WO1993014784A1 - Vacuna frente a estafilococos y su elaboracion - Google Patents

Vacuna frente a estafilococos y su elaboracion Download PDF

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WO1993014784A1
WO1993014784A1 PCT/ES1993/000007 ES9300007W WO9314784A1 WO 1993014784 A1 WO1993014784 A1 WO 1993014784A1 ES 9300007 W ES9300007 W ES 9300007W WO 9314784 A1 WO9314784 A1 WO 9314784A1
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aureus
strain
vaccine
inoculum
exopolysaccharides
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PCT/ES1993/000007
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Beatriz Amorena Zabalza
Rafael Baselga Domingo
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Consejo Superior Investigaciones Cientificas
Universidad De Zaragoza
Diputacion General De Aragon
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/085—Staphylococcus

Definitions

  • This patent describes a new method for developing an inactivated vaccine directed against staphylococcal infections, using liposomes containing exopolysaccharides.
  • exopolysaccharides therefore inhibits the phagocytosis of bacteria, which represents the main form of immune defense in the case of mamitis (Peterson et al. 1978, Infec. Immun. 19, 943-949). It concludes that the production of antibodies against the mucus could favor the opsonization and phagocytosis of the bacteria, counteracting the virulent effect of the mucus.
  • the aforementioned mucus also has the disadvantage of being little immunogenic (low in immunopotence), which is why, in natural conditions, the affected individual produces few antibodies against it. The consequent lack of opsonization and phagocytosis leads to the progress and chronicity of the infection.
  • Vaccines in the market for staphylococcal mastitis in ruminants are directed against strains of 5. aureus that cause gangrenous mamitis, but not against other staphylococcal species involved in mastitis. These vaccines frequently use toxoids, produced by this bacterial species, in order to reduce the severity of the lesion. They also incorporate inactivated bacteria with the ⁇ n to produce opsonizing antibodies (Watson, 1988, Res. Vet-Sci., 45, 16-21; Meliota, 1990, Attualitá e prospettive nella pro ⁇ lassi della mastite gangrenosum sta ⁇ lococcica deg ⁇ ovini, ed. FATRO, pp. . 32-39).
  • the vaccine developed with the technology described in this patent is being applied in field trials, using 1000 sheep subject to mastitis control in the Basque Country. Likewise, it has been requested to be used by two countries (Morocco and Cyprus) within the framework of an EEC project in which our team participates as coordinator. The French team that collaborates in this project has shown a special interest in the aforementioned technology after their visit (October 1991) to our laboratory.
  • Two species of the genus Staphylococcus (S. aureus and S. simulans) are integrated in order to broaden the protection spectrum (coagulase staphylococcus species - positive and negative), with respect to existing vaccines.
  • a Against the cell wall to favor the opsonization and phagocytosis of non-mucous strains (uses inactivated bacteria, thereby avoiding the risk of bacterial contamination).
  • b Against staphylococcal exotoxins, to limit the tissue damage caused by the pathogen involved in the infection (uses culture supernatants of S. aureus).
  • c Against bacterial exopolysaccharide, to favor the opsonization and phagocytosis of mucous strains (use purified exopolysaccharides, in order to increase the quantity and quality of these).
  • liposomes as an immunopotentiating agent of the humoral response against the exopolysaccharide.
  • the C104 + strain of S. aureus isolated from a case of bovine mamitis by our team, was used as a source of exopolysaccharides. This strain was identified as highly producing exopolysaccharides according to the method applied by this team (Baselga et al. 1991, Current Microbiol., in press).
  • Strains 1A of S. aureus and C338 of S. simulans were used as a source of bacteria, as described below. After the bacteria grew for 18h at 37 ° C in Brain heart infusion broth, a 2 ml aliquot was transferred to each 2-liter flask containing 1.5 liters of BHI. The bacteria were incubated in a total volume of 6 liters (11 flasks) at 37 ° C under stirring (120 rpm) for 5-7.5h, until the end of the exponential phase of growth was reached, which was determined by optical density. The bacteria were inactivated male with fo ⁇ naldehyde (1%) for 24 hours at 4 [ deg.] C.
  • tangential flow (0.16 ⁇ filter) was used to concentrate and wash the bacteria extensively with PBS (pH 7, two). After centrifuging, the bacteria were collected in a final volume of 70 ml and lyophilized after determining the bacterial concentration by optical density (A5 40 ).
  • Strain 1A of S. aureus was used as a source of exotoxins. For this, the supernatant obtained by tangential flow in the previous point was concentrated, washed extensively with PBS (pH 7.2), using again tangential flow (10,000D filter) until reaching a final volume of 360 ml, and lyophilized.
  • strain C104 + grew in Tryptic I am broth supplemented with 2% glucose (TSB-G).
  • the glucose in a concentration of 20% was sterilized by filtration and added to the medium (TSB) when it had reached the temperature of 70-80 ° C.
  • TSB medium
  • the bacteria were incubated in a total volume of 6 liters (11 flasks) at 37 ° C under stirring (120 rpm) for 5-7.5h until reaching the end of the exponential phase of growth, as determined by optical density.
  • the Supernatant was separated from bacteria by tangential filtration (Pellicon, Millipore; USA) using a 0.16 ⁇ filter. The remaining supernatant that could not be recovered by filtration was collected after centrifugation of the bacteria.
  • tangential filtration with a 10,000 D filter was used, collecting the final sample in an approximate volume of 360 ml, after being extensively washed with physiological saline. To this volume was added sodium azide (0.01%) and two successive digestions of nucleic acids with DNase (0.1 mg / ml) and RNAse (0.02 mg / ml; both from Boehringer, Germany) were performed.
  • the first of the digestions was carried out throughout the night, while the second was 6 hours. Subsequently, two digestions with pronase (0.1 mg / ml; Boehringer) were performed, following the same pattern as the previous ones. The rest of the enzymes were removed by phenolic extraction with phenol / chloroform / isoamyl acid (25/25/1; v / v / v), previously washed with PBS. The mixture was centrifuged at 2500 g (15 min) and the aqueous phase was recovered. This phase was dialyzed against PBS and then against distilled water by tangential flow using a 10,000D filter. It was then lyophilized, obtaining 1 g of exopolysaccharides.
  • the sample contained traces of nucleic acids, as determined by absorbance at 280 nm, and traces of proteins, as determined by the method of Bradford (1976, Analyt Biochem. 72: 248-258).
  • liposomes were prepared as described by New and cois, in "Liposomes: a practical approach” (1990; IRL Press, page 56) with slight modifications, as set forth below:
  • the doses and components of the vaccine were determined based on the results obtained in the experiences described below.
  • va ⁇ -aal components are distributed in two inoculums (A and B); both are injected simultaneously in each individual.
  • Inactivated strain 1A (10 10 bacteria; 2.63 mg).
  • Inactivated strain C338 (IO 10 bacteria; 4 1 mg)
  • Exotoxins 22.63 mg, corresponding to the amount produced by 10 10 bacteria
  • Adjuvant 150 mg Dextran sulfate T500, Pharmacia, LKB; Sweden
  • inoculum A 150 mg Dextran sulfate T500, Pharmacia, LKB; Sweden
  • the inoculum B components are initially reconstituted in 0.2 ml of PBS, subsequently completing up to 1 ml.
  • the inoculation is performed intramuscularly, applying each of the inoculums at a different point of the individual.
  • the administration of the vaccine is carried out ideally on two dates (a first immunization with inoculum A and B, and a memory with both inoculums), with an interval of 60 to 90 days between them. (The recommended protocol is detailed in Fig. 1 for immunization in sheep).
  • the vaccine does not cause detectable side effects or introduces new pathogens into the environment.
  • the proposed patent is of special interest to the veterinary pharmaceutical industry as a prophylactic measure against staphylococcal mastitis of different dairy-producing livestock species and may be susceptible to use in human medicine against staphylococcal infections.
  • TEST Humoral response against staphylococci isolated from sheep mastitis using inoculum A
  • the ELISA was performed according to the technique described by Poutrel and cois, (personal communication), as described below.
  • the wells of microtiter plates (Nunc, Maxisorp) were upholstered with strains 1A (S. aureus), C338 (S. simulans), C330 (5. hyiats), C333 (5. epidermidis), C335 (S. warnery ⁇ ) and C340 (S. chromogenes).
  • strains 1A S. aureus
  • C338 S. simulans
  • C330 5. hyiats
  • C333 5. epidermidis
  • C335 S. warnery ⁇
  • C340 S. chromogenes
  • the supernatant of strain 1A was used without concentrating to determine the neutralization power of the hemolytic activity (attributable to the antibodies against the inoculated toxoid) presented by the immune sera in lots 1 and 2.
  • 50 ⁇ l of the supernatant was incubated (lh at 37 ° C) with 50 ⁇ l of the immune sera (lots 1 and 2) and the normal sera (non-immune: lot 5) at various dilutions (1/1 to 1/1024), all obtained in the weeks O and or.
  • 50 ⁇ l of a 0.5% suspension of sheep and rabbit erythrocytes were added to determine the alpha and beta hemditic activities, respectively.
  • Prior to reading incubation was performed for 1 hour at 37 ° C and, in the case of sheep erythrocytes, for an additional hour at 4 ° C, stirring in every case every half hour.
  • the liposomes used were prepared following the procedure already indicated, with the proportions (exopolysaccharideriposomes) listed in Table 2.
  • Rasa Aragonese sheep Fourteen non-pregnant Rasa Aragonese sheep were randomly distributed in experimental lots (2 animals per lot; 4 lots with liposomes and another 4 without them but with the adjuvant dextran; Dextran T500, Pharmacia), as indicated in Table 2. In each one of the animals, two intramuscular inoculations (lml per inoculadón) were made with an interval of 33 days between them. Serum samples were obtained every 7 days, for 8 weeks, beginning the same day of inoculation.
  • the ELISA was performed according to the technique described in Test 1.
  • the microtiter plate pods were upholstered with exopolysaccharide (purified as described), using strain C104 +.
  • 100 ⁇ l of an exopolysaccharide suspension (15 g / ml distilled water) was distributed in each of the wells and dried when incubated overnight at 45 ° C.
  • the bacteria used Prior to the experimental infection, the bacteria used believed in BHI. Aliquots were prepared in BHI supplemented with glycerol (5%) with a bacterial concentrate of 100 uf per ml and freezing. This process did not alter the viability. On the day of inoculation, the sample was thawed and the cfu / ml number was determined. In all cases 100 cfu (90-120) were inoculated in both breasts. With the intra-mammary infection in both breasts we make sure that the lamb sucks both and that at least one of the two breasts is infected. (Intra-mammary infection ensures that bacteria penetrate all breasts in a homogeneous way.)
  • a bacteriological sample was taken on the day of infection (no breast was infected) and at 48, 72 and 96 h after inoculation. At the same time, the condition of the breast was clinically assessed by palpation with ratings (readings) ranging from (1) healthy or slight inflammation, to (3) gangrenous mastitis.
  • the most indicative data of infection establishment were: a) positive or negative bacteriology in the case of S. simulans; and b) the injury in the case of S. aureus. As lactation progressed, all the animals infected by S. aureus tended to develop the lesion, possibly because the lamb stopped breastfeeding, so the lesion reading was established at 96 h as the most differentiating data.
  • Table 4 Number of animals with the different degrees of injury according to the period after inoculation of S. aureus and according to the vaccine lot.
  • Fig. 1 Humoral response of lots 1-2 and 5 against S. aureus strain 1A, evaluated by the ELISA test.
  • Fig. 2. Humoral response of lots 1-2 and 5 against S. simulans strain C338, evaluated by the ELISA test.
  • Fig. 3. Humoral response of lots 1-2 and 5 against the supernatant of strain 1A of S. aureus, evaluated by the ELISA test.
  • Fig. 4. Humoral response to the S. aureus mucus, assessed by the test
  • Staphylococcus aureus 1A, C104 + and simulans C 338 are deposited in The National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Ltd of the United Kingdom, under the identifications NCIMB 40457, 40458 and 40459 respectively.

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Abstract

La vacuna elaborada está integrada por cinco componentes: a) bacterias inactivadas del género Staphylococcus (S. aureus, cepa 1A y S. simulans, cepa C338); b) exotoxinas de S. aureus (cepa 1A); c) adyuvante dextran sulfato; d) exopolisacáridos purificados de S. aureus (cepa C104+) y e) liposomas que contienen dichos exopolisacáridos. Está compuesta por los inóculos A y B: los componentes a, b y c integran el inóculo A y los componentes d y e constituyen el inóculo B. Todas la cepas constituyentes fueron aisladas para la vacuna. La utilización de exopolisacáridos purificados y de liposomas para inmunopotenciarlos (inóculo B) hacen a esta vacuna eficaz frente a cepas mucosas de Staphylococcus, mientras que la aplicación del inóculo A la hacen útil frente a cepas no mucosas de este género, así como frente a las toxinas de S. aureus. Esta vacuna puede ser aplicada a especies de rumiantes (frente a la mamitis) y también es susceptible de uso en la especie humana.

Description

MEMORIA DESCRIPTIVA
VACUNA FRENTE A ESTAFILOCOCOS Y SU ELABORACIÓN"
SECTOR DE LA TÉCNICA
Esta patente describe un nuevo método para elaborar una vacuna inactivada dirigida frente a infecciones estafilocócicas, utilizando liposomas que contienen exopolisacáridos.
ESTADO ACTUAL DEL TEMA
En medicina humana, especialmente en pacientes en los que se ha introducido algún tipo de bioma-erial (catéteres, prótesis, etc.), son frecuentes las infecciones estafilocócicas y difíciles de eliminar por antibioterapia, debido a la presencia de bioΩlms bacterianos en los que las bacterias se hallan rodeadas de una matriz de exopolisacáridos
(Christensen y cois. 1985, J. Clin. Microbiol.22, 996-1006)
Por otro lado, en rumiantes, y más concretamente en ovino, la mayoría de los procesos mamíticos están producidos en su mayoría por el género Staphylococcus, siendo S. aureus la especie más prevalente y virulenta de este género (McCarthy y cois. 1988, J. Anim. Sci. 66, 2715-2721).
Parte de la ineficacia de las vacunas frente a estafilococos (Watson, 1988, Res. Vet Sci., 45, 16-21) se debe al hecho de que muchas de las bacterias escapan al ataque inmunitario mediante la producción de exopolisacáridos. Se ha comprobado "in vitro" que esta capa mucosa, si bien no impide la fijación de opsoninas (inmunoglobulinas y complemento) a la superficie bacteriana, sí inhibe la interacción de estas con los receptores para las opsoninas situados en los fagocitos (fundamentalmente neutróΩlos en los procesos mamíticos). La producción de exopolisacáridos por lo tanto inhibe la fagocitosis de las bacterias, la cual representa la principal forma de defensa inmunológica en el caso de la mamitis (Peterson y cois. 1978, Infec. Immun. 19, 943-949). De ello se concluye que la producción de anticuerpos frente al mucus podría favorecer la opsonización y fagocitosis de las bacterias, contrarrestando el efecto virulento del mucus.
La presencia de exopolisacáridos "in vivo" durante la infección mamaria bovina producida por S. aureus ha sido puesta en evidencia por Watson (1989, Res. Vet. Sci., 47, 152-157) y Johne y cois. (1989, J. Clin. Microbiol., 27: 1631-1635). Asimismo, nosotros hemos comprobado "in vivo" en la infección mamaria ovina producida por esta especie bacteriana la presencia de dichos exopolisacáridos (datos no publicados).
El mencionado mucus presenta a su vez la desventaja de ser poco iπmunogénico (bajo en inmunopotencia), por lo cual, en condiciones naturales, el individuo afectado produce escasos anticuerpos frente al mismo. La consiguiente falta de opsonización y fagocitosis conduce al progreso y a la cronicidad de la infección.
Las vacunas existentes en el mercado para las mamitis estafilocócicas en rumiantes están dirigidas frente a cepas de 5. aureus causantes de mamitis gangrenosas, pero no frente a otras especies de estafilococos implicadas en la mamitis. Estas vacunas frecuentemente utilizan toxoides, producidos por esta especie bacteriana, con el fin de reducir la gravedad de la lesión. También incorporan bacterias inactivadas con el Ωn de producir anticuerpos opsonizantes (Watson, 1988, Res. Vet- Sci., 45, 16-21; Meliota, 1990, Attualitá e prospettive nella proΩlassi della mastite gangrenosa staΩlococcica degϋ ovini, ed. FATRO , págs. 32-39). El uso del adyuvante Dextran sulfato parece asegurar la respuesta prioritariamente con anticuerpos de la dase IgG2 (Watson, 1988, Res. Vet. Sci., 45, 16-21). Sin embargo, las vacunas actuales en ningún caso incorporan exopolisacáridos purificados ni componentes para aumentar la inmunopotencia de estos. Ξlo puede ser la causa de la ineficacia de estas vacunas.
La vacuna desarrollada con la tecnología descrita en esta patente está siendo aplicada en ensayos de campo, utilizando 1000 ovejas sometidas a control de mamitis en el País Vasco. Asimismo, se ha solicitado su utilización por parte de dos países (Marruecos y Chipre) en el marco de un proyecto de la CEE en el que nuestro equipo participa como coordinador. El equipo francés que colabora en dicho proyecto ha mostrado un especial interés por la mencionada tecnología tras su visita (Octubre 1991) a nuestro laboratorio.
EXPLICACIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Las características principales de la vacuna elaborada son las siguientes:
1. La intregran dos especies del género Staphylococcus (S. aureus yS. simulans) con el fin de ampliar el espectro de protección (especies de estafilococos coagulasa-- positivas y negativas), respecto de vacunas existentes.
2. Incluye varios componentes, seleccionados con el fin de provocar en el individuo receptor la producción de anticuerpos de varias especificidades: a Frente a ia pared celular, para favorecer la opsonización y la fagocitosis de las cepas no mucosas (utiliza bacterias inactivadas, con lo cual evita el riesgo de contaminación bacteriana). b: Frente a las exotoxinas estafilocócicas, para limitar el daño tisular producido por el agente patógeno implicado en la infección (utiliza sobrenadantes de cultivos de S. aureus). c Frente al exopolisacárido bacteriano, para favorecer la opsonización y la fagocitosis de las cepas mucosas (utiliza exopolisacáridos purificados, con el fin de aumentar la cantidad y calidad de estos).
3. Lleva incorporado un adyuvante promotor de la producción de IgG2 (Dextran sulfato T500; Pharmacia).
4. Utiliza liposomas como agente inmunopotenciador de la respuesta humoral frente al exopolisacárido.
5. Todas las especies bacterianas utilizadas para la elaboración de esta vacuna han sido aisladas por este equipo (inventores).
La descripción detallada de la patente (modo de obtención de la vacuna) se expone a continuación, siguiendo el orden metodológico aplicado para la obtención de los diferentes componentes.
Cepas bacterianas empleadas
La cepa 1 A de 5. aureus fue utilizada para la obtención de toxoide y de bacterias enteras inactivadas. Esta cepa fué aislada y caracterizada por nuestro equipo de un caso de mamitis gangrenosa ovina (Amorena y cois. 1991, J. Comp. Pathol, 104: 289-302), habiéndose empleado para la infección experimenta] en las especies cunícola y ovina (Amorena y cois., 1991, J. Comp. Pathol., 104: 289-302; Penadés y cois., 1991, ITEA, 11, 760-762).
La cepa C338 de S. simulans, aislada de un caso de mamitis subclínica ovina por nuestro equipo, fue utilizada para obtener bacterias inactivadas.
La cepa C104+ de S. aureus, aislada de un caso de mamitis bovina por nuestro equipo, fue utilizada como fuente de exopolisacáridos. Esta cepa fue identificada como altamente productora de exopolisacáridos según el método aplicado por este equipo (Baselga y cois. 1991, Current Microbiol., en prensa).
Obtención de bacterias inactivadas
Se utilizaron las cepas 1A de S. aureus y C338 de S. simulans como fuente de bacterias, según se describe a continuación. Después de crecer las bacterias durante 18h a 37°C en caldo Brain heart infusión, se transfirió una alícuota de 2 mi a cada matraz de 2 litros que contenía 1,5 litros de BHI. Las bacterias se incubaron en un volumen total del6 litros (11 matraces) a 37°C en agitación (120 rpm) durante 5-7,5h, hasta alcanzar el final de la fase exponencial de crecimiento, lo cual se determinó por densidad óptica. Las bacterias se inacti varón con foπnaldehído (1%) durante 24h a 4βC. Tras determinar la ausencia de viabilidad, se utilizó flujo tangencial (filtro de 0,16 μ) para concentrar y lavar las bacterias extensamente con PBS (pH 7,2). Después de centrifugar, las bacterias se recogieron en un volumen final de 70 mi y se liofilizaron tras determinar la concentración bacteriana por densidad óptica (A540).
Obtención de exotoxinas
Se utilizó la cepa 1A de S. aureus como fuente de exotoxinas. Para ello, el sobrenadante obtenido mediante flujo tangencial en el punto anterior se concentró, se lavó extensamente con PBS (pH 7,2), usando de nuevo flujo tangencial (filtro de 10.000D) hasta alcanzar un volumen final de 360 mi, y se liofilizó.
Purificación de exopolisacáridos
Se utilizó el método descrito por Fournier y cois. (1987, Ann. Inst.
Pasteur/Microbiol., 138: 561-567) con ligeras modificaciones, según se indica a continuación. Brevemente, La cepa C104+ creció enTryptic soy broth suplementado con glucosa al 2% (TSB-G). La glucosa en una concentración del 20% fue esterilizada por filtración y añadida al medio (TSB) cuando este había alcanzado la temperatura de 70- 80°C. Después de 18h a 37°C, se transfirió una alícuota de 2 mi a cada matraz de 2 litros que contenía 1,5 litros de TSB-G. Las bacterias fueron incubadas en un volumen total del6 litros (11 matraces) a37°C en agitación (120 rpm) durante 5-7,5h hasta alcanzar el final de la fase exponencial de crecimiento, según se determinó por densidad óptica. El sobrenadante se separó de las bacterias mediante filtración tangencial (Pellicon, Millipore; USA) usando un filtro de 0, 16 μ. El sobrenadante restante que no pudo ser recuperado por filtración se recogió tras la centrifugación de las bacterias. Para concentrar el exopolisacándo se utilizó la filtración tangencial con un filtro de 10.000 D, recogiendo la muestra final en un volumen aproximado de 360 mi, tras ser extensamente lavado con solución salina fisiológica. A este volumen se le añadió azida sódica (0,01%) y se realizaron dos digestiones sucesivas de ácidos nucleicos con DNAsa (0,1 mg/ml) y RNAsa (0,02 mg/ml; ambas de Boehringer, Alemania). La primera de las digestiones se realizó durante toda la noche, mientras que la segunda fué de 6 h. Posteriormente, se realizaron dos digestiones con pronasa (0,1 mg/ml; Boehringer), siguiendo el mismo patrón que las anteriores. El resto de las enzimas se eliminó mediante una extracción fenólica con fenol/cloroformo/ácido isoamílico (25/25/1 ; v/v/v), previamente lavado con PBS. La mezcla se centrifugó a 2500 g (15 min) y se recuperó la fase acuosa. Esta fase se dializó frente a PBS y luego frente a agua destilada mediante flujo tangencial usando un filtro de 10.000D. A continuación se liofilizó, obteniéndose 1 g de exopolisacáridos.
La muestra contenía trazas de ácidos nucleicos, según se determinó mediante la absorbancia a 280 nm, y trazas de proteínas, según se determinó mediante el método de Bradford (1976, Analyt Biochem. 72: 248-258).
Preparación de iiposomas con exopolisacáridos
Materiales:
Fosfatidilcolina (SIGMA, código P9671) Cdesterol (SIGMA, código C8667) Dicetil fosfato (SIGMA, código D2631)
Procedimiento:
Se prepararon los liposomas según describen New y cois, en "Liposomes: a practical approach" (1990; IRL Press, pág. 56) con ligeras modificaciones, según se expone a continuación:
(i) Los constituyentes se prepararon en las siguientes proporciones: 120 mg de fosfatidilcolina, 60 mg de colesterol y 10 mg de dicetil fosfato. La mezcla se resuspendió en 5 mi de cloroformo, utilizando un recipiente de 50 mi que se acoplaría posteriormente al rotovapor.
(ii) El cloroformo fué eliminado de la muestra mediante el vacío aplicado en el rotovapor. Durante este tiempo, el recipiente estaba introducido en un baño a 40°C y en rotación (80 rpm).
(iii) Se añadieron 5 mi de agua destilada. La muestra se resuspendió mediante agitación y se traspasó a un tubo de 10 mi.
En todos los pasos anteπores el recipiente estaba sellado herméticamente y el aire fué sustituido por nitrógeno.
(iv) Se sónico la muestra introduciendo la varilla del sonicador a través d tapón de goma que sellaba herméticamente el tubo. La sonicación se realizó a lo largo de 45 min, sonicando por periodos de 20 segundos y permitiendo que la muestra se enfriara durante 40 segundos. Para que la temperatura no subiera, el tubo estuvo en todo momento sumergido en un baño refrigerante. Simultáneamente se pasó una corriente continua de nitrógeno por la muestra.
(v) Se añadieron 2 mi de agua destilada con la suspensión de exopolisacándos para conseguir una concentración final de 0,5: 1 (exopolisacáridos:liposomas; p/p)
(vi) La mezcla se liofilizά.
EJEMPLO (Preparación y aplicación del inoculo vacunal)
Las dosis y los componentes de la vacuna se determinaron según los resultados obtenidos en las experiencias realizadas que se describen más adelante.
Constitución de los inóculos vacunales
Los componentes vaα-aales se distribuyen en dos inóculos (A y B); ambos se inyectan simultáneamente en cada individuo.
Constitución del inoculo A/dosis/individuo:
Cepa 1A inactivada (1010 bacterias; 2,63 mg). Cepa C338 inactivada (IO10 bacterias; 4 1 mg) Exotoxinas (22,63 mg, correspondientes a la cantidad producida por 1010 bacterias)
Adyuvante (150 mg de Dextran sulfato T500, Pharmacia, LKB ; Suecia) Estos componentes del inoculo A se reconstituyen en 1 mi de PBS.
Constitución del inoculo B/dosis/individuo:
Liposomas que contienen el exopolisacárido (3 mg), elaborado según se ha descrito en el apartado anterior. Los componentes del inoculo B se reconstituyen inicialmente en 0,2 mi de PBS, completando posteriormente hasta 1 mi.
Protocolo de inmunización
Ruta:
La inoculación se realiza por vía intramuscular, aplicando cada uno de los inóculos en un punto distinto del individuo.
xAdministración:
La administración de la vacuna se realiza idóneamente en dos fechas (una primera inmunización con los inóculos A y B, y un recuerdo con ambos inóculos), con un intervalo de 60 a 90 días entre ellas. (El protocolo recomendado se detalla en la Fig. 1 para inmunización en ganado ovino).
Consideraciones
La vacuna no causa efectos secundarios detectables ni introduce nuevos patógenos en el ambiente.
APLICACIONES
La patente propuesta es de especial interés para la industria farmacéutica veterinaria como medida profiláctica frente a las mamitis estafilocócicas de distintas especies ganaderas productoras de leche y puede ser susceptible de uso en medicina humana frente a infecciones estafilocócicas.
ENSAYOS UTILIZADOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN Y DE LA DOSIS VACUNAL
ENSAYO 1. Respuesta humoral frente a estafilococos aislados de mamitis ovina utilizando el inoculo A
Metodología
Inmunización:
Veinticuatro ovejas de raza Rasa Aragonesa, no gestantes, fueron distribuidas al azar en cinco lotes experimentales, según se indica en la Tabla 1. En cada uno de los animales, se realizaron dos inmunizaciones intramusculares (lml por inoculación) con un intervalo entre ellas de 33 días. Se obtuvieron muestras de suero cada 7 días, durante 8 semanas, comenzando el mismo día de la inoculación.
Titulación de anticuerpos mediante ensayo inmunoenzimdtico (ELISA):
El ELISA se realizó de acuerdo con la técnica descrita por Poutrel y cois, (comunicación personal), según se describe a continuación. Los pocilios de las placas microtiter (Nunc, Maxisorp) fueron tapizados con las cepas 1A (S. aureus), C338 (S. simulans), C330 (5. hyiats), C333 (5. epidermidis), C335 (S. warneryí) y C340 (S. chromogenes). Para ello, tras crecer las bacterias toda la noche en BHI (37°C), se inocularon 20 μl del cultivo en 8 mi de BHI, incubándose la suspensión en agitación durante 6 h a 37°C. Tras dos lavados, las bacterias se diluyeron en PBS (pH 7,2) ajustando la concentración mediante absorbancia (A60CF0.2). Cien micro-itros de esta suspensión se distribuyeron en cada uno de los pocilios y se incubaron durante la noche a 4βC. A continuación, se lavaron dos veces las placas con PBS-Tween 20 (0,1%), se secaron y se conservaron a 4°C hasta día del test
El mismo protocolo se siguió para tapizar los pocilios con el liofilizado del sobrenadante de la cepa 1A (15 g/ml de agua destilada), con la diferencia de que la unión del sobrenadante a la placa se consiguió mediante evaporación (18h a 45° . Los sueros problema se testaron a una dilución 1/100. El conjugado utilizado fué suero de conejo anti-IgG de oveja
nhibición de la hemolisis:
El sobrenadante de la cepa 1A fue utilizado sin concentrar para determinar el poder de neutralización de la actividad hemolítica (atribuíble a los anticuerpos frente al toxoide inoculado) que presentaban los sueros inmunes en los lotes 1 y 2. Para ello, 50 μl del sobrenadante se incubaron (lh a 37°C) con 50 μl de los sueros inmunes (lotes 1 y 2) y de los normales (no inmunes: lote 5) a varias diluciones (1/1 a 1/1024), todos ellos obtenidos en las semanas O y ó. Posteriormente, se añadieron 50 μl de una suspensión al 0,5% de eritrocitos de oveja y de conejo, para determinar las actividades hemdíticas alfa y beta, respectivamente. Previo a la lectura, se realizó la incubación durante lh a 37°C y, en el caso de los eritrocitos de oveja, durante una hora adicional a 4°C, agitando en todos los casos cada media hora. Resultados v discusión;
Aunque el lote 1 (Tabla 1) mostraba una tendencia a producir una respuesta más alta, no se encontraron diferencias significativas entre los lotes 1 y 2 frente a ninguna de las cepas testadas ni frente al sobrenadante (r=0,7; P<0,05), por lo que los datos correspondientes a ambos lotes se agruparon.
Según se ilustra en las Figs. 2 y 3, al comparar los lotes 1 y 2 (con sobrenadante que contenía los toxoides) con el lote 5 (sin sobrenadante), pudo observarse que los primeros lotes ( 1 y 2) presentan una respuesta más alta frente a todas las cepas desde la primera inoculación, manteniéndose esta respuesta elevada tras la segunda inoculación. Esta alta respuesta puede deberse a un efecto inmunopotenciador del sobrenadante en los lotes 1 y 2. En el lote 5, se observaron más claramente dos picos en la respuesta humoral. Esta respuesta fué más débil que la de los lotes 1 y 2, concretamente frente a dos cepas (lA y C338).
Como cabía esperar, sólo presentaron una respuesta clara frente al sobrenadante los lotes 1 y 2, aunque en este caso se aprecia una mayor respuesta tras la segunda inmunización (Fig. 4). Esta respuesta podría potenciarse si en lugar de efectuar la segunda inmunización al mes de la primera, se aplicase más tarde (entre 60 y 90 días). Así habría una mayor amplificación de la respuesta inmune. Los lotes 3 y 4 (con inmunógenos constituidos por las cepas 1 A y C338, respectivamente) presentaron frente a todas las cepas y frente al sobrenadante una débil respuesta (datos no ilustrados). Ninguno de los lotes reaccionó frente a las cepas C335 (S. warneri) y C340 (5. chromogenes; datos no presentados). La conveniencia de incluir estas cepas como inmunógenos en una vacuna de campo dependerá de la incidencia de estos microorganismos entre los rebaños implicados.
En el ensayo de inhibición de la hemolisis, sólo los sueros obtenidos en los lotes 1 y 2 a la sexta semana fueron capaces de neutralizar las hemoiisinas a unos títulos de 1/16 ó 1/32. El resto de los sueros no poseía anticuerpos neutralizantes o si estos existían, neutralizaban las hemolisinas a un título de 1/1 (datos no presentados).
En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo, indican que con los inóculos de los lotes 1 y 2 se obtienen anticuerpos frente a las especies S. aureus, S. simulans, S. hyicus y S. epidermidis y que las mejores respuestas inmunitarias frente a las bacterias y sus toxoides corresponden a aquellos lotes en los que ambos componentes se inocularon simultáneamente (lotes 1 y 2), hechos a tener en cuenta de cara a la elección del inmunógeno consututivo de la vacuna objeto de esta invención. Dado que no se observaron diferencias entre los lotes 1 y 2, se eligió como dosis idónea para la mencionada vacuna la correspondiente al lote 2, es decir la menos concentrada de ambas.
Tabla 1. Com osidón de los inóculos utilizados
Figure imgf000012_0001
ENSAYO 2. Uso de liposomas en la inmunización frente al exopolisacárido de Staphylococcus aureus (inoculo B)
Teniendo en cuenta el bajo poder antigénico del mucus, se han realizado en este estudio distintos ensayos de inmunización frente al mismo, una vez obtenido a partir de una cepa de S. aureus aislada de mamitis ovina, con el fin de incrementar su inmunopotencia de cara a la elaboración de nuevas vacunas. Hemos considerado que el uso de liposomas implica procedimientos más senάllos y rentables que los asodados a la utilizadón de moléculas transportadoras para la inmunopotendadón del exopolisacárido.
Metodología
Componentes del inoculo:
Los liposomas utilizados se elaboraron siguiendo el procedimiento ya indicado, con las proporciones (exopolisacáridαrliposomas) que figuran en la Tabla 2.
Protocolo de inmunización:
Catorce ovejas no gestantes Rasa Aragonesa se distribuyeron al azar en lotes experimentales (2 animales por lote; 4 lotes con liposomas y otros 4 sin ellos pero con el adyuvante dextrano; Dextran T500, Pharmacia), según se indica en la Tabla 2. En cada uno de los animales, se realizaron dos inoculaciones intramusculares ( lml por inoculadón) con un intervalo de 33 días entre ellas. Se obtuvieron muestras de suero cada 7 días, durante 8 semanas, comenzando el mismo día de la inoculación.
Tabla 2.- Composición de los inóculos utilizados
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0002
*Con 50 mg de Dextran T500 (Pharmada, Uppsala, Sueda)
Titulación de anticuerpos frente al exopolisacárido mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA):
El ELISA se realizó de acuerdo con la técnica descrita en el Ensayo 1. Los podllos de las placas microtiter se tapizaron con exopolisacárido (purificado según se ha descrito), utilizando la cepa C104+. Para ello, se ditribuyeron 100 μl de una suspensión de exopolisacárido (15 g/ml de agua destilada) en cada uno de los pocilios y se desecaron al incubarse durante la noche a 45°C.
Resultados v discusión
Tras un estudio estadístico ("t" de Student), no se encontraron diferencias significativas entre las respuestas correspondientes a los lotes 1, 2, 3 y 4 (con liposomas), por lo que estos se agruparon. Por otra pane y por el mismo motivo, se agruparon los lotes 5, 6 y 7 (sin liposomas, pero con el adyuvante dextrano). Según se ilustra en la Fig. 5, solamente se obtuvo una respuesta frente al mucus cuando se utilizaron los inóculos que contenían liposomas (lotes 1, 2, 3 y 4).
En conclusión, en este trabajo se ha demostrado que el efecto de los liposomas sobre el poder inmunogénico del exopolisacárido es intenso en reladón al que ejerce el adyuvante dextrano. Este efecto inmunopotendador de los liposomas se observa incluso cuando la cantidad de antígeno (mucus) es muy pequeña (loie 4). Todo ello indica que la utilización de los liposomas es altamente aconsejable para vacunas que incluyan exopolisacárido de 5. aureus en el inoculo.
ENSAYO 3. Infección experimental
Material v métodos
Animales
Se utilizaron 42 ovejas de la raza Rasa Aragonesa para esta experiencia, distribuidos en los siguientes lotes:
1. -Control: sin vacunar.
2.-Vacunado con bacterias y exotoxinas, sin exopolisacáridos ni liposomas
(vacuna del lote 2 del experimento 1). 3. -Vacunado con bacterias y exotoxinas, con exopolisacáridos y liposomas
(vacuna de esta patente). Todos los animales fueron infectados a los 20-25 días post-parto.
Bacterias
En la infección experimenta] se utilizaron las cepas C338 de S. simulara y C195+ de S. aureus .
Infección experimental
Previamente a la infección experimental, las bacterias utilizadas crederon en BHI. Se prepararon alícuotas en BHI suplementado con glicerol (5%) con una concentradón bacteriana de 100 uf por mi y se procedió a su congelación. Dicho proceso no alteró la viabilidad. El día de la inoculadón se descongeló la muestra y se determinó el número de ufc/ml. En todos los casos se inocularon 100 ufe (90-120) en ambas mamas. Con la infección intramamaria en las dos mamas nos aseguramos de que el cordero mamara de ambas y de que al menos una de las dos mamas resultase infectada. (La infección intramamaria asegura el hecho de que las bacterias penetren en todas las mamas de una forma homogénea).
Los corderos se separaron de sus madres 1 h antes de la inoculación, y se reincorporaron junto a ellas de 2 a 4 h después de la misma. Toma de muestras y valoración clínica
Se tomó una muestra bacteriológica el día de la infección (ninguna mama estaba infectada) y a las 48, 72 y 96 h tras la inoculación. Al mismo tiempo, se valoró clínicamente el estado de la mama por palpación con las calificaciones (lecturas) que oscilaban desde (1) sana o ligera inflamación, hasta (3) mamitis gangrenosa.
Resultados
Como datos más indicativos del establecimiento de la infección se tomaron: a) la bacteriología positiva o negativa en el caso de S. simulans ; y b) la lesión en el caso de S. aureus. Al avanzar la lactación todos los animales infectados por S. aureus tendían a desarrollar la lesión, posiblemente debido a que el cordero dejaba de mamar, por ello se estabJedó la lectura de la lesión a las 96 h como el dato más diferendador.
Infección por S. simulans:
No se encontraron lesiones clínicas, por lo que en este caso sólo se consideraron los resultados bacteriológicos. Los resultados se reflejan en la Tabla 3.
Tabla 3. Efecto protector de la vacuna en la infecdón experimental por S. simulans
Mamas Mamas bacteriología- Mamas bacteriología- positivas negativas
No vacunadas 9 1
Vacunadas (vacuna de los lotes 263) 2 12
Se encontraron diferendas significativas entre los animales vacunados y los no vacunados (P<0,001) respecto de la probabilidad de contraer la infecdón por S. simulans (estafilococos coagulasa-negativos).
Infección por S. aureus (C195+)
Se consideró en este caso la lesión por individuo, valorando la lesión de la mama más afectada en el caso de que se infectaran las dos mamas. Los resultados se ilustran en la Tabla 4.
Tabla 4. Número de animales con los distintos grados de lesión según el periodo transcurrido tras la inoculación de S. aureus y según el lote vacunal.
Grado de 48 h 72 h 96 h
Figure imgf000016_0001
De la experiencia preliminar ilustrada en la Tabla 4, se concluye que la vacuna sin liposomas (lote 2) no protege frente a S. aureus, mientras que la vacuna con liposomas
(lote 3) parece proteger frente a esta especie bacteriana al inocular 100 ufe en un animal.
Dicho efecto puede atribuirse a la utilizadón de exopolisacáridos incluidos en liposomas y está corroborándose actualmente en experiencias de campo.
LEYENDA DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Respuesta humoral de los lotes 1-2 y 5 frente a la cepa 1A de S. aureus, evaluada mediante el test ELISA.
Fig. 2. Respuesta humoral de los lotes 1-2 y 5 frente a la cepa C338 de S. simulans, evaluada mediante el test ELISA. Fig. 3. Respuesta humoral de los lotes 1-2 y 5 frente al sobrenadante de la cepa 1A de S. aureus, evaluada mediante el test ELISA. Fig. 4. Respuesta humoral frente al mucus de S. aureus, evaluada mediante el test
ELISA.
El Staphylococcus aureus 1A, C104+ y simulans C 338 se encuentran depositados en The National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Ltd del Reino Unido, bajo las identificaciones NCIMB 40457, 40458 y 40459 respectivamente.
HOJA SUSTITUIDA

Claims

REIVINDICACIONES
1) VACUNA FRENTE A ESTAFILOCOCOS Y SU ELABORACIÓN caracterizada por estar constituida por dos inóculos (A y B). El inoculo A está constituido por una cepa inactivada de S. aureus, una cepa del género Staphylococcus distinta de S. aureus, las exotoxinas producidas por S. aureus y un adyuvante. El inoculo B está constituido por liposomas que contienen el exopolisacárido purificado obtenido de una cepa del género Staphylococcus.
2) Vacuna según reivindicación 1 en la que la cepa 1A de S. aureus es parte constitutiva del inoculo A.
3) Vacuna según reivindicación 1 en la que la cepa C338 de S. simulans es parte constitutiva del inoculo A. 4) Vacuna según reivindicación 1 en la que la exotoxinas de la cepa 1A de S. aureus son parte constitutiva del inoculo A.
5) Vacuna según reivindicación 1 en la que el exopolisacárido de la cepa C104+ de S. aureus es parte constitutiva del inoculo B.
6) Método de elaboración de la vacuna caracterizado por la preparación de liposomas conteniendo el exopolisacárido.
7) Vacuna según reivindicaciones anteriores para su usó en ganado ovino, caprino y bovino y en enfermedades correspondientes a infecciones estafilocócicas.
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