WO1993001499A1 - Determination de la malignite des cellules de tumeurs au moyen de lectines endogenes - Google Patents

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WO1993001499A1
WO1993001499A1 PCT/FR1992/000675 FR9200675W WO9301499A1 WO 1993001499 A1 WO1993001499 A1 WO 1993001499A1 FR 9200675 W FR9200675 W FR 9200675W WO 9301499 A1 WO9301499 A1 WO 9301499A1
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csl
lectin
ligands
cells
lectins
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PCT/FR1992/000675
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Jean-Pierre Zanetta
Guy Vincendon
Jacques Robert
Suzanna Maschke
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4724—Lectins

Definitions

  • the subject of the invention is the determination of the malignancy of human or animal tumor cells, by means of endogenous lectins.
  • the invention uses the properties of certain endogenous lectins, to bind to glycan ligands, in particular ligands rich in mannose present at the level of cell membranes, to detect the presence of malignant cells in biological samples.
  • the malignant transformation of cells generally corresponds to a loss of inhibition of contact between cells, resulting from too many cellular signals generated by intercellular contacts.
  • Cells facing an "overexpression" of signals equivalent to a polysemic signal may no longer be able to interpret these signals and turn into malignant cells.
  • the inventors defined a group of specific lectins capable of interacting with glycan groups modified during the malignant transformation of cells and were able to formulate a hypothesis on the process of this transformation.
  • the lectins which have been the subject of the studies which have led to this hypothesis are endogenous lectins capable of having a role in the phenomena of intercellular adhesion and / or recognition and therefore of intervening in the generation of signals at the level of these cells. They mainly belong to two families.
  • the endogenous lectins of interest in the context of the invention are capable of binding with a specific and strong affinity with the glycan part of glycoproteic ligands rich in mannose, this bond generating intercellular contacts, by means of the bridges made between the glycans. carried by membrane glycoproteins and such lectins.
  • the modifications of membrane glycoconjugates include a notable increase in the number of ligands affine of endogenous lectins defined within the framework of the invention and if necessary a diversification (increase in the quantity of ligands) of these ligands. They hypothesized that this increase in the level of ligands of certain endogenous lectins would favor the multiplication of intercellular contacts and therefore the generation of excess signals not processed by the cell, observed in malignant processes.
  • the inventors have demonstrated the existence of a systematic variation of the same type of marker, associated with the malignant transformation of cells. In addition, they found that the malignant transformation is accompanied by disturbances, as described above, of recognition and homotypic (between identical cells) and heterotypic (between cells of different nature) between cells.
  • the invention takes advantage of this hypothesis to propose a test allowing the in vivo detection of tumor cells, from biological samples for example constituted by tissues, cell lines, isolated cells or histological sections.
  • the test defined in the context of the invention consists in demonstrating the increase in the number and in the quantity of glycan ligands of endogenous affine lectins for these ligands and, if necessary, in determining their level.
  • the increase in the number of ligands is defined relative to a given ligand present on normal cells but in lower number. We can also observe an increase in the quantity of ligands in the sense of a greater variety of these ligands in comparison with the profile of normal cells.
  • the endogenous lectins used in the context of carrying out this test are particular lectins capable of intervening in the phenomena of intercellular adhesion and / or recognition, and capable of binding specifically and independently of calcium, with a site involving mannose residues, present at the glycan part of glycoconjugates, in particular membrane or soluble glycoproteins, usually present in reduced number in normal cells.
  • This group of lectins mainly comprises lectins from the following two families.
  • a first family of lectins specific to carrying out the detection test described above is that which includes the endogenous mannose lectin designated by the abbreviation CSL (Cerebellar Soluble Lectin).
  • CSL has so far been isolated from rat cerebellum cells and described in the article by Zanetta et al, 1987, J. Neurochem. 51: 1250-1257).
  • This endogenous lectin was known, for its properties at the level of myelination on the one hand, and at the level of the contact guide for the migration of immature neurons, on the other hand this molecule was moreover isolated from the cerebellum of rat.
  • CSL although initially isolated from the cerebellum, is widely distributed in mammalian tissue.
  • the CSL described in the abovementioned publication comprises at least three forms of subunits of relative molecular masses (Mr) close to 31,500, 33,000 and 45,000 kd.
  • This molecule is soluble and versatile, and has a very fine glycan specificity for glycans rich in mannose. Its dissociation constant for certain endogenous glycans can be estimated at least 10 * 8 M (Marschall et al, 1989, Biochemistry 5_: 10-20).
  • RI Receptor 1
  • This lectin had, according to the description given, a specifically neuronal localization in the cerebellum and was expressed transiently on the surface of certain cells of the nervous system.
  • This lectin was also known for its intercellular recognition properties through the contact between RI, transiently externalized, and glycoproteins present on the surface of axons. It has been shown that the membrane lectin RI was not specific to cerebellar neurons but could be present in other areas of the central or peripheral nervous system, or in other cells and in particular on the surface of endothelial cells, macrophages and muscles.
  • the inventors have defined a family or group of lectins which can be used for the detection of malignant cells, characterized in that they are endogenous lectins involved in the phenomena of adhesion and / or cellular recognition with an affinity independent of calcium for a site involving mannose residues and present at the level of glycan ligands and having an immunological and / or structural relationship with the CSL, or in that they are fragments of these lectins, since these fragments retain the affinity of the original lectin, with respect to glycan ligands.
  • an immunological and / or structural relationship to such a lectin also exists with the lectin RI.
  • the lectins used are characterized in that they are neither specific E lectins, nor specific P lectins.
  • the lectin is thus used to detect or even measure the increase in the number and if necessary of the quantity of membrane glycan ligands of these cells.
  • the inventors have found that the glycan ligands increase on the surface of tumor cells in a proportion of 1 to 100 or even more, relative to the quantity of these ligands on normal cells.
  • This increase in the level of glycan ligands of endogenous lectins according to the invention varies slightly depending on the tumors but cannot be linked to the grade of the cancer.
  • an endogenous lectin corresponding to this definition has an immunological relationship with CSL, and where appropriate with RI, since it is recognized by antibodies directed against CSL or antibodies directed against RI.
  • antibodies capable of being used to determine whether an endogenous lectin can be used in the context of the invention are the following antibodies: - the polyclonal antibodies obtained in rabbits against the various separate subunits of the CSL or their whole;
  • mice - anti-Rl monoclonal antibodies produced in mice.
  • CSL can be characterized by the elements described in the publication by Zanetta et al 1987 referenced above and in particular by the fact that it is inhibited by mannose, the inhibition being obtained for 37.5 mM, the others monosaccharides having no inhibitory effect on this lectin.
  • glycoprotein ligands of the CSL the following molecules will be mentioned:
  • MAG glyco ⁇ major protein of the myelin of the nervous system
  • mannose is an inhibitor at a dose of 75 mM and the other monosaccharides are not inhibitors.
  • CSL and RI have an affinity for a so-called “hybrid" glycan structure having both a mannosidic chain and a chain terminated by a glucuronic residue sulfated in position 3.
  • CSL and RI have a particular affinity for a PO glycoprotein chain such as the following:
  • CSL and RI are not inhibited by low concentrations of lactose (absence of inhibition up to 75.10 " - ⁇ ) and glycosaminoglycans (concentration less than or equal to 250 ⁇ g / ml corresponding approximately to 2.5.10 " M of disaccharic units).
  • the subject of the invention is therefore the use for the in vitro determination of the presence of malignant cells in a given biological sample, of endogenous lectins intervening in the phenomena of intercellular adhesion and / or recognition having an affinity independent of calcium for a site involving mannose residues at the level of glycan ligands, this lectin having an immunological and / or structural relationship with the CSL, or fragments of these lectins, since these fragments retain the affinity of the original lectin, vis against glycan ligands.
  • the lectins used also have an immunological and / or structural relationship with RI.
  • the ligands for which the inventors have found an affinity for the lectins of the invention may be membrane ligands or soluble ligands.
  • An endogenous lectin which is particularly advantageous for carrying out the invention is CSL in purified and active form or fragments of CSL or CSL modified as soon as the functional relationship with CSL with regard to the independent affinity of calcium against glycan ligands is preserved.
  • a CSL molecule can be modified, in particular by addition, deletion or substitution of one or more amino acids of the molecule, the resulting lectin retaining however its capacity to bind glycan ligands, in particular membrane ligands normally recognized by the CSL.
  • a method for the purification of CSL is described in the examples which appear on the following pages and the activity of the molecule is verified by an agglutination test of the rat red blood cells previously fixed by glutaraldehyde. This test is also described on the following pages.
  • the CSL used is obtained by expression in a prokaryotic or eukaryotic cell host.
  • the recombinant molecule is characterized as being CSL by a glycan binding capacity, identical to that of CSL obtained by extraction, and / or by recognition by the anti-CSL antibodies defined above. It may have a different glycosylation or an absence of glycosylation, in particular the presence of N-glycans sensitive to N-glycan or endo-N-acetyl-glucosaminidase F.
  • the lectin used for the in vitro detection of cell malignancy in a biological sample is the lectin RI, or a fragment of RI or RI modified as soon as the functional relationship with RI as regards the independent affinity of calcium with respect to the membrane glycan ligands is conserved.
  • lectins corresponding to the preceding definitions, the inventors have determined in a very interesting manner that there is a very large homology, indeed even a practically perfect and in any event significant similarity, between the profiles of ligands. of these lectins and in particular of CSL in various transformed lines or in malignant tumors, whatever the tissue origin or the species. This is verified for cancers affecting cell strains where lectins and in particular CSL are present and their ligands overexpressed. This is the case with tumor lines such as C6 gliomas, NIE 115 neuroblasts, CHO cells, human K562 erythroblastoid cells, IGROV1 human ovarian cancer cells and MCF7 mammary gland cancer cells.
  • tumor lines such as C6 gliomas, NIE 115 neuroblasts, CHO cells, human K562 erythroblastoid cells, IGROV1 human ovarian cancer cells and MCF7 mammary gland cancer cells.
  • carcinomas of mammary glands infiltrating ducts, infiltrating lobular or mucinous grade I to III
  • malignant schwannomas malignant histiocytofibromas
  • dedifferentiated liposarcomas pulmonary metastases.
  • the detection of the presence of malignant cells in a biological sample in vitro, by determining an increase in the number of glycan ligands and, where appropriate, the assay of these ligands, can be carried out by different techniques.
  • An advantage of the invention results from the speed with which the test can be carried out and from the sensitivity of the results obtained.
  • the invention therefore relates to the use of a lectin or a fragment of lectin meeting the criteria given above, characterized in that this lectin or this fragment of lectin is labeled, for example by a radioactive isotope (radioisotope) , a fluorescent marker or an amplification marker.
  • a radioactive isotope radioactive isotope
  • fluorescent marker for example, a fluorescent marker or an amplification marker.
  • radioactive marker mention may be made of iodine and, as an example of a fluorescent marker, mention may be made of the fluorophore FITC.
  • An amplification system suitable for carrying out the invention is for example the system in which the lectin used is labeled with biotin, the revelation of the connection between the biotinylated lectin and the glycan of a membrane glycoconjugate being carried out for example using 1 • avidin coupled for example with alkaline phosphatase .
  • This embodiment is particularly advantageous since the biotinylated CSL can be stored for several years in frozen form, without losing its activity.
  • markers of the enzymatic type such as peroxidase, ⁇ glactosidase or three-component amplification systems using three antibodies (of the ABC type).
  • the invention also relates to a kit for the in vitro determination in a given biological sample, of the presence of malignant cells, characterized in that it comprises an endogenous lectin involved in adhesion and / or intercellular recognition reactions having a calcium-independent affinity for a glycan ligand site involving mannose residues, this lectin having an immunological and / or structural relationship with CSL, or fragments of these lectins, since these fragments retain the affinity of the lectin origin, with respect to glycan ligands, possibly marked.
  • the lectins used in this kit can also have an immunological and / or structural relationship with RI, according to a particular embodiment of the invention.
  • the lectin used is CSL, in purified and active form.
  • the lectin used is the membrane lectin RI, in purified and active form.
  • This kit can be used on different types of biological samples likely to contain tumor cells: it can be constituted for example by a biopsy, a tissue extract, isolated cells, a histological section or even a cell line.
  • tissue extract to search for the presence of malignant cells allows obtaining a quantitative result.
  • histological sections makes it possible to carry out an immunocytochemical reaction and leads to the obtaining of a qualitative result which can be observed under the microscope.
  • the kit can be applied in all cases of tumors occurring in tissues likely to contain CSL or RI and for example in hepatic tumors (hepatomas), in neuroblastomas, glioblastomas, cancer erythrocytic leukemia, or ovarian cancer. These examples are not, however, limiting and the kit can be used for detection at the level of tissue samples in which the presence of CSL or of another lectin meeting the definitions given in the preceding pages is observed.
  • the kit can also be used to detect the presence of circulating tumor cells, in particular by using biotinylated or fluorescent CSL on pellets or slides of circulating cells.
  • a kit suitable for carrying out the invention may also contain several types of lectins, for example CSL and RI, in particular when it is a question of to determine the increase in membrane ligands in circulating cells whose tissue origin is not known.
  • the lectin used can also be marked in particular by the markers described above of the radioactive, fluorescent or amplifier type.
  • the lectins in the kit are in particular in the form of a solution or in lyophilized form or else in all forms suitable for the preservation of proteins.
  • a particular kit also comprises a negative control consisting of a sample of normal cells whose level of affine membrane ligands for the lectins of the kit is known.
  • the invention also relates to a method for the in vitro determination in a given biological sample, of the presence of malignant cells, characterized in that it comprises the following steps:
  • the lectin used in the process can also have an immunological and / or structural relationship with RI.
  • the determination of the quantity of ligands which have reacted with the lectins can be replaced by the determination of the increase in the number of ligands sought. It can also be a qualitative determination.
  • these ligands can be membrane or soluble.
  • the lectin used for carrying out the process is the purified, active CSL.
  • the endogenous lectin used is the lectin RI.
  • the process can be carried out on the various forms of samples which are discussed in the preceding pages and in particular from samples from which the proteins have previously been extracted. This technique is used in particular when the sample consists of a tumor or cells in culture.
  • the determination of the presence of a quantity of ligands of an endogenous affine lectin for glycans as described above, can be carried out from the proteins of the samples deposited either directly on a support, for example according to a method analogous to Immunodotting or with the ELISA technique, either after electrophoresis and electrotransfer (technique analogous to immunoblotting) on the proteins of the tumor previously separated.
  • Supports that can be used to deposit proteins are filters such as nitrocellulose filters, or ELISA type plates.
  • the lectins used are marked according to the techniques which have been described previously.
  • the implementation of the detection method of the invention by means of a technique for depositing the proteins of the sample on a support allows the differentiation of non-homogeneous tumors, and consequently makes it possible to determine to what extent a tumor contains part of healthy tissue, and therefore the malignancy rate of the tumor.
  • the method of the invention can also make use of a step of comparing the result obtained during the step of revealing the presence of lectin-ligand complexes, characteristic of cellular malignancy, with standards or ranges of standard. , possibly pre-established, and which make it possible to correlate the degree of malignancy of a cell with the level of glycan ligands.
  • standards or ranges of standard possibly pre-established, and which make it possible to correlate the degree of malignancy of a cell with the level of glycan ligands.
  • ranges of standard or control can be obtained from samples and in particular from cell cultures of which the quantity of glycan ligands is known exactly and by progressive dilution of these samples.
  • the observations made by bringing the lectins into contact with a sample which it is sought to determine if it contains malignant cells can be related to a known signal, obtained for a determined number of glycan ligands, put in the presence of determined lectins .
  • lectins of the invention for example lectins CSL and RI, can intervene successively over time in the process of malignant transformation.
  • the CSL participates in the formation of contacts between tumor cells which have on their surface a very large number of glycoprotein ligands. This contact generates a nonsense signal in the cells which thus lose contact inhibition.
  • the cells that leave the primary tumor enter the circulation. Lacking the appropriate ligands on their surface, they do not attach to the majority of endothelial cells with other recognition systems.
  • the lectin RI can for example be considered as determining in the domiciliation ("homing") of certain metastases. It participates in the development of metastases by modifying the possibilities of heterotypic recognition and adhesion between cancer cells and vascular endothelium and extracellular matrix or host cells.
  • Figure 1 electrophoretic control (silver revelation) of biotinylated CSL preparations.
  • An aliquot of the fractions obtained after separation on a column of Ultrogel AcA 202 of the biotinylation products of the CSL was deposited on the gel.
  • the profile of the CSL found in fractions of the dead volume of the column is identical to that of the original preparation: it contains the same proportion of the 33,000 and 31,500 subunits of the CSL and of its degradation products ( low molecular weight).
  • An identical profile is obtained after revelation with avidin-alkaline phosphatase.
  • the numbers on the right indicate the position of the markers of Mr.
  • FIG. 2 electrophoretic profiles of proteins revealed by CBB (A) and CSL ligands revealed by the CSL-biotinylated-Avidin-AKP (B) method present in normal or transformed cells of hepatic origin.
  • the amount of protein deposited is the same (15 ⁇ g) for each of the wells.
  • the samples are as follows:
  • FIG. 3 electrophoretic analysis of CSL ligands in normal or transformed nerve cells and tissues.
  • the material deposited comes from the following tissues or cells:
  • Figure 4 electrophoretic analysis of the profile of CSL ligands in transformed cells of various origins.
  • Figure 5 appearance in phase contrast microscopy of cultures of neuroblastoma NIE115 not differentiated: A) or differentiated by dibutyryl-cAMP: B). The bars represent 100 ⁇ m. Note the presence of extensions in B).
  • FIG. 6 localization of CSL (A) and its ligands (B-D) in the cultures of neuroblastoma NIE115 not differentiated (A-C) or differentiated by dibutyryl c-AMP (D).
  • the bars represent 10 ⁇ m.
  • the CSL has a clearly intracellular location (large arrows) but is also located on the surface of the cells (small arrows).
  • B-D The ligands of the CSL revealed by the biotinylated CSL, itself revealed by avidin-HRP are located exclusively on the surface of the cell bodies (B and C) and of the extensions (D).
  • Figure 7 Electrophoretic analysis of CSL ligands in eight (1-8) malignant tumors of the human mammary glands.
  • Figure 8 schematic representation of the hypothesis of the nonsense signal of the malignant transformation.
  • Figure 9 schematic representation of the involvement of the CSL and RI lectins and their glycoprotein ligands in malignant transformation.
  • All the buffers contain protease inhibitors: 0.01% of the methyl ester of p-tosylarginine and 0.1 mM of phenyl methyl sulfonyl fluoride.
  • the cerebellum is homogenized in 300 ml of 10 mM Tris-HCl buffer at pH 7.2, then centrifuged (1 h X 200,000 g).
  • the pellet is homogenized in 10 ml of water and 90 ml of an 11 mM Tris-HCl buffer at pH 7.2 containing 0.44 M NaCl are added. After homogenization, the suspension is centrifuged (1 h X 200,000 g).
  • the pellet is homogenized in 10 ml of water and one adds 90 ml of an 11 M Tris-HCl buffer at pH 7.2, containing 0.44 M NaCl. After homogenization, the suspension is centrifuged (1 h X 200,000 g) (idem 2).
  • the pellet is homogenized in 10 ml of water and 90 ml of an 11 mM tris-HCl buffer at pH 7.2 containing 0.44 M and 0.55 M of mannose are added. After homogenization, the suspension is centrifuged (2h X 200,000g). This fraction is called TNM1.
  • TNM2 The TNM fraction obtained by combining the TNM1 and TNM2 fractions serves as a starting point for the purification of the CSL by immunoaffinity.
  • the immunoglobulin fractions are obtained by precipitation with ammonium sulphate (250 mg / ml) at 4 ° C of sera or plasmas containing anti-CSL antibodies, followed by centrifugation (1 h x 100,000 g ).
  • the immunoglobulin pellets are taken up in an initial volume of PBS buffer (25 mM Na phosphate at pH 7.2 containing 150 mM NaCl) and then dialyzed several times over a period of 48 h against large volumes of PBS at 4 ° C. and with stirring.
  • the source of the immunoglobulins can be rabbit serum producing anti-CSL antibodies or sera or plasmas from patients suffering from multiple sclerosis or others. diseases in which there are significant anti-CSL antibodies.
  • the immunoglobulins thus isolated are immobilized on a support (generally Sepharose 4B activated by cyanogen bromide) according to the protocols suggested by the manufacturer. After reaction overnight at 4 ° C, the residual activation sites are blocked by reaction for 1 hour at 4 ⁇ C with a 1M solution of ethanolamine brought to pH 9.0 with concentrated hydrochloric acid. The gel is then washed extensively with PBS, then subjected to a "blank" immunoaffinity cycle (as below, but without proteins in the TNM fraction).
  • a support generally Sepharose 4B activated by cyanogen bromide
  • the column is then washed with 25 ml of 0.2 M Glycine-HCl buffer at pH 7.2, then neutralized using a PBS buffer 8 times concentrated. After a final wash with PBS, the gel is recovered and stored at 4 "C in this buffer to which sodium azide is added (final concentration 1/1000). Depending on the affinity of the antibodies, the CSL may be found either in the 3 X PBS eluate or in the pH 2.0 eluate. 4) The fractions eluted by PBS 3 times concentrated are kept frozen at 80 "C. The fractions containing the proteins eluted by the buffer at pH 2.0 are dyalized several times against large volumes of PBS at 4 ° C and with stirring for a period of 24 hours.
  • Test for the preparation of purified CSL an aliquot of the fractions obtained is mixed with a volume of Laemmli solubilization mixture and subjected to electrophoresis in polyacrylamide gel at 13% acrylamide in the presence of SDS. The gel is then colored with Coomassie blue, then with a silver color. The quality of the preparations is judged by the absence of bands other than those of PM 31 500, 33 000 and 45 000 characteristics of the CSL.
  • the activity of the preparations is tested by agglutination of the red blood cells of rats previously fixed with glutaraldehyde. These globules are prepared according to the method recommended by SIMPSON et al. (Nature (1977), 266: 367-369). 2 in 2 dilutions of lectin in PBS are placed in the round bottom wells of agglutination plates, in a volume of 100 ⁇ l. 100 ⁇ l of the suspension of red blood cells are added and the mixture is left to stand for approximately 1 hour. The maximum agglutinative activity observed is of the order of 0.1-0.2 ⁇ g / ml.
  • the protein thus purified is labeled with either an isotope radioactive (iodine), either by a fluorophore (FITC) or by an amplification system (biotin, which makes it possible to use a revelation by avidin coupled for example to alkaline phosphatase).
  • iodine an isotope radioactive
  • FITC fluorophore
  • biotin an amplification system
  • Triton-X-100 is then added (final concentration 0.1%) in order to avoid the subsequent precipitation of the biotinylated CSL on the gel filtration column.
  • the latter prepared before the start of the experiment, consists of Ultrogel AcA 202 (IBF) balanced in PBS buffer containing 0.1% Triton-X-100 and 1 mg / ml of acid-treated BSA periodic (BSA-HI04; Glass et al., 1981).
  • BSA-HI04 The purpose of using BSA-HI04 at this stage is to saturate the gel sites which could, subsequently, adsorb the biotinylated CSL and thus reduce the yield of this step.
  • the column is then washed for a long time in PBS containing 0.1% of Triton-X-100 without BSA-HI04.
  • the sample is placed on the column (7 cm in length and 1 cm in diameter) and eluted in this buffer. Fractions of about 1 ml are collected.
  • the quantity of CSL ligands can be determined from the proteins of tumor cells or tumors, deposited either directly at a point on a support (analogous to immunodotting or ELISA), or, after electrophoresis and electro ⁇ transfer (analogous to immunoblotting), on the proteins of the tumor previously separated.
  • Tumor lines of tissue origin and different species have been studied. It's about :
  • the cells are cultured in polystyrene dishes in the presence of the media indicated below, to which the following antibiotics have been added: penicillin (100 U / ml) and streptomycin (1 mg / ml).
  • DMEM Dulbecco medium modified according to Eagle
  • SVF fetal calf serum
  • All the cultures are maintained at 37 ° C. in an atmosphere of air containing 5% of CO 2.
  • the culture media are changed twice a week.
  • the culture dishes are rinsed with fresh medium.
  • the cells are then mechanically detached using a "policeman" and they are dissociated by several passages through a needle 0.8 mm in diameter and 4 cm in length.
  • the cell suspension thus obtained from a culture on a solid support, as well as those obtained from cultures in a liquid medium, are centrifuged (5-10 min x 400 g). The supernatant is then removed and the pellet is resuspended in a suitable volume of culture medium which is distributed in several dishes.
  • the cells are trypsinized: the culture medium is aspirated, then the cells are brought into contact with a solution containing 0.25% trypsin for 2 to 3 min. Fresh culture medium is then added which neutralizes the action of trypsin and the cells are detached by gently shaking the dish with rotational movements. The cells then in suspension are dissociated by passage through a 0.8 mm diameter syringe. The cell suspension is then taken up in a suitable volume of medium and distributed in several boxes.
  • the solid phase cultures are washed with fresh medium, while the suspension cultures are centrifuged (5-10 min x 400 g). The cells are then suspended in fresh medium so as to obtain a cell concentration of approximately 5 ⁇ 10 6 cells per ml in the presence of 10% of fetal calf serum and 10% of dimethyl sulfoxide (DMSO). The cell suspension thus obtained is stored in liquid nitrogen.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • 1% of SDS is added to the tissue in water so as to have a protein concentration of the order of 2 mg / ml (proteins represent approximately 10% of the fresh weight of a tissue).
  • proteins represent approximately 10% of the fresh weight of a tissue.
  • the tissue is first manually dissociated dry, immediately after removing it from liquid nitrogen, in a conical glass Potter homogenizer fitted with a plunger. teflon.
  • the dissociated tissue is then mechanically homogenized in a 1% SDS solution so as to obtain a final protein concentration of approximately 2 mg / ml.
  • the protein extracts thus obtained are stored at -20 ⁇ C.
  • the exact protein concentration of the homogenates is determined according to the protocol recommended by Lowry et al (1951, J. Biol. Chem. 193_: 265-275).
  • the extracts are diluted in the Laemmli dissociation mixture (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-685) so as to obtain a protein concentration of 1 mg / ml and heated for 5 min at 90 ° C.
  • Electrophoresis in the presence of SDS on polyacrylamide gel is carried out in the Laemmli buffer system (Nature (1970), 227: 680-685). Usually, 13% acrylamide gels (0.75 mm thick) are used, they allow good resolution of proteins of low molecular weight and of average molecular weight, proteins among which are the major ligands of CSL ). Proteins are stained with Coomassie Brilliant R Blue (CBB). The quantity deposited on the gels is approximately 15 ⁇ g for the protein stains, from 1 to 5 ⁇ g for the revelations of the CSL ligands.
  • CBB Coomassie Brilliant R Blue
  • the proteins of the gels are then transferred to nitrocellulose filters (pore of 0.22 or 0.45 ⁇ m in diameter) in the buffer system developed by Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979), 16 .: 4350-4354) with the difference that SDS (0.04%) is added to the buffer in order to facilitate the transfer of highly hydrophobic proteins.
  • SDS 0.04%
  • the blots are rinsed several times with distilled water, then dried between sheets of filter paper and thus stored until they are used. 4 - Deposit of dowry samples:
  • the proteins dissolved in the 1% SDS at a concentration of 1 mg / ml are deposited using a microsyringe on the nitrocellulose filter. Volumes of 0.1-0.25-0.5-0.75 and l ⁇ l of material and corresponding controls are deposited and dried under a stream of air. The plate is then rinsed several times with distilled water and dried between sheets of filter paper until they are used.
  • the sample dissolved in 1% SDS at a concentration of 1 mg / ml is diluted 10 times in PBS.
  • An aliquot of 10 ⁇ l is placed in a well of an ELISA plate and left to dry in a ventilated oven brought to 37 ° C.
  • the well is then washed quickly with 5 times 100 ⁇ l of PBS, then 200 ⁇ l of BSA-HI04 are added and left for 1 h at ordinary temperature. After three rapid washes with PBS and once with water, the plates are inverted and left to dry. They can be kept dust-free until needed.
  • the ligands glycoproteins of the lectin CSL are detected.
  • This detection can be carried out in different ways depending on the nature of the method allowing the detection of the CSL fixed on its ligands.
  • It can be CSL marked by a radio-element (iodine in particular), the marking being revealed by autoradiography or more recent techniques.
  • he can be CSL rendered fluorescent or CSL covalently labeled by any other fluorophore viewed in ultraviolet light.
  • It can be an amplifying system comprising, for example, biotinylated CSL, revealed by a system of the avidin-alkaline phosphatase type (or avidin coupled to any other conventional means of detection).
  • the latter technique, biotinylated CSL associated with revelation by avidin, itself coupled to alkaline phosphatase constitutes an efficient and very sensitive system but which does not exclude other methods of detecting proteins.
  • the nitrocellulose filters are wetted in PBS and then incubated for 1 h at ordinary temperature in 3% BSA-HI04 in PBS.
  • the biotinylated CSL (lng / ml) is then added and the mixture is left to react for 4 h with stirring. Wash with PBS for 2 h every 10 minutes. Incubate for approximately 30 min with 3% BSA-HI04 in PBS and then add a dilute solution 1/1500 of avidin-alkaline phosphatase. It is left to incubate overnight at 4 ° C. with stirring, then washed as above. It is finally rinsed with TBS for 5 min before the development.
  • Alkaline phosphatase is revealed by the reagent NBT-BCIP (Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 8fJ: 4045-4049). After a quick rinse with distilled water, the nitrocellulose filters are dried with filter paper. Protocol for revealing CSL ligands by the CSL-biotinylated / Avidin-alkaline phosphatase method in pseudo-ELISA technique
  • the wells of the microtitration plates are wetted in PBS and then incubated for 1 h at ordinary temperature in 3% BSA-HI04 in PBS.
  • the biotinylated CSL (lng / ml) is then added and the mixture is left to react for 4 h with stirring. Wash with PBS for 2 hours every 10 minutes approximately.
  • CSL ligands on histological sections of tumor tissues or on preparations of tumor cells using labeled CSL.
  • This labeling of the CSL can be carried out with a suitable fluorophore (FITC, TRITC, etc.), either with a colored compound (colloidal gold for example), or using an indirect method, using for example biotinylation followed by detection of biotin by labeled avidin (by alkaline phosphatase or peroxidase for example). Since the constituents revealed by the CSL are essentially glycoprotein in nature, the treatment of the preparations with organic solvents does not in any way modify the reaction.
  • FITC fluorophore
  • TRITC TRITC
  • an indirect method using for example biotinylation followed by detection of biotin by labeled avidin (by alkaline phosphatase or peroxidase for example). Since the constituents revealed by the CSL are essentially glycoprotein in nature, the treatment of the preparations with organic solvents does not in any way modify the
  • the revealed ligands being of a carbohydrate nature, they are not modified by the aldehydic nature of fixators generally used to fix cells or tissues.
  • fixators generally used to fix cells or tissues.
  • oxidizing periodate
  • acid treatments likely, them, to destroy recognized glycans.
  • the cells are first fixed for 1 h at 4 ⁇ C with a solution containing 4% of paraformaldehyde and 0.1% of glutaraldehyde in PBS buffer.
  • the cells are then incubated with a biotinylated CSL solution at a concentration of approximately l ⁇ g / ml for 4 h at room temperature.
  • the cells are incubated with avidin coupled to horseradish peeoxidase (avidin-HRP) at a dilution of 1/100 in PBS overnight at 4 ⁇ C.
  • avidin coupled to horseradish peeoxidase avidin-HRP
  • Neuroblastoma cells differentiated or not
  • NIE115 neuroblastoma cells undifferentiated or differentiated by dibutyryl-cAMP, have a considerable amount and number of CSL ligands. This situation is very different from that which can be found for neurons. In this respect, it is very difficult to obtain a good neuronal witness for neuroblastoma NIE115 and this is the reason why it has been compared to a tissue particularly rich in neuronal material, the rat cerebellum. Although CSL ligands are present in large quantities in this organ on the 14th postnatal day, it can be seen that practically 5 major ligands known to have a neuronal origin are detected (FIG. 3, line 1).
  • the CSL cloning technique consisted of screening by various anti-CSL antibodies for the products expressed by the clones of a cDNA library in ZAP2.
  • This cDNA library was made from 14-day rat cerebellum mRNA.
  • the anti-CSL antibodies used for screening the library are:
  • Antibodies are prepared according to conventional techniques, by immunizing an animal with CSL or with a CSL subunit described above. Polyclonal antibodies can be recovered from the serum of the immunized animal. To produce the monoclonal antibodies, spleen cells from the animal immunized with CSL or a subunit are fused with myeloma cells to form hybridomas. These hybridomas are cloned and selected for their ability to specifically recognize CSL or at least one of its subunits.
  • the culture of C6 glio es cells was carried out under the conditions described above.
  • the cells were dissociated by gentle mechanical treatment and propagated with a density of 5 10 A cells per ml in the culture medium containing variable dilutions (1/1, 1/3 and 1/10) of solutions of the inhibitors of N-glycosylation: tunicamycin (2.5 ⁇ g / ml), deoxynojirimycin (2400 ⁇ g / ml), castanospermine (375 ⁇ g / ml), deoxymannonojirimycin (10 ⁇ g / ml), swainsonine (1 ⁇ g / ml; Smith et al 1991, J. Neurochem.
  • Fab were added to the cultures at the time of cell seeding and proliferation was followed by incorporation of thymidine.
  • the cells were kept in culture for 24 hours, then 9.25 kBq of 3 H-thymidine were added and the incorporation continued for an additional 4 hours.
  • the cell culture plates (containing 0.5 ml of culture medium) were cooled on ice and 500 ⁇ l of precooled 1.2 M perchloric acid was added. The plates were scratched with a "policeman" having a rubber tip and the suspension was transferred into 5 ml conical glass tubes for centrifugation. The culture plates were washed three times with 1 ml of 0.6 M perchloric acid. The combined supernatants were left for 30 minutes at 4 ⁇ C and then centrifuged (30 minutes at 2000 g).
  • the supernatant was removed and the pellet was dissolved in 400 ⁇ l of 0.1 M NaOH.
  • the samples were precipitated again by adding 3.6 ml of 0.6 M perchloric acid. After standing for 1 hour at 4 "C, the samples were centrifuged as above and the supernatant was separated. After drying, the samples were dissolved in 500 ⁇ l of 1% SDS buffered with 50 mM Tris-HCl buffer at pH 8.2. Samples were transferred to a scintillation container, 15 ml of Biofluor scintillation liquid was added and the radioactivity was counted in a Beckmann counter. All the experiments were carried out in triplicate. The controls were obtained by adding labeled thymidine to unlabeled cultures and immediately adding perchlorate.
  • the CSL purified by immunoaffinity chromatography was dialyzed exhaustively against a PBS buffer (25 mM sodium phosphate buffer, pH 7.2 containing 15 mM sodium chloride).
  • the lectin solution was adjusted to pH 9.0 by addition of 0.1 M NaOH and subjected reaction with an ester of N-hydroxysuccinimide biotin for 1 hour at 4 ⁇ C.
  • the excess reagent was neutralized by the addition of 0.2 M glycine in 0.1 M disodium phosphate.
  • the biotinylated CSL was separated from the low molecular weight biotinylated compounds by gel filtration on a 7.5 xl cm column of Ultrogel AcA202® equilibrated with a PBS buffer containing 0.1% Triton X-100. The biotinylated CSL was recovered, pBSA was added until a final concentration of 0.1% CSL was obtained and the CSL was stored in small aliquots at -70 "C until use.
  • nitrocellulose filters were saturated by incubation with 3% pBSA in PBS buffer with slow stirring for 1 hour at room temperature, followed by the addition of biotinylated CSL (final concentration 5 ng / ml) and incubation overnight at 4 "C.
  • the filters were washed every 10 minutes for 3 hours with PBS, then incubated for 1 hour in 3% of pBSA in PBS, then washed again every 10 minutes for a period of 3 hours with PBS.
  • Filters were incubated for 30 minutes with pBSA then alkaline phosphatase-avidin (avidin-AKP) or streptavidin-AKP (1/1500 in final dilution) was added and incubation was carried out overnight at 4 ⁇ C.
  • avidin-AKP alkaline phosphatase-avidin
  • streptavidin-AKP (1/1500 in final dilution
  • the cells in culture on Chamber Slides were fixed with a mixture of 4% paraformaldehyde, 0.1% glutaraldehyde (Kuchler et al, 1988, Dev. Neurosci. JLO: 199-212) for overnight at 4 ° C. They were rinsed several times in PBS before staining of the CSL ligands or for staining with toluidine blue.
  • the fixed cells were incubated with 3% of pBSA solution in PBS for 30 minutes at room temperature then the biotinylated CSL was added (5 ng / ml to the final concentration).
  • CSL was localized in C6 glioma cells by implementing an indirect immunoperoxidase technique according to the description previously given by Kuchler et al, 1988. CSL was detected by immunoblotting on the same samples as those used for the detection of CSL ligands. Two antibodies were used in these studies.
  • a rabbit polyclonal anti-CSL antibody (Zanetta et al, 1987, J. Neuroche. 9_: 1250-1257) used at a 1/250 dilution and / or an anti-CSL monoclonal antibody produced in mice designated by D2.11B and described above in the form of ascites at a dilution of 1/1000.
  • the first effect of certain inhibitors on C6 glioma cell cultures concerns cell density and morphology.
  • the effects on cell morphology can be observed after fixation with an aldehydic medium followed by staining with toluidine blue.
  • Control cells (not subjected to reaction) have a relatively homogeneous cell population with two categories: round cells and bipolar cells.
  • tunicamycin cell proliferation has stopped and the few cells are either large and flat or round.
  • deoxynojirimycin and castanospermine depending on the concentration of the inhibitor, the cell density is much lower compared to that of the control cells and the cell population is divided into two groups: elongated bipolar cells with thin parts and branched and occasionally large multinucleated flat cells.
  • N-glycosylation, outsourcing and sulfation inhibitors have variable effects on cell proliferation.
  • Tunicamycin, deoxynojirimycin, castanospermine, monensin and sodium chlorate show significant, concentration-dependent inhibition of C6 cell proliferation.
  • Thymidine intake was reduced to 78% with tunicamycin, 45% with deoxynojirimycin, 46% with castanospermine, 64% with monensine and 47% with sodium chlorate.
  • deoxymannonojirimycin and swainsonine at a concentration level used for the inhibition of the maturation of N-glycans did not affect cell proliferation.
  • CSL glycoprotein ligands are quantitatively affected by inhibitors of glycosylation, export of glycoproteins and sulfation
  • CSL was localized using the indirect immunoperoxidase technique applied to C6 cells, fixed under conditions identical to those of histochemical studies of CSL ligands.
  • CSL was detected in C6 glioma cells. Its diffuse intracellular concentration was significantly higher in undifferentiated cells (round cells) than in other cells and was not significantly affected by the various inhibitors. In all conditions, 1 • immunostaining did not become homogeneous in postmitotic cells since it was particularly concentrated in oblong and spherical structures (0.5 to 3 ⁇ m in diameter). These strongly immunostained structures were particularly frequent at the end of cell maturation but also in the body of the cell. These structures were partly found in the extracellular space with no apparent relation to the cells. This process, probably representing the externalization of CSL, was not modified using the various inhibitors.
  • C6 glioma cells are treated with tunicamycin, blocking the synthesis of the lipid intermediate involved in the biosynthesis of N-glycans, their proliferation is completely blocked.
  • Castanospermine and deoxynojirimycin two glycosylation inhibitors blocking glucosidases I and II respectively and therefore the elimination of glucose residues from Glc3Man9GlcNAc2 structures, inhibit proliferation of cells and simultaneously lead to their morphological differentiation.
  • deoxymannonojirimycin and swainsonine inhibitors of golgian annosidases which direct the biosynthesis of glycans towards oligomannosidic or hybrid types, do not influence this proliferation.
  • sodium chlorate an inhibitor of sulfation inhibits the proliferation of C6 cells at very low concentration (with a concomitant morphological differentiation).

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Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation pour la détermination in vitro de présence de cellules malignes dans un échantillon biologique donné, de lectines endogènes intervenant dans les phénomènes d'adhésion et/ou reconnaissance cellulaire ayant une affinité indépendante du calcium pour un site impliquant des résidus mannose au niveau de ligands glycanniques, et présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL ou avec R1, ou des fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques.

Description

DE ERMINATICW DE LA MALIGNITE DES CELLULES DE TUMEURS AU MOYEN DE LECTINES ENDOGENES
L'invention a pour objet la détermination de la malignité des cellules de tumeurs humaines ou animales, au moyen de lectines endogènes.
L'invention met en oeuvre les propriétés de certaines lectines endogènes, de se fixer à des ligands glycanniques, notamment des ligands riches en mannose présents au niveau des membranes de cellules, pour détecter la présence de cellules malignes dans des échantillons biologiques.
Selon les inventeurs, dans la cadre de la présente demande, la transformation maligne de cellules correspond de façon générale à une perte de 1'inhibition de contact entre des cellules, résultant d'un trop grand nombre de signaux cellulaires générés par les contacts intercellulaireε. Les cellules confrontées à une "surexpression" de signaux équivalents à un signal polysémique peuvent ne plus être en mesure d'interpréter ces signaux et se transformer en cellules malignes.
On connaissait la propriété des glycoconjugués de surface des cellules transformées (cellules tumorales) , d'être modifiés par rapport à ceux des cellules normales, qu'il s'agisse des glycoprotéines, des glycolipides ou même des protéoglycannes.
De plus certains auteurs avaient envisagé que la présence de cellules tumorales pouvait être accompagnée de modifications de certaines lectines endogènes.
La nature des lectines en cause n'avait pas cependant été identifiée. En outre aucune relation n'avait été établie entre les modifications de lectines lors de la transformation maligne de cellules et les modifications des glycannes de surface observées dans des conditions comparables.
Les inventeurs ont défini un groupe de lectines spécifiques, capables d'interagir avec des groupements glycanniques modifiés lors de la transformation maligne des cellules et, ont été en mesure de formuler une hypothèse sur le processus de cette transformation. Les lectines qui ont fait l'objet des études ayant conduit à cette hypothèse, sont des lectines endogènes susceptibles d'avoir un rôle dans les phénomènes d'adhésion et/ou de reconnaissance intercellulaires et donc d'intervenir dans la génération de signaux au niveau de ces cellules. Elles appartiennent principalement à deux familles.
Les lectines endogènes intérressantes dans le cadre de l'invention sont capables de se lier avec une affinité spécifique et forte avec la partie glycannique de ligands glycoprotéiques riches en mannose, cette liaison générant des contacts intercellulaires, par l'intermédiaire des pontages réalisés entre les glycannes portés par des glycoprotéines membranaires et de telles lectines.
Les inventeurs ont remarqué que les modifications de glycoconjugués membranaires, lors de la transformation maligne de cellules, comprennent une augmentation notable du nombre des ligands affines de lectines endogènes définies dans le cadre de l'invention et le cas échéant une diversification (augmentation de la quantité de ligands) de ces ligands. Ils ont émis l'hypothèse selon laquelle cette augmentation du taux de ligands de certaines lectines endogènes favoriserait la multiplication des contacts intercellulaires et par conséquent la génération de signaux en surnombre non traités par la cellule, constatée dans les processus malins. De façon avantageuse, les inventeurs ont mis en évidence l'existence d'une variation systématique d'un même type de marqueur, associée à la transformation maligne des cellules. De plus ils ont constaté que la transformation maligne s'accompagne de perturbations, telles que décrites plus haut, de la reconnaissance et de l'adhésion homotypique (entre cellules identiques) et hétérotypique (entre cellules de nature différente) entre les cellules.
L'invention met à profit cette hypothèse pour proposer un test permettant la détection in vivo de cellules tumorales, à partir d'échantillons biologiques par exemple constitués par des tissus, des lignées cellulaires, des cellules isolées ou encore des coupes histologiques. Le test défini dans le cadre de l'invention consiste à mettre en évidence l'augmentation du nombre et de la quantité de ligands glycanniques de lectines endogènes affines pour ces ligands et le cas échéant à doser leur taux.
L'augmentation du nombre des ligands est définie par rapport à un ligand donné présent sur des cellules normales mais en nombre inférieur. On peut en outre constater une augmentation de la quantité de ligands au sens d'une plus grande variété de ces ligands en comparaison avec le profil de cellules normales.
Les lectines endogènes utilisées dans le cadre de la réalisation de ce test, sont des lectines particulières capables d'intervenir dans les phénomènes d'adhésion et/ou de reconnaissance intercellulaires, et susceptibles de se lier de façon spécifique et indépendante du calcium, avec un site impliquant des résidus mannose, présent au niveau de la partie glycannique de glycoconjugués, en particulier de glycoprotéines membranaires ou solubles, habituellement présents en nombre réduit au niveau de cellules normales.
Ce groupe de lectines comporte principalement des lectines des deux familles suivantes.
La spécificité glycannique de ces deux familles de lectines et leurs différences par rapport à d'autres lectines endogènes décrites dans la littérature ont été cernées dans 1'article de Marschall et coll. , Biochimie 71 (1989) 645-653. Les résultats décrits dans cet article montrent également que les deux familles de lectines possèdent des spectres de spécificité glycannique partiellement superposables.
Une première famille de lectines propres à la réalisation du test de détection précédemment décrit, est celle qui comprend la lectine endogène à mannose désignée par l'abréviation CSL (Cerebellar Soluble Lectine) . La CSL a été isolée jusqu'à présent à partir de cellules de cervelet de rat et décrite dans l'article de Zanetta et al, 1987, J. Neurochem. 51: 1250-1257) . On connaissait cette lectine endogène, pour ses propriétés au niveau de la myélinisation d'une part, et au niveau du guidage de contact de la migration des neurones immatures, d'autre part cette molécule a d'ailleurs été isolée à partir du cervelet de rat. On avait également mis en évidence le rôle de la lectine endogène CSL dans le domaine de la pathologie comme cible immunologique dans la sclérose en plaques. On avait également constaté que la CSL, bien qu'initialement isolée du cervelet, est largement répandue dans les tissus de mammifères. La CSL décrite dans la publication précitée comporte au moins trois formes de sous-unités de masses moléculaires relatives (Mr) voisines de 31 500, 33 000 et 45 000 kd. Cette molécule est soluble et polyvalente, et possède une spécificité glycannique très fine pour des glycannes riches en mannose. Sa constante de dissociation pour certains glycannes endogènes peut être estimée à au moins 10*8 M (Marschall et al, 1989, Biochimie 5_: 10-20) .
Les inventeurs se sont également intéressés à une autre famille de lectines endogènes comprenant en particulier la lectine désignée par RI (Receptor 1) cette lectine a été décrite en 1985 (Dontenwill et al Dave Brain Res. 17: 245-252) . Cette lectine RI avait selon la description donnée, une localisation spécifiquement neuronale dans le cervelet et était exprimée transitoirement à la surface de certaines cellules du système nerveux. Cette lectine était connue en outre pour ses propriétés de reconnaissance intercellulaire par le biais du contact entre RI, externalisé de façon transitoire, et de glycoprotéines présentes à la surface des axones. Il a été montré que la lectine membranaire RI n'était pas spécifique des neurones cérébelleux mais pouvait être présente dans d'autres zones du système nerveux central ou périphérique, ou encore dans d'autres cellules et notamment à la surface de cellules endothéliales, les macrophages et les muscles.
Les structures des lectines endogènes CSL et RI sont donc différentes mais les inventeurs ont constaté qu'elles possèdent en commun leur spécificité vis à vis de groupements glycanniques de glycoconjugués membranaires.
A partir des études menées sur ces deux lectines particulières, les inventeurs ont défini une famille ou groupe de lectines utilisables pour la détection de cellules malignes, caractérisées en ce qu'il s'agit de lectines endogènes intervenant dans les phénomènes d'adhésion et/ou reconnaissance cellulaire ayant une affinité indépendante du calcium pour un site impliquant des résidus mannose et présent au niveau de ligands glycanniques et présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL, ou en ce qu'il s'agit de fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent 1'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention une parenté immunologique et/ou structurale d'une telle lectine existe également avec la lectine RI.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les lectines utilisées sont caractérisées en ce qu'elles ne sont ni des lectines E spécifique, ni des lectines P spécifique.
La lectine est ainsi utilisée pour détecter voire mesurer l'augmentation du nombre et le cas échéant de la quantité de ligands glycanniques membranaires de ces cellules.
Les inventeurs ont constaté que les ligands glycanniques augmentent à la surface de cellules tumorales dans une proportion de 1 à 100 voire plus, par rapport à la quantité de ces ligands sur des cellules normales. Cette augmentation du taux de ligands glycanniques des lectines endogènes selon l'invention, varie légèrement en fonction des tumeurs mais ne peut pas être reliée au grade du cancer.
Une lectine endogène répondant à cette définition présente une parenté immunologique avec la CSL, et le cas échéant avec RI, dès lors qu'elle est reconnue par des anticorps dirigés contre la CSL ou des anticorps dirigés contre RI. A cet égard des anticorps susceptibles d'être utilisés pour déterminer si une lectine endogène peut être mise en oeuvre dans le cadre de l'invention sont les anticorps suivants : - les anticorps polyclonaux obtenus chez le lapin contre les diverses sous-unités séparées de la CSL ou leur ensemble;
- les anticorps contenus dans le liquide céphalo- rachidien ou le sang de patients atteints de maladie démyélinisante, dont la sclérose en plaques et donnant des résultats positifs par le test d'i munoréplique mis au point pour le diagnostic de la sclérose en plaques (Zanetta et coll. Lancet 3_35_ (1990) 1282-1284, Zanetta et coll. C.R. Acad. Sci Paris, Série III 311 (1990) 327-331) ;
- les anticorps monoclonaux produits chez la souris permettant de révéler les sous-unités 31 500 et 33 000 de la CSL ou la sous-unité 45 000;
- un anticorps polyclonal produit chez le lapin contre la lectine purifiée RI;
- les anticorps monoclonaux anti-Rl produits chez la souris.
Ces anticorps sont obtenus selon les techniques classiques de production d'anticorps.
La CSL peut être caractérisée, par les éléments décrits dans la publication de Zanetta et al 1987 ci- dessus référencée et en particulier par le fait qu'elle est inhibée par le mannose, l'inhibition étant obtenue pour 37,5 mM, les autres monosaccharides n'ayant aucun effet inhibiteur sur cette lectine.
Parmi les ligands glycoprotéiques de la CSL, on citera les molécules suivantes :
- la glycoprotéine 31 kDa (Kuchler et coll. Neuro¬ science 3_3 (1989) 111-124), la glycoprotéine formée d'un doublet de Mr 31 et 28 000, exprimé transitoirement à la surface des neurones; - la glycoprotéine majeure du système nerveux périphérique, la glycoprotéine PO (Kuchler et coll., Cell. Molec. Biol. 3_5 (1989) 581-596);
- la " yelin-associated glycoprotein", MAG, glyco¬ protéine majeure de la myéline du système nerveux (Kuchler et coll., Dev. Neurosci. ,0 (1988) 199- 212) .
Dans le cas de la lectine RI, le mannose est inhibiteur à une dose de 75 mM et les autres monosaccharides ne sont pas inhibiteurs.
En particulier la CSL et RI possèdent une affinité pour une structure glycannique dite "hybride" possédant à la fois une chaîne mannosidique et une chaîne terminée par un résidu glucuronique sulfaté en position 3. A cet égard la CSL et RI présentent une affinité particulière pour une chaîne de la glycoprotéine PO telle que la suivante :
S04-3 - GlcUAl-3
I Gal/31-4
I Manαl-2 GlcNAc/81-2 i I
Manαl-3 Manαl-6 - Manαl-3
Man,31-4 ""
I S04-6 - GlcNAcjSl-2
I Fuαl-6 - GlcNac31
I Gly-Asp-Asn-Gly-Thr
Notons également que la CSL et RI ne sont pas inhibées par de faibles concentrations de lactose (absence d'inhibition jusqu'à 75.10"-^) et de glyco- saminoglycannes (concentration inférieure ou égale à 250 μg/ml correspondant environ à 2,5.10"M d'unités disacchariques) . Ces résultats sont obtenus en effectuant les tests d'agglutination d•érythrocytes de rats selon la technique décrite par Marschal et al (Biochimie 71 (1989) 645-653).
L'invention a donc pour objet, l'utilisation pour la détermination in vitro de la présence de cellules malignes dans un échantillon biologique donné, de lectines endogènes intervenant dans les phénomènes d'adhésion et/ou reconnaissance intercellulaires ayant une affinité indépendante du calcium pour un site impliquant des résidus mannose au niveau de ligands glycanniques, cette lectine présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL, ou des fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques.
Les cas échéant les lectines utilisées présentent également une parenté immunologique et/ou structurale avec RI.
Les ligands pour lesquels les inventeurs ont constaté une affinité des lectines de 1'invention peuvent être des ligands membranaires ou des ligands solubles.
Une lectine endogène particulièrement avantageuse pour la réalisation de 1'invention est la CSL sous forme purifiée et active ou encore des fragments de la CSL ou la CSL modifiée dès lors que la parenté fonctionnelle avec la CSL s'agissant de l'affinité indépendante du calcium vis à vis des ligands glycanniques est conservée.
Une molécule de CSL peut être modifiée, notamment par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés de la molécule, la lectine résultant conservant toutefois sa capacité de se lier aux ligands glycanniques en particulier membranaires normalement reconnus par la CSL.
Un procédé pour la purification de la CSL est décrit dans les exemples qui figurent dans les pages suivantes et 1'activité de la molécule est vérifiée par un test d'agglutination des globules rouges de rat préalablement fixés par la glutaraldehyde. Ce test est également décrit dans les pages qui suivent.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la CSL utilisée est obtenue par expression dans un hôte cellulaire procaryote ou eucaryote. La molécule recombinante est caractérisée comme étant la CSL par une capacité de fixation des glycannes, identique à celle de la CSL obtenue par extraction, et/ou par une reconnaissance par les anticorps anti-CSL définis ci-dessus. Elle peut présenter une glycosylation différente ou une absence de glycosylation en particulier la présence de N-glycannes sensibles à la N-glycanne ou endo-N-acétyl- glucosaminidase F.
Selon un autre aspect de la réalisation de l'invention, la lectine utilisée pour la détection in vitro de la malignité de cellules dans un échantillon biologique, est la lectine RI, ou un fragment de RI ou RI modifiée dès lors que la parenté fonctionnelle avec RI s'agissant de 1'affinité indépendante du calcium vis à vis des ligands glycanniques membranaires est conservée.
Grâce à la mise en oeuvre des lectines répondant aux définitions précédentes, les inventeurs ont déterminé de façon tout à fait intéressante qu'il existe une homologie très importante, voire une similitude pratiquement parfaite et en tout état de cause significative, entre les profils des ligands de ces lectines et en particulier de la CSL dans les divers lignées transformées ou dans les tumeurs malignes, quelle qu'en soit l'origine tissulaire ou l'espèce. Ceci est vérifié pour les cancers affectant des souches cellulaires où les lectines et en particulier la CSL sont présentes et leurs ligands surexprimés. C'est le cas des lignées tumorales telles que les gliomes C6, les neuroblasto es NIE 115, les cellules CHO, les cellules erythroblastoïdes humaines K562, les cellules cancéreuses ovariennes humaines IGROV1 et les cellules cancéreuses des glandes mammaires MCF7. C'est également le cas pour des tumeurs humaines comme les carcinomes de glandes mammaires (canalaires infiltrants, lobulaires infiltrants ou mucineux de grade I à III) , les schwannomes malins, histiocytofibromes malins, liposarcomes dédifférenciés, métastases pulmonaires.
La détection de la présence de cellules malignes dans un échantillon biologique in vitro, par la détermination d'une augmentation du nombre des ligands glycanniques et le cas échéant le dosage de ces ligands, peut être réalisée par différentes techniques. Un avantage de 1'invention résulte de la rapidité avec laquelle le test peut être effectué et de la sensibilité des résultats obtenus.
L'invention concerne donc l'utilisation d'une lectine ou d'un fragment de lectine répondant aux critères donnés ci-dessus, caractérisée en ce que cette lectine ou ce fragment de lectine est marqué, par exemple par un isotope radioactif (radioisotope) , un marqueur fluorescent ou un marqueur d'amplification.
A titre d'exemple de marqueur radioactif, on peut citer l'iode et comme exemple de marqueur fluorescent on peut citer le fluorophore FITC.
Un système d'amplification adapté pour la réalisation de l'invention est par exemple le système dans lequel la lectine mise en oeuvre est marquée avec de la biotine, la révélation de la liaison entre la lectine biotinylée et le glycanne d'un glycoconjugué membranaire étant réalisée par exemple à 1•aide d'avidine couplée par exemple à la phosphatase- alcaline. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux dès lors que la CSL biotinylée peut être conservée pendant plusieurs années sous forme congelée, sans perdre son activité.
D'autres systèmes de marquage peuvent être également utilisés et on aura notamment recours aux marqueurs de type enzymatique tels que la peroxydase, la β glactosidase ou des systèmes d'amplification à trois constituants faisant appel à trois anticorps (du type ABC) .
L'invention concerne également un kit pour la détermination in vitro dans un échantillon biologique donné, de la présence de cellules malignes, caractérisé en ce qu'il comprend une lectine endogène intervenant dans les réactions d'adhésion et/ou de reconnaissance intercellulaires ayant une affinité indépendante du calcium pour un site de ligands glycanniques impliquant des résidus mannose, cette lectine présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL, ou des fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques, éventuellement marquée.
Les lectines mises en oeuvre dans ce kit peuvent aussi présenter une parenté immunologique et/ou structurale avec RI, selon un mode particulier de réalisation 1'invention.
Dans un mode de réalisation préféré de ce kit, la lectine utilisée est la CSL, sous forme purifiée et active. Dans un autre mode de réalisation de ce kit, la lectine mise en oeuvre est la lectine membranaire RI, sous forme purifiée et active.
Ce kit peut être utilisé sur différents types d'échantillons biologiques susceptibles de contenir des cellules tumorales : il peut être constitué par exemple par une biopsie, un extrait tissulaire, des cellules isolées, une coupe histologique ou encore une lignée cellulaire.
L'utilisation d'un extrait tissulaire pour rechercher la présence de cellules malignes, permet l'obtention d'un résultat quantitatif. L'utilisation de coupes histologiques permet d'effectuer une réaction immunocytochimique et conduit à l'obtention d'un résultat qualitatif qui peut être observé au microscope.
Le kit peut être appliqué dans tous les cas de tumeurs se produisant au niveau de tissus susceptibles de contenir de la CSL ou RI et par exemple au niveau de tumeurs hépatiques (hépatomes) , au niveau de neuroblas- tomes, de glioblastomes, de cancers du sein, de leucémies érythrocytaires, ou de cancers des ovaires. Ces exemples ne sont toutefois pas limitatifs et le kit peut être mis en oeuvre pour la détection au niveau d'échantillons de tissus au niveau desquels on constate la présence de CSL ou d'une autre lectine répondant aux définitions données dans les pages précédentes.
Le kit peut également être mis en oeuvre pour détecter la présence de cellules tumorales circulantes et ce notamment en utilisant la CSL biotinylée ou fluorescente sur des culots ou lames de cellules circulantes.
Un kit convenant à la réalisation de l'invention peut aussi contenir plusieurs types de lectines, par exemple la CSL et RI, notamment lorsqu'il s'agit de déterminer 1'augmentation de ligands membranaires au niveau de cellules circulantes dont 1*origine tissulaire n'est pas connue.
Selon un mode de réalisation particulier du kit selon l'invention, la lectine utilisée peut également être marquée notamment par les marqueurs décrits plus haut de type radioactif, flurorescent ou amplificateur.
Les lectines du kit se présentent notamment sous forme de solution ou sous forme lyophilisée ou encore sous toutes formes adaptées à la conservation des protéines.
Un kit particulier comprend en outre un témoin négatif constitué par un échantillon de cellules normales dont le taux de ligands membranaires affines pour les lectines du kit est connu.
Il peut contenir aussi des courbes étalons sous forme d'une gamme de concentration de matériel contenant une quantité connue de ligands caractérisés de la CSL, ces étalons doivent permettrent de définir un degré de malignité des cellules de l'échantillon. Ces gammes permettent de préciser qu'un taux déterminé de ligands définis ci-dessus est corrélé avec un signal donné obtenu avec des lectines du kit après mise en contact avec cet échantillon.
L'invention vise aussi un procédé pour la détermination in vitro dans un échantillon biologique donné, de la présence de cellules malignes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- mise en contact de 1'échantillon biologique testé, avec une quantité déterminée de lectines endogènes, intervenant dans les réactions d'adhésion et/ou de reconnaissance intercellulaires, ayant une affinité indépendante du calcium pour un site impliquant des résidus mannose et présent au niveau de ligands glycanniques contenant des résidus mannose, cette lectine présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL, ou des fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques, cette lectine étant en outre marquée, dans des conditions permettant la réaction de ladite lectine marquée avec des ligands glycanniques;
- élimination de la lectine n'ayant pas réagi avec les ligands;
- révélation de la présence de complexes du type lectine-ligand, caractéristiques de la malignité cellulaire; détermination de la quantité de ligands glycanniques ayant réagi.
La lectine mise en oeuvre dans le procédé peut en outre avoir une parenté immunologique et/ou structurale avec RI.
La détermination de la quantité de ligands ayant réagi avec les lectines peut être remplacée par la détermination de l'augmentation du nombre des ligands recherchés. Il peut aussi s'agir d'une détermination qualitative.
Comme on l'a dit plus haut, ces ligands peuvent être membranaires ou solubles.
Selon un mode de réalisation avantageux, la lectine utilisée pour la réalisation du procédé est la CSL purifiée, active.
Selon un autre mode de réalisation de ce procédé, la lectine endogène utilisée est la lectine RI.
Le procédé peut être réalisé sur les diverses formes d'échantillons dont il est question dans les pages précédentes et en particulier à partir d'échantillons dont on a préalablement extrait les protéines. Cette technique est notamment utilisée lorsque l'échantillon est constitué par une tumeur ou par des cellules en culture.
La détermination de la présence d'une quantité de ligands d'une lectine endogène affine pour des glycannes tels que décrits ci-dessus, peut être réalisée à partir des protéines des échantillons déposés soit directement sur un support, par exemple selon une méthode analogue à 1'immuno-dotting ou à la technique ELISA, soit après électrophorèse et électrotransfert (technique analogue à 1'immuno- blotting) sur les protéines de la tumeur préalablement séparées.
Une description détaillée de ces modes de réalisation est donnée dans les exemples.
Des supports utilisables pour déposer les protéines sont des filtres tels que les filtres de nitrocellulose, ou encore des plaques de type ELISA.
Pour la réalisation du procédé, les lectines utilisées sont marquées selon les techniques qui ont été décrites précédemment.
La mise en oeuvre du procédé de détection de 1•invention au moyen d'une technique de dépôt des protéines de l'échantillon sur un support, permet la différenciation des tumeurs non homogènes, et en conséquence permet de déterminer dans quelle mesure une tumeur contient une partie de tissu sain, et donc le taux de malignité de la tumeur.
Le procédé de l'invention peut également faire appel à une étape de comparaison du résultat obtenu lors de l'étape de révélation de la présence de complexes de type lectine-ligand, caractéristiques de la malignité cellulaire, avec des étalons ou des gammes de standard, éventuellement pré-établies, et qui permettent de corréler le degré de malignité d'une cellule avec le taux de ligands glycanniques. Ces gammes de standard ou témoin peuvent être obtenues à partir d'échantillons et notamment de cultures cellulaires dont on connait exactement la quantité de ligands glycanniques et par dilution progressive de ces échantillons. En conséquence les observations effectuées par mise en contact des lectines avec un échantillon dont on cherche à déterminer s'il contient des cellules malignes, peuvent être rapportées à un signal connu, obtenu pour un nombre de ligands glycanniques déterminé, mis en présence de lectines déterminées.
Les inventeurs ont démontré que les lectines de l'invention, par exemple des lectines CSL et RI, peuvent intervenir successivement dans le temps dans le processus de transformation maligne.
Dans la tumeur primaire, la CSL participe à la formation des contacts entre cellules tumorales qui possèdent à leur surface un nombre très important de ligands glycoprotéiques. Ce contact génère un signal non-sens dans les cellules qui perdent ainsi l'inhibition de contact.
Les cellules qui quittent la tumeur primaire entrent dans la circulation. Ne possédant pas les ligands appropriés sur leur surface, elles ne se fixent pas sur la majorité des cellules endothéliales possédant d'autres systèmes de reconnaissance.
Lorsque ces cellules rencontrent des cellules endothéliales portant la lectine RI, elles sont fixées spécifiquement et peuvent alors pénétrer dans le tissu pour y générer une tumeur secondaire.
Ainsi la lectine RI peut par exemple être considérée comme déterminante dans la domiciliation ("homing") de certaines métastases. Elle participe au développement des métastases en modifiant les possibilités de reconnaissance et d'adhésion hétérotypiques entre cellules cancéreuses et endothélium vasculaire et matrice extracellulaire ou cellules hôtes.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples et les figures qui suivent.
Figure 1 : contrôle électrophorétique (révélation argentique) des préparations de CSL biotinylée. Une partie aliquote des fractions obtenues après séparation sur une colonne d'Ultrogel AcA 202 des produits de biotinylation de la CSL a été déposée sur le gel. Le profil de la CSL trouvée dans des fractions du volume mort de la colonne est identique à celui de la préparation d'origine : il contient la même proportion des sous-unités 33 000 et 31 500 de la CSL et de ses produits de dégradation (bas poids moléculaire) . Un profil identique est obtenu après révélation par 1'avidine-phosphatase alcaline. Les nombres sur la droite indiquent la position des marqueurs de Mr.
Figure 2 : profils électrophorétiques des protéines révélées par le CBB (A) et des ligands de la CSL révélés par la méthode CSL-biotinylée-Avidine-AKP (B) présents dans des cellules normales ou transformées d'origine hépatique. La quantité de protéines déposées est la même (15 μg) pour chacun des puits. Les échantillons sont les suivants :
1) hépatocytes de souris
2) hépatome Al de souris
3) hépatocytes de rat
4) hépatome H56 de rat
5) hépatome HTC de rat
On notera la quantité importante de ligands de la CSL dans les lignées tumorales. Figure 3 : analyse électrophorétique des ligands de la CSL dans des cellules et tissus d'origine nerveuse normaux ou transformés.
A) coloration des protéines par le CBB
B) révélation par la CSL-biotinylée.
15 μg de protéines ont été déposés dans chacun des puits. Le matériel déposé provient des tissus ou cellules suivants :
1) cervelet de rat âgé de 14 jours
2) cervelet de rat adulte
3) neuroblastome NIE115 non différencié
4) neuroblastome NIE115 différencié par le dibutyryl c-AMP
5) glioblastome C6
6) astrocytes
7) oligodendrocytes
8) cellules de Schwann de rat nouveau-né
On notera la quantité importante de ligands de la CSL dans les trois types de cellules tumorales
Figure 4 : analyse électrophorétique du profil des ligands de la CSL dans des cellules transformées d'origines diverses.
A) coloration des protéines par le CBB
B) révélation par la CSL biotinylée.
15 μg de protéines ont été déposés dans chacun des puits.
1) IGROVl
2) MCF7
3) K562
On notera la quantité importante de ligands de la CSL et la similitude de leur profil.
Figure 5 : aspect en microscopie à contraste de phase des cultures de neuroblastome NIE115 non différencié : A) ou différencié par le dibutyryl-cAMP : B) . Les barres représentent 100 μm. On notera la présence de prolongements en B) .
Figure 6 : localisation de la CSL (A) et de ses ligands (B-D) dans les cultures du neuroblastome NIE115 non différencié (A-C) ou différencié par le dibutyryl c-AMP (D) . Les barres représentent 10 μm.
A) La CSL présente une localisation manifestement intracellulaire (grosses flèches) mais se situe également à la surface des cellules (petites flèches) . B-D) Les ligands de la CSL révélés par la CSL biotinylée, elle même révélée par 1 'avidine-HRP sont localisés exclusivement à la surface des corps cellulaires (B et C) et des prolongements (D).
Figure 7 : analyse électrophorétique des ligands de la CSL dans huit (1-8) tumeurs malignes des glandes mammaires humaines.
A) coloration des protéines par le CBB
B) révélation par la CSL biotinylée
15 μg de protéines ont été déposés dans chacun des puits. On notera, pour la plupart des tumeurs, la présence d'une quantité importante de ligands de la CSL. Il existe toutefois des variations entre elles.
C) témoin correpondant à la piste 7, incubé avec 1'avidine-phosphatase alcaline mais sans CSL- biotinylée.
Figure 8 : représentation schématique de l'hypothèse du signal non sens de la transformation maligne. A) dans des cellules normales, le contact entre cellules est assuré par la lectine CSL entre les glycannes portés par un nombre limité de glycopro¬ téines (ici une seule) . Ce contact génère un signal intracellulaire (a) parfaitement interprété par la cellule. B) dans la cellule transformée, le même contact assuré par la CSL se réalise à travers de nombreuses glycoprotéines différentes générant chacune un signal intracellulaire différent (a) (b) (c) (d) (e) . La résultante de ces signaux équivaut à un signal polysémique non interprété par la cellule : il équivaut à un signal "non-sens".
Figure 9 : représentation schématique de l'implication des lectines CSL et RI et de leurs ligands glycoprotéiques dans la transformation maligne.
E X E M P L E S
A) PURIFICATION DE LA CSL
Protocole d'extractions séquentielles
20 ratons (entre 12 et 22 jours après la naissance) sont tués par décapitation et le cervelet est prélevé sur glace. Toutes les opérations sont réalisées alors à 4βC. Tous les tampons contiennent des inhibiteurs de protéases : 0,01% de l'ester méthylique de la p-tosyl- arginine et 0,1 mM de fluorure de phényl méthyl sulfonyle.
1) Les cervelets sont homogénéisés dans 300 ml de tampon 10 mM Tris-HCl à pH 7,2, puis centrifugés (lh X 200 000g) .
2) Le culot est homogénéisé dans 10 ml d'eau et l'on ajoute 90 ml d'un tampon 11 mM Tris-HCl à pH 7,2 contenant 0,44 M de NaCl. Après homogénéisation, la suspension est centrifugée (lh X 200 000g) .
3) Le culot est homogénéisé dans 10 ml d'eau et 1'on ajoute 90 ml d'un tampon 11 M Tris-HCl à pH 7,2, contenant 0,44 M de NaCl. Après homogénéisation, la suspension est centrifugée (lh X 200 000g) (idem 2) .
4) Le culot est homogénéisé dans 10 ml d'eau et l'on ajoute 90 ml d'un tampon 11 mM tris-HCl à pH 7,2 contenant 0,44 M et 0,55 M de mannose. Après homogénéisation, la suspension est centrifugée (2h X 200 000g) . Cette fraction est appelée TNM1.
5) Le culot est homogénéisé dans 10 ml d'eau et l'on ajoute 90 ml d'un tampon 11 mM Tris-HCl à pH 7,2 contenant 0,44 M de NaCl et 0,55 M de mannose. Après homogénéisation, la suspension est centrifugée (2h X 200 000g). Cette fraction est appelée TNM2. 6) La fraction TNM obtenue en réunissant les fractions TNMl et TNM2 sert de départ pour la purification de la CSL par immunoaffinité.
Protocole pour la purification de la CSL par immunoaffinité
1) - les anticorps polyclonaux obtenus chez le lapin contre les diverses sous-unités séparées de la CSL ou leur ensemble;
- les anticorps contenus dans le liquide céphalo- rachidien ou le sang de patients atteints de maladie démyélinisante dont la sclérose en plaques et donnant des résultats positifs par le test d'immunoréplique mis au point pour le diagnostic de la sclérose en plaques (Zanetta et coll. Lancet 335 (1990) 1282-1284, Zanetta et coll. C.R. Acad. Sci Paris, Série III 3L1 (1990) 327-331) ;
- les anticorps monoclonaux produits chez la souris permettant de révéler les sous-unités 31 500 et 33 000 de la CSL ou la sous-unité 45 000 ayant pour noms D36A, D36B, D36C, D36D;
Préparation des immunoglobulines : les fractions d'immunoglobulines sont obtenues par précipitation par le sulfate d'ammonium (250 mg/ml) à 4°C des sérums ou plasmas contenant des anticorps anti-CSL, suivie d'une centrifugation (lh X 100 000g) . Les culots d'immunoglobulines sont repris dans un volume initial de tampon PBS (25 mM Phosphate de Na à pH 7,2 contenant 150 mM NaCl) puis dialysées plusieurs fois sur une durée de 48 h contre de grands volumes de PBS à 4°C et sous agitation. La source des immu¬ noglobulines peut être du sérum de lapin produisant des anticorps anti-CSL ou des sérums ou plasmas de patients atteints de sclérose en plaques ou d'autres maladies dans lesquelles il existe des anticorps anti-CSL en quantité importante.
2) Immobilisation des immunoglobulines : les immunoglo- bulines ainsi isolées sont immobilisées sur un support (généralement de la Sepharose 4B activée par le bromure de cyanogène) selon les protocoles suggérés par le fabricant. Après réaction pendant une nuit à 4°C, les sites d'activation résiduels sont bloqués par réaction pendant lh à 4βC avec une solution 1M d'éthanolamine portée à pH 9,0 par de l'acide chlorhydrique concentré. Le gel est alors largement lavé avec du PBS, puis soumis à un cycle d'immunoaffinité "à blanc" (comme ci-dessous, mais sans protéines dans la fraction TNM) .
3) Chromatographie d'immunoaffinité : la colonne (5 cm de longueur et 1 cm de diamètre) est équilibrée dans du tampon 2,5 mM Tris-HCl à pH 7,2 contenant 0,1 M de NaCl. La fraction TNM est diluée 4 fois avec de l'eau glacée et l'on ajoute les inhibiteurs de protéase à la concentration habituelle. Cette fraction est passée lentement sur la colonne (30 ml par heure au maximum) . Quand tout 1'échantillon est passé, la colonne est lavée avec le tampon d'équilibration puis avec 25 ml de PBS trois fois concentré. Pour cette élution, le matériel sortant de la colonne est recueilli sur un collecteur de fractions, en fractions d'environ 0,5 ml. La colonne est alors lavée avec 25 ml de tampon Glycine-HCl 0,2 M à pH 7,2, puis neutralisée à l'aide d'un tampon PBS 8 fois concentré. Après un dernier lavage avec du PBS, le gel est récupéré et stocké à 4"C dans ce tampon auquel on ajoute de l'azide de sodium (concentration finale 1/1000). Selon l'affinité des anticorps, la CSL peut se trouver soit dans l'éluat 3 X PBS, soit dans l'éluat pH 2,0. 4) Les fractions éluées par le PBS 3 fois concentré sont gardées congelées à 80"C. Les fractions contenant les protéines éluées par le tampon à pH 2,0 sont dyalisées plusieurs fois contre de grands volumes de PBS à 4°C et sous agitation pendant une période de 24h.
5) Test de préparation de CSL purifiée : une partie aliquote des fractions obtenues est mélangée avec un volume de mélange de solubilisation de Laemmli et soumis à une électrophorèse en gel de polyacrylamide à 13% d'acrylamide en présence de SDS. Le gel est ensuite coloré par le bleu de Coomassie, puis par une coloration argentique. La qualité des préparations se juge par l'absence de bandes autres que celles de PM 31 500, 33 000 et 45 000 caractéristiques de la CSL.
L'activité des préparations est testée par agglutination des globules rouges de rat préalablement fixés par la glutaraldehyde. Ces globules sont préparés selon la méthode préconisée par SIMPSON et coll. (Nature (1977) , 266: 367-369) . Des dilutions de 2 en 2 de la lectine dans du PBS sont placées dans les puits à fond rond de plaques d'agglutination, dans un volume de 100 μl. On ajoute 100 μl de la suspension de globules rouges et on laisse reposer pendant environ lh. L'activité agglutinante maximale observée est de l'ordre de 0,1-0,2 μg/ml.
B) MARQUAGE DE LA CSL
La protéine ainsi purifiée, dont l'activité est vérifiée par sa capacité d'agglutiner des globules rouges de rat préalablement fixés par la glutaraldehyde (Marschal et coll., Biochimie (1989), 71: 645-653) est marquée soit par un isotope radioactif (iode) , soit par un fluorophore (FITC) soit par un système d'amplification (biotine, qui permet d'utiliser une révélation par 1*avidine couplée par exemple à la phos- phatase alcaline) . Ce dernier mode de marquage et de révélation est particulièrement avantageux, la CSL biotinylée pouvant conserver son activité durant plusieurs années de congélation.
Protocole de biotinylation de la CSL
Toutes les opérations sont réalisées à 4°C. A 500 μl d'une solution de CSL (environ 500 μg de protéine / ml de PBS) placés dans un tube Eppendorf de 1,5 ml, on rajoute 30 μl de soude 0,1 N afin de porter le pH à 9,25. On rajoute, lentement sous agitation, lOμl d'une solution de N-hydroxy-succinimide ester de biotine (75 mM dans du diméthylformamide) . On laisse ainsi agir pendant lh à 4βC en agitant régulièrement. On ajoute alors 100 μl d'une solution 0,2 M de glycine afin de bloquer l'excès de réactif. On ajoute ensuite du Triton-X-100 (concentration finale 0,1%) afin d'éviter la précipitation ultérieure de la CSL biotinylée sur la colonne de gel filtration. Cette dernière, préparée avant le début de l'expérience, est constituée d'Ultrogel AcA 202 (IBF) équilibrée dans du tampon PBS contenant 0,1% de Triton-X-100 et 1 mg/ml de BSA traitée par l'acide périodique (BSA-HI04; Glass et coll., 1981). L'emploi de BSA-HI04 à ce stade a pour but de saturer les sites du gel qui pourraient, par la suite, adsorber la CSL biotinylée et ainsi diminuer le rendement de cette étape. La colonne est ensuite longuement lavée dans du PBS contenant 0,1% de Triton- X-100 sans BSA-HI04. L'échantillon est déposé sur la colonne (7 cm de longueur et 1 cm de diamètre) et élue dans ce tampon. On recueille des fractions de 1 ml environ.
Une partie aliquote de 20 μl de chacune des fractions recueillies est déposée dans les puits d'une plaque de microtitration ELISA et on le laisse sécher. On ajoute 100 μl de BSA-HI04 pendant lh à température ordinaire. Après quelques lavages avec du PBS, on ajoute 100 μl d'une solution diluée 1000 fois d'avidine couplée à la phosphatase alcaline. Après incubation pendant lh à température ambiante, les puits sont lavés une dizaine de fois avec du PBS. Après quelques lavages à l'eau, on révèle par le substrat p-nitrophényl- phosphate de la phosphatase alcaline à 37°C pendant environ 5 min. L'intensité de la coloration obtenue est mesurée dans un lecteur de plaques ELISA classique.
Ces préparations sont testées également par électrophorèse en milieu dénaturant (SDS) avec une coloration argentique. Une vérification de la biotiny- lation de toutes les chaînes est réalisée après transfert sur filtre de nitrocellulose par révélation avec l'avidine marquée à la phosphatase alcaline (voir ci-dessous) .
Enfin il est conseillé de vérifier l'activité de la CSL biotinylée en utilisant la technique d'hémagglutination (voir ci-dessus) .
Afin de vérifier l'intégrité de la CSL biotinylée des parties aliquotes des préparations ont été soumises à des analyses électrophorétiques suivies de coloration par le CBB (Coomassie Brilliant Blue R) ou le nitrate d'argent ou, après transfert sur filtre de nitrocellulose, révélation par 1'avidine-phosphatase alcaline. Dans tous les cas (CSL biotinylée active ou non), on a pu vérifier qu'il n'y avait pas de protéolyse de la CSL au cours du protocole de biotinylation, et que la biotinylation portait sur toutes les chaînes CSL. En effet, il n'y a pas de modifications substantielles du profil électrophorétique de la CSL avant et après biotinylation : on retrouve le même type de profil avec les mêmes bandes (deux majeures à 31 500 et 33 000 ainsi que des bandes mineures initialement présentes vers 15 000 et correspondant à une dégradation de la CSL) dans les mêmes proportions, toutes étant biotinylées (figure 1) .
C) UTILISATION DE LA CSL POUR LE DOSAGE DES LIGANDS DE LA CSL
La détermination de quantité des ligands de la CSL peut se faire à partir des protéines des cellules tumorales ou des tumeurs, déposées soit directement en un point d'un support (analogue à 1'immuno-dotting ou à l'ELISA), soit, après électrophorèse et électro¬ transfert (analogue à 1'immunoblotting) , sur les protéines de la tumeur préalablement séparées.
1 - Techniques de cultures cellulaires
Origine des lignées cellulaires
Des lignées tumorales d'origines tissulaires et d*espèces différentes ont été étudiées. Il s'agit :
- du clone C6 dérivant d'un glioblastome de rat induit par la nitrosurée (Benda et coll., Science 161 (1968) 370-371) ,
- du clone HTC dérivant de l'hépatome de Morris de rat (Thompson et coll., Proc. Natl; Acad. Sci. USA 56 (1966) 296-303) , - du clone H56 dérivant d'un hépatome de rat (Deschatrette et Weiss, Biochimie 5> (1974) 1603- 1611) ,
- du clone NIE115 dérivant d'un neuroblastome de souris (Lampert et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73 (1976) 3165-3167),
- du clone Al dérivant d'un hépatome de souris (Chott et al Anticancer Drugs Vol. 191 (1989) 245- 252) ,
- du clone MCF7 (WT 101/22/26) dérivant d'un cancer de sein humain (Soûle et coll., J. Natl. Cancer Inst. 5_1 (1973) 1409-1416),
- du clone K562 dérivant d'une leucémie érythrocytaire humaine (Lozzio et Lozzio, Blood 4J5
(1975) 321-334),
- du clone IGROV1 dérivant d'un cancer des ovaires humains (Bénard et coll.. Cancer Res. £5 (1985) 4970-4979) ,
- astrocytes de rat (Pettmann et coll., Dev. Neurosci. 4. (1981) 37-45) ,
- oligodendrocytes (McCarthy et DeVellis, J. Cell Biol. 85 (1980) 890-902).
Techniques de cultures cellulaires
Les cellules sont cultivées dans des boîtes en polystyrène en présence des milieux indiqués ci-après, auxquels on a ajouté les antibiotiques suivants : pénicilline (100 U/ml) et streptomycine (1 mg/ml) .
- pour le clone C6 : milieu de Dulbecco modifié selon Eagle (DMEM) complétés avec 10% de sérum de veau foetal (SVF)
- pour le clone HTC : milieu DMEM + 10% SVF
- pour le clone H56 : milieu DMEM + 5% SVF - pour le clone Al : mélange nutritionnel F-12 HAM + 10% SVF
- pour le clone NIE115 : milieu DMEM + 10% SVF
- pour le clone IGROVI : milieu RPMI-1640 (RPMI) + 10% SVF
- pour le clone MCF7 : RPMI + 10% SVF
Toutes les cultures sont maintenues à 37"C dans une atmosphère d'air contenant 5% de C02. Les milieux de culture sont changés deux fois par semaine.
Repiquage des cultures
Pour la plupart des cultures en phase solide, à l'exception des neuroblastomes de souris, on rince les boîtes de culture avec du milieu frais. On détache ensuite mécaniquement les cellules à l'aide d'un "policeman" et on les dissocie par plusieurs passages à travers une aiguille de 0,8 mm de diamètre et de 4 cm de longueur. La suspension cellulaire ainsi obtenue à partir d'une culture sur support solide, ainsi que celles obtenues à partir des cultures en milieu liquide, sont centrifugées (5 - 10 min x 400 g) . On élimine alors le surnageant et on resuspend le culot dans un volume convenable de milieu de culture que l'on répartit dans plusieurs boîtes.
Pour le repiquage des neuroblastomes, on procède par trypsinisation des cellules : on aspire le milieu de culture, puis on met les cellules en contact avec une solution contenant 0,25% de trypsine pendant 2 à 3 min. On ajoute ensuite du milieu de culture frais qui neutralise 1'action de la trypsine et 1'on détache les cellules en agitant doucement la boîte par des mouvements de rotation. Les cellules alors en suspension sont dissociées par passage à travers une seringue de 0,8 mm de diamètre. La suspension cellulaire est alors reprise dans un volume convenable de milieu et répartie dans plusieurs boîtes.
Conservation des lignées cellulaires
Lorsqu'elles arrivent à confluence, les cultures en phase solide sont lavées avec du milieu frais, alors que les cultures en suspension sont centrifugées (5 - 10 min x 400 g) . Les cellules sont alors mises en suspension dans du milieu frais de façon à obtenir une concentration cellulaire d'environ 5 x 106 cellules par ml en présence de 10% de sérum de veau foetal et 10% de diméthylsuifoxyde (DMSO) . La suspension cellulaire ainsi obtenue est conservée dans l'azote liquide.
2 - Méthodes d'extraction des protéines des cultures de cellules ou de tumeurs :
Pour les tumeurs, on ajoute au tissu du SDS 1% dans 1'eau de façon à avoir une concentration de 1'ordre de 2mg/ml en protéines (les protéines représentent environ 10% du poids frais d'un tissu). Pour les cultures de cellules, il est nécessaire d'effectuer deux lavages avec du PBS avant de dissoudre le matériel dans le SDS 1%.
Pour les tumeurs du sein, conservées dans l'azote liquide, le tissu est d'abord dissocié manuellement à sec, immédiatement après l'avoir retiré de l'azote liquide, dans un homogénéisateur de Potter conique en verre muni d'un piston de téflon. Le tissu dissocié est alors homogénéisé mécaniquement dans une solution de SDS à 1% de façon à obtenir une concentration protéique finale d'environ 2 mg/ml. Les extraits protéiques ainsi obtenus sont conservés à -20βC. La concentration protéique exacte des homogénats est déterminée selon le protocole préconisé par Lowry et coll (1951, J. Biol. Chem. 193_: 265-275). Avant électrophorèse, les extraits sont dilués dans le mélange de dissociation de Laemmli (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-685) de façon à obtenir une concentration protéique de 1 mg/ml et chauffés pendant 5 min à 90°C.
3) - Techniques électrophorétiques :
Les électrophorèses en présence de SDS sur gel de polyacrylamide sont réalisées dans le système tampon de Laemmli (Nature (1970) , 227: 680-685) . Habituellement, des gels à 13% d'acrylamide (0,75 mm d'épaisseur) sont utilisés, ils permettent une bonne résolution des protéines de bas poids moléculaires et de poids moléculaires moyens, protéines parmi lesquelles se trouvent les ligands majeurs de la CSL) . Les protéines sont colorées avec du Bleu de Coomassie Brilliant R (CBB) . La quantité déposée sur les gels est de 15 μg environ pour les colorations protéiques, de 1 à 5 μg pour les révélations des ligands de la CSL. Les protéines des gels sont alors transférées sur filtres de nitrocellulose (pore de 0,22 ou 0,45 μm de diamètre) dans le sytème de tampon développé par Towbin et coll. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979), 16.: 4350-4354) avec la différence que du SDS (0,04%) est ajouté au tampon afin de faciliter le transfert de protéines hautement hydrophobes. Les blots sont rincés plusieurs fois à l'eau distillée, puis séchés entre des feuilles de papier filtre et conservés ainsi jusqu'à leur utilisation. 4 - Dépôt des échantillons en dots :
Les protéines dissoutes dans le SDS 1% à la concentration de lmg/ml sont déposées à 1*aide d'une microseringue sur le filtre de nitrocellulose. On dépose des volumes de 0,1-0,25-0,5-0,75 et lμl de matériel et de témoins correspondants et 1'on sèche sous courant d'air. La plaque est alors rincée plusieurs fois à l'eau distillée et séchée entre des feuilles de papier filtre jusqu'à leur utilisation.
5 - Technique pseudo-ELISA :
L'échantillon dissous dans du SDS 1% à la concentration de lmg/ml est dilué 10 fois dans du PBS. Une partie aliquote de lOμl est déposée dans un puits d'une plaque ELISA et laissée à sécher dans une étuve ventilée portée à 37*C. Le puits est alors lavé rapidement avec 5 fois 100 μl de PBS, puis 200 μl de BSA-HI04 sont ajoutés et laissés pendant lh à température ordinaire. Après trois lavages rapides par du PBS et une fois par de l'eau, les plaques sont retournées et laissées à sécher. Elles peuvent être gardées à l'abri de la poussière jusqu'à leur utilisation.
6 - Révélation
A partir de ce matériel fixé sur le support, on détecte les glycoprotéines ligands de la lectine CSL. Cette détection peut être réalisée de différentes façons suivant la nature du procédé permettant la détection de la CSL fixée sur ses ligands. Il peut s'agir de CSL marquée par un radio-élément (iode en particulier) , le marquage étant révélé par autoradiographie ou techniques plus récentes. Il peut s'agir de la CSL rendue fluorescente ou de la CSL marquée de façon covalente par tout autre fluorophore visualisé en lumière ultra-violette. Il peut s'agir d'un système amplificateur comprenant, par exemple, la CSL-bioti- nylée, révélée par un système du type avidine-phospha- tase alcaline (ou avidine couplée à tout autre moyen classique de détection) . Cette dernière technique, de la CSL biotinylée associée à une révélation par l'avidine, elle-même couplée à la phosphatase alcaline, constitue un système efficace et très sensible mais qui n'exclut pas les autres méthodes de détection des protéines.
Protocole de révélation des ligands de la CSL par la méthode CSL-biotinylée/Avidine-phosphatase alcaline sur filtre de nitrocellulose :
Les filtres de nitrocellulose sont mouillés dans du PBS puis incubés pendant lh à température ordinaire dans de la BSA-HI04 à 3% dans du PBS. On ajoute alors la CSL biotinylée (lng/ml) et l'on laisse réagir pendant 4h avec agitation. On lave avec du PBS pendant 2h toutes les 10 minutes. On incube pendant environ 30 min avec de la BSA-HI04 à 3% dans du PBS puis on ajoute une solution diluée 1/1500 d'avidine-phosphatase alcaline. On laisse incuber pendant la nuit à 4°C sous agitation, puis on lave comme ci-dessus. On rince finalement avec du TBS pendant 5 min avant la révélation. On révèle par le réactif NBT-BCIP de la phosphatase alcaline (Leary et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 8fJ: 4045- 4049) . Après un rapide rinçage à l'eau distillée, les filtres de nitrocellulose sont séchés avec du papier filtre. Protocole de révélation des ligands de la CSL par la méthode CSL-biotinylée/Avidine-phosphatase alcaline en technique pseudo-ELISA
Les puits des plaques de microtitration sont mouillés dans du PBS puis incubés pendant lh à température ordinaire dans de la BSA-HI04 à 3% dans du PBS. On ajoute alors la CSL biotinylée (lng/ml) et l'on laisse réagir pendant 4h avec agitation. On lave avec du PBS pendant 2h toutes les 10 minutes environ. On incube pendant environ 30 min avec de la BSA-HI04 à 3% dans du PBS puis de nouveau pendant 2h toutes les 10 minutes avec du PBS. On incube ensuite pendant 30 min avec de la BSA-HI04 à 3% dans du PBS puis on ajoute une solution diluée 1/1500 d'avidine-phosphatase alcaline. On laisse incuber pendant la nuit à 4"C sous agitation, puis on lave comme ci-dessus. On rince finalement avec du TBS pendant 5 min avant la révélation. On révèle par le réactif p-nitrophényl-phosphatase de la phosphatase alcaline à 37eC. La coloration dans les puits des plaques de microtitration est mesurée à 1'aide du lecteur automatique de plaques ELISA.
7 - Détection histologique des ligands de la CSL
Il est possible de mettre en évidence les ligands de la CSL sur des coupes histologiques de tissus tumoraux ou sur des préparations de cellules tumorales en utilisant la CSL marquée. Ce marquage de la CSL peut être réalisé avec un fluorophore convenable (FITC, TRITC, etc) , soit à un composé coloré (or colloïdal par exemple), soit à l'aide d'une méthode indirecte, utilisant par exemple biotinylation suivie d'une détection de la biotine par l'avidine marquée (par la phosphatase alcaline ou la peroxydase par exemple) . Etant donné que les constituants révélés par la CSL sont essentiellement de nature glycoprotéique, le traitement des préparations par des solvants organiques ne modifie en rien la réaction. De même, les ligands révélés étant de nature glucidique, ils ne sont pas modifiés par les fixateurs de nature aldehydique généralement utilisés pour fixer cellules ou tissus. Par contre, il est très fortement déconseillé d'utiliser des traitements oxydants (periodate) ou acides, susceptibles, eux, de détruire les glycannes reconnus. On peut donc utiliser cette technique sur tous les types de coupes de tissus classiques (paraffine, cryostat, vibratome) sur tissus fixés ou non par les aldéhydes (paraformaldéhyde et glutaraldehyde) .
Protocole préconisé pour la mise en évidence des ligands de la CSL par les techniques histochimiques
Les cellules sont d'abord fixées pendant lh à 4βC avec une solution contenant 4% de paraformaldéhyde et 0,1% de glutaraldehyde dans du tampon PBS. Les cellules sont ensuite incubées avec une solution de CSL biotinylée à une concentration d'environ lμg/ml pendant 4h à température ambiante. Après 2h de lavages dans du PBS, les cellules sont incubées avec l'avidine couplée à la peeoxydase de Raifort (avidine-HRP) à la dilution de 1/100 dans du PBS pendant une nuit à 4βC. Après plusieurs lavages dans du PBS l'activité peroxydasique est révélée par la méthode à la 3,3'-diaminobenzidine (DAB) (Graham et Karnovsky, 1966 J.Histochem. Cytochem. 14 291-302) et les coupes sont observées à l'aide d'un microscope optique Orthoplan Leitz.
Comme variante on pourra employer la CSL préalablement rendue fluorescente selon la technique classique (FITC/Célite) , suivie d'une étape de gel filtration identique à celle utilisée pour purifier la CSL biotinylée. Elle possède l'avantage d'être une méthode directe donc plus rapide. Par contre elle nécessite une observation au microscope à fluorescence.
D) RESULTATS CONCERNANT LA DETECTION DES LIGANDS DE LA CSL DANS LES CELLULES OU TISSUS TUMORAUX
1- Les ligands de la CSL dans les cellules normales et transformées d'origine hépatique
Hépatomes et hépatocytes de souris
Comme le montre la figure 2, il existe des variations qualitatives importantes entre les profils protéiques des cellules tumorales (Al) et les hépatocytes de souris cultivés pendant 3 jours. Mais cette différence est bien moins prononcée que celle qui existe pour les ligands de la CSL. En effet, dans les hépatocytes de souris (figure 2, ligne 1), on distingue une bande majeure de masse moléculaire relative (Mr) voisine de 100 000 et une plus faible de basse Mr 19 900 (ligne 2). D'autres ligands sont également présents mais en quantité infimes. Dans les cellules Al le nombre et la quantité de ligands sont considérablement plus élevés. Les ligands majeurs révélés ont des Mr très variées avec trois groupes majeurs : un groupe de masse Mr (inférieure à 20 000) ,un groupe de Mr voisine de 30 000 et un groupe de Mr supérieure à 50 000. On pourra noter que le ligand de la CSL dans les hépatocytes de souris n'est pas augmenté de façon proportionnelle dans l'hépatome Al puisqu'à ce niveau de Mr, on ne retrouve que des constituants mineurs. Hépatomes et hépatocytes de rats
Pour les hépatocytes de rat (figure 2, lignes 3-5), le profil des ligands de la CSL est plus complexe que celui observé pour les hépatocytes de souris, puisque l'on distingue 5 constituants, de Mr respectives 100 000, 52 300, un triplet vers 33 000, 31 000 et 20 000. Dans leux deux hépatomes examinés, la situation est notablement plus complexe. D'une part la quantité de ces ligands est considérablement augmentée, et, d'autre part, le nombre de ligands majeurs de la CSL est très élevé. Comme pour les hépatomes Al de souris, on distingue trois groupes de ligands intenses, mais on retrouve également pour HTC (figure 2, ligne 5) des bandes importantes situées entre ces zones. H56 (figure 2, ligne 4), par contre, possède un profil tout à fait voisin de celui de 1*hépatome murin Al.
2- Les ligands de la CSL dans les cellules normales et transformées d'origine nerveuse
Cellules d'origine neuronale
. Cellules du neuroblastome différencié ou non
Comme le montre la figure 3 (lignes 3-4) , les cellules de neuroblastome NIE115 non différenciées ou différenciées par le dibutyryl-cAMP, possèdent une quantité et un nombre considérables de ligands de la CSL. Cette situation est très différente de celle que l'on peut trouver pour des neurones. A cet égard, il est très difficile d'obtenir un bon témoin neuronal du neuroblastome NIE115 et c'est la raison pour laquelle il a été comparé à un tissu particulièrement riche en matériel neuronal, le cervelet de rat. Bien que les ligands de la CSL soient présents en grande quantité dans cet organe au 14ème jour postnatal, on constate que pratiquement 5 ligands majeurs connus pour avoir une origine neuronale sont détectés (figure 3, ligne 1) . La situation dans le neuroblastome est donc considérablement modifiée par rapport aux profils observés in vivo dans le système nerveux central. On remarquera que le fait que le clone NIE115 soit différencié sous les effets du dibutyryl-cAMP, ne modifie en rien la complexité du profil des ligands de la CSL. On peut constater (figure 3, lignes 3-4) que cette différenciation s'accompagne d'une légère augmentation de la quantité des ligands de la CSL.
. Localisation de la CSL et de ses ligands dans une cellule tumorale : le neuroblastome NIE115
Il était important, au terme de ces études montrant une augmentation considérable des ligands de la CSL dans des cellules tumorales, de savoir si ces ligands étaient présents à l'intérieur ou à la surface des cellules et si la CSL elle même était présente à la surface cellulaire. Ce type d'étude a été conduit pour ce qui concerne la CSL, sur les cellules d'hépatomes et sur les cellules ovariennes de hamster (CHO) . Une démonstration directe de la présence extracellulaire des ligands de la CSL est possible en utilisant d'une part la CSL biotinylée détectée par 1'avidine couplée à la peroxydase pour les ligands, et d'autre part, les anticorps anti-CSL et la technique immunocytochimique indirecte pour la CSL elle-même.
Cette étude a été réalisée sur le neuroblastome NIE115 qui présentait un intérêt tout particulier dans la mesure où 1'on peut facilement le faire se différencier et donc étudier la CSL et ses ligands dans deux situations où les cellules sont morphologiquement différentes (figure 5) . Comme le montre la figure 6A, la CSL est présente dans les cellules de neuroblastome à la fois à 1*intérieur et à 1'extérieur des cellules. Cette localisation est observée tant dans les cellules NIE115 non différenciées que dans celles qui l'ont été. Dans ce dernier cas, une réactivité notable est associée à des prolongements neuritiques et en particulier aux régions ayant 1•aspect des cônes de croissance. Les arguments pour affirmer cette dualité de localisation intra et extra cellulaire proviennent de l'observation du liseré entourant la cellule (traduisant le marquage de la membrane) et de l'aspect irrégulier, en granulation notamment (traduisant la présence d'antigène dans des vésicules intracellulaires, localisation assez caractéristique de la CSL (Zanetta et coll., 1987, J. Neurochem. 9_: 1250- 1257) .
Pour ce qui concerne les ligands de la CSL (figure 6, B-D) , le marquage est exclusivement de surface en microscopie optique, ce point ayant été vérifié en icroscopie électronique.
Cellules d'origine gliale
Comme le montre la figure 3 (lignes 6-8) , les astrocytes, les oligodendrocytes et les cellules de Schwann immatures possèdent respectivement un nombre limité de ligands de la CSL. Un nombre de ligands de basse Mr (une bande majeure à 21 000 pour les astrocytes et les oligodendrocytes, un triplet vers 21 000 pour les cellules de Schwann) , un groupe de Mr intermédiaire entre 30 000 et 50 000 (une bande majeure à 38 000 pour les cellules de Schwann) et un groupe de haute Mr (comprenant la MAG) . Par contre, pour le glioblastome C6, le profil des ligands de la CSL est extrêmement complexe et leur quantité est très élevée (figure 3, ligne 5).
3- Les ligands de la CSL dans les autres cellules tumorales
Nous avons étudié également des cellules tumorales d'origines diverses notamment d'origine humaine. Les résultats concernant ces cellules sont regroupés dans la figure 4. On notera dans ces cellules la quantité importante des ligands de la CSL et leur hétérogénéité. On pourra constater que les résultats obtenus sur le neuroblastome NIE115 et le glioblastome C6 présentent une extrême similitude de profils, du moins pour ce qui concerne les ligands majeurs de la CSL.
• Les ligands de la CSL dans les tumeurs mammaires humaines
Pour compléter les études précédentes réalisées sur des cellules tumorales cultivées in vivo, une vingtaine de tumeurs humaines malignes du sein ont été étudiées. Il apparaît que la plupart d'entre elles présentent des niveaux importants de ligands de la CSL (figure 7) . D'après l'intensité des marquages obtenus, on peut considérer que le taux de ces ligands est plus faible que dans les autres cellules tumorales examinées. Néanmoins, il est très nettement supérieur à celui que l'on peut obtenir à partir d'un tissu adulte sain (foie, cerveau par exemple) . Selon les tumeurs, il existe des variations qualitatives notables des profils. Ces différences ne sont pas en relation avec ce que les cancérologues définissent comme le "grade" de la tumeur. E) TECHNIQUE DE CLONAGE DE LA CSL
La technique de clonage de la CSL a consisté en un criblage par divers anticorps anti-CSL des produits exprimés par les clones d'une banque cDNA dans ZAP2. Cette banque de cDNA a été fabriquée à partir de mRNA de cervelet de rat de 14 jours. Les anticorps anti-CSL utilisés pour le criblage de la banque sont :
- un anticorps polyclonal dirigé contre la CSL totale (mélange des sous-unités sous-unités 45,33 et 31,5 kDa)
- un anticorps contre la sous-unité 45 kDa purifiée
- un anticorps contre la sous-unité 33 kDa purifiée
- un anticorps contre la sous-unité 31,5 kDa purifiée
- un anticorps monoclonal anti-CSL
- une préparation d'immunoglobuline de patient atteint de sclérose en plaques.
Les anticorps sont préparés selon les techniques classiques, par immunisation d'un animal avec la CSL ou avec une sous-unité de la CSL décrite plus haut. Les anticorps polyclonaux peuvent être récupérés à partir du sérum de l'animal immunisé. Pour produire les anticorps monoclonaux, des cellules spléniques de l'animal immunisé avec la CSL ou une sous-unité sont fusionnées avec des cellules de myélome pour former des hybridomes. Ces hybridomes sont clones et sélectionnés pour leur capacité à reconnaître spécifiquement la CSL ou au moins l'une de ses sous-unités.
Ces anticorps utilisés pour le criblage de la banque permettent de sélectionner les séquences spécifiques de la CSL. F) TRANSFORMATION MALIGNE ET INHIBITEURS DE GLYSOSYLATION
Les conditions de réalisation de ces tests sont les suivantes.
La culture des cellules de glio es C6 a été réalisée dans les conditions précédemment exposées.
Cultures en présence des inhibiteurs agissant sur la
N-glycosylation, 1'externalisation de la glycoprotéine et de la sulfatation
Les cellules ont été dissociées par un traitement mécanique doux et propagées avec une densité de 5 10A cellules par ml dans le milieu de culture contenant des dilutions variables (1/1, 1/3 et 1/10) de solutions des inhibiteurs de la N-glycosylation : la tunicamycine (2,5 μg/ml) , la deoxynojirimycine (2400 μg/ml) , la castanospermine (375 μg/ml), la deoxymannonojirimycine (10 μg/ml) , la swainsonine (1 μg/ml ; Smith et al 1991, J. Neurochem. 57:655-664) ou la monensine (100 μg/ml) (Pimpaneau et al 1989, Glycoconjugate J. :561-574)). Pour le chlorate de sodium, les concentrations finales dans le milieu de culture étaient 10 mM, 5 mM, 1 mM et 0,1 mM (Poduslo, 1990, J. Biol. Chem. 265:3719-3725) . Pour les expérimentations biochimiques et histologiques, les cellules ont été maintenues pendant deux jours en culture sans modification du milieu.
Traitement des cellules avec les fragments Fab d'anticorps anti-CSL et d'anticorps anti-Rl
Pour réaliser un test concernant l'effet des fragments Fab préparés à partir d'anticorps polyclonaux anti-CSL et anti-Rl de lapin (Lehmann et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6455-6459) , 100 μg/ml de
Fab ont été ajoutés aux cultures au moment de la période de 1'ensemencement des cellules et la prolifération a été suivie par incorporation de thymidine.
Traitement des cellules pour mesurer 1'incorporation de thymidine
Pour 1'incorporation de 3H-thymidine les cellules ont été maintenues en culture pendant 24 heures, puis 9,25 kBq de 3H-thymidine ont été ajoutés et l'incorporation a continué pendant 4 heures de plus. Les plaques de culture de cellules (contenant 0,5 ml de milieu de culture) ont été refroidies sur la glace et 500 μl d'acide perchlorique 1,2 M prérefroidi a été ajouté. Les plaques ont été gratées avec un "policeman" possédant un embout en caoutchouc et la suspension a été transférée dans des tubes de verre conique pour la centrifugation, de 5 ml. Les plaques de culture ont été lavées trois fois avec 1 ml d'acide perchlorique 0,6 M. Les surnageants combinés ont été laissés pendant 30 minutes à 4βC puis centrifugés (30 minutes à 2000 g). Le surnageant a été éliminé et le culot a été dissous dans 400 μl de NaOH 0,1 M. Les échantillons ont été précipités à nouveau en ajoutant 3,6 ml d'acide perchlorique 0,6 M. Après avoir reposé pendant 1 heure à 4"C, les échantillons ont été centrifugés comme précédemment et le surnageant a été séparé. Après séchage, les échantillons ont été dissous dans 500 μl de SDS 1% tamponné avec un tampon Tris-HCl 50 mM à pH 8,2. Des échantillons ont été transférés dans un récipient pour la scintillation, 15 ml de liquide de scintillation Biofluor ont été ajoutés et la radioactivité a été comptée dans un compteur Beckmann. Toutes les expériences ont été réalisées en trois exemplaires. Les témoins ont été obtenus en ajoutant de la thymidine marquée dans des cultures non marquées et en ajoutant immédiatement du perchlorate.
Traitements des échantillons pour les études d'électrophorèse.
Les cultures ont été lavées avec précaution trois fois avec de grands volumes de tampon de phosphate de sodium 25 mM, à pH 7,2 contenant 150 mM NaCl (PBS), les cellules ont été suspendues à une concentration de 2 mg/ml de protéine (Lowry et al, 1951 précités) dans 1% de SDS et homogénéisées avec un homogénéiseur Potter Elvejheim. Les échantillons ont été ramenés à une concentration de 1 mg/ml de protéine par addition d'un volume de tampon de dissociation de Laemmli (Laemmli 1970 précité) et portés à ébullition pendant 5 minutes avant 1'électrophorèse.
Techniques d'électrophorèse
On se reportera pour la description de cette technique à la partie C)3) ci-dessus.
Coloration des ligands de la CSL sur des empreintes (blots) avec la CSL biotinylée
Préparation de CSL biotinylée
Pour la biotinylation, la CSL purifiée par chromatographie d'immunoaffinité a été dialysée de façon exhaustive contre un tampon PBS (25 mM de tampon de phosphate de sodium, pH 7,2 contenant 15 mM de chlorure de sodium) . La solution de lectine a été ajustée à pH 9,0 par addition de NaOH 0,1 M et soumise à réaction avec un ester de N-hydroxysuccinimide biotine pendant 1 heure à 4βC. Le réactif en excès a été neutralisé par l'addition de 0,2 M de glycine dans 0,1 M de phosphate de disodium. La CSL biotinylée a été séparée des composés biotinylés de bas poids moléculaire par filtration sur gel sur une colonne de 7,5 x l cm d'Ultrogel AcA202® équilibrée avec un tampon PBS contenant 0,1% de Triton X-100. La CSL biotinylée a été récupérée, on a ajouté du pBSA jusqu'à obtention d'une concentration finale de 0,1% de CSL et la CSL a été conservée en petites parties aliquotes à -70"C jusqu'à utilisation.
Coloration des ligands de la CSL sur les empreintes
Les filtres de nitrocellulose ont été saturés par incubation avec 3% de pBSA dans un tampon PBS sous agitation lente pendant 1 heure à température ambiante, suivie par l'addition de CSL biotinylée (concentration finale 5 ng/ml) et incubation pendant la nuit à 4"C. Les filtres ont été lavés chaque 10 minutes pendant 3 heures avec du PBS, puis incubés pendant 1 heure dans 3% de pBSA dans le PBS, puis lavés à nouveau chaque 10 minutes pendant une période de 3 heures avec du PBS. Les filtres ont été incubés pendant 30 minutes avec pBSA puis la phosphatase alcaline-avidine (avidine-AKP) ou la streptavidine-AKP (1/1500 en dilution finale) a été ajoutée et l'incubation a été réalisée toute la nuit à 4βC. Après des lavages répétés, comme ci-dessus, 1*avidine fixée a été révélée en utilisant le réactif NBT-BCIP (Leary et al, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8O:4045-4049) . Les témoins ont été réalisés en omettant la CSL biotinylée ou en ajoutant du mannose (0,3 M) pendant l'incubation avec la CSL biotinylée et pendant les trois premiers lavages successifs, ou en utilisant de la CSL biotinylée dénaturée (15 minutes à 100βC) . Histochimie d'affinité pour les ligands de la CSL sur les cellules en culture
Les cellules en culture sur des lamelles Chamber ("Chamber Slides") ont été fixées avec un mélange de 4% de paraformaldéhyde, 0,1% de glutaraldehyde (Kuchler et al, 1988, Dev. Neurosci. JLO:199-212) pendant une nuit à 4°C. Elles ont été rincées plusieurs fois dans du PBS avant coloration des ligands de la CSL ou pour coloration avec le bleu de toluidine. Pour la détection des ligands de la CSL, les cellules fixées ont été incubées avec 3% de solution de pBSA dans le PBS pendant 30 minutes à température ambiante puis la CSL biotinylée a été ajoutée (5 ng/ml à la concentration finale) . Après incubation pendant 4 heures à température ambiante, les cultures ont été lavées dans le PBS pendant 4 heures puis de 1'avidine-HRP (lOOμg/ml dans le PBS) a été ajoutée et incubée toute la nuit à 4βC. Après rinçage, dans les conditions précédemment décrites, 1'avidine-HRP liée a été révélée en utilisant la méthode à la diaminobenzidine (Graham et Karnovsky, 1966, J. Histochem. Cytochem. 14_:291-302) . Les contrôles ont été obtenus en omettant 1'incubation avec la CSL biotinylée. Des cellules ont été observées avec un microscope Leitz Orthoplan.
Immunodétection de la CSL sur des cultures cellulaires ou sur des empreintes
La CSL a été localisée dans les cellules de gliomes C6 par mise en oeuvre d'une technique indirecte à 1'immunoperoxidase selon la description précédemment donnée par Kuchler et al, 1988. La CSL a été détectée par immunoempreinte sur les mêmes échantillons que ceux utilisés pour la détection des ligands de la CSL. Deux anticorps ont été utilisés dans ces études. Un anticorps polyclonal de lapin anti-CSL (Zanetta et al, 1987, J. Neuroche . 9_:1250-1257) utilisé à une dilution de 1/250 et/ou un anticorps monoclonal anti- CSL produit chez la souris désigné par D2.11B et décrit plus haut sous forme d'ascite à une dilution de 1/1000.
RESULTATS
Le premier effet de certains inhibiteurs sur les cultures de cellules de gliomes C6 concerne la densité cellulaire et la morphologie. Les effets sur la morphologie cellulaire peuvent être observés après fixation avec un milieu aldehydique suivi par une coloration au bleu de toluidine. Les cellules témoin (non soumises à réaction) présentent une population cellulaire relativement homogène avec deux catégories : des cellules de forme ronde et des cellules bipolaires. Avec la tunicamycine, la prolifération des cellules a cessé et les rares cellules sont soit larges et plates, soit rondes. Avec la deoxynojirimycine et la castanospermine, en fonction de la concentration de l'inhibiteur, la densité cellulaire est beaucoup plus faible comparée à celle des cellules contrôle et la population de cellules est divisée en deux groupes : des cellules bipolaires allongées avec des parties fines et ramifiées et des cellules plates et larges occasionnellement multinucléées. Avec la deoxymanno- nojirimycine et la swainsonine, à toutes les concentrations testées, la proportion de cellules rondes et bipolaires était analogue à celle des cellules contrôle C6. La monensine et le chlorure ont donné, en fonction de la concentration, des images similaires à celles observées avec la castanospermine et la deoxynojirimycine. Les cellules étaient soit plates soit ramifiées. La densité cellulaire était réduite en fonction de la concentration de l'inhibiteur.
Effets des inhibiteurs de glycosylation et du transport de la glycoprotéine et de la sulfatation sur la prolifération des cellules de gliomes C6
La prolifération cellulaire réduite sous l'effet de certains des inhibiteurs, observés au microscope, a été mesurée par des études quantitatives en utilisant l'incorporation de thymidine marquée. Les inhibiteurs de N-glycosylation, d'externalisation et de sulfatation entraînent des effets variables sur la prolifération cellulaire. La tunicamycine, la deoxynojirimycine, la castanospermine, la monensine et le chlorate de sodium montrent une inhibition importante, dépendante de la concentration, de la prolifération des cellules C6. L'incorporation de thymidine a été réduite jusqu'à 78% avec la tunicamycine, 45% avec la deoxynojirimycine, 46% avec la castanospermine, 64% avec la monensine et 47% avec le chlorate de sodium. Au contraire la deoxymannonojirimycine et la swainsonine, à un taux de concentration utilisé pour l'inhibition de la maturation des N-glycannes n'ont pas affecté la prolifération cellulaire.
Les ligands glycoprotéiques de la CSL sont quantitativement différemment affectés par les inhibiteurs de glycosylation, d'exportation de glycoprotéines et de sulfatation
Par des étapes de séparation électrophorétique de protéines produites au niveau de la culture cellulaire, puis électrotransfert sur nitrocellulose et détection spécifique en utilisant la CSL biotinylée suivie d'un traitement par 1'avidine-AKP ou la streptavidine-AKP, on a mis en évidence un comportement différent des ligands de la CSL sous 1'effet des différents inhibiteurs de la glycosylation. Cette observation a montré que ces ligands sont essentiellement des N- glycannes. La tunicamycine qui inhibe la synthèse du glycolipide polyisoprenique intermédiaire, inhibe presque complètement la synthèse de composés se liant à la CSL. Les inhibiteurs affectant la maturation des N- glycannes de la glycoprotéine conduisent à plusieurs shémas. La deoxynojirimycine et la castanospermine (qui inhibent la glucosidase I et la glucosidase II conduisant au groupement Glc3Man9GlcNAc2 et Glc2Man7- 9GlcNAc2N-glycannes, respectivement (Kornfeld et Kornfeld, 1985, Annu. Rev. Bioche . 5_4_:631-664 ; Elbein 1990, J. Biol. Chem. 265:15599-15605) ont inhibé de façon drastique la synthèse des glycannes se liant à la CSL. L'effet n'était pas dû à l'absence totale de synthèse de la chaîne polypeptidique portant ces glycannes puisque les mêmes composés avec un poids moléculaire identique ont été détectés mais en quantité très inférieure. Ceci indique que la présence de glucose à la position terminale dans la structure des N-glycannes est suffisante pour inhiber la fixation à la CSL. La deoxymannonojirimycine, qui inhibe la mannosidase I et donne lieu à des Man7-9GlcNAc2 N- glycannes (Kornfeld précité ; Elbein précité) , n'a pas réduit la quantité et n'a pas modifié le profil des ligands de la CSL en comparaison avec le contrôle. La swainsonine, qui inhibe la mannosidase II de Golgi et donne lieu à un hybride et à des N-glycannes oligomannosidiques, n'a pas réduit la quantité de ligands de la CSL. La omensine qui inhibe l'exportation des glycoprotéines et leur accumulation dans le Golgi n'a pas modifié la quantité de glycannes se liant à la CSL ni modifié leur profil. Il apparaît donc que les ligands de la CSL sont soit un hybride soit des N-glycannes oligomannosidiques.
La réduction des ligands de la CSL en fonction de la concentration, après traitement des cellules C6 avec du chlorate de sodium montre que le groupement sulfate était soit important pour la synthèse des glycoprotéines se liant à la CSL et/ou la synthèse des glycannes se liant à la CSL ou que le sulfate était un déterminant important dans le glycanne se liant à la CSL pour la reconnaissance par la lectine CSL.
Effets des inhibiteurs de glycosylation, du transport des glycoprotéines et de la sulfatation sur l'expression des ligands de la CSL à la surface des cellules de gliomes C6
Des observations en histochimie ont été réalisées ; elles permettent de constater que le niveau de ligands de CSL observée sur les empreintes est apparenté à celui observé en histochimie en utilisant la CSL biotinylée à l'exception des résultats obtenus avec la monensine. Dans le cas d'utilisation de la monensine, les ligands n'ont pas été exprimés à la surface de la cellule mais se sont accumulés intracellulairement. En combinant les résultats de l'analyse des empreintes et de la localisation histσchimique des ligands de la CSL sur les cellules C6 traitées avec la monensine, il apparaît que la surexpression des ligands de la CSL à la surface de la cellule était liée à l'activité de forte prolifération des cellules du gliome C6. La CSL présente au niveau des cellules C6 n'est pas affectée par les inhibiteurs de la N-glycosylation dans sa synthèse et son externalisation
La CSL a été localisée en utilisant la technique indirecte à 1'immunoperoxidase appliquée sur les cellules C6, fixée dans des conditions identiques à celles des études histochimiques des ligands de la CSL. La CSL a été détectée dans des cellules de gliomes C6. Sa concentration intracellulaire diffuse était de façon significative plus forte dans les cellules non différenciées (cellules de forme ronde) que dans les autres cellules et n'était pas affectée de façon significative par les différents inhibiteurs. Dans toutes les conditions, 1•immunocoloration n'est pas devenue homogène dans les cellules postmitotiques puisqu'elle était particulièrement concentrée dans les structures oblongues et sphériques (0,5 à 3 μm de diamètre) . Ces structures fortement immunocolorées étaient particulièrement fréquentes à la fin de la maturation cellulaire mais également dans le corps de la cellule. Ces structures ont été en partie trouvées dans 1•espace extracellulaire sans relation apparente avec les cellules. Ce processus, représentant probablement 1'externalisation de la CSL n'a pas été modifié en utilisant les différents inhibiteurs.
Effets des fragments Fab d'anticorps anti-CSL et anti-Rl sur la prolifération de cellules C6
Cet effet a été étudié et on a montré que les fragments Fab anti-CSL présentaient un effet d'inhibition significative sur la prolifération des cellules C6. 30% d'inhibition ont été obtenus à une concentration de 100 μg/ml. Cet effet était significativement différent de l'effet des fragments Fab dérivés des anticorps anti-Rl utilisés à titre de contrôle. Ceci constitue un contrôle intéressant pour déterminer la fixation non spécifique des fragments Fab.
Lorsque les cellules du gliome C6 sont traitées par la tunicamycine, bloquant la synthèse de l'intermédiaire lipidique intervenant dans la biosynthèse des N-glycannes, leur prolifération est totalement bloquée. La castanospermine et la deoxynoji- rimycine, deux inhibiteurs de glycosylation bloquant respectivement les glucosidases I et II et donc l'élimination des résidus de glucose des structures Glc3Man9GlcNAc2, inhibent la prolifération des cellules et conduisent simultanément à leur différentiation morphologique. Au contraire, la deoxymannonojirimycine et la swainsonine, inhibiteurs des annosidases golgiennes qui orientent la biosynthèse des glycannes vers les types oligomannosidiques ou hybrides, n'influent pas sur cette prolifération. En fait, on assiste dans les trois permiers cas à une diminution dramatique des ligands de la CSL (par affino-réplique ou par affino-cytochi ie avec de la CSL biotinylée) . Par contre, dans les deux derniers, comme chez le témoin, ces ligands sont présents en grande quantité à la surface des cellules.
En outre il apparaît que ces ligands doivent nécessairement être exprimés à la surface cellulaire. En effet, lorsque les cellules sont traitées par la momensine, qui bloque le transport des glycoprotéines vers la membrane, on assiste, parallèlement à l'accumulation intracellulaire de ligands, à une inhibition de la prolifération et à une nette augmentation de la différentiation morphologique des cellules. Comme la CSL est exprimée de façon similaire dans tous les cas, ces résultats sont en parfait accord avec l'hypothèse du signal non-sens.
Enfin, et ceci est un argument particulièrement important pour justifier le mécanisme que nous proposons, le chlorate de sodium (un inhibiteur de la sulfatation) inhibe à très faible concentration la prolifération des cellules C6 (avec une différentiation morphologique concomitante) .
On a donc montré l'existence d'une relation claire entre la présence d'une quantité importante de ligands de la CSL à la surface cellulaire et la capacité proliférative de ces cellules malignes. Ces résultats sont en outre en accord avec le fait que le ligand privilégié de la CSL est le glycanne de la PO portant l'enchaînement glucuronique-3-sulfate, dont la structure a été déterminée par Kitamura et al (Abstr. Jap. Neurochem. Soc. p. 189) .

Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1. Utilisation pour la détermination in vitro de présence de cellules malignes dans un échantillon biologique donné, de lectines endogènes intervenant dans les phénomènes d'adhésion et/ou reconnaissance intercellulaires ayant une affinité spécifique indépendante du calcium, pour un site impliquant des résidus mannose au niveau de ligands glycanniques, cette lectine présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL, ou des fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques.
2. Utilisation d'une lectine endogène selon la revendication 1, caractérisée en ce que cette lectine est la CSL sous forme purifiée et active ou en ce qu'il s'agit de fragments de la CSL ou de la CSL modifiée dès lors que la parenté fonctionnelle avec la CSL s'agissant de l'affinité indépendante du calcium vis à vis de ligands glycanniques est conservée.
3. Utilisation d'une lectine endogène selon la revendication 1, caractérisée en ce que cette lectine est RI, ou un fragment de RI ou RI modifiée dès lors que la parenté fonctionnelle avec RI s'agissant de l'affinité indépendante du calcium vis à vis de ligands glycanniques est conservée.
4. Utilisation d'une lectine ou d'un fragment de lectine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que cette lectine ou ce fragment de lectine est marqué par exemple par un isotope radioactif, un marqueur fluorescent ou un marqueur d'amplification.
5. Kit pour la détermination in vitro dans un échantillon biologique donné, de la présence de cellules malignes, caractérisé en ce qu'il comprend une lectine endogène intervenant dans les réactions d'adhésion et/ou de reconnaissance intercellulaires ayant une affinité indépendante du calcium pour un site impliquant des résidus mannose au niveau de ligands glycanniques, cette lectine présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL, ou des fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques, éventuellement marquée.
6. Kit selon la revendication 1, caractérisé en ce que la lectine est la CSL sous forme purifiée et active.
7. Kit selon la revendication 1, caractérisé en ce que la lectine est la lectine embranaire RI sous forme purifiée et active.
8. Kit selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que l'échantillon biologique susceptible de contenir des cellules tumorales, est constitué par un extrait tissulaire, des cellules isolées, une coupe histologique de tissu ou une lignée cellulaire.
9. Kit selon 1'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que la lectine est marquée par un marqueur radioactif, par exemple l'iode.
10. Kit selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que la lectine est marquée par un marqueur fluorescent, par exemple le fluorophore.
11. Kit selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que la lectine est marquée par un système d'amplification, par exemple la biotine.
12. Procédé pour la détermination in vitro dans un échantillon biologique donné, de la présence de cellules malignes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en contact de l'échantillon biologique testé, avec une quantité déterminée de lectines endogènes intervenant dans les phénomènes d'adhésion et/ou de reconnaissance intercellulaires, ayant une affinité indépendante du calcium pour un site impliquant des résidus mannose au niveau de ligands glycanniques, cette lectine présentant une parenté immunologique et/ou structurale avec la CSL, ou des fragments de ces lectines, dès lors que ces fragments conservent l'affinité de la lectine d'origine, vis à vis des ligands glycanniques, cette lectine étant en outre marquée, dans des conditions permettant la réaction de ladite lectine marquée avec des ligands glycanniques;
- élimination de la lectine n'ayant pas réagi avec les ligands;
- révélation de la présence de complexes du type lectine-ligand, caractéristiques de la malignité cellulaire; détermination de la quantité de ligands glycanniques ayant réagi.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la lectine endogène est la CSL purifiée, active.
14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la lectine endogène est RI.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que l'échantillon biologique testé est constitué par des cellules tumorales, un extrait tumoral, le cas échéant préparé sous la forme d'une coupe histologique.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que les cellules tumorales ou 1'extrait de tumeur sont solubilisés.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que l'échantillon biologique testé est préalablement fractionné par électrophorèse et transféré par électro¬ transfert.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est traité afin de dissoudre les protéines.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16, caractérisé en ce que l'échantillon contenant les protéines dissoutes est déposé sur un filtre, par exemple un filtre de nitrocellulose.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16, caractérisé en que l'échantillon contenant les protéines dissoutes, est déposé sur une plaque de type ELISA.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 20, caractérisé en ce que les lectines sont marquées par un radioisotope, par exemple l'iode.
22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 20, caractérisé en ce que les lectines sont marquées par un marqueur fluorescent, par exemple le fluorophore.
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 20, caractérisé en ce que les lectines sont marquées par un marqueur d'amplification tel que la biotine.
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