Immunologisches Bestimmungsverfahren zur Bestimmung von Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten sowie Kit zur
Durchführung des Verfahrens
Die Erfindung betrifft ein immunologisches Bestimmungsverfahren zur Bestimmung von Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere von Autoantikörpern, deren Nachweis die Diagnose einer Autoimmunerkrankung ermöglicht.
Immunologische Bestimmungsverfahren spielen in zahlreichen Varianten eine sehr wesentliche Rolle in der medizinischen Diagnostik. Neben derartigen Bestimmungsverfahren, die auf die qualitative und/oder quantitative Bestimmung von Antigenen oder Haptenen, z.B. Hormonen, abzielen, gibt es auch zahlreiche derartige Bestimmungsverfahren zur Bestimmung von Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere humanen Seren. Antikörper sind Eiweißkörper, die als Immunglobuline (Ig) bezeichnet werden und die vom Körper als Reaktion auf ein
Antigen gebildet werden. Da Antigene normalerweise zahlreiche antigene Determinanten aufweisen, sind Antikörper polyklonaler Natur, stellen also eine Population von Eiweißkörpern mit unterschiedlichen Bindungseigenschaften gegenüber dem Antigen, gegen das sie gerichtet sind, dar. Sie werden normalerweise gegen körperfremde Antigene gebildet, um den Körper gegen Substanzen zu schützen, die entsprechende antigene Determinanten aufweisen. Erkennt das Immunsystem des Körpers fälschlich bestimmte körpereigene Zellen oder Zellstrukturen als fremd, können aber auch Antikörper gegen Antigendeterminanten körpereigener Elemente gebildet werden. Derartige körpereigene Elemente werden dann als Autoantigene bezeichnet, und die gegen sie gebildeten Antikörper als Autoantikörper.
Bekannte Bestimmungsverfahren für Antikörper verwirklichen in der einen oder anderen Form verschiedene Grundprinzipien, von denen zwei beispielsweise in der US-PS B1
3 654090 in Spalte 3, oben, schematisch dargestellt sind. Gemäß einer Variante, die dem klassischen Radioimmunoassay (RIA) entspricht, wird ein Unterschuß eines immobilisierten Antigens verwendet, und der zu untersuchenden Probe wird eine markierte Form des zu bestimmenden Antikörpers in einer bekannten Menge zugesetzt. Aus dem Grad der Bindung des markierten Antikörpers an das immobilisierte Antigen kann auf die Anwesenheit bzw. Konzentration des gesuchten Antikörpers zurückgeschlossen werden. Für diesen nach dem Konkurrenzprinzip arbeitenden Test wird das Antigen in hochreiner Form benötigt.
Gemäß einem zweiten Verfahrensprinzip wird so vorgegangen, daß eine bekannte Menge des zu bestimmenden Antikörpers oder eines geeigneten Derivats davon an einem festen Träger immobilisiert wird, und man läßt dann den in der zu untersuchenden Probe vorhandenen Antikörper und den immobilisierten Antikörper um ein dem Reaktionssystem zugesetztes markiertes Antigen konkurrieren. Die Anwesenheit bzw. Menge des
zu bestimmenden Antikörpers ergibt sich aus der Verminderung der Bindung des markierten Antigens an den immobilisierten Antikörper und damit an die feste Phase. Bei der zuletzt genannten Art der Bestimmung wird eine markierte Form des zugehörigen hochreinen Antigens benötigt, und der zu bestimmende Antikörper und der immobilisierte Antikörper müssen in solchen Mengen vorliegen, daß es, gegebenenfalls unter Berücksichtigung nicht völlig identischer Affinitäten zu dem markierten Antigen, zu einer wirksamen Konkurrenz zwischen dem immobilisierten Antikörper und dem Antikörper in der zu untersuchenden Probe kommen kann.
Gemäß einem weiteren Verfahrensprinzip wird in analoger Vorgehensweise zu dem für die Antigenbestimmung gut bekannten Sandwich-Test zuerst ein Überschuß eines Antigens, üblicherweise in immobilisierter Form, vorgelegt, durch das die Gesamtmenge des zu bestimmenden Antikörpers gebunden wird, und durch eine nachfolgende zweite immunologische Umsetzung mit einem zweiten markierten "Antigen" gegen den im ersten Schritt gebundenen Antikörper wird dieser unter Ausbildung eines sandwichartigen Immunkomplexes markiert. Das zweite "Antigen" ist dabei häufig ein anti-Antikörper (Doppelantikörperverfahren), oder es wird zur Markierung das markierte sog. Protein A eingesetzt, ein aus Bakterien gewonnenes Protein, das unspezifisch an zahlreiche IgG-Antikörper bindet. Bei diesem Verfahren werden solche Mengen an Antigen benötigt, daß die Bindungskapazität zur Bindung aller in der Probe vorhandenen Antikörper ausreicht. Muß mit größeren Mengen der zu bestimmenden Antikörper gerechnet werden, müssen die Proben daher in der Regel mehrfach verdünnt werden, bevor sie in den Test eingesetzt werden können. Das gilt insbesondere für die aus praktischen Gründen häufig zu bevorzugende "coated tube"-Technik und Mikrotiterplatten-Technik, bei der ein mit Antigen beschichtetes
Teströhrchen nur eine Bindungskapazität von ca. 1-2 μg humanen Antikörpern aufweist.
Bei der Bestimmung von Antikörpern gegen körperfremde Antigene lassen sich die Funktionsvoraussetzungen für die verschiedenen Tests häufig ohne größere Schwierigkeiten erfüllen. Die Antikörperkonzentrationen gegen körperfremde Antigene sind im Normalfalle relativ niedrig, und die zugehörigen Antigene oder auch Haptene können häufig in ausreichenden Mengen auf chemischem oder biotechnologischem Wege synthetisiert oder aus natürlichem Material isoliert und angereichert werden.
Beabsichtigt man jedoch, nach einem der geschilderten Verfahrensprinzipien Autoantikörper zu bestimmen, so stößt man auf eine Reihe von teilweise erheblichen Schwierigkeiten, und zwar sowohl aufgrund der auftretenden Autoantikörperkonzentrationen als auch aufgrund der Natur der Autoantigene.
Die Bestimmung von Autoantikörpern ist für den Nachweis des Vorliegens einer Autoimmunerkrankung sehr wichtig, insbesondere um die beobachteten Krankheitserscheinungen richtig zu interpretieren und evtl. schädliche Falschbehandlungen zu vermeiden. Bekannte Autoimmunerkrankungen, die teilweise außerordentlich schwerer Natur sind, sind beispielsweise die rheumatoide Arthritis, der Diabetes mellitus Typ 1, die Myasthenia gravis sowie einige mit der Schilddrüse assoziierte Autoimmunerkrankungen, wie die Basedow-Hyperthyreose (auch Graves-Krankheit genannt), die Myxödemanämie und die Hashimoto Thyreoiditis. Als Autoantigene wirken im Falle der Schilddrüsen-Autoimmunerkrankungen je nach Art der Krankheit das Thyreoglobulin, der TSH-Rezeptor und/oder die Schilddrüsenperoxidase (TPO), wobei letztere nach jüngeren Erkenntnissen mit dem sogenannten mikrosomalen Antigen identisch ist. Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend insbesondere im Hinblick auf die Bestimmung von Schilddrüsenautoantikörpern, insbesondere von Antikörpern gegen hTPO, beschrieben, das der Erfindung zugrundeliegende neue Verfahrensprinzip ist jedoch nicht auf diese speziellen Bestim
mungen beschränkt, sondern kann nutzbringend auch zur Bestimmung anderer Autoantikörper angewandt werden. Es kann ferner im Einzelfall auch bei der Bestimmung anderer Antikörper Vorteile gegenüber den nach den bekannten Verfahrensprinzipien arbeitenden Bestimmungsverfahren bieten.
Zusammenfassungen des derzeitigen Erkenntnisstandes auf dem Gebiet der Schilddrüsen-Autoimmunerkrankungen finden sich in der wissenschaftlichen Literatur beispielsweise in dem
Artikel von Marian Ludgate und Gilbert Vassart in: Autoimmunity, 1990, Band 7, Seiten 201-211; ferner in dem Review von Jadwiga Furmaniak und Bernard Rees Smith in: Autoimmunity, 1990, Band 7, Seiten 63-80; sowie in dem Artikel von P.-M. Schumm-Drager, H.J.C. Wenisch in: Akt. Endokr. Stoffw. 10 (1989), Seiten 9-102 (Sonderheft), wo ein Überblick über die Methoden zum Nachweis von Schilddrüsenautoantikörpern gegeben wird.
Die immundiagnostische Bestimmung von Schilddrüsen-Autoantikörpern bzw. Autoantikörpern generell unter sinngemäßer Anwendung eines der eingangs genannten Bestimmungstypen stößt auf die grundsätzliche Schwierigkeit, daß die Autoantikörper sehr häufig gegen Autoantigene gerichtet sind, die in der Zellmembran verankert sind und in der für die übliche Verfahrensdurchführung erforderlichen hohen Reinheit und Menge nur schwer erhältlich sind. Im Falle der menschlichen Schilddrüsenperoxidase (hTPO), eines Enzyms, das als Autoantigen für die Hashimoto Thyreoiditis verantwortlich ist, handelt es sich beispielsweise um ein glycosyliertes Hämoprotein, das an die Schilddrüsenmembranen gebunden ist. Seine antigenen Eigenschaften, einschließlich der vorhandenen Typen von Epitopen auf seiner Oberfläche, sind beschrieben in dem Artikel von P. Carayon et al. in: Endocrinology, Vol. 125, No.3, S. 1211 bis 1218. Um für die immundiagnostisehen Bestimmungsverfahren nach den bekannten VerfahrensPrinzipien diese Schilddrüsenperoxidase in ausreichender Reinheit und Menge als Antigen zur Verfügung zu haben, muß
die Schilddrüsenperoxidase auf proteolytischem Wege oder mit Hilfe von Detergenzien aus der Membran herausgelöst und über Immunadsorbenzien oder mittels konventioneller Chromatographiemethoden an unterschiedlichen Trennphasen gereinigt werden, z.B. mittels Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Chromatographie über hydrophobe Interaktionen, Chromatographie über aromatische Interaktionen, Adsorptionschromatographie und Chromatographie über Concanavalin A. Diese Verfahren sind aufwendig und mit dem Risiko ungewollter Veränderungen des zu isolierenden Enzyms sowie starkem Materialverlust verbunden. Hochgereinigte native Schilddrüsenperoxidase (TPO) ist daher nur in geringen Mengen und zu hohen Preisen verfügbar. Als Alternative zur Isolierung der Schilddrüsenperoxidase aus Schilddrüsen wurden daher auch schon Versuche unternommen bzw. Verfahren entwickelt, nach denen TPO auf gentechnologischem Wege erzeugbar ist. Auch die so gewonnene TPO ist jedoch nur in begrenzten
Mengen und zu hohen Preisen verfügbar, und die Identität des gentechnologisch gewonnenen Materials mit der natürlichen Schilddrüsenperoxidase, insbesondere was die antigenen
Eigenschaften angeht, ist nicht in jedem Falle garantiert.
Eine weitere Schwierigkeit ergibt sich ferner daraus, daß die antigenen Eigenschaften der TPO sehr stark durch chemisehe Einwirkungen beeinträchtigt werden können, insbesondere wenn dadurch die dreidimensionale Struktur verändert wird und/oder die Disulfidbrücken geöffnet werden (vgl. den genannten Artikel von P. Carayon). Um TPO jedoch als markiertes Antigen in dem klassischen Verfahren zur Antikörperbestimmung einsetzen zu können, muß an das TPO ein Markierungsanteil chemisch gebunden werden. Zusätzlich zu der Schwierigkeit der Gewinnung von reinem TPO besteht auf dieser Stufe das Risiko, daß durch die mit der Markierung verbundenen Umsetzungen die antigenen Eigenschaften der TPO so beeinflußt werden, daß sie nicht mehr der nativen TPO entspricht und daher auch als Antigen zum Nachweis von Autoantikörpern nur noch bedingt geeignet ist. Beispielsweise
können die durch die Isolierung und/oder Markierung der TPO bewirkten Veränderungen dazu führen, daß nur noch ein Teil der polyklonalen TPO-Autoantikörper mit einer derartigen markierten TPO reagiert.
Um die mit der Isolierung und Markierung von TPO verbundenen Probleme wenigstens teilweise zu umgehen, wurde als Abwandlung des eingangs geschilderten Sandwich-Tests zur Antikörperbestimmung auch schon ein Test entwickelt, bei dem als immobilisertes Antigen ein nicht hochgereinigt, sondern roh eingesetztes TPO verwendet wird. Bei diesem Test besteht jedoch die Gefahr, daß in dem immobilisierten rohen TPO noch andere Substanzen mit antigenen Eigenschaften vorhanden sind, die zu einer Immobilisierung anderer als der gesuchten Antikörper führen, und daß diese dann bei der nachfolgenden, relativ unspezifischen Markierung nach einem Doppelantikörperverfahren oder durch markiertes Protein A markiert werden und falsche positive Ergebnisse vortäuschen. Eher unter praktischen Gesichtspunkten, insbesondere im Hinblick auf den erforderlichen Arbeitsaufwand und die erzielbare Bestimmungsgenauigkeit, stellt es bei der Bestimmung von Autoantikörpern ein weiteres Problem dar, daß diese im Falle des Vorliegens einer Autoimmunkrankheit in außerordentlich hohen Mengen in den biologischen Flüssigkeiten, insbesonderen den Patientenseren, vorkommen. Bei einem
Probenvolumen von 20 μl Serum ist z.B. mit bis zu 20 μg humanen Autoantikörpern zu rechnen. Um sie bestimmen zu können, insbesondere nach der "coated tube"-Technik oder Mikrotiterplatten-Technik, ist es daher normalerweise erforderlich, die Patientenseren mehrfach zu verdünnen, was arbeits- und zeitaufwendig ist und eine zusätzliche Fehlerquelle darstellt. Angesichts der geschilderten Schwierigkeiten einer Bestimmung von Autoantikörpern nach den bekannten immundiagnostischen Bestimmungsverfahren besteht daher ein dringender
Bedarf nach einem neuartigen Verfahren zur immundiagnostischen Bestimmung von Autoantikörpern in biologischen Flüssigkeiten, das eine sichere qualitative Bestimmung von Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten ermöglicht, das durch geeignete Eichung und Optimierung der Verfahrensparameter auch zur zuverlässigen quantitativen Bestimmung von Antikörpern geeignet ist, bei dem unverdünnte Seren eingesetzt werden können und bei dem es nicht nötig ist, hochgereinigte Antigene zu den zu bestimmenden Antikörpern in nennenswerten Mengen einzusetzen.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein derartiges Verfahren zu schaffen. Diese Aufgabe wird durch ein immunologisches Bestimmungsverfahren gelöst, wie es im Patentanspruch 1 dargestellt wird.
Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen enthalten.
Bei dem erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren wird so vorgegangen, daß zum Nachweis von Antikörpern (Ak), insbesondere von Autoantikörpern, die Störung der Ausbildung eines Sandwichkomplexes aus einem ersten immobilisierten Antikörper (Akimm), einem zugesetzten Antigen (Ag), insbesondere rohen Antigen, und einem weiteren Antikörper (Ak*), der eine nachweisbare Markierung trägt, festgestellt wird, die auf die Anwesenheit der zu bestimmenden Antikörper (Ak) in der biologischen Flüssigkeit zurückzuführen ist. Die Behinderung der Ausbildung eines Sandwichkomplexes der genannten Art äußerst sich in einer Verminderung der Bindung des markierten Antikörpers (Ak*) an die feste Phase. Die Störung der Ausbildung des Sandwich durch den in der Probe vorhandenen, zu bestimmenden Antikörper bzw. Autoantikörper (Ak) kann dabei grundsätzlich an jeder einzelnen der Bindungs-stellen zum Aufbau des Sandwich oder an beiden gleichzeitig erfolgen. Substanzen, die als Autoantigene wirken und gegen
die Autoantikörper gebildet werden können, sind in der Regel Komplexe großer Moleküle, meist von proteinischer Natur, die mehr als zwei an der Antikörperbindung beteiligte Regionen oder Epitope aufweisen, und die gebildeten Antikörper sind polyklonal. Je nach Wahl der für den Test als immobilisierte bzw. markierte Antikörper ausgewählten Antikörper können daher Sandwichkomplexe verschiedener Art konstruiert werden, die sich - was die involvierten Bindungen und ihre Störungen angeht - gegenüber der Anwesenheit der Autoantikörper (Ak) ganz verschieden verhalten können. Die Konstruktion derartiger Sandwiches unter Vorgabe geeigneter Eigenschaften für den Nachweis von bestimmten Autoantikörpern (Ak) kann insbesondere dann maßgeschneidert werden, wenn sowohl der immobilisierte Antikörper (Akimm) als auch der markierte Antikörper (Ak*) geeignete monoklonale Antikörper sind. Im
Falle der Bestimmung von Autoantikörpem gegenüber TPO sind die an diesem Antigen vorhandenen Epitope relativ gut charakterisiert, und es sind verschiedene monoklonale Antikörper verfügbar, die gegen spezifische Epitope dieses Antigens gerichtet sind. Es wird in diesem Zusammenhang verwiesen auf den bereits erwähnten Artikel von P. Carayon et al in Endocrinology, Volume 125, Nr. 3, Seiten 1211-1218.
Wählt man als immobilisierten Antikörper gegen TPO einen solchen, insbesondere monoklonalen, Antikörper, der TPO in einer Region bindet, in der auch Autoantikörper gegen TPO gebunden werden, und wählt man den markierten Antikörper Ak* so, daß seine Bindung durch Autoantikörper nicht beeinflußt wird, erfolgt die Störung des Aufbaus des Sandwiches aufgrund einer Konkurrenz zwischen dem immobilisierten Antikörper Akimm und dem zu bestimmenden Antikörper Ak um den Komplex Antigen-markierter Antikörper (Ag-Ak*), der als indirekt markiertes Antigen betrachtet werden kann. Geht man umgekehrt vor und wählt den immobilisierten Antikörper Akimm so, daß seine Bindung an das Antigen durch die zu bestimmenden Antikörper (Ak) nicht gestört wird, während der markierte Antikörper Ak* an Regionen oder Epitope des Antigens bindet,
an die auch die zu bestimmenden Antikörper bzw. Autoantikörper binden, so erfolgt die Störung des Aufbaus eines Sandwiches, der markierten Antikörper Ak* enthält, aufgrund der Konkurrenz von Ak* und Ak um das indirekt immobilisierte Antigen. Binden beide Antikörper Akimm und Ak* an solche
Bereiche des Antigens, an die auch die Autoantikörper (Ak) binden, kommt es durch die Anwesenheit derartiger Autoantikörper (Ak) zu einer doppelten Beeinträchtigung des Sandwichaufbaus und seiner Immobilisierung und damit gegebenenfalls zu einer Erhöhung der Empfindlichkeit.
Es ist ein sehr wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß das Antigen Ag nicht wie bei den bisher bekannten Bestimmungsverfahren in hochgereinigter Form vorliegen muß, sondern als rohes Antigen, beispielsweise in Form eines Organextrakts, verwendet werden kann. Die doppelte Antikörperspezifitat, die zum Aufbau eines Sandwichs, der eine Markierung enthält, erforderlich ist, führt dazu, daß unspezifische Störungen des Tests durch Fremdbestandteile, die mit dem rohen Antigen in die Bestimmung eingeführt werden, ohne Schwierigkeiten eliminiert werden können, so daß die Sandwichbildung auf die gewünschten immunologischen Bindungspartner beschränkt ist. Während im oben beschriebenen Falle, bei dem man das rohe Antigen zusammen mit Begleitsubstanzen immobilisiert, die Gefahr besteht, daß nicht nur Antikörper gegen das immobilisierte Antigen an die feste Phase gebunden und markiert werden, sondern auch immunologische Bindungspartner zu anderen im rohen Antigen vorhandenen antigenen Substanzen, werden derartige Störungen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sehr unwahrscheinlich. Die Möglichkeit, ein rohes Antigen in Form eines geeigneten Organextrakts zu verwenden, hat den ferneren Vorteil, daß relativ schonende Gewinnungsverfahren für das Antigen angewandt werden können und auf solche Reinigungsschritte verziehtet werden kann, durch die die native Struktur des
Antigens angegriffen wird. Das Antigen kann daher sehr viel genauer das im Organismus vorhandene Antigen und dessen
vollständiges immunologisches Bindungsspektrum repräsentieren. Die Gefahr, daß nur eine Teilfraktion der im Organismus gebildeten Autoantikörper durch den Test erfaßt wird, ist somit geringer.
Andererseits läßt es sich durch eine geeignete Auswahl der für den Test verwendeten monoklonalen Antikörper auch erreichen, daß der Test ganz gezielt nur auf bestimmte Autoantikörper anspricht und damit selektiver gemacht werden kann. Wenn z.B. bestimmte mit der Autoimmunerkrankung verbundene Krankheitserscheinungen auf ganz bestimmte Klone der vom Körper gebildeten polyklonalen Autoantikörper zurückgeführt werden können, kann unter Verwendung monoklonaler oder ggf. selektierter polyklonaler Antikörper das Verfahren für die Bestimmung derartiger Autoantikörper-Klone spezifisch gemacht werden
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren stellen die zu erwartenden hohen Autoantikörperkonzentrationen kein Problem dar, da das rohe Antigen, z.B. das rohe hTPO, in ausreichenden, den Autoantikörpermengen vergleichbaren Mengen eingesetzt werden kann, ohne den Test übermäßig zu verteuern. Es hat sich gezeigt, daß die Möglichkeit, das rohe Antigen zu verwenden, kostenmäßig so vorteilhaft ist, daß die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erforderlichen zwei zugesetzten Antikörper (Akimm, Ak*) keinen Kostennachteil gegenüber mit hochgereinigten Antigenen, jedoch nur einem Antikörper arbeitenden
Verfahren bedeuten. Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren eignet sich ferner ausgezeichnet dazu, im Hinblick auf die gewünschte Empfindlichkeit optimiert zu werden, indem man die vorgesehenen Mengen an Antigen Ag bzw. markiertem Antikörper Ak* bzw.
immobilisiertem Antikörper Akimm an die Testbedingungen in weiten Grenzen anpaßt. Das ist aufgrund der guten Verfügbarkeit und des relativ geringen Preises des verwendeten rohen, nativen Antigens ohne größere Probleme möglich. Die
Antigenmenge kann direkt auf die zu erwartenden oder möglichen Mengen an Autoantikörper abgestimmt werden, was gleichzeitig bedeutet, daß die biologischen Flüssigkeiten, d.h. insbesondere Seren, in unverdünnter Form eingesetzt werden können.
Was die einzusetzenden Mengen der immunologischen Umsetzungspartner angeht, so versteht es sich für den Fachmann von selbst, daß die Menge an zugesetztem Antigen nicht so groß sein sollte, daß sowohl alle zu bestimmenden Antikörper Ak als auch alle markierten Antikörper Ak* bzw. alle immobilisierten Antikörper Akimm abgesättigt werden und es zwischen ihnen zu keiner nennenswerten Konkurrenz um das Antigen mehr kommt. In einem solchen Falle kann eine nennenswerte Ausbildung eines immobilisierten, markierten Sandwiches u.U. überhaupt unterdrückt werden, und es sind keine quantitativen Aussagen über die tatsächlich in der Probe vorhandenen Autoantikörpermengen möglich. Setzt man gegenüber der Menge des zugesetzten Antigens einen Unterschuß an z.B. markiertem Antikörper Ak* ein, so daß nur ein Teil der Antigenmenge unter Ausbildung eines Immunkomplexes Ag-Ak* markiert wird, darf natürlich die Menge des markierten Ak* nicht so gering sein, daß die schließlich gebundene Menge des Komplexes aufgrund seiner Konkurrenz mit unmarkiertem Antigen um den immobilisierten Antikörper Akimm zu niedrig wird. Analoges gilt, in einer anderen geschilderten Verfahrensvariante, für die Menge des immobilisierten Antikörpers Akimm.
Die für einen bestimmten Test erforderlichen oder vorteilhaftesten Konzentrationen an Antigen Ag, immobilisiertem Antikörper Akimm und markiertem Antikörper Ak* lassen sich unter Berücksichtigung der zu erwartenden Mengen der zu bestimmenden Antikörper Ak ohne nennenswerte Schwierigkeiten in Routineoptimierungen ermitteln, indem die Testempfindlichkeit (Eichkurvenverlauf) über z.B. die zugesetzten
Antigenmengen variiert wird.
Antikörper, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, können im wesentlichen alle für immunologische Bestimmungsverfahren geeigneten Antikörper sein. Ihre Affinitätskonstanten liegen üblicherweise im Bereich von 1012 bis 108 1/mol.
Die Verfahrensdurchführung unterscheidet sich, was die verwendbaren festen Träger für die immobilisierten Antikörper Akimm und die Bedingungen der immunologischen Reaktion (pH zwischen 4 und 9, Anwesenheit von Puffern; Temperatur im Bereich von 0 bis ca. 55ºC; Reaktionszeiten) angeht, nicht grundsätzlich von anderen üblichen immunologischen Bestimmungsverfahren. Die immunologische Umsetzung kann dabei unter solchen Bedingungen durchgeführt werden, daß das
Gleichgewicht zwischen allen Reaktionspartnern erreicht wird, es ist jedoch grundsätzlich auch möglich, die Umsetzung zu einem vorgegebenen früheren Zeitpunkt zu stoppen und die Verhältnisse zu diesem früheren Zeitpunkt zu ermitteln.
Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand eines Ausführungsbeispiels, das die Bestimmung von Autoantikörpern gegen humane Schilddrüsenperoxidase (hTPO) unter Verwendung zweier zugesetzter monoklonaler Antikörper gegen hTPO sowie von roher hTPO in Form eines Extrakts aus humanen Schilddrüsen als zugesetztes Antigen betrifft, noch näher erläutert und hinsichtlich seiner Wirksamkeit bekannten Verfahren zur Bestimmung der gleichen Autoantikörper gegenübergestellt.
In den Figuren zeigen:
Figur 1 eine schematische Darstellung des erfindungs-gemäßen Verfahrens in einer ersten Variante, in der der immobilisierte Antikörper Aklmm an eine solche Region des Antigens Ag bindet, die auch von dem zu bestimmenden Anti
körper Ak, der vorzugsweise ein Autoantikörper ist, erkannt wird, so daß der Antikörper Ak mit dem immobilisierten Antikörper Akimm um das Antigen Ag konkurriert und damit dessen Fixierung auf der festen Phase stört; die durch den Antikörper Ak hervorgerufene Störung ist hier und in den folgenden Figuren 2 und 3 symbolisch als intervenierende Bewegung des Antikörpers Ak dargestellt, obwohl, wie dem Fachmann ohne weiteres klar ist, die beobachtete Störung auf eine Konkurrenz um das Antigen zurückzuführen ist.
Figur 2 eine weitere Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens, gemäß der der zu bestimmende Antikörper Ak und der markierte Antikörper Ak* um die Region des über Akimm indirekt immobilisierten Antigens Ag, die vom Autoantikörper Ak erkannt wird, konkurrieren.
Figur 3 eine dritte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens, gemäß der sowohl der immobilisierte Antikörper Akimm als auch der markierte Antikörper Ak* an eine Region des Antigens Ag binden, die auch von dem Antikörper Ak erkannt wird, so daß die Anwesenheit des Antikörpers Ak in der Probe eine doppelte Störung hervorruft;
Figur 4 eine graphische Darstellung des Standardkurvenverlaufs bei einem Assay zum Nachweis von humanen Autoantikörpern gegen humane Schilddrüsenperoxidase (hTPO) in Abhängigkeit von der eingesetzten Antigenmenge (rohes hTPO).
Beispiel
Das nachfolgende Beispiel zeigt die Durchführung und die praktischen Vorteile eines Assays, in dem das erfindungsgemäße Verfahren verwirklicht wird, anhand eines bevorzugten Ausführungsbeispiels, das den Nachweis von humanen Autoantikörpern gegen humane Schilddrüsenperoxidase (hTPO) betrifft.
1. Immobilisierung eines monoklonalen anti-hTPO-Antikörpers (Akimm) auf einer festen Phase
Als Antikörper, der an die feste Phase gekoppelt wird, wurde ein gereinigter monoklonaler Antikörper gewählt, der an eine Region der hTPO bindet, die von humanen Autoantikörpern gegen hTPO erkannt wird. Der verwendete gereinigte monoklonale Antikörper war ein monoklonaler Maus-anti-hTPO-Antikörper, der hergestellt worden war gemäß dem in der Veröffentlichung von P. Carayon in: Endocrinology, Vol. 125, Nr. 3, Seite 1212, linke Spalte unten, rechte Spalte oben, beschriebenen Verfahren, und der nach den in der gleichen Veröffentlichung beschriebenen Auswahlkriterien so ausgewählt wurde, daß er hTPO in einer Region erkennt, die auch von humanen anti-hTPO-Autoantikörpern erkannt wird.
Die Kopplung des genannten monoklonalen Maus-anti-hTPO-Antikörpers an die feste Phase in Form der Wände eines
Teströhrchens wurde nach bekannten Verfahren wie folgt durchgeführt:
Teströhrchen (STAR Tubes 12 × 75 mm der Firma NUNC, Katalog Nr. 470/319) wurden mit je 1 μg Anti-Maus-IgG (Firma SIGMA, Katalog Nr. MA 8642) in 300 μl einer wäßrigen Pufferlösung von pH 7,8 befüllt, die eine Konzentration von 10 mmol
TRIS/HCL und 10 mmol NaCl aufwies. Nach einer 20stündigen Inkubation bei Raumtemperatur erfolgte ein zweimaliger
Waschgang der Röhrchen. Abgesättigt wurden die Röhrchen mit einer Lösung aus 0,5 % BSA (bovines Serumanlbumin; SIGMA, Katalog Nr. A 3294), d.h. die Röhrchen wurden mit der Absättigungslösung befüllt, 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wonach der Inhalt dekantiert wurde. In einem nachfolgenden dritten Schritt erfolgte die Bindung des zugesetzten monoklonalen Maus-Anti-hTPO-Antikörpers an die feste Phase durch Immunextraktion aus einer Lösung des genannten monoklonalen Antikörpers, die diesen in einer Menge von 0,2 μg in 300 μl der oben genannten Pufferlösung
enthielt, zu welchem Zwecke für 20 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Danach wurden die Röhrchen gewaschen, und es erfolgte eine letzte Absättigung mit der gleichen Absättigungslösung wie oben. Danach wurden die Röhrchen mit dem immobilisierten monoklonalen Antikörper lyophilisiert.
2. Herstellung eines hTPO-Extraktes aus humaner Schilddrüse
Gefrorene humane Schilddrüsen (60 g) wurden zerkleinert, mit Puffer (200 ml phosphatgepufferter Salzlösung, PBS) versetzt und anschließend mittels eines Homogenisators (Ultraturrax der Firma IKA Werke) homogenisiert. Nach einer einstündigen Zentrifugation bei 100 000 g wurde der Überstand entfernt, und das erhaltene Pellet wurde auf die gleiche Weise wie die zerkleinerten Schilddrüsen rehomogenisiert. Daran schloß sich eine weitere Zentrifugation bei 100 000 g für 1 Stunde an. Das nunmehr erhaltene Pellet wurde wieder in PBS (200 ml) rehomogenisiert, das zusätzlich als Detergens 0,5 % Triton X 100 der Firma PIERCE (Katalog-Nr. 28314) enthielt, und es wurde 1 Stunde bei 4°C gerührt. Zuletzt wurde das erhaltene Homogenisat bei 100 000 g für 2 Stunden zentrifugiert. Der resultierende Überstand stellt den hTPO-Extrakt dar, der als rohes natives Antigen Ag in das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Autoantikörpern gegen hTPO eingesetzt wird.
3. Herstellung eines mit einem Chemilumineszenzlabel markierten Anti-hTPO-Antikörpers (Ak*) Ein monoklonaler Maus-anti-hTPO-Antikörper, der grundsätzlich nach dem gleichen Verfahren erhalten wurde wie der oben unter 1. beschriebene entsprechende monoklonale Antikörper, der jedoch so ausgewählt wurde, daß er hTPO außerhalb der Region bindet, die auch von humanen Autoantikörpern gegen hTPO erkannt wird, wird nach bekannten Methoden mit Akridiniumester markiert. Zu diesem Zwecke wird der reine monoklonale Antikörper (100 μg in 100 μl PBS) mit Akridiniumester
(2μg in 2 μl Acetonitril) für 10 min bei Raumtemperatur umgesetzt. Anschließend wird der mit dem Akridiniumester markierte Antikörper über HPLC von nicht-umgesetztem freien Akridiniumester abgetrennt.
4. Bestimmung von humanen Autoantikörpern gegen hTPO a) Zur Bestimmung von humanen Autoantikörpern gegen hTPO wurde im vorliegenden Falle zuerst der markierte Antikörper Ak* in einem molaren Verhältnis von 1 :1 mit dem als Antigen Ag verwendeten hTPO-Extrakt umgesetzt. Die Umsetzung erfolgte innerhalb von 20 Stunden bei 4°C in einem Puffer, der folgende Bestandteile in den nachfolgend angegebenen Konzentrationen enthielt: 50 mmol Natriumphosphat, 0,1 Gew.-% Triton X 100, 0,2 Gew.-% EDTA, 0,3 % BSA (bovines Serumalbumin), 100 μg/ml Maus-IgG (Firma SIGMA, Nr. I 5381), 10 μg/ml bovines IgG (Firma SIGMA, Nr. 5506). Der pH des Puffers betrug 7,8. b) Zum Nachweis von humanen Autoantikörpern gegen hTPO bzw. zur Eichung wurde jeweils wie folgt vorgegangen:
1. Es wurden jeweils 20 μl der zu untersuchenden Probe bzw. des Standards oder Serums in Teströhrchen pipettiert, die gemäß dem unter 1. beschriebenen Verfahrensschritt mit Mausanti-hTPO-Antikörpern beschichtet worden waren.
2. Anschließend wurden 300 μl des gemäß 4a) bereiteten Cocktails pipettiert, der das Antigen hTPO in Form des
Extrakts aus humanen Schilddrüsen sowie den damit umgesetzten markierten Maus-anti-hTPO-Antikörper enthielt.
3. Nach dem Abschluß der Zugabe wurde die erhaltenen Reaktionsmischung 3 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Danach wurden die Teströhrchen gewaschen, und die Menge des an die Wand des Teströhrchens gebundenen Akridiniumester-Tracers wurde in einem Berthold-Autoclinilumaten LB 952/16 auf an sich bekannte Weise mittels der Lichtreaktion gemessen.
Figur 4 zeigt die für verschiedene Mengen von Autoantikörpern in der zu untersuchenden Probe bzw. dem verwendeten Standard erhaltenen Meßkurven für Assays mit unterschiedlichen Mengen an zugesetztem Antigen (hTPO) in Form eines humanen Schilddrüsenextrakts, wobei die Angabe "TPO-Verdünnung" sich auf den oben unter 2. beschriebenen Schilddrüsenmembranextrakt bezieht. Figur 4 ist klar zu entnehmen, daß über eine Variation der eingesetzten Antigen-Menge
(hTPO-Menge) der Kurvenverlauf und damit die Meßempfindlichkeit variiert werden kann.
5. Klinische Daten
In einer klinischen Untersuchung wurden die mit dem beschriebenen neuartigen Verfahren erhaltenen Meßergebnisse mit denen verglichen, die unter Verwendung existierender immunologischer Bestimmungsverfahren zur Autoantikörperbestimmung gegen hTPO für 29 positiv reagierende Patienten erhalten werden.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
Tabel le 1
Autoantikörper Units/ml a )* b) * c)* d) Neues
Verfahren
Normkol lektiv al le neg. al le neg. alle neg. al le neg.
Patienten-Poole
(N=25)
Patient-Nr.
1 156 neg. 168 138
2 neg. neg. neg. neg.
3 129 83 240 207
4 3869 1163 8706 3742
5 2225 1414 2163 2235
6 182 91 249 147
7 198 598 2596 1728
8 3232 1006 5283 4834
9 1015 110 362 784
10 neg. neg. 110 neg.
11 433 198 886 600
12 1049 359 1171 1473
13 140 89 168 135
14 neg. neg. neg. neg.
15 134 86 255 94
16 2768 7496 5106 5159
17 2154 1412 4090 2791
18 341 105 neg. 109
19 898 530 1173 1552
20 1478 476 1125 1471
21 3753 2215 2593 5069
22 274 108 141 237
23 784 516 461 414
24 921 472 521 451
25 405 341 798 709
26 1415 424 997 1032
27 1914 1011 2608 2170
28 183 704 2631 1747
29 161 neg. 130 378 * : Ergebnisse von Vergleichsverfahren
In dieser Tabelle 1 betreffen die Spalten a), b) und c) die Ergebnisse von Bestimmungsverfahren des Standes der Technik, die nachfolgend noch genauer erläutert werden, während d) die nach dem neuen, wie vorstehend beschrieben durchgeführten Verfahren erhaltenen Ergebnisse zeigt.
Die als Vergleichsverfahren dem erfindungsgemäßen Verfahren gegenübergestellten Verfahren des Standes der Technik waren im einzelnen:
a) Ein Verfahren, bei dem ein Anti-hTPO-Antikörper auf der Festphase verwendet wird. Radioaktiv markiertes und gereinigtes hTPO wird durch humane Autoantikörper von der Festphase verdrängt. Der verwendete Test ist ein kommerziell erhältlicher Test, der als
DYNOtest Anti-TPO der Anmelderin im Handel ist. b) Bei diesem Test ist Protein A auf der Festphase
immobilisiert. Der Nachweis von Autoantikörpern in einer Probe erfolgt durch deren Bindung an die Festphase und ihren anschließenden Nachweis mit Hilfe von markiertem gereinigtem hTPO. Im konkreten Falle wird radiojodiertes hTPO gemäß dem IMMUtest Anti-TPO der Anmelderin verwendet.
c) Bei diesem Test wird rohes TPO (als sogenanntes
mikrosomales Antigen) auf der Festphase immobilisiert eingesetzt. Die Bindung und der Nachweis der gebundenen Autoantikörper erfolgt mit Hilfe eines markierten Protein A. Bei dem Vergleichstest handelt es sich um den PROMAK-Assay der Anmelderin.
Der Tabelle 1 mit den Vergleichsergebnissen ist deutlich zu entnehmen, daß das Vergleichsverfahren a) (gereinigtes markiertes hTPO als Tracer) sowie das Vergleichsverfahren b) (Protein A auf einer Festphase, gereinigtes markiertes hTPO als Tracer) teilweise niedrigere Werte liefern als das
Bestimmungsverfahren gemäß c) und das erfindungsgemäße
Verfahren d). So werden gemäß Bestimmungsverfahren a) für
einzelne Patientenproben (Patienten 7, 16, 28) deutlich niedrigere Werte erhalten als nach den restlichen Verfahren, während gemäß Bestimmungsverfahren b) für einige Patienten negative Ergebnisse erhalten werden, die nach den anderen Verfahren schwach positiv sind (Patienten 1, 29) bzw. für einige Patienten niedrigere Werte ermittelt werden als nach den anderen Bestimmungsverfahren (Patienten 4, 8, 11, 12, 17, 19, 20, 27). Es ist darauf hinzuweisen, daß im Falle der Patienten 1 und 29 die Proben gemäß Bestimmungsverfahren b) sogar unrichtig als autoantikörperfrei ermittelt wurden. Im Falle der Patienten 7 und 28 findet das Bestimmungsverfahren a) die Patienten nur als extrem schwach positiv, während sie in den anderen Verfahren stark positiv sind. Verfahren c) hat den Nachteil, daß neben Antikörpern gegen hTPO auch eine Vielzahl weiterer Autoantikörper gegen begleitende Proteine gemessen werden, was beispielsweise dazu führt, daß für den Patienten 10, der gemäß allen anderen Verfahren frei von Autoantikörpern gegen hTPO ist, Autoantikörper gegen hTPO vorgetäuscht werden.
Das dem erfindungsgemäßen Verfahren zugrundeliegende Verfahrensprinzip ist - wie eingangs ausführlich erläutert - in vielfacher Hinsicht variierbar. Da ein Antikörper markiert ist, kann jedes z.Zt. bekannte Label zur Markierung eingesetzt werden. Anstelle der im konkreten Falle geschilderten vorausgehenden Umsetzung von Antigen (rohem hTPO) mit dem markierten Antikörper ist es auch möglich, das Verfahren als Synchronreaktion durchzuführen, d.h. das rohe Antigen (hTPO) wird nicht vor der Zugabe der zu untersuchenden Probe in einem getrennten Schritt mit dem markierten Antikörper indirekt vormarkiert, sondern die Inkubation wird folgendermaßen durchgeführt: In das mit dem immobilisierten Antikörper beschichtete
Teströhrchen wird zuerst die auf Autoantikörper zu untersuchende Probe pipettiert, anschließend wird der markierte
Antikörper Ak* zugegeben, und als letztes wird die Antigenlösung (hTPO-Lösung) zugegeben, womit die Reaktion gestartet wird.
Ein solches Vorgehen ist dann von Vorteil, wenn die Bindungsverhältnisse so sind, daß humane Autoantikörper auch die Wechselwirkung zwischen dem markierten Antikörper Ak* und dem Antigen Ag (hTPO) beeinflussen und schwächen, und zwar etwa im Sinne des Verfahrensschemas gemäß Figur 3.
Andere Pipettierschemate sind ebenfalls möglich. Beispielsweise ist es auch möglich, die Immobilisierung des ersten Antikörpers Akimm erst während des Bestimmungsverfahrens vorzunehmen, indem man im Testgefäß eine Festphase mit einem Binder für Akimm vorlegt und anschließend z.B. eine Mischung aus Akimm und Ak* pipettiert und zuletzt durch Zugabe von Antigen Ag die Umsetzung startet.
Auch wenn der Wegfall des Zwangs zur Vorverdünnung der
Proben einen wesentlichen Vorteil des erfindungsgemäßen
Verfahrens darstellt, ist es bei Bedarf selbstverständlich auch möglich, den Test so zu variieren, daß die Proben vorverdünnt eingesetzt werden. Wie bereits eingangs erwähnt wurde, ist das neue Verfahrensprinzip nicht auf die Bestimmung von Autoantikörpern gegen hTPO beschränkt. Es läßt ähnliche Vorteile auch für die
Bestimmung anderer Autoantikörper erwarten, die gegen membranassoziierte und andere Autoantigene gebildet werden. Es kann in diesem Zusammenhang die Bestimmung von Autoantikörpern gegen Acetylcholinrezeptoren vom Nikotintyp erwähnt werden, deren Auftreten nach allgemeiner Ansicht für die schwere Autoimmunerkrankung Myasthenia gravis kennzeichnend ist.
Selbstverständlich kann das erfindungsgemäße Verfahren jedoch auch zur Bestimmung von Antikörpern verwendet werden,
die keine Autoantikörper sind und gegebenenfalls in den biologischen Flüssigkeiten in sehr viel geringeren Konzentrationen vorkommen als Autoantikörper. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in diesem Falle in Einzelfällen den Vorteil bieten, daß nur schwer in reiner Form erhältliche Antigene in Rohform eingesetzt werden können und/oder daß eine direkte Markierung empfindlicher und/oder schwer zu markierender Antigene vermieden werden kann.