WO1994006907A1 - Modifizierte glutamat-dehydrogenase - Google Patents

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WO1994006907A1
WO1994006907A1 PCT/EP1993/002458 EP9302458W WO9406907A1 WO 1994006907 A1 WO1994006907 A1 WO 1994006907A1 EP 9302458 W EP9302458 W EP 9302458W WO 9406907 A1 WO9406907 A1 WO 9406907A1
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glutamate dehydrogenase
ammonia
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dextran
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Rainer Schmuck
Josef Heinle
Kurt Weindel
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Boehringer Mannheim Gmbh
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
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    • C12N11/093—Polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase

Definitions

  • the invention relates to a glutamate dehydrogenase which is covalently bound to a soluble polysaccharide and a method for preventing the clouding of solutions of glutamate dehydrogenase.
  • Glutamate dehydrogenase (L-glutamate: NAD (P) oxidoreductase, EC 1.4.1.3) catalyzes the conversion of ⁇ -ketoglutarate and NH 4 + in the presence of NAD (P) H to L-glutamate, H 2 0 and NAD (P ) + .
  • This enzyme is of great importance in enzymatic analysis for the determination of ammonia or NH 4 + and for the removal of ammonia or NH A + from samples for the enzymatic determination of other parameters such as creatinine or potassium.
  • glutamate dehydrogenase from rat liver is not that for mammalian liver glutamate dehydrogenases shows typical association behavior (Biochim. Biophys. Acta 251 (1971), 133 - 140) and therefore less cloudy.
  • glutamate dehydrogenase from other mammals, such as cattle in particular is of far greater importance for large-scale production.
  • the object of the invention was therefore to provide a glutamate dehydrogenase from mammals, the solutions of which do not or only slightly cloud over a longer period (weeks and months) after production.
  • GlDH mammalian glutamate dehydrogenase
  • the invention therefore furthermore relates to a process for preventing the clouding of solutions of glutamate dehydrogenase from mammals, in particular from cattle, by covalent binding of glutamate dehydrogenase to a water-soluble polysaccharide or polyurethane, preferably to dextran, Ficoll or a polyvinyl saccharide.
  • the covalent binding of glutamate dehydrogenase to water-soluble polysaccharides or polyurethanes is carried out according to known methods by incubating the enzyme with an activated derivative of polysaccharides or polyurethanes.
  • Such methods are described, for example, in J. Marshall, TIBS 1978, 79-83, P. Germain et al. , Biotechnology and Bioengineering 33 (1989), 563-569, Krysteva et al., Biotechnology and Applied Biochemistry 10 (1988), 124-130, M. Kobayashi et al., Agric. Biol. Chem. 53 (1989), 3133-3138 and in EP-B 0 069 379.
  • CDAP l-cyano-4-dimethylamino-pyridinium tetrafluoroborate
  • N-cyano-N, N, N-triethylammonium tetrafluoroborate activated dextran or Ficoll or a polyurethane activated according to EP-A 0 280 212.
  • Modified glutamate dehydrogenase is dissolved in conventional buffers such as phosphate buffers, tris buffers or preferably triethanolamine buffers at pH values from 6.5 to 9 in a concentration of 10 U / ml up to 1000 U / ml (corresponding to 100 mg modified enzyme / ml). Such solutions have no turbidity of the reaction solution even with longer incubation times (days to weeks).
  • the modified glutamate dehydrogenase does not differ in its affinity for the product from the unmodified enzyme. It is therefore particularly well suited for the enzymatic determination of ammonia or NH + or for the removal of ammonia or H4 + from samples for the enzymatic determination of other parameters such as creatinine or potassium.
  • Another object of the invention is therefore the use of a glutamate dehydrogenase according to the invention for the enzymatic determination of ammonia or NH4 + ions, the sample being incubated with ⁇ -ketoglutarate and NAD (P) H in the presence of glutamate dehydrogenase and the content of ammonia or NH4 + determined from the consumption of NAD (P) H.
  • the invention furthermore relates to the use of a glutamate dehydrogenase according to the invention for removing ammonia or NH4 + ions from analytical samples, the sample being incubated with ⁇ -ketoglutarate and NAD (P) H in the presence of glutamate dehydrogenase.
  • the dialysate is centrifuged off at 25,000 g for 10 minutes, diluted to a protein concentration of 15-20 mg / ml with 20 mmol / 1 potassium phosphate buffer pH 7.0 and a pH of 7.0 is adjusted by adding 1 mol / 1 K2HPO4.
  • EDTA ad 1.5 mg / ml
  • ⁇ -ketoglutarate Boehringer Mannheim GmbH, catalog No. 040 584
  • the pH is corrected to 7.0 with 1 mol / 1 K2HPO4.
  • a pH of 8.5 is set with 1 mol / 1 KH2PO4, EDTA ad 1.5 mg / ml is added and, after the EDTA has been dissolved, the pH is corrected to pH 7.0 with 1 mol / 1 KH2PO4.
  • the pH is again adjusted to pH 7.0 with 1 mol / 1 K2HPO4 or KH2PO4 and adjusted. finally incubated for one hour at room temperature and then overnight at 4 ° C.
  • the coupling mixture is then dialyzed against 20 mmol / l Tris / citrate pH 6.3 at 4-8 ° C for 24 hours.
  • 30 g of Crotein C (Croda) is dissolved in the batch and a solution of 6 g of ADP (free acid) in 60 ml of H2O (pH value adjusted to 6.3 with 2 mol / 1 Tris base) is added.
  • the mixture is then filtered through a membrane filter (0.2 ⁇ m) and the filtrate is lyophilized. Approx. 100 g lyophilisate with a specific activity of approx. 8 U / mg are obtained.
  • Ficoll 70 (Pharmacia, catalog no. 177 458) is dissolved in 200 ml of H2O and cooled to 2 ° C. 2 g of CDAP are then added with stirring and, as soon as the CDAP has dissolved, 24 ml of 0.2 mol / 1 triethylamine (in H2O) are added dropwise and the mixture is incubated at 2-10 ° C. for 10 minutes.
  • a pH of 8.5 is set with 1 mol / 1 KH2 O4, EDTA ad 1.5 mg / ml is added and, after the EDTA has been dissolved, the pH is corrected to pH 7.0 with 1 mol / 1 KH2PO4.
  • the pH is again corrected to pH 7.0 with 1 mol / 1 K2HPO4 or KH2PO4 and then incubated first at room temperature and then overnight at 4 ° C.
  • the coupling mixture is then dialyzed against 20 mmol / l Tris / citrate pH 6.3 at 4 - 8 ° C for 24 hours.
  • 40 g of bovine serum albumin (Boehringer Mannheim GmbH, catalog No. 738 328) are dissolved in the batch and a solution of 12 g of ADP (free acid) in 120 ml of H2O (pH value with 2 mol / 1 Tris base) set to 6.3) added.
  • the mixture is then filtered through a membrane filter (0.2 ⁇ m) and the filtrate is lyophilized. Approx. 100 g lyophilisate with a specific activity of approx. 15 U / mg are obtained.
  • Unmodified glutamate dehydrogenase and glutamate dehydrogenase modified with dextran according to Example 1 were mixed in parallel in 100 mmol / 1 Tris / HCl pH 8.5 or 250 mmol / 1 Tris / HCl pH 7.85 at a protein concentration of 2 mg / ml incubated up to 72 hours at 30 ° C and 37 ° C.
  • the absorbance at 366 nm and a layer thickness of 1 cm against buffer was measured at different times. The results are listed in the following tables.
  • the unmodified glutamate dehydrogenase shows a significant increase in extinction in the course of the 72-hour incubation, the glutamate dehydrogenase modified with dextran according to Example 1 shows no or only a slight increase in the absorbance.
  • 1.0 ml sample solution (EDTA plasma or buffer for the reagent blank) is mixed with 2.0 ml reagent solution (0.12 mmol / 1 NADPH, 0.15 mol / 1 triethanolamine buffer pH 8.6, 15 mmol / 1 ketoglutarate and 1.5 mmol / 1 ADP), mixed and preincubated for 1 minute at room temperature.
  • 20 ⁇ l glutamate dehydrogenase solution (755 U / ml in triethanolamine buffer pH 8.6) was added, mixed and, after 10 minutes of incubation at room temperature, the absorbance E2 was measured. Then another 20 ⁇ l of glutamate dehydrogenase are added and the extinction E3 is determined after a further 10 minutes.
  • Example 1 covalently modified with dextran, glutamate dehydrogenase is converted into a volume concentration in 150 mmol / 1 triethanolamine buffer pH 8.6, which contains 1.5 mmol / 1 ADP and 15 mmol / 1 ⁇ -ketoglutarate and 0.1% sodium azide tion of 1000 U / ml added.
  • this enzyme solution the content of NH4 + ions or NH3 in standard solutions (Preciset, Boehringer Mannheim GmbH, Cat. No. 166 570) and in ammonium sulfate solutions of a defined concentration is determined as described in Example 4. These determinations were repeated over the course of several weeks, with the glutamate dehydrogenase solution being stored at 2-8 ° C. between the determinations.
  • the stability of the modified glutamate dehydrogenase was examined in various ways:
  • the solution is pipetted four times a week and decanted twice over a period of 8 weeks.
  • the pipetting is carried out by aspirating the solution with a 1 ml pipette, moving the pipette several times and letting the pipette run out again.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine wäßrige Lösung von Glutamat-Dehydrogenase, die kovalent an ein lösliches Polysaccharid oder Polyurethan gebunden ist sowie ein Verfahren zur Verhinderung der Eintrübung von Lösungen von Glutamat-Dehydrogenase.

Description

MODIFIZIERTE GLUTAMAT-DEHYDROGENASE.
Die Erfindung betrifft eine Glutamat-Dehydrogenase, die kovalent an ein lösliches Polysaccharid gebunden ist sowie ein Verfahren zur Verhinderung der Eintrübung von Lösungen von Glutamat-Dehydrogenase.
Glutamat-Dehydrogenase (L-Glutamat:NAD(P) Oxidoreductase, EC 1.4.1.3) katalysiert die Umsetzung von α-Ketoglutarat und NH4 + in Gegenwart von NAD(P)H zu L-Glutamat, H20 und NAD(P)+ . Dieses Enzym hat große Bedeutung in der enzy- matischen Analyse für die Bestimmung von Ammoniak oder NH4 + und zur Entfernung von Ammoniak oder NHA + aus Proben für die enzy atische Bestimmung anderer Parameter wie z.B. Creatinin oder Kalium.
Glutamat-Dehydrogenase aus Säugerleber assoziiert spontan zu Aggregaten mit Molekulargewichten von mehreren Millionen Dalton (H. Arnold et al., Biochim. Biophys. Acta 251 (1971), 133 - 140). Diese Aggregation hat zwar keinen Einfluß auf die enzymatische Aktivität der Glutamat-Dehy¬ drogenase, führt jedoch bei längerer Inkubation von Lösun¬ gen der Glutamat-Dehydrogenase zu einer zunehmenden Trübung. Diese Trübung kann beispielsweise bei photometri- schen Bestimmungsverfahren für Ammoniak oder andere Parame¬ ter (s. o. ) zu Störungen führen. H. Arnold et al. haben zwar gefunden, daß die Glutamat-Dehydrogenase aus Ratten¬ leber nicht das für Säugerleber-Glutamat-Dehydrogenasen typische Assoziationsverhalten zeigt (Biochim. Biophys. Acta 251 (1971), 133 - 140) und demnach weniger eintrübt. Jedoch ist für eine großtechnische Herstellung die Glutamat-Dehydrogenase aus anderen Säugetieren wie insbe¬ sondere Rindern von weitaus größerer Bedeutung.
Aufgabe der Erfindung war es daher, eine Glutamat-Dehydro¬ genase aus Säugetieren zur Verfügung zu stellen, deren Lösungen auch längere Zeit (Wochen und Monate) nach Her¬ stellung nicht oder nur wenig eintrüben.
Diese Aufgabe wird gelöst durch eine wäßrige Lösung von Glutamat-Dehydrogenase (GlDH) aus Säugetieren, die kovalent an ein wasserlösliches Polysaccharid oder Polyurethan gebunden ist. Vorzugsweise wird als wasserlösliches Poly¬ saccharid Dextran, Ficoll oder ein Polyvinylsaccharid verwendet.
Überraschenderweise kann durch eine solche kovalente Bin¬ dung von Glutamat-Dehydrogenase an ein wasserlösliches Polysaccharid oder Polyurethan das für Glutamat-Dehydroge¬ nase typische Aggregationsverhalten, das zu einer Trübung bei längerer Inkubation führt, verhindert werden. Lösungen von nativer GldH trüben bei mechanischen Belastungen (Schütteln, Dehantieren, Pipettieren, Transport in Analy¬ senautomaten) zudem sehr stark ein. Durch eine Modifizie¬ rung der GldH mit Polysacharid oder Polyure-than kann die Empfindlichkeit des Enzyms gegen derartige Belastungen erheblich reduziert werden. Zudem wird durch die Modifizie¬ rung eine deutlich verbesserte Chargenhomogenität für GldH (Aktivität) erreicht.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfah¬ ren zur Verhinderung der Eintrübung von Lösungen von Glutamat-Dehydrogenase aus Säugetieren, insbesondere aus Rindern, durch kovalente Bindung von Glutamat-Dehydrogenase an ein wasserlösliches Polysaccharid oder Polyurethan, vorzugsweise an Dextran, Ficoll oder ein Polyvinylsaccha- rid.
Die kovalente Bindung von Glutamat-Dehydrogenase an wasser¬ lösliche Polysaccharide oder Polyurethane erfolgt nach bekannten Verfahren durch Inkubation des Enzyms mit einem aktivierten Derivat von Polysacchariden oder Polyurethanen. Derartige Verfahren sind zum Beispiel beschrieben in J. Marshall, TIBS 1978, 79 - 83, P. Germain et al. , Biotechno- logy and Bioengineering 33 (1989), 563 - 569, Krysteva et al., Biotechnology and Applied Biochemistry 10 (1988), 124 - 130, M. Kobayashi et al., Agric. Biol. Chem. 53 (1989), 3133 -3138 sowie in EP-B 0 069 379. Vorzugsweise werden mit l-Cyano-4-dimethylamino-pyridinium-tetrafluoroborat (CDAP) oder N-Cyano-N,N,N-triethylammoniumtetrafluoroborat akti¬ viertes Dextran oder Ficoll oder ein gemäß EP-A 0 280 212 aktiviertes Polyurethan verwendet.
Modifizierte Glutamat Dehydrogenase wird in üblichen Puf¬ fern wie Phosphatpuffer, Trispuffer oder vorzugsweise Triethanolaminpuffer bei pH-Werten von 6.5 - 9 in einer Konzentration von 10 U/ml bis zu 1000 U/ml (entsprechend 100 mg modifiziertes Enzym/ml) gelöst. Derartige Lösungen weisen auch bei längeren Inkubationszeiten (Tage bis Wo¬ chen) keine Trübung der Reaktionslösung auf. Die modifi¬ zierte Glutamat Dehydrogenase unterscheidet sich in ihrer Affinität zum Produkt nicht vom nicht modifizierten Enzym. Sie eignet sich daher besonders gut für die enzymatische Bestimmung von Ammoniak oder NH + oder zur Entfernung von Ammoniak oder H4+ aus Proben für die enzymatische Bestim¬ mung anderer Parameter wie z.B. Creatinin oder Kalium. Verfahren zur Bestimmung von Ammoniak oder NH4+ unter Verwendung von Glutamat Dehydrogenase sind dem Fachmann bekannt (z.B. aus Da Fonseca-Wolheim, Z. Klin. Chem. Klin Biochem. 11 (1973) 421 und 426). Dabei wird α-Ketoglutarat mit NH + und NAD(P)H in Gegenwart von Glutamat Dehydrogena¬ se umgesetzt zu L-Glutamat, H2O und NAD(P)+. Die Bestimmung von Ammoniak bzw. NH4+ erfolgt dann in üblicher Weise über die Messung des Verbrauchs an NAD(P)H. Da bei dieser Reak¬ tion der in der Probe vorhandene Ammoniak bzw. H4+ bei einem Überschuß an α-Ketoglutarat vollständig umgesetzt wird, kann über diese Reaktion auch Ammoniak oder NH4+ aus einer Probe entfernt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwen¬ dung einer erfindungsgemäßen Glutamat-Dehydrogenase zur enzymatischen Bestimmung von Ammoniak oder NH4+-Ionen, wobei man die Probe mit α-Ketoglutarat und NAD(P)H in Gegenwart von Glutamat Dehydrogenase inkubiert und den Gehalt an Ammoniak oder NH4+ über den Verbrauch von NAD(P)H bestimmt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist schließlich die Verwendung einer erfindungsgemäßen Glutamat-Dehydrogenase zur Entfernung von Ammoniak oder NH4+-Ionen aus Analysen¬ proben, wobei man die Probe mit α-Ketoglutarat und NAD(P)H in Gegenwart von Glutamat Dehydrogenase inkubiert.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Beispiel 1
Bindung von Glutamat-Dehydrogenase an Dextran
10 g Glutamat Dehydrogenase aus Rinderleber (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog Nr. 151 408, spezifische Aktivität ca. 130 U/mg) in einer Konzentration von 30mg/ml in 2 mol/1 Ammoniumsulfatlösung pH 7 werden 30 Minuten bei 25000 g abzentrifugiert. Der Niederschlag wird in 20 mmol/1 Kalium¬ phosphatpuffer / 1 mmol/1 EDTA pH 6.3 auf das Ausgangsvolu¬ men aufgenommen und über Nacht gegen 4 x 201 20 mmol/1 Kaliumphosphatpuffer/1 mmol/1 EDTA pH 6.3 bei 4°C dialy- siert.
Das Dialysat wird 10 Minuten bei 25000 g abzentrifugiert, mit 20 mmol/1 Kaliumphosphatpuffer pH 7.0 auf eine Protein¬ konzentration von 15 - 20 mg/ml verdünnt und durch Zugabe von 1 mol/1 K2HPO4 ein pH-Wert von 7.0 eingestellt. Nach Zugabe von EDTA ad 1.5mg/ml und α-Ketoglutarat (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog Nr. 040 584) ad 20 mg/ml wird der pH-Wert mit 1 mol/1 K2HPO4 auf 7.0 korrigiert.
Zur Bindung an Glutamat-Dehydrogenase wird 50 g Dextran T 40 (Roth) in 500 ml H2O gelöst und auf 2°C abgekühlt. Unter Rühren wird dann 5 g l-Cyano-4-dimethylamino-pyridinium- tetrafluoroborat (CDAP, Boehringer Mannheim GmbH, Katalog Nr. 783 994) zugegeben und sobald sich das CDAP gelöst hat, 60 ml 0.2 mol/1 Triethylamin (in H2O) zugetropft und 10 Minuten bei 2 - 10°C inkubiert. Sofort anschließend wird mit 1 mol/1 KH2PO4 ein pH-Wert von 8.5 eingestellt, EDTA ad 1.5mg/ml zugegeben und nach Lösung des EDTA der pH-Wert mit 1 mol/1 KH2PO4 auf pH 7.0 korrigiert. Nach Zugabe des vorbereiteten Enzymdialysats wird der pH-Wert erneut mit 1 mol/1 K2HPO4 oder KH2PO4 auf pH 7.0 korrigiert und an- schließend zunächst eine Stunde bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4°C inkubiert.
Der Kopplungsanssatz wird anschließend gegen 20mmol/l Tris/Citrat pH 6.3 bei 4 - 8 °C für 24 Stunden dialysiert. Zur Lyophilisation wird 30 g Crotein C (Croda) im Ansatz gelöst und eine Lösung von 6 g ADP (freie Säure) in 60ml H2O (pH-Wert mit 2 mol/1 Tris-Base auf 6.3 eingestellt) zugegeben. Der Ansatz wird dann über einen Membranfilter (0.2 μm) filtriert und das Filtrat lyophilisiert. Erhalten werden ca. 100 g Lyophilisat mit einer spezifischen Aktivi¬ tät von ca. 8 U/mg. Gemäß HPLC an einer Superose 6 Säule (HR 30 von Pharmacia, Schweden) in 200 mmol/1 Phosphatpuf¬ fer pH 7.2 wird eine vollständige Umsetzung der eingesetz¬ ten Glutamat Dehydrogenase zum modifizierten Enzym erreicht. Die Aktivitätsausbeute beträgt 60 - 70 %.
Beispiel 2
Bindung von Glutamat-Dehydrogenase an Ficoll
20 g Glutamat Dehydrogenase aus Rinderleber werden wie in Beispiel 1 beschrieben, für die Kopplung vorbereitet, jedoch ohne Zugabe von α-Ketoglutarat.
Zur Bindung an Gluamat-Dehydrogenase wird 20 g Ficoll 70 (Pharmacia, Katalog Nr. 177 458) in 200 ml H2O gelöst und auf 2°C abgekühlt. Unter Rühren wird dann 2 g CDAP zugege¬ ben und sobald sich das CDAP gelöst hat, 24 ml 0.2 mol/1 Triethylamin (in H2O) zugetropft und 10 Minuten bei 2 - 10 °C inkubiert. Sofort anschließend wird mit 1 mol/1 KH2 O4 ein pH-Wert von 8.5 eingestellt, EDTA ad 1.5mg/ml zugegeben und nach Lösung des EDTA der pH-Wert mit 1 mol/1 KH2PO4 auf pH 7.0 korrigiert. Nach Zugabe des vorbereiteten Enzymdia- lysats wird der pH-Wert erneut mit 1 mol/1 K2HPO4 oder KH2PO4 auf pH 7.0 korrigiert und anschließend zunächst eine Stunde bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4°C inku¬ biert.
Der Kopplungsansatz wird anschließend gegen 20mmol/l Tris/Citrat pH 6.3 bei 4 - 8°C für 24 Stunden dialysiert. Zur Lyophilisation wird 40 g Rinder-Serumalbumin (Boehrin¬ ger Mannheim GmbH, Katalog Nr. 738 328) im Ansatz gelöst und eine Lösung von 12 g ADP (freie Säure) in 120ml H2O (pH-Wert mit 2 mol/1 Tris-Base auf 6.3 eingestellt) zugege¬ ben. Der Ansatz wird ann über einen Membranfilter (0.2 μm) filtriert und das Filtrat lyophilisiert. Erhalten werden ca. 100 g Lyophilisat mit einer spezifischen Aktivität von ca. 15 U/mg. Gemäß HPLC an einer Superose 6 Säule (HR 30 von Pharmacia, Schweden) in 200 mmol/1 Phosphatpuffer pH 7.2 wird eine vollständige Umsetzung der eingesetzten Glutamat Dehydrogenase zum modifizierten Enzym erreicht. Die Aktivitätsausbeute beträgt 50 - 60 %.
Beispiel 3
Vergleich der Trübungszunähme von modifizierter und nicht modifizierter Glutamat-Dehydrogenase
Nicht modifizierte Glutamat-Dehydrogenase sowie nach Bei¬ spiel 1 mit Dextran modifizierte Glutamat-Dehydrogenase wurde in Parallelansätzen in 100 mmol/1 Tris/HCl pH 8.5 bzw. 250 mmol/1 Tris/HCl pH 7.85 bei einer Proteinkonzen¬ tration von 2mg/ml bis zu 72 Stunden bei 30°C und 37°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeiten wurde die Extinktion bei 366 nm und einer Schichtdicke von 1 cm gegen Puffer gemes¬ sen. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen aufgeli- stet. Die nicht modifizierte Glutamat-Dehydrogenase zeigt eine deutliche Extinktionszunahme im Verlauf der 72-stündi- gen Inkubation, die gemäß Beispiel 1 mit Dextran modifi¬ zierte Glutamat-Dehydrogenase keine oder nur eine geringe Zunahme der Extinktion.
Tabelle 1: Extinktionszunahme von nicht modifizierter Glutamat- Dehydrogenase (2 verschiedene Chargen)
Figure imgf000011_0001
Tabelle 2: Extinktion von mit Dextran modifizierter Glutamat- Dehydrogenase (2 verschiedene Chargen)
Figure imgf000012_0001
Beispiel 4
Bestimmung von H4+ mit Dextran-modifizierter Glutamat Dehydrogenase
1.0 ml Probelösung (EDTA-Plasma bzw. Puffer für den Reage zienleerwert) wird mit 2.0 ml Reagenzlösung (0.12 mmol/1 NADPH, 0.15 mol/1 Triethanolaminpuffer pH 8.6, 15 mmol/1 Ketoglutarat und 1.5 mmol/1 ADP) versetzt, gemischt und 1 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert. Nach Messung der Anfangsextinktion Ej_ (bei 365 n ) von Reagenzienleerwert und Probe werden 20μl Glutamat-Dehydrogenase-Lösung (755 U/ml in Triethanolaminpuffer pH 8.6) zugegeben, gemischt und nach 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur die Extinktion E2 gemessen. Anschließend werden nochmals 20 μl Glutamat-Dehydrogenase zugegeben und nach weiteren 10 Minuten die Extinktion E3 bestimmt.
Die Berechnung der Menge an NH4+ in der Probe erfolgt dann nach
c = 1469 x (ΔEProbe - AEReagenzienleerwert) [μg/100ml] c = 863 x (ΔEProbe - AEReagenzienleerwert) [μ ol/ml]
wobei ΔE = (E1-E2 )-(E2-E3 ) ist.
Beispiel 5
Stabilität der dextranmodifizierten Glutamatdehydrogenase
Gemäß Beispiel 1 kovalent mit Dextran modifizierte Gluta¬ matdehydrogenase wird in 150 mmol/1 Triethanolaminpuffer pH 8,6, welcher 1,5 mmol/1 ADP und 15 mmol/1 α-Ketoglutarat sowie 0,1 % Natriumazid enthält, zu einer Volumenkonzentra¬ tion von 1000 U/ml aufgenommen. Mit dieser Enzymlösung wird wie in Beispiel 4 beschrieben der Gehalt an NH4+-Ionen bzw. NH3 in Standardlösungen (Preciset, Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 166 570) sowie in Ammoniumsulfatlösungen definierter Konzentration bestimmt. Diese Bestimmungen wurden im Laufe mehrerer Wochen wiederholt, wobei die Glutamatdehydrogenase-Lösung zwischen den Bestimmungen bei 2 - 8°C gelagert wurde. Die Stabilität der modifizierten Glutamatdehydrogenase wurde dabei in verschiedener Hinsicht untersucht:
1. Durch Bestimmung des NH4+- bzw. NH3~Gehalts in den obengenannten Proben über einen weiten Konzentra- tionsbereich mit UV-Monotest Ammoniak (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog-Nr. 125847) wird die Funkti¬ onsstabilität der modifizierten Glutamatdehydrogenase bestimmt. Über einen Zeitraum von bis zu 8 Wochen wird auch bei mechanischer Belastung keine Änderung der Funktion der modifizierten Glutamatdehydrogenase in diesem Test beobachtet.
2. Durch Bestimmung der enzymatischen Aktivität der modi¬ fizierten Glutamatdehydrogenase über einen Zeitraum von 10 Wochen kann gezeigt werden, daß die Enzymakti¬ vität über 10 Wochen nicht abnimmt, wenn das Enzym wie oben beschrieben bei 2 - 8°C gelagert wird.
3. Unter Anwendung eines definierten Streßmodells für mechanische Belastung. Zur Überprüfung der Trübungs¬ stabilität wird eine Lösung verwendet von:
1000 U/ml GlDH in 150 mmol/1 Triäthanola in, pH 8,6, 15 mmol/1 α-Ketoglutarat, 1,5 mmol/1 ADP.
Mechanische Belastung:
Über 8 Wochen wird die Lösung einmal pro Woche viermal pipettiert und zweimal dekantiert.
Die Pipettierung erfolgt durch Ansaugen der Lösung mit einer 1 ml-Pipette, mehrfaches Bewegen der Pipette und Wiederauslaufenlassen der Pipette.
Lösungen der dextranmodifizierten Glutamatdehydrogena¬ se zeigen über einen Zeitraum von 8 Wochen hinweg keine Zunahme der Trübung. Das nicht modifizierte Enzym hingegen trübt in erheblichem Umfang ein, wie die folgende Tabelle zeigt. Tabelle 3: Vergleich der Trübungsstabilität von nativer und dextranmodifizierter GL-DH
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000015_0002
(Meßwerte angegeben in Extrinktionswerten, gemessen bei 578 nm Wellenlänge bei 1 cm Schichtdicke)

Claims

Ansprüche
1. Wäßrige Lösung von Glutamat-Dehydrogenase, die kova¬ lent an ein wasserlösliches Polysaccharid oder Polyu¬ rethan gebunden ist.
2. Wäßrige Lösung von Glutamat-Dehydrogenase gemäß An¬ spruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als wasserlös¬ liches Polysaccharid Dextran, Ficoll oder ein Polyvi- nylsaccharid verwendet wird.
3. Verfahren zur Verhinderung der Eintrübung von Lösungen von Glutamat-Dehydrogenase durch kovalente Bindung der Glutamat-Dehydrogenase an ein wasserlösliches Poly¬ saccharid oder Polyurethan.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als wasserlösliches Polysaccharid Dextran, Ficoll oder ein Polyvinylsaccharid verwendet wird.
5. Verwendung einer Glutamat-Dehydrogenase-Lösung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 zur enzymatischen Bestim¬ mung von Ammoniak oder NH4+-Ionen, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß man die Probe mit α-Ketoglutarat und NAD(P)H in Gegenwart einer Glutamat-Dehydrogenase gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 inkubiert und den Gehalt an Ammoniak oder NH4+ über den Verbrauch an NAD(P)H bestimmt.
6. Verwendung einer Glutamat-Dehydrogenase-Lösung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Entfernung von Ammo¬ niak oder NH4+-Ionen aus Analysenproben, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit α-Ketoglutarat und NAD(P)H in Gegenwart einer Glutamat-Dehydrogenase gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 inkubiert.
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