WO1992019733A1 - Recepteur thyroidien de n-acetylglucosamine - Google Patents

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WO1992019733A1
WO1992019733A1 PCT/FR1992/000396 FR9200396W WO9219733A1 WO 1992019733 A1 WO1992019733 A1 WO 1992019733A1 FR 9200396 W FR9200396 W FR 9200396W WO 9219733 A1 WO9219733 A1 WO 9219733A1
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receptor
protein
thyroid
antibodies
glcnac
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PCT/FR1992/000396
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Raymond Miquelis
Joöel COURAGEOT
Valérie THIBAULT
Olivier Blanck
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Centre National De La Recherche Scientifique
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    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the thyroid proho ⁇ onal receptor, its purification method and its use in diagnostic tests for thyroid pathologies. Furthermore, the invention relates to antibodies directed against the receptor and the use of part of the receptor as a "delay molecule", to prolong the half-life of a pharmacological agent.
  • the first attempts to characterize and purify the GlcNAc thyroid receptor (Miguelis et al, J. Biol. Chem., Vol 262, 31, pp 15291-15298, November 1987) only allowed a very small amount to be recovered. largely contaminated protein material. Its analysis on SDS-PAGE under denaturing conditions revealed a protein of molecular weight of approximately 45 kDa, but a protein "trail" from 43 kDa to 60 kDa suggested that the preparation could be contaminated by cellular proteins such as epithelial cell cytokeratins (40-70 kDa), actin, tubulin (43 kDa) and lectin-like proteins, i.e. of the same family, such as mannose-6-phosphate receptors ( 43 kDa). This preparation contaminated could not be purified further and could not allow the complete characterization, the sequencing of the receptor, or the preparation of antibodies specific to the receptor.
  • epithelial cell cytokeratins 40-70
  • the receptor could be classified as a member of the family of calcium-dependent animal lectins, when it was observed: 1) that the binding of ligands required the presence of calcium at physiological concentrations (cf MIQUELIS et al, Ibid) and 2) that antibodies generated in rabbits by a consensus sequence present in these lectins recognized the preparation of the thyroid receptor (Blanck O. et al, 1990, Biochem. Biophys. Res. Corn. 169, 880-887).
  • This family of animal lectins has only one domain in common, that of carbohydrate residue recognition (or "carbohydrate recognition domain", C.R.D.), consisting of approximately 130 amino acids. There are 11 invariant residues present in all the animal species studied (ranging from the simplest, such as the sea urchin and the butterfly, to mammals), and around 50% homology among the lectins of vertebrates.
  • the technical problem which arose during the development of the present invention was to provide a preparation of the thyroid receptor of purity and in a sufficiently high quantity to be able to characterize it completely, and prepare antibodies specific to the receptor.
  • the inventors have now developed a method for purifying the receptor which makes it possible to obtain, in micromolar amounts, a preparation devoid of contaminants. This method is part of the objects of the present invention.
  • the invention relates to a method for purifying the GlcNAc thyroid receptor, characterized in that it comprises the following successive steps:
  • This new method has several changes compared to the method used in 1987, including:
  • the receptor is polymeric (2 to 3 monomers) and use as a ligand of a molecule having accessible groups or "clusters" of GlcNAc and thus having better affinity;
  • the second purification step leads to the denaturation of the protein. It has been found that the denatured receptor can be used for the generation of antibodies which recognize the receptor in its native form.
  • step (v) consists of electroendosmosis on polyacrylamide gel in the presence of SDS.
  • the affinity column of step (iv) preferably includes ovomucoid.
  • This method can be used to purify the human, porcine or any other mammalian thyroid receptor, and allows the preparation of the receptor on an industrial scale.
  • the receiver could be completely characterized. It is a protein receptor, made up of 2 to 3 homologous or different monomers in their amino acid sequence, each monomer having a molecular weight of approximately 51 kDa determined as a denaturing gel in the presence of Triton X-100. Each monomer contains approximately 510 amino acids.
  • the receptor is specific for N- residues Acetylglucosamine, i.e. glycan residues carried by the thyroglobulin molecule. It is mainly located in the apical part of the thyrocytes.
  • the association with its ligand is done according to a positive association mechanism.
  • the bond between the thyroglobulin molecule and the receptor is all the more important as the thyroglobulin molecule is more immature, that is to say richer in accessible N-acetylglucosamine residues.
  • the mature molecule is characterized by a certain iodine content and a masking of the carbohydrate residues recognized by the receptor.
  • the purified receptor is recognized by antibodies directed against rat hepatic lectin and those directed against the consensus sequence of the CRD of the calcium-dependent lectin family. The partial amino acid sequence of the receptor has also been elucidated.
  • the invention also relates to the purified preparation of the receptor. More particularly, the invention relates to a protein having an N-acetylglucosamine (GlcNAc) thyroid receptor activity characterized in that it consists of monomers with a molecular weight of approximately 51 kDa, an isoelectric point of approximately 5.2 , is substantially devoid of contaminating cellular proteins and comprises at least one of the amino acid sequences illustrated in FIGS. 2 and 7, or a sequence having at least 80% homology with one of these sequences.
  • GlcNAc N-acetylglucosamine
  • the molecular weight of 51 kDa is that determined in denaturing acrylamide gel in the presence of Triton-X 100 and corresponds thus to the monomer in a lipid detergent environment. Without detergent, the molecular weight of the monomeric protein is approximately 40 kDa.
  • receptor protein of the invention means a protein having all of the characteristics indicated above, and includes the oligomeric receptor, as well as its monomeric subunits possessing receptor activity.
  • the inventors have determined the mechanism of action of the receptor. It is involved in hormonogenesis and thyroid secretion in the following way:
  • thyroglobulin thyroid prohormones
  • immature prohormone molecules characterized by their low iodine and hormone content and by their high content of accessible N-Acetylglucosamine residues
  • bind to the N-Acetylglucosamine receptor the binding is optimal at acidic pH between 4.8 and 5.1.
  • this receptor conveys the prohormone molecules to the apical part of the thyrocytes, where there is thyroperoxidase, an enzyme which allows the fixation of iodine on tyrosyl residues and the subsequent coupling of tyrosyl residues for the formation of thyroid hormones.
  • This conveying takes place thanks to a "motor” part of the receptor which is capable of causing the detachment of the entire receptor from the membrane by a process of "budding” or “budding” forming new intra-cellular vesicles.
  • successive recycling increases the hormone content of thyroglobulin molecules and avoids their addressing to lysosomes and therefore their degradation. Recycling via the Golgi allows complementary glycosylations which lead to the disappearance of accessible N-Acetylglucosamine residues and the appearance of galactose and then sialic acid.
  • the acid pH between 4.8 and 5.1 corresponds to the physiological values found in the endosomal compartments.
  • molecules with terminal GlcNAc residues for example neoglycoproteins, partially deglycosylated or ovomucoid proteins
  • the ability to prevent degradation of molecules carrying GlcNAc motifs can be confirmed as follows.
  • the receptor protein is introduced into a cell (for example, a fibroblast) by permanent transfection, or by expression of the recombinant gene.
  • two molecules, one carrying carbohydrate residues recognized by the receptor (GlcNAc) and the other carrying residues not recognized by the receptor, each marked with a different marker, are added to the culture medium.
  • the metabolic fate of each molecule can then be determined using markers.
  • the degradation of the molecule carrying GlcNAc residues is slower than that of the other molecule when the receptor protein exhibits thyroid receptor activity of GlcNAC.
  • the receptor proteins of the invention comprise at least one of the amino acid sequences TGR-CL1bis, -CL4, -CL5 bis, -CL6, -CL7, -CL10, -CL10C, -CL11 and -CLH illustrated in the figures 2 and 7, or a sequence having at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with one of these sequences, provided that the activity of thyroid receptor is present.
  • sequences determined by the inventors, correspond to the human receptor and probably form part of the zone of extracellular membrane extension.
  • proteins comprising a sequence having at least 80% homology with one of the illustrated sequences
  • proteins obtained by substitution, deletion or insertion of one or more amino acids from the natural sequence can be prepared, for example, by the purification method of the invention, optionally followed by modification of the sequence of the protein thus produced, and verification of the receptor properties.
  • the proteins of the invention can also be produced recombinantly in a competent cellular host, the sequence coding for the protein being under the control of appropriate regulatory sequences. In the case of recombinant production, it is possible to produce the protein in the form of a fusion protein in cases where this will facilitate its expression, its labeling, or its transport in certain cellular hosts.
  • cellular hosts mention may be made of E. coli and Bacillus, as well as the yeast strains and the mammalian cells usually used for the expression of recombinant proteins.
  • the proteins of the invention can also be produced by chemical synthesis.
  • a particularly preferred protein according to the invention is that which comprises at least the amino acid sequence encoded by TGR-CLH and indicated in FIG. 7.
  • This TGR-CLH protein is preferably produced by the recombinant route. This protein constitutes almost all of at least one monomer in the receptor.
  • the proteins of the invention are substantially free of contaminants, in particular the epithelial cell cytokeratins, actin, tubulin and lectin-like proteins, such as the mannose-6-phosphate receptor. "Significantly free” means that the quantity of contaminants present does not allow their detection on gel electrophoresis and does not give rise to the formation of antibodies against the contaminants.
  • the proteins of the invention can sometimes be associated, in the physiological environment, with "transduction” proteins.
  • One such protein is the proteins G s ⁇ ( ⁇ subunit of the "guanine nucleotide binding protein"), part of the sequence of which, in the forward and reverse directions, is illustrated in FIG. 6.
  • the invention also relates to peptide fragments of the protein of the invention. These fragments are characterized in that they are recognized by a polyclonal serum or by at least some of the monoclonal antibodies generated by the whole receptor protein. This property means that the fragment in question exhibits at least part of the immunological characteristics of the receptor protein. Normally, these fragments contain at least 6 amino acids, and preferably at least 12 or at least 15 amino acids. In the context of the invention, the term "fragment" means a chain of amino acids ranging from the peptide having at least 6 amino acids to a polypeptide of approximately 510 amino acids. When the fragment has a size of approximately 500 to 510 amino acids, it may be one of the monomeric subunits of the receptor.
  • fragments retain the activity of the thyroid receptor. That said, this activity is not necessarily present according to this aspect of the invention, the important thing being that at least part of the immunological characteristics of the receptor is retained.
  • Particularly preferred fragments are fragments comprising at least 6 consecutive amino acids or even all of one of the sequences: TGR-CL1bis, TGR-CL4, TGR-CL5bis, TGR-CL6, TGR-CL7, TGR-CL10, TGR-CLH and TGR-CLH illustrated in FIGS. 2 and 7.
  • a fragment comprising at least the sequence coded by nucleotides 16 to 834 and corresponding to the amino acids deduced from 6 to 278 of TGR-CLH and illustrated in Figure 7 is particularly preferred.
  • the protein fragments of the invention can also form part of "hybrid" molecules which comprise on the one hand, a part originating from a molecule other than the thyroid receptor and on the other hand, the receptor fragment having at least six acids amines.
  • this type of molecule are a fragment of the receptor coupled to a carrier molecule to optimize the immunogenic properties of the smallest fragments (the fragment then being a hapten), or a fragment of the receptor coupled to a marker allowing its visualization. or an agent allowing its targeting.
  • the fragments of the invention are produced by hydrolysis of the entire receptor, by recombinant route or even by chemical synthesis.
  • a peptide fragment of the receptor which is particularly preferred according to the invention is the part constituting the domain of recognition of carbohydrate residues, or CRD
  • CRD This part of the molecule is responsible for the carbohydrate specificity of the receptor and for the binding of the ligand at acid pH ( between 4.8 and 5.1).
  • the CRD has about 130 to 150 amino acids and is probably located at one end of the protein, that is to say at the N or C terminus of the receptor. For some people monomers, it could be crosslinked by 2 disulfide bridges and has a part homologous to the consensus sequence present in the CRDs of other members of the calcium-dependent lectin family. This property is demonstrated by the recognition of the receptor by antibodies generated by the consensus sequence.
  • CRD is not crosslinked by two disulfide bridges and has a different sequence from those established to date for other members of the family of animal lectins. This latter property was demonstrated by the sequencing of the TGR-CLH clone, which represents an almost total monomer of the receptor and which does not contain a consensus sequence.
  • the CRD fragment (s) is (are) capable of being produced, from the entire receptor, by the following process:
  • proteolytic hydrolysis of the protein of the invention having a GlcNAc thyroid receptor activity the hydrolysis giving rise to protein fragments with a minimum size of 130 to 150 amino acids;
  • CRD can also be produced by chemical synthesis or by recombinant techniques, by the expression of the gene coding for the CRD in an appropriate cell host. In the latter case, transcriptional regulatory sequences are also present, and optionally, sequences which facilitate its expression or its secretion in the chosen host.
  • a preferred example of CRD according to the invention is that located within the sequence coded by nucleotides 16 to 836 of TGR-CLH and corresponding to the deduced amino acids from 6 to 278 (see FIG. 7).
  • the carbohydrate specificity of CRD can optionally be modified or extended by modifying the amino acid sequence of native CRD, depending on its subsequent use.
  • the CRD can be modified to be able to recognize GalNAc or sialic acid, the amino acid sequences responsible for these specificities being known in the art. It is however important that, during such a modification, the binding properties of the ligand at acid pH and its release at neutral pH are maintained. These properties can be tested by using the method described above.
  • proteins and protein fragments of the invention can be used in many different applications.
  • the invention also relates to antibodies directed against the receptor protein of the invention or against a fragment of this protein, these antibodies being specific for said protein.
  • These antibodies can be monoclonal or polyclonal. Their specificity can be ensured by bringing the antibodies into contact with other lectins of the same family, for example, rat hepatic lectin, or with the consensus sequence of the CRD, followed by the elimination of all the antibodies which recognize these related proteins.
  • the antibodies of the invention recognize the primary structure of the receptor. Indeed, it has been found that the denatured receptor induces the formation of antibodies capable of recognizing the native receptor.
  • the antibodies are directed against the protein coded by the sequence TGR-CLH, or a fragment of this protein, for example that coded by the sequence TGR-CLlbis.
  • Polyclonal antibodies directed against a fusion protein including TGR-CLlbis allow recognition of the native protein on fixed or non-fixed cells.
  • Other preferred antibodies according to the invention are those directed against one of the proteins coded by the sequences of FIG. 2. The fact that these sequences do not have homology with other proteins allows the production of specific antibodies for the receiver.
  • the specificity of the antibodies allows their use in vivo or in vitro in the detection of various thyroid dysfunctions. They serve as thyroid cell markers and, more specifically, receptor markers.
  • thyroid cancers exist in two very different forms from a histological point of view:
  • undifferentiated cancers affect the elderly and have a very poor prognosis due to a very rapid development. They are discovered late, and the various treatments have so far been ineffective. They represent 15 to 20% of thyroid cancers.
  • papillary cancers 60 to 70%
  • papillary cancers 60 to 70%
  • the N-Acetylglucosamine receptor is located at the apical part of the thyroid cells. A marking, dense and punctiform, is sometimes also observed in intracytoplasmic compartments.
  • the expression of the receptor is conserved in vesicular carcinomas, but a delocalization of this receptor is observed, the labeling then being basolateral.
  • the expression of the receptor is abolished (absence of labeling) in the epithelial cells forming the papillae, but there is a specific extracellular labeling of the connective tissue forming the chorion.
  • adenomas from carcinomas, papillary carcinomas from vesicular carcinomas and carcinomas from healthy tissue.
  • the invention relates more particularly to a method for the detection and differential identification in vitro of thyroid adenocarcinomas, characterized in that it comprises the following steps:
  • a section of thyroid tissue sample into contact with antibodies recognizing the GlcNAc thyroid receptor, said antibodies being associated with a means allowing their detection, ii) detection of the absence or presence of labeling of the GlcNAc thyroid receptor by antibodies, the adenomas being completely lacking in labeling, the papillary carcinomas being devoid of marking at the level of the epithelial cells forming the papillae, but having a specific extra-cellular marking of the connective tissue forming the chorion, and vesicular carcinomas exhibiting a delocalization of the marking in the basolateral region of the thyrocyte only.
  • Antibodies are detected by all means known in the art: radioactive, fluorescent, enzymatic labeling, with colloidal gold, etc.
  • the antibodies are preferably selected for their specificity for the GlcNAC receptor. That said, if the detection is done in vitro, it is also possible to use, as a first step, antibodies which recognize the receptor, but which also recognize other members of the family. For example, antibodies to the consensus sequence of CRD can be used in this method. The use of this type of antibody is however less advantageous, because of the reduced specificity and affinity.
  • the antibodies used according to this aspect of the invention are either monoclonal antibodies or polyclonal antibodies.
  • a polyclonal serum or a cocktail of monoclonal antibodies is particularly preferred because of the spectrum of recognized epitopes.
  • This aspect of the invention further comprises a kit or kit for the detection and differential identification (s) of carcinomas and thyroid adenomas, characterized in that it comprises:
  • antibodies against the receptor protein of the invention or against the fragment of this protein means allowing the detection of the reaction between said antibodies and the GlcNAc thyroid receptor, for example by enzymatic, radioactive, fluorescent labeling or with silver or avidin.
  • the antibodies specific for the GlcNAc receptor can, thanks to their high specificity, be used in the identification of metastases of thyroid cancers in vivo. Despite the presence of lectins belonging to the same family in these different tissues, the diagnosis is quite specific. It is also possible to couple said antibodies to an agent capable of treating or eradicating metastasis, for example a radioactive agent, or a molecule capable of inducing the destruction of the thyroid receptor. Antibodies coupled to such an agent also form part of the invention.
  • a monoclonal antibody specific for the GlcNAc receptor directed for example against the protein coded by TGR-CLH, or one of its fragments, for example that coded by TGR-CLlbis and TGR- CL5bis.
  • the receptor protein and its fragments can also be used in the diagnosis of autoimmune pathologies, such as Graves' disease and Hashimoto's disease.
  • diagnostic tests involve the use of an antigen that is recognized by the patient's antibodies.
  • the tests Current products often use total preparations of human thyroid membranes, but the autoantigens are poorly represented.
  • Other tests involve the use of thyroperoxidase (TPO) as an antigen.
  • TPO is not, however, the only membrane constituent involved in thyroiditis: there are antibodies directed against the TSH receptor (Greave disease) and others directed against constituents different from TPO. (Bogner U. et al, Acta Endocrinal 1990, 123, 431-437).
  • the invention therefore relates to the use of the receptor protein of the invention, or one of its fragments, as an antigen in the detection of these diseases. More particularly, the invention relates to a method for the detection of autoimmune diseases of the thyroid such as Hashimoto's or Graves' disease, characterized in that it comprises the following steps:
  • the antigen used is a fragment of the receptor
  • This aspect of the invention also relates to a kit or kit for the detection of auto-diseases.
  • thyroid immune systems such as Hashimoto's disease, characterized in that it comprises:
  • the means allowing the detection of the reaction between the protein (or some of its peptide fragments) and the autoantibodies include, for example, when the protein of the invention (or some of its peptide fragments) is (are) fixed ( es) on a solid support, labeled anti-antibody antibodies (for example anti-IgG), or even labeled anti-receptor antibodies which are displaced by the autoantibodies. It is also possible to carry out a "sandwich" test by fixing anti-receptor antibodies on a solid support, followed by the passage of the protein of the invention (or certain of its peptide fragments), previously labeled (es) and finally the biological sample containing the autoantibodies.
  • the invention also relates to a nucleotide sequence coding for at least part of the GlcNAc thyroid receptor, characterized in that it comprises at least 20, and preferably at least 30 or 40 consecutive bases of one of the nucleotide sequences illustrated in Figures 2 or 7, or a sequence which hybridizes with one of these sequences under non-stringent conditions, or the sequence complementary to one of these sequences, or the corresponding RNA sequence.
  • the nucleotide sequences of the invention are in a genetic environment different from that corresponding to the natural chromosome. However, when the sequences consist of genomic DNA, for example when they are derived from the screening of a genomic DNA library, they may contain introns.
  • the sequences which hybridize under these conditions generally have a homology of at least 70%, for example 80%, with the probe sequence.
  • the positive sequences can then be subjected to further screening by hybridization with more astringent conditions by increasing the wash temperatures to 68 ° C and lowering the salinity of the wash buffer to 0.1 x SSC, 0 , 1% SDS.
  • the invention also relates to a method for detecting congenital diseases of the thyroid, such as goiter and juvenile hypothyroidism, characterized in that it comprises:
  • a genomic DNA sample from the patient into contact with at least one probe or primer, comprising the nucleotide sequence according to claim 7 or 8, the DNA having previously been made accessible for hybridization under conditions allowing hybridization between the probe or the primer and the gene coding for the thyroid receptor of GlcNAc carried by genomic DNA;
  • Fragments of the sequences of the invention can also be used as nucleotide primers in the amplification, for example by the polymerase chain reaction, of the gene coding for the thyroid receptor.
  • a pair of primers chosen so that the interesting part of the gene is framed in 5 'and in 3' by the primers.
  • These primers comprise at least 20 consecutive bases and more particularly, at least 25 consecutive bases of the sequences illustrated in FIG. 2.
  • Another aspect of the invention relates to the use of a fragment of the receptor protein, and in particular, the CRD part as a "delay molecule" to increase the half-life of pharmacological agents administered to the body.
  • This phenomenon leads, in the natural situation, to an extension of the residence time of the ligand in the thyrocyte, since its transfer into the lysosomes and its degradation are thus prevented.
  • This property can be applied in other cells of the body, in particular, those accessible to the blood circulation, for example, the liver and the kidney.
  • the CRD is coupled to the pharmacological agent intended to be administered to the body via the circulation.
  • the couple CRD-pharmacological agent circulates in the blood and undergoes the process of internalization, for example, in the cells of the liver and the kidney.
  • the pharmacological agent would be transferred, by endocytosis, to the lysosomes, where it would be hydrolyzed.
  • the pharmacological agent binds to all the membranes of the cellular compartments which have GlcNAc residues and which have a pH close to 5.0 (between 4.8 and 5.1), that is to say say endosomes.
  • the CRD-pharmacological agent couple undergoes the recycling specific to the intracellular membranes, towards the surface of the cell, where the ligand will be released due to the neutral pH (7.0 approximately). The process can then start again.
  • the couple CRD-pharmacological agent is therefore not delivered to the lysosomes, and the half-life of the agent is significantly increased.
  • This aspect of the invention therefore relates to a pharmaceutical composition having a prolonged half-life, characterized in that it comprises a complex consisting on the one hand, of at least one domain for recognition of carbohydrate residues (CRD) of the receptor GlcNAc thyroid, and, on the other hand, a pharmaceutically active product, and optionally a phairmacologically acceptable excipient.
  • CCD carbohydrate residues
  • This system is valid for any type of chemical compound, for example vaccines, enzymes, hormones, macromolecules, drugs. It has the effect of increasing the time of presence of the drug in the circulation. It is therefore particularly advantageous when the drug is very selective, the CRD not being in itself a means of targeting. Its use can be considered both by the cutaneous route (cosmetic, care of wounds and burns) and by blood pathway (decrease in hepatic mediated hepatic clearance).
  • the "delay" effect can be optimized by modifying the selectivity of the CRD so that it recognizes other carbohydrate motifs (N-Acetylgalactosamine, sialic acid, mannose, etc.). This modification can be carried out chemically and / or by mutagenesis. This modification should not affect the pH-dependent nature of the ligand binding.
  • the efficiency of binding to membrane glycans can be increased by the use of CRD oligomers (the "cluster" effect) for each molecule of the pharmacological agent.
  • the ratio between the number of molecules of CRD and the number of molecules of the pharmacological agent is greater than one.
  • the CRDs can all be the same, or on the other hand, it can be an oligomer made up of different types of CRD; on the one hand, CRD, part of which is common to all lectins and, on the other hand, the unique CRD of the GlcNAc receptor.
  • the method used to couple CRD to the pharmacological agent depends on the nature of the agent, how the CRD is made, and the desired ratio between the number of CRD molecules and pharmacological agents.
  • the pharmacological agent is a protein
  • This method results, of course, in a complex composed of one molecule of CRD for each molecule of pharmacological agent.
  • a grouping of CRD molecules for each molecule of pharmacological agent is desired, it is necessary to first manufacture the CRD, either recombinantly, or by purification as described above, or by chemical synthesis, and then coupling them with the pharmacological agent.
  • the method used for coupling is illustrated in Example 8 below.
  • This method can also be used when the ratio between the number of CRD molecules and those of the pharmacological agent is 1, and when the pharmacological agent is not of a protein nature.
  • the CRD is coupled to an agent allowing subsequent visualization by microscopy (for example, horseradish peroxidase, ferritin, etc.), and is placed in the culture medium of the cells being studied. .
  • an agent for example, horseradish peroxidase, ferritin, etc.
  • the CRD of these complexes binds to membrane glycoconjugates (glycolipids, glycans of glycoproteins) due to the acid pH which exists in these compartments, and their path and kinetics of transfer to d Other cell compartments (Golgi, plasma membranes) can be visualized and analyzed by the marker molecules.
  • membrane glycoconjugates glycolipids, glycans of glycoproteins
  • the carbohydrate specificity of CRD can also be modified or extended in order to be able to fix other residues, according to the technique described for other aspects of the invention.
  • FIG. 1 schematically shows the intracellular fate of the thyroglobulin molecules internalized by the thyrocyte.
  • the "mature” molecules (TG) no longer having an accessible N-Acetylglucosamine motif are directed to the lysosomes (Lys) where they are hydrolyzed.
  • FIG. 2 (a) to 2 (h) shows the nucleotide sequences of the EcoRI insertion fragments of seven clones TGRCL-1bis, -CL4, -CL5bis, -CL6, -CL7, -CL10, -CL10c, -CL11, isolated by immunological screening with polyclonal antibodies directed against the purified thyroid receptor. The deduced amino acid sequence for each of the corresponding expression products is also shown.
  • the clone TGR-CL10C represents the sequence complementary to the sequence TGR-CL10.
  • Figure 3 shows the overlap between the sequences of the TGR-C11 and TGR-C15 clones.
  • the protein sequence indicated in FIG. 3 does not correspond to that of the receptor, since this sequence is the sequence complementary to that coding for the receptor,
  • - Figure 5 shows TGR-CL1 and TGR-CL5 sequences which represent the cDNA complementary to the TGR-CL1bis and TGR-CL5bis sequences respectively. The deduced protein sequences of TGR-CL1 and TGR-CL5 therefore do not represent the receptor sequence.
  • FIG. 6a and b shows the sequences of 2 clones TGR-CL3 and TGR-CL3C respectively which represent the direct and complementary partial sequences respectively, of a protein called HSGMS1 (or "human G s ⁇ ") associated with the receptor.
  • HSGMS1 human G s ⁇
  • FIG. 7 shows the TGR-CLH sequence obtained by oligoscreening in the ⁇ gt11 bank with the TGR-CL1bis and TGR-CL5bis probes. It is capable of coding (ATG to +16) for a protein of around 35 kDa having a putative signal peptide (6 to 20) and a putative transmembrane segment (278-298).
  • the sequence TGR-CLH contains the sequences TGR-CLlbis and TGR-CL5bis (amino acids 4 to 135 of TGR-CL1bis correspond to amino acids 67 to 198 of TGR-CLH. Amino acids 4 to 128 of TGR-CL5bis correspond to amino acids 155 to 279 of TGR-CLH). These different regions are indicated on the sequence of FIG. 7.
  • the ATG initiation codon for -CLH is at position +16, the nucleotides upstream of this position being, according to the experimental protocol applied, essentially of vector origin. .
  • FIGS 8 and 9 illustrate the restriction map of the TGR-CLH sequence.
  • This suspension was centrifuged at 12,000 g for 15 minutes and the supernatant was incubated for 3 hours using a rotary shaker with CaCl 2 (final concentration 20 mM), protease inhibitors (10 ⁇ g / ml each of leupeptine, pepstatin and phenylmethylsulfonylfluoride and 10 mM alpha-aminocaproic acid), and 25 ml of ovomucoid AcA 22 affinity gel (2.4 mg protein / ml gel).
  • An alternative method of elution of the receptor which does not use the selectivity of the pH of the receptor, but its specificity of sugar, consisted in eluting it by the addition of N-acetylglucosamine (100 to 250 mM) to the buffer. fixing at acid pH.
  • the eluted material was subjected to an additional purification step under native or denaturing conditions.
  • the purification was carried out by passing the material again through an affinity column comprising ovomucoid (5 ml).
  • the purification was carried out by electroendosmosis using an ELFE device (GENOFIT).
  • GEOFIT electroendosmosis using an ELFE device
  • GlcNAc anti-receptor antibodies Male New Zealand rabbits were immunized by intradermal inoculation with 40 ⁇ g of a denatured GlcNAc receptor preparation (0.5 ml), prepared according to the method described above and emulsified in complete Freund's adjuvant (0.5 ml). Three new subcutaneous injections were made on the 28th, 38th and 60th days using 25 ⁇ g of antigen (1 ml) in incomplete Freund's adjuvant (1 ml). The sera are collected 8, 12 and 16 days after the third boost.
  • the polyclonal antibodies (IgG) directed against the denatured receptor were purified by affinity columns using either protein A or Avid-Al Gel (BioProbe TM).
  • a normal human thyroid cDNA library had been constructed in ⁇ gt 11. After spreading on 92 mm dishes phage-transfected bacteria (5 boxes, 30,000 pfu / box) 15 clones were isolated by immunoscreening on sheet of leaves nitrocellulose with TGRD-Ab (20 ⁇ g / ml), prepared according to the method described above. After two other successive low density screens (700 pfu then 50 pfu / dish), 13 clones were finally confirmed as positive ( ⁇ 1 / 11000 pfu). Their EcoRI insertion fragment was subcloned into the plasmids PUC 18 and then sequenced on the two strands by the method of SANGER et al. Finally, six clones with an open reading frame, compatible with their expression from ⁇ gt 11, and this over more than 123bp, were selected and subjected to a search for sequence homology.
  • TGR-CLlbis The clones, called TGR-CLlbis, -CL4, CL5bis, CL6, CL7, CL10, CL11 are presented in FIG. 2.
  • the complementary sequences of TGR-CLlbis and TGR-CL5bis (called TGR-CL1 and TGR-CL5 respectively) are illustrated in Figure 5.
  • TGR-CL1 and TGR-CL5 The overlap of these two clones TGR-CL1 and TGR-CL5 is illustrated in Figure 3.
  • the rereading of these clones in particular within TGR-CLH made it possible to choose definitively, the orientation direct (see Figure 2a, Figure 2c and Figure 7) and deduce the sequence protein. Homology research results indicated:
  • TGR-C1 Ibis and TGR-C1 5bis present a partial overlapping on approximately 1/4 of each of the clones (see FIG. 7 and legend);
  • TGR-CLH A clone, called TGR-CLH, was obtained by screening the bong with TGR-CLlbis and TGR-CL5bis according to the following protocol: bacteria Y1090 are infected by phages from the bank, previously diluted (50,000 pfu / 30 ⁇ l ) then spread on 150 mm diameter dishes (LB medium, 10 mM MgS0 4 , 50 ⁇ l ml Ampicillin), after formation of the lysis areas, Nylon filters (Durcelon UV, Stratagene) are placed on the box, then immersed in a denaturation solution (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH), neutralized (1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-Hll, pH 7.4) and rinsed (2 x SSC).
  • a denaturation solution 1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH
  • neutralized 1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-Hll, pH 7.4
  • the filters After passing through a UV oven (Stratalinker, Stratagene) and prewashing, the filters are placed in the presence of the TGR-CLlbis and TGR-CL5bis clones previously radiolabelled by random-prime (dCTP ⁇ 32 P (50 ⁇ Ci), for marking 25 ng of DNA, specific activity 10 ° dpm / ⁇ g). 10 positive clones were obtained, including the one with the sequence longest nucleotide, TGR-CLH, has been sequenced (see Figure 7).
  • the vector chosen is pMal (New England-Biolabs) which synthesizes, under IPTG induction, the Maltose Binding Protein.
  • the insert of the TGR-CLlbis clone is inserted into pMAL after prior cutting by EcoRI, after ligation and transfection then mini-preparation in the competent cells, the orientation of the insert is verified by sequencing.
  • the bacteria containing the fusion plasmid are cultured in 1 liter of LB-Ampicillin (50 ⁇ g / ml) until 2-10 8 bacteria / ml are obtained.
  • the bacterial growth is stopped by centrifugation at 4000 xg and the pellet is resuspended in lysis buffer (10 mM phosphate, 30 mM NaCl, 0.25% Tween 20, 10 mM 2-mercaptoethanol, 10 mM Edta, 10 mM EGTA, 10 ⁇ g / ml PMSF).
  • lysis buffer 10 mM phosphate, 30 mM NaCl, 0.25% Tween 20, 10 mM 2-mercaptoethanol, 10 mM Edta, 10 mM EGTA, 10 ⁇ g / ml PMSF.
  • the pellet is centrifuged at 9000 xg for 30 minutes, and the extract is passed through a column of amylase resin retaining MBP. After washing, the fusion protein is eluted with a buffer containing 10 mM maltose and 250 ⁇ l of PMSF.
  • the fusion proteins are visualized with Blue Coomassie on acrylamide gels (10%), and their antigenic properties are tested by Western blot with an anti-MBP and TGRD-Ab anticoprs. Aliquots of the fusion protein (250 ⁇ g / 0.5 ml) are stored at -20 ° C for immunization.
  • Specimens of pathological thyroids fixed in BOUIN and included in paraffin were used for their reactivity with TGRD-Ab.
  • Nonspecific labeling was estimated by the use of IgG sera from pre-immunities prepared according to the same methods as TGRD-Ab and used at the same concentrations.
  • Adenomas are characterized by a loss of cell labeling in the cases observed. No specific extracellular labeling was noted (FIG. 4, h, i). At the periphery of the adenoma, the distinction between pathological tissue and healthy tissue was clearly visualized by the positive labeling of thyrocytes from healthy tissue ( Figure 4, i right part)
  • Papillary carcinomas also lost specific labeling in the epithelial cells forming the papillae ( Figure 4, d).
  • this is the unique characteristic of this type of carcinoma a specific extracellular marking was noted for all the cases observed in certain regions of carcinomas in the connective tissues forming the chorion or surrounding the carcinomas ( Figure 4, e).
  • TGRD-Ab antibodies can be used for the differential diagnosis of thyroid adenocarcinomas. It appears that by following the localization and the level of expression of the receptor GlcNAc by TGRD-Ab, it is possible to differentiate adenomas (tendency to disappear labeling) from papillary cancers (disappearance of cellular labeling, appearance of extracellular labeling ) and vesicular cancers (delocalization of the marking in the basolateral region only).
  • Gallbladder cancers are the most likely to develop metastases.
  • TGRD-Ab antibodies to visualize and eradicate metastases in vivo, in particular those of vesicular cancers.
  • the antibodies are then coupled to radioactive molecules. active or to drugs directed against preparations of purified receptor, recombinant proteins or synthetic peptides mimicking the immunogenic regions of said receptor.
  • Thyroiditis 3 3 It may be noted that despite the use of the denatured form of the receptor, sera antibodies from thyroid patients recognized the thyroid GlcNAc receptor.
  • the purified receptor has also been used, applying the same experimental protocol, for the detection of autoantibodies in the serum of patients suffering from goiter or Graves' disease. In the case of Graves' disease, the presence of autoantibodies has been detected. On the other hand, the results in the case of patients with goiter were less conclusive, no doubt due to the denatured form of the protein used.
  • GlcNAc receptor The positive recognition of the GlcNAc receptor by some patients will make this receptor or its derivatives (recombinant proteins, peptides) a possible candidate to replace (or supplement) the antigens used in current tests.
  • the starting material used, according to this example, in the preparation of CRD was the receptor purified by the method described in Example 1.
  • the steps for the isolation of CRD from the whole receptor were as follows:
  • the CRD-pharmacological agent complex is produced by a coupling between the
  • the technique used can be applied both to CRD produced by proteolysis of the whole receptor, and to CRD produced by recombinant techniques or by chemical synthesis.
  • the steps of this technique are as follows:
  • CRD can be used as a vector making it possible to isolate the fusion protein (s) as well as the CRD-drug complex.

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Abstract

L'invention concerne une protéine ayant une activité de récepteur thyroïdien de N-Acétylglucosamine (GlcNAc) caractérisée en ce qu'elle est consituée de monomères d'un poids moléculaire d'environ 51kDa, un point isoélectrique d'environ 5.2, est sensiblement dépourvue de protéines cellulaires contaminantes et comporte au moins l'une des séquences en acides aminés illustrées dans les figures 2 et 7, ou une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec l'une de ces séquences. L'invention concerne aussi sa méthode de purification, son utilisation dans des tests de diagnostic de pathologies thyroïdiennes. En outre, l'invention concerne des anticorps dirigés contre le récepteur et l'utilisation d'une partie du récepteur comme "molécule de retard", pour prolonger la demi-vie d'un agent pharmacologique.

Description

RECEPTEUR THYROIDIEN DE N-ACETYLGLUCOSAMINE
La présente invention concerne le récepteur prohoπαonal thyroïdien, sa méthode de purification et son utilisation dans des tests de diagnostic de pathologies thyroïdiennes. En outre, l'invention concerne des anticorps dirigés contre le récepteur et l'utilisation d'une partie du récepteur comme "molécule de retard", pour prolonger la demi-vie d'un agent pharmacologique.
Des études sur les mécanismes de l'hormonogénèse et de la sécrétion thyroïdienne ont amené les inventeurs à inférer l'existence d'un récepteur pour les molécules de thyroglobuline, prohormone thyroïdienne. La fonction biologique de ce récepteur est d'augmenter le temps de présence des molécules de thyroglobuline dans les vésicules thyroïdiennes et, par là même, d'optimiser l'hormonogénèse et la sécrétion hormonale.
Les premières tentatives de caractérisation et de purification du récepteur thyroïdien de GlcNAc (Miguelis et al, J. Biol. Chem., Vol 262, 31, pp 15291-15298, Novembre 1987) n'ont permis de récupérer qu'une quantité très faible d'un matériel protéique largement contaminé. Son analyse sur des SDS-PAGE en conditions dénaturantes a révélé une protéine de poids moléculaire d'environ 45 kDa, mais une "traînée" protéique de 43 kDa à 60 kDa a suggéré que la préparation pouvait être contaminée par des protéines cellulaires telles que les cytokératines des cellules épithéliales (40-70 kDa), l'actine, la tubuline (43 kDa) et des protéines de type lectines, c'est-à-dire de même famille, telles que les récepteurs de mannose-6-phosphate (43 kDa). Cette préparation contaminée n'a pu être purifiée plus avant et n'a pu permettre ni la caractérisation complète, ni le séquençage du récepteur, ni la préparation d'anticorps spécifiques au récepteur.
Le récepteur a pu être classé comme membre de la famille des lectines animales dépendant du calcium, lorsqu'il a été observé : 1) que la fixation des ligands nécessitait la présence de calcium à des concentrations physiologiques (cf MIQUELIS et al, Ibid) et 2) que des anticorps générés chez le lapin par une séquence consensus présente chez ces lectines reconnaissaient la préparation du récepteur thyroïdien (Blanck O. et al, 1990, Biochem. Biophys. Res. Corn. 169, 880-887). Cette famille de lectines animales ne possède en commun qu'un domaine, celui de reconnaissance des résidus glucidiques (ou "carbohydrate récognition domain", C.R.D.), constitué d'environ 130 acides aminés. On note 11 résidus invariants présents dans toutes les espèces animales étudiées (allant des plus simples, comme l'oursin et le papillon, jusqu'aux mammifères), et environ 50 % d'homologie parmi les lectines des vertébrés.
D'autres membres de la famille des lectines dépendantes du calcium sont les lectines hépatiques de poulet, de lapin et de rat (Drickamer K., 1981, J. Biol. Chem., 256, 5827-5839 ; Hudgin R.L. et al, 1974, J. Biol. Chem. 17, 5536-5543 ; et Bischoff J. et al, 1987, J. Biol. Chem., 262, 11825-11832). Ces lectines lient leurs ligands à pH neutre et les libèrent à pH acide.
Le problème technique qui s'est posé lors de l'élaboration de la présente invention était de fournir une préparation du récepteur thyroïdien de pureté et en quantité suffisamment élevées pour pouvoir le caractériser complètement, et préparer des anticorps spécifiques au récepteur.
Les inventeurs ont maintenant mis au point une méthode de purification du récepteur qui permet d'obtenir, dans des quantités micromolaires, une préparation dépourvue de contaminants. Cette méthode fait partie des objets de la présente invention.
Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé de purification du récepteur thyroïdien de GlcNAc, caractérisée en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes :
i) passage sur tamis d'un éminçage de tissu thyroïdien, par exemple, des follicules thyroïdiens ; ii) lavage des épithélia ainsi obtenus à des conditions de pH neutre, et en présence d'E.D.T.A. ; iii) précipitation des épithélia à l'acétone, produisant ainsi une "poudre d'acétone" ;
iv) passage à pH = 5.0 environ, (entre 4.8 et 5.1) d'une suspension de la poudre d'acétone sur une colonne d'affinité comportant des groupements ou "clusters" de GlcNAc accessibles, par exemple sous forme d'ovomucoïdes ou d'asialogalactoprotéines, et élution soit à pH neutre, par exemple entre 6.5 et 8.2, soit par l'addition de N-Acétylglucosamine dans le tampon de fixation, des protéines ainsi fixées ; v) éventuellement, répétition de l'étape (iv) ou électroendosmose des protéines éluées sur SDS-PAGE.
Cette nouvelle méthode comporte plusieurs changements par rapport à la méthode utilisée en 1987, notamment :
- élimination du tissu conjonctif extracellulaire et de la membrane basale, la plus pauvre en récepteurs de GlcNAc, par l'éminçage du tissu et le passage forcé sur tamis ; - lavages des épithélia ainsi obtenus à des conditions de pH neutre et en présence d'EDTA afin d'éliminer des ligands endogènes (thyroglobuline présente à 100-200 mg/ml) ;
- utilisation d'une poudre d'acétone afin de diminuer les volumes de la préparation à purifier ;
- prise en compte du fait que le récepteur est polymérique (2 à 3 monomères) et utilisation comme ligand d'une molécule présentant des groupements ou "clusters" de GlcNAc accessible et possédant ainsi une meilleure affinité ;
- une deuxième étape de purification sur SDS-PAGE peut être utilisée si des rendements élevés sont souhaités.
La deuxième étape de purification entraîne la dénaturation de la protéine. Il a été constaté que le récepteur dénaturé peut servir à la génération d'anticorps qui reconnaissent le récepteur dans sa forme native.
Selon un mode de réalisation préféré, l'étape (v) consiste en l'électroendosmose sur gel de polyacrylamide en présence de SDS. La colonne d'affinité de l'étape (iv) comporte, de préférence, de l'ovomucoïde.
Cette méthode peut être utilisée pour purifier le récepteur thyroïdien humain, porcin ou de toute autre espèce de mammifère, et permet la préparation du récepteur à l'échelle industrielle.
Grâce à cette méthode, le récepteur a pu être complètement caractérisé. Il s'agit d'un récepteur protéique, constitué de 2 à 3 monomères homologues ou différents dans leur séquence en acides aminés, chaque monomère ayant un poids moléculaire d'environ 51 kDa déterminé en gel dénaturant en présence de Triton X-100. Chaque monomère comporte environ 510 acides aminés. Le récepteur est spécifique des résidus N- Acétylglucosamine, c'est-à-dire des résidus glycanniques portés par la molécule de thyroglobuline. Il est localisé essentiellement dans la partie apicale des thyrocytes. L'une des caractéristiques les plus remarquables est qu'il lie les ligands à pH acide, c'est-à-dire entre pH = 4.8 et pH = 5.1, et les libère à pH neutre, par exemple entre pH = 6.5 et pH = 8.2. L'association avec son ligand se fait selon un mécanisme d'association positive. La liaison entre la molécule de thyroglobuline et le récepteur est d'autant plus importante que la molécule de thyroglobuline est plus immature, c'est-à-dire plus riche en résidus N-Acétylglucosamine accessibles. En effet, la molécule mature est caractérisée par un certain contenu en iode et un masquage des résidus glucidiques reconnus par le récepteur. Le récepteur purifié est reconnu par des anticorps dirigés contre la lectine hépatique de rat et ceux dirigés contre la séquence consensus du CRD de la famille des lectines dépendant du calcium. La séquence partielle en acides aminés du récepteur a également été élucidée.
L'invention vise également la préparation purifiée du récepteur. Plus particulièrement, 1 ' invention concerne une protéine ayant une activité de récepteur thyroïdien de N-Acétylglucosamine (GlcNAc) caractérisée en ce qu'elle est constituée de monomères d'un poids moléculaire d'environ 51 kDa, un point isoélectrique d'environ 5.2, est sensiblement dépourvue de protéines cellulaires contaminantes et comporte au moins l'une des séquences en acides aminés illustrées dans les figures 2 et 7, ou une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec l'une de ces séquences. Il est à noter que le poids moléculaire de 51kDa est celui déterminé en gel d'acrylamide dénaturant en présence de Triton-X 100 et correspond ainsi au monomère dans un environnement de détergent lipidique. Sans détergent, le poids moléculaire de la protéine monomérique est d ' environ 40 kDa.
Dans ce qui suit, la désignation "protéine réceptrice de l'invention" signifie une protéine présentant l'ensemble des caractéristiques indiquées ci-dessus, et englobe le récepteur oligomérique, ainsi que ses sous-unités monomériques possédant l'activité de récepteur.
Les inventeurs ont déterminé le mécanisme d'action du récepteur. Il est impliqué dans 1 'hormonogénèse et la sécrétion thyroïdiennes de la manière suivante :
- toutes les molécules de thyroglobuline (prohormones thyroïdiennes) présentes dans les lumières des follicules thyroïdiens peuvent être internaiisées (endocytées) par les thyrocytes et convoyées dans des compartiments endosomiaux, compartiments communs à toutes les voies d'endocytose.
- dans ces compartiments, les molécules de prohormones immatures (caractérisées par leur faible contenu en iode et en hormones et par leur contenu élevé en résidus de N-Acétylglucosamine accessibles) se lient au récepteur de N-Acétylglucosamine (la liaison est optimale aux pH acides entre 4.8 et 5.1).
- ce récepteur convoie les molécules de prohormones vers la partie apicale des thyrocytes, là où se trouve la thyropéroxydase, enzyme qui permet la fixation de l'iode sur les résidus tyrosyls et le couplage subséquent des résidus tyrosyls pour la formation des hormones thyroïdiennes. Ce convoiement s'effectue grâce à une partie "motrice" du récepteur qui est capable de provoquer le détachement du récepteur entier de la membrane par un processus de "bourgeonnement" ou "budding" formant de nouvelles vésicules intra-cellulaires. - des recyclages successifs permettent d'accroître le contenu en hormone des molécules de thyroglobuline et d'éviter leur adressage vers les lysosomes et donc leur dégradation. Des recyclages via le Golgi permettent des glycosylations complémentaires qui conduisent à la disparition des résidus de N-Acétylglucosamine accessibles et à l'apparition de galactose puis d'acide sialique.
Le recyclage des molécules de thyroglobuline internalisées est illustré schématiquement dans la figure 1.
Dans le contexte de l'invention, une "activité de récepteur thyroïdien de GlcNAc" signifie que la protéine en question fixe spécifiquement des résidus de GlcNAc à pH = 5.0 environ (et plus précisément entre pH = 4.8 et pH = 5.1) et les libère à pH neutre. En outre, il permet le convoiement intracellulaire de molécules possédant des motifs GlcNAc, en présence de Ca2+, empêchant ainsi leur adressage vers les lysosomes et donc leur dégradation. Le pH acide entre 4.8 et 5.1 correspond aux valeurs physiologiques trouvées dans les compartiments endosomiaux. La fixation spécifique de GlcNAc à pH acide, c'est-à-dire entre pH 4.8 et pH = 5.1, en particulier pH = 5.0, peut être testée, soit sur colonne de GlcNAc-gel, soit par blot sur feuilles de nitrocellulose sur lesquelles des molécules présentant des résidus GlcNAc terminaux (par exemple des néoglycoprotéines, protéines partiellement déglycosylées ou ovomucoïde) ont été préalablement déposées.
La capacité d'empêcher la dégradation de molécules portant des motifs GlcNAc peut être confirmée de la manière suivante. La protéine réceptrice est introduite dans une cellule (par exemple, un fibroblaste) par transfection permanente, ou par expression du gène recombinant. Ensuite, deux molécules, l'une portant des résidus glucidiques reconnus par le récepteur (GlcNAc) et l'autre portant des résidus non reconnus par le récepteur, chacune étant marquée par un marqueur différent, sont rajoutées au milieu de culture. Le devenir métabolique de chaque molécule peut ensuite être déterminé grâce aux marqueurs. La dégradation de la molécule portant des résidus GlcNAc est plus lente de celle de l'autre molécule lorsque la protéine réceptrice présente une activité de récepteur thyroïdien de GlcNAC.
Les protéines réceptrices de l'invention comportent au moins l'une des séquences en acides aminés TGR-CL1bis, -CL4, -CL5 bis, -CL6, -CL7, -CL10, -CL10C, -CL11 et -CLH illustrées dans les figures 2 et 7, ou une séquence présentant au moins 80 %, et de préférence au moins 90 %, d'homologie avec l'une de ces séquences, à condition que l'a'tivité de récepteur thyroïdien soit présente. Ces séquences, déterminées par les inventeurs, correspondent au récepteur humain et font probablement partie de la zone d'extension membranaire extracellulaire. Le manque d'homologie de ces séquences avec d'autres lectines animales et l'absence de pont disulfure suggèrent que les séquences ne correspondent pas à la partie CRD de la molécule ou qu'au moins l'un des monomères du récepteur possède, au sein de sa séquence, ou par association d'au moins deux monomères, un CRD (de spécificité N-acétylglucosamine) différent des séquences établies à ce jour pour d'autres membres de la famille des lectines animales.
Comme exemples de protéines comportant une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec l'une des séquences illustrées, on peut citer des protéines obtenues par substitution, délétion ou insertion d'un ou plusieurs acides aminés de la séquence naturelle. Ces protéines homologues peuvent être préparées, par exemple, par la méthode de purification de l'invention, suivie éventuellement de modification de la séquence de la protéine ainsi produite, et vérification des propriétés réceptrices. Les protéines de l'invention peuvent également être fabriquées par voie recombinante dans un hôte cellulaire compétent, la séquence codant pour la protéine étant sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées. En cas de production par voie recombinante, il est possible de produire la protéine sous forme de protéine de fusion dans les cas où ceci facilitera son expression, son marquage, ou son transport dans certains hôtes cellulaires. Comme exemples d'hôtes cellulaires, on peut citer E. coli et Bacillus, ainsi que les souches de levure et les cellules de mammifères habituellement utilisées pour l'expression de protéines recombinantes. Les protéines de l'invention peuvent aussi être produites par synthèse chimique.
Une protéine particulièrement préférée selon l'invention est celle qui comporte au moins la séquence en acides aminés codés par TGR-CLH et indiquée dans la figure 7. Cette protéine TGR-CLH est fabriquée, de préférence, par voie recombinante. Cette protéine constitue la presque totalité d'un monomères au moins du récepteur.
Les protéines de l'invention sont sensiblement dépourvues de contaminants, en particulier les cytokératines de cellules épithéliales, l'actine, la tubuline et les protéines de type lectines, telles que le récepteur de mannose-6-phosphate. "Sensiblement dépourvues" signifie que la quantité de contaminants présents ne permet pas leur détection sur gel d ' électrophorèse et ne donne pas lieu à la formation d ' anticorps contre les contaminants.
Les protéines de l'invention peuvent parfois être associées, dans l'environnement physiologique, à des protéines de "transduction". Une telle protéine est la protéines Gsα (sous-unité α de la "guanine nucléotide binding protein") dont une partie de la séquence, en sens direct et inverse est illustrée dans la figure 6.
L'invention concerne également des fragments peptidiques de la protéine de l'invention. Ces fragments sont caractérisés en ce qu ' ils sont reconnus par un sérum polyclonal ou par au moins certains des anticorps monoclonaux générés par la protéine réceptrice entière. Cette propriété signifie que le fragment en question présente au moins une partie des caractéristiques immunologiques de la protéine réceptrice. Normalement, ces fragments comportent au moins 6 acides aminés, et de préférence, au moins 12 ou au moins 15 acides aminés. Dans le contexte de l'invention, le terme "fragment" signifie un enchaînement d'acides aminés allant du peptide ayant au moins 6 acides aminés jusqu'à un polypeptide d'environ 510 acides aminés. Lorsque le fragment possède une taille d'environ 500 à 510 acides aminés, il peut s'agir de l'une des sous-unités monomériques du récepteur. Il est possible que certains de ces fragments retiennent l'activité du récepteur thyroïdien. Ceci étant, cette activité n'est pas obligatoirement présente selon cet aspect de l'invention, l'important étant qu'au moins une partie des caractéristiques immunologiques du récepteur soit retenue. Des fragments particulièrement préférés sont des fragments comportant au moins 6 acides aminés consécutifs ou même la totalité de l'une des séquences : TGR-CL1bis, TGR-CL4, TGR-CL5bis, TGR-CL6, TGR-CL7, TGR-CL10, TGR-CLH et TGR-CLH illustrées dans les figures 2 et 7. Un fragment comportant au moins la séquence codée par les nucleotides 16 à 834 et correspondant aux acides aminés déduits de 6 à 278 de TGR-CLH et illustrée dans la figure 7 est particulièrement préféré.
Selon cet aspect de l'invention, il est possible de fusionner deux ou plusieurs de ces fragments en tête-à-queue, pourvu que les conditions immunologiques évoquées ci-dessus soient satisfaites.
Les fragments protéiques de l'invention peuvent aussi faire partie de molécules "hybrides" qui comportent d'une part, une partie provenant d'une molécule autre que le récepteur thyroïdien et d'autre part, le fragment du récepteur ayant au moins six acides aminés. On citera comme exemples de ce type de molécule, un fragment du récepteur couplé à une molécule porteuse pour optimiser les propriétés immunogéniques des plus petits fragments (le fragment étant alors un haptène), ou encore un fragment du récepteur couplé à un marqueur permettant sa visualisation ou à un agent permettant son ciblage.
Les fragments de l'invention sont produits par hydrolyse du récepteur entier, par voie recombinante ou encore par synthèse chimique.
Un fragment peptidique du récepteur qui est particulièrement préféré selon l'invention est la partie constituant le domaine de reconnaissance des résidus glucidiques, ou C.R.D. Cette partie de la molécule est responsable de la spécificité glucidique du récepteur et de la fixation du ligand à pH acide (entre 4.8 et 5.1). Le CRD comporte environ 130 à 150 acides aminés et est probablement situé à l'une des extrémités de la protéines, c'est-à-dire à l'extrémité N ou C terminale du récepteur. Pour certains monomères, il pourrait être réticulé par 2 ponts disulfure et comporte une partie homologue à la séquence consensus présente dans les CRD des autres membres de la famille des lectines dépendant du calcium. Cette propriété est mise en évidence par la reconnaissance du récepteur par des anticorps générés par la séquence consensus. Pour d'autres monomères, le CRD n'est pas réticulé par deux ponts disulfures et présente une séquence différente de celles établies à ce jour pour d'autres membres de la famille des lectines animales. Cette dernière propriété a été mise en évidence par le séquençage du clone TGR-CLH, qui représente un monomère quasi-total du récepteur et qui ne contient pas de séquence consensus.
Le ou les fragment(s) CRD est (sont) susceptible (s) d'être produit(s), à partir du récepteur entier, par le procédé suivant :
i) hydrolyse protéolytique de la protéine de l'invention ayant une activité de récepteur thyroïdien de GlcNAc, l'hydrolyse donnant lieu à des fragments protéique d'une taille minimum de 130 à 150 acides aminés ;
ii) ajustement du pH des milieux d'hydrolyse à un pH d'environ 5.0 (plus particulièrement entre 4.8 et 5.1) et addition de Ca2+ ;
iii) passage, à pH = 5.0 environ, des fragments d'hydrolyse sur colonne d'affinité comportant des groupements ou "clusters" de résidus GlcNAc, par exemple de l'ovomucoïde ;
iv) élution, à pH neutre, des fragments retenus ;
v) tamisage moléculaire des fragments élues et sélection des fragments les plus petits.
Bien entendu, le CRD peut également être produit par synthèse chimique ou par des techniques recombinantes, par l'expression du gène codant pour le CRD dans un hôte cellulaire approprié. Dans ce dernier cas, des séquences régulatrices de transcription sont également présentes, et éventuellement, des séquences facilitant son expression ou sa sécrétion dans l'hôte choisi. Les propriétés de fixation spécifique de GlcNAc à pH = 5.0 environ permet la purification du CRD à partir du milieu de culture. Il est avantageux d'employer dans l'étape de purification une colonne d'affinité comportant des molécules riches en GlcNAc, par exemple l'ovomucoïde. Un exemple préféré de CRD selon l'invention est celui situé au sein de la séquence codée par les nucleotides 16 à 836 de TGR-CLH et correspondant aux acides aminés déduits de 6 à 278 (voir figure 7).
La spécificité glucidique du CRD peut éventuellement être modifiée ou élargie par la modification de la séquence en acides aminés du CRD natif, en fonction de son utilisation ultérieure. Par exemple, le CRD peut être modifié pour pouvoir reconnaître le GalNAc ou l'acide sialique, les séquences en acides aminés responsables de ces spécificités étant connues dans l'art. Il est cependant important que, lors d'une telle modification, les propriétés de fixation du ligand à pH acide et sa libération à pH neutre soient maintenues. Ces propriétés peuvent être testées par l'utilisation de la méthode décrite plus haut.
Les protéines et les fragments protéiques de l'invention peuvent être utilisés dans de nombreuses applications différentes.
Tout d'abord, ils peuvent servir à la génération d'anticorps reconnaissant le récepteur. L'invention vise également des anticorps dirigés contre la protéine réceptrice de l'invention ou contre un fragment de cette protéine, ces anticorps étant spécifiques de ladite protéine. Ces anticorps peuvent être monoclonaux ou polyclonaux. Leur spécificité peut être assurée par mise en contact des anticorps avec d'autres lectines de la même famille, par exemple, la lectine hépatique de rat, ou avec la séquence consensus du CRD, suivie par l'élimination de tous les anticorps qui reconnaissent ces protéines apparentées. De préférence, les anticorps de l'invention reconnaissent la structure primaire du récepteur. En effet, il a été constaté que le récepteur dénaturé induit la formation d'anticorps capables de reconnaître le récepteur natif. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les anticorps sont dirigés contre la protéine codée par la séquence TGR- CLH, ou un fragment de cette protéine, par exemple celle codée par la séquence TGR-CLlbis. Des anticorps polyclonaux dirigés contre une protéine de fusion incluant TGR-CLlbis permettent la reconnaissance de la protéine native sur les cellules fixées ou non-fixées. D * autres anticorps préférés selon l'invention sont ceux dirigés contre l'une des protéines codées par les séquences de la figure 2. Le fait que ces séquences ne présentent pas d'homologie avec d'autres protéines permet la production d'anticorps spécifiques pour le récepteur.
La spécificité des anticorps permet leur utilisation in vivo ou in vitro dans la détection de différents dysfonctionnements thyroïdiens. Ils servent de marqueurs cellulaires thyroïdiens et, plus précisément, de marqueurs du récepteur.
Grâce à ces marqueurs, les inventeurs ont constaté que, dans les affections engendrant d'importants bouleversements cellulaires telles que les cancers, l'expression du récepteur était modifiée. Les cancers thyroïdiens existent sous deux formes très différentes d'un point de vue histologique :
- les cancers dits "indifférenciés" touchent le sujet âgé et sont de très mauvais pronostic du fait d'une évolution très rapide. Ils sont découverts tard, et les divers traitements ont été jusqu'à présent inefficaces. Ils représentent 15 à 20 % des cancers thyroïdiens.
- les autres sont dits "différenciés". On distingue dans ce groupe :
i) les cancers papillaires (60 à 70 %), qui naissent plutôt chez le sujet jeune mais ne deviennent visibles que vers 40 à 60 ans, qui ont une évolution très lente, qui essaiment précocement pour donner des métastases locorégionales d'évolution très lente aussi, sans créer de dommage grave ;
ii) les cancers vésiculaires bien différenciés (10 %) qui évoluent lentement, donnant des métastases à distance (lymphatiques, pulmonaires, osseuses) souvent découvertes avant le foyer primaire ;
iii) les cancers vésiculaires moyennement différenciés ou trabéculaires (15 %), plus graves que les précédents par une aptitude à métastaser plus grande.
60 % de ces cancers sont découverts seulement après l'exérèse d'un nodule froid à la scintigraphie suivie de son analyse histologique, qui se révèle très souvent difficile, étant donné le polymorphisme des structures thyroïdiennes. Il existe en outre d'autres méthodes de détection, par exemple, l'utilisation d'anticorps anti-thyropéroxydase (De Micco et al, Thyroperoxidase and Thyroïd autoimmunity, Ed. P. Carayon, J. Ruf., Colloque INSERM 1990, vol. 207, pp 133-136) ou d'anticorps dirigés contre un antigène de carcinome thyroïdien d'environ 250 kDa (EP-A-0370768). Ces méthodes ne permettent pas la distinction entre les cancers vésiculaires et les cancers papillaires. De plus, il est souvent nécessaire de les utiliser en combinaison avec les tests histologiques.
Les inventeurs, en utilisant les anticorps antirécepteur de l'i'vention, ont constaté que :
- sur les portions de tissu sain des pièces d'exérèses, le récepteur de N-Acétylglucosamine est localisé à la partie apicale des cellules thyroïdiennes. Un marquage, dense et punctiforme, est parfois aussi observé dans des compartiments intracytoplasmiques.
- l'expression du récepteur est abolie (absence de marquage) dans les adénomes thyroïdiens.
- l'expression du récepteur est conservée dans les carcinomes vésiculaires, mais on observe une délocalisation de ce récepteur, le marquage étant alors basolatéral.
- dans les carcinomes papillaires, l'expression du récepteur est abolie (absence de marquage) au niveau des cellules épithéliales formant les papilles, mais il y a un marquage spécifique extracellulaire du tissu conjonctif formant le chorion.
Il est ainsi possible de différencier les adénomes des carcinomes, les carcinomes papillaires des carcinomes vésiculaires et les carcinomes du tissu sain.
L'invention concerne plus particulièrement un procédé pour la détection et l'identification différentielle in vitro d'adénocarcinomes thyroïdiens, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
i) mise en contact d'une coupe de prélèvement de tissu thyroïdien avec des anticorps reconnaissant le récepteur thyroïdien de GlcNAc, lesdits anticorps étant associés à un moyen permettant leur détection, ii) détection de l'absence ou de la présence de marquage du récepteur thyroïdien GlcNAc par les anticorps, les adénomes étant totalement dépourvus de marquage, les carcinomes papillaires étant dépourvus de marquage au niveau des cellules épithéliales formant les papilles, mais présentant un marquage spécifique extra-cellulaire du tissu conjonctif formant le chorion, et les carcinomes vésiculaires présentant une délocalisation du marquage dans la seule région basolatérale du thyrocyte.
La détection des anticorps s'effectue par tous les moyens connus dans l'art : marquage radio-actif, fluorescent, enzymatique, à l'or colloïdal etc...
Selon cet aspect de l'invention, les anticorps sont de préférence sélectionnés pour leur spécificité pour le récepteur GlcNAC. Ceci étant, si la détection se fait in vitro, il est également possible d'utiliser, dans un premier temps, des anticorps qui reconnaissent le récepteur, mais qui reconnaissent également d'autres membres de la famille. Par exemple, les anticorps dirigés contre la séquence consensus du CRD peuvent être utilisés dans cette méthode. L'utilisation de ce type d'anticorps est cependant moins avantageuse, en raison de la spécificité et de l'affinité réduites.
Les anticorps employés selon cet aspect de l'invention sont, soit des anticorps monoclonaux, soit des anticorps polyclonaux. Un sérum polyclonal ou un cocktail d'anticorps monoclonaux est particulièrement préféré en raison du spectre d'épitopes reconnus.
Cet aspect de l'invention comprend, en outre, un kit ou nécessaire pour la détection et l'identification différentielle (s) de carcinomes et d'adénomes thyroïdiens, caractérisé en ce qu'il comprend :
i) anticorps contre la protéine réceptrice de l'invention ou contre le fragment de cette protéine ; ii) des moyens permettant la détection de la réaction entre lesdits anticorps et le récepteur thyroïdien GlcNAc, par exemple par marquage enzymatique, radioactif, fluorescent ou par l'argent ou l'avidine.
Les anticorps spécifiques du récepteur GlcNAc peuvent, grâce à leur spécificité élevée, être utilisés dans l'identification de métastases de cancers thyroïdiens in vivo. Malgré la présence de lectines appartenant à la même famille dans ces différents tissus, le diagnostic est tout à fait spécifique. Il est également possible de coupler lesdits anticorps à un agent capable de traiter ou d'éradiquer la métastase, par exemple un agent radioactif, ou une molécule capable d'induire la destruction du récepteur thyroïdien. Les anticorps couplés à un tel agent font également partie de l'invention. Il est particulièrement préféré d'utiliser un anticorps monoclonal spécifique au récepteur GlcNAc selon cet aspect de l'invention dirigé par exemple contre la protéine codée par TGR-CLH, ou un de ses fragments, par exemple celui codé par TGR-CLlbis et TGR-CL5bis.
La protéine réceptrice et ses fragments peuvent aussi être utilisés dans le diagnostic des pathologies auto-immunes, telles que la maladie de Basedow et celle d'Hashimoto. En effet, les inventeurs ont mis en évidence la présence d'auto-anticorps contre le récepteur GlcNAc chez des personnes atteintes de ce genre de maladie. En règle générale, les tests de diagnostic impliquent l'utilisation d'un antigène qui est reconnu par les anticorps du patient. Les tests actuels utilisent souvent des préparations totales de membranes thyroïdiennes humaines, mais les autoantigènes y sont faiblement représentés. D' autres tests impliquent l'utilisation de la thyroperoxidase (TPO) comme antigène. La TPO n'est cependant pas le seul constituant membranaire impliqué dans les thyroïdites : il existe des anticorps dirigés contre le récepteur de TSH (maladie de Greave) et d'autres dirigés contre des constituants différents de la TPO. (Bogner U. et al, Acta Endocrinal 1990, 123, 431-437).
L'invention concerne donc l'utilisation de la protéine réceptrice de l'invention, ou de l'un de ses fragments, comme antigène dans la détection de ces maladies. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour la détection de maladies auto-immunes de la thyroïde telles que la maladie d'Hashimoto ou de Basedow, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
i) mise en contact d'un échantillon biologique avec la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou avec le fragment de la revendication 5 ou 6 ;
ii) détection de la réaction entre la protéine ou le fragment et des anticorps anti-récepteurs GlcNAc dans l'échantillon par des moyens connus en soi.
Il a été constaté que l'utilisation de la protéine réceptrice, ou de ses fragments, conduit à la détection de maladies auto-immunes, même dans des cas où l'utilisation d'anticorps antimicrosomiaux et antithyroglobuline avait donné des résultats négatifs.
Dans le cas où l'antigène utilisé est un fragment du récepteur, il est important de vérifier que le fragment en question possède au moins certains des épitopes reconnus par les auto-anticorps.
Cet aspect de 1 ' invention vise également un kit ou nécessaire pour la détection de maladies auto- immunes de la thyroïde telles que la maladie d 'Hashimoto, caractérisé en ce qu'il comprend :
i) protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou un fragment selon la revendication 5 ou 6 ; ii) des moyens permettant la détection d'une réaction entre ladite protéine ou ledit fragment et des anticorps anti-récepteur GlcNAc, tels que des anticorps anti-anticorps ou des anticorps antiprotéine.
Les moyens permettant la détection de la réaction entre la protéine (ou certains de ses fragments peptidiques) et les auto-anticorps comprennent, par exemple, lorsque la protéine de l'invention (ou certains de ses fragments peptidiques) est (sont) fixée (es) sur un support solide, des anticorps antianticorps marqués (par exemple anti-lgG), ou encore des anticorps anti-récepteurs marqués qui sont déplacés par les auto-anticorps. Il est également possible d'effectuer un essai "sandwich" en fixant sur un support solide des anticorps anti-récepteur, suivi par le passage de la protéine de l'invention (ou certains de ses fragments peptidiques), préalablement marquée (es) et enfin de l'échantillon biologique contenant les auto-anticorps.
L'invention vise également une séquence nucléotidique codant pour au moins une partie du récepteur thyroïdien de GlcNAc, caractérisée en ce qu'il comprend au moins 20, et de préférence au moins 30 ou 40 bases consécutives de l'une des séquences nucléotidiques illustrées dans les figures 2 ou 7, ou d'une séquence qui hybride avec l'une de ces séquences dans des conditions non stringentes, ou encore de la séquence complémentaire à l'une de ces séquences, ou encore la séquence ARN correspondante. Les séquences nucléotidiques de l'i'vention sont dans un environnement génétique différent de celui correspondant au chromosome naturel. Néanmoins, lorsque les séquences sont constituées d'ADN génomique, par exemple lorsqu'elles sont issues du criblage d'une banque d'ADN génomique, il se peut qu'elles contiennent des introns.
Les conditions non-stringentes évoquées dans cette définition sont les suivantes : l ' hybridation s'effectue sur des filtres de nitrocellulose ou de nylon avec la sonde oligonucleotidique (séquence de l'invention) marquée au 32P, mise en solution dans 20 % formamide, 6x SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM Sodium phosphate pH = 7.6, 5 x de solution de Denhart, 0,1 % SDS, et 50 μg/ml de DNA de sperme de saumon dénaturé. L'incubation s'effectue toute une nuit à 42 °C. Les filtres sont ensuite lavés avec 2 x SSC, 0,1 % SDS, à 42°C et ce, deux fois durant 30 minutes, puis autoradiographiés. Les séquences qui hybrident dans ces conditions présentent en général une homologie d'au moins 70 %, par exemple 80 %, avec la séquence sonde.
Les séquences positives peuvent ensuite être soumises à d'autres criblages par hybridation avec des conditions plus astringentes en augmentant les températures de lavage jusqu'à 68 °C et en diminuant la salinité du tampon de lavage jusqu'à 0,1 x SSC, 0,1 % SDS.
Ces séquences peuvent servir de sondes dans la détection du gène codant pour le récepteur, let par conséquent, dans la détection d'anomalies par rapport à un gène sain. En effet, le rôle du récepteur thyroïdien de GlcNAc dans l'optimisation de l'h'rmonogénèse a conduit les inventeurs à penser qu'une anomalie dans son métabolisme, soit dans l'expression de son gène, soit dans la structure de la protéine synthétisée, pourrait avoir des conséquences directes sur la production hormonale de la glande, entraînant ainsi une pathologie thyroïdienne, par exemple, le goitre, l'hypothyroïdie et l'hyperthyroïdie.
L'invention concerne aussi un procédé de détection de maladies congénitales de la thyroïde, telles que le goitre et l'hypothyroïdisme juvénile caractérisé en ce qu'il comprend :
i) mise en contact d'un échantillon d'ADN génomique du patient avec au moins une sonde ou une amorce, comportant la séquence nucléotidique selon la revendication 7 ou 8, l'ADN ayant été préalablement rendu accessible à l'hybridation dans des conditions permettant l'hybridation entre la sonde ou l'amorce et le gène codant pour le récepteur thyroïdien de GlcNAc porté par l'ADN génomique ;
ii) éventuellement, l'amplification de l'ADN génomique :
iii) dénaturation de l'ADN hybride ;
iv) analyse de la séquence génomique ainsi isolée pour mettre en évidence des altérations par rapport au gène sain.
Des fragments des séquences de l'invention peuvent aussi être utilisés comme amorces nucléotidiques dans l'amplification, par exemple par la réaction de polymérase en chaîne, du gène codant pour le récepteur thyroïdien. Bien entendu, il est préférable d'utiliser un couple d'amorces, choisi de façon à ce que la partie intéressante du gène soit encadrée en 5' et en 3' par les amorces. Ces amorces comportent au moins 20 bases consécutives et plus particulièrement, au moins 25 bases consécutives des séquences illustrées dans la figure 2. Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'un fragment de la protéine réceptrice, et notamment, la partie CRD comme "molécule de retard" pour augmenter la demi-vie d'agents pharmacologiques administrés au corps.
Cet aspect de l ' invention exploite une propriété unique du CRD du récepteur, c'est-à-dire la fixation du ligand (GlcNAc) à pH = 5 environ, plus particulièrement entre 4.8 et 5.1 et sa libération à pH neutre, par exemple entre 6.5 et 8.2. Ce phénomène conduit, dans la situation naturelle, à une prolongation du temps de séjour du ligand dans le thyrocyte, puisque son transfert dans les lysosomes et sa dégradation sont ainsi empêchés.
Cette propriété peut être appliquée dans d'autres cellules du corps, en particulier, celles accessibles à la circulation sanguine, par exemple, le foie et le rein.
Toutes les macromolécules solubles, internalisées par une cellule, sont destinées à être délivrées aux lysosomes, via les endosomes, pour y être dégradées. Ce processus détermine leur durée de vie et diminue ainsi l'efficacité de certains agents pharmacologiques (hormones, préparations vaccinales, macromolécules, médicaments). L'internalisation de soluté extracellulaire est un phénomène inhérent à toute activité cellulaire et ne peut être modifié. Les inventeurs ont conçu un processus de recyclage d'agents pharmacologiques vers le milieu extracellulaire, à partir des compartiments endosomiaux, qui sont les seuls compartiments à posséder un pH acide.
Selon cet aspect de l'invention, le CRD est couplé à l'agent pharmacologique destiné à être administré au corps via la circulation. Le couple CRD-agent pharmacologique circule dans le sang et subit le processus d' internalisation, par exemple, dans les cellules du foie et du rein. En l'absence du CRD, l'agent pharmacologique serait transféré, par endocytose, aux lysosomes, où il serait hydrolyse. En revanche, lorsqu'il est lié au CRD, l ' agent pharmacologique se fixe sur toutes les membranes des compartiments cellulaires qui possèdent des résidus GlcNAc et qui présentent un pH voisin de 5.0 (entre 4.8 et 5.1), c'est-à-dire les endosomes. De cette manière, le couple CRD-agent pharmacologique subit le recyclage propre aux membranes intracellulaires, vers la surface de la cellule, où le ligand sera libéré en raison du pH neutre (7.0 environ). Le processus peut alors recommencer. Le couple CRD-agent pharmacologique n'est donc pas livré aux lysosomes, et la demi-vie de l'agent est sensiblement augmentée.
Cet aspect de l'invention concerne donc une composition pharmaceutique présentant une demi-vie prolongée, caractérisée en ce qu'elle comporte un complexe constitué d'une part, d'au moins un domaine de reconnaissance des résidus glucidiques (le CRD) du récepteur thyroïdien GlcNAc, et, d'autre part, d'un produit pharmaceutiquement actif, et éventuellement un excipient phairmacologiquement acceptable.
Ce système est valable pour tout type de composé chimique, par exemple des vaccins, des enzymes, des hormones, des macromolécules, des médicaments. Il a l'effet d'augmenter le temps de présence de la drogue dans la circulation. Il est donc particulièrement avantageux lorsque la drogue est très sélective, le CRD n ' étant pas en soi un moyen de ciblage. Son utilisation peut être envisagée tant par voie cutanée (cosmétique, soins des plaies et brûlures) que par voie sanguine (diminution de la clairance hépatique médiée par les hépatocytes).
L'effet "retard" peut être optimisé par modification de la sélectivité du CRD pour qu'il reconnaisse d'autres motifs glucidiques (N-Acétylgalactosamine, acide sialique, mannose, etc...). Cette modification peut être effectuée par voie chimique et/ou par mutagénèse. Cette modification ne doit pas affecter la nature pH-dépendante de la fixation du ligand.
L'efficacité de la liaison aux glycannes membranaires peut être accrue par l'utilisation d'oligomères du CRD (l'effet du "cluster") pour chaque molécule de l'agent pharmacologique. Dans ce cas, le rapport entre le nombre de molécules de CRD et le nombre de molécules de l'agent pharmacologique est supérieur à un. Selon cette variante de l'invention, les CRDs peuvent être tous les mêmes, ou en revanche, il peut s'agir d'un oligomère constitué de différents types de CRD ; d'une part, le CRD dont une partie est commune à toutes les lectines et, d'autre part, le CRD unique du récepteur GlcNAc.
La méthode utilisée pour coupler le CRD à l'agent pharmacologique dépend de la nature de l'agent, de la façon dont le CRD est fabriqué, et du rapport souhaité entre le nombre de molécules de CRD et d'agents pharmacologiques. Par exemple, si l'agent pharmacologique est une protéine, il est possible de fabriquer le complexe CRD-agent directement par voie recombinante, sous forme de protéine de fusion. Cette méthode résulte, bien entendu, en un complexe composé d'une molécule de CRD pour chaque molécule d'agent pharmacologique. Si un groupement de molécules CRD pour chaque molécule d'agent pharmacologique est souhaité, il est nécessaire de fabriquer d'abord le CRD, soit par voie recombinante, soit par purification comme décrit ci-dessus, soit par synthèse chimique, et de les coupler ensuite avec l'agent pharmacologique. La méthode employée pour le couplage est illustrée dans l'exemple 8 ci-dessous.
Cette méthode peut également être utilisée lorsque le rapport entre le nombre de molécules de CRD et celles de l'agent pharmacologique est de 1, et lorsque l'agent pharmacologique n'est pas de nature protéique.
Une dernière application de la molécule CRD consiste en son utilisation comme marqueur de glycoconjugués membranaires endosomiaux. En effet, les membranes endosomales sont extrêmement difficiles à étudier. Selon cet aspect de l'invention, le CRD est couplé à un agent permettant une visualisation ultérieure en microscopie (par exemple, la horseradish péroxydase, la ferritine, etc), et est mis dans le milieu de culture des cellules objets de l'étude. Après leur internalisation non spécifique et leur transfert dans les endosomes, le CRD de ces complexes se lie aux glycoconjugués membranaires (glycolipides, glycannes des glycoprotéines) en raison du pH acide qui existe dans ces compartiments, et leur voie et leur cinétique de transfert vers d'autres compartiments cellulaires (Golgi, membranes plasmiques) peuvent être visualisées et analysées par les molécules marqueuses.
La spécificité glucidique du CRD peut également être modifiée ou élargie pour pouvoir fixer d'autres résidus, selon la technique décrite pour d'autres aspects de l'invention.
Différents aspects de l'invention sont illustrés dans les figures, notamment : la figure 1 montre schématiquement le devenir intracellulaire des molécules de thyroglobuline internalisées par le thyrocyte. Les molécules "immatures" (GlcNAc-TG), riches en motifs N-Acétylglucosamine, sont recyclées à partir du compartiment endosomal (Ed), pH = 4.8 à 5.1, soit via l'appareil de Golgi (G) à pH = 6.5 (voie 1), soit directement vers la lumière folliculaire (voie 2). Les molécules "matures" (TG) ne présentant plus de motif N-Acétylglucosamine accessible, sont dirigées vers les lysosomes (Lys) où elles sont hydrolysées.
la figure 2(a) à 2(h) montre les séquences nucléotidiques des fragments d'insertion EcoRI de sept clones TGRCL-1bis, -CL4, -CL5bis, -CL6, -CL7, -CL10, -CL10c, -CL11, isolés par criblage immunologique avec des anticorps polyclonaux dirigés contre le récepteur thyroïdien purifié. La séquence en acides aminés déduite pour chacun des produits d'expression correspondante est également montrée. Le clone TGR- CL10C représente la séquence complémentaire à la séquence TGR-CL10.
la figure 3 montre le chevauchement entre les séquences des clones TGR-C11 et TGR-C15. La séquence protéique indiquée dans la figure 3 ne correspond pas à celle du récepteur, puisque cette séquence est la séquence complémentaire de celle codant pour le récepteur,
la figure 4 montre l'utilisation des anticorps TGRD-Ab dans le diagnostic différentiel en anatomopathologie : a, b, c : tissu sain (a = témoin ; b = marquage spécifique à l'échelle folliculaire ; c = marquage spécifique de la surface apicale) ; d, c : carcinome paillaire ; f, g : carcinome vésiculaire ; h, i : adénome (h = partie centrale et i = partie périphérique du tissu pathologique). - la figure 5 montre des séquences TGR-CL1 et TGR-CL5 qui représentent les cDNA complémentaires des séquences TGR-CL1bis et TGR-CL5bis respectivement. Les séquences protéiques déduites de TGR-CL1 et de TGR-CL5 ne représentent donc pas la séquence du récepteur.
- la figure 6a et b montre les séquences de 2 clones TGR-CL3 et TGR-CL3C respectivement qui représentent les séquences partielles directes et complémentaires respectivement, d'une protéine appelée HSGMS1 (ou "human Gsα") associée au récepteur.
- la figure 7 montre la séquence TGR-CLH obtenue par oligoscreening dans la banque λgt11 avec les sondes TGR-CL1bis et TGR-CL5bis. Elle est susceptible de coder (ATG à +16) pour une protéine d'environ 35 kDa possédant un peptide signal putatif (6 à 20) et un segment transmembranaire putatif (278-298). La séquence TGR-CLH renferme les séquences TGR-CLlbis et TGR-CL5bis (les acides aminés 4 à 135 de TGR-CL1bis correspondent aux acides aminés 67 à 198 de TGR-CLH. Les acides aminés 4 à 128 de TGR-CL5bis correspondent aux acides aminés 155 à 279 de TGR-CLH). Ces différentes régions sont indiquées sur la séquence de la figure 7. Le codon d'initiation ATG de -CLH se trouve à la position +16, les nucleotides en amont de cette position étant, selon le protocole expérimental appliqué, essentiellement d'origine vectorielle.
Les figures 8 et 9 illustrent la carte de restriction de la séquence TGR-CLH.
EXEMPLES
1. Purification du récepteur thyroïdien de N- Acétylglucosamine : 40 à 60 thyroïdes de porc provenant d'un abattoir ont été émincées et le tissu conjonctif extracellulaire a été enlevé par passage forcé sur tamis (300 μm). Cette étape ainsi que toutes les étapes postérieures ont été effectuées à 4°C. Les épithélia thyroïdiens ont été récupérés par centrifugation à 12 000 g dans 500 ml de 20 mM Tris-HCl, pH = 7.8, 20 % sucrose et 10 mM EDTA pendant 15 minutes. Après deux lavages dans un même volume de 20 mM Tris-HCl, pH = 7.8, le culot a été mélangé à 8-10 volumes d'acétone froid pendant deux périodes de 10 minutes chacune. La suspension a été filtrée sur papier Whatman n° 1 sous vide. Une poudre d'acétone sèche a été récupérée à un rendement d'environ 5 g par 300 g de thyroïdes porcines (environ 50 organes) et stockée à - 20ºC.
Lors de la première étape de purification, 5 g de poudre d'acétone ont été remis en suspension dans 250 ml de 20 mM Tris-HCl, pH = 7.8, 5 mM EDTA, 0.2 M NaCl, et mis sous agitation pendant 30 minutes. Après centrifugation à 12 000 g pendant 15 minutes, le culot a été lavé une première fois avec le même milieu dépourvu de EDTA et de NaCl et remis en suspension dans un tampon d'extraction composé de 20 mM d'acétate de sodium, pH = 5.0, 0,4 M KCl, et 1 % Triton X-100 (Tampon A). Cette suspension a été centrifugée à 12 000 g pendant 15 minutes et le surnageant a été incubé pendant 3 heures en utilisant un agitateur rotatif avec du CaCl2 (concentration finale 20 mM), des inhibiteurs de protéase (10 μg/ml chacun de leupeptine, pepstatine et phénylméthylsulfonylfluoride et 10 mM d'acide alpha-aminocaproïque), et 25 ml d'ovomucoïde AcA 22 gel d'affinité (2,4 mg de protéine/ml de gel). Le gel résultant a été appliqué à une colonne (1 x 10 cm) et lavé avec 5 à 10 volumes d'un tampon contenant 20 mM d'acétate pH = 5.0, 1 M NaCl, 20 mM CaCl2, et 0,5 % Triton X-100 (tampon B). Les protéines fixées ont été récupérées par elution avec un tampon contenant 20 mM Tris-HCl pH = 7.8, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, et 0.05 % Triton X-100. Le matériel ainsi obtenu a été analysé à 280 nm, dessalé par dialyse contre un tampon contenant 20 mM Tris-HCl pH = 7.4, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, et 0,05 % Triton x 100 et finalement concentré au moyen d'un appareil à microconcentration (système MicroProdicon BIO Molecular Dynamics). Une méthode alternative d'elution du récepteur, qui fait appel non pas à la sélectivité du pH du récepteur, mais à sa spécificité de sucre, consistait à l'éluer par l'addition de N- acétylglucosamine (100 à 250 mM) au tampon de fixation à pH acide.
Selon l'objectif des expériences ultérieures, le matériel élue a été soumis à une étape supplémentaire de purification dans des conditions natives ou dénaturantes. Dans des conditions natives, la purification a été effectuée par un nouveau passage du matériel sur une colonne d'affinité comportant de l'ovomucoïde (5 ml). Dans des conditions dénaturantes, la purification a été effectuée par électroendosmose au moyen d'un appareil ELFE (GENOFIT). Avant d'effectuer l'électrophorèse sur 10 % SDS/Acrylamide gel à 4°C, des fractions aliquotes du matériel élue concentré ont été iodées et ajoutées à l'échantillon pour la visualisation. Avant de subir d'autres analyses, des fractions aliquotes (400 μl toutes les 6 minutes) ont été récupérées et celles contenant le monomère du récepteur GlcNAc ont été réunies.
2. Production d'anticorps antirécepteur GlcNAc (TGRD-Ab) : Des lapins mâles de souche New Zealand ont été immunisés par une inoculation intradermale avec 40 μg d'une préparation de récepteur GlcNAc dénaturé (0,5 ml), préparée selon la méthode décrite ci-dessus et émulsifiée dans de l'adjuvant complet de Freund (0,5 ml). Trois nouvelles injections par voie sous-cutanée étaient pratiquées au 28ème, au 38ème et au 60ème jours en utilisant 25 μg d'antigène (1 ml) dans de l'adjuvant incomplet de Freund (1 ml). Les sera sont prélevés 8, 12 et 16 jours après le troisième boost. Les anticorps polyclonaux (IgG) dirigés contre le récepteur dénaturé étaient purifiés par des colonnes d'affinité utilisant soit la protéine A, soit Avid-Al Gel (BioProbe T.M.). Dans le premier cas, 1,5 ml de sérum était déposé sur 3,5 ml de protéine A-sépharose 4CL gel, la colonne étant lavée avec 100 mM Tris-HCl, pH = 8.0, 150 mM NaCl (10 volumes morts), puis 10 mM Tris-HCl, pH = 8.0, 150 mM NaCl, l' elution s'effectuait avec un tampon 100 mM glycine, pH = 3.0. L'éluat était collecté, neutralisé par ajout d'un volume égal de 1 M Tris-HCl pH = 8.0. Dans le second cas, 1 ml de sérum était dilué avec 4 ml de 0.1 M phosphate buffer, 150 mM NaCl, pH = 7.8 et déposé sur une colonne de 1,5 ml d*Avid-Al Gel. Après lavage avec le même tampon (10 volumes morts), les IgG étaient éluées avec un tampon 0,1 M sodium acétate pH 3.0 et traitées comme décrit ci-dessus. Des fractions aliquotes de ces préparations étaient conservées à - 20 °C et ont donné ultérieurement les mêmes résultats. Ces préparations d'IgG sont appelées TGRD-Ab.
Le même protocole général a été utilisé pour la production d'anticorps polyclonaux dirigés contre une protéine de fusion synthétisée dans E. coli à partir d'une construction : Maltose Binding Protein - TGR-CLlbis. Ces protéines de fusion, préparées et purifiées comme décrit ci-après étaient injectées par dose de 250 μg chez le lapin pour chacun des immunisation et rappel. Ces anticorps ont été appelés TGR-CLlbis/Ab.
3. Séquences nucléotidiques et protéiques partielles du récepteur GlcNAc :
Une banque de cDNA de thyroïde humaine normale avait été construite dans λgt 11. Après étalement sur boîtes de 92 mm des bactéries transfectées par les phages (5 boîtes, 30000 pfu/boîte) 15 clones étaient isolés par criblage immunologique (immunoscreening) sur feuille de nitrocellulose avec TGRD-Ab (20μg/ml), préparé selon la méthode décrite ci-dessus. Après deux autres criblages successifs à faible densité (700 pfu puis 50 pfu/boîte), 13 clones étaient finalement confirmés comme positifs (≈1/11000 pfu). Leur fragment d ' insertion EcoRI était sous-cloné dans les plasmides PUC 18 puis séquence sur les deux brins par la méthode de SANGER et al. Finalement, six clones présentant un cadre de lecture ouvert, compatibles avec leur expression à partir de λgt 11, et ce sur plus de 123bp, avaient été sélectionnés et soumis à une recherche d'homologie de séquence.
Les clones, appelés TGR-CLlbis, -CL4, CL5bis, CL6, CL7, CL10, CL11 sont présentés dans la figure 2. Les séquences complémentaires de TGR-CLlbis et TGR- CL5bis (appelés TGR-CL1 et TGR-CL5 respectivement) sont illustrés dans la figure 5. Le chevauchement de ces deux clones TGR-CL1 et TGR-CL5 est illustré dans la figure 3. La relecture de ces clones en particulier au sein de TGR-CLH a permis de choisir de façon définitive, l'orientation directe (voir figure 2a, figure 2c et figure 7) et d'en déduire la séquence protéique. Les résultats des recherches d'homologie ont indiqué :
1) qu'il n'existait aucune homologie stricte (de 100 %) avec une protéine déjà séquencée ;
2) qu'il n'existait que des homologies très partielles (voisines ou inférieures à 35 %) sur seulement des portions des séquences des clones, bien que les inventeurs aient inclus, outre 1 'homologie stricte, la recherche d'homologies fonctionnelles (substitution d'un aminoacide par un autre présentant des propriétés similaires ou voisines) ;
3) parmi les six clones, seuls TGR-C1 Ibis et TGR-C1 5bis présentent un overlapping partiel sur environ 1/4 de chacun des clones (voir figure 7 et légende) ;
4) leur cadre de lecture étant ouvert pour chacun des brins, les brins (+) et (-) sont présentés pour deux clones : TGR-C1 10 et 10c.
Un clone, appelé TGR-CLH, a été obtenu par un criblage de la bangue avec TGR-CLlbis et TGR-CL5bis selon le protocole suivant : les bactéries Y1090 sont infectées par les phages de la banque, préalablement diluée (50 000 pfu/30μl) puis étalées sur des boîtes de 150 mm de diamètre (milieu LB, 10 mM MgS04, 50 μl ml Ampicillin), après formation des plages de lyse, des filtres de Nylon (Durcelon UV, Stratagène) sont posés sur la boîte, puis immergés dans une solution de dénaturation (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH), neutralisés (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-Hll, pH 7,4) et rincés (2 x SSC) . Après passage dans un four U.V. (Stratalinker, Stratagène) et prélavage, les filtres sont mis en présence des clones TGR-CLlbis et TGR-CL5bis préalablement radiomargués par random-prime (dCTP α32P (50 μCi), pour le marquage de 25 ng d'ADN, activité spécifique 10° dpm/μg). 10 clones positifs ont été obtenus, dont celui possédant la séquence nucléotidique la plus longue, le TGR-CLH, a été séquence (cf figure 7).
Des expériences Northern Blot avec TGR-CLH radio-marqué par random-priming sur des préparations de mRNA de thyroïde humaine non tumorale ont révélé que TGR-CLH s'hybridait avec un transcript d'environ 1,8 Kb, indiquant ainsi qu'une séquence d'environ 0,3 Kbp, située en 5' et incluant la région promotrice, restait à rechercher.
4. Construction et production d'une protéine de fusion incluant le clone TGR-CLlbis :
Le vecteur choisi est pMal (New England-Biolabs) qui synthétise, sous induction à l'IPTG, la Maltose Binding Protein. L'insert du clone TGR-CLlbis est inséré dans pMAL après coupure préalable par EcoRI, après ligation et transfection puis mini-préparation dans les cellules compétentes, l'orientation de l'insert est vérifié par séquençage. Les bactéries contenant le plasmide de fusion sont mises en culture dans 1 litre de LB-Ampicillin (50 μg/ml) jusqu'à obtention de 2-108 bactéries/ml. Après ajout de 0, 3 mM final d'IPTG (4 h), la croissance bactérienne est arrêtée par centrifugation à 4000 x g et le culot est resuspendu dans un tampon de lyse (10 mM phosphate, 30 mM NaCl, 0,25 % Tween 20, 10 mM 2-mercaptoéthanol, 10 mM Edta, 10 mM EGTA, 10 μg/ml PMSF). après un cycle de congélation-décongélation et sonication, le culot est centrifugé à 9000 x g pendant 30 minutes, et l'extrait est passé sur une colonne de résine d'amylase retenant la MBP. Après lavage, la protéine de fusion est éiués avec un tampon contenant 10 mM de maltose et 250 μl de PMSF. Après dialyse à concentration (appareil MicroProdicon, 10 mM Tris-Hll, pH 8,0, 10 mM NaCl), les protéines de fusion sont visualisées au Bleu de Coomassie sur des gels d'acrylamide (10 %), et leurs propriétés antigéniques sont testés par Western blot avec un anticoprs anti MBP et TGRD-Ab. Des fractions aliquotes de la protéine de fusion (250 μg/0,5 ml) sont conservées à -20 °C pour immunisation.
5. Utilisation des anticorps TGRD-Ab dans le diagnostic différentiel en anatomopathologie :
Des spécimens de thyroïdes pathologiques fixées dans du BOUIN et inclus en paraffine étaient utilisés pour leur réactivité avec TGRD-Ab.
Des coupes de tissu fixé étaient déparaffinées avec du toluène, traitées avec de l'éthanol (95 %) et finalement réhydratées avec de l'eau distillée puis du tampon PBS . Ensuite, le spécimen était traité avec du PBS contenant 5 % de non immune goat sérum (NGS) et les TGRD-Ab étaient ajoutés à la concentration de 3,2 μg à 4,5 μg/100 μl PBS pendant la nuit à 4°C. Après lavage avec du tampon PBS, un second anticorps anti-IgG de lapin, couplé à la rhodamine, dilué au 1/100 dans une solution de PBS, 5 % NGS, était incubé en présence du spécimen pendant 1 heure. Après lavage avec du PBS, le spécimen était monté avec du Moviol entre lame et lamelle avant observation au microscope à fluorescence.
Le marquage non spécifique était estimé par l'utilisation d'IgG de sera préimmuns préparés selon les mêmes méthodes que TGRD-Ab et utilisé aux mêmes concentrations.
Les résultats sont résumés dans le tableau I :
Figure imgf000038_0001
Un marquage positif des thyrocytes était observé dans le tissu sain (figure 4, a, b). La caractéristique du tissu sain est un marquage dense à la partie apicale des thyrocytes (figure 4, c). Aucun marquage spécifique du tissu conjonctif n'est observé (figure 4, a, c).
Les adénomes se caractérisent par une perte de marquage cellulaire dans les cas observés. Aucun marquage extracellulaire spécifique n'était noté (figure 4, h, i). A la périphérie de l'adénome, la distinction entre tissu pathologique et tissu sain était clairement visualisée par le marquage positif de thyrocytes du tissu sain (figure 4, i partie droite)
Les carcinomes papillaires perdaient eux aussi le marquage spécifique au niveau des cellules épithéliales formant les papilles (figure 4, d). Par contre, et ceci est la caractéristique unique de ce type de carcinome, un marquage spécifique extracellulaire était noté pour tous les cas observés dans certaines régions des carcinomes au niveau des tissus conjonctifs formant le chorion ou entourant les carcinomes (figure 4, e). La nature de cet antigène, détectable dans les seuls cancers papillaires de même que son éventuelle détection dans les cancers d'autres tissus restent à établir. Cette observation était aussi valable pour une métastase de cancer papillaire localisé dans le tissu musculaire adjacent à la thyroïde (résultats non montrés).
Les cellules épithéliales des cancers vésiculaires présentaient un marquage positif, ce marquage tend à être plus faible que dans le tissu sain et était localisé exclusivement au niveau basolatéral. Aucun marquage extracellulaire n'est observé (figure 4, f, g). Ces résultats montrent que les anticorps TGRD-Ab peuvent servir au diagnostic différentiel des adenocarcinom.es thyroïdiens. Il apparaît qu' en suivant la localisation et le niveau d'expression du GlcNAc récepteur par TGRD-Ab, on peut différencier les adénomes (tendance à la disparition du marquage) des cancers papillaires (disparition du marquage cellulaire, apparition d'un marquage extracellulaire) et des cancers vésiculaires (délocalisation du marquage dans la seule région basolatérale).
Les cancers vésiculaires sont ceux qui ont la plus grande probabilité de présenter des métastases. L'utilisation des anticorps antirécepteurs, selon l'invention, dans le diagnotic différentiel des adénocarcinomes permet donc aussi un pronostic de la capacité métastasiante du carcinome : les interactions lectines-glycoconjugés sont des éléments essentiels dans la migration et l'adhésion cellulaire ; le maintien de l'expression du récepteur GlcNAc, en particulier dans les régions basolatérales des cellules épithéliales est vraisemblablement à l'origine d'un pouvoir métastasiant élevé.
Il est à noter que les mêmes résultats ont été obtenus avec les anticorps monoclonaux TGR-CLlbis/Ab dirigés contre la protéine de fusion produite à partir du clone pMal-MBP-TGR-CLlbis, ce qui indique que les monomères codés par TGR-CLH représentent le même pattern d'expression que celui du récepteur natif de N-acétylglucosaminé, tel qu'il est détecté avec TGRD-Ab.
Les résultats obtenus montrent aussi qu'il est possible, en utilisant les anticorps TGRD-Ab, de visualiser et d'éradiquer in vivo les métastases, en particulier celles des cancers vésiculaires. Les anticorps sont alors couplés à des molécules radio- actives ou à des drogues dirigées contre des préparations de récepteur purifié, de protéines recombinantes ou de peptides synthétiques mimant les régions immunogéniques dudit récepteur.
6. Diagnostic différentiel de maladies auto-immunes :
Le protocole expérimental était le suivant : 20 μg de récepteur GlcNAc purifiés, dilués et dénaturés (préparés selon la méthode de l'exemple 1), étaient soumis à une électrophorèse (SDS-PAGE, 8 % acrylamide) puis blottés sur feuille de nitrocellulose. Des bandelettes de la feuille de nitrocellulose étaient ensuite immergées dans un tampon 10 mM Tris-HCl, pH = 8.0, 150 mM NaCl, 0,05 % Tween 20 (TBST) additionné de 1 % BSA. Après lavage avec TBST, elles étaient incubées en présence de sérum de patient (1/50 dilution finale dans TBST) pendant 1 h. Après lavage avec TBST, des anticorps de mouton, couplés à la phosphatase alcaline et dirigés contre les IgG humaines, étaient dilués au 1/500 et incubés pendant 1 h. Après quatre lavages, les anticorps fixés étaient révélés au bout de 5-15 min par ajout d'un tampon 0,1 M Tris-HCl, pH = 9.5, 100 mM NaCl, 4 mM MgCl2 contenant les substrats 5-bromo-4-chloroindolylphosphate et nitrobluetetrazolium.
Des résultats obtenus en particulier sur des patients souffrant de thyroïdites, ne présentant ni anticorps antithyroglobuline, ni anticorps antimicrosomiaux, et dont la maladie n'avait donc pas pu être formellement identifiée en ayant recours à ces méthodes connues, sont résumés ci-dessous :
Nombre de cas Nombre de cas testés positifs
Thyroïdites 3 3 On peut noter qu'en dépit de l'utilisation de la forme dénaturée du récepteur, les anticorps de sera de patients atteints de thyroïdite reconnaissaient le récepteur GlcNAc thyroïdien.
Le récepteur purifié a également été utilisé, en appliquant le même protocole expérimental, pour la détection d'auto-anticorps dans du sérum de patients souffrant de goitre ou de la maladie de Basedow. Dans le cas de la maladie de Basedow, la présence d'auto- anticorps a été détectée. En revanche, les résultats dans le cas des patients souffrant de goitre étaient moins conclusifs, sans doute en raison de la forme dénaturée de la protéine utilisée.
La reconnaissance positive du récepteur GlcNAc par certains sera de patients font de ce récepteur ou de ses dérivés (protéines recombinantes, peptides) un candidat possible pour se substituer aux (ou compléter les) antigènes utilisés dans les tests actuels.
7. Identification et préparation du CRD :
Le matériel de départ utilisé, selon cet exemple, dans la préparation du CRD était le récepteur purifié par la méthode décrite dans l'exemple 1. Les étapes de l'isolation du CRD à partir du récepteur entier étaient les suivantes :
- Hydrolyse protéolytique ménagée des protéines par des enzymes (pepsine, papaïne, protéase V8 , protéase KX2 et clostripaïne) ou par des méthodes chimiques (bromure de cyanogène, coupure au tryptophane), les fragments ainsi obtenus ayant une taille minimum de 130 à 150 acides aminés ;
- Ajustement du pH des milieux d'hydrolyse à pH = 5.0 avec un tampon acétate 1 M ; addition de CaCl2 (15mM concentration finale) ; Chromatographie des fragments d'hydrolyse sur colonne d'affinité (ovomucoïde - sépharose ou équivalent), lavage avec un tampon 50 mM acétate, pH = 5.0, 150 mM NaCl, 15 mM CaCl2 : elution des fragments retenus par un tampon 0,1 M Tris-HCl, pH = 8.0, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA ;
- Tamisage moléculaire sur colonne de Séphacryl S-200 HR ;
Récupération et concentration d'une population homogène de CRD, les fragments les plus petits (ceux ayant une taille d'environ 130 à 150 acides aminés) étant les meilleurs candidats pour une utilisation ultérieure comme "molécule de retard".
7. Couplage du CRD avec l'agent pharmacologique :
Dans cet exemple, le complexe CRD-agent pharmacologique est produit par un couplage entre le
CRD et l'agent pharmacologique.
La technique utilisée peut s'appliquer à la fois au CRD produit par protéolyse du récepteur entier, et au CRD produit par des techniques recombinantes ou par synthèse chimique. Les étapes de cette technique sont les suivantes :
- Couplage de l'agent pharmacologique (par exemple, drogue, hormone) sur le CRD par un hétérobifonctionnel "linker" (MSCC, MBS, SMBP) à pH = 7.0, en présence de N-Acétylglucosamine (0.1 M) pour protéger le site actif du CRD ;
Dialyse des complexes CRD-effecteurs biologiques contre un tampon acide, i.e. 50 mM acétate, pH = 5.0, 150 mM NaCl, 20 mM CaCl2 ;
- Chromatographie des complexes sur colonne d'affinité ovomucoïde-sépharose (10 mg/ml gel) ;
- Lavage de la colonne avec le tampon acétate pH = 5.0, 10 mM CaCl2 ; - Elution des complexes par un tampon 0,1 Tris-HCl, pH = 8.0, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA ;
- Désalage par dialyse du matériel élue contre un tampon PBS ;
- Vérification du maintien de l'activité biologique du CRD par chromatographie sur ovomucoïde-sépharose, selon le protocole décrit ci-dessus sur une partie aliquote de cette préparation.
On notera aussi que, selon ce type de protocole, le CRD peut être utilisé comme vecteur permettant d'isoler tout aussi bien la (les) protéine (s) de fusion, que le complexe CRD-drogue.

Claims

REVENDICATIONS
1. Protéine ayant une activité de récepteur thyroïdien de N-Acétylglucosamine (GlcNAc) caractérisée en ce qu'elle est constituée de monomères d'un poids moléculaire d'environ 51 kDa, un point isoélectrique d'environ 5.2, est sensiblement dépourvue de protéines cellulaires contaminantes et comporte au moins l'une des séquences en acides aminés illustrées dans les figures 2 et 7, ou une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec l'une de ces séquences.
2. Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins la séquence en acides aminés codée par TGR-CLH et indiquée dans la figure 7.
3. Protéine purifiée selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les protéines cellulaires dont elle est dépourvue sont les cytokératines de cellules épithéliales, l'actine, la tubuline et les protéines de type lectines, telles que le récepteur de mannose-6-phosphate.
4. Protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle est dénaturée ou native.
5. Fragment protéique, caractérisée en ce qu'il comporte un fragment de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et est reconnu par un sérum polyclonal ou par des anticorps monoclonaux dirigés contre ladite protéine.
6. Fragment protéique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comporte au moins 6 acides aminés, par exemple entre 10 à 500 acides aminés.
7. Séquence nucléotidique codant pour au moins une partie du récepteur thyroïdien de GlcNAc, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 20 bases consécutives de l'une des séquences nucléotidiques TGR-CL1bis, -CL4, -CL5bis, -CL6, -CL7, TGR-CL10, - CL10C, -CL11, -CLH illustrées dans les figures 2 et 7, ou d'une séquence qui hybride avec l'une de ces séquences dans des conditions non stringentes, ou encore de la séquence complémentaire à l'une de ces séquences, ou encore la séquence ARN correspondante.
8. Amorce nucléotidique apte à être utilisée dans l'amplification du gène codant pour le récepteur thyroïdien de GlcNAc, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins 20 bases consécutives, et plus particulièrement, au moins 25 bases consécutives de la séquence de la revendication 7.
9. Procédé de purification du récepteur thyroïdien de GlcNAc, caractérisée en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes :
i) passage sur tamis d'un éminçage de tissu thyroïdien, par exemple, des follicules thyroïdiens ; ii) lavage des épithélia ainsi obtenus à des conditions de pH neutre, et en présence d'E.D.T.A. ; iii) précipitation des épithélia à l'acétone, produisant ainsi une "poudre d'acétone" ;
iv) passage à pH 5.0 environ, par exemple entre 4.8 et 5.1, d'une suspension de la poudre d'acétone sur une colonne d'affinité comportant des "clusters" de GlcNAc accessibles, par exemple sous forme d'ovomucoïde ou d'asialogalactoprotéine, et elution, soit à pH neutre, soit par l'ajout de N-Acétylglucosamine dans le tampon de fixation, des protéines ainsi fixées ;
v) éventuellement, répétition de l'étape (iv) ou électroendosmose des protéines éluées sur SDS-PAGE.
10. Anticorps dirigés contre la protéine de l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou contre le fragment de la revendication 5 ou 6, et spécifiques pour ladite protéine.
11. Anticorps selon la revendication 10, caractérisés en ce que ce sont des anticorps polyclonaux ou monoclonaux.
12. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent la structure primaire de la protéine.
13. Procédé pour la détection et l'identification différentielle in vitro d'adénocarcinomes thyroïdiens, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
i) mise en contact d'une coupe de prélèvement de tissu thyroïdien avec des anticorps reconnaissant le récepteur thyroïdien de GlcNAc, lesdits anticorps étant associés à un moyen permettant leur détection, ii) détection de l'absence ou de la présence de marquage du récepteur thyroïdien GlcNAc par les anticorps, les adénomes étant totalement dépourvus de marquage, les carcinomes papillaires étant dépourvus de marquage au niveau des cellules épithéliales formant les papilles, mais présentant un marquage spécifique extra-cellulaire du tissu conjonctif formant le chorion, et les carcinomes vésiculaires présentant une délocalisation du marquage dans la seule région basolatérale du thyrocyte.
14. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que les anticorps sont les anticorps selon l'une quelconque des revendications 10 à 12.
15. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 10 à 12 pour le traitement des métastases de cancers thyroïdiens, lesdits anticorps étant couplés à un agent radio-actif ou à une molécule capable d'induire la destruction du GlcNAC récepteur thyroïdien.
16. Procédé pour la détection de maladies auto- immunes de la thyroïde telles que la maladie d'Hashimoto ou de Basedow, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
i) mise en contact d'un échantillon biologique avec la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou avec le fragment de la revendication 5 ou 6 ;
ii) détection de la réaction entre la protéine ou le fragment et des anticorps anti-GlcNAC récepteurs dans l'échantillon par des moyens connus en soi.
17. Kit ou nécessaire pour la détection et l'identification différentielle (s) de carcinomes et d'adénomes thyroïdiens, caractérisé en ce qu'il comprend :
i) anticorps contre la protéine de l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou contre le fragment de la revendication 5 ou 6 ;
ii) des moyens permettant la détection de la réaction entre lesdits anticorps et le GlcNAc récepteur thyroïdien, par exemple par marquage enzymatique, radio-actif, fluorescent ou par l'argent ou l'avidine.
18. Kit ou nécessaire pour la détection de maladies auto-immunes de la thyroïde telles que la maladie d'Hashimoto, caractérisé en ce qu'il comprend :
i) protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou un fragment selon la revendication 5 ou 6 ; ii) des moyens permettant la détection d'une réaction entre ladite protéine ou ledit fragment et des anticorps anti-GlcNAc récepteur, tels que des anticorps anti-anticorps ou des anticorps antiprotéine.
19. Procédé de détection de maladies congénitales de la thyroïde, telles que le goitre et l'hypothyroïdisme juvénile caractérisé en ce qu'il comprend :
i) mise en contact d'un échantillon d'ADN génomique du patient avec au moins une sonde ou une amorce, comportant la séquence nucléotidique selon la revendication 7 ou 8 , l'ADN ayant été préalablement rendu accessible à l'hybridation dans des conditions permettant l'hybridation entre la sonde ou l'amorce et le gène codant pour le récepteur thyroïdien de GlcNAc porté par l'ADN génomique ;
ii) éventuellement, l'amplification de l'ADN génomique ;
iii) dénaturation de l'ADN hybride ;
iv) analyse de la séquence génomique ainsi isolée pour mettre en évidence des altérations par rapport au gène sain.
20. Fragment du GlcNAc récepteur thyroïdien, selon la revendication 5, ledit fragment constituant le domaine de reconnaissance des résidus glucidiques ("carbohydrate récognition domain" ou C.R.D.) du récepteur, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être produit par le procédé suivant :
i) hydrolyse protéolytique de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, l'hydrolyse donnant lieu à des fragments protéiques ayant une taille minimum d'environ 130 à 150 acides aminés ;
ii) ajustement du pH des milieux d'hydrolyse à un pH d'environ 5.0 et addition de Ca2+ ;
iii) passage, à pH = 5.0 environ, par exemple 4.8 à 5.1, des fragments d'hydrolyse sur colonne d'affinité comportant des "clusters" de résidus GlcNAc, par exemple de l'ovomucoïde ;
iv) elution, à pH neutre, des fragments retenus ;
v) tamisage moléculaire des fragments élues et sélection des fragments les plus petits .
21. Fragment selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il comporte environ 130 à 150 acides aminés, est réticulé par 2 ponts disulfures et est reconnu par des anticorps dirigés contre la séquence consensus en acides aminés des C.R.D. d'autres membres de la famille des lectines dépendantes de Ca2+.
22. Fragment selon la revendication 20 caractérisé en ce qu'il est situé au sein de la séquence codée par les nucleotides 16 à 834 correspondant aux acides aminés déduits 6 à 278 de TGR-CLH illustrée dans la figure 7.
23. Fragment selon la revendication 20, caractérisé en ce que sa spécificité glucidique a été modifiée par rapport à celle qu'il possède naturellement.
24. Composition pharmaceutique présentant une demi-vie prolongée, caractérisée en ce qu'elle comporte un complexe constitué d'une part, d'au moins un fragment selon l'une quelconque des revendications 20 à 23 et, d'autre part, d'un produit pharmaceutiquement actif, par exemple une hormone, une préparation vaccinale, une macromolécule, un médicament et éventuellement un excipient pharmacologiquement acceptable.
25. Composition pharmaceutique selon la revendication 24 pour utilisation comme médicament à demi-vie prolongée.
26. Composition pharmaceutique selon la revendication 24, caractérisée en ce que le complexe comporte un groupement desdits fragments protéiques pour chaque molécule de produit pharmaceutiquement actif.
27. Fragment selon l'une quelconque des revendications 20 à 23, couplé à un agent permettant sa visualisation par exemple la horseradish peroxydase ou la ferritine.
28. Utilisation du fragment selon la revendication 27 comme marqueur de glycoconjugués membranaires des endosomes.
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JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. vol. 262, no. 31, 5 Novembre 1987, BALTIMORE US pages 15291 - 15298; Miquelis, R. et al.: 'The N-acetylglucosamine-specific receptor of the Thyroid -Binding characteristics, partial characterization, and potential role.' cité dans la demande *

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