WO1993004180A1 - Verfahren zur gezielten genetischen veränderung von ashbya gossypii - Google Patents

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WO1993004180A1
WO1993004180A1 PCT/EP1992/001878 EP9201878W WO9304180A1 WO 1993004180 A1 WO1993004180 A1 WO 1993004180A1 EP 9201878 W EP9201878 W EP 9201878W WO 9304180 A1 WO9304180 A1 WO 9304180A1
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Sabine Steiner
Juergen Wendland
Martin C. Wright
Roland Kurth
Peter Philippsen
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Basf Aktiengesellschaft
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination

Definitions

  • the present invention relates to a method for the targeted genetic modification of Ashbya gossypii by homologous recombination, and to the Ashbyagossypii strains modified by this method.
  • the filamentous Hemiascomycet Ashbya gossypii is of great interest, for example, as a ribo-flavin-producing microorganism.
  • homologous recombination has been observed in filamentous ascomycetes such as Aspergillus or Neurospora; however, the proportion of homologous versus non-homologous recombination is often low. In addition, no reliable parameter is specified which • leads preferentially or almost exclusively to homologous recombination (Microbiological Reviews, 53, 148-170, 1989).
  • the object was therefore to provide a method which allows the targeted genetic modification of Ashbya gossypii by homologous recombination.
  • the gene of the translation elongation factor EF-l ⁇ (TEF) from Ashbya gossypii is contained in a 4.6 kb EcoRI-EcoRI fragment and a 6.3 kb BamHI-BamHI fragment, which are derived from Ashbya DNA libraries by hybridization with a TEF sample Have Saccnaromyces cerevisiae (EMBO J.3, 3311-3315, 1984) isolated (Fig. 12).
  • the coding part of the TEF gene lies within the overlapping 2.1 kb EcoRI-BamHI fragment, the sequence of which is shown in the DNA sequence listing SEQ ID NO: 1 together with the adjacent sequences.
  • Ashoya gossypii strains modified by this process represent microorganisms with valuable properties.
  • the transformation of Ashbya gossypii means the transfer of recombined DNA into Ashbya gossypii nuclei or other DNA-bearing organelles using different methods. Protoplast transformation and electroporation are particularly suitable methods of transmission.
  • the protoplast transformation is expediently carried out in such a way that protoplasts are produced from the mycelium with the aid of enzymes such as zymolyase.
  • the protoplasts are suspended in an aqueous buffer containing calcium ions in a concentration of 1 to 10 ⁇ 10 8 / ml, preferably 3 to 5 ⁇ 10 ° / ml, and incubated with the purified DNA.
  • the purified DNA is added in a ratio of 1 to 50 ⁇ g, preferably 10 to 25 ⁇ g, per 100 ml protoplast suspension.
  • the transformed Ashbya gossypn cells are incubated in nutrient medium and spread on agar plates. If a selection marker, for example an antibiotic resistance gene, is used, the successfully transformed cells can be recognized particularly easily by growth on antibiotic-containing soil. Clonal purification via spore isolation is then advisable.
  • Recombinant DNA constructions which contain the DNA to be recombined flanked by one or more gene regions of Ashbya gossypii are used as vectors for the transformation.
  • a flanking gene region that is particularly well suited for homologous recombination is the TEF gene region.
  • the DNA to be recombined is flanked, for example, as shown in the plasmids pAG-102 and pAG-145 (FIGS. 4 and 11).
  • the DNA to be recombined can also come from Ashbya gossypii; however, DNA from other organisms of both prokaryotic and eukaryotic origin or synthetic DNA can also be used.
  • the DNA to be recombined can be coding or non-coding DNA; preference is given to using coding DNA.
  • the vectors used in the method according to the invention can also contain further DNA sequences such as selection markers.
  • Shuttle vectors which replicate in bacteria and are used for the transformation of Ashbya gossypii are preferably used.
  • these vectors usually have a bacterial origin of DNA replication and one or more antibiotic resistance genes.
  • the plasmid pAG-102 and the plasmid pAG-145 or derivatives derived therefrom are particularly preferred as the vector (FIGS. 4 and 11). Derivatives are to be understood as those plasmids which, in addition to or instead of the G418 resistance gene, contain further DNA sequences flanked by A. gossypii DNA.
  • circular DNA is used as a vector, it is linearized before the transformation of Ashbya gossypii in such a way that fragments with a terminal A. gossypii sequence are formed which initiate homologous recombination.
  • the Ashbya gossypii strains modified in a targeted manner by this method can be identified by the fact that vector DNA has been integrated at the predetermined locations in the homology region (eg TEF gene locus). This can be demonstrated, for example, by Southern blotting with a vector sample. The isolation of modified Ashbya gos- sypii strains if a selection marker is contained in the vector DNA. Then only the changed strains can be isolated under selective conditions, for example by antibiotic selection.
  • strains genetically modified with the plasmid pAG-102 by homologous recombination have the designations LU8334 to LU8341. These strains were deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Braunschweig, under the following numbers:
  • LU 8334 DSM 6661 LU 8335: DSM 6662 LU 8336: DSM 6663 LU 8337: DSM 6664 LU 8338: DSM 6665 LU 8339: DSM 6666 LU 8340: DSM 6667 LU 8341: DSM 6668
  • the method according to the invention makes it possible to construct genetic changes, such as insertions, deletions and substitutions which are accurate to the base pair, in a simple and genetically stable or unstable manner as desired.
  • the Hemiascomycet Ashbya gossypii is just as easily accessible as the single-cell yeast S. cerevisiae for genetic engineering processes which aim, for example, at genetically stable overexpression by homologous promoters.
  • TEF gene sample comprises nucleotides 363 to 1235 of the 1377 bp long open reading frame of the S. cerevisiae TEF2 gene (Schirmaier and Philippsen, EMBO J. 3 (1984), 3311-3315).
  • a 4.6 kb EcoRI fragment and a 6.3 kb BamHI fragment hybridized to the heterologous TEF gene sample.
  • SEQ ID NO: 1 contains the open reading grid of 1377 bp (SEQ ID NO: 2), 436 bp of the 5'-non-coding region and 686 bp of the 3'-non-coding region.
  • the promoter region was then isolated as a 403 bp HindIII / Hincll fragment which, in addition to the 379 bp before the start codon, also carries the first 24 bp of the open reading frame of the TEF gene, and was used for the constructions of pAG-100.
  • pAG-1 (Fig. 1) (deposited DSM 6010), a derivative of the vector pEX4 was according to Ernst and Chan, J.Bacteriol. 163 (1985), 8-14.
  • pAG-1 contains a 1.7 kb SalI fragment with the G418 resistance gene (G418r) of the transposon Tn903 coding for the aminoglycoside phosphotransferase (APH (3 ') I).
  • G418r G418 resistance gene
  • APH (3 ') I aminoglycoside phosphotransferase
  • pAG-1 contains the Saccharomyces cerevisiae ARS elements ARS1 and 2 ⁇ ARS and replicates autonomously in Ashbya gossypii.
  • pAG-2 (Fig. 2).
  • the 1.7 kb Sall fragment with the G418 resistance gene was excised from pAG-1 and inserted into the Sall site of S. cerevisiae-E. coli shuttle vectors YEp24 (Botstein et al., Gene 8 (1979), 17-24; New England Biolabs Inc., Beverly, MA, USA, 1988-1989 Catalog, 112-113).
  • the structure of the newly formed plasmid - pAG-2 - was checked by restriction endonuclease mapping, the Xhol interface located in the 1.7 kb SalI fragment being used to check the insert orientation.
  • pAG-2 contains the Saccharomyces cerevisiae ARS element 2 ⁇ ARS and replicates autonomously in Ashbya gossypii. (Wright and Philippsen, Gene 109, 99-105 (1991) c) pAG-100 (Fig. 3).
  • pAG-2 contains the Saccharomyces cerevisiae ARS element 2 ⁇ ARS and replicates autonomously in Ashbya gossypii. (Wright and Philippsen, Gene 109, 99-105 (1991) c) pAG-100 (Fig. 3).
  • a 403 bp Hindlll / Hincll fragment which the promoter region and contains the first 24 bp of the open reading frame of the gene for the translation elongation factor EF-l ⁇ (TEF gene) from A. gossypii.
  • pAG-100 contains the Saccharomyces cerevisiae ARS element 2 ⁇ ARS and replicates autonomously in Ashbya gossypii.
  • pAG-102 (Fig. 4).
  • the starting vector is pUC19, in which the BamHI site was inactivated after cutting, filling and religating.
  • a 940 bp fragment was inserted into the HindIII site of pAG-121, which carries the additional 5 'end of the G418 resistance gene, fused to the TEF promoter.
  • This fragment was obtained by digesting pAG-100 with HindIII. By inserting this fragment, a complete G418 resistance gene is created again.
  • pAG-103 was partially digested with HindIII and the linearized plasmid isolated from an agarose gel.
  • the protruding ends were blunt-ended by filling in using the Klenow fragment of DNA polymerase I and a 1.64 kb BamHI / Sall fragment from pAG-122 with the kanamycin resistance gene under control of the TEF promoter after filling of the protruding ends inserted.
  • the fusion of the filled Sall and Hindlll interfaces again results in Hindlll interfaces.
  • Transformation of A. gossypii with TEF gene region vectors The transformations were carried out according to the following scheme:
  • MA2 Peptone (Gibco casein hydrolyzate, No. 140): 10 g / 1 yeast extract (Gibco): 1 g / 1
  • SMA2 agar Sorbitol peptone yeast extract glucose myo-inositol agar (Gibco)
  • SMA2 top layer Like SMA2 agar, instead of agar 0.8% agarose
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • Tris Tris (hydroxymethyl) aminomethane
  • PTC40 40% (w / v) polyethylene glycol 4000 (Merck);
  • the plasmid also carries a G418 resistance gene under the control of the TEF promoter, which gives Ashbya gossypii transformants resistance to the aminoglycoside G418.
  • the plasmid has no signals for autonomous replication Ashbya gossypii. pAG-102 DNA was found within the
  • TEF homology region (3 'end of the TEF gene) cut at the BamHI site and used to transform Ashbya gossypii protoplasts according to Example 3. This allows homologous recombination 3 'to be induced by the TEF gene.
  • the eight independently obtained G418-resistant transformants (LU8334-LU8341, deposited with DSM, Braunschweig) retained their G418 resistance after clonal cleaning and without selection pressure.
  • the pAG-102 DNA had been stably integrated into the Ashbya gossypii genome.
  • FIG. 5a shows a chromosome separation of the eight transformants and the wild-type strain (middle lane).
  • the TEF gene is located on the largest of the five visible chromosomes, in which the plasmid was also integrated in all eight cases (FIG. 5b).
  • DNA fragments containing the novel uoints between chromosomal and plasmid DNA were cloned from three of the eight transformants as a control.
  • a sequence analysis in the area of the BamHI sites showed no change compared to the wild type DNA.
  • A. gossypii protoplasts were transformed with BamHI cut plasmid pAG-145. As a result, homologous recombination 5 'and 3' of the TEF gene can be induced simultaneously.
  • Five transformants were clonally purified and examined for the integration of the kanamycin resistance gene using Southern analyzes. The analyzes of EcoRI-cleaved DNA were carried out with two clonally purified strains of each transformand, the analyzes of BglII-cleaved DNA with one clonally purified strain of each transformande. The results of these analyzes are shown in FIGS. 13 and 14; the data are interpreted using the model in FIG. 15.
  • a stabilization test was carried out with the clonally purified transformants 1 to 5. Mycelium was incubated for six days on non-selective medium and then mycelium was transferred from the edge of each colony onto a new plate of non-selective medium and onto a plate with selective medium. After an incubation of a further three days on non-selective medium, mycelium was again transferred to new plates. After six days of non-selective growth, all of the transformants were still G418-resistant. After nine days, transformants 1, 2 and 3 had lost their resistance to G418. The data from the heart indicate that the loss is due to a homologous recombination between the TEF promoter fragments. The relatively high deletion frequency of the heterologous marker (G418 resistance gene) observed with this construction may be advantageous in the case of cotransformations.
  • Cultivation in a liquid culture or on a plate is achieved by inoculating with mycelium or spores.
  • Medium 1 liter
  • MA-2 1 g peptone 1 g yeast extract
  • MA-2-G418 MA-2 + 200 mg G418 / ml
  • the gels thus obtained were transferred to Hybond-N membranes by Southern transfer and baked at 80 ° C. for 2 hours. Prehybridization, hybridization and the subsequent washing were carried out non-radioactively under stringent conditions ('Non-radioactive Labeling and Detection' Applications Manual, Boehringer Mannheim, order number: 1093 657).
  • Running conditions 20 h running time, 48 s pulse duration
  • Fig. 5 a Chromosome separation with OFAGE.
  • Chromosomal DNA is characterized by thick lines, the plasmid DNA by thin or double lines. Arrows show the location of the TEF reading frame.
  • B BamHI
  • FIG. 12 Comparison of the homology regions used for the integration of pAG-102 and pAG-145, a: Homology region of pAG-102: 4.6 kb EcoRI fragment b: Homology region of pAG-145: 6.3 kb BamHI fragment Der Arrow indicates at which point in the genome the foreign DNA is integrated after homologous recombination.
  • Figure 13 Southern with BglII-digested DNA from five pAG-145 transformants
  • Genomic DNA from five clonally purified transformants of the plasmid pAG-145 and the untransformed parent strain was cleaved with BglII, separated on a 0.4% agarose gel and hybridized against radioactively labeled pAG-145 DNA in a Southern experiment. All transformants (lanes 1 to 5) show a signal with a length of about 17 kb, which also occurs in the wild-type DNA lane 6). In addition, all transformants have a fragment with a length of approximately 18.6 kb, which indicates integration of the G418 resistance gene into the 17 kb BglII fragment.
  • FIG. 14 Southern with EcoRI digested DNA from five pAG-145 transformants
  • Genomic DNA from two clonally purified strains of five transformants of the plasmid pAG-145 and the untransformed starting strain was split with EcoRI, separated on a 0.8% agarose gel and in a Southern experiment against radioactively labeled pAG-103 DNA hybridizes.
  • the transformants 1 (lanes 1, 2), 3 (lanes 5, 6), 4 (lanes 7, 8) and 5 (lanes 9, 10) no longer have the fragment which occurs in the wild-type DNA (lane 11) of 1.55 kb, but instead a 1.32 kb fragment and additionally a 1.6 kb fragment that corresponds to the G418 resistance gene.
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTI-SENSE NO
  • ORIGINAL.SOURCE

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten genetischen Veränderung von Ashbya gossypii durch homologe Rekombination.

Description

Verfahren zur gezielten genetischen Veränderung von Ashbya gossypii
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten genetischen Veränderung von Ashbya gossypii durch homologe Re¬ kombination, sowie die nach diesem Verfahren veränderten Ashbya- gossypii-Stämme.
Der filamentöse Hemiascomycet Ashbya gossypii ist beispielsweise als Ribo-flavin produzierender Mikroorganismus von großem Inter¬ esse.
Ein Verfahren zur gezielten genetischen Veränderung durch homo¬ loge Rekombination wurde von Struhl et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 1035-1039, 1979) für die Hefe Saccharomyces cerevi- siae beschrieben und später durch Rothstein (Meth. Enzymology Vol. 194, S. 281 ff.) erweitert.
Bei filamentösen Ascomyceten wie Aspergillus oder Neurospora wurde homologe Rekombination beobachtet; jedoch ist der Anteil der homologen gegenüber der nicht-homologen Rekombination oftmals gering. Es wird außerdem kein zuverlässiger Parameter angegeben, •der bevorzugt oder fast ausschließlich zur homologen Rekombina¬ tion führt (Microbiological Reviews, 53, 148-170, 1989).
Es bestand daher die Aufgabe, ein Verfahren bereitzustellen, das die gezielte genetische Veränderung von Ashbya gossypii durch ho¬ mologe Rekombination erlaubt.
Demgemäß wurde gefunden, daß die gezielte genetische Veränderung von Ashbya gossypii durch homologe Rekombination besonders effek- tiv erfolgt, wenn Ashbya gossypii mit Vektoren transformiert wird, die die neu zu rekombinierende DNA flankiert von einer oder mehreren Genregion von Ashbya gossypii enthalten. Als Genregion von Ashbya gossypii werden bevorzugt DNA-Sequenzen im Bereich des Genlocus des Translationselongationsfaktors EF-lα (TEF-Gen) für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet.
Das Gen des Translationselongationsfaktors EF-lα (TEF) von Ashbya gossypii ist in einem 4,6 kb großen EcoRI-EcoRI-Fragment und ei¬ nem 6,3 kb großen BamHI-BamHI-Fragment enthalten, die sich aus Ashbya-DNA-Genbanken durch Hybridisierung mit einer TEF-Probe aus Saccnaromyces cerevisiae (EMBO J.3, 3311-3315, 1984) isolieren lassen (Fig. 12) .
Der codierende Teil des TEF-Gens liegt innernalb des uberlappen- den 2 , 1 kb großen EcoRI-BamHI-Fragments, dessen Sequenz m DNA- Sequenzprotokoll SEQ ID NO:l zusammen mit den angrenzenden Se¬ quenzen angegeoen ist.
Außerdem wurde gefunden, daß die mit diesem Verfahren veranderten Ashoya gossypii-Stamme Mikroorganismen mit wertvollen Eigen¬ schaften darstellen.
Unter Transformation von Ashbya gossypii versteht man die Über¬ tragung von rekombinierter DNA in Ashbya gossypii-Kerne oder an- dere DNA-tragende Organellen mit unterschiedlichen Methoden. Be¬ sonders geeignete Methoden zur Übertragung sind Protoplasten- Transrormation und Elektroporation.
Die Protoplasten-Transformation wird zweckmäßig in der Weise durcngefuhrt, daß aus dem Mycel mit Hilfe von Enzymen wie bei¬ spielsweise Zymolyase Protoplasten hergestellt werden. Die Proto¬ plasten werden m einem wäßrigen, Calcium-Ionen enthaltenden Puf¬ fer in einer Konzentration von 1 bis 10 x 108/ml, bevorzugt 3 bis 5 x 10°/ml, suspendiert und mit der gereinigten DNA inkubiert. Die gereinigte DNA wird m einem Verhältnis von 1 bis 50 μg, bevorzugt 10 bis 25 μg pro 100 ml Protoplastensuspension zugegeben. Die transformierten Ashbya gossypn-Zellen werden in Nährmedium inku¬ biert und auf Agarplatten ausgestrichen. Bei Verwendung eines Selektionsmarkers, beispielsweise eines Antibiotikaresistenzgens, können die erfolgreich transformierten Zellen besonders leicht durcn Wachstum auf Antibiotikum-haltigen N hrboden erkannt wer¬ den. Anschließend ist eine klonale Aufreinigung über Sporeniso- lierung zweckmäßig.
Als Vektoren für die Transformation werden rekombmante DNA-Kon¬ struktionen verwendet, die die neu zu rekombinierenden DNA flan¬ kiert von einer oder mehreren Genregionen von Ashbya gossypii enthalten. Eine flankierende Genregion, die besonders gut zur homologe Rekombination geeignet ist, ist die TEF-Genregion. Die neu zu rekombinierende DNA wird beispielsweise so flankiert, wie es in den Plasmiden pAG-102 und pAG-145 (Fig. 4 und 11) darge¬ stellt ist. Die neu zu rekombinierende DNA kann ebenfalls aus Ashbya gossypii stammen; es kann aber auch DNA aus anderen Organismen sowohl prokaryontisehen als auch eukaryontisehen Ursprungs oder auch synthetische DNA verwendet werden.
Bei Verwendung von DNA aus Ashbya gossypii als neu zu rekombinie¬ rende DNA ist es beispielsweise möglich, schwach exprimierte Ash¬ bya gossypii-Gene unter die Kontrolle eines starken Promotors (z. B. TEF-Promotor) durch basenpaargenaue Integration zu bringen und somit eine Expressionssteigerung zu bewirken, ohne artfremde Expressionssignale verwenden zu müssen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es auch möglich, DNA aus anderen Organismen als Ashbya gossypii, beispielsweise aus der genetisch besser definierten Hefe Saccharomyces cerevisiae oder den Bakterien Bacillus subtilis oder Escherichia coli, gezielt in Ashbya gossypii-Zellen einzuführen und dort stabil zu vermehren, bzw. gegebenenfalls zu exprimieren.
Bei der zu rekombinierenden DNA kann es sich um codierende oder nicht-codierende DNA handeln, bevorzugt ist die Verwendung von codierender DNA.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Vektoren können darüber hinaus weitere DNA Sequenzen wie beispielsweise Selek- tionsmarker enthalten. Bevorzugt verwendet werden shuttle-Vekto- ren, die sowohl in Bakterien replizieren als auch zur Transforma¬ tion von Ashbya gossypii verwendet werden. Dazu besitzen diese Vektoren in der Regel einen bakteriellen Ursprungspunkt der DNA- Replikation und ein oder mehrere Antibiotika-Resistenzgene. Be¬ sonders bevorzugt wird als Vektor das Plasmid pAG-102 und das Plasmid pAG-145 oder davon abgeleitete Derivate (Fig. 4 und 11) . Als Derivate sind solche Plasmide zu verstehen, die zusätzlich zur oder anstatt des G418-Resistenz-Gens weitere DNA-Sequenzen flankiert von A. gossypii DNA enthalten.
Bei Verwendung von zirkulärer DNA als Vektor wird diese vor der Transformation von Ashbya gossypii so linearisiert, daß Fragmente mit terminaler A. gossypii Sequenz entstehen, die die homologe Rekombination einleiten.
Die nach diesem Verfahren gezielt veränderten Ashbya gossypii- Stämme lassen sich dadurch identifizieren, daß an den vorbestimm¬ ten Stellen der Homologieregion (z.B. TEF-Genlocus) eine Integra- tion von Vektor-DNA stattgefunden hat. Dies läßt sich beispiels¬ weise durch Southern-Blotting mit einer Vektor-Probe nachweisen. Besonders einfach ist die Isolierung von veränderten Ashbya gos- sypii-Stämmen, wenn in der Vektor-DNA ein Selektions- marker ent¬ halten ist. Dann können unter selektiven Bedingungen, beispiels¬ weise durch Antibiotika-Selektion, ausschließlich die veränderten Stämme isoliert werden.
Die mit dem Plasmid pAG-102 durch homologe Rekombination gene¬ tisch veränderten Stamme tragen die Bezeichnung LU8334 bis LU8341. Diese Stamme wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikro¬ organismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, unter folgenden Nummern hinterlegt:
LU 8334: DSM 6661 LU 8335: DSM 6662 LU 8336: DSM 6663 LU 8337: DSM 6664 LU 8338: DSM 6665 LU 8339: DSM 6666 LU 8340: DSM 6667 LU 8341: DSM 6668
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, gezielt genetische Veränderungen wie beispielsweise basenpaargenaue Insertionen, Deletionen und Substitutionen einfach und je nach Wunsch gene¬ tisch stabil oder instabil zu konstruieren. Dadurch wird der Hemiascomycet Ashbya gossypii für gentechnische Verfahren, die beispielsweise auf eine genetisch stabile Überexpression durch homologe Promotoren zielen, ähnlich gut zugänglich wie die ein¬ zellige Hefe S. cerevisiae.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1
Isolierung der Ashbya gossypii-TEF-Genregion
Aus A.gossypii-Mycel isolierte DNA wurde mit den Restriktions- endonukleasen EcoRI und BamHI geschnitten. DNA-Fragmente, die das TEF-Gen oder Teile davon tragen, wurden nach Größentrennung der Restriktionsfragmente in einer Agarose-Gelelektrophorese und eine nachfolgende Hybridisierung mit einer 32P-markierten heterologe TEF-Genprobe identifiziert. Die TEF-Genprobe umfaßt die Nukleo- tide 363 bis 1235 des 1377 bp langen offenen Leserasters des S. cerevisiae TEF2-Gens (Schirmaier und Philippsen, EMBO J. 3 (1984), 3311-3315). Ein 4,6 kb langes EcoRI-Fragment und ein 6,3 kb langes BamHI-Fragment hybridisierten mit der heterologen TEF-Genprobe. Fragmente dieser Längenbereiche wurden aus Agarose- gelen eluiert, in den mit EcoRI bzw. BamHI geschnittenen Vektor pUC8 (Vieira und Messing, Gene 19 (1982), 259-268) kloniert und in E.coli transformiert. Die Klone mit TEF-DNA wurden durch Kolo- niehybridisierung (Grunstein und Hogness, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72 (1975), 3961-3965) mit Hilfe der 32P-markierten hetero- logen Probe erkannt. Die positiven Klone enthielten entweder das 4,6 kb lange EcoRl-Fragment oder das 6,3 kb lange BamHI-Fragment. Beide Klone überlappen in einem Bereich von 2,1 kb, der die Homo¬ logie zur TEF-Genprobe trägt und der sequenziert wurde. Die Sequenz des 2,1 kb Fragments und angrenzender Bereiche ist in SEQ ID NO: 1 enthalten. SEQ ID NO: 1 enthält das offene Lese¬ raster von 1377 bp (SEQ ID NO: 2), 436 bp der 5'-nichtkodierenden Region und 686 bp der 3'-nichtkodierenden Region. Anschließend wurde die Promotorregion als 403 bp langes Hindlll/Hincll-Frag- ment, das neben den 379 bp vor dem Startcodon noch die ersten 24 bp des offenen Leserasters des TEF-Gens trägt, isoliert und für die Konstruktionen von pAG-100 eingesetzt.
Beispiel 2
Plasmidkonstruktionen
a) Der Vektor pAG-1 (Fig. 1) (hinterlegt DSM 6010), ein Derivat des Vektors pEX4 wurde gemäß Ernst und Chan, J.Bacteriol. 163 (1985), 8-14 hergestellt. pAG-1 enthält ein 1,7 kb Sall-Fragment mit dem für die Aminoglykosidphosphotransfe- rase (APH(3')I) kodierenden G418-Resistenzgen (G418r) des Transposons Tn903. Im ursprünglichen pEX4-Kons rukt wurde zu¬ nächst das 1695 bp PvuII-Fragment von Tn903 (Oka et al., J.Mol.Biol. 147 (1981), 217-226) in ein Plasmid mit aufge- füllten Sall-Schnittstellen einligiert. Die Sall-Schnittstel- len bleiben dabei erhalten und das Resistenzgen kann als 1,7 kb Sall Fragment isoliert werden. pAG-1 enthält die Saccharo- myces cerevisiae ARS-Elemente ARS1 und 2μ ARS und repliziert autonom in Ashbya gossypii.
b) pAG-2 (Fig. 2). Das 1,7 kb Sall-Fragment mit den G418-Re- sistenzgen wurde aus pAG-1 ausgeschnitten und in die Sall- Schnittstelle des S. cerevisiae-E. coli Shuttlevektors YEp24 (Botstein et al., Gene 8 (1979), 17-24; New England Biolabs Inc., Beverly, MA, USA, 1988-1989 Catalog, 112-113) einge¬ fügt. Die Struktur des neu entstandenen Plasmides - pAG-2 - wurde durch Restrik ionsendonukleasekartierung überprüft, wo¬ bei die im 1,7 kb Sall-Fragment gelegene Xhol-Schnittstelle zur Überprüfung der Insertorientierung benutzt wurde. pAG-2 enthält das Saccharomyces cerevisiae ARS-Element 2μ ARS und repliziert autonom in Ashbya gossypii. (Wright und Philipp- sen, Gene 109, 99-105 (1991) c) pAG-100 (Fig. 3) . In die Xhol Schnittstelle von pAG-2 , die 30 bp m 3 '-Richtung hinter dem Translationsstart des G418-Re- sistenzgens liegt, wurde nach Auffüllen der überstehenden Enden ein 403 bp langes Hindlll/Hincll-Fragment, das die Pro- motorregion und die ersten 24 bp des offenen Leserasters des Gens für den Translationselongationsfaktor EF-lα (TEF-Gen) aus A.gossypii enthalt, eingefugt. Die Orientierung des Frag¬ mentes in dem so entstandenen Plasmid pAG-100 wurde durch Re- stπktionsendonukleasekartierung mit Hmdlll überprüft. Durch Einfugen des 403 bp langen Fragmentes wurden die 10 N-termi- nalen Aminosäuren der APH(3')I durch die ersten 8 Aminosäuren des A.gossypii Translationselongationsfaktors EF-lα ersetzt. Entfernen oder Austausch der ersten 19 Aminosäuren der APH(3')I durch andere Aminosäuren führt nicht zu einem Ver- lust der Aktivität (Chen und Fukuhara, Gene 69 (1988),
181-192) . pAG-100 enthalt das Saccharomyces cerevisiae ARS- Element 2μ ARS und repliziert autonom m Ashbya gossypii.
d) pAG-102 (Fig. 4) . Ausgangsvektor ist pUC19, in dem die BamHI- Stelle nach Schneiden, Auffüllen und Religieren inaktiviert wurde. Das 4 , 6 kb EcoRI-Fragment der TEF-Region wurde die EcoRI-Stelle von pUC19 kloniert (Pfeil = offenes Leseraster des TEF-Gens) . Anschließend wurde das 2, 1 kb Sall-Fragment aus pAGlOO nach Auffüllen der Enden m die Sspl-Stelle klo- niert (dünner Pfeil = offenes Leseraster des G418-Resistenz- gens; dicker weißer Pfeil = TEF-Promotor Hindlll-HmcII-Frag- men ) .
e) Konstruktion von pAG-103 (Abb. 10)
In die Barn HI-Schnittstelle des Plasmides pBluescript II SK- (Altmg-Mees und Short, Nucl. Acids Res., 17, 9494 ff., 1989) wurde das 6,3 kb BamHI-Fragment mit dem TEF-Gen aus A. gossy¬ pii einkloniert. Die Orientierung dieses Fragmentes wurde durch Restrikt10nsSpaltungen mit EcoRI, HmcII und Hindlll überprüft (TEF = TEF-Gen aus A. gossypii, weißer Pfeil auf schwarzem Grund = TEF-Promotor) .
f) Konstruktion von pAG-121
Ein 669 bp großes SalI/HindiIl-Fragment, welches das 3 '-Ende des G418-Resistenzgens tragt, wurde aus pAG-100 isoliert und in das Sall/Hindlll-geschnittene Plasmid pBlueskπpt II SK + (Al mg Mees und Short, 1989) eingefügt. g) Konstruktion von pAG-122
In die Hindlll-Schnittstelle von pAG-121 wurde ein 940 bp großes Fragment eingefügt, welches das ergänzende 5'-Ende des G418-Resistenzgens, fusioniert an den TEF-Promotor, trägt.
Dieses Fragment wurde durch Spaltung von pAG-100 mit Hindill gewonnen. Durch Einfügen dieses Fragmentes entsteht erneut ein komplettes G418-Resistenzgen.
h) Konstruktion von pAG-145 (Abb.11)
pAG-103 wurde mit Hindlll partiell gespalten und das lineari- sierte Plasmid aus einem Agarosegel isoliert. Die überstehen¬ den Enden wurden durch Auffüllen unter Verwendung des Klenow- Fragmentes der DNA-Polymerase I in stumpfe Enden überführt und ein 1,64 kb großes BamHI/Sall-Fragment aus pAG-122 mit dem Kanamycinsresistenzgen unter Kontrolle des TEF-Promotors nach Auffüllen der überstehenden Enden eingefügt. Die Lage und Orientierung des G418-Resistenzgens wurde durch Restrik- tionsspaltungen überprüft (weißer bzw. schraffierter Pfeil auf schwarzem Grund = TEF-Promotor (Hindlll/HincII-Fragment) , schraffiert = G418-Resistenzgen) . Die Fusion der aufgefüllten Sall- und Hindlll-Schnittstellen ergibt wieder Hindlll- Schnittstellen.
Beispiel 3
Transformation von A.gossypii mit TEF-Genregion-Vektoren Die Transformationen erfolgten nach folgendem Schema:
200 ml MA2 mit ca. l-2xl07 Sporen beimpfen
32-40 h bei 27°C mit 350 Upm in Schikanenkolben inkubieren Myzel mit Saugfiltration abfiltrieren und lx in 30 ml H2O waschen
Frischgewicht bestimmen (ca. 2-3 g)
Myzel in 30 ml SD suspendieren und 30 min bei 30°C in Schüttler inkubieren
Myzel in 5-10 ml SPEZ pro g Frischgewicht suspendieren
Bei 30°C in Wasserbadschüttler inkubieren, Protoplastierung mikroskopisch überprüfen (nach 30 min sollte ein Proto¬ plastierungsgrad von über 90 % erreicht sein) Protoplastensuspension über Glasfilter (Schott, Porosität 1) filtrieren
Filtrat 5 min zentπfugieren (Sorvall SM24 Rotor, 1800 Upm)
Sediment lx in 20 ml ST und lx in 20 ml STC waschen
Protoplasten in 20 ml STC suspendieren und Titer in Zählkam¬ mer bestimmen
Nach Zentrifugation Protoplasten zu einer Dichte von 4xl08/ml in STC resuspendieren
100 ml Protoplastensuspension zu DNA in maximal 15 ml TE ge- ben und mischen (DNA-Mengen für integrative Transformation mit linearisierten TEF-Genregion-Vektoren: 15-20 mg)
15 min bei Raumtemperatur inkubieren
- Vorsichtig 1 ml PTC40 zugeben und durch Invertieren mischen
5 min zentrifugieren (Heraeus Biofuge A, 1500 Upm)
Überstand vorsichtig abziehen und Sediment in 1 ml SMTCI sus- pendieren
3 h bei 27°C inkubieren, ca. alle 45 min durch Invertieren mischen
- Nach Zentrifugation Sedimente in 1 ml SM suspendieren
Suspension mit 9 ml SMA2 Toplayer mischen und auf SMA2 Platte geben (20 ml SMA2-Agar pro Platte)
- Platten 18 h bei 27°C inkubieren
Platten mit G418 uberschichten (0,54 ml G418 Stammlösung +0,46 ml H2O + 6 ml 0,5 % Agarose (in H2O, vorgewärmt auf 42-C) )
Platten bei 27°C weiter inkubieren, Transformanden sind nach 3-6 Tagen sichtbar Medien und Lösungen
Medien: MA2: Pepton (Gibco Caseinhydrolysat, No. 140): 10 g/1 Hefeextrakt (Gibco) : 1 g/1
Glucose 10 g/1 myo-Inositol 0,3 g/1
SMA2-Agar: Sorbitol Pepton Hefeextrakt Glucose myo-Inositol Agar (Gibco)
Figure imgf000011_0001
SMA2-Toplayer: Wie SMA2-Agar, statt Agar 0,8 % Aga- rose
Lösungen: SD: IM Sorbitol; 50 mM Dithiothreitol
SPEZ: IM Sorbitol; 10 mM Na-Phosphatpuffer pH 5,8;
10 mM EDTA; 2 mg/ml Zymolyase 20 T (Seikagaku Kogyo Co., Tokyo)
ST: IM Sorbitol; 10 mM Tris-HCl pH 8
STC: IM Sorbitol; 10 mM Tris-HCl pH 8; 10 mM CaCl"
TE: 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA
EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
Tris: Tris (hydroxymethyl)aminomethan
SDS: Natriumlaurylsulfat ddH2θ: doppelt destilliertes Wasser
TBE: 100 mM Tris, 100 M Borsäure, 2 mM EDTA, pH = 8,0 PTC40: 40 % (w/v) Polyethylenglykol 4000 (Merck);
10 mM Tris-Cl pH 8; 10 mM CaCl" SMTCI: 50 % SM (siehe unten); 50 % STC; 0,03 g/1 myo-Inositol SM: 50 % 2M Sorbitol; 50 % MA2 G418-Stammlösung: 20 mg/ml G418 (Geneticin, Gibco) in H20 Beispiel 4
Transformation von A. gossypii mit pAG-102
Das Plasmid pAG-102 (Figur 4) enthalt ein 4,6 kb EcoRI-Fragment aus der Ashbya gossypn-TEF-Region (TEF = Gen des Translations¬ elongationsfaktors EF-lα) . Weiterhin tragt das Plasmid ein G418-Resιstenzgen unter Kontrolle des TEF-Promotors, das Ashbya gossypii Transformanden Resistenz gegenüber dem Aminoglykosid G418 verleiht. Das Plasmid besitzt keine Signale für autonome Re- plikation Ashbya gossypii. pAG-102 DNA wurde innerhalb der
TEF-Homologieregion (3 '-Ende vom TEF-Gen) an der BamHI-Stelle ge¬ schnitten und zur Transformation von Ashbya gossypii Protoplasten gemäß Beispiel 3 benutzt. Dadurch kann homologe Rekombination 3' vom TEF-Gen induziert werden. Die acht unabhängig erhaltenen G418-resιstenten Transformanden (LU8334-LU8341, hinterlegt bei DSM, Braunschweig) behielten nach klonaler Reinigung und ohne Se- lektionsdruck ihre G418-Resιstenz. Die pAG-102 DNA war stabil ins Ashbya gossypii Genom integriert worden.
Figur 5a zeigt eine Chromosomenauf rennung der acht Transforman¬ den und des Wildtypstammes (mittlere Bahn) . Das TEF-Gen liegt auf dem größten der fünf sichtbaren Chromosomen, in das allen acht Fällen auch das Plasmid integriert wurde (Fig. 5b) .
Diese Integrationen fanden ausschließlich am TEF-Locus statt, denn das Bglll-Fragment, das den TEF-Locus enthalt, ist im Ver¬ gleich zum Wildtyp Bglll-Fragment in allen acht Transformanden um etwa 10 kb langer (Fig. 6). Eine homologe Rekombination sollte nach Figur 7 zu einer präzisen Verdopplung der 4,6 kb TEF-Region fuhren. Dies trifft zu, wie die Analyse der Transformanden und Wildtyp DNA nach Spaltung mit BamHI __cιd EcoRI zeigt (Fig. 8a,b) .
Von drei der acht Transformanden wurden zur Kontrolle DNA-Frag¬ mente kloniert, die die "novel uoints" zwischen chromosomaler und Plasmid DNA enthalten. Eine Sequenzanalyse im Bereich der BamHI Stellen ergab keine Änderung im Vergleich zur Wildtyp DNA.
Nach einjähriger Lagerung bei -70c wurden die acht Transformanden wiederum analysiert und zwar nach erneutem Mycelwachstum und Sporulierung. Dabei ergaben sich Hinweise auf Amplifikationen, denn drei der analysierten Klone trugen zwei Plasmidkopien und zwei sogar drei Plasmidkopien (Fig. 9), teilweise mit Sequenz¬ umlagerungen. Eine dieser Umlagerungen führte wahrscheinlich zu einer tandem Duplikation des G418-Resιstenzgens. Der Grund für diese Umlagerungen beruht vielleicht auf den zwei TEF-Promotor- regionen pro Plasmidkopie (s. Fig. 4). Beispiel 5
Transformation von A. gossypii mit pAG-145
A. gossypii-Protoplasten wurden mit BamHI-geschnittenem Plasmid pAG-145 transformiert. Dadurch kann homologe Rekombination 5' und 3' vom TEF-Gen gleichzeitig induziert werden. Fünf Transformanden wurden klonal aufgereinigt und mittels Southern-Analysen auf die Integration des Kanamycinresistenzgens untersucht. Die Analysen EcoRl-gespaltener DNA erfolgten mit zwei klonal aufgereinigten Stämmen jeder Transformande, die Analysen Bglll-gespaltener DNA mit einem klonal aufgereinigten Stamm jeder Transformande. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in Fig. 13 und Fig. 14 gezeigt, eine Interpretation der Daten erfolgt anhand des Modells in Fig. 15.
Im Bglll-Southern zeigen alle Transformanden zwei Banden: die größere Bande mit einer Länge von ca. 18,6 kb tritt nicht im un- transformierten Wildtyp auf. Sie entspricht dem TEF-Lokus -nach Integration des G418-Resistenzgens (s. Fig. 15b). Die kleinere Bande mit einer Länge von ca. 17 kb tritt auch im Wildtyp auf und entspricht dem TEF-Lokus ohne integriertes G418-Resistenzgen. Sie kann entweder von einer Wildtyp-Kopie des TEF-Lokus gebildet wer¬ den (s. Fig. 15a), oder durch ein sekundäres Ereignis nach der Integration, nämlich eine Deletion des G418-Resistenzgens durch •homologe Rekombination zwischen den beiden TEF-Pro otor-Kopien, entstanden sein (s. Fig. 15c) .
Dies wäre z.B. unter Bedingungen von Vorteil, wenn ein integrier- ter heterologer Marker nach erfolgter Integration eines Sequenz¬ signals oder eines Gens entfernt werden soll.
Um dies zu untersuchen, wurde die Analyse mit EcoRI-gespaltener DNA durchgeführt. Vor dem TEF-Promotor-Fragment des G418-Resi- stenzgens befindet sich eine zusätzliche EcoRI-Schnittstelle, die aus dem Polylinker von pAG-122 stammt und daher nicht vor dem TEF-Promotorfragment des TEF-Gens vorkommt. Sollte das 17 kb große Bglll-Fragment in den Trans ormanden durch Integration und anschließende Deletion entstanden sein, müßte sich die zusätzli- ehe EcoRI-Schnittstelle nachweisen lassen, da sie vor der verdop¬ pelten Region liegt und daher nicht von der Deletion betroffen sein sollte (s. Fig. 15c). In diesem Fall dürften die Transfor¬ manden nicht mehr das 1,55 kb große EcoRI-Fragment des Wildtyp- Lokus besitzen, sondern müßten stattdessen ein 1,32 kb und ein 0,27 kb großes Fragment aufweisen. Die Abwesenheit des 1,55 kb großen Fragmentes sowie das Aftreten des 1,32 kb großen Fragmen- tes konnten für die Transformanden 1, 3, 4 und 5 gezeigt werden (Fig. 14) .
Mit den klonal aufgereinigten Transformanden 1 bis 5 wurde ein Stabiltatstest durchgeführt. Mycel wurde für sechs Tage auf nicht selektivem Medium inkubiert und anschließend Mycel vom Rand einer jeden Kolonie auf eine neue Platte nichtselektiven Mediums sowie auf eine Platte mit Selektivmedium übertragen. Nach einer Inkuba¬ tion von weiteren drei Tagen auf nichtselektivem Medium wurde wieder Mycel auf neue Platten übertragen. Nach sechs Tagen nichtselektiven Wachstums waren alle Transformanden noch G418-re- sistent. Nach neun Tagen hatten die Transformanden 1, 2 und 3 ihre Resistenz gegen G418 verloren. Die Southerndaten deuten dar¬ auf hin, daß der Verlust durch eine homologe Rekombination zwi- sehen den TEF-Promotorfragmenten bedingt ist. Die mit dieser Kon¬ struktion beobachtete relativ hohe Deletionsfrequenz des hetero¬ logen Markers (G418-Resistenzgen) ist bei Cotransformationen un¬ ter Umstanden von Vorteil.
a) Aufzucht von Ashbya gossypii
Die Aufzucht in einer Flussigkultur oder auf einer Platte wird erreicht durch Animpfen mit Mycel oder Sporen. Medium: 1 Liter MA-2 : 1 g Pepton l g Yeast Extract
10 g Glucose
12 g Agar
Selektivmedium: MA-2-G418: MA-2 + 200 mg G418/ml
b) DNA-Isolierung
1. Flüssigkultur in MA-2-Medium in einem Schikanekolben an¬ setzen. 200 ml Medium liefern dabei ca. 1,5 g Mycel. In- kubation über 48 h bei 27°C.
2. Mycel waschen: Mycel über eine Saugpumpe abnutschen
Mycel in 30 ml ddH2θ aufnehmen 2-3 mal wiederholen
Das Mycel (ca. 1,5 g) dann in 30 μl SCE-Puffer aufnehmen SCE: 1 M Sorbitol
0.1 M Natriumeitrat
60 mM EDTA pH 8
Zugabe von 30 ml 2-Mercaptoethanol (14 M) Zugabe von 5 mg Zymolyase pro 1,5 g Mycel 5. Inkubation bei 37=C für 1 h
6. Protoplastierung im Mikroskop überprüfen und ggf. Inkubationsdauer verlängern
7. Zugabe von 3 ml 0, 5 M EDTA pH 7,5 Zugabe von 3 ml 10 % SDS
8. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min
9. Zugabe von 5 mg Proteinase K pro 1,5 g Mycel
10. Inkubation bei 37°C für 1 h
11. Bestimmen des Volumens Zugabe des gleichen Volumens 5M Ammoniumacetat-Lösung
12. Zentrifugation 15 min - 15000 U/min
13. Pellet verwerfen
14. Ethanolfällung mit 2,5fachem Volumen
15. Zentrifugation 10 min - 10000 U/min 16. Pellet in 70 % Ethanol waschen, trocknen und in 4 ml TE 10:1 resuspendieren
17. Zugabe von 0,5 mg RNAse
18. Inkubation bei 37°C für 1 h
19. Phenol-Extraktion 20. Phenol-Chloroform-Extraktion
21. Bestimmen des Volumens
22. DNA-Fällung mit gleichem Volumen 5M Ammoniumacetat-Lösung und 2,5fachem Volumen Ethanol
23. DNA in 1 ml TE 10:1 resuspendieren.
c) DNA-Spaltung für Southern-Analysen
Pro Ansatz wurden ca. 1 μg DNA gespalten.
EcoRI-BamHI-Doppelverdau:
DNA 20 μl
10*MS-Puffer 20 μl ddH20 159 μl
BamHI 1-0 πn-its 200 μl
Inkubation bei 37CC über Nacht Zugabe von 10 μl AS-Puffer Zugabe von 10 Units EcoRI Inkubation bei 37°C über Nacht
Figure imgf000015_0001
Bglll 10 Units
200 μl
Inkubation bei 37°c über Nacht
Anschließend:
DNA-Fallung mit gleichem Volumen 5M Ammoniumacetat-Lösung und dem 2,5fachen Volumen Ethanol Zentrifugation 15 min - 15000 U/min Pellet in 70 % Ethanol waschen
Pellet trocknen und in 20 μl TE 10:1 resuspendieren.
Puffer: 1*MS-Puffer: 50 mM NaCl
10 mM Tris-HCl pH 7,5 10 mM MgCl"
1 mM Dithiothreitol
AS-Puffer: 500 mM NaCl
400 mM Tris-HCl pH 7,5
Laufbedingungen:
Für Eco/Bam-Verdau: 0,8 % Agarosegel
3 V/cm 8 h Laufzeit Für Bglll-Verdau: 0,6 % Agarosegel
1 V/cm 66 h Laufzeit
Die so erhaltenen Gele wurden auf Hybond-N-Membranen durch Southern-Transfer übertragen und 2 h bei 80°C gebacken. Prahybri- disierung, Hybridisierung und der anschließende Nachwaschen wur¬ den unter stringenten Bedingungen nichtradioaktiv durchgeführt ( 'Non-radioaktive Labeling and Detection' Applications Manual, Boehringer Mannheim, Bestellnummer: 1093 657) .
d) OFAGE-Präparation
1. Frischgewicht des Mycels nach Abnutschen einer MA-2 Flüs¬ sigkultur bestimmen
2. 0,5 g Mycel in 2 ml 50 mM EDTA pH 7,5 resuspendieren 3. Zugabe von Puffer I
4. Vorsichtige Zugabe von 5 ml Low Melting Agarose (40°C)
5. Mischung in eine Petrischale (5 cm Durchmesser) geben und erstarren lassen
6. Mit Puffer II uberschichten 7. Inkubation bei 37°C über Nacht
8. Puffer II absaugen und Puffer III zusetzen
9. Inkubation bei 55°C über Nacht 10. Zur Konservierung der Präparation Puffer III absaugen und durch 5 ml 0,5 M EDTA pH 8,5 ersetzen und Petri- schale bei 4°C aufbewahren.
Puffer: I: 3 mg Zymolyase
320 ml 0.5M Dithiothreitol 0,9 ml SCE
II: 4,5 ml 0,5M EDTA pH 8,5 50 ml IM Tris-HCl pH 8
200 ml 0,5M Dithiothreitol 250 ml ddH20
III: 5 mg Proteinase K 50 mg N-Lauroylsarcosinat
4.5 ml 0,5M EDTA pH 8 50 μl IM Tris-HCl pH 8 450 μl ddH20
Low Melting Agarose: 1 % in 0,125 M EDTA pH 7,5
e) OFAGE-Lauf (Gerät: Rotaphor®, Biometra)
1. Aus OFAGE-Präparation kleinen Block herausschneiden 2. 3mal lh bei Raumtemperatur in 5 ml 50 mM EDTA pH 7,5 waschen
3. Blocks in Geltaschen stecken Gel: 1 % Agarosegel in 0,4* TBE
4. Laufbedingungen: 20 h Laufzeit 48 s Pulsdauer
4-9°C Puffertemperatur 0,4* TBE Laufpuffer 300 V Spannung 80-90 mA Stromstärke
Legende zu Figuren 5 bis 9 und 12 bis 14
Fig. 5 a: Chromosomentrennung mit OFAGE.
Von links nach rechts: LU8334, LU8335, LU8336, LU8337, ATCC 10985, LU8338, LU8339, LU8340, LU8341. b: Hybridisierung der getrennten Chromosomen mit einer PUC19 DNA Probe Fig. 6 Auf rennung von Bglll gespaltener DNA der Stämme (von rechts nach links) LU8334, LU8335, LU8336, LU8337, ATCC 10985, LU8338, LU8339, LU8340, LU8341 und Hybridisie¬ rung mit einer pAG-102 DNA Probe
Fig. 7 Integrationsschema des Plasmids pAG-102 über homologe
Rekombination. Chromosomale DNA ist durch dicke Linien, die Plasmid DNA durch dünne oder Doppellinien gekenn¬ zeichnet. Pfeile zeigen die Lage des TEF-Leserasters. B=BamHI,
E=EcoRI, Bgl=BglII
Fig. 8 a: Auftrennung BamHI plus EcoRI gespaltener pAG-102 und Ashbya gossypii DNA sowie Hindlll und EcoRI geschnitte- ner λ DNA. Von links nach rechts: λ, pAG-102,
ATCC 10895, LU8334 bis LU8341, λ. b: Hybridisierung mit einer pAG-102 DNA Probe. c: Unterexponierung der pAG-102 Bahn.
Fig. 9: Analyse Bglll-gespaltener DNA der zweimal klonal aufge¬ reinigten pAG-102 Transformanden 1 bis 8
DNA von zweifach klonal aufgereinigten pAG-102-Transfor- manden sowie des untransformierten Wildtyps wurde mit Bglll gespalten, auf einem 0,4 %igen Agarosegel aufge¬ trennt und in einem Southern-Experiment gegen radioaktiv markierte pAG-102-DNA hybridisiert. In keiner der Trans¬ formanden tritt das ca. 17 kb große Fragment, das der Wildtyp-Kopie entspricht, auf. Die stattdessen vorhande¬ nen Banden deuten auf eine einfache Integration in den Transformanden 2, 3 und 6 sowie auf Doppel- bzw. Drei¬ fachintegrationen in den Transformanden 1, 4, 5, 7 und 8 hin, was durch weitere Spaltungen bestätigt wird. Die Transformanden 1 bis 8 leiten sich von LU8334 bis LU8341 ab. Sie sind in Vergleich zu diesen Stämmen ein weiteres Mal klonal aufgereinigt worden (wt: Wildtyp). Die Länge¬ nangaben geben ungefähre Werte wieder.
Fig. 12 Gegenüberstellung der für die Integration von pAG-102 und pAG-145 verwendeten Homologieregionen, a: Homologieregion von pAG-102: 4,6 kb EcoRI-Fragment b: Homologieregion von pAG-145: 6,3 kb BamHI-Fragment Der Pfeil zeigt an, an welcher Stelle im Genom nach homo- loger Rekombination die Fremd-DNA integriert ist. Fig. 13: Southern mit Bglll-gespaltener DNA von fünf pAG-145-Transformanden
Genomische DNA von fünf klonal aufgereinigten Transfor- manden des Plasmides pAG-145 und des untransformierten AusgangsStammes wurde mit Bglll gespalten, auf einem 0,4 %igen Agarosegel aufgetrennt und in einem Southern- Experiment gegen radioaktiv markierte pAG-145-DNA hybri¬ disiert. Alle Transformanden (Bahnen 1 bis 5) zeigen ein Signal mit einer Länge von ca. 17 kb, das auch in der Wildtyp-DNA Bahn 6) auftritt. Daneben besitzen alle Transformanden ein Fragment mit einer Länge von ca. 18,6 kb, das auf eine Integration des G418-Resistenzgens in das 17 kb große Bglll-Fragment hinweist.
Fig. 14: Southern mit EcoRI-gespaltener DNA von fünf pAG-145-Transformanden
Genomische DNA von je zwei klonal aufgereinigten Stämmen von fünf Transformanden des Plasmides pAG-145 sowie des untransformierten Ausgangsstammes wurde mit EcoRI gespal¬ ten, auf einem 0,8 %igen Agarosegel aufgetrennt und in einem Southern-Experiment gegen radioaktiv markierte pAG-103-DNA hybridisiert. Die Transformanden 1 (Bahnen 1, 2), 3 (Bahnen 5, 6), 4 (Bahnen 7, 8) und 5 (Bahnen 9, 10) besitzen nicht mehr das in der Wildtyp-DNA (Bahn 11) auf¬ tretende Fragment von 1,55 kb, stattdessen jedoch ein 1,32 kb großes Fragment und zusätzlich ein 1,6 kb großes Fragment, das dem G418-Resistenzgen entspricht. Fragmente dieser Länge treten auch in der Bahn mit EcoRI-gespalte¬ ner pAG-145-DNA auf (Bahnen 12, 13). Die Transformande 2 (Bahnen 3, 4) zeigt das 1,6 kb große Fragment (G418-Resi- stenzgen) und ein 1,55 kb Fragment, was auf eine Diploi- disierung oder eine Genkonversion hinweist. Daher wurde mittels OFAGE (orthogonal field alternation gel electro- phoresis) untersucht, ob eine Diploidisierung bezüglich des größten Chromosoms, auf dem die Homologieregion loka¬ lisiert ist, stattgefunden hatte. Hierfür konnten keine Hinweise erhalten werden. In allen Transformanden bewei- sen die 5,15 kb und 4,6 kb Fragmente und die Abwesenheit weiterer Signale die homologe Rekombination. Fig. 15: Modell der Integration des BamHI-Fragmentes aus pAG-145 in das Genom von A. gossypii sowie der anschließenden De¬ letion des G418-Resιstenzgens durch homologe Rekombina¬ tion. Schwarzer Balken: TEF-Promotor (Hindlll/HincII-Fragment) , G418r: G418-Resιstenzgen, TEF: A. gossypii TEF-Gen, Pfeile : Transkriptionsrichtung
SEQUENCE LISTING
(1) GENERAL INFORMATION:
(i) APPLICANT:
(A) NAME: BASF Aktiengesellschaft
(B) STREET: Carl-Bosch-Strasse 38
(C) CITY: Ludwigshafen
(E) COUNTRY: Bundesrepublik Deutschland
(F) POSTAL CODE (ZIP) : D-6700
(G) TELEPHONE: 0621/6048526 (H) TELEFAX: 0621/6043123 (I) TELEX: 1762175170
(ii) TITLE OF INVENTION: Verfahren zur gezielten genetischen Veraenderung von Ashbya gossypii (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 2
(iv) COMPUTER READABLE FORM: Not Applicable (v) CURRENT APPLICATION DATA: APPLICATION NUMBER:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:l:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 2496 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: Single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTI-SENSE: NO (vi) ORIGINAL.SOURCE:
(A) ORGANISM: Ashbya gossypii (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 437..1810
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:l: TGGGCGGCCC GCACTCGTGC CTTCTTCGCA CGGGCCGCCG AACCCCGCCA GGCCATCAAG 6 CTTGCCTCGT CCCGCCGGGT CACCCGGCCA GCGACATGGA GGCCCAGAAT ACCCTCCTTG 12 ACAGTCTTGA CGTGCGCAGC TCAGGGGCAT GATGTGACTG TCGCCCGTAC ATTTAGCCCA 18 TACATCCCCA TGTATAATCA TTTGCATCCA TACATTTTGA TGGCCGCACG GCGCGAAGCA 24 AAAATTACGG CTCCTCGCTG CAGACCTGCG AGCAGGGAAA CGCTCCCCTC ACAGACGCGT 30 TGAATTCTCC CCACGGCGCG CCCCTGTAGA CAAATATAAA AGGTTAGGAT TTGCCACTGA 36 GGTTCTTCTT TCATATACTT CCTTTTAAAA TCTTGCTAGG ATACAGTTCT CACATCACAT 42 CCGAACATAA ACAAAA ATG GGT AAG GAA AAG ACT CAC GTT AAC GTT GTC 46
Met Gly Lys Glu Lys Thr His Val Asn Val Val 1 5 10
GTC ATC GGT CAC GTC GAC TCT GGT AAG TCT ACT ACC ACC GGT CAC TTG 51 Val Ile Gly His Val Asp Ser Gly Lys Ser Thr Thr Thr Gly His Leu 15 20 25 ATC TAC AAG TGT GGT GGT ATT GAC AAG AGA ACC ATC GAG AAG TTC GAG 56 Ile Tyr Lys Cys Gly Gly Ile Asp Lys Arg Thr Ile Glu Lys Phe Glu
30 35 40
AAG GAG GCT GCC GAG TTG GGT AAG GGT TCT TTC AAG TAC GCC TGG GTT 61 Lys Glu Ala Ala Glu Leu Gly Lys Gly Ser Phe Lys Tyr Ala Trp Val
45 50 55
TTG GAC AAA TTG AAG GCT GAG AGA GAG AGA GGT ATC ACC ATC GAC ATT 66 Leu Asp Lys Leu Lys Ala Glu Arg Glu Arg Gly Ile Thr Ile Asp Ile 60 65 70 75
GCG TTG TGG AAG TTC GAG ACT CCA AAG TAC CAC GTC ACT GTC ATT GAC 70 Ala Leu Trp Lys Phe Glu Thr Pro Lys Tyr His Val Thr Val Ile Asp
80 85 90
CCC CCA GGC CAC AGA GAC TTC ATC AAG AAC ATG ATT ACC GGT ACT TCT 75 Pro Pro Gly His Arg Asp Phe Ile Lys Asn Met Ile Thr Gly Thr Ser
95 100 105
CAA GCT GAC TGT GCC ATC TTG ATC ATT GCT GGT GGT GTC GGT GAG TTC 80 Gin Ala Asp Cys Ala Ile Leu Ile Ile Ala Gly Gly Val Gly Glu Phe
110 115 120
GAG GCT GGT ATC TCC AAG GAC GGT CAG ACC AGA GAG CAC GCT TTG TTG 853 Glu Ala Gly Ile Ser Lys Asp Gly Gin Thr Arg Glu His Ala Leu Leu
125 130 135
GCT TAC ACC TTG GGT GTC AAG CAG TTG ATC GTT GCC ATC AAC AAG ATG 90 Ala Tyr Thr Leu Gly Val Lys Gin Leu Ile Val Ala Ile Asn Lys Met 140 145 150 155
GAC TCC GTC AAG TGG GAC GAG TCC AGA TAC CAG GAG ATT GTC AAG GAG 949 Asp Ser Val Lys Trp Asp Glu Ser Arg Tyr Gin Glu Ile Val Lys Glu
160 165 170
ACC TCC AAC TTC ATC AAG AAG GTC GGT TAC AAC CCT AAG ACT GTT CCA 997 Thr Ser Asn Phe Ile Lys Lys Val Gly Tyr Asn Pro Lys Thr Val Pro
175 180 185
TTC GTT CCA ATC TCC GGC TGG AAC GGT GAC AAC ATG ATT GAG GCC ACC 1045 Phe Val Pro Ile Ser Gly Trp Asn Gly Asp Asn Met Ile Glu Ala Thr
190 195 200
ACC AAC GCC CCA TGG TAC AAG GGC TGG GAG AAG GAG ACC AAG GCT GGT 1093 Thr Asn Ala Pro Trp Tyr Lys Gly Trp Glu Lys Glu Thr Lys Ala Gly
205 210 215
GCC GTC AAG GGT AAG ACC TTG TTG GAG GCC ATT GAC GCC ATT GAG CCA 1141 Ala Val Lys Gly Lys Thr Leu Leu Glu Ala Ile Asp Ala Ile Glu Pro 220 225 230 235
CCT GTC AGA CCA ACT GAC AAG GCA TTG AGA TTG CCA TTG CAG GAT GTC 1189 Pro Val Arg Pro Thr Asp Lys Ala Leu Arg Leu Pro Leu Gin Asp Val
240 245 250
TAC AAG ATC GGT GGT ATT GGT ACG GTT CCA GTC GGC AGA GTC GAG ACC 1237 Tyr Lys Ile Gly Gly Ile Gly Thr Val Pro Val Gly Arg Val Glu Thr
255 260 265
GGT GTC ATC AAG CCA GGT ATG GTT GTT ACC TTC GCC CCA TCC GGT GTC 1285 Gly Val Ile Lys Pro Gly Met Val Val Thr Phe Ala Pro Ser Gly Val 270 275 280 ACC ACT GAA GTC AAG TCC GTC GAG ATG CAC CAC GAG CAA TTG GAG GAG 133 Thr Thr Glu Val Lys Ser Val Glu Met His His Glu Gin Leu Glu Glu
285 290 295
GGT GTC CCA GGT GAC AAC GTT GGT TTC AAC GTC AAG AAC GTC TCC GTC 138 Gly Val Pro Gly Asp Asn Val Gly Phe Asn Val Lys Asn Val Ser Val 300 305 310 315
AAG GAG ATC AGA AGA GGT AAC GTT TGC GGT GAC TCC AAG AAC GAC CCA 142 Lys Glu Ile Arg Arg Gly Asn Val Cys Gly Asp Ser Lys Asn Asp Pro
320 325 330
CCA AAG GCT GCT GAG TCC TTC AAC GCT ACC GTC ATT GTC TTG AAC CAC 147 Pro Lys Ala Ala Glu Ser Phe Asn Ala Thr Val Ile Val Leu Asn His
335 340 345
CCA GGT CAA ATC TCT GCC GGT TAC TCT CCA GTC TTG GAC TGT CAC ACT 152 Pro Gly Gin Ile Ser Ala Gly Tyr Ser Pro Val Leu Asp Cys His Thr
350 355 360
GCC CAC ATT GCT TGT AAG TTC GAC GAG TTG TTG GAG AAG AAC GAC AGA 157 Ala His Ile Ala Cys Lys Phe Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asn Asp Arg
365 370 375
AGA ACC GGT AAG AAG TTG GAA GAC TCT CCA AAG TTC CTA AAG GCC GGT 162 Arg Thr Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ser Pro Lys Phe Leu Lys Ala Gly 380 385 390 395
GAC GCT GCC ATG GTC AAG TTT GTC CCA TCC AAG CCA ATG TGT GTT GAG 166 Asp Ala Ala Met Val Lys Phe Val Pro Ser Lys Pro Met Cys Val Glu
400 405 410
GCT TTC ACC GAC TAC CCA CCA TTG GGT AGA TTC GCT GTC AGA GAC ATG 171 Ala Phe 'Thr Asp Tyr Pro Pro Leu Gly Arg Phe Ala Val Arg Asp Met
415 420 425
AGA CAG ACC GTT GCT GTC GGT GTC ATC AAG TCT GTT GTC AAG TCC GAC 176 Arg Gin Thr Val Ala Val Gly Val Ile Lys Ser Val Val Lys Ser Asp
430 435 440
AAG GCT GGT AAG GTC ACC AAG GCC GCC CAA AAG GCT GGT AAG AAA 181
Lys Ala Gly Lys Val Thr Lys Ala Ala Gin Lys Ala Gly Lys Lys
445 450 455
TAGAGTAACT GACAATAAAA AGATTCTTGT TTTCAAGAAC TTGTCATTTG TATAGTTTTT 187 TTATATTGTA GTTGTTCTAT TTTAATCAAA TGTTAGCGTG ATTTATATTT TTTTTGCCTC 193 GACATCATCT GCCCAGATGC GAAGTTAAGT GCGCAGAAAG TAATATCATG CGTCAATCGT 199 ATGTGAATGC TGGTCGCTAT ACTGCTGTCG ATTCGATACT AACGCCGCCA TCCAGTGTCT 205 ACCTGTCAAA TTTGCCAGCG TCAAATGCCT CCAGGATAGA ATATGCTCGA CAACTGTTGA 211 AGTCCATCAA CAAGGATAAC CCATATGCTC TATCGGCGGA GAAAACGTTG CCAGAGCCGC 217 TTCCTTCCGC AGACGTGCCC CTTCCACTGC TAGATGAGAA GTACGGGGTA GTTAGTGTTT 223 CCAGGCCTCG TAAATGCCGC AATAAATGCT TCCTTGGGTT CGCTACGCCA TCTCAGGCAG 229 ACGAGTTTCT ACAAAACTTC AAGGACCGCC TTTTCATATA TGGCCACCAG GTCAATATAG 235 AGCCAGCGAA GCATGATGCA TTCTGGTATA TTGAACGCGA GGATCCGCGA GCATGCCAAC 241 GCGTGCGCAA ACACCGAGCG CCAGTTGCTG ATCCAGAAGC CAAGTTGCGT GTTCGTAGCA 247 ACCGCCGCCT GGCCAGGTTA CGAAGC 249
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 458 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: Met Gly Lys Glu Lys Thr His Val Asn Val Val Val Ile Gly His Val
1 5 10 15
Asp Ser Gly Lys Ser Thr Thr Thr Gly His Leu Ile Tyr Lys Cys Gly
20 25 30
Gly Ile Asp Lys Arg Thr Ile Glu Lys Phe Glu Lys Glu Ala Ala Glu
35 40 45
Leu Gly Lys Gly Ser Phe Lys Tyr Ala Trp Val Leu Asp Lys Leu Lys
50 55 60
Ala Glu Arg Glu Arg Gly Ile Thr Ile Asp Ile Ala Leu Trp Lys Phe 65 70 75 80
Glu Thr Pro Lys Tyr His Val Thr Val Ile Asp Pro Pro Gly His Arg
85 90 95
Asp Phe Ile Lys Asn Met Ile Thr Gly Thr Ser Gin Ala Asp Cys Ala
100 105 110
Ile Leu Ile Ile Ala Gly Gly Val Gly Glu Phe Glu Ala Gly Ile Ser
115 120 125
Lys Asp Gly Gin Thr Arg Glu His Ala Leu Leu Ala Tyr Thr Leu Gly
130 135 140
Val Lys Gin Leu Ile Val Ala Ile Asn Lys Met Asp Ser Val Lys Trp 145 150 155 160
Asp Glu Ser Arg Tyr Gin Glu Ile Val Lys Glu Thr Ser Asn Phe Ile
165 170 175
Lys Lys Val Gly Tyr Asn Pro Lys Thr Val Pro Phe Val Pro Ile Ser
180 185 190
Gly Trp Asn Gly Asp Asn Met Ile Glu Ala Thr Thr Asn Ala Pro Trp
195 200 205
Tyr Lys Gly Trp Glu Lys Glu Thr Lys Ala Gly Ala Val Lys Gly Lys
210 215 220
Thr Leu Leu Glu Ala Ile Asp Ala Ile Glu Pro Pro Val Arg Pro Thr 225 230 235 240
Asp Lys Ala Leu Arg Leu Pro Leu Gin Asp Val Tyr Lys Ile Gly Gly
245 250 255
Ile Gly Thr Val Pro Val Gly Arg Val Glu Thr Gly Val Ile Lys Pro
260 265 270
Gly Met Val Val Thr Phe Ala Pro Ser Gly Val Thr Thr Glu Val Lys
275 280 285
Ser Val Glu Met His His Glu Gin Leu Glu Glu Gly Val Pro Gly Asp
290 295 300
Asn Val Gly Phe Asn Val Lys Asn Val Ser Val Lys Glu Ile Arg Arg 305 310 315 320
Gly Asn Val Cys Gly Asp Ser Lys Asn Asp Pro Pro Lys Ala Ala Glu
325 330 335
Ser Phe Asn Ala Thr Val Ile Val Leu Asn His Pro Gly Gin Ile Ser 340 345 350 Ala Gly Tyr Ser Pro Val Leu Asp Cys His Thr Ala His Ile Ala Cys
355 360 365
Lys Phe Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asn Asp Arg Arg Thr Gly Lys Lys
370 375 380
Leu Glu Asp Ser Pro Lys Phe Leu Lys Ala Gly Asp Ala Ala Met Val 385 390 395 400
Lys Phe Val Pro Ser Lys Pro Met Cys Val Glu Ala Phe Thr Asp Tyr
405 410 415
Pro Pro Leu Gly Arg Phe Ala Val Arg Asp Met Arg Gin Thr Val Ala
420 425 430
Val Gly Val Ile Lys Ser Val Val Lys Ser Asp Lys Ala Gly Lys Val
435 440 445
Thr Lys Ala Ala Gin Lys Ala Gly Lys Lys 450 455

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur gezielten genetischen Veränderung von Ashbya gossypii durch homologe Rekombination, dadurch gekennzeich¬ net, daß Ashbya gossypii mit Vektoren transformiert wird, die die neu zu rekombinierende DNA flankiert von einer oder meh¬ reren Genregionen von Ashbya gossypii enthalten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Genregion von Ashbya gossypii DNA-Sequenzen im Bereich des Genlocus des Translationselongationsfaktors EF-lα verwendet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als
Vektor das Plasmid pAG-102 oder ein davon abgeleitetes Deri¬ vat verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Vektor das Plasmid pAG-145 oder ein davon abgeleitetes Deri¬ vat verwendet wird.
5. Genetisch veränderte Ashbya gossypii-Stämme, erhältlich nach einem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 4.
Genetisch veränderte Ashbya gossypii-Stämme, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LU8334 bis LU8341.
Zeichn.
PCT/EP1992/001878 1991-08-22 1992-08-18 Verfahren zur gezielten genetischen veränderung von ashbya gossypii WO1993004180A1 (de)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999061623A2 (de) * 1998-05-28 1999-12-02 Basf Aktiengesellschaft Genetisches verfahren zur herstellung von riboflavin
US6291660B1 (en) 1998-10-08 2001-09-18 Syngenta Participations Ag Fungal genes required for normal growth and development

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992000379A1 (de) * 1990-06-25 1992-01-09 Basf Aktiengesellschaft Neue promotorregion

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992000379A1 (de) * 1990-06-25 1992-01-09 Basf Aktiengesellschaft Neue promotorregion

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
METHODS IN ENZYMOLOGY, 'RECOMBINANT DNA TECHNOLOGY' Bd. 101, 1983, ACADEMIC PRESS, INC.; NEW YORK, US; Seiten 202 - 211 R. ROTHSTEIN 'One step gene disruption in Yeast' *
YEAST Bd. 6, 31. Juli 1990, CHICHESTER, GB; Seite 244 S.STEINER ET AL. 'Translation elongation factor EF-1alpha of the filamentous yeast Ashbya gossypii and the use of its promoter in transformation experiments' *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999061623A2 (de) * 1998-05-28 1999-12-02 Basf Aktiengesellschaft Genetisches verfahren zur herstellung von riboflavin
WO1999061623A3 (de) * 1998-05-28 2000-01-27 Basf Ag Genetisches verfahren zur herstellung von riboflavin
US6291660B1 (en) 1998-10-08 2001-09-18 Syngenta Participations Ag Fungal genes required for normal growth and development

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