WO1993006840A1

WO1993006840A1 - Medicament de prevention et de traitement de la tendance a l'hemorragie

Info

Publication number: WO1993006840A1
Application number: PCT/JP1992/001309
Authority: WO
Inventors: Tasuku Okamoto; Kiyoshi Okano; Yuichiro Sato; Nobutaka Ida; Masanobu Naruto
Original assignee: Toray Industries, Inc.
Priority date: 1991-10-09
Filing date: 1992-10-08
Publication date: 1993-04-15
Also published as: CA2098008A1; EP0560998A4; EP0560998A1

Description

明細出血傾向予防および治療薬技術分野

本発明は出血傾向の予防および治療薬に関する。詳しくは、本発明はィンターロイキン 6 (以下、 I L— 6 と略す）を有効成分とする出血傾向の予防および治療薬に関する。背景技術

出血傾向はその発現機序から大別して、 ①血小板の量的 · 質的異常 ②血管の異常 ③血液凝固に関与する血漿夕ンパクの欠乏、あるいは質的異常、異常活性化およびそれらの組み合わせに分類される。また、これらの諸病因による出血傾向にはそれぞれ先天性のものと後天性のものがある。出血傾向が発症する疾患には以下に述べるようなものが代表的である。即ち、ベルナール · スリエ症候群 (Bernard- Soul ier syndrome) 、■ ストレ—ジブ —ル病（Storage pool d i s e a s e)などの血小板無力症、フアンコニ症候群、再生不良性貧血、特発性血小板減少症、薬剤過敏性、特発性血小板減少性紫斑病、播種性血管内凝固（D I C) などの血小板減少症、壊血病、アレルギ一性紫斑病などの血管性疾患、フォンビルブランド病、ビ夕ミン K欠乏症、ネフ口—ゼ症候群など、非常に多くの疾患に認められるものである（医科学大辞典 No.21 、講談社、 1982^ ； Hematology, 4 tb edition, Wi l l iams J. W. , Beutier E. , e t a 1, 1990)。

癌化学療法後と癌放射線療法後の骨髄抑制に伴う出血傾向、骨髄移植後の出血傾向については、表面的には血小板数の減少が見られ、血小板弒少症と称されるが、臨床的危険症状としての出血傾向はより総合的な素因の複合した症状である。すなわち骨髄抑制を誘発する化学療法剤や放射線は同時に肝臓をはじめ種々の臓器に障害を与え、生体の恒常性を著しく乱すことによって、その総合的結果として出血傾向を誘発する。

出血傾向の治療は、直接的には止血系の正常化を図ることによって達成される。例えば凝固因子の異常による出血性素因の改善としては血友病の例が代表的である。この疾患は出血時間は正常であるが、凝固時間や部分トロンボプラスチン時間が延長し、筋肉内や関節内に出血を起こす。この場合には欠乏している血液第珊因子や第 X I因子製剤の投与が行われ、止血機能の正常化が図られる。また、ビタミン K欠乏性患者に対しては、ビタミン K製剤の投与が行われている。一方血管壁の障害による出血に対しては、フラボノイドやエタンシレート等の血管強化剤が使用されている。ところが血小板の量的 · 質的異常による出血傾向の発症に対しては、低下した機能の正常化が可能な優れた治療薬が無く、唯一血小板輸血が行われている。しかしこの血小板輸血には拒絶反応や自己抗体の出現、輸血血小板の早期減少化、ウィルス感染の危険性など幾つかの副作用と問題点が存在しており、完全な治療法にはなり得ていないのが実状である。この点においては、本来生体内に存在し目的の機能を有している物質を医薬品として応用することは生体のリズムを乱さない点においてより望ましいと言えるが、生体由来の生理活性物質出の中にも、未だ出血傾向を有効に予防 · 治療する物質は見出だされてはいない。

—方、インターロイキン 6 (以下、 I L— 6 と略す）は、

インターフェロン ₂ (Z i I be r s t e i n, A. e t. a t. , E BO J . 5^.2529 - 2537, 1986 ) 、 B細胞分化因子（B S F - 2 ) ： (Hi rano, T e t. a 1, , ature, 324, 73 - 76, 1986) 、 2 6 - k D a プロティン (Hageman, G. e t. a i . , Eur. J. B i o c h em. , 159, 625 - 632, 1986 ) 、

ハイプリドーマプラズマサイトーマ增殖因子（VanDam me, J. et. a 1. , J. Exp. Med. , 165, 914 - 919, 1987 ) 、肝細胞刺激因子（H S F) ： (Andus, T. e t. a I. , FEBS Le ti.， 221, 18 - 22, 1987 ；

Gaul die, J. e t. a 1. , Proc. Nat I. Acad. Sc i. USA, , 7251 -72 55, Ι9Π ) 、

など、別々に研究されてきた生理活性物質が同一分子であることが分かり、その生理活性の多様性から I L— 6 と呼ぶことが提唱され、その名称が定着している。 I L — 6は上記したように、その発見に伴う生理作用の他に最近、 in vitroにおいて巨核球の成熟を促進し（isiiitia sii, T. , Proc. Na 11. Acad. Sc i. , 86, 5953 -5957, 1989) 、 in 7Ϊ 70 に投与すると血小板が增加することが報告されている (Assno, S. , Blood, 75, 1602- 1605, 1990) 。

このように I L一 6については多くの生理活性が報告されているが、止血機構と血液凝固線溶系に対する効果は明確に示されていない。すなわち、前述したように血小板増加作用は認められるものの実際に生体の止血機構におよぼす影響については知られていない。哺乳動物の止血機構が必ずしも血小板の数のみに制御されるわけではない以上、止血能と血小板数の変動とは機能上区別して検討することが望まれている。すなわち、単に血小板を増加させるだけでは、出血傾向の症状の改善には必ずしもつながらず、また逆に、血小板数の増加のみを指標に血小板増加薬剤を投与すれば、不必要な副作用の発現を伴う。

これまでに I L一 6投与でラット末梢血中に增加した血小板が正常細胞と同等の凝集能を備えていることや、血小板の形質膜上には I L一 6の受容体が存在しないために直接の作用を受けることはないとの報告がなされている。

さらに I L一 6は、血中フイブリノ —ゲン量の増加など止血と凝固促進に作用する因子を増加させること、ァンチトロンビン IE (A T IE) のような血液凝固の制御因子を増加させることの他、プラスミノーゲンァクティべ —タインヒビタ— （ P A I ) など線溶系の制御因子を増加させることに関しても報告がされている。しかしそれらの総合的な作用が実際に生体内（i n v i v o) の止血機構と凝固線溶機構にどの様な反応を引き起こすのかについては不明なままであり、まして I L— 6の生体内への投与が生体の止血能力に対してどのような作用をおよぼすかについては知られていない。

本発明で解決しょうとするのは、本来生体内で作用を有する微量な生理活性物質を純化して、これを医薬品として提供することにある。詳細に述べると、出血傾向は血小板の質的 ·量的異常、血管の異常、凝固因子の欠乏，障害に起因して発症する疾病である。なかでも血小板機能障害と血管障害に起因する出血傾向に対しては優れた治療薬が存在せず、医療の現塲において切望されているものである。特に癌化学療法後と癌放射線療法後の骨髄抑制に伴う出血傾向、骨髄移植後の出血傾向、再生不良性貧血、あるいは特発性血小板減少性紫斑病などにおける出血傾向は生命を直接危機にさらすものであり、これをいかに制御するかが重要な治療技術となつている。本発明の目的は、止血を妨げる出血素因を改善治療する生理活性物質を提供することにある。発明の開示

本発明者らは新たに、 I L 一 6が血小板増加という単純な指標でなく、より総合的に、また、より直接的効果 D

として出血傾向を改善することを発見し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、 I L— 6を有効成分とする出血傾向予防および治療薬に関する。

本発明は、 I L 一 6を生体に投与することで（ 1 ) 血小板の機能亢進、（2 ) 血管内皮細胞の保護活性化、および（3 ) 血小板凝集、血液凝固線溶系に関する因子のバランスのとれた増加、（4 ) 血小板の増加を起こさせ総合的に止血能力を増強させて出血傾向を治療し得ることを見出し、 I L一 6が従来得られなかった出血傾向予防および治療薬として直接的に有用であることを示すものである。発明を実施するための最良の形態

本発明を更に詳しく述べれば、 I L— 6の生体への投与が血小板数の增加を第一の目的とするのでなく、また必ずしも I L一 6の投与により血小板の増加を伴わない力、、あるいは血小板增加が軽微であっても、効率良く出血時間を短縮させることを新規に見出したことにより達成されたものである。すなわち本発明による出血傾向の予防と治療は、 I L一 6による血小板の質的，量的な機能改善と血管内皮細胞活性化および血小板の凝集や凝固 •線溶系に関する因子のパランスの取れた増加、また血小板の増加を同時に総合的に達成させるのが特徵である。本発明の治療および/もしくは予防効果の一部は、 I L一 6を哺乳動物（特にヒト）の生体内に投与することで、血小板粘着 ' 凝集および放出能の亢進を伴い止血を増強させることから得られる。血小板内の顆粒に含まれており、活性化に伴い放出され得る物質は例えば A T P、 A D P、セロトニン、血小板活性化因子（ P A F ) 、血小板由来増殖因子（P D G F) 、 ^— トロンボグロプリン、血小板第 4因子（ P F— 4 ) 、フォンビルブランド因子（vWF) 、トロンボスボンジン等である。これらのうちのすくなくとも一部の含有量または放出量の増大が本発明の効果の重要な要因となつている。また本発明の効果の一部は、 I L一 6の生体内への投与により血小板のリン脂質代謝、カルシウムイオン代謝、タンパク質リン酸化酵素の代謝を増強させることによると推測される。すなわちァラキドン酸ゃィノシト一ル 3 - リン酸 ( I P 3 ) 、ジァシルグリセロール（ D G ) 、サイクリック AM P ( c AMP) などの細胞内情報伝達機能の亢進がおこる結果、血小板血栓の形成が増強されることによると考えられる。さらに本発明の効果の一部は、 I L 一 6の生体内への投与により血小板の形質膜上に存在する表面抗原の増加や親和性の増強が起こり、同様に細胞内情報伝達機能が亢進して血小板血栓の形成が増強されてもたらされると考えられる。その様な表面抗原として G P n _b / m_a や G P I _b / IX夕ンパク質に代表される細胞接着因子（もしくは受容体）が挙げられる。また本発明の効果の一部は、 I L一 6の生体内への投与によつて血管内皮細胞が活性化して本細胞が産生し得るフォンビルブランド因子（v W F ) の血漿中（血流中）濃度を高め、 1次止血を強化させることによると考えられる。さらに本発明の効果の一部は、 I L— 6の生体内への投与によって肝臓が産生する、血小板凝集や凝固線溶系に関与する因子の量を增加させることによると考えられる。血小板凝集や凝固線溶系に関与する因子としてはフィブリノ一ゲン、セル口プラスミン、アンチトロンビン m、各種プロテアーゼ阻害剤が挙げられる。また本発明の効果の一部は、 I L一 6の血小板数の増加作用によると考えられ、これらが総合的に作用し止血能力を増強させているのが特徴である。

本発明の実施例に示したように I L一 6による血小板凝集や出血時間の改善は明らかな血小板増加を伴っていなくても達成されている。この点において、出血傾向治療および予防薬としての I L— 6 ©有用性は、従来の医薬品では達成できなかった血小板機能の正常化もしくは機能亢進、さらに血管内皮細胞の修復と活性化の全てを同時に改善治療することにあり、本発明はこの事実を最初に明確に示したのである。

本発明で使用する I L— 6にはとくに制限はなく、既知の方法で得られる哺乳動物 I L一 6が好適に使用される。例えば I L一 6産生細胞を培養して得られたもの、あるいは遺伝子組換え法により得られた組換え型 I L 一 6でも良い。ヒ卜の臨床目的には、好ましくは I L— 6 産生ヒト細胞を培養して得られるものが使用される。 g 培養ヒト細胞から取得した I L— 6は、ヒト以外の種由来の不純物の混入を避けることができ、得られる I L 一 6は本来生体内で働く I L— 6に近いものとなるため好ましい。すなわち糖鎖および微細修飾を含んだ構造がヒト生体内 I L— 6に近いものとなるために、ヒトに医薬として投与したときに抗体産生を相対的に排除することができるため好ましい。したがって、ヒト培養細胞が産生する I L— 6は生体内でのより効率的な有効性を期待することができる。

本発明の培養ヒト細胞が産生する I L 一 6 とは、ヒト由来の細胞を培養することによって得られる I L 一 6を意味し、さらに特定すれば、正常細胞すなわち、癌化 (極端な形質転換）していない、あるいは癌細胞由来でない付着性ヒト細胞を培養することによつて得られる I L 一 6が好ましい。これらの条件によって得られる I し

- 6 は通常糖鎖の付加した構造を有する。癌細胞由来でない正常ヒト細胞として、特に線維芽細胞、内皮細胞、ストローマ細胞などが生体内での I L 一 6の源の一つと考えられており、その一部は正常細胞に近い形で培養できるので特に好適に用いられるが、特にこれらに限定されるものではない。

上記の正常ヒト細胞のうち、特に好適な細胞は付着性であるので、一般的な細胞培養条件にて培養できる。一般的な培養フラスコ、ローラ一ボトル、マイクロキヤリ了 (微粒子）を用いる培養法などが好適に甩いられるがこれに限定されるものではない。こうしてヒト細胞の培養によって得られた培養液から通常の精製法により、ほぼ純粋な I L— 6を得ることができる。これら培養および精製法については実施例でその一例を示すが勿論これに限定されるものではない。

一方、組換え型 I L一 6は、既知の方法により製造することができる。一例として、大腸菌を宿主とした例を実施例として示したが、これ以外でも広く知られた遺伝子操作法を用いることによって製造することができる。たとえば、枯草菌などの原核細胞、酵母、ハムスター細胞 · マウス細胞 · サル細胞 · ヒト細胞などの動物細胞、昆虫細胞、昆虫体に、 I L一 6遺伝子をその宿主で機能するプロモーターなどの下流に連結して D N Aもしくはウィルスなどの形態で導入することによつても調製することができる。

本発明の組成物は前述した方法で製造される I L 一 6 を主成分として含有する。他の成分としては、一般的な医薬添加物が選ばれる。もちろん添加物が無くとも本発明の目的は達成される。一般的には主として安定化のために添加物が加えられる。そのような医薬添加物としては、日本薬局方に記載された、医薬品添加物として使える夕ンパク質および Zまたは糖類等の中から選ばれる。特に好適にはヒト血清アルブミン（H S A ) 、ゼラチン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、トレノヽ口一ス、界面活性剤などの中から適宜あるいは組み合わせて ^ ^ 選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。

本発明はまた、 I L一 6 と他の薬剤、生物学的医薬品、合成医薬品などとの、同時もしくは逐次的な併用投与をも包含する。他の薬剤としては、 I L— 1、 I L— 2、 I L— 3、】 L一 7、 I L— 1 1などのインターロイキン類ゃ C S F (コロニー刺激因子）や E P O (エリス口ポイエチン）、インターフェロン、トロンボポイエチン、 M S F (巨核球刺激因子）、 M e g— C S F (巨核球コロニー刺激因子）などのサイトカイン類、あるいは I L 一 6の本発明の目的を補完、補助する既知の医薬品などのなかから選ばれる。

本発明の目的である出血傾向予防および洽療を具体的に達成するためには、こうして得られた I L一 6を主成分とする組成物を生体に投与する。投与方法としては、特に限定するものではないが癌化学療法後の血小板減少、癌放射線療法後の骨髄抑制、骨髄移植後の骨髄抑制、あるいは外傷 · 手術などに伴う出血傾向、一般的な注射、すなわち静脈注射、皮下注射、筋肉注射、点滴静脈内注入などの内適当な一つが選ばれる。経口、経鼻、経肺、経腸のような経粘膜投与法も場合により、好適に実施さレる o

有効投与量としては、 1 日につぎ体重 1 k g当たり 0. 0 0 0 1から 3 0 0 // gの範囲で選ばれる。好適には体重 l k g当たり 0. 0 0 1 — 5 0 // gの範囲で選ばれる。前述の投与量は症状によっても異なり、これらの値に限定されるものでは勿論ない。本発明の特徴として、投与量は生体内で血小板増加を示す用量よりも通常低い用量が好適に選ばれるが勿論これに限定されるものではない。投与回数としては通常 1 日 1ないし 2回、もしくは 2 ないし数日に 1回の範囲で選ばれるがこれに限定されるものではない。

投与対象としては、生体が出血傾向を示す時、例えば血小板数が低下したときに投与されるが特に限定されるものではない。実施例 4に示すように、血小板減少は軽微であっても、出血傾向は顕著である場合があり、このような場合においても本発明の薬剤は出血傾向の改善に有効性を示した。

ヒトの臨床上において重度な血小板減少は血小板数が 2 1ΐ / μ 以下と定義されることが多く、血小板輸血は通常、このような重度血小板減少に対して実施されるが、化学療法剤の投与や他の病的素因による出血傾向は必ずしも血小板数が 2万以下に関わらない場合がある。その様な例の多くにおいても本発明の I L 一 6を含む組成物は有効に使用され得る。中程度の血小板減少は血小板数が 4万ないし 5万 Z 以下と定義され、通常血小板輸血は行われないが、出血傾向があり、患者に内出血が懸念される場合には本発明の組成物の治療対象になる。また血小板数が 4万ないし 5 7ΐ / β & 以上であつても、化学療法剤投与やその他の誘因で出血傾向がある場合、もしくは出血傾向の出現があらかじめ予想される場合にも本発明の組成物の治療もしくは予防的治療の対象とな本発明の特徴として、投与量は生体内で血小板増加を示す用量よりも低い用量が選ばれてもよく、投与回数も必ずしも、血小板増加を示さない程度のものが出血傾向治療および予防薬として有用であることが主張される。勿論投与量および投与回数はこれらに限定されるものではない。実施例

以下に本発明を実施例によって、より詳細に、より具体的に説明するが、もちろんこれによつて本発明が制限されるものではない。

なお、 I L一 6の活性評価法は以下の方法により行なつた。

生物活性の評価法：

株細胞 7 T D 1 ( I L— 6依存ハイプリドーマ細胞 ( J. van Snick e t a I . , European J. Immunol. , 18, 1 93 - 197 (1988 )) を用いて、それに適当量の I L一 6を添加することにより、 7 T D 1の細胞増殖を MT T法により測定し、別途標準 I L一 6の段階希釈サンプルについての増殖活性との比較により、 I L'— 6の生物活性評価を行った。標準 I L— 6としては、下記に示す東レ株式会社ヒト I L— 6 E L I S Aキットに添付されているのと同じものを使用した。 E L I S A (酵素免疫評価法）法：

抗 I L— 6抗体 I" e t al. , Biociem. Biophys. Res. CommuD. , 165, 728 - 734, (1989 )) を用いた E L I S A法で測定した。東レ株式会社製造、トーレ · フジバイオニクス販売、ヒト I L一 6 E L I S Aキットを用いて I L一

6の評価を行つた。

実施例 1

大腸菌由来 I L一 6の調製：

既知文献（T. Hirano ら、 N a t u r e , v o l . 3 2 4， 7 3 ( 1 9 8 6 ) ) と同じ遺伝子配列を持つ I L

— 6 c D N Aを骨格とする I L— 6発現べク夕一を下記の方法で作成した。

甲状腺癌由来細胞株 N I M— 1細胞（通山薰ら、日本血液学会雑誌、 5 3巻、 8 0 5 ( 1 9 9 0 ) を培養して通常の方法で調製した mR N Aから、逆転写酵素で合成した c D N A混合物から下記 2本の化学合成 D N Aオリゴマー

C C G A T C G A T G C C A G T A C C C C C A G G

A (配列リストの配列番号 1 ) 、および

G C C A C G G A T C C T A C A T T T G C C G A A

G (配列リス卜の配列番号 2 )

をプライマーとして P C R反応を行った。得られた增幅 D NAを制限酵素 C 1 a I と B a mH I で消化した後、得られた D N A断片を大腸菌発現べクター p K M 6 (Tan aka et a 1. , J. Interferon Res. , 6, 429 - 35 (1986) ) の C 1 a I部位と B g 1 I I部位の間に掙入して、発現 I L— 6ベクター p K M I L — 6 を得た。この p KM I L - 6を大腸菌 H B 1 0 1 に導入し、組換え体を得た。この組換え体を下記のように培養して大腸菌組換え型 I L — 6を調製した。

ヒ卜インターロイキン一 6発現プラスミドを保持する大腸菌 H B 1 0 1 Z p KM I L — 6を、 3 0 L容ジャーを用いて培養した。 3 0 Lの増殖用培地（リン酸 1 カリゥム 0. 3 %、リン酸 2ナトリウム 0. 6 %、塩化ナトリウム 0. 5 %、塩化アンモニゥム 0. 1 %、ダルコ一ス 0. 5 %、カザミノ酸 0. 5 %、硫酸マグネシウム 1 mM、硫酸第 1鉄 3 ίί Μ、ビタミン B 1 6 g I、アンピシリン 5 0 ^ g /m l ) を 3 0 L容ジャーに仕込み、上記組換え体を植菌した。ジャーは、攪拌数 3 0 0 r p m、通気量 1 V VM、 2 5 °Cの条件で運転した。トリブトフアンオペ口ンの誘導物質であるインド一ルァクリル酸を加え、グルコースとカザミノ酸を添加しながら 6 0時間培養した。培養菌体を 1 0， 0 0 0 x g 2 0分間の遠心分離操作により集めた。菌体は、約 8 9 5 g得られた。集めた菌体を 1 mM E D T A、 l O O mMN a

C 1 を含む 5 0 mM トリス塩酸バッファー p H 8. 0 に 0 D 550 nm が 2 0 となるように懸濁した。菌体をマントンゴーリンにより破砕し、遠心分離を行い、破砕抽出物を回収した。抽出液中の蛋白量は 2 3 5 g、インター口ィキン一 6 は 4 9 5 m gであった。ここで I L — 6の量ば、前記の E L I S A法で測定した（以下同じ）。

抽出液をシリカカラム 5. 5 Lに吸着させ、酸性溶液で溶出した。 I L— 6は 46 2 m g回収した。溶出液に硫酸アンモニゥムを終濃度 1. 3 3 M添加して、遠心により、不溶性不純物を除去した。次にプチルカラム（ブチルトヨパール東ソ一社製） 2 0 0 m lに吸着させ、低塩中性溶液で溶出した。 S D S— P A G E純度検定法により純度 8 4%の I L一 6を 23 7 m g得た。溶出した I L— 6をそのままへパリンカラム（ A Fへパリントョパール東ソ一社製） 8 0 m 1 に吸着させた。中性塩ノッファ一で溶出した。純度 9 1 %の I L一 6を 1 1 4 m g得た。溶出液をさらにプチルカラム（プチルトヨパール東ソ一社製） 2 0 0 m 1で再度精製して、 I L— 6を 6 6 m g得た。上記で調製した I L— 6の純度は逆相 H P L C法で 9 5 %以上であつた。上記 I L— 6は実施例 1に記載した評価法で活性を持った I L— 6であることを確認した。 '

実施例 2 - ヒト細胞由来 I L一 6の調製：

本発明の I L一 6は一例として次の方法で調整された。

2 Lのガラス製培養槽に 1 Lの 5%の N C Sを含むィ一ダル M E M培地中で、細胞数が 1 0⁶ /mUこなるようにヒト線維芽細胞をビーズ培養した（ビーズ： "サイトデックス 1 " 、（フアルマシア社）、 3 7 °C) o その後、培地を少量のカルボキシメチルセル口一スを含む無血清 ^ ^ イーグル M E M培地 1 Lに交換し、プライミングとして 1 0万単位 Z Lのヒト天然型ィンタ一フロン 3を添加した。翌日さらにポリ I ：ポリ C 5 0 mgZ L、シクロへキシミド 1 0 mgZL添加した。その 4時間後、ァクチノ . マイシン Dを 4mgZL投入し、そして、さらに 1時間後、産生培地として少量のメチルセルロースを含むイーグル MEM培地に置換し、スーパーインダクション処理を行なった。その後 2 日間そのまま培養を続けた（3 7°C) 。撹拌を停止し、マイクロキャリアを沈降させた後、上清および産生培地での洗液をろ過し、 1 Lを別の撹拌装置付き容器に移した。この産生液に滅菌した "ブルーセファロ一ス C L— 6 B F F" (フアルマシア社）を投入し、 1 5°C， 4日間撹拌しながらバッチ吸着させた。撹拌停止後、ブルー担体を沈降させ上清を別の容器に移した。シリカ担体は、リン酸ナトリウム緩衝液中で高圧蒸気滅菌（ 1 2 1 °C、 3 0分）したのち、 4 m lずつ 2本のカラムに充填して直列に接続させた。これに、ブル— 担体の素通り上清を流速 2 0 m l Zh rで流した。全量流した後、 2本のカラムを別々に精製した。それぞれリン酸ナトリウム緩衝液 2 5 m 1 を流した後、 2 0 mM塩酸を流してインターロイキン— 6含有画分 1 O m 1 を回収した。この塩酸回収液にさらに硫酸アンモニゥムを 1. 3 3 Mになるように添加し、 4 °C、 1晚ゆるやかに撹拌した。沈殿物を 3 0 0 0 r p in, 3 0分遠心分離（4°C) 、除去した。分離した上清を疎水性ク口マトグラフィ一用担体であるブチルトヨパール 6 5 0 M" 1 m l (東ソ一社）を充填したカラムに流し、吸着させた。このカラムを 1. 3 3 Mの硫酸アンモニゥムを含む 2 0 mM塩酸、 1. 3 3 Mの硫酸アンモニゥムを含む 5 O mMリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した後、 5 0 mMリン酸ナトリウム緩衝液で回収した。その後、逆相系のクロマトグラフィーである O D Sカラム（C₁₈) (YMC— P a c k O D S A— 3 1 2 S - 5 1 2 0 A, YMC社）を装着した高速液体ク口マトグラフィー（島津 L C— 4 A) を用いて、 0. 1 % トリフロロ酢酸を含有する水と 0. 1 %トリフロロ酢酸を含有するァセトニトリルでグラジェント溶出させヒト天然型ィンターロイキン一 6 ピークを分取した。こうして得られたヒト天然型インターロイキン一 6を "セフアデックス G— 2 5" (フアルマシア社）で

5 mMギ酸を溶媒としてゲルろ過しァセトニトリルを含まないィンターロイキン一 6溶液を得た。

上記で調製した I L— 6の純度は逆相 H P L C法で 9 5 %以上であつた。上記 I L一 6は前記に示す評価法で - 活性を持つた I L一 6であることを確認した。

実施例 3

I L - 6による血液止血能の亢進'：

C 5 7 B LZ6マウスに実施例 2で得た I L一 6の溶液を 1日 1回の割合で毎日皮下投与して、 1 1 日巨に出血時間を測定した。対照投与液としては、生理食塩水を同様に投与して出血時間を測定した。出血時間の測定方法としては、マウスの尻尾の先端を 1 c m切断して、出てくる血液を 5秒ごとに濾紙に染み込ませて出血の認められなくなつた時間を測定する方法で求めた。投与した I L— 6用量は体重 l K g当たり 1 日 2 8 0 gとした。その結果、生理食塩水投与の対照コントロール群（n = 8 ) の平均出血時間が 1 0 0. 9 ± 6. 7秒（平均出血時間土 S E) であったのに対し、 I L— 6投与群（n = 8) では平均 5 4. 7 ± 5. 4秒となり、統計学的に有意（ pく 0. 0 0 5 ) な短縮が認められた。そのとき生理食塩水投与群に比べ、 I L - 6投与群の血小板数は 1 3 5 %であり約 3 5 %の増加を認めたにすぎなかった。このように、 I L— 6の生体内への投与により見られる出血時間（止血までの時間）の短縮の反応は、血小板增加の反応よりも鋭いと言える。

同様に、 I L一 6を 1 日 1回の割合で皮下連続投与して、 2日目に出血時間を測定した。その結果、生理食塩水投与の対照コントロール群の平均出血時間が 1 1 0.

5 ± 5. 4秒であったのに対して、 I L— 6の 2回投与群では平均 8 0. 5 ± 7. 7秒となり、統計学的に有意 ( p < 0. 0 1 ) な短縮が認められた。またこの時 I L ― 6投与群の血小板数は、対照群に比べて有意な変動は認められなかった。以上の結果より、必ずしも血小板数増加と相関しない状況での、 I L— 6による止血能の亢進が明らかとなった。実施例 4

CI ) マウス化学療法剤投与モデルでの出血時間の回復 (皮下投与）：

C 5 7 B L/6マウスに、癌化学療法剤であるマイトマイシン C (以下、 MM Cと略す）を（S m g/k g) 単回腹腔内投与して血小板減少症を誘発した。このマウス群に血小板が減少し始める MM C投与後 7 曰目から、実施例 2で調製した I L— 6を 1 日 1回の割合で 1 1 日間皮下投与して最終投与日の翌日実施例 3 と同様の方法で出血時間を測定した。投与した I L— 6用量は体重 1 K g当たり 1 曰 2 8 0 gとした。

その結果、 MM C投与後生理食塩水のみ連続投与した対照群（血小板减少群）の出血時間が平均 1 3 1. 4土 1 5. 1秒となり、正常マウス群の平均 1 0 0. 9 ± 6. 7秒に比べ、統計学的に有意（P < 0. 0 1 ) に遅延した。一方、 MM C投与後 I L一 6を連続投与した群（血小板回復群）では平均 8 2. 7 ± 6. 6秒となり、 MM C単独投与群に比べ統計学的に有意（P < 0. 0 1 ) に短縮する効果を認めた。この時 MM Cを投与したマウスでは、血小板数は正常値の約 Ί 0 %に減少しているにすぎなかったが出血傾向は顕著であり、全身状態は悪化していた。この例では、投与された化学療法剤は肝臓や他の臓器に対する障害を起こし、より総合的に出血傾向を誘発しており、血小板減少は軽微であっても、出血傾向は顕著であった。このような場合においても I L— 6は 2 \ 出血傾向の改善に有効性を示し、血小板の増加が主たる作用でないことを示している。すなわち、止血までの時間は MM Cを投与して I L— 6を投与していない対照群では 1 3 1. 4秒に延長していたのに対して、 MMCを投与して更に I L一 6を投与した群では平均 8 2. 7秒にまで短縮していた。 MM Cを投与せずに生理食塩水を投与した対照群は平均 1 0 0. 9秒であった（正常値を示す対照群）。この例では I L— 6投与によつて出血時間は正常値を越えてまで短縮したことになる。一方、このとき血小板数は正常値の 9 7 %まで回復しているのみであった。このことは、 I L一 6が血小板増加のためでなく、出血素因の改善（治療および Zもしくは予防）に対して、より有効に作用していることを明らかに示すものである。

(2) マウス化学療法剤投与モデルでの出血時間の回復

(静脈内投与）：

C 5 7 B L Z 6マウスに、癌化学療法剤である MM C を 2 m gZk g単回腹腔内投与して血小板減少症を誘発した。このマウス群に血小板が減少し始める MM C投与後 7日目から、 I L— 6を 1 日 1回の割合で 6 日間尾静脈内投与して最終投与日の翌日実施例 3と同様の方法で出血時間を測定した。投与した I L一 6用量は体重 1 K g当たり 1 日 1 7 7 gとした。その結果、 MMC投与後生理食塩水のみ連続投与した対照群の出血時間が平均 1 5 1. 4 ± 1 5. 1秒となり、正常マウス群の平均 1 3 0. 9 ± 6. 7秒に比べ、統計学的に有意（P < 0. 0 1) に遅延した。一方、 MM C投与後 I L— 6を連続投与した群では平均 1 3 4. 7 ± 6. 6秒となり、 MM C単独投与群に比べ統計学的に有意（p < 0， 01) に短縮して正常値に回復させる効果を認めた。

以上の結果より、化学療法剤投与により出血時間が遅延したマウスに I L一 6を投与することで、遅延した出血時間を改善し正常化させることを見出だした。

実施例 5

I L一 6によるコラ—ゲン刺激血小板の粘着 · 凝集能の亢進：

C 5 7 B LZ6マウス（n = 8) に、癌化学療法剤である MMC (2 m gXk g) を単回腹腔内投与した。このマウス群に血小板が減少し始める MM C投与後 7日目から、実施例 2で調製した 1 乙ー 6を 1 日 1回の割合で 6日間尾静脈内連続投与して最終投与日の翌日に血小板の粘着 · 凝集能を測定した。投与した I L一 6用量は体重 l K g当たり 1日 1 7 とした。詳細に述べると、

I L - 6の連日投与が終了後の翌日多血小板血漿（P R P) を採取した。コラーゲン 2 g/m を惹起剤として使い、全血凝集計（CH L O NO L O G ；クロノログ社製全血凝集能測定装置モデル 560) でのインピーダンス法により粘着，凝集能を測定した。 P R Pは血小板数を 8 0 X 1 0⁴ 個 Z/z に定めた。その結果、 I L一 6投与マウスから採取した血小板の最大凝集値（1 0分値）は 7. 5 Ωとなり、生理食塩水を同様に投与した対照マウスの血小板の 4. 8 Ωを上回った。以上の結果と次の実施例 6の結果より、 T RM— 6 0 0を投与した動物では、その血小板のリン脂質 · ァラキドン酸代謝が高まることでトロンボキサン A 2産生量及び遊離 C a ^{2 +}量が増大することが示唆され、最終的にその血小板の粘着 • 凝集能が増強することが分かった。

実施例 6

I L一 6によるコラ—ゲン刺激血小板の A T P放出能の亢進：

C 5 7 B LZ6マウス（n = 8) に、癌化学療法剤である MM C (2 m g/k g) を単回腹腔内投与した。このマウス群に血小板が減少し始める MM C投与後 7曰目から、実施例 2で調製した I L— 6を 1 日 1回の割合で 6日間尾静脈内連続投与して血小板の放出能を測定した。投与した I L— 6用量は体重 I K g当たり 1 日 1 7 7 gとした。詳細に述べると、 I L一 6投与した後に多血小板血漿（PRP) を採取してコラーゲン 2 g Zm で粘着 · 凝集を惹起させ、その時の放出 A T P量をルシフエリン · ルシフヱラーゼ試薬を用いた発光法（C H L 0 N

O L O G ; クロノ口グ社製全血凝集能測定装置モデル 5 6 0) で定量した。その結果、 I L— 6投与マウスから採取した血小板の最大 A T P放出量は 1. 6 ± 0. 2 Μとなり、生理食塩水を同様に投与した対照マウスの血小板の 1. 2 ± 0. 1 Μを上回った。以上の結果より I L - 6を投与した動物では、その血小板のリン脂質 · ァラキドン酸代謝が高まることでトロンボキサン A 2産生量及び遊離 C a ²⁺量が増大し、さらにひき続き起こる AT Pの放出反応が増大することが示唆され、最終的にその血小板の粘着 ·凝集能が増強することが分かった。血小板の放出物質としては、 AT Pの他に代表的な物として AD P、セロトニン，血小板活性化因子（P A F) 、血小板第 4因子（P F 4) 、フォンビルプランド因子

( V W F ) 、トロンボスボンディン等が知られているが、ここでは AT Pのみを指標として計測している。

実施例 7

I L一 6によるァラキドン酸刺激血小板の粘着 ·凝集能の亢進：

C 5 7 B LZ6マウス（n = 8) に、癌化学療法剤である MMC (2 m gZk g) を単回腹腔内投与した。このマウス群に血小板が減少し始める MM C投与後 7日目力、ら、実施例 2で調製した I L— 6を 1 日 1回の割合で 6曰間尾静脈内連続投与して最終投与日の翌日に血小板の粘着 ·凝集能を測定した。投与した I L一 6用量は体重 l K g当たり 1日 1 77 gとした。詳細に述べると、

I L一 6投与した後に多血小板血漿（P R P) を採取し、ァラキドン酸 4 0 0 Mを惹起剤'として全血凝集計（C HL O NO L O G ; クロノ口グ社製全血凝集能測定装置モデル 5 6 0 ) でのインピーダンス法により粘着 ·凝集能を測定した。 P R Pは血小板数を 8 0 X 1 0⁴ 個〃 ^ ₅

^ に定めた。その結果、 I L 一 6投与マウスから採取した血小板は、誘導期 7. 7分の後最大凝集値 1 8. 7 Ω となり、生理食塩水を同様に投与した対照マゥスの血小板の誘導期 9. 9分、最大凝集値 1 5. 0 Ωを上回った。以上の結果より T R M— 6 0 0を投与した動物では、血小板のァラキドン酸代謝が高まりトロンボキサン A 2産生量及び遊離 C a ^{2 +}量が増大することが示唆され、最終的にその血小板の粘着 ·凝集能が増強することが分かつた。

実施例 8

I L 一 6による血小板凝集能の亢進（ラット）：

実施例 3 と同様の検討を動物種を変えてラットで行つた。即ち、 S p r a g u e - D a w l e y ( S D) ラット雄 8週令（約 2 5 0 g ) に I L 一 6溶液（ l O O ju g /m 1 ) 0. 5 m 1 を 1 日 1回の割合で毎日皮下投与し、

6 曰目に血小板凝集能を測定した。対照投与液としては生理食塩水を用いた。血小板凝集能は以下の様にして測定した。

クェン酸血 5 m l を 1 , 0 0 0回転 1 0分間、室温で遠心し、上層（ P R P : p l a t e l e t r i c h p 1 a s m a ) を取り、さらに下層を 3， 0 0 0回転 2 0分間、室温で遠心し、上層（ P P P ： p 1 a t e 1 e t p o r p l a s m a ) を分離した。 P R Pを P P Pで希釈し、血小板濃度が 5 0万個 Z 1 となるように調整した。この血小板浮遊液 2 0 0 1 に A D P (終濃度 3 i M) あるいはコラーゲン（終濃度 1 0 g / 1 ) のどちらか添加し、最大凝集率を測定した。凝集計として二光バイオサイェンス社へマトレーサー 8 0 1型を用いた。

その結果、生理食塩水投与群（n = 4) の血小板凝集率が A D Pでは 3 2. 8 ± 2. 7 % (平均値土 S E) 、コラーゲンでは 1 2. 8 ± 4. 9 %であったのに対し、 I L一 6投与群（n = 3 ) では 4 8. 5 ± 0. 5 % (A D P) 、 4 7. 0 ± 3. 0 % (コラーゲン）となり、統計学的に有意（Pく 0. 0 5 ) な増加が認められた。また、この時 I L— 6投与群の血小板数は、 1 4 8. 8土 4. 3 X 1 0⁴ 個 Z I であり、生理食塩水投与群の血小扳数（ 9 4. 4 ± 1. 6 X 1 0⁴ 個/^ 1 ) より、有意（Pく 0 0 0 1 ) に高かった。

以上の結果より I L一 6投与で血小板数が増加した時期においては、実施例 3 と同様に単位血小板数当たりの凝集能が亢進していることが明らかとなつた。

実施例 9

化学療法剤投与モデルでの血小板凝集能の亢進（ラット）：実施例 4 と同様の検討を動物種を変えてラッ卜で行つた。即ち、 S p r a g u e— D a w l e y ( S D) ラット雄 8週合（約 2 5 0 g) に癌化学療法剤である塩酸二ムスチン（以下 A C N Uと記述する）を 2 2. 5 m g / k g静脈内単回投与した。このラッ卜に A C N U投与の翌日から I L— 6溶液（ 1 0 0 g Zm 1 ) 0. 5 m l を 1 日 1回の割合で 5日間毎日皮下投与し、 5日目に透過度法による血小板凝集能を前項実施例と同様に測定した。対照投与液としては生理食塩水を用いた。血小板凝集能はコラーゲン終濃度 2 0 gZm 1で測定した。

その結果、生理食塩水投与群（n = 4) の血小板凝集率が 44. 3 ± 6. 8 % (平均値土 S E ) であったのに対し、 I L— 6投与群（n = 4) では 5 2. 3 ± 4. 9 %となり、統計学的に有意（P < 0. 0 1) な増加が認められた。また、この時血小板数は、 A C N U投与により正常値（1 1 4. 4 ± 7. 3 X 1 0⁴ 個/ 1 ) の 7 8 % (8 9. 7 ± 4. 5 X 1 0⁴ 個/ 1 ) まで減少したのに対し、 A C N U投与後 I L一 6を投与した群の血小板数は 1 1 4. 0 ± 1 1. 1 1 0⁴ 個〃 1 と正常値とほぼ同じであった。

以上の結果より化療剤投与ラッ卜の血小板減少モデルにおいて、 I L— 6投与による血小板数低下の抑制が認められる時期では、実施例 4と同様に単位血小板数当たりの凝集能が亢進していることが明らかとなつた。

実施例 1 0

I L— 6による vWF (フォンビルブランド因子）の増加作用：

C 5 7 B LZ6マウス（n = 8) に、瘙化学療法剤である MM C (2 m g/k g) を単回腹腔内投与した。このマウス群に血小板が減少し始める MM C投与後 7日目から、実施例 2で調製した I L一 6を 1日 1回の割合で 6日間尾静脈内連続投与して、最終投与の翌日に血漿中の遊離フオンビルブランド因子（vWF) 濃度をサンドイッチ E I A法で測定した。 I L一 6の投与量は、体重 1 k g当たり 1日 1 7 7〃 gとした。その結果、 MMC のみ投与したマウスの血漿中 vWF濃度は 3. 8 ± 0. 3 g m lであり、生理食塩水を投与した対照マウスの 4. 7 ± 0. 6 μ gZm 1に比べ有意（pく 0. 0 1) に減少した。それに対して MMC投与後 I L一 6を連続投与したマウスでは 4. 4 ± 0. 4 g/m l となり、

MMC単独投与群より有意（p < 0. 0 1) に増加させて正常値に回復した。以上の結果より、 I L一 6を投与した動物では血管内皮細胞が活性化してタンパク質の産生放出能が増大していることが推定され、少なくとも事実として血液中の遊離 vWF濃度が増加することが示された。

実施例 1 1

I L一 6による培養ヒト血管内皮細胞の V WF産生増強作用：

健常人の臍帯静脈から常法に従って血管内皮細胞を分離して、 in vitroにおける培養を行つた。培養は 1 0 % ゥシ胎仔血清を含む R P M I - 1 6 4 0培地で行つた。 24穴プレートを使用して 5 X 1 0⁵ 個 Z穴で内皮細胞を添加し、 3 7°C、 5 % C 02 の条件で培養した。一方の群（n = 3) の内皮細胞には、実施例 2で調製した I L— 6を 1 O n g /m 1で添加し、対照群（ n = 3 ) には生食を同量添加して、 4 8時間培養した。培養終了後、培養上澄を回収してそこに含まれる vWF量を実施例 1 0と同様のサンドイッチ E I Aで定量した。その結果、 I L一 6添加した内皮細胞の V W F量は 4 0 0 ± 4 5 n gZm 1 となり、対照群の S S O i S S n gZm l に比ベ有意（Pく 0. 0 1 ) に増加した。以上の結果より、 I L一 6はヒト血管内皮細胞に作用して、これを活性化して vWFの産生量を増大させる作用を持つことが分かつた。

実施例 1 2

I L一 6によるフイブリノ —ゲン産生量の増加作用：

C 5 7 B LZ6マウス（n = 8) に、癌化学療法剤である MMC (2 m g/k g) を単回腹腔内投与した。このマウス群に血小板が減少し始める MMC投与後 7日目から、実施例 2で調製した I L— 6を 1 日 1回の割合で 6日間尾静脈内連続投与して、血漿中の遊離フィプリノ —ゲン（以下 F b gと略）濃度を測定した。 I L— 6の投与量は、体重 1 k g当たり 1 日 1 7 7 ^ gとした。その結果、 MMCのみ投与したマウスの血漿中 F b g濃度は 1 4 0. 4 ± 8. 0 m g d 1 であり、生理食塩水を投与した対照マウスの 2 1 1. 9 + 2 2. 6 m g / d 1 に比べ有意に（ Pく 0. 0 1 ) 減少した。それに対して MM C投与後 I L一 6を連続投与したマウスでは 2 3 9. 3 ± 7. 3 m g Z d 1 となり、 MM C単独投与群より有意（p < 0. 0 1) に増加して正常値に回復した。また、 I L一 6の 1日投与量を 1. 7 7 gの低用量とした場合にも 191. 8±5. 6mgZd lとなり、 MMC単独投与群よりも有意（p < 0. 0 1) に増加して正常値に回復した。以上の結果より、 I L一 6を投与した動物の血液中には、肝臓で産生され得る遊離 F b _g濃度が増加することが分かつた。

実施例 1 3

I L一 6による出血時間の正常化：

実施例 5と同一の実験系を用い、実施例 3と同様の方法で出血時間を測定した。その結果、 MMC単独投与群 Cn = 8 ) の平均出血時間が 1 5 5 ± 9秒となり、生理食塩水投与群（n = 8 ) の平均出血時間 1 3 0 ± 1 0秒に比べ、統計学的に有意（P < 0. 0 0 1) に遅延した。 MM C投与マゥスには出血傾向が発症したと言える。

これに対して、 MMC投与後にマウスの体重 1 k g当たりに I L— 6を 1. 7 7 gで 6回連続投与した群 (n = 8 ) の平均出血時間は 1 45 ± 1 4秒（p < 0. 2 1) 、 1 7, 7 β g投与の群（n = 8) では 1 3 5土 3秒（Pく 0. 0 0 1) になり、さらに 1 7 7 g投与の群（n = 8) では 1 3 3 ± 5秒（Pく 0. 0 0 1) となり、統計学的に有意に短縮して正常な出血時間に回復した。この結果より、 I L一 6が出血傾向を改善して正常な出血時間に治療し得ることが明らかとなつた。産業上の利用可能性

以上のように本発明により、生体内での出血素因を改善して出血傾向を予防もしくは治療できる医薬を得ることができる。すなわち I L— 6 は、これまでに優れた治療薬のなかった血小板の質的 · 量的な異常と血管の異常などに起因する出血傾向に対して、これらを総合的に改善して止血機構を正常にもどす新規な治療薬である。特に癌化学療法後と癌放射線療法後の骨髄抑制から来る出血傾向、骨髄移植後の出血傾向、再生不良性貧血の出血傾向、あるいは特発性血小板減少性紫斑病などにおける出血傾向の治療に有効である。また、 I L— 6 は生体内に存在するものであるため、合成医薬に比べより生体と調和するという優れた出血傾向治療および予防薬が期待できる。

配列リス卜配列番号： 1

配列の長さ： 2 5

S2列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鑌状

配列の種類：他の核酸合成 D N A

CCCATCGATG CCACTACCCC CAGGA 25 配列番号： 2

配列の長さ： 2 5

配列の型：核酸

鏆の数 -'—本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 D N A

配列

GCCACGGATC CTACATTTGC CGAAG 25

Claims

請求の範囲

1 . インタ一ロイキン 6を有効成分とする出血傾向予防および治療薬。

2 . インターロイキン 6が培養ヒト細胞が産生するものである請求の範囲第 1項記載の出血傾向予防および治療