 0 I (東洋紡社製） で 2時間処理しエタノール沈殿として DNAを回収し、 5 mM M g C 12 , 1 OmM DTT, 1 mMの d ATP, d CTP, d G T P , d TTPを含む 2 OmMトリス塩酸緩衝液 （pH7. 4 ) 中 1 0。Cにて D N Aポリメラ ーゼの K 1 e n 断片で 1時間処理し末端を平滑化した。 次いでァガロースゲル電気 泳動を行ない、 1. 9Kbp の DNA断片を回収した。
ベクタ一 pMAL— c (New England BioLabs社製） を l OmM M g C 12 , 1 mM DTT , 5 OmM N a C を含む 20 mM卜 リ ス塩酸緩衝液 （PH 7. 5) 中 3 7 °Cにて制限酵素 S t u Iで 2時間処理した後アル力 リ フォスファタ—ゼ （宝酒 造社製） を加えて 6 5 °Cにて 2時間保温することにより脱リン酸した。 DNAを フエ ノール処理を行なうことにより除蛋白し、 エタノール沈澱として回収した。 これと先の 1 . 9Kbp の DN A断片と混合後 6. 6 m M g C 1 2 , 5 m D TT, 1 mM A T Pを含む 6 6 mM卜リ ス塩酸緩衝液 （pH 7. 5 ) 中 1 6 °Cにて T 4 DN Αリガ—ゼをー晚反応させ、 これを大腸菌 J M 1 0 9株に導入して p M B PK P 02 7を得た （図 6) 。 図 6に示されるごと くこのプラスミ ドは発現ュ ニッ トと して t a c プロモーターの下流にマルト一ス結合蛋白質 （MB P) 遺伝 子 （m a l E A 2 — 2 6) 、 Factor X aの認識配列および M e g - P OTの 3 4番めのァミ ノ酸 S e r以降の c DNAがフレームが一致するように接続されて いる。
実施例 2 1. 大腸菌 J M 1 0 9株での融合蛋白質の発現
実施例 2 0において pMB PK P O 2 7で形質転換した大腸菌を 5 O ugZnilの アン ピシリ ンおよび 0. 2 %グルコースを含む L B培地 5ml中で 3 7 °Cにて 1 6 時間培養し、 この培養液41111を 5
Figure imgf000034_0001
のァンピシリ ンぉょび0 . 2 %ダルコ ースを含む L B培地 4 0 Omlに加えた。 3 7 °Cにて約 2時間培養後、 0. 3 mMに なるようにィソプロピル— 5 _ D—チォガラク トシドを加えさらに 3,時間培養を 続けた。 この培養菌体を実施例 1 0と同様に S D Sポリアク リルアミ ド電気泳動 にかけ、 上記抗 M e g - P OTぺプチド血清または抗 MB P血清によるウェスタ ンブロッティ ングをおこなったところ MB Pと M e g - P O Tの融合蛋白質の発 現が確認された。
発現された組換え型巨核球増幅因子 （Me g _ P OT) を菌体より下記のとお り精製した。
10mM E DTAを含む 20mM 卜リス塩酸緩衝液 （pH 7.5) 中、 超音波処理 （20 分間） によ り破砕した懸濁液を遠心操作 （10,00flrpm x 30min, 4 °C, SA 600口 —夕—、 Sorvall社製） にかけ、 集めた沈澱を蒸留水に懸濁した。 懸濁液を再び 遠心操作 （ 10 , 000 g X 90min) にかけ、 集めた沈澱を 1 % 2 — メルカブトエタノ —ル（2- ME)及び 8 M尿素を含む 25mM トリス塩酸緩衝液 （pH 8.0) に溶解し、 再 び遠心操作（35 , 000 rpm x 6 Omi n)を行い不溶物を除去した後、 10mM 2 -ME, lOmM E DTA, OmM NaClを含む lOmM トリス塩酸緩衝液（pH 8.0)で 2倍希釈した。 この溶 液を同緩衝液にて平衡化したアミロースカラム （75ml，BioLabs社製） に添加し、 同緩衝液にてカラムを洗浄した。 10mM マル ト一スを含む同緩衝液にてカラムに 結合している蛋白を溶出させた。 この画分を Factor Xa の消化緩衝液である 2 mM CaCl2及び 150mM NaClを含む 20mM 卜リス塩酸緩衝液（pH 7. Oに対して透析した 。 透析内液に Factor Xaを加え、 37° Cで 16時間酵素消化した。 反応液を、 メ ンブ ラ ンフ ィ ルタ一 PM— 1 0 (アミコン社製） にて濃縮後、 上記ァミロ一スカラム の平衡化緩衝液で平衡化した P D一 1 0 カラムに通した後、 再びァミロースカラ ムに添加し、 同緩衝液にてカラムを洗浄して、 素通り画分及び洗浄画分を集めた 。 セン ト リ ブレッ プ一 1 0にて上記画分を濃縮した。
このように して得た組換え型巨核球増幅因子を、 F r e u n dの完全アジュバ ン ドとともに家兎に 2週間ごとに 5回感作した。 最終感作後 1 0日目に、 けい動 脈より全採血し、 抗巨核球増幅因子抗血清を得た。
実施例 2 2 . p E F D K P O f ベクタ—の構築 （動物細胞用）
P K P 0 2 7を 1 0 mM M g C 1 2 , 1 m DTT , 1 0 0 mM K C 1 を含む 2 OmM卜リ ス塩酸緩衝液 （pH8 . 5 ) 中 3 7 °Cにて制限酵素 E c o R I、 B a m H I (宝酒造社製） で処理した後、 ァガロースゲル電気泳動を行い 1 . 8 k b p の D N A断片を回収した。
ベクター D H F R-厶 E- R V hを E c 0 R I、 B a m H Iにて同様に処理した 後、 アルカ リ フォスファターゼ （宝酒造社製） で 6 0 °C、 2時間処理することに より脱リン酸してァガロースゲル電気泳動を行ない回収した 7 k b p DN Aを先 の 1 . 8 k b pの DN A断片と連結させ p E F DK P 0 5 ' を得た。
これを 1 0 mM M g C l 2、 1 mM D TT、 1 0 0 mM K C 1 を含む 2 0 mMトリ ス塩酸緩衝液（p H 8 . 5 ) 中 3 7 °Cにて制限酵素 B a mH I処理した後、 6 . 7 mM M g C l 2、 1 6 . 6 mM(N H 4) 2 S O " 1 0 mM 2 —メルカプトエタ ノ —ル、 6 . 7 mM E D TA、 3 3 0mM d N T Pを含む 6 7 mMトリス緩衝液中 3 7 °C、 5分間 T 4 DN Aポリメラ一ゼで処理し末端を平滑化した。 さらに K p n I リ ンカ一 （Am e r s h a m社製） と連結し p E F D K P O 5 ' Kを得た。 新 たに Ρ Κ Ρ 0 2 7を 1 0 mM M g C l 2、 1 mM D TT、 1 0 0 mM K C 1 を含 む 2 OmM卜 リ ス塩酸緩衝液（p H 8 . 5 ) 中 3 7 °Cにて制限酵素 X h o I で切断 後、 6. 7 mM M g C l 2、 1 6. 6 mM(N H 4) 2 S O 4、 1 O mM 2 —メルカプ 卜エタ ノール、 6 . 7 mM E D TA、 3 3 0 mM d N T Pを含む 6 7 mMトリス緩 衝液中 3 7 °C、 5分間 T 4 D N Aポリメラーゼで処理し末端を平滑化した。 これ をさらに 1 O mM M g C l 2、 1 mM DTT、 1 0 0 mM （： 1 を含む5 01111¾1 卜 リス塩酸緩衝液（P H 7. 5) 中 3 7°Cにて制限酵素 S a 1 Iで処理しァガロ 一スゲル電気泳動を行い 1. 3 k b pの DNA断片を回収した。 ベクタ一 p CD M 8 ( I n V i t r o g e n社製） を 1 0 mM M g C 1 2、 1 mM D T T、 1 0 OmM K C 1 を含む 2 0 mMト リ ス塩酸緩衝液（p H 8. 5) 中 3 7 °Cにて制限酵 素 X h 0 Iで処理した後さらに 1 OmM M g C I 2、 1 mM DTT、 1 00 mM K C 1 を含む 2 OmM卜 リ ス塩酸緩衝液（P H 8. 5 ) 中 3 7 °Cにて制限酵素 H p a Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動を行ない回収した 3. 3 k b p DNAを先 の 1. 3 k b pの DNA断片と連結し p CDMKP O 3 ' を得た。 p E FDKP 05' Kと p CDMKPO 3' を 1 0 raM M g C 12、 1 mM DTTを含む 1 0m M卜 リス塩酸緩衝液（p H 7. 5) 中 3 7。Cにて制限酵素 K p n Iで処理しァガロ —スゲル電気泳動を行ない、 それぞれ 1 0 k b p、 0. 9 k b pの断片を回収 3 して、 これらを連結し p E FDK P 0 ίを得た （図 7) 。 図に示されるごと く こ のブラスミ ドはジヒ ドロ葉酸還元酵素遺伝子 （d h f r ) を含み EF 1 なプロモ —ターと S V 4 0 p o 】 y Aシグナルの間にヒ 卜 Me g— POT c DN Aが接 銃されている。
なお、 前記ベクター D H FR -A E - RVhは国際公開 WO 92 / 1 9 7 5 9 号公報に記載の D H FR— Δ Ε— PMh— gァ 1及び R V h - PM 1 f - 4を用 いて次の様に作製した。
DHFR— Δ Ε— PMh— gァ 1及び RV h— PMl f — 4を 1 OmM M g C I 2、 1 mM DTT、 1 00 mM KC 1、 0. 0 1 % B S Aを含む 2 0 mMト リ ス塩酸緩衝液（P H 8. 5 ) 中 3 7 °Cにて制限酵素 P V u I , B a mH I (宝酒 造社製） で処理しァガロースゲル電気泳動を行い 4 k b p、 3 k b pの断片を回 収して、 これらを連結することによ り DHFR— Δ Ε— RV hを作製した。
実施例 2 3. C H 0細胞での巨核球増幅因子 （M e g - P 0 T) 遺伝子の発現 C H 0細胞 D X B— 1 1を 1 X 1 07 個/ m 1になるように p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e (PB S) に懸濁し、 この細胞浮遊液 0. 8 m 1に p E F D K P 0 ίを 1 0 g加えた。 1 900 V、 25/iFの条件で G e n e P u l s a r (B i o R a d社製） を用いて電気穿孔法 （ e 1 e c t r o p o r a t i o n) によりブラスミ ドを C H O細胞に導入した。 室温にて 1 0 分間の回復期間の後、 エレク ト口ポレーシヨ ンした細胞を 1 0%ゥシ胎児血清を 含む" -MEM培地 （G I B C O社製） 2 5 m 1に加えた。 3 7 °C , 2 4時間培 養後、 トリプシン処理にて回収した細胞を 1 0 0倍に希釈し、 1 0 %ゥシ胎児血 清添加リボヌクレオシド及びデォキシリボヌク レオシド非含有な - Μ Ε M培地 （ G I B C O社製） で 3週間培養した。 この時 3〜 4日に一度の割合で培地交換を 行った。 コロニーが肉眼で確認できるまでに成長したのでクローンを拾い、 クロ ―ン毎に培養を続けた。 その後、 先の培地に m e t h o t r e x a t e (MTX ) (S i g m a社製） を添加し、 選択培養を続けた。 一次選択時の MTX濃度は 1 0 n Mとし、 得られた耐性ク口一ンに対して MTX濃度 5 0 n Mの培地で二次 選択を行った。 最終的に得られたクローンを 5 0 n M MTX及び 2 % F C Sを 含む I MDM培地 （G I B C 0社製） にて大量培養し、 その培養上清を精製に供 した。
培養上清を S D SZP A G Eにて分析し、 N末近傍の合成べプチドを抗原とし て作製した抗体を用いたウェスタ ンブロッテイ ング法により M e g — P O Tを検 出した。 なお、 分子量マーカ一としては、 実施例 1 5に示すバイオラッ ド社製プ レスティ ン ド分子量マーカ一を使用した。 図 8に示すように、 分子量約 3 3 k d 、 3 0 k d、 2 7 . 5 k dに 3本のバン ドが検出された。
実施例 2 4 · C H O細胞の培養上清からの組換え型巨核球増幅因子 （M e g - P 0 Tの精製 I
実施例 2 3で調製した C H O細胞の培養上清 1 0 ί に Tween 2 0を、 終濃度が 0 . 0 1 %になるよ うに加え、 5 mのメ ンブラ ンフ ィルタ一 （富士フ イルム社 製） を通して不溶物を除去した。 この培養上清から以下の手順により組換え型巨 核球増幅因子を精製した。
( i ) 上記培養上清を 0. 0 1 % Tween 2 0及び 0 . 2 M N a C 1 を含 む 5 0 mMトリス塩酸緩衝液 （P H 8 ) で平衡化した B l e - S e p h a r o s e f a s t f l o wカラム 、 5 . 0 x 2 0 c m、 P h a r m a c i a社 製）に添加した。 カラムを同緩衝液で洗浄した後、 0 . 0 1 % Tween 2 0及び 2 M K C 1 を含む 5 0 mMトリ ス塩酸緩衝液 （p H 9 ) でカラムに吸着した蛋 白を溶出させた。 この画分を集め、 ミニタン （m i 1 1 i p 0 r e社製） にて濃 縮し、 0 . 0 1 % Tween 2 0を含む 2 0 mM酢酸緩衝液 （p H 5 ) を加えて 希釈する操作を繰り返し脱塩した後、 生じた不溶物を遠心操作 （1 0， 0 0 0 r P m x 3 0 m i n ) により除去した。 上清を次のカチオン交換クロマ トグラフ ィ 一での精製にかけた。
( ϋ ) 0 . 0 1 % Tween 2 0を含む 2 0 mM酢酸緩衝液 （ p H 5 ) で平 衡ィ匕した S — S e p h a r o s e f a s t f l o wカラム （ 5 - 0 x 1 2 c ni) に上記画分を添加し、 同緩衝液にてカラムを洗浄した後、 同緩衝液中、 N a C 1濃度を 0 . 1、 0 . 2、 0 . 3、 0 . 5 Mと上げてカラムに吸着したタンパ ク質を溶出させた。
(iii) 組換え型 M e g — P O Tを含む 0 . 1 M N a C l画分を、 あらかじ め 0 . 1 %T F Aを含む 2 4 %ァセ トニ ト リルで平衡化した V y d a c C 4 力 ラム （ 1 0 x 2 5 0 mm) に添加し、 同溶離液にてカラムを洗浄した後、 0 . 1 %T F A中ァセ トニ 卜 リル濃度を 4 8分間に 2 4 - 4 8 %まで直線的に上げて力 ラムに吸着したタ ンパク質を溶出させた。 流速は 1 m 1 /m i nで、 タンパク質 の検出は 2 2 0 n m及び 2 8 0 n mの二波長で行った。 ァセ トニ ト リル濃度が 4 0〜 4 5 %の組換え型 M e g - P 0 Tを含む画分を集め、 次の G e l P e r m e a t i o n C h r o m a t o g r a p h yに力 丁た。
(iv) 組換え型 M e g — P O Tを含む画分を 0 . 0 1 %T F Aを含む 4 0 % ァセ 卜二 卜 リルで平衡化した T S K g e 1 G 3 0 0 0 SWカラム （ 2 1 . 5 x 6 0 c m) に添加した。 流速は 3 m 1 Zm i nでタンパク質の検出は 2 8 0 n m で行った。 3 7〜 4 4分に溶出された主要ピークを集め、 0 . 1 %T F Aにて希 釈後、 （Hi) と同条件にて逆相 H P L Cを行い主要ピークを回収した。
こう して得られた組換え型巨核球増幅因子 （M e g - P O T) を S D S P A G Eにて分析した。 ゲル濃度は 1 2 %で、 L a e mm 1 i の方法 N a t u r e , 2 2 7 , 6 8 0 ( 1 9 7 0 ) に従って泳動し、 2 D -銀染色試薬 · 「第一」 （第 一化学薬品製） を用いてタンパク質を染色した。 なお分子量マーカ一はバイオラ ッ ド社製低分子量マーカ— [ホスホリ ラ一ゼ Β ( 9 2 . 5 k d ) 、 ゥシ血清アル ブミ ン （ 6 6 . 2 k d ) 、 オボアルブミ ン （ 4 5 · 0 k d ) 、 炭酸脱水素酵素 （ 3 1 . 0 k d ) 、 大豆卜 リ ブシンイ ンヒ ビター （ 2 1 . 5 k d ) , リ ゾチーム （ 1 4 . 4 k d ) ] を用いた。
その結果、 精製された組換え型 M e g - P O Tは分子量約 3 3 , 0 0 0に単一 バン トを与えた。 実施例 2 5. 組換え型巨核球増幅因子 （Me g - POT) の N末端及び C末端 ァミ ノ酸配列分析
( i ) 実施例 2 4で得られた組換え型 Me g - POTについて、 気相式プロ ティ ン シークェンサ一 4 7 6 A型 （A p p l i e d B i o s y s t e m s社製 ) を用いて N末端アミ ノ酸配列分析を行った。 その結果、 以下に示す （a) 〜 （ c ) の 3種類の N末端アミノ酸配列が認められた。
(a) Ser-Arg-Thr-Leu-Ala-Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Ala-Ala- - · · ·
( b ) Leu-Ala-Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-A la-Ala-Pro-Leu-Asp- - · · ·
(c) Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Ala-Ala-Pro-Leu-Asp-Gly-Val- - · · · これらの配列は実施例 1 3における、 配列 （a) ~ (c) に対応する。
(ii) 組換え型 Me g - POTの C末端アミノ酸配列分析を行った。
組换ぇ型 M e g— POTに 1 0m g/m 1の臭化シアンを含む 70 %ギ酸溶液 1 00；« 1 を加え、 室温にて 24時間昊化シアン分解した後、 遠心濃縮機にて過 剰の試薬を除いた。 その残渣を 0. 1 %TFAに溶解し、 0. 1 %TFA中で平 衡化した V y d a c C 4カラム （4. 6 x 2 5 0 m m ) に添加し、 0. 1 %T F Α中ァセ 卜二トリル濃度を 40分間に 80 %まで直線的に上げ、 力ラムに吸着 した臭化シアン断片を溶出させた。 得られた 2本のピークのうち、 C末ペプチド 断片について更に E n d o A s p - N消化した。 C末ペプチドを 5 0 mMリ ン酸緩衝液 （P H 8. 0) に溶解し、 E n d 0 A s p— N を加え、 室温に て 1 6時間酵素消化した。 反応液に 1 0 %TF Aを加え p Hを 3とした後、 0. 1 %T F Aで平衡化した V y d a c C I 8カラムに添加し、 ァセトニト リル濃 度を 4 8分間に 0 ~ 4 8 %に直線的に上げカラムに吸着したぺプチ ドを溶出させ た。 得られた断片を気相式プロティンシークェンサ一 4 7 6 A型にて分析した結 果、 C末断片のァミノ酸配列は以下に示す如くであった。
As -Pro-Ser-Trp-Arg-Gln-Pro-Glu-Arg 実施例 2 6. C H 0細胞の培養上清中の巨核球増幅因子 （M e g - P 0 T)
活性の測定
実施例 2 3で得られた C HO細胞の培養上清及び、 実施例 24で精製した組換 え型巨核球増幅因子の巨核球増幅因子活性を前述した方法に従って測定した。 その結果表 6に示したように、 巨核球増幅因子の c D N Aを含むべクタ一を導 入した C H O細胞の培養上清は明らかに巨核球増幅因子活性を示し、 それより精 製した組換え型巨核球増幅因子も巨核球増幅因子活性を示した。
なお、 精製品の蛋白量はァミノ酸分析法により A 1 a = 2 8として算出した。
[表 6 ]
C H 0細胞の培養上清中及び精製組換え型 M e g - P O T
の巨核球増幅因子活性 被検々体終濃度 巨核球コロニ-数
C H 0細胞培養上清 0 . 0 8 %
0 . 3 1 %
1 . 2 5 % 1 0 . 5 a)
5 % 1 2 a)
PR 0 . 0 1 n g/m 1 0 b)
0 . 1 n g / m 1 6 b)
1 n /m 1 8 b)
1 0 n g /m 1
a ) 形成されたコロニー数から I L - 3単独で形成されたコロニー数
( 2 5個） を引いた値。
b ) 形成されたコロニー数から I L - 3単独で形成されたコロニー数
( 2 0 . 5個） を引いた値。 実施例 2 7 . C H O細胞の培養上清からの組換え型巨核球増幅因子 （M e g P O T) の精製]！
実施例 2 3で調製した C H O細胞の培養上清 1 0 1 ( 1 0 リ ッ トル） に Tw e e n 2 0を終濃度が 0 . 0 1 %になるように加え、 5 mのメ ンブラ ンフ ィ ル ター （富士フィルム社製） を通して不溶物を除去した。 この培養上清から以下の 手順により組換え型巨核球増幅因子を精製した。
(i) 上記培養上清を、 スパイラルカー 卜リ ッジ （アミコン社製） を用いて 20倍に 濃縮した。 濃縮液を 4 °Cにて撹拌しながら硫安を最終的に 50%飽和濃度になるよ うに加え、 析出した蛋白を遠心操作 （10， 000 g X 30min) により沈澱と して集め 、 lOmM 卜 リ ス塩酸緩衝液（pH 7.4)に溶解した。 その画分に、 終濃度が 1 Mとなる ように硫安を加え、 次の疎水クロマ 卜グラフィ 一にかけた。
(ii) 1 M 硫安を含む 10mM 卜 リ ス塩酸緩衝液（pH 7.りで平衡化した Pheny 1- sephar ose 6FFカラム （5,0 15cm, Pharmacia 社製） に添加した。 カラムを同緩衝液 で洗浄した後、 硫安濃度を 0.1M まで下げてカラムを再び洗浄後、 0.1% Tween 20 を含む 10mM 卜 リ ス塩酸緩衝液（pH 8.5)で組換え型 M e g - P O Tを溶出させた 。 この画分をメンブランフ ィ ルタ一 PM— 1 0 (アミ コン社製） にて濃縮後、 0. 01% Tween 20を含む lOmM トリス塩酸緩衝液（pH 8.5)で 10倍希釈し、 ァニオン交 換クロマ トグラフィ 一にかけた。
(iii)上記画分を希釈に用いた緩衝液にて平衡化した DEAE- sepharose fast flow カラム （ 5 x 13cm) に添加し、 同緩衝液にてカラムを洗浄後、 同緩衝液中 NaCl 濃度を 0.1Mに上げてカラムに吸着した蛋白を溶出した。 組換え型 M e g - P 0 T を含むこの画分を 10% TFAを加えて p Hを 3と し、 次に、 下記に示す条件で逆相 H P L Cにかけた。
(iv) fl.1% TFAを含む 32%ァセ 卜二 卜 リルで平衡化した Vydac (^カラム（10 x 250mm )に上記画分を添加し、 同溶離液にてカラムを洗浄後、 0.1% TFA中ァセ トニ ト リ ル濃度を 64分間に 32〜4 まで直線的に上げ、 力ラムに吸着した蛋白を溶出した 。 流速は 1.0 ml/minで、 蛋白の検出は 220nm及び 280 nmの 2波長で行った。 40-45% のァセ 卜二 ト リル濃度で溶出される画分を集め、 G.l¾ TFAで 2倍に希釈した。 こ の溶液を同条件で逆相 H P L Cを行い、 40-45%のァセ 卜二 ト リル濃度に溶出する 主要ピークを集め、 次の Gel Permeation Ch r oma t o gr aphyに力、けた。
(v) 0.1¾ TFA を含む 40% ァセ トニ ト リルで平衡化した TSK G3000 SW力ラム（21.5 x 60cm)に上記画分を添加した。 流速 3 ml/minで蛋白の検出は 280nmで行った。 42- 分間に溶出された主要ピークを集め、 0.1% TFAで希釈した。
(vi)上記画分を（iv)と同条件にて逆相 H P L Cを行い、 主要画分を回収した。 必要に応じて、 この画分をカチオン交換クロマ トグラフ ィ ーにかけ、 有機溶媒 及び TFAを除いた。 上記画分を 0.01% Tween 20 を含む 20mM 酢酸緩衝液（pE 5.0) で 倍希釈し、 同緩衝液にて平衡化した S- sepharose fast f lowカラムに添加し 、 同緩衝液でカラムを洗浄後、 0.3M NaClを含む同緩衝液にて組換え型 M e g - P 0 Tを溶出させた。
こうして得られた組換え型巨核球増幅因子 （Me g - P OT) を S D S/P A G Eにて分析した。 ゲル濃度は 1 2 %で、 Laemraliの方法 Nature, 227 , 680 (19 70)に従って泳動し、 2 D -銀染色試薬 · 「第一」 （第一化学薬品製） を用いて タンパク質を染色した。 なお分子量マーカ一は実施例 1 5で使用したバイオラッ ド社製低分子量マ一カーを用いた。
その結果、 精製された組換え型 M e g - P OTは分子量約 3 0 , 0 0 0に単一 バン ドを与えた。
このものの巨核球増幅因子活性を前述した方法に従って測定し、 実施例 2 4で 得た分子量約 3 3 , 0 0 0のものと比較した。 その結果、 表 7に示したように、 分子量約 3 0 , 0 0 0のものは測定したいずれの濃度においても活性を示さなか つた。
[表 7 ]
精製された巨核球増幅因子の巨核球増幅因子活性 分子量 巨核球増幅因子活性 a) 終濃度（ng/ml) 40 10 2.5 0.625 約 3 3、 0 0 0 1 i 8.5
約 3 0、 0 0 0 1 0.5 .5 a) 形成されたコロニー数から IL-3単独で形成されたコロニー数（25)
を引いた値。 実施例 2 8. 組換え型巨核球増幅因子 （M e g - P OT) の N末端及び C末端ァ ミノ酸配列分析 H
(i)実施例 2 7で得られた分子量約 3 0 , 0 0 0の組換え型 M e g - P OTに ついて、 気相式プロティンシークェンサ一 476A型 （Applied B i o sy s t ems社製） を 用いて N末端アミ ノ酸配列分析を行った。 その.結果、 以下に示す （a) ~ ( c ) の 3種類の N末端ァミ ノ酸配列が認められた。
(a ) Ser-Arg-Thr-Leu-Ala-Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Ala-Ala- · · · · ( b ) Leu-Ala-Gly-Glu-Thr-Gly-Glii-Glu-A la-Ala-Pro-Leu-Asp- · · · · (c ) Gly-Glu-Tbr-Gly-Gln-Glu-Ala-Ala-Pro-Leu-Asp-Gly-Val- · · · · これらの配列は、 実施例 2 5における、 配列 （a ) 〜 ( c ) に対応する。
(ii)組換え型 M e g - P OTの C末端ァミ ノ酸配列分析を行った。
分子量約 3 0 , 0 0 0の組換え型 M e g _ P OTに 1 0 m gZm 1の臭化シァ ンを含む 7 0 %ギ酸溶液 を加え、 室温にて 2 4時間臭化シアン分解した後 、 遠心濃縮機にて過剰の試薬を除いた。 その残渣を 0.1 %TF Aに溶解し、 0. 1 %TF Aで平衡化した Vydac C4カラム （ 4.6 x 250mm) に添加し、 0.1 %T F Α中ァセ 卜二 トリル濃度を 4 0分間に 8 0 %まで直線的に上げ、 力ラムに吸着 した臭化シアン断片を溶出させた。 流速は 1 ml/min、 ペプチ ドの検出は 22 Onm及 び 280nmで行った。 得られた 2本のピークについて気相式プロティンシ一クェン サ— 型にて分析した結果、 C末断片のァミ ノ酸配列は以下に示す如くであつ た。
As -Ala-Leu-Arg-Gly-Leu-Leu-Pro-V l-Leu-Gly-Gln-Pro-Ile-Ile-Ar 実施例 2 5から実施例 2 8より、 分子量約 3 3 , 0 0 0と分子量約 3 0 , 0 0 0のア ミ ノ酸配列の N末端は同等であるが、 C末端のみが相違する。 一方、 巨核 球増幅因子活性については、 分子量約 3 3 , 0 0 0のものは活性を示すが、 分子 量約 3 0 , 0 0 0のものは活性を示さない。 したがって、 分子量約 3 3 , 0 0 0 と約 3 0， 0 0 0の間の C末端のァミ ノ酸配列中に巨核球増幅因子活性に関与す る重要な部位が存在することが考えられる。
実施例 2 9. 組換え型巨核球増幅因子 （M e g - P 0 T) の精製 m
(i)実施例 2 4の Blue sepharose fast flow カラムから 2M K C 1 によ り溶 出された M e g - P OT画分をミニタ ン （millipore) にて脱塩後、 4 °Cにて硫 安を 50%飽和になるように加え 3 0分撹拌し、 生じた沈澱を遠心操作 （10， 000 g X 30分間） により集め、 蒸留水で溶解した。 この溶液を 4 °Cにて一晚、 0.01% Twe en 20 を含む lOmM 卜リス塩酸緩衝液 （pH 8.0) に対して透析し、 同緩衝液にて 平衡化した Q— sepharose fast ί 1 o カラム ό 10cm、 Pharmacia) に添カ卩した 。 同緩衝液にてカラムを洗浄後、 同緩衝液中 NaCl濃度を 0.1， 0.2, 0.3, 0.5, 1. 0 と段階的に上げてカラムに吸着した蛋白質を溶出させた。 各画分を S D SZ P AG Eにかけた後、 実施例 2 3で作製した M e g - P OTに対する抗体を用い てウェスタ ンブロッテイ ング法で M e g— P O Tを検出した。 この時の分子量マ —カーは、 バイ オラッ ド社製プレスティ ン ド分子量マ一カー 〔ホスフ オ リ ラーゼ Β ( 1 0 6 k d ) 、 ゥシ血清アルブミ ン （ 8 0.0 k d ) 、 オボアルブミ ン （4 9.5 k d ) 、 炭酸脱水素酵素 （ 3 2.5 k d ) 、 大豆トリプシンインヒ ビター （ 2 7.5 k d ) 、 リゾチーム （ 1 8.5 k d ) 〕 を用いた。 その結果、 分子量約 7 0， 0 0 0にもバン ドが染色された （図 9 ) 。 この分子種にも M e g - P 0 T活 性が認められるか否か確認するため、 分子量約 3 3， 0 0 0の分子種と分離すベ く以下に示す如く精製を行った。
(ii)分子量約 7 0 , 0 0 0の分子種が含まれる 0.2M NaCl画分に酢酸を加え p Hを 5とした後、 0.1% TFA を含む 32% ァセトニトリルで平衡化した Vydac C4力 ラムに添加した。 同溶離液にてカラムを洗浄後、 TFA 中ァセトニト リル濃 度を まで 40分間に直線的に上げ、 カラムに吸着した蛋白を溶出させた。 ァセトニ 卜リルの濃度が 39- 41%の囤分を集め、 次のゲル濾過にかけた。
(iii)上記画分を Twee ii 20 を含む PBSで希釈し、 セン 卜 リ ブレツ ブー 1 0で濃縮し、 同緩衝液にて平衡化した TSK G3000 SWカラムに添加した。 流速は 3 m で、 蛋白の検出は 220 nm及び ΠΟηιηの 2波長で行った。 1 m lずつ分画し、 一部をコロニー形成法により Meg- P0T活性を測定し、 また SDS/PAGE後ゥエスタ ン プロティ ング法により、 M e g - P OTの検出を行った。 その結果、 分子量約 7 0， 0 0 0の分子種は、 4 2 ~ 4 6分に溶出され、 その画分には分子量約 3 3 , 0 0 0の分子種は検出されなかった （図 1 0) 。 なお、 分子量マ一カーは前述の バイオラッ ド社製分子量マーカーを用いた。
実施例 2 6と同様に 4 2 ~ 4 6分の画分の M e g - P 0 T活性を測定したとこ ろ、 表 8に示すごとく、 この 4 2 ~ 4 6分の画分にも M e g - P 0 T活性が認め られたことから、 分子量約 7 0 , 0 0 0の分子種にも M e g - P O T活性がある と推定された。 [表 8 ]
C H O細胞の培養上清の各精製画分の巨核球増幅因子活性
T S K G 3 0 0 0 SW画分 （分） 42 - 43 3 44-45 45-46 巨核球増幅因子活性 a) 12 9 10.5 5.5 a) ：形成されたコロニー数から、 I L - 3単独で形成されたコロニー数
( 1 9. 5 ) を引いた値。 実施例 3 0. 修飾体の発現ベクターの構築及び C 0 S細胞での発現
( 1 ) pEFMPOSべクターの構築
修飾体の Meg- POT遺伝子を得るために PCKを用いた。 PCRに用いるプライマーと して次に示すォリゴヌク レオチドを配列番号 1 0に示した遺伝子の塩基配列をも とに 381A DNA SynthesizerCApplied B i o sy s t ems社製）を用いて合成した。 ブライマ- 3S :5'-CTGGCTCACCGGCTCTCTGA-3' プライマ — :5'-ATGGATCCTTACCGCCGGAACCGCGGCCG-3'
組換え CH0細胞の培養上精から精製された Meg- POTの C末端付近に存在する動物 細胞内プロセシング酵素 Fu r i nの認識配列 Ar g_x- Ar g- Ar g295までをコ- ドする Meg -POT遺伝子を作製し、 これを用いてその発現ベクターを構築した。
PKP027を鏡型として DNA Thermal Cyclerひ erkin Elmer Cetus社製）を用いて KR を行なった。 PKP027 を 20mM Tr i s-HC 1 (pH8.8) , 1 OmM KCl,6mM (NH4)2 S04 , 2mM MgCl2,0-l% Triton X-l 00 , 0. lmg/ml BSA, 1 OOmM de oxy nu c 1 e o t i de triphosphate (dNTP)，ブライマ- 3S及び G 2Aそれぞれ lOOpmolを含む 100>« 1の PCR反応溶液中で 増幅した。 まず 95°Cで 6分間変性後、 85°Cに冷却し - 単位の!^!! DNA Polymerase (Stratagene社製）を加えた。 その後、 変性 94°C 1分間、 ァニ-ル 60°C 30秒間、 伸長 72°C、 2分間のサイ クルを 30回繰返して PCKを行なった （図 1 1 ) 。 サンプル はァガ口 -スゲル電気泳動し、 増幅された 590 bpMA断片を抽出した。 Polynucleo tide kinaseを用いて DNAの 5'端をリン酸化し、 予め制限酵素 Smalとアルカリフォ スファ タ —ゼで処理したベクタ—PSP73と連結し、 PSP 982 Aを得た。 この挿入塩基 配列を Dideoxy sequencing法にて決定し、 982番目の Gが Tに置換されその 3'側に B amII Iサイ 卜があり、 その他に変異がないことを確認した。
PSP982Aと PRVHKP027を制限酵素 Sal I、 BamHI処理した後、 ァガ口 -スゲル電 気泳動を行ないそれぞれより 190bp、 9.5kbpの A断片を回収し、 これらを連結さ せ pEFMPOSを得た （図 1 2 ) 。
(2) COS細胞での発現
COS細胞を 1 X 107個/ ^1になるように PBSに懸濁し、 この細胞浮遊液 0.8mlに pEF M'POSを 20 « g加えた。 1500V、 25 FDの条件で Ge n ePu 1 s a r (B i oRad社製）を用いて 電気穿孔法 （electroporation) によりプラスミ ドを COS細胞に導入した。 エレク トロポレ-シヨンした細胞を 1%ゥシ胎児血清を含む DMEM培地 （GIBC0社製） に加 え、 72時間培養後培養上清を集めた。 それぞれの培養上清をセン トリブレッ プ - 10で約 10倍に濃縮し、 SDSポリアク リルアミ ドゲル電気泳動にかけた。 実施例 2 1で得られた大腸菌にて発現させ精製した Meg- POT蛋白質を抗原として家兎に免 疫して得た抗巨核球増幅因子抗血清を用いて、 ウェスタンブロ ッティ ングを行な い、 培養上清中に Meg- POT修飾体の蓄積を確認した。
この培養上清の巨核球増幅因子活性を前述した方法に従って測定した。 その結 果を表 9に示した。
[表 9 ]
cos細胞の培養上清中の巨核球増幅因子活性 cos細胞 巨核球増幅因子活性' 培養上清濃度 （％) 10 5 2.5 .25 0.625 対照 COS 1 0 0 1 1
ρΜΗΚΡΟΠί導入 COS 9.5 9.5 6.5 12 0
pEFNKPOS導入 COS 9.5 0.5 1 0 0 a) 形成されたコロニー数から IL- 3単独で形成されたコロニー数 (40.5)を引いた値。
(3) アミ ノ酸置換 Meg- POT発現ベクターの構築
PCRに用いるブライマ一と して次に示すォリゴヌクレオチ ドを配列番号 1 0に 示した遺伝子の塩基配列をもとに 381A DNA Synthesizer(Applied Biosystems社 製）を用いて合成した。
プライマ— T3- 2 :5'-CATGATTACGCCAAGCTCGAA-3' プライマ— 754GA :5'-GCTGCCTCCTCCTGGTCCTGGTCCAGGGGTCC-3J プライマー 754GS ： 5' -CCAGGACCAGGAGGAGGCAGCCAGGGCGGC-3' プライマ一 850 GA 5'-AGCACGGGCACCAGGCCCCGCAGAGCGTCC-3' ブラィマ一 850GS 5'-CTGCGGGGCCTGGTGCCCGTGCTGGGCCAGCCC-3' pEFMPOSの 252番目の1^11を 1に置換した1^8-?(^修飾体発現べクタ - pEFMPOL 252 Vを搆築した。 上記と同様の条件で PKP027 をプライマ _ T3-2と 850GAの組み合 わせと 850GSと G982Aの組み合わせでそれぞれ PCRを行なった。 サンプルはゲル電 気泳動を行い、 それぞれ OJkb 150bpMAを抽出した。 これら DM断片を混合後 、 ブライマ一 T3- 2と G982Aを用いて再度 PCRを行なった （図 1 1 ) 。 ァガロースゲ ル電気泳動を行い、 増幅された lkbpDMを抽出した。 Polynucleotide kinaseを用 いて DNAの 5'端をリ ン酸化し、 予め制限酵素 Smalとアル力 リ フォスファタ -ゼで 処理したベクタ — PSP73と連結し PSP850Gを得た。 この挿入塩基配列を Dideoxy se quencing法にて決定し、 850番目の C力； Gに、 9Π番目の Gが Tに置換されその 3'側に BamH Iサイ 卜力；あり、 その他に変異がないことを確認した。 p SP 850 Gと pRVHKP027 を制限酵素 Sai l、 BamH I処理した後、 ァガ口 -スゲル電気泳動を行ないそれぞ れより 190bp、 9.5kbpの D 断片を回収し、 これらを連結させ pEFNKPOU 52 Vを得た (図 1 2 ) 。
また pEFMPOSの 220番目の Ginを Gluに置換した Meg-POT修飾体発現べクタ - pEFN KPO£i22(IEを構築した。 上記と同様の条件で PKP027 をプライマ- T3 - 2と 754GAの組 み合わせと 754GSと G982Aの組み合わせでそれぞれ PCRを行なった。 サンプルはゲ ル電気泳動を行い、 それぞれ 0.9kbp、 150bpMAを抽出した。 これら DNA断片を混 合後、 プライマ一 T3- 2と G 2Aを用いて再度 PCRを行なった。 ァガロ -スゲル電気 泳動を行い、 増幅された lkbpDNAを抽出した。 Polynucleotide kinaseを用いて DN Aの 5'端をリ ン酸化し、 予め制限酵素 Smalとアル力 リ フォ スフ ァタ—ゼで処理し たべクタ— pSP73と連結し pSP7 Gを得た。 この挿入塩基配列を Dideoxy sequenci ng法にて決定し、 754番目の Cが Gに、 982番目の Gが Tに置換されその 3'側に BamH I サイ 卜力 Sあり、 その他に変異がないことを確認した。 PSP754Gと PRVHKP027を制限 酵素 EcoR I、 BamHI処理した後、 ァガロ -スゲル電気泳動を行ないそれぞれより lkbp、 8.7kbpの DNA断片を回収し、 これらを連結させ PEFMP0Q 220 Eを得た （図 1 2 )
(4 ) アミ ノ酸置換 Meg_P0Tの COS細胞での発現
上記と同様にして電気穿孔法 （electroporation) によ り pEFNKPOU 52 V、 pEFNK POQ220 E を COS細胞に導入した。 それぞれの 72時間培養上清をセン ト リ ブレップ - で約 10倍に濃縮し、 SDSポリアク リルアミ ドゲル電気泳動にかけた。 同様に 実施例 2 1で得られた大腸菌にて発現させ精製した Meg-POT蛋白質を抗原と して 家兎に免疫して得た抗巨核球増幅因子抗血清を用いてゥエスタ ンブロッティ ング を行ない、 培養上清中に Meg-POT修飾体の蓄積を確認した。 配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 1 6
配列の型 ： アミ ノ酸
卜ポロジ— ：直線状
配列の種類： ぺプチ ド
配列：
Leu Ala Gly Glu Xaa Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu 1 5 10 15 配列番号： 2
配列の長さ ： 1 6
配列の型 ： アミ ノ酸
トポロジー ：直線状
配列の種類： ぺブチ ド
配列：
Ala Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu Ala 1 5 10 15 配列番号： 3
配列の長さ ： 1 6
配列の型： アミ ノ酸
卜ポロジ— ：直線状
配列の種類： ペプチ ド
配列：
Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu Ala Asn 1 5 10 15 配列番号： 4 配列の長さ ： 1 4
配列の型： アミ ノ酸
トポロジ— ：直線状
配列の種類：ペプチド
配列：
Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu
1 5 10 配列番号： 5
配列の長さ ： 3 5
配列の型： アミ ノ酸
トポロジー ：直線状
配列の種類：ペプチド
配列：
Leu Ala Val Ala Leu Ala Gin Lys Asn Val Lys Leu Se r Thr Glu
1 5 10 15
Glo Leu Arg Xaa Leu Ala His Arg Leu Ser Glu Pro Pro Glu Asp
20 25 30
Leu Asp A 1 a Leu Pro
35 配列番号： 6
配列の長さ ： 4 0
配列の型：核酸
鎖の数：ニ本鎮
卜ポロジー ：直線状
配列の種類： DN A
配列：
CTCAACAGAG CAGCTGCGCT GTCTGGCTCA CCGGCTCTCT 40 配列番号： 7
配列の長さ ： 69
配列の型：核酸
鎖の数：ニ本鎮
卜ポロジ一：直線状
配列の種類： c DN A
配列：
CGC CAA CTC CTT GGC TTC CCG TGT GCG GAG GTG TCC GGC CTG AGC 45 Arg Gin Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu Ser
1 5 10 15
ACG GAG CGT GTC CGG GAG CTG GCT 69 Thr Glu Arg Val Arg Glu Leu Ala
20 配列番号： 8
配列の長さ ： 7 5
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
卜ポロジー ：直線状
配列の種類： c DN A
配列：
CTC TCT GAG CCC CCC GAG GAC CTG GAC GCC CTC CCA TTG GAC CTG 45 Leu Ser Glu Pro Pro Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu
1 5 10 15
CTG CTA TTC CTC AAC CCA GAT GCG TTC TCG 75 Leu Leu Phe Leu Asn Pro Asp Ala Phe Ser
20 25 配列番号： 9
配列の長さ ： 1 97 配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
卜ポロジ— ：直鎖状
配列の種類： c DN A
起源
生物名 ： ヒ 卜
特徴： ヒ 卜脬臓癌患者のリンパ節から得られた培養細胞に由来し、 ヒ 卜巨核球 増幅因子活性を有するポリべプチドの一部分をコ一 ドする c DNA。
配列：
AA CTC CTT GGC TTC CCG TGT GCG GAG GTG TCC GGC CTG AGC ACG 44 Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu Ser Thr
1 5 10
GAG CGT GTC CGG GAG CTG GCT GTG GCC TTG GCA CAG AAG AAT GTC 89 Glu Ar g Val Ar Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gin Ly s Asn Val
15 20 25
AAG CTC TCA ACA GAG CAG CTG CGC TGT CTG GCT CAC CGG CTC TCT 134
Ly s Leu Ser Thr Glu Gin Leu Ar g Cys Leu Ala His Ar g Leu Ser
30 35 40
GAG CCC CCC GAG GAC CTG GAC GCC CTC CCA TTG GAC CTG CTG CTA 179
Glu Pro Pro Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Leu
45 50 55
TTC CTC AAC CCA GAT GCG 197
Phe Leu Asn Pro Asp Ala
60 65 配列番号： 1 O
配列の長さ ： 2 1 29
配列の型：核酸 鎖の数：ニ本鎮
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： c D N A
起源
生物名 ： ヒ 卜
直接の起源： プラスミ ド P KP02 7
特徴： ヒ ト脖臓癌患者のリ ンパ節から得られた培養細胞に由来し、 ヒ ト巨核球 増幅因子活性を有するポリべプチ ドをコ一 ドする c DNA。
配列：
GAATTCGGCA CGAGGCCACT CCCGTCTGCT GTGACGCGCG GACAGAGAGC 50 TACCGGTGGA CCCACGGTGC CTCCCTCCCT GGGATCTACA CAGACC ATG GCC 102
Met Ala
TTG CCA ACG GCT CGA CCC CTG TTG GGG TCC TGT GGG ACC CCC GCC 147 Leu Pro Thr Ala Arg Pro Leu Leu Gly Ser Cys Gly Thr Pro Ala
5 10 15
CTC GGC AGC CTC CTG TTC CTG CTC TTC AGC CTC GGA TGG GTG CAG 192 Leu Gly Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu Gly Trp Ya 1 Gin
20 25 30
CCC TCG AGG ACC CTG GCT GGA GAG ACA GGG CAG GAG GCT GCA CCC 237 Pro Ser Arg Thr Leu Ala Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro
35 40 45
CTG GAC GGA GTC CTG GCC AAC CCA CCT AAC ATT TCC AGC CTC TCC 282 Leu Asp Gly Va 1 Leu Ala Asn Pro Pro Asn lie Ser Ser Leu Ser
50 55 60
CCT CGC CAA CTC CTT GGC TTC CCG TGT GCG GAG GTG TCC GGC CTG 327 Fro Arg Gin Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu
65 70 75
AGC ACG GAG CGT GTC CGG GAG CTG GCT GTG GCC TTG GCA CAG AAG 372 Ser Thr Glu Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gin Lys S" 0" SI2
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06 S8 08 fSI0/£6dr/JDd ΠεθΙ 6 O CAG GGC GGG GGA CCC CCC TAC GGC CCC CCG TCG ACA TGG TCT GTC 822
Gin Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Trp Ser Val
230 235 240
TCC ACG ATG GAC GCT CTG CGG GGC CTG CTG CCC GTG CTG GGC CAG 867
Ser Thr Met Asp Ala Leu Arg Gly Leu Leu Pro Val Leu Gly Gin
245 250 255
CCC ATC ATC CGC AGC ATC CCG CAG GGC ATC GTG GCC GCG TGG CGG 912
Pro lie lie Arg Ser lie Pro Gin Gly He Val Ala Ala Trp Arg
260 265 270
CAA CGC TCC TCT CGG GAC CCA TCC TGG CGG CAG CCT GAA CGG ACC 957 Gin Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gin Pro Glu Arg Thr
275 280 285
ATC CTC CGG CCG CGG TTC CGG CGG GAA GTG GAG AAG ACA GCC TGT 1002 lie Leu Ar Pro Arg Phe Arg Arg Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys
290 295 300
CCT TCA GGC AAG AAG GCC CGC GAG ATA GAC GAG AGC CTC ATC TTC 1047 Pro Ser Gly Lys Lys Ala Arg Glu 11 e Asp Glu Ser Leu 11 e Phe
305 310 315
TAC AAG AAG TGG GAG CTG GAA GCC TGC GTG GAT GCG GCC CTG CTG 1092 T r Lys Lys Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val Asp Al Ala Leu Leu
320 325 330
GCC ACC CAG ATG GAC CGC GTG AAC GCC ATC CCC TTC ACC TAC GAG 1137 Ala Thr Gin Met Asp Arg Val Asn Ala He Pro Phe Thr Tyr Glu
335 340 345
CAG CTG GAC GTC CTA AAG CAT AAA CTG GAT GAG CTC TAC CCA CAA 1182 Gin Leu Asp Val Leu L s His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gin
350 355 360
GT TAC CCC GAG TCT GTG ATC CAG CAC CTG GGC TAC CTC TTC CTC 1227 Gly Tyr Pro Glu Ser Val He Gin His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu
365 370 375
AAG ATG AGC CCT GAG GAC ATT CGC AAG TGG AAT GTG ACG TCC CTG 1272
Lys Me t Ser Pro Glu Asp lie Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser Leu
380 385 390
GAG ACC CTG AAG GCT TTG CTT GAA GTC AAC AAA GGG CAC GAA ATG 1317
Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu Val Asn Lys Gly His Glu Met
395 400 405
AGT CCT CAG GTG GCC ACC CTG ATC GAC CGC TTT GTG AAG GGA AGG 1362 Ser Pro Gin Val Ala Thr Leu He Asp Arg Phe Val Lys Gly Arg
410 415 420
GGC CAG CTA GAC AAA GAC ACC CTA GAC ACC CTG ACC GCC TTC TAC 1407 Gly Gin Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr Leu Thr Ala Phe Tyr
425 430 435
CCT GGG TAC CTG TGC TCC CTC AGC CCC GAG GAG CTG AGC TCC GTG 1452 Pro Gly Tyr Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Ser Ser Val
"0 " 5 450
CCC CCC AGC AGC ATC TGG GCG GTC AGG CCC CAG GAC CTG GAC ACG 1497 Pro Pro Ser Ser lie Trp Ala Val Arg Pro Gin Asp Leu Asp Thr
455 460 465
TGT GAC CCA AGG CAG CTG GAC GTC CTC TAT CCC AAG GCC CGC CTT 1542 Cys Asp Pro Arg Gin Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala Arg Leu
470 475 480
GCT TTC CAG AAC ATG AAC GGG TCC GAA TAC TTC GTG AAG ATC CAG 1587 Ala Phe Gin Asn Met Asn Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys lie Gin
485 490 495
TCC TTC CTG GGT GGG GCC CCC ACG GAG GAT TTG AAG GCG CTC AGT 1632 Ser Phe Leu Gly Gl Ala Pro Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser 500 505 510
CAG CAG AAT GTG AGC ATG GAC TTG GCC ACG TTC ATG AAG CTG CGG 1677
Gin Gin Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg
515 520 525
ACG GAT GCG GTG CTG CCG TTG ACT GTG GCT GAG GTG CAG AAA CTT 1722
Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val Gin Lys Leu
530 535 540
CTG GGA CCC CAC GTG GAG GGC CTG AAG GCG GAG GAG CGG CAC CGC 1767 Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu Arg His Arg
545 550 555
CCG GTG CGG GAC TGG ATC CTA CGG CAG CGG CAG GAC GAC CTG GAC 1812 Pro Val Arg Asp Trp lie Leu Ar Gin Ar Gin Asp Asp Leu Asp
560 565 570
ACG CTG GGG CTG GGG CTA CAG GGC GGC ATC CCC AAC GGC TAC CTG 1857 Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gin Gly Gly lie Pro Asn Gly Tyr Leu
575 580 585
GTC CTA GAC CTC AGC GTG CAA GAG GCC CTC TCG GGG ACG CCC TGC 1902 Val Leu Asp Leu Ser Val Gin Glu Ala Leu Ser Gly Thr Pro Cys
590 595 600
CTC CTA GGA CCT GGA CCT GTT CTC ACC GTC CTG GCA CTG CTC CTA 1947 Leu Leu Gly Pro Gly Pro Val Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Leu
605 610 615
GCC TCC ACC CTG GCC TGA 1965 Ala Ser Thr Leu Ala
620
GGGCCCCACT CCCTTGCTGG CCCCAGCCCT GCTGGGGATC CCCGCCTGGC 2015 CAGGAGCAGG CACGGGTGAT CCCCGTTCCA CCCCAAGAGA ACTCGCGCTC 2065 AGTAAACGGG AACATGCCCC CTGCAGACAC GTAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2115 AAAAAAAACT CGAG 2129 配列番号： 1 1
配列の長さ ： 1 7
配列の型 ： アミ ノ酸
卜ポロジ— ： 直線状
配列の種類： ぺプチ ド
配列：
Ser Arg Thr Leu Ala Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro Leu
1 5 10 15
Asp Gly 配列番号 ： 1 2
配列の長さ ： 5 8 4
配列の型： アミ ノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： ぺプチ ド
配列
Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro
1 5
Leu Asp Gly Va 1 Leu Ala Asn Pro Pro Asn lie Ser Ser Leu Ser
10 15 20
Pro Arg Gin Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu
25 30 35
Ser Thr Glu Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gin Lys
40 45 SO
Asn Val Lys Leu Ser Thr Glu Gin Leu Arg Cys Leu Ala His Arg
55 60 65
Leu Ser Glu Pro Pro Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu
70 75 80 Leu Leu Phe Leu Asn Pro Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gin Ala Cy s 85 90 95
Thr Arg Phe Phe Ser Arg lie Thr Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu 100 105 110
Pro Arg Gl Ala Pro Glu Arg Gin Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu 115 120 125
Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser Leu Leu Ser Glu Ala Asp Val 130 135 140
Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp Leu Pro Gly Arg Phe Val Π5 150 155
Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg Leu Val Ser Cys Pro 160 165 170
Gly Pro Leu Asp Gin Asp Gin Gin Glu Ala Ala Arg Ala Ala Leu
175 180 185
Gin Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Trp Ser Val
190 195 200
Ser Thr Met Asp Ala Leu Arg Gly Leu Leu Pro Val Leu Gly Gin
205 210 215
Pro He He Arg Ser lie Pro Gin Gly He Val Ala Ala Trp Arg
220 225 230
Gin Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gin Pro Glu Arg Thr
235 240 245
lie Leu Arg Pro Arg Phe Arg Arg Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys
250 255 260
Pro Ser Gly Lys Lys Ala Arg Glu He Asp Glu Ser Leu lie Phe
265 270 275
Tyr Lys Lys Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val Asp Ala Ala Leu Leu
280 285 290
Ala Thr Gin Met Asp Arg Val Asn Ala lie Pro Phe Thr Tyr Glu
295 300 305 -65-
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535 540 545
Val Leu Asp Leu Ser Val Gin Glu Ala Leu Ser Gly Thr Pro Cys
550 555 560
Leu Leu Gly Pro Gly Pro Val Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Leu
565 570 575
Ala Ser Thr Leu Ala
580 584 配列番号： 1 3
配列の長さ ： 2 4 8
配列の型： ア ミ ノ酸
卜ポロジ— ： 直鎖状
配列の種類： ぺプチ ド
配列
Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala Ala Pro 1 5
Leu Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn lie Ser Ser Leu Ser 10 15 20
Pro Arg Gin Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu 25 30 35
Ser Thr Glu Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gin Lys 40 45 50
Asn Val Lys Leu Ser Thr Glu Gin Leu Arg Cys Leu Ala His Arg 55 60 65
Leu Ser Glu Pro Pro Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu 70 75 80
Leu Leu Phe Leu Asn Pro Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gin Ala Cys 85 90 95
Thr Arg Phe Phe Ser Arg lie Thr Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu 100 105 110
Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg Gin Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser Leu Leu Ser Glu Ala Asp Val
130 135 140
Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp Leu Pro Gly Arg Phe Val
Π5 150 155
Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg Leu Val Ser Cys Pro
160 165 170
Gly Pro Leu Asp Gin Asp Gin Gin Glu Ala Ala Arg Ala Ala Leu
175 180 185
Gin Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Trp Ser Val
190 195 200
Ser Thr Met Asp Ala Leu Arg Gly Leu Leu Pro Val Leu Gly Gin
205 210 215
Pro lie He Arg Ser lie Pro Gin Gly lie Val Ala Ala Trp Arg
220 225 230
Gin Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gin Pro Glu Arg
235 240 245 248

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 配列番号 1 2に示すアミ ノ酸配列をコ一 ドする塩基配列、 またはこれ を一部置換、 欠除もしくは付加した塩基配列、 あるいはこれらにハイ ブリ ダィ ズ する塩基配列を含む D N A。
2 . 請求項 1記載の D N Aを含有する組換えベクター。
3 . 請求項 2記載の組換えベクターにより形質転換された原核または真核 宿主細胞。
4 . 請求項 3記載の宿主細胞を培養し、 産生されたタ ンパク質を分離する ことを特徴とする組換えタンパク質の製造方法。
5 . 請求項 4記載の組換えタ ンパク質が巨核球増幅因子活性を有するタ ン パク質である組換えタ ンパク質の製造方法。
6 . 配列番号 1 3に示すアミ ノ酸配列をコー ドする塩基配列、 またはこれ を一部置換、 欠除もしくは付加した塩基配列、 あるいはこれらにハイ ブリダィズ する塩基配列を含む D N A。
7 . 請求項 6記載の D N Aを含有する組換えベクター。
8 . 請求項 7記載の組換えべクターにより形質転換された原核または真核 宿主細胞。
9 . 請求項 8記載の宿主細胞を培養し、 産生されたタンパク質を分離する ことを特徴とする組換えタンパク質の製造方法。
1 0 . 請求項 9記載の組換えタ ンパク質が巨核球増幅因子活性を有するタ ン パク質である組換えタ ンパク質の製造方法。
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