WO1993006232A1 - HUMAN MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST GLYCOPROTEIN IIb/IIIa - Google Patents

HUMAN MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST GLYCOPROTEIN IIb/IIIa Download PDF

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WO1993006232A1
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monoclonal antibody
platelet aggregation
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Yoh-Ichi Matsumoto
Yasuo Ikeda
Makoto Handa
Takashi Kawamura
Toshinobu Murakami
Satoshi Sasaki
Tsuyoshi Kimura
Tomoko Sagawa
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Teijin Limited
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2848—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a human monoclonal antibody against human glycoprotein (Glycoprotein) ⁇ b / Ia (GPIb / Ia) (hereinafter referred to as MCA) and a hybridoma producing the same.
  • MCA human monoclonal antibody against human glycoprotein
  • MCA monoclonal antibody against human glycoprotein ⁇ b / Ia
  • vWF von Willebrand factor
  • the receptor on platelets for VWF in the adhesive is Glycoprotein lb (GPIb), and platelet aggregation is due to the Glycoprotein in inb / Ia (GP ⁇ b / Is fibulinogen
  • antiplatelet agents that suppress platelet functions such as platelet adhesion, aggregation, and release and experimental thrombus formation.
  • many of these have platelet aggregation inhibitory ability as one aspect of the action of the drug, have low specificity, and have problems in side effects.
  • aspirin also known as an analgesic antipyretic
  • has gastrointestinal bleeding There is a prostacyclin click Li emissions will keep in synthesis inhibition side effects in Ronbokisan A 2 and the vascular endothelium.
  • side effects such as gastrointestinal symptoms, liver damage and leukopenia have been observed.
  • human-derived MCA in order to be administered safely to humans and to be useful for the prevention and treatment of thrombosis, human-derived MCA, not mouse-derived, is essential.
  • human-derived MCA is composed of human B-lymphocytes, which have the ability to produce antibodies having GPII b / na-specific and platelet aggregation-inhibiting activity, and lymphoid cells such as myeloma cells. It is produced from hybridoma obtained by the fusion of E. coli, or is produced from a lymphoblastoid cell obtained by transforming the above human B lymphocyte with EB virus.
  • the present invention provides a human monoclonal antibody having the ability to bind to human platelet GPII bZHa and inhibit human platelet aggregation.
  • the present invention also relates to a hybridoma producing the monoclonal antibody or a progeny thereof, which is formed by fusing human lymphocytes with mouse myeloma cells. About.
  • the present invention also relates to the method for producing the monoclonal antibody, which comprises culturing the hybridoma.
  • the present invention also relates to a method for producing a hybridoma, which comprises selecting a hybridoma producing the monoclonal antibody.
  • Figure 1 is a graph showing the binding of human type M CA of the present invention with respect to C a + + GP ⁇ b ⁇ a in the presence or absence of a.
  • (A) Indicates the binding of ICF 2 C8, and (b) indicates the binding of IAD 2-1.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of the human MCA of the present study on the binding between F bg and GP ⁇ b ⁇ a.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of the human MCA of the present invention on the binding between vWF and GPE bZHIa.
  • FIG. 4 is a chart of flowcyttometry showing the binding ability of ICF2C8 to GPHb / IEa on the platelet surface.
  • A when no antibody was reacted,
  • B when anti-GPH bZDI a human MCA was not reacted and only FITC-labeled anti-human IgM goat antibody was reacted with platelets
  • C shows the case where the reaction with FITC-labeled anti-human IgM goat antibody was carried out after the reaction with ICF 2 C8.
  • FIG. 5 is a diagram showing platelet aggregation inhibitory activity of ICF 2 C8. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the human lymphocytes used in the present invention are contained in spleen, lymph node, peripheral blood, bone marrow, tongue, adenoid, etc. of patients with idiopathic thrombocytopenia (hereinafter referred to as ITP).
  • ITP idiopathic thrombocytopenia
  • any material can be used, but preferably a lymph node, spleen, or tonsil from an ITP patient.
  • strains include P3X65Ag8 strains of PAL-BZC mice and P3-NS1Z1-A g4—1 strain, P3X63AgUl strain, SP2ZOA gl4 strain, P3x63Ag 8.6.5.3 strain, MPC 1 1—45.6.TG 1. There are 7 shares and SP-1 shares.
  • the human trimer sphere prior to fusion of the human lymphocyte and the mouse myeloma cell, the human trimer sphere is trapped and the mouse MCA against the human trimer sphere [for example, Ort 'Diagnostic Stake (Orth. Diagnostics).
  • T lymphocytes by treating with sheep erythrocytes treated with OKT3] or with Fic011 treated with AII.
  • a human solid lymphatic tissue is excised by surgery from an ITP patient, and the excised tissue is gently loosened with scissors and a female to obtain a cell dispersion. The following two methods are used to remove T-member spheres from the cell dispersion.
  • the cell dispersion is layered on the Fic011-Paque layer, and the lymphocytes are separated by centrifugation. Furthermore, the cells are treated with complement 1Z2 volume and anti-human T lymphocyte ′ mouse MCA, the T lymphocyte is destroyed in advance, and the remaining B lymphocyte is centrifuged.
  • the cell dispersion is mixed with AET-treated sheep erythrocytes, and B cells are separated by Fic01 1-Paque centrifugation. When these methods are used, the generation rate of hybridomas is higher than when untreated spheres are used.
  • human lymphocytes obtained in this way are fused with mouse ⁇ myeloma cells.
  • human lymphocytes and myeloma cells are mixed at a ratio of 10: 1 to 1: 100, preferably 1: 1 to 1:10, and a suitable cell fusion solution, for example, about 35%
  • a suitable cell fusion solution for example, about 35%
  • poly (ethylene glycol) molecular weight of about 1,000 to 6,000
  • RPMI 164 containing about 7.5% dimethyl sulfoxide
  • a hybridoma producing the desired antibody by checking the binding activity of the antibody produced in the culture to GPE b / ba and the binding inhibitory activity of Fbg. GPE bZBIa Only pick out. Then, the hybridoma is taken out and cloned by limiting dilution to establish a subclone stably producing MCA.
  • the thus obtained mouse-human hybridoma producing the anti-GPKbZIIIa′tMCA of the present invention can be stored frozen.
  • the human MCA of the present invention can be obtained from the culture supernatant.
  • the hybridoma can be transplanted into an animal to form a tumor, and human MCA can be obtained from the ascites or serum.
  • ICF2C8 had the following characteristics.
  • the human MCA of the present invention had a subclass of IgM, and its light weight was S.
  • the human monoclonal antibody of the present invention is expected as an active ingredient of a platelet aggregation inhibitor for preventing or treating thrombosis, for example.
  • a platelet aggregation inhibitor for example.
  • the spleen removed from the ITP patient by surgery is loosened finely with scissors and a stool, and the medium A (RPMI 1640 — 10% fetal serum (FCS) — 2 ⁇ glutamin, 1 mM sodium birubate 20 ⁇ g / ffl £ L — Serine 0.05 u / fflfi Human insulin (80 ⁇ m / ⁇ pentamycin sulfate) was suspended.
  • This ce11 cell suspension was overlaid on the Fico11-Paque solution, and centrifuged at 1,500 rpm for 20 minutes.
  • the cells that had accumulated on the Fic011-Paque were removed, and one fraction was washed with phosphate buffer (PBS) and centrifuged twice with RPMI 1640. to obtain a re-Nba spheres suspended in l X 1 0 7 cells / mi in 0.
  • PBS phosphate buffer
  • Human GP ⁇ b / DIa was diluted to 2; g / ⁇ with A buffer (127 mM Ca ++ / 90 mM Mg ++ / PBS (pH 7.2)), and diluted with 96
  • the plate was put into a ELISA plate at 50 ⁇ £ Zwe 11 and allowed to stand at 4′C. After that, the GP II b / Ha solution was removed, 10% FCS / A buffer was added at 200 ° C. for 11 minutes, and then 37 minutes and 120 minutes. After washing three times with 0.02% Hibiden (registered trademark) (ICI), the culture supernatant of Hypridoma was added at 50 £ / 61, and reacted for 37 minutes and 60 minutes.
  • Hibiden registered trademark
  • anti-GPH bZlE a mouse MCA diluted to 500 ngZ with 10% FCS / A buffer (Serotec CA 468) was added at 50 / £ / we 11 and reacted for 37 minutes and 60 minutes.
  • 0.0 0 After washing 3 times with 2% Hibiden placed l O ⁇ FC SZA buffer at 1 0 4 fold diluted Peruokishitaze labeled anti-mouse I g G antibody (TAGO Co.) in SO i / jg / well, 3 7 And reacted for 60 minutes.
  • the hybridoma that showed a positive result in the screening in (2) was closed as follows. First, a 96-well flat plate was inoculated with only 2 ⁇ 10 4 mouse mucosal exudate cells. Then, 1 hour to 1 day later, the medium was removed, and the hybridoma was inoculated into 96-wells with 10 cell wells. HT medium was used for the first clone and medium A was used for the second cloning. After 2-3 weeks of culture, the antibody activity was measured, and positive clones were picked up.
  • Hypridoma ICF2C8 that stably produces MCA having the above properties (Table 1). .
  • it does not show the binding inhibitory activity of Fbg'GPHbnoHa, it also stably produces MCA by cloning for seven types of hybridomas that bind to GPbba. It was established as a hybrid vehicle (Table 1).
  • Hypuri Domas Cell Line ICF 2C8 was obtained by the Institute of Microbial Engineering, 1-3-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan, based on the Budapest Treaty. Deposited on October 8, 1980 as FERMBP No. 3656 (FERMBP—3596).
  • the Con A Sepharose was washed with 1 MNaC 1/20 mM NaPi (pH 7.2) and 1 MNaC 1/50 mMAcNa ( PH 4.0) in that order. Elution was carried out with ⁇ -methyl mannose / 0.5 MN ac 1/20 mM Na P i ( P H7.2).
  • the eluted fraction was concentrated with Amicon (YM10 membrane), and then applied to Sepharose CL-6B equilibrated with PBS.
  • the fraction containing 1 & 3 ⁇ 44 was collected as 1 CF2C8 (5 mg ).
  • ICF2C8 obtained by this method was confirmed to be more than 90% pure IgM by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). .
  • the purified GPI b ZHIa was diluted to 1 ⁇ & / ⁇ with A buffer, added to a 96-well ELIS ⁇ plate at 100 £ / we 11, and left to stand at 4'C. Discarded GP ⁇ b / M a solution was placed 2% BS AZB buffer one (1 O mME DTA / PBS to (P H7.
  • ICF 2 C 8 is C a + + present is only the concentration-dependent manner absorbance increases under, C a + + is not increased at all absorbance in the absence. Than this, ICF 2 C 8 are, C a + + only in C a + + absence bound to GP [pi b / la in the presence was found not to bind.
  • IAD 2 - 1 was found to bind with C a + + related engagement as Ku in the presence or absence GP II b / ffi a.
  • Example 4 The binding of human MCA to the binding of F b g to GP II b
  • anti-GPU b Z BI diluted to 500 ng / with 10% FCS / A buffer to measure the amount of bound GPD b / Ia a
  • a mouse-type MCA (MCA468, manufactured by Serotec) was placed in SOit / Zwell and reacted at 37'C for 60 minutes.
  • 1 0% FCS / A buffer 1 0 4 fold diluted Peruokishidaze labeled anti-mouse I g G antibody (TAGO Co.) at 5 0 ⁇ / well. Put 3 7 The reaction was performed for 60 minutes. Thereafter, five surfaces were washed with 0.002% hibiden.
  • ZIEa mouse type MCA (Serotec, MCA468) was charged in 1 and allowed to react for 37 minutes and 60 minutes.
  • FIG. 3 shows the relationship between the added anti-GP GPb / Ia human MCA concentration and the absorbance at 405 nm obtained by the above method.
  • anti-GPIIbZlIIa-human MCAICF2C8 reduced the absorbance in a concentration-dependent manner, and reduced the absorbance to 11% at 10 ⁇ /.
  • ICF 2C8 inhibited 89% of the binding between vWF and GPlbZDla at an antibody concentration of 89%.
  • the anti-GP ⁇ b / Dla human MCAIAD 2 — 1 did not harm the binding of vWF to GPH bZnia.
  • a FITC-labeled anti-human IgM goat antibody was reacted at room temperature for 30 minutes. After the reaction was centrifuged (250 rpm, 10 minutes), the precipitated platelets were washed once with buffer 1A. The platelets were resuspended in buffer A and subjected to ⁇ 10wcyt0metry. Fig. 4 shows the results.
  • FIG. 4 shows that no antibody was reacted, (b) did not react with the anti-GPE bZIEa human monoclonal antibody and only FITC-labeled anti-human IgM goat antibody was used.
  • (c) is a flow cytometry chart when reacting with FITC-labeled anti-human IgM goat antibody after reacting with ICF 2 C8. From FIG. 4, it can be seen that FITC-labeled anti-human IgM goat antibody does not bind to the platelet surface under the present conditions because the positions of the beaks in (a) and (b) remain unchanged.
  • the monoclonal antibody and the active fragment thereof of the present invention are expected to be used as an active ingredient of a platelet aggregation inhibitor for preventing or treating thrombosis.

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Description

" 明 細 書 グリ コプロティ ン Π b /I a に対するヒ ト型モノ ク ローナル抗体 技術分野
本発明は、 ヒ トグリ コプロテイ ン （Glycoprotein) Π b /I a ( G P I b / I a ) に対するヒ ト型モノ ク ローナル抗体 （以下 M C Aと赂す） とそれを産生するハイプリ ドーマに関する。 背景技術
血栓症の発現と進展に血小板が重要な役割を果たしていることが 明らかになり、 抗血小板薬療法が抗血栓療法の 1つとして注目され てきた。 血栓は、 血管の内皮細胞が何らかの原因で剝離すると、 von Willebrand因子 （ v W Fと略す） に対する レセプターをもって いる血小板が内皮下に粘着し、 活性化され、 放出反応と凝集を起こ し、 血小板血栓が形成される。 この血小板血栓の形成において、 粘 着における V W Fに対する血小板上のレセブターは Glycoprotein l b ( G P I b ) であり、 血小板凝集は、 血小板膜上の Glycoprote in Π b / I a ( G P Π b / ΙΠ a ) 同士がフイブリ ノ一ゲン
(Fibrinogen) ( F b g ) または v W Fを介して結合することにより 起きることがわかっており、 そのそれぞれの結合部位についても研 究されている。
現在までに、 血小板の粘着 · 凝集 · 放出などの血小板機能や実験 的血栓形成を抑制する多数の抗血小板剤が開発されてきた。 しかし、 これらの多く はその薬剤の作用の一面として血小板凝集抑制能を有 するものであり、 特異性が低く、 副作用の点で問題がある。 例えば、 鎮痛解熱剤としても有名なァスピリ ンは、 消化管出血、 血小板の ト ロンボキサン A2 と血管内皮でのプロスタサイ ク リ ン合成阻害とい う副作用がある。 また、 チク ロビジンの場合は、 胃腸症状、 肝障害、 白血球減少などの副作用が観察されている。
また、 近年、 マウス型 M CAの作製技術の確立にともない、 抗血 小板マウス型 M C Aを抗血小板剤として使用する試みが行われてい る。 その 1例としては、 H.K. Goldらの行ったもので 〔If.K.Gold, et. al.,J. Clin. Invest. ,86 651-659 (1990) 〕 、 ヒ ト G P H bノ HI a に特異的でかつ血小板凝集を抑制するマウス型 M C Aを作製し、 臨 床治験を行っている。 しかし、 マウス型であるため、 ヒ トでの治験 では、 血小板凝集の抑制効果はあるものの、 半減期 · 抗原性の点で 問題があり、 治療 · 予防としては、 完全なものとは思われない。
そこで、 ヒ トに投与し安全でかつ血栓症の予防及び治療に役立て るには、 マウス由来でなく、 ヒ ト由来の M C Aが不可欠となる。 一 般にヒ ト由来の M CAは、 G P II b/n a特異的でかつ血小板凝集 阻害活性を有する抗体産生能力を持つヒ ト Bリ ンパ球と、 ミエロー マ細胞等のリ ンパ系樹立細胞との融合によつて得られるハイプリ ド' 一マから産生されるか、 または上記ヒ ト Bリ ンパ球を E Bウィルス によって形質転換することによって得られる リ ンバ芽球様細胞から 産生される。
1 9 8 0年頃から現在に至るまで、 多く のヒ ト型 MC A作製研究 が行われてきたが、 上記の両方法ともにそれぞれ固有の問題をかか えており、 マウス型 MCAのように確立した技術となっていない。 しかし、 もし効率よ く ヒ ト Bリ ンパ球を免疫感作でき、 かつヒ ト G P I b /I aに特異的で血小板凝集阻害能を有するヒ ト型 MC A産 生能のあるハイプリ ドーマが得られるならば、 これから得られる M CAは生産性が高く、 かつ、 医薬品としての安全性上も望ましいも のとなる。 G P Π b /I aに特異的に結合し、 ヒ トの血小板凝集を抑制する マウス型モノ ク ローナル抗体は 1 9 8 5年以来、 多く の論文に発表 されている （例えば、 B.S. Coller ら、 Blood, Vol. 86, No.3, 1986, 783-786 頁） 。
また、 G P H bZDI aに特異的に結合するヒ ト型モノ ク ローナル 抗体が、 D.J. Nugent ら、 Blood, Vol. 70, No.l, 1987, 16-22 頁 ； 及び P CTZU S 8 9 / 0 5 1 8に記載されている。
しかしながら、 G P n b/IH aに特異的に結合し、 且つヒ ト血小 板凝集を抑制する能力を有するヒ ト型モノ ク ローナル抗体は知られ ていない。 発明の開示
従って本発明は、 ヒ ト血小板の G P II bZH aに結合し且つヒ ト 血小板凝集を抑制する能力を有するヒ ト型モノ ク口一ナル抗体を、 提供する ものである。
本発明はまた、 ヒ ト · リ ンパ球とマウ ス · ミ エ ローマ細胞とを融 合するこ とによつて形成される、 前記のモノ ク 口一ナル抗体を産生 するハイ プリ ドーマ又はその子孫に関する。
本発明はまた、 前記ハイ プリ ドーマを培養することを特徴とする、 前記モノ クローナル抗体の製造方法に関する。
本発明はまた、 前記モノ ク ローナル抗体を産生するハイプリ ドー マを選択することを特徴とする、 ハイ プリ ドーマの製造方法に関す る c 図面の簡単な説明
図 1は、 C a + +の存在下、 または非存在下における G P Π b ΖΙΠ aに対する本発明のヒ ト型 M CAの結合を示すグラフである。 （ a ) は I C F 2 C 8の結合を、 （ b ) は I A D 2— 1の結合を示す。 図 2は、 F b gと G P Π b ΖΠΙ aの結合に対する本究明のヒ ト型 MCAの影響を示すグラフである。
図 3は、 vWFと G P E bZHI aの結合に対する本発明のヒ ト型 M C Aの影響を示すグラフである。
図 4は、 I C F 2 C 8の血小板表面の G P H b / IE aへの結合能 を示す f l o w c y t o m e t r yのチャー トである。 （ a ) は 抗体を全く反応させなかった場合、 （ b ) は抗 G P H bZDI aヒ ト 型 M C Aを反応させず、 F I T C標識化抗ヒ ト I g Mャギ抗体のみ を血小板と反応させた場合、 （ c ) は I C F 2 C 8を反応後、 F I T C標識化抗ヒ ト I g Mャギ抗体を反応させた場合を示す。
図 5は、 I C F 2 C 8の血小板凝集抑制活性を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明において用いられるヒ ト · リ ンパ球は、 特発性血小板減少 症 （以下 I T Pという） 患者の脾臓、 リ ンバ節、 末梢血、 骨髄、 扁 挑、 アデノイ ド等の中に含まれている。 本発明の目的のためには、 いかなる材料のリ ンバ球でも用いることができるが、 望ましく は I TP患者由来のリ ンバ節、 脾臓、 扁桃である。
マウスのミエローマ細胞としては、 8—ァザグァニン耐性株を用 いるのが有利であり、 公知のものとしては、 B AL BZCマウスの P 3 X 6 5 A g 8株、 P 3— N S 1 Z1— A g 4— 1株、 P 3 X 6 3 A g U l株、 S P 2ZOA g l 4株、 P 3 x 6 3 A g 8. 6. 5. 3株、 MP C 1 1— 4 5. 6. TG 1. 7株、 S P— 1株等がある。 本発明においては、 ヒ ト リ ンバ球とマウスミエロ一マ細胞融合に 先立って、 ヒ ト リ ンバ球を捕体とヒ ト リ ンバ球に対するマウス M C A 〔例えば、 オル ト ' ダイァグノ ステイク社 （Orth。 Diagnostic社） の O KT 3〕 とで処理し、 あるいは A Ε Τで処理した羊赤血球と F i c 0 1 1 とで処理し、 Tリ ンパ球を除去しておく ことが望ましい。 本発明のヒ ト型 M CAを作成するに際しては、 例えばヒ ト固型リ ンパ組織を I T P患者から手術によって摘出し、 摘出組織をハサミ とメ スによっておだやかにほぐし、 細胞分散液を得る。 細胞分散液 から Tリ ンバ球を除去するために次の 2つの方法を用いる。
( 1 ) 細胞分散液を F i c 0 1 1 — P a q u e層に重層し、 遠心 することによってリ ンパ球を分離する。 さらに、 補体 1 Z 2容と抗 ヒ ト Tリ ンパ球 ' マウス M C Aで処理し、 あらかじめ Tリ ンパ球を 破壊し、 残った B リ ンパ球を遠心分離する。
( 2 ) 細胞分散液を、 A E T処理した羊赤血球と混合し、 F i c 0 1 l — P a q u e遠心法により B細胞を分離する。 これらの方法 を用いると、 未処理のリ ンバ球を用いる場合より もハイプリ ドーマ の生成率が上昇する。
かく して得られたヒ ト リ ンパ球とマウス ♦ ミエローマ細胞とを融 合する。 例えばヒ ト リ ンパ球と ミエローマ細胞を 1 0 ： 1〜 1 ： 1 0 0、 好ま しく は 1 : 1〜 1 : 1 0 の比率で混合し、 適当な細胞融 合溶液、 例えば約 3 5 %ポリ エチレングリ コール （分子量 1, 0 0 0 〜6, 0 0 0程度） および約 7.5 %ジメ チルスルホキシ ドを舍む R P M I 1 6 4 0を加えて、 室温〜 3 7てで 1〜数分間攬拌し、 その後 1 0 %ゥシ胎児血清 （ F C S ) 添加 R P M I 1 6 4 0で徐々に希釈 し、 洗浄の後、 HAT (ヒポキサンチン一ア ミ ノ プテリ ン一チ ミ ジ ン） 選択培養液にて細胞濃度が 1〜5 X 1 05 個 となるように 調整する。
これを 0. ずつ、 例えば 9 6穴プレー トに分柱し、 5 %C 02 を舍む空気中で 3 5〜 3 8てで 2〜 3週間培養する。 9 6穴プレー トにはフィーダ一相としてマウス腹腔摻出細胞を入れて置き、 融合 した ώ胞を入れる直前にその培養液を除まする。 H AT培養液中で はハィブリ ドーマのみが生存し、 8—アサグァニン耐性のミエロー マ細胞及びミエローマ同士の融合細胞は生存し得ない （未融合の抗 体産生細胞は数日で死滅する） 。
培養後、 培養液中に産生された抗体の G P E b /Ί aへの結合活 性と F b g . G P E bZBI aの結合阻害活性をチュ ック し、 目的と する抗体を産生しているハイプリ ドーマのみを選び出す。 そして、 そのハイブリ ドーマを取り出し、 限界希釈法によってクローニング し、 MC Aを安定に産生するサブクローンを樹立する。
このようにして得られた本発明の抗 G P K bZIII a ' t MCA を産生するマウスーヒ トハイプリ ドーマは、 凍結して保存すること ができる。 かかるハイプリ ドーマのセルライ ン （細胞株） 及び Z又 はそれに由来する細胞株を適当な方法で大量に培養すると、 培養上 清から本発明の目的とするヒ ト型 MCAを得ることができる。 また、 このハイブリ ドーマを動物に移植して腫瘍化し、 その腹水や血清か らヒ ト型 MCAを得ることもできる。
以上の如く して得られた本発明の抗 G P D bZBI a ' ヒ ト型 MC Aのうち、 I C F 2 C 8は次の様な特性を有していた。
( 1 ) ヒ ト血小板より得られた G P II b/lK aを固定化した E L I S Aで結合陽性を示した。
( 2 ) in vitroで F b gと G P E bZ aの結合を阻害した。
( 3 ) in vitroで vWFと G P H b/M aの結合を阻害した。
( ) aggregometerを使った測定系でヒ ト血小板の AD Pまたはコ ラーゲンによる凝集を阻害した。
( 5 ) 本発明のヒ ト型 MCAである I C F 2 C 8は、 サブクラスが I g Mであり、 その軽鎮がスであった。
G P E b /I aに特異的に結合し、 且つ赤小板凝集を抑制する本 発明のヒ ト型モノ クローナル抗体は、 例えば血栓症の予防又は治療 のための血小板凝集抑制剤の活性成分として期待される。 しかしな がら、 この用途のためには、 生来の （ n a t i v e ) モノ クローナ ル抗体のみならず、 その特異的結合能を有する活性断片、 例えば F a b , F ( a b ' ) z 等も使用することができる。 従って、 本発 明は、 この様なモノ ク ローナル抗体の活性断片も包舍する。 これら の断片は、 例えば新生化学実験講座第 1 2巻 1 8 5〜 1 9 5頁、 東 京化学同人発行に記載されている様な常法に従って製造することが できる。 実施例
以下、 実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
実施例 1
( 1 ) 細胞融合 '
( a ) リ ンパ球の調製
I T P患者から手術によつて摘出された脾臓をハサミ とメ スによ つて細かく ほぐし、 培地 A 〔 R P M I 1 6 4 0 — 1 0 %ゥシ胎児血 清 （ F C S ) — 2 ιηΜグルタ ミ ン、 1 mMビルビン酸ナ ト リ ゥム 一 2 0 〃g/ffl£ L —セ リ ンー 0. 0 5 u /fflfiヒ ト イ ンシユ リ ンー 8 0 μも/諕ケ' ンタマイ シ ン硫酸塩） に細胞を懸濁した。 この c e 1 1細胞懸濁液 を F i c o 1 1 — P a q u e液に重層し、 l, 5 0 0 rpm で 2 0分間 遠心した。 F i c 0 1 1 - P a q u eの上に集積した細胞を取り出 し、 リ ン酸緩衝液 （ P B S ) で 1 画、 R P M I 1 6 4 0で 2面遠心 洗浄し、 最終的に R P M I 1 6 4 0中に l X 1 07 c e l l s / mi に懸濁させてリ ンバ球を得た。
( b ) 細胞融合
リ ンパ球を 1 0 % human B cell grouth factor または 1 % Pokeweed Mitogenの入った 1 0 % F C S — R P M I 1 6 4 0培地で 3〜4 日培養した。 そのリ ンパ球 3 X 1 0 7 細胞とマウス ' ミエ口 一マ P 3 U l c e l l s ( 3 X 1 0 7 細胞） とを R P M I 1 6 4 0 培地で混合し、 細胞を遠心沈殺 （1, 6 0 O rpm , 5分間） させた。 上清を除去し、 その細胞ペレッ トをタ ツビングによってほぐし、 1 のボリエチレングリ コール溶液 （ 3 5 % Vノ Vボリエチレンダリ コール # 1 0 0 0 — 5 % V Ζ Vジメ チルスルホキシ ドー R Ρ Μ I 1 6 4 0中） をゆっ く り加え、 室温で 1分間放置した。
次に、 これに 2 ^の R P M I 1 6 4 0を加えて、 1分間放置し、 さらに 2 sz£の R P M I 1 6 4 0を加えて、 2分間放置し、 次に 4 の H A T培地 （培地 A中 9 5 〃 Mヒポキサンチン一 0. 4 ァミノ プテリ ン一 1 6 Mチミジン） を加えて 2分間放置し、 次いで 8 fflfi の H A T培地を加えて 2分間放置し、 そして 2 4 ^の H A T培地を 加えて、 3 7 ·(：で 3 0分間放置した。 最終的に H A T培地で 7 5な いし 1 5 0 fflgとした。
これを約 2 0 0 μ Hずつ 9 6 ゥエルの平らな培養ブレードに接種 した。 なお、 この培養ブレードには、 前もって I C Rマウス （雄性） の腹腔摻出細胞を 2 X 1 0 4 細胞 Zゥエルずつ接種し融合した細胞 を接種する直前に培養液を除去し、 融合細胞を入れた。 この培養プ レートを 3 7てで C 02 —イ ンキュベータ一中で培養した。 培地は 1週藺毎に、 半量ずつ H T培地 （ H A Tからアミノブテリ ンを省い たもの） で置換して、 ハイプリ ドーマ · クローンが出現するまで培 養を続けた。
( 2 ) スク リ ーニング
ハイプリ ドーマコ ロニーが出現した時点において、 ヒ ト G P Π b /l aに対する結合活性と F b g ' G P U b ZIE a結合阻害活性を、 ゥエル毎に下記 （ a ) ( b ) の方法で測定し、 陽性を示したコロニ 一のハイ ブリ ドーマをクローユングした。
( a ) ヒ ト G P II bZlE aに対する結合活性
ヒ ト G P Π b/DI aを Aバッ フ ァ ー 〔 1 2 7 mM C a + + / 9 0 mMM g + + / P B S (pH7.2 ) 〕 で 2 ; g /^に希釈し、 9 6ゥエル E L I S Aプレー トに 5 0 〃 £Zw e 1 1で入れ、 4 'Cでー晚静置した。 その後 G P II b/H a溶液をすて、 1 0 %F C S/Aバッファーを 2 0 0 £ノ w e 1 1で入れ、 3 7て， 1 2 0分置いた。 0.0 0 2 %ヒ ビデン （登録商標） （ I C I社） で 3回洗浄後、 ハイプリ ドー マの培養上清を 5 0 £/ 6 1 1 で入れ、 3 7て， 6 0分反応さ せた。
0.0 0 2 %ヒ ビデンで 3回洗浄した後、 G P II bZHI aに結合し たヒ ト型 M CAを検出するため、 1 0 %F C S/Aバッファーで 1 04 倍に希釈したアルカ リ ホスファタ一ゼ標識化抗ヒ ト I g Gを 5 0
Figure imgf000011_0001
e l lで入れ、 3 7て， 6 0分反応させた。 0.0 0 2 %ヒ ビデンで 5回洗浄後、 P—ニ トロ リ ン酸 2ナ ト リ ウムを 0.2 5 mMM g C 12 / 1 Mジエタノ ールァ ミ ン （pH9.8 ) に 1 0 mg/ に なるように溶解し、 l O O z jg/w e 1 1 で入れ、 室温で適度に発 色させた。 その後、 4 0 5 nmの吸光度を測定して、 G P Π bノ HI a に対する結合活性を調べた。
( b ) F b g - G P n b/ffi a結合阻害活性
ヒ トフイ ブリノ一ゲン （ F b g ) を Aノ ッファーで 1 0 〃 g/fflCに 希釈し、 9 6ウエノレ E L I S Aプレー ト に l O O /z jg/w e l 1 で 入れ、 3 7 ， 6 0分静置した。 その後、 1 %B S AZ 1 %F C S ノハ ンク ス液でゥエルを洗浄した。 1 0 % F C S Z0. 1 %N a N3 ノ Aバッファ一を S O O /z jgZw e l l で入れ、 3 7て， 6 0分静 置した後、 0.0 0 2 %ヒ ビデンで 3回洗浄した。 1 0 %F C S/A ノ ッ フ ァ ーで希釈した 0.2 5 〃 g/ ヒ ト G P Π b / I a とハイ プリ ドーマの培養上清を等量で混合し、 3 7て， 6 0分反応させたもの を、 5 0 // £Zw e l lで入れ、 3 7て， 6 0分結合させた。
0.0 0 2 %ヒビデンで 3回洗浄した後、 結合した G P bZ a 量を測定するため、 1 0 %F C S/Aバッファーで 5 0 0 ngZ に 希釈した抗 GP H bZlE aマウス型 MCA ( S e r o t e c社製、 C A 4 6 8 ) を 5 0 / £ /w e 1 1で入れ、 3 7て， 6 0分反応 させた。 0.0 0 2 %ヒビデンで 3回洗浄した後、 l O^F C SZA バッファーで 1 04 倍希釈したペルォキシターゼ標識化抗マウス I g G抗体 （TAGO社） を S O i/ jg/w e l lで入れ、 3 7て， 6 0分反応させた。
その後、 0.0 0 2 %ヒビデンで 5回洗浄した。 0.4 5mgZffl£TM B Z - H C L (pH2.0 ) と 0.0 1 7 %H2 0 z / 5 9 mM N a H P 04 Z 4 1 milクェン酸 （PH4.3 ) を等量で混合し、 1 0 0 £ノ w e 1 1で入れ、 室温で適度に発色させた。 1 MH2 S 04 を 1 0 0 〃 /w e l lで入れて発色を止め、 4 5 0 nmの吸光度を測定して F b gに結合した G P b/M a量を測り、 F b g ' G P U bZItt a結 合阻害活性を調べた。
( 3 ) ク ローニング
( 2 ) のスク リーニングで陽性を示したハイプリ ドーマを次のよ うにク ローユングした。 まず、 9 6ゥェル平ブレー トに、 マウス膜 腔滲出細胞 2 X 1 04 細胞 Zゥエルだけを接種しておいた。 そして、 1時間〜 1日後に培地を除去し、 ハイプリ ドーマを、 1 0細胞ノウ エルで 9 6ゥエルに接種した。 第一ク ローユングには H T培地を用 い、 第二クローニングには培地 Aを用いた。 培養 2〜3週間後に抗 体活性を測定し、 陽性クローンを拾った。
( ) 実験結果
I T P患者の脾臓等より得られたリ ンバ球 （約 1 0種類） を使つ て 8 0'回に及ぶ細胞融合とスク リーニ ングを行った。 上記 （ 2 ) の スク リ ーニ ング系 （ a ) の G P II bノ El aに対する結合活性陽性を 示すハイプリ ドーマは全体の約 1 0 %あつたが、 その中でスク リー ニング系 （ b ) の F b g · G P Π b /I aの結合阻害活性を有して いたハイプリ ドーマは 1種しか存在しなかった。
この両スク リーニ ング系に陽性を示したハイプリ ドーマ 1種をク ローニングすることによって、 上記の性質を有する M C Aを安定に 産生するハイプリ ドーマ I C F 2 C 8を樹立することに成功した (表 1 ) 。 また、 F b g ' G P H bノ H aの結合阻害活性は示さな いが、 G P Π b ΖΙΠ aに対して結合する 7種のハイプリ ドーマにつ いても、 クローニ ングにより M CAを安定に産生するハィブリ ド一 マとして樹立した （表 1 ) 。
こう して得られたハイプリ ドーマセルライ ン I C F 2 C 8は、 日 本国茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3号工業技術院微生物工業技術研 究所に、 ブダぺス ト条約に基き、 1 9 9 1年 1 0月 8日に微ェ研条 寄第 3 5 9 6号 （ F E R M B P— 3 5 9 6 ) として寄託されてい る。
表 1
CO
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(注 ： 表中、 N. D . は測定しなかったことを示す。 ）
実施例 2 , I C F 2 C 8の精製
ハイプリ ドーマ I C F 2 C 8を I T E S /P V P培地で培養した 培養液 （ 3 L ) を出発材料として用いた。 この培養液をァ ミ コ ン ( YM 3 0 メ ンブレン） で約 5 0 0 ffl«に濃縮した後、 ポリ エチレン グリ コールを終濃度 1 0 %になるように加え、 4 ΐで 1 2 0分置い た。 そして、 沈澱物を遠心により集め、 l M N a C l / 2 0 mMリ ン 酸バッファー （pH7. 2 ) に溶解した後、 同バッファーで平衡化した Con A Sepharose に力、けた。 この Con A Sepharose を 1 M N a C 1 / 2 0 mMN a P i (pH7.2 ) 、 1 M N a C 1 / 5 0 mMA c N a (PH 4.0 ) で順に洗浄した後、 M C Aを 0.5 Μ α—メチルマンノース / 0.5 M N a c 1 / 2 0 mMN a P i (PH7.2 ) で溶出した。
この溶出分画をア ミコ ン （ Y M 1 0 メ ンブレン） で濃縮後 P B S で平衡化した Sepharose C L— 6 Bにかけ、 1 & ¾4を舍む分画を 1 C F 2 C 8 として回収した （ 5 m g ) 。 この方法で得られた I C F 2 C 8 は ドデシル硫酸ナ ト リ ウム—ポリ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳 動 （ S D S— P A G E ) で 9 0 %以上純粋な I g Mであることが確 認された。
実施例 3 , C a 存在下 · 非存在下での G P D b ZlII a に対する ヒ ト型 M C Aの結合
( 1 ) C a + +存在下での G P H b Zffl a に対するヒ ト型 M C Aの 結合
精製 G Ρ Π bノ H aを Aバッファー 〔 1 2 7 mM C a + + / 9 O mMM g + + / P B S (pH7.2 ) 〕 で こ希釈し、 9 6 ゥエル E L I S Aプレー トに 1 0 0 tf £ /w e l 1 で入れ、 4 'Cで一晩静置した。
G P Π b Z Dl a溶液をすて、 2 % B S A/Aバッファーを 1 7 5 μ jg /w e l l で入れ、 3 7てて' 1 2 0分静置して Aバッファーで 3 回洗浄した後、 0.2 %B S A/"Aバッ ファーで 0〜 5 〃 g/ に希釈 した抗 G P H b /BI a ヒ ト型 M C A ( I C F 2 C 8または I A D 2 一 1 ) を 1 0 0 / ノ w e l l で入れ、 3 7て > 6 0分反応させた。
Aバッファーで 3回洗浄後、 G P E b aに結合したヒ ト型 M C A量を測定するため、 アルカ リ フォスファターゼ標識化抗ヒ ト I g M (または抗ヒ ト I g G ) 抗体を 0. 2 % B S Aノ Aバッファーで 1 0 4 倍希釈して 1 0 0 // ^ノ w e 1 1 で入れ、 3 7 'C , 6 0分反 応させた。 Aバッファーで 4回洗浄後、 P — 二 トロリ ン酸 2ナ ト リ ゥムを 0. 2 5 mMM g C 1 2 / 1 Mジエタノールァ ミ ン （pH9. 8 ) ) に 1 0 mgZ で溶解し、 1 0 0 i £ Zw e l l で入れ、 室温で適度 に発色させた。 その後、 4 0 5 nmの吸光度を測定し、 吸光度より G P U b ZIIi aに対するヒ ト型 M C Aの結合能を調べた。 図 1 にその 結果を示す。
( 2 ) C a + +非存在下での G P E b / IK aに対するヒ ト型 M C A の結合
精製 G P I b ZHI aを Aバッファーで 1 μ &/諕に希釈し、 9 6 ゥ エル E L I S Αプレー トに 1 0 0 £ /w e 1 1 で入れ、 4 'Cで一 晚静置した。 G P Π b /M a溶液をすて、 2 % B S AZBバッファ 一 ( 1 O mME D T A/ P B S (PH7. 2 ) 〕 を 1 7 5 ^Zw e l 1 で入れ、 3 7 'C , 1 2 0分静置して、 Bバッファーで 3回洗浄した 後、 0. 2 % B S A / Bノ ッファーで 0〜 5 ^ g/m£に希釈した抗 ? E b ZBI a ヒ ト型 M C A ( I C F 2 C 8または I A D 2 — 1 ) を 1 0 0 μ £ /w e 1 1で入れ、 3 7てで 6 0分反応させた。
Aバッファ一で 3面洗浄後、 G P Π b 1 aに結合したヒ ト型 M C A量を測定するため、 アルカ リ フォスファターゼ標識化抗ヒ ト I g M (または抗ヒ ト I g G ) 抗体を 0. 2 %B S A/Aバッファーで 1 0 4 倍希釈して 1 0 0 〃 ^Zw e l l で入れ、 3 7てで 6 0分反 応させた。 Aバッファーで 4面洗浄後、 C a + +存在下と同じ発色操 作を行って G P Π b / ffi a に対する M C Aの結合能を調べた。 その 結果を図 1 に示す。
図 1 の （ a ) より、 I C F 2 C 8 は C a + +存在下でのみ濃度依存 的に吸光度が増しており、 C a + +非存在下では全く吸光度が増して いない。 これより、 I C F 2 C 8 は、 C a + +存在下でのみ G P Π b /l a と結合し C a + +非存在下では結合しないことがわかった。
また、 図 1 ( b ) より、 I A D 2 — 1 は C a + +存在 · 非存在に関 係な く G P II b / ffi a と結合することがわかった。
実施例 4 , F b g と G P II bノ m a の結合に対するヒ ト型 M C Aの
歷
ヒ トフ イ ブリ ノ 一ゲン （ F b g ) を Aバッ ファーで 1 Q μも/ I： 希釈し、 9 6 ゥエル E L I S Aプレー トに 1 0 0 / £ Zw e l 1 で 入れ、 3 7て， 6 0分静置した。 その後、 1 % B S A/ 1 % F C S /ハンクス液でゥエルを洗浄した。 1 0 % F C S / 0. l % N a N 3 /Aバッファーを 2 0 0 〃 £ /w e 1 1 で入れ、 3 7 て， 6 0分静 置した後、 0. 0 0 2 %ヒビデンで 3回洗浄した。 1 0 % F C S _ A ノ ッファ一で希釈した 0. 2 5 μ g/mSLヒ ト G Ρ Π b / I a と各濃度の 抗ヒ ト G P II bノ m a ヒ ト型 M CA ( I C F 2 C 8または I A D 2 一 1 ) を等量で混合し、 3 7 て， 6 0分反応させたものを、 5 0 / £ / 6 1 1 で入れ、 3 7て， 6 0分結合させた。
0. 0 0 2 %ヒビデンで 3画洗浄した後、 結合した G P D b / I a 量を測定するため、 1 0 % F C S / Aバッフ ァーで 5 0 0 ng/ に 希釈した抗 G P U b Z BI a マウス型 M C A ( S e r o t e c社製、 M C A 4 6 8 ) を S O it/ Zw e l l で入れ、 3 7 'Cで 6 0分反応 させた。 0. 0 0 2 %ヒビデンで 3回洗浄した後、 1 0 % F C S /A バッファーで 1 0 4 倍希釈したペルォキシダーゼ標識化抗マウス I g G抗体 （ T A G O社） を 5 0 ^ /w e l l で.入れ、 3 7 てで 6 0分'反応させた。 その後、 0. 0 0 2 %ヒビデンで 5面洗浄した。 0.4 5 mg/ T M B Z— H C 1 (PH2. 0 ) と 0. 0 1 7 % H 2 02 Z 5 9 mMN a 2 H P 0 , / 4 I mMク工ン酸 （Ρίί4. 3 ) を等量で混合 し、 1 0 0 £ Zw e I l で入れ、 室温で適度に発色させた。 1 M H 2 S 04 を 1 0 0 £ Zw e l 1 で入れて発色を止め、 4 5 0 nm の吸光度を測定して F b gに結合した G P Π b ZDI a量を測った。 結果を図 2 に示す。
図 2より I C F 2 C 8の濃度依存的に吸光度が減少していること がわかる。 つまり、 F b g と G P E b /I a の結合は、 加えた I C F 2 C 8 により濃度依存的に阻害され、 I C F 2 C 8の終濃度 2. 5 〃g/ のときにはその 7 0 %が阻害された。 しかし、 同じ抗 G P II b ZET a ヒ ト型 M C Aである I A D 2 — 1 によっては、 F b g と G P I b a の結合は阻害されなかつた。
畫施例 5 v W Fと G P fl b /HI aの結合に対する I C F 2 C 8の
9 6 ゥエル E L I S Aプレー トに Aノ ッファーで 2 1. 6 μ g/πέに 希釈した抗 v W Fボリ ク ローナル抗体を 1 0 O /z ^ Zw e 1 1 で入 れ、 4 'Cに一晩静置した。 抗体溶液をすて、 2 %B S AZAバッ フ ァーを Zw e l l で入れ、 3 7てに 1 2 0分静置した。 Aバッファ一でゥエルを 3回洗浄した後、 v o n W i 1 1 e b r a n d病治療薬へマーテ （登録商標） P 〔へキス ト ジャパン㈱〕 を 0. 2 %B S AZAバッ ファーで 0. 6 2 5 u n i ί Zi に希釈し、 1 0 0 £ /w e 1 1 で入れ、 3 7 て， 1 2 0分反応させ、 v W F を結合させた。
Aバッファ一でゥエルを 3回洗浄後、 0. 2 %B S AZAバッファ 一で希釈した G P bノ]] l a ( 2 g/mi) と抗 G P II b ZIII a ヒ ト 型 M C A ( 0〜 1 0 g/ffifi) を等量で混合し、 3 7 'Cで 9 0分反応 させたものを、 1 0 0 ^ £ / w e l l で入れ、 3 7 てで 9 0分反応 させ、 v W Fと G P II b / ffi a を結合させた。 Aバッファーでゥェ ルを 3回洗浄後、 V W Fに結合した G P II b Z DI aを測定するため、 0. 2 % B S AZAバッ ファーで 5 0 に希釈した抗 G P II b
Z IE a マウス型 M C A ( S e r o t e c社製、 M C A 4 6 8 ) を 1 で入れ、 3 7 ΐ , 6 0分反応させた。
Αバッファーで 3回洗浄後、 0. 2 % B S Aノ Aバッ ファーで 1 0 4 倍希釈したアル力 リ フォスファ タ一ゼ標識化抗マウス I g G抗体 ( T A G O I n c . , C a t 1^ 6 5 5 0 ) を 1 0 0 / £ / w e 1 1 で入れ、 3 7 て， 6 0分反応させた。 Aバッファーで 4回 洗浄後、 P—ニ トロ リ ン酸 2 ナ ト リ ウムを 0. 2 5 mMM g C 1 2 / 1 Mジエタノールァ ミ ン （ pH 9. 8 ) に 1 0 mg/ mfiになるように溶解し、 1 0 0 μ £ e 1 1 で入れ、 室温で 6 0分発色させた。 その後、 4 0 5 nmの吸光度を測定した。 この吸光度より、 v W F と G P H b / 1Π aの結合量を調べた。 加えた抗 G P Π b /I a ヒ ト型 M CA濃 度と上記の方法で得られた 4 0 5 nmの吸光度の関係を図 3 に示す。 図 3より、 抗 G P II b Z lII a ヒ ト型 M C A I C F 2 C 8 は濃度依 存的に吸光度を減少させ、 1 0 μ / で 1 1 %まで吸光度を減少さ せた。 つまり、 I C F 2 C 8 は、 の抗体濃度で v W F と G P Π bZ Dl a の結合を 8 9 %阻害したこ とになる。 抗 G P Π b / Dl a ヒ ト型 M C A I A D 2 — 1 は v WFと G P H bZni aの結合を 胆害しなかった。
実施例 6 , I C F 2 C 8の血小板表面への結合能
ヒ ト新鮮血と 3. 8 %クェン酸ナ ト リ ウムを 9 ： 1 で混ぜた後、 1 0 0 0 rpm で 1 0分間遠心して P l a t e l e t r i c h p i a s m aを得た。 この p l a t e l e t r i c h l a s m a と終濃度 5 μ g/i になるように抗 G P II b / H a ヒ ト型モノ ク ロ一 . ナル抗体 （ I C F 2 C 8 ) を混合し、 室温で 3 0分反応させた。 こ の反応物を遠心 （ 2 5 0 0 rpm , 1 0分間） した後、 沈殺した血小 扳をバッファー C C 1 5 mMT r i s - H C 1 / 1 5 0 mMN a C 1 (pH7.4 ) 3 で 1回洗浄した。
この血小板をバッファー Cにけん濁後、 F I T C標識化抗ヒ ト I gMャギ抗体を室温で 3 0分間反応させた。 この反応物を遠心 （ 2 5 0 0 rpm , 1 0分間） した後、 沈殺した血小板をバッファ一 Aで 1回洗浄した。 この血小板を再度バッ ファ一 Aにけん濁し、 ί 1 0 w c y t 0 m e t r yにかけた。 結果を図 4に示す。
図 4の （ a ) ば抗体を全く反応させなかった場合、 （ b ) は抗 G P E bZIE a ヒ ト型モノク ローナル抗体を反応させず、 F I T C標 識化抗ヒ ト I g Mャギ抗体のみを血小板と反応させた場合、 （ c ) は I C F 2 C 8を反応後、 F I T C標識化抗ヒ ト I g Mャギ抗体を 反応させた場合の f l o w c y t o m e t r yのチャー トである。 図 4から、 （ a ) と （ b ) のビークの位置は変化がないので F I T C標識化抗ヒ ト I g Mャギ抗体は今回の条件下では血小板表面に 結合しないことがわかる。 I C F 2 C 8を血小板に反応させた場合 の （ c ) のビークの位置は、 （ a ) , ( b ) に比べて右に移動して いた。 このことより、 I C F 2 C 8は、 精製 G P II bノ IH aだけで なく、 ヒ ト血小板表面上の G P I b /I aにも結合することがわか つた。
実施例 7 , I C F 2 C 8の血小板凝集抑制活性
ヒ ト新鲜血と 3.8 %クェン酸ナ ト リ ウムを 9 ： 1で混ぜた後、 1 0 0 0 rpm で 1 0分間遠心して p l a t e l e t r i c h P 1 a s m a (P R P ) を得た。 この P R P 4 5 0 / £と各濃度の I C F 2 C 8の 4 5 / £を 3 7 'Cで 1分間反応させた後、 A D Pを終濃 度 4.8 / Mになるように加え、 血小板凝集を起こし、 ァグリコメー ターにて血小板凝集を 3 7てで 5分間観察した。 結果を図 5に示す。 図 6より、 I C F 2 C 8 は濃度依存的に血小板凝集を抑制し、 終 濃度 1 0 0 で凝集を約 7 0 %抑制した。 産業上の利用可能性
本発明のモノ ク口一ナル抗体及びその活性断片は、 血栓症の予防 又は治療のための血小板凝集抑制剤の活性成分としての使用が期待 される。
規則第 1 3 9 2の寄託された微生物への言及
寄託機関 工業技術院微生物工業技術研究所
茨城県つく ば市東 1 丁目 1番 3号
I C F 2 C 8 微ェ研条寄第 3 5 9 6号
( F E R M B P— 3 5 9 6 )
寄託日 1 9 9 1年 1 0月 8 曰

Claims

請 求 の 範 囲
1. ヒ ト Glycoprotein E b I aに特異的に結合し且つヒ ト血小 板凝集を抑制する能力を有するヒ ト型モノ ク ローナル抗体、 又はそ の活性断片。
2. ヒ ト Glycoprotein H b / I aに特異的に結合し且つヒ ト血小 板凝集を抑制する能力を有するヒ ト型モノ ク ローナル抗体を産生す る、 ヒ ト . リ ンパ球とマウス · ミエローマ細胞との融合によって得 られるハイプリ ドーマ又はその子孫。
3. 請求項 1 に記載のハイブリ ドーマを培養することを特徴とす る、 ヒ ト Glycoprotein E b / I aに特異的に結合し且つヒ ト血小板 凝集を抑制する能力を有するヒ ト型モノ クローナル抗体の製造方法。
4. ヒ ト · リ ンバ球とマウス · ミエローマ細胞とを融合せしめ、 そしてヒ ト Glycoprotein Π b /I aに特異的に結合し且つヒ ト血小 板凝集を抑制する能力を有するヒ ト型モノクローナル抗体を産生す るハイプリ ドーマを選択することを特徴とする、 該モノ ク ローナル 抗体を産生するハイブリ ドーマの製造方法。
5. ヒ ト Glycoprotein E b /I aに特異的に結合し且つヒ ト血小 板凝集を抑制する能力を有するヒ ト型モノクローナル抗体又はその 活性断片を含んで成る血小板凝集抑制剤。
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