WO1992018647A1

WO1992018647A1 - Process for separating or extracting nucleic acid from specimen containing the same

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Publication number: WO1992018647A1
Application number: PCT/JP1992/000473
Authority: WO
Inventors: Toshihiko Kishimoto; Shin-Ichiro Niwa; Hiromichi Tsurui
Original assignee: Sumitomo Electric Industries, Ltd.
Priority date: 1991-04-15
Filing date: 1992-04-15
Publication date: 1992-10-29
Also published as: EP0533952A1; EP0533952A4

Description

核酸試料中の核酸の分離または抽出法

明

技術分野書

本発明は分子生物学の分野に関し、さらに詳しくは、核酸試料から特定の核酸を分離または抽出する方法に関する。北

冃景技各種の核酸を含む溶液からの核酸の分離、抽出は、遺伝子工学の分野、例えば、各種一本鎖 D N Aの調製、一本鎖 D N Aライブラリ一の作成、および遺伝子クロ一ニング等において重要である。試料中の核酸を分離する方法の 1例として、固定化した一本鎖核酸を用いて各種の核酸を含む混合液からある核酸を分離し、各種の一本鎖 D N Aを調製したり、一本鎖 D N Aライブラリ一を作成する方法がある。鶴井博理等（細胞工学、 Vol.8，No.7, 1989) は、高速液体ク口マトグラフィ一（ H P L C ) 用ビーズに固定化された D K Aプローブを用いて、核酸混合液から 1種類の一本鎖 DN Aを回収し、ついで、この一本鎖 DNAの特定領域にプライマ一 DNAをつけ、 DNAポリメラーゼを用いて二本鎖 DN Aにすることにより、目的遺伝子をクローニングする方法を提案した。しかしながら、この方法には以下の問題点があった。 a) —度に 1種類の一本鎖 Aしか回収できない。 b) 二本鎖 DNAを作成する際、回収した一本鎖 DN Aの全領域を二本鎖 DN Aにできない（プライマー DN A の付着点以降しか二本鎖 DNAにならない）。

また、制限酵素処理等で得られた二本鎖 DNA断片を M 1 3ファ —ジベクターに D N Aリガ一ゼを ¾いて導入し、ついで大腸菌に形質転換した後、 Ml 3—本鎖 DNA分子の形態で DNAを回収して一本鎖 DNAライブラリ一とする方法が知られている。しかし、この方法には、以下の問題点があった。 a) 使用できるベクターが限られる。 b) ベクターに組み込める DNA断片の大きさに制限がある。 c) すべての DN Aが大腸菌に形質転換しているか否かが不明である。

他方、核酸試料中に含まれる特定の核酸を取り去る核酸サブトラクシヨン法は、例えば、同種の生物から近縁の 2種類の細胞（例、 T細胞と B細胞）が得られ、その一方だけが目的のタンパク質を作る場合、または特定のタンパク質を発現する細胞と発現しない変異細胞とがある場合等に、一方の細胞のみが産生するタンパク質の遺伝子をクローニングする目的で用いられる。この方法では、一方の細胞から得た mR N Aを用いて c DNAを作り、この c DNAと第 2の細胞から得た mR N Aとでハイブリツド形成させ、ハイプリッド形成しなかった c DNAまたは mRN Aを得、それを用いて c D N Aライブラリ一を作成し、該遺伝子をクローニングする。

この方法は、従来、 c DNAをメンブラン上に非特異的吸着により固定してなる固定化 c DNAを、目的の細胞から調製した核酸溶液とハイプリダイゼ一ション条件下で接触させ、該 c DN Aとハイプリッド形成する mRN Aを除き、溶液中に残存する mRN Aを回収することにより、目的細胞に特異的な mRN Aを得ることで行われている。逆に、相補的 mRNAを見付けれらなかった c DNAを得ることによつても行うことができる。しかしながら、この方法には以下のような問題点があった。 a) cDNAを c DNAライブラリーから回収する手間が非常に大きい。 b) c DNAの固定化が非特異的な吸着によるため mRN Aとのハイプリダイゼ一ションが完全でない。 c) c DNAの固定化密度が非常に低いため、操作に手間がかかる上、完全に mRN Aと反応させることが困難である。また、もう一つの方法として、目的細胞より調製した mRNAをサブトラクションするための c DNAと混合し、ハイブリダイゼ一ションを行った後、二本鎖核酸のみを特異的に吸着するとされているハィドロキシァパタイトカラムに溶液を流すことで、 mRNAと c D NAのハイブリツドニ本鎖を除去し、目的細胞にのみ特異的に存在する mRNAを回収する方法がある。この方法には以下の問題点がある。 a ) カラムを用いるため、操作が煩雑でしかも回収した核酸溶液が希釈されてしまう。 b) カラムからの mRNAの回収率が非常に悪い。 c ) 再現性がないことが多い等。

上記のごとく従来の核酸分離または抽出法には様々な問題点があり、これらを解決した効率的な方法の開発が強く望まれていた。本発明者らは、鋭意研究した結果、一本鎖核酸をその分子末端で支持体に固定したものを用いると、非常に精度の高いハイブリツド形成 (DN A— DNAハイブリッド、 DN A— RN Aハイブリッド）が可能となるため、特定の核酸を効率よく、かつ、完全に分離できることを見出した。従って、塩基配列の異なる一本鎖核酸の末端を分離可能な不溶性支持体に固定化することにより、 2個以上の 1本鎖核酸を同時に分離および回収することができるようになったばかりカヽ高精度の、改良された核酸サブトラクシヨン法を達成することができた。

発明の開示即ち、本発明は、核酸試料中の特定の核酸を分離または抽出する方法であって、

1 ) 一本鎖核酸をその末端で不溶性支持体に固定化し；

2 ) 核酸ハイブリツド形成の条件下、溶液中で該固定化一本鎖核酸を該核酸試料に接触させ；

3 ) 該支持体に固定化された一本鎖核酸とハイブリツド形成する該試料中の核酸を分離することからなる方法を提供するものである。本発明は 1つの実施態様として、塩基配列の異なる 2以上の一本鎖核酸を分離可能な複数種類の支持体に別個に固定化してなる複数の固定化一本鎖核酸を、 2以上の核酸を含有する核酸試料とハイブリダイゼ一ションの条件下で接触させ、それぞれの固定化一本鎖核酸に相補的な塩基配列を有する該試料中の核酸を同時に分離する方法を提供する。

次いで、固定化一本鎖核酸とハイプリッドを形成した試料核酸混合液の一本鎖核酸は、各支持体から、加熱やアルカリ処理等の常法により、再び一本鎖核酸として回収することができる。

この方法を用いて、例えば、試料核酸混合液中の目的の二本鎖 D N A断片を 2つの一本鎖 D N Aとしてから、各一本鎖 D N Aを 2種類の固定化核酸の各々とハイブリッド形成させ、それを回収し、回収した 2つの一本鎖 DNAをァ二—リングすれば、目的 DN A断片の全領域をカバーした二本鎖 DN Aを得ることが可能となる。さらに、種々のべクタ一 DNAに特異的な塩基配列を有する DN Aを、ベクター DN Aの二本鎖のそれぞれについて、プローブ DN Aとして各支持体に固走化した固定化核酸を用いると、様々なべクタ一に対して特異的な塩基配列を有する一本鎖 DN Aラィブラリ一 'を作成できるので、べクターに組み込める DN A断片の大きさが限定されず、しかも数種のベクターについて DNA断片の導入、大腸菌への形質転換を行なうことで、全ての DN Aが形質転換している可能性を高めることができる。

本発明は、他の実施態様として、固定化 1本鎖核酸を用いる核酸 _

PCT/JP92/00473

サブトラクシヨンによる、試料中の核酸の抽出法を提供する。即ち、固定化 1本鎖核酸とハイプリッド形成する試科中の核酸を除去し、溶液中に残存する核酸を回収することにより、試料に含まれる特異的な核酸を抽出する。この方法を用いて、例えば、正常な細胞から得た m R Aで調製した c D N Aを支持体上に固定化したものを用い、癌などの変異細胞から得られた mRNA混合物を処理して、相補的な塩基配列を有する mRN Aを取り去ると、病気に特異的な核酸（遺伝子）を回収することができる。なお、当業者ならば容易に理解することである力 ^?、例示の方法の変法として、変異細胞から調製した c DNAを固定化し、正常細胞由来の mRNA混合物と反応させ、相補的 mRNAを見付けれなかった固定化 c DNAを得ることによっても、同様に変異細胞に特異的なタンパク質をコードする遺伝子-をクローニングすることができる。

本発明方法にとって好ましい固定化 1本鎖核酸は、合成 DNAまたは試験管内で逆転写された c D N Aであり、核酸試料は m R N A および c D N Aのいずれかを含有する溶液試料である。

本発明方法に用い得る不溶性支持体を以下に例示する。

1 ) 天然または合成の有機化合物の膜状のもの。

具体例としては、ナイロンメンブラン、ニトロセルロースメンブラン、ポリテトラフルォロエチレンメンブラン、ポリエチレンメンブラン、ポリイソプレンメンブラン、ポリスチレンメンブラン等、天然または合成有機高分子メンブラン（膜状体）を挙げることができる。ニトロセルロースルのように、有機高分子（例；セルロース）を化学的に処理し、改質して得たメンブランを含む。同様に、表面を核酸が結合しやすいように、また、使用しやすいように加工（化学的、物理的）したものを含む。

2 ) 天然または合成有機化合物の粒子状のもの。

具体例としては、ナイロン、ニトロセルロース、セルロース、ポリテトラフルォロエチレン、ポリエチレン、ポリイソプレン、ポリスチレン等の有機高分子粒子を挙げることができる。これらの有機高分子粒子は、例えば酸化、還元、加水分解などの化学的処理、あるいは、例えばプラズマ照射などの物理的処理で改質したものを含

3 ) 無機化合物の膜状のもの。

具体例としては、グラフアイト、多孔質ガラス、シリカ等の無機高分子メンブラン；アルミニウム、ァパタィト等の金属メンブラン；アルミナ、窒化珪素等のセラミックスメンブラン；食塩等の結晶を挙げることができる。さらに、これらの表面を化学的、物理的に表面処理することで改質されれたものも使用できる。

4 } 無機化合物の粒子状のもの。

具体例としては、グラフアイト、多孔質ガラス、シリ力等の無機高分子粒子；アルミニウム、アパタイト等の金属粒子；アルミナ等のセラミック粒子；等を挙げることができる。これらの無機化合物粒子は、例えばイオンプレーティングなどの物理的、化学的に表面処理を行なうことで改質されたものも使用できる。 δ ) ポリアクリルアミド、ァガロース等の性状がゲル状のもの。本発明方法を用いて複数核酸を同時に分離するには、これら各種の支持体の内から分離可能な複数種類の支持体を選択するとよい。支持体の分離は例えば、以下の方法で行う。

i) 比重の異なる支持体を用い、ハイブリダィゼ一シヨン後、中間の比重をもつ溶液を加えて重い支持体と軽い支持体に分離する。 ii) 複数の膜状支持体やそれぞれ粒径の異なる複数種類の粒状支持体、あるいは膜状支持体と粒状支持体との組み合わせなど、形状的に容易に分離可能なものを用いる。

iii) 鉄等の磁石（または磁力）により回収できる支持体と、磁石で回収できない支持体を用いて、磁石で分離する。

iv ) 上記各種方法を適宜組み合わせる。

なお、上記の方法において、複数種類の支持体とは、材質が同じ複数の膜状支持体や材質が同じで粒径の異なる粒状支持体なども包含する。本発明の複数の核酸を同時に分離する方法にとって好ましい支持体の組み合わせは、有機化合物の粒子状のもの、および有機、無機の膜状のものの中で粒子状の中より適当な 2種の組み合わせ、膜状の中より適当な 2種の組み合わせであり、ハイプリダイゼ一ションの速度、効率を考えると、有機、無機化合物の粒子状のものの中より適当な 2種の支持体が特に好ましく、分離法としては粒子状支持体の場合は比重により分離する方式が好ましい。

また、本発明の核酸サブトラクシヨンを行うには、上記例示支持体から適当な支持体を選択すればよい。

サブトラクシヨン法にとつて好ましい支持体はハィブリダィゼ一ションの速度および効率が高くなる無機化合物、有機化合物の粒子状のものが望ましく、シリ力等の無機高分子粒子が特に好ましい。さらに、非特異吸着が少なく、分散、沈殿の容易な H P L C用シリ力ゲルが最も用い易い。

選択した支持体への一本鎖核酸の固定化は当業者にとって既知であり、例えば、固定化される一本鎖核酸（以下、 DN Aについて述ベる）と支持体との親和力を利用した非特異的吸着による方法、紫外線で活性化した支持体に D N Aのアミノ基を共有結合させる方法などが知られている。しかしながら、本発明方法に用いる末端で固定化された固定化 DNAを得るには、その末端に 1もしくはそれ以上の余分のヌクレチォド分子を含んでいる DN A、あるいはその末端のヌクレオチド分子が化学的修飾を受けている DNA、または官能 ¾を有する化学物質 [Applied Biosystems In (A B I ) 社のァミノリンク 2等] を末端に導入した D NAが用いられる。即ち、余分のヌクレオチド、化学的修飾を受けたヌクレオチド、または官能基を有する化学物質を介して、一本鎖 DN Aを支持体に結合させる。以下、支持体上への一本鎖 DN Aの固定化の具体例について、詳細に説明する。

A. 一本鎖 DN Aの末端を化学的に修飾する場合

1 ) まず、末端に固定化に適した官能基（例えば一: NH2、一 CO OH) を導入した一本鎖 DNAを調製する。 DNAを合成する場合、その合成は、市販の DNA合成装置（AB I社製 3 9 1型 P CR — MATEなど）を使用し、常法によって行なうことができる ₌ 官能基の導入は、例えば次のような方法で行うことができる a) ァミノリンク 2 (AB I社製）の導入

以下の反応式にしたがい、 DNA合成装置を使って、へキシルァミノ基を D N A末端に導入することができる（Applied Biosystems I nc User Bulletin, No.49, August 1988)。

一本鎖 DNA カルボキシ末端一 OH

H

Nゝノ CF,

0

ァミノリンク 2

\

--本鎮 ί? 八八八 - 力ルボキシ末端端一 0— Ρ— 0'

0 b ) 式：

で示されるリンカ一を、 DNA合成装置（AB I社製、 A— 3 9 1

E P P C R— MATEなど）を用いて D N A末端に導入し、これを処理することにより、このリンカ一末端を反応性のあるアルデヒド基またはカルボキシ基に導き、さらにアルデヒド基の場合は、ビォチンのヒドラシド化合物と反応させることにより、アビジンと特異的に結合して複合体を形成し得るピオチンを導入することができる (Jonathan N.Kremsky et al., Nucleic Acid Research 1987, Vol.15, p.2891〜参照)

c ) DNA合成装置を用い、アミノ基をもつ塩基のヌクレオチド 1

〜数 1 0個を相補部分の D N A末端に付加する

d ) ターミナルトランスフヱラーゼにより、支持体との結合に適した塩基、またはその反応性誘導体を、 DN A末端に導入する（Deug G.and Wu R., Methods in Enzymology, Vol.100, p.96-116, 1983、参照）。

2 ) 次に、 1 ) で得た一本鎖 DNAの相補鎖を 1 ) と同様の合成装置を用いて調製し、両者をアニーリングさせて、二本鎖 DNAとす c

3 ) 上で得た二本鎖 DNAを含む溶液に固定化用の不溶性支持体を加え、両者を結合させる。 DNAと支持体との結合法は、 DNAおよび支持体の者の化学的修飾の種類によつて異なり、例えば、次のような各種の方法を用いることができる。

a) DNAまたは支持体上の水酸基（主としてジオール基）をトリフロォロェタンスルフォニルクロライド（以下、トレシルク口ライドと略言己） (K.Nillson and K. Mosbach, Biochem. Biophys. Res. C ommun., 102， 449， 1981)、 C N B r (R.Axen et al., Nature, 214. 1302, 1967; 、トリクロロトリアジン（T.H.Finlay et al.， Anal. Bio chem., 87, 77, 1978) 、ェピクロロヒドリン（I. Matsumoto et al. , J. Biochem.,85, 1091, 1979) 、ビスォキシラン（L.Sundberg and J. Porath, J. Chromatogr. ,90, 87, 1974) 、ジビニルスルホン酸 (J.Pora th, Meth.Enzymol.,34,27, 1974) 、ベンゾキノン（J. Brandt et al. , B iochem.Biophys. Acta., 386, 196, 1975) 、カルボニルジイミダゾ一ル - (G.S.Bethell et al., J. Biol. Chem., 254, 2572, 1979) などで活性化し、支持体上、または DNAの主としてアミノ基と結合させる。 b ) DN Aまたは支持体上の主としてカルボキシル基（一C 00H 基）を水溶性カルポジイミド等のカルボジイミド（A.Tengblad, Bi ohem. J., 199,297, 1981 ;M.Funabashi et aL.Anal. Biochem., 126, 414,

1982) または 2—エトキシー 1—ェトキシカルボニル一 1， 2 —ジヒドロキノリン（E E DQ) (G.Saccomani et al., J. Biochem.,

256, 12405, 1981;B. Belleuau and G. Malek, J. Am. Chem. Soc, 90, 1651, 1968) で活性化し、支持上または D N Aの主としてアミノ基 (-NH₂) と縮合結合させる。

c ) 従来の非特異的または末端とは限らない状態で支持体に結合した DNAに、所望の DNAを DNAリガ一ゼ（連結酵尜）を用いて結合させる。

d ) 支持上および DNAのヒドラジド基とアルデヒド基、またはヒドラジド基とカルボキシル基を用いて結合させる。ヒドラジド基とアルデヒド基の場合は、混合するとヒドラゾン結合を形成する。これを還元操作を行うと共有結合化する（Jonathan N.Kremsky et al. , 上掲文献参照）。ヒドラジドとカルボキシル基の場合は、 b ) のようにカルボジィミド等を用いる。

e) DNAおよび支持体上に互いに親和力のある物質を導入し（例えば、ピオチンとアビジン）、その親和力に基づいて固定化を行う (Jonathan N.Kremsky et al., 上掲文献参照）。

f ) DNAと支持体上のチオール基どうしを活性化、固定化する（K. Brocklehurst et al., Biochm. J. , 133,573, 1973) _c

g) D N Aと支持体上のァミノ基どうしをプリモアセタミド法にて結合させる（P.Cuatrecasas, J. Biol. Chem.，245,3059， 1970) 4 ) 上で得た固定化二本鎖 D N Aを 2.4 Mテトラエチルァンモニゥムクロライド水溶液、適宜希釈した 1 0 X S S C ( 1. 5M N a C 1および 0. 1 5Mクェン酸ナトリウム； p H 7. 0 ) 、 0. 1 〜 2 M N a C 1水溶液等の塩溶液中、熱（約 4 0 °C以上）またはアルカリを加えることにより変性させ、遠心して固相と液相を分離することにより、固定化一本鎖 DNAを得る。

B. 二本鎖 DNAをそのまま、あるいは末端を化学的に修飾して用いる場合

二本鎖 DN Aの一方の鎖に 1若しくはそれ以上のヌクレチォド分子が付加した形の二本鎖 DNAは、そのままあるいは化学的な修飾を施した後支持体に末端で結合させることができるので、上記 Aの工程 3 ) 以降の操作を施せば、上と同様の目的を達成することができる。このような二本鎖 D N Aは、次のようにして調製することができる。

a ) ターミナルトランスフェラ一ゼを使用して、片方の D N A鎖の末端にのみ支持体との結合に適した塩基またはその反応性誘導体を導入する。

b ) 末端に一本鎖部分ができるように制限酵素で切断する。

c ) 官能 ¾を持つ D N A分子と、二本鎖 D N Aを D N Aリガーゼにより結合させる。例えば、二本鎖 DNAの両端の切断端が異なる配列を持つように 2種の制限酵素で処理する。そこで、一方の切断端に特異的に結合できる配列を有する官能基を有する DN Aを加え、そこに DNAリガーゼを作用させることにより目的 DNA断片の末端に官能基を導入できる。この場合、除去したい方の鎖の 5' 末端を脱リン酸化しておいてもよい。即ち、目的とする二本鎖 DNAの一端だけが出た長い二本鎖 DNAを調製し、この状態で脱リン酸化酵素により 5' 末端を脱リン酸化し、その後二本鎖 DNAを切断して目的断片をつくると一方の 5' 末端は脱リン酸化されたものができる =

d ) 二本鎖 DNAの 3' 末端— OH基にトリクロロトリアジン基を導入することで OH基を活性化する。 5' 末端— OH¾には、 c ) で述べた脱リン酸化を行い一 OH基を露出させトリクロ口トリアジンを反応させて活性化する。 3' 末端の一 OH基と 5' 末端の一 0 H基では、 5' 末端の方が反応性に富むため、 5' 末端— 0H基を特異的に活性化できる。

C. mRNAから固定化 c DNAを合成する場合

支持体上にオリゴマー（ 1〜 1 0 0 0塩基）のデォキシチミン [以下、オリゴ（d T) と略記] を固定する。この固定化法としては、前記一本鎖 D Aの末端を化学的に修飾してから支持体上に固定化する方法が採用できる。次いで、このオリゴ（ d T ) に m R N Aをハイブリダィゼ一シヨンさせ、次いで逆転写酵素を用いて、 m RNAを錶型とし、かつ、オリゴ（d T) をプライマーとして c D N Aを合成し、しかる後、常法により m R N Aを除去することにより、末端がオリゴ（d T) を介して支持体上に固定化された c DN Aを得る。上記 A、 Bまたは Cのいずれの方法によっても本発明方法に適した固定化一本鎖 DNAが得られる。以下の実施例では、複数核酸の同時分離には、 Aの方法で調製した固定化一本鎖 DNAを用い、核酸サブトラクションには Cの方法で調製した固定化一本鎖 c DNA を用いている。しかしながら、本発明は DNAの固定化法によって制限されるものではなく、上記以外の任意の適当な方法で調製された固定化 DNAを用いて実施することができる。

核酸試料となる核酸溶液を以下に例示する。

1 ) 細胞から抽出された（天然の） 2本鎖 DNA、およびこの DN Aを制限酵素や物理的剪断力等で切断したもの、

2 } 天然の 1本鎖 DNA (上記①の DNAを熱またはアルカリ等で変性させたものも含む）、

3 ) ポリメラーゼチェーンリアクション（ P C R法）等で in vitroで増幅された 1本鎖または 2本鎖 DNA、および該 2本鎖 DNAを熱またはアル力リ等で変性させたもの、 4 ) 合成 DNA、

5) 天然の RNA、

6 ) 合成 RNA、

7) 上記 1 ) 〜 6) の任意の DNA， RNAの混合物。

発明を実施するための最良の形態試料中の複数核酸を同時に分離するには、例えば、以下のごとくに行う。

まず、分離可能な複数種類の支持体の各々に塩基配列の異なる一本鎖核酸を固定化したもの（固定化核酸）を作成する。次いで、この固定化核酸と核酸混合物試料とを溶液中で接触させて、各固定化核酸と試料中の、それらに相補的な塩¾配列を持つ一本鎖核酸とでそれぞれハイプリッドを形成させる。

ハイブリダイゼ一シヨンは、公知の各種の方法および反応条件を採用することができる。この場合、固定化核酸は、その末端で支持体上に固定化されているので、固定化による DN A塩基の破壊がなレ。従って、液相中での D N Aとほぼ同じ挙動が期待され、相補的な塩基配列を有する核酸（D N A、 R N A ) と効率よく、かつ、完全なハイブリツド形成が可能である。その結果、試科核酸混合液から各固定化一本鎖核酸に相補的な塩基配列を有する特定の一本鎖核酸をそれぞれ分離することができる。

固定化核酸とハイプリッドを形成した核酸試料中の一本鎖核酸は、各支持体を分離した後、常法にしたがつて加熱ゃァル力リ処理することにより再び一本鎖核酸として回収することができる。

核酸サブトラクシヨンは例えば以下のようにして行う。

一本鎖核酸をその末端で不溶性の支持体上に固定化したものと核酸試科とをハイプリッド形成条件下、溶液中で接触させる。固定化一本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する核酸を除去し、核酸試料中に残存する、該固定化一本鎖核酸と相補性を有さない核酸を回収する。この場合も公知の各穩ハイプリダィゼーシヨン法が採用できる。上記同様、固定化 D N Aはその末端で支持体上に固定化されているため、固定化による 0 八塩¾の破壊がなく、液相中での DN Aとほぼ同じ挙動が期待され、相補的な塩基配列を有する核酸（DNA、 RNA) と効率よく、かつ、完全にハイブリダィゼーシヨンすることが可能である。その結果、核酸溶液から相補性のある塩基性配列を有する特定の核酸のみを取り去ることができる。

この方法では、特定の mRNAを錶型として、支持体上に固定化された c DNAを合成し、核酸溶液から相補性のある mRNAのみを抽出することができる。例えば、内容未知の mRNAを含む 2つの核酸溶液の一方の mRNAを铸型として、固定化 c DNAを作成し、これを用いて他方の核酸溶液を処理して、ハイブリダィゼーシヨンを行なえば、核酸溶液中に残存して回収される mR N Aは、一方の核酸溶液に存在しないものであることが分かる。逆の操作も可能である。また、相補的な mRNAを見付けられなかった c DN A に ¾づいて分析することもできる。

したがって、この方法により、内容不明の 2つの核酸溶液の間で相互に存在しない特異的核酸を fel収し、それをクローニングすることができる。このように、本発明の核酸サブトラクシヨン法は、遺伝子操作、特に、遗伝子クローニング等に好適である。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。

龍例 1 試料中の複数の核酸の同時分離

1. 固定化一本鎖 DN Aの調製

( 1 ) 以下の塩悲配列を有する 4欞の DNAを DNA合成装置〔A ：81社の39 1 E P PCR— MATE) にて合成し、 HP LC にて精製することで調製した。

配列は p U C 18ベクターのポリクローニングサイトカら 25塩基を選んで用いた。

① X T G C A G G CAT G C A A G C TTG G C A C T G G

② CCA GTG CCA AG C TTG CAT G C C T G C A

③ X C CA G T A C CA A G C TT G CAT G C C T G C A

上記の各塩基配列は、 5' 末端から 3 ' 末端方向に一本鎖で左から右へ記載されている。なお、 Xは、 AB I社製のァミノリンク 2 であり、最終段階で 5' 末端に導入した。 1 スケールで合成し、各 DN Aを既知の方法で精製した後、 1. 3〜 1. 8 m gの範囲で回収した。

(2 ) 固定化

以下の操作により、各支持体上に一本鎖 DN A①およぴ③をその末端で固定化した固定化核酸を作成した。

1 ) 固定化 DNA ( a)

①および②の DN Aをそれぞれ 1 0 0 g分とつて減圧下で乾固した。次に、 DNA① 100 _Λ gを 1 M N a C 1 ( 1 00 1 ) に溶かし、 DNA② 100 gと混合した。この溶液を 95 °Cの水浴上で 2分間あたためた後、 1時間かけて 35°Cにまで冷却した。ついで、 0. 4M N a H C 0₃ (p H 7. 5) を力 Π た。

これに、後に説明する方法で調製したトレシル活性化シリ力ゲル 20mgを加え、室温で 24時間反応させた。反応終了後、シリカゲルを 1M N a C 1で 3回洗诤し、最後に、 1M N a C I 1 m 1に懸濁した。これを 95でで 5分間加温し、直ちに 1 2000 r pmで遠心し、上清を除去し、これを 3回繰返して、一本鎖 DN A①をシリカゲルに固定化した固定化 DNA (a) を得た。

2) 固定化 DNA (b)

③ぉよび④の D N Aをそれぞれ 100 _Λ g分とつて減圧下で乾固した。次に、 DNA®100/z gを 1M N a C 1 100 1に溶かし、乾固した D N A④ 100 gと混合した。これを 9 5 °Cの水浴上で 2分間あたため、 1時間かけて 3 5 °Cに冷却した。これに蒸留水 1 0 0 / 1 を加えた。

また、 TO S OH社製 CM— 5 PW3 0 mgを 4 0 m g WS C (水溶性カルボジィミド： D〇 J I N社製）を溶かした 5 0 0 1

HC 1水（p H 4. 0) に加え、 4でで、 2時間活性化した。次いで、蒸留水で 3回洗浄し、得たゲルを前記核酸液と混合し、 4°Cで、 5時間攪拌反応させた。次いで、 9 5°Cの水温で 5分間加熱し、直ちに 1 2 0 0 0 r p mで遠心した後、上清を除去し、再び 0. δ M N a C 1 に懸濁し、加熱（ 9 5 °C、 5分間）、遠心（ 1 2 0 0 0 r p m) を 3回繰り返して、一本鎖 DN A③を CM— 5 P Wに固定化した固定化 DNA (b) を得た。

2. トレシル活性化シリカゲルの調製

以下の操作は、ドライボックスもしくは乾燥窒素を満たした無菌パックなどを適宜利用し、水分の混入を防ぎながら行なった。なお、シリ力ゲルを単にゲルと略称することがある。 1 ) アセトン、ピリジンを予めモレキュラーシ一ブで脱水してお

2 ) 1 m lの脱水ァセトン、 1 0 0 1のピリジン、および小さなスターラ一チップを 1 O m 1 のメスフラスコに入れておく c

3 ) 1 gのゲルをガラスフィルター（# 5メッシュ）上でァスピレ—ターで吸収しながら、アセトン、脱水アセトンで素早く洗浄し、直ちに 2 ) で用意したメスフラスコに入れる。

4 ) 乾燥窒素で外気が混入しないようにしながら、スターラーでゲルを激しく攪拌しつつ、 1 0 0〜 2 0 0 z l のトレシルク口ライド（F 1 u k a社製）を約 1分を要して滴下する。この際、氷を詰めたビニール袋などでメスフラスコを 0 °C付近に保っておく _c

5) メスフラスコに蓋をし、ゲルを破砕させないようにスターラ一の速度を落し 2 0分間反応させる。メスフラスコは 0 °C付近に保つておく。

6 ) 反応後、ガラスフィルタ一上に移し、アセトン、アセトン + 5 mM H C 1 ( 1 : 1 ) ぉょび5：11]\1 H C 1 で洗浄する。

7 ) さらにアセトンで洗浄し、フィルタ一上で十分アセトンを揮散させる。

8 ) ナスフラスコに移し、減圧下にアセトンを揮散させる。トレシルは高温では不安定なので、 5 ) で用いた氷入りビニールなどで低温に保ちつつ乾燥させると、トレシル化シリ力ゲルが得られる。 3. 核酸試料の調製

市販の P U C 1 8 DNA (宝酒造社製） l O O gを用い、以下の操作により試料核酸混合液を調製し、固定化 D NA ( a ) および (b ) と接触させて、ハイブリダィゼ一シヨン処理を行なった。 1 ) 以下の組成の液で D N Aを切断する。

p U C 1 8 (宝酒造製）（ 5 0 0 / g/m l ) 2 0 0 ^ 1 EcoR I (宝酒造製）（ 2 0単位/" m l ) 2 0 μ \

EcoR I緩衝液（宝酒造製）（X 1 0倍濃度） 5 0 ^ 1 滅菌蒸留水 2 3 0 _Λ 1 合計 5 0 0〃 1 上記混合物を 3 7 °Cで 1時間反応させた後、 0. 5M エチレンジァミン四酢酸（E DT A ； p H 8. 0 ) を 1 0 1加え反応を停止する。

2 } 上記 1 ) の反応液に 5 M酢酸ナトリウム 5 0 1 を加え、さらにエタノ一ルを 1 m I加え、一 80 °Cで 2 0分間放置する。

3 ) 4。C、 1 2 0 0 0 r p mで 1 0分間遠心分離する。

4 ) 上清を除去し、一 2 0 °Cで冷却した 70 %エタノールで沈殿を洗浄し、 4 °C、 1 2 0 0 0 r pmで 3 0秒間遠心した後、上清を除去する。

5) デシケーター中で減圧乾燥する。

6 ) 2. 4Mテトラェチルアンモニゥムクロライド（TEAC 1 ) (和光純薬社製） 2 0 0 _Λ 1 を加え、よく溶かし、 75 °C、 5分間放置する。

7) 上記 2. で調製した 2種の固定化 DNA ( a) および（b) を全量加え、よく攪拌し、 2 0°Cで 1 5分間放置する。

8 ) 1 2 0 0 0 r p mで遠心し、上清を別のエツペンドルフチューブに移す。

9 ) 2.4 M TEAC 1 を 2 0 0 /^ 1加え、よく攪袢し、 1 2 0 0 0 r p mで数秒間遠心してゲルを沈殿させ、上清を除去する。

1 0 ) 2. 4 M TEAC 1 を 2 0 0 / 1加え、そこに比重を 1. 5に合わせたテトラブロムエタンノクロロホルムを 3 0 0 1加え、 6 0 0 0 r p mで数秒間遠心する。

1 1 ) 分離したゲル（各支持体）をそれぞれ回収する。

1 2 ) 各ゲルを、それぞれ 2.4M TE AC 1 ( 1 0 0 / 1 ) に懸濁する。

1 3 ) 7 0 °Cで 1 0分間保持し、ハイブリッド形成した D N Aを液相に溶出させ、液相（サンプル DNA液）を回収する。

4. 回収 DN Aの検定

以下の操作により、前項で試料核酸混合液から回収した一本鎖 D N Aの検定を行なった。

1 ) 20 X S S P E溶液 1 0m lで濾紙（ 5.5 X 5.5 c m ) を湿らせる。 20 X S S P E溶液は以下の組成：

N a C 1 1 74 g

a H₂P 0₄ · 2 H₂0 3 1.2 g

E D T A · 2 N a · 2 H₂〇 7.4 g からなる混合物を 800 m 1の水に溶かし、 NaOHでp H7. 4 とした後、 1 リットルにし、オートクレープ滅菌することにより調製される。

2 } 上記 1 ) の濾紙を 96穴のミニホールド装置（Bio-Rad社製' に配置する。

3) 5 5 (： 111の8100¥ ¹£メンブラン（PALL社製）を滅茵水で湿らせた後、 20 X S S P Eに付ける。その後、ミニホールド装置に装着する。

4 ) 一度、 20 XS SPEでミニホールドの各ゥヱルを洗浄する ₌ 5 ) サンプル D N A液を各々 2 ゥエルづっ各 5 1 づっミニホールドのゥエルに加える。

6 ) 吸引して D N Aをメンブランに吸着させる。

7 ) メンブランを外し、 2回 2 0 X S S P Eで洗诤する。

8 ) 8 0 °Cで真空乾燥し、その後、 2つに切る（ 2スポット）。以下、 2枚になったメンブランについて、各々以下の処理を行な

9 ) メンブランを 2 X S S P Eに浸す。

1 0 ) メンブランを 0. 5 m 1ハイブリダィゼ一シヨン液に浸し、 6 5 °Cで 2時間保持する。

ハイブリダィゼ一シヨン液は以下の組成からなる。

2 0 X S S P E 1 5 m l 5 0 X D e n h a r d t ' s液 2 m l 1 0 % S D S (ドデシル硫酸ナトリウム） 2. 5 m l \ Q _μ g /m \ サケ精子 DNA 0. 5 m l 滅菌水 30m l 合計 50m l

1 1 ) 液を捨て、新しく 12.5m lのハイプリダイゼーション液を加え、後述する方法で調製した、 ³²Pでラベルした DNAプローブ

(A) または DNAプローブ（B) を各 50 i加えて、 65 °Cでー晚反応させる。

12) 65 °Cに保温した 0.2 XSSPE、 0.1 % S D S緩衝液で、 1 5分間、 4回洗浄する。

13 ) メンブランをポリ塩化ビニリデンフィルムの上に載せる。

14) X線フィルムを挟み、一 80 °Cでー晚感光する。

1 5) フィルムを現像し、陽性または陰性を検出する。

2つの分画 DNAの分析結果は、それぞれの固定化 D N Aに相補的な塩基配列を有する DN Aが回収できていることを示している c 結果を以下の表 1に示す。プローブ A プローブ B

シリカゲル分画 DNA + —

CM— 5 PW分画 DNA - +

注： +は陽性、 —は陰性を表す。

5. DN Aプローブの作製

下記の操作により、 DNAプローブ（A) および（B) を作成した。

1 ) 下記⑤と⑥の DNAを AB I社製 DN A合成装置 3 9 1 E P PCR— MATEを用いて合成し、 AB I社教示の方法で精製した。

⑤ TGC AGG CAT GCA AGC TTG GCA C T G G

2) 精製した⑤と⑥の DNAをそれぞれ滅菌水に溶かし、分光光度計で 260 nmの吸光で濃度を測定し、滅菌水で希釈して 1 0 pmol

/ μ 1にする。

3) 以下の組成の溶液で⑤と⑥の各 DN Αの 5 ' 末端をラベル化 (ァ一³² Pで標識）する。

DN A ( 1 Opmol/// 1 ) 1.0 ^ 1 1 0 Xバクテリオファージ T 4ポリヌクレオチド

キナーゼ緩衝液 * 2.0 ^ 1

[₇ -³² P〗 ATP (sp.act. δ 000 C i /

mmol； 1 0 mC i /m 1水溶液）（ 10 pmol) 5.0 ," 1 水 1 1.0 1 * ： 1 0 Xバクテリオファ一ジ T 4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液は以下の組成からなる

Tris- H Cl (pH 7.6 0.5 M

MgCl 0.1 M ジチオトレイトール（DTT) 5 0 mM スペルミジン H C 1 1 mM

E DTA (p H 8.0 ) 1 mM

4 ) 8単位のバクテリオファージ T 4ポリヌクレオチドキナ一ゼを加え、 3 7°Cで 4 5分間放置する。

5) 6 8 °C、 1 0分間で反応を停止する

6 ) 4 0 1 の滅菌水を加え、よく混合する

7 ) 2 4 0 1の 5 M酢酸ナトリゥムを加え、よく混合する

8 ) 7 5 0 1 の一 2 0 °Cエタノールを加え、 0 °Cに 3 0分間放置する

9) 0 °C, 1 2 0 0 0 r p mで 2 0分間遠心する。 10 ) 500 ^ 1 80 %エタノールを加え、攪袢し、 0 、 1 2 000 r pmで 1分間遠心し、上清を除去する。

11) Ι Ο Ο Ιの TE (pH7.6) 緩衝液を加え、十分に溶かす。

T E緩衝液は以下の組成からなる。

T r i s -HC 1 (pH 7.5) 1 0 mM

E D T A 1 mM

液体シンチレ一ションカウンタ一で比放射活性を測定すると、 2 540 C i /mmolであった。

実施例 1の結果は、本発明の方法により、一度に様々な種類の一本鎖 D N Aを簡単に調製でき、本発明方法が一本鎖 D N Aを用いるサンガ一法の DN Aシークェンスサンプルの調製に有用であることを示すものである。

また、従来、 Ml 3ファージ系によってのみ可能であった一本鎖 D N Aライブラリ一の作成が、本発明方法によれば、どのようなサィズの DN Aについても簡単に作ることができる。しかも、二本鎖 D N Aのライブラリ一から作ることが可能となつた。

さらには、従来の固定化プローブによるクロー二ング法と異なり、 DNA (核酸）断片全領域をカバ一する断片のクローニングができる。即ち、本発明方法によれば、目的断片の 2本鎖 DNAを各々 2 種の分離可能な固定化 D N Aプロ一ブで回収した後、アニーリングすることで目的断片全領域を高効率でクローニングできる。

実施例 2 核酸サブトラクシヨン

1. トレシル活性化シリ力ゲルの調製

実施例 1と同様にしてトレシル活性化シリ力ゲルを調製した。 2. オリゴ（dT) の合成と支持体への固定

AB I社製 DN A合成装置にて、 Ι Μスケールで、下記配列の一本鎖 D N Aを合成した。精製後、 1.5 m gの D N Aが回収された。

Τ Τ Τ Τ Τ Τ Τ 3 '

X : ァミノリンク 2 (A Β I社製）得られた DNA (27— 111 6 1"の（1丁）を常法により高速液体ク口マトグラフィーを用いて精製した。この DNAを 500〃 g分とつて減圧下で乾固した。この乾固した DNA100 / gを 1M N a C 1 (1 00/^ 1 ) に溶かし、次いで 0. 4M N aHC0₃ (p H 7. 5 ) を 1 00 _Λ 1加えた。この溶液に、トレシル活性化シリカゲルを加え、室温で 24時間反応させた。反応終了後、シリ力ゲルを 1M N a C 1で 3回洗浄し、最後に、 1M N a C 1 Im iに懸濁した。これを 95°Cで 5分間加温した後、直ちに遠心し（1 2000 r pm) 、上清を除去して、残渣としてシリ力ゲルに固定化した 27— me rのオリゴ（dT) を得た。

3.mRNAの調製

1 ) B ALBZcマウス 3週齢の肝臓 2 gと脾臓 2 gをとり出し、以下の操作によってそれぞれから m R N Aを調製した。

以下の操作は、肝臓および脾臓について、個別に行なった =

2) 70m l 5. 5Mチオシァニン酸グァニジン溶液（以下、 5. 5 M GTC液と略記）を加え、ポリテトラフルォロエチレン一ガラスホモジナイザーですり潰す。

5. 5 M GTC溶液は以下の組成：

GTC (和光純薬） 5.5M

クェン酸ナトリウム（和光純薬社製） 2 5 mM

S a r k 0 s y 1 0.5 %

からなる混合液を N a OHで p H 7.0に調整し、フィルターを通す。使用直前に 0.2Mとなるように 2—メルカプトエタノールを加えて調製する。

3 ) テルモ社製 1 0 m 1デイスポーザブルシリンジに # 1 8注射針をつけ、これを使って 2 ) のホモジネートを出し入れし、 DNA を機械的に切断する。

4 ) オートクレーブ滅菌したポリア口マ一社製遠心チュ一ブに C s TFA— Ο. Ι Μ E DTA液を半分入れ、その上へ 3 ) のサンプルを重層し、 2 3 0 0 0 r p m、 1 5 °Cで 2 4時間遠心する。 C s TFA— 0. 1 M E D T A液は以下の組成からなる。 C s TFA (P h a rma c i a社製）

EDTA (p H 8.0) 0.25 M

これを蒸留水で p = 1.51とする。

5) ピペットを用いて、上からタンパク質、 DN A層を取り除き、液を除去して、残渣を回収する。この残渣を 4 M GTC溶液（5. 5 M G T C溶液を蒸留水で希釈したもの） 4m lに溶かす-

6) 10000 r pm, 10分間遠心して、不溶物を除く。

7 ) 上清に、 1 M酢酸 100 1とエタノール 3m lを加え、 - 20°Cで 5時間静置する。

8) 1 0000 r pm、 20分間遠心する。

9 ) 残渣を 3 m 1の TEに溶かし、 1 0000 r pm、 1 0分間遠心した後、上清を回収する。 TEは以下の組成からなる。

T r i s— HC 1 ( p H 7.5 1 0 mM

EDTA 1 mM 1 0 ) 0. 3 m lの 2M N a C 1 と 6 m 1 のエタノール加え、一 2 0 °Cで 3時間静置して沈殿させる。

1 1) 1 0, 00 0 r pm、 1 0分間遠心した後、沈殿を回収する。

1 2 ) 沈殿を T r i s— HC 1 (p H 7.5 ) 1 0 mM、 N a C 1 0.5M、 E DTA 1 mM、 S D S. 0.1 %からなる緩衝液 A に溶力、し、 0.5 m g / m 1 にする。

1 3 ) 1 M N a C l を 1 2 ) の溶液の等量加える。

1 4 ) 6 5°Cで 5分間処理した後、急冷する。

1 5) 1 2， 00 0 r pm、 5分間遠心した後、不溶物を除去する。

1 6 ) P h a r m a c i a社製 T y p e 7オリゴ（ d T ) セル口 —ス 0.5 g を蒸留水で膨潤し、詰めたカラムを 0.1 M N a 0 H 5 m l で洗い、その後、緩衝液 Aで平衡化する。次いで、 0.5M

N a C 1 1 0 m lで平衡化する。

1 7 ) 1 6 ) のカラムに 1 5) の上清を通す。

1 8 ) 溶出液をもう 1度同じカラムに通す。 1 9 ) 緩衝液 A 1 0m lで溶出する。これは 500 1づっ分画し、各分面の A 260 を測定し、ピークを回収する（分鲥4〜

7) c

20) 250m lの 3 M酢酸ナトリウム（和光純薬社製） p H 5. 1および 6 m 1エタノールを加え、よく攪袢し、一 20 °Cで沈殿さセる。

以上の操作により、 BALBZcマウス 3週齢の肝臓および脾臓から、それぞれ mRN Aを調製した。

4. 固¾化 c DNAの合成とそれを用いた核酸サ—ブ] ラ_クシ_ョン以下の操作により、先ず BALBZcマウス 3週齢の肝臓から抽出した mRNAを錡型として、支持体上に固定化した c DNAを合成し、次いで、この固定化 c DN Aを用いて、 BALBZcマウス 3週齢の脾臓から抽出した mRNAを含む核酸溶液を処理し、ハイブリダィゼ一シヨンを行なった。そして、該核酸溶液に残する核酸（mRNA) の分析を行なった。 1 ) B A L BZ cマウス 3週齢の肝臓から抽出した mR N A 5 gを 1 0 1の H₂0に溶かす。

2 ) 1〃 1の 1 0 01111\4 CH₃H g OHを加え、 1 0分間放置す。

- 3 ) 7 0 0 mM 2—メルカプトエタノール（原液を 2 0倍に希釈したもの）を 2 1加え、よく攪拌して、 CH₃H g OHを不活性化する。

4 ) 直ちに、 RNaseインヒビタ一（TAKARA酒造社製） 6 0 ュニット（ 6 1 ) を加え、攪拌後、 5分間放置する。

5 ) 上記 2. で作製した 2 7— m e rのオリゴ（ d T) を固定化したゲル 1 0 m gを加える。

6 ) 以下の反応混合物溶液を 4 5 °Cで 2時間反応させる。

5) の混合物 1 2 1の液成分ファーストストランド合成液 1 0 1

8 0 mM N a—ピロリン酸 2.5 1 d NT P s混合液 5 μ 1

逆転写酵素（生化学工業製） 1000ユニットファーストストランド合成液は以下の組成からなる。

T r i s -H C 1 (p H 8. 3 ) 250 m

M g C 1₂ 50 mM

KC 1 250 mM

7) 上記 6) の反応液に、 RNaseH (ベ一リンガーマンハイム山之内社製）を 2ユニット加え、 12°Cで 60分間、 22 Cで 60分間反応させる。

8) 70°C、 1 0分間で酵素を失活させる。

9 ) 12000 r pm、 1分間遠心し、上清を除去する。

1 0 ) 500 1の TEで洗浄した後、 12000 r pm、 1分間遠心し、上清を除去する。

1 1) 500 1 TEに懸濁する。 1 2 ) 2 m g/m 1 の（ d A) ₃₀ (アデニンの 3 0— m e r ) を 1 0 0 _Λ 1加える。

1 3 ) 5 M N a C 1 1 0 0 1 を加え、攪拌後、そのまま 3 7でで 1 5分間放置する。

1 4 ) 1 2 0 0 0 r p m、 1分間遠心した後上清を除去する。

1 5 ) 沈殿に、脾臓の mR NA 5 μ gを緩衝液 A 1 0 0 1 に溶かし、 7 0 °Cに加熱した後、冷却したものを加える。

1 6 ) 1 0 μ I 5 M N a C l加える。

1 7 ) H₂0を加え 5 0 0 1 にする。

1 8 ) 5 5 °Cで 1 0分間攪拌し反応させる。

1 9 ) 1 2 0 0 0 r p mで 1 0分間遠心する。

2 0 ) 上清を回収する。

2 1 ) エタノール 1. 5 m l を加えた後、 — 2 0 °Cで 5時間保持す

2 2 ) 1 2 0 0 0 r Dmで 1 0分間遠心し、 4 °Cに冷却した後、上清を除去する。

23 ) 5 μ 1 ΤΕに溶かす。

2 4 ) 1 1 を取り、 1 gZm 1ェチジゥムブロマイド 2 0 ^ I と混合し、紫外線を照射すると、オレンジ色に発色した。

このことは、 RN Aがこの溶液中に存在することを示しており、肝臓の mRN Aから調製した c D NAとハイプリッド形成しない m RNAが脾臓に存在する、即ち肝臓にはない m R N Aが脾臓にあることを示している。

実施例 2の結果は、本発明のサブトラクシヨン法により、内容不明の 2つの核酸混合物の間で相互に存在しない特異的核酸が回収できることを示すものである。例えば、正常の細胞の核酸を固定化し、病気の細胞（例えば、癌など）の核酸との間で、本発明の方法を実施すれば、回収される核酸は、病気に特異的な遺伝子であることが分かる。

このように、本発明のサブトラクシヨン法は、病気の遺伝子の解明の有用な方法ともなり、また、 2種の核酸混合物をいろいろ組み合わせることにより、老化の遺伝子、臓器特異的遺伝子等を効率的に回収できる。

Claims

請求の範囲

1 . 核酸試料中の特定の核酸を分離または抽出する方法であって、

1 ) 一本鎖核酸をその末端で不溶性支持体に固定化し；

3 ) 該支持体に固定化された一本鎖核酸とハイブリツド形成する該試料中の核酸を分離することからなる方法。

2 . 固定化一本鎖核酸が、塩基配列の異なる 2以上の 1本鎖核酸を分離可能な複数種類の支持体に別個に固定化することにより得られるものであり、該固定化一本鎖核酸と核酸試料とを接触させ、各固定化一本鎖核酸とハイプリッド形成する核酸試料中の 2以上の核酸を同時に分離することからなる請求項 1の方法。

3 . 固定化 1本鎖核酸とハイブリツド形成する試料中の核酸を除去し、溶液中に残存する核酸を回収する請求頊 1の方法。

4. 不溶性支持体に固定化される一本鎖核酸が合成 D N Aである請求項 1の方法。

5. 固定化一本鎖核酸が、末端を修飾された一本鎖 DNAとその相補鎖からなる 2本鎖 DN Aを、該修飾された末端を介して支持体に結合させ、次いで相補鎖を除ますることにより得られるものである請求埙 1の方法。

6. 固定化一本鎖核酸が、

1 ) オリゴマーのデォキシチミンを支持体に固定化し；

2) 該固定化オリゴマ一デォキシチミンに mRN Aをハイプリダイゼ一シヨンさせ、

3) 逆転写酵素を用い、 mRNAを鍩型とし、オリゴマーデォキシチミンをプライマ一とする c DNA合成を行い；

4) mRN Aを除去することにより得られる固定化 c DN Aである請求項 1の方法。

7. 核酸溶液が、 mRN Aおよび c DN Aからなる群から選ばれる少なくとも 1種の核酸を含有する溶液である請求項 1の方法 <